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Introduzione Analisi di una singola ibridazione Analisi di più ibridazioni PCA e Visualizzazione scientifica
Analisi di dati Microarray:Esercitazione Matlab
Laboratorio di Bioinformatica II
Pietro Lovato
Anno Accademico 2011/2012
Introduzione Analisi di una singola ibridazione Analisi di più ibridazioni PCA e Visualizzazione scientifica
Contenuti
1 IntroduzioneIntroduzione a MatlabBioinformatics ToolboxDNA Microarray
2 Analisi di una singola ibridazioneAmbiente MatlabSottrazione del backgroundScatter plot
3 Analisi di più ibridazioniEsempio: Serie temporali di lievitoGene SelectionCluster analysisValidare i risultati
4 PCA e Visualizzazione scientificaPrincipal Component Analysis
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Introduzione a Matlab
Che cos’èMATrix LABoratory
Sistema interattivo per il calcolo tecnico e scientifico
Linguaggio di programmazione
Internamente: librerie numeriche altamente ottimizzate
Una caratteristica di Matlab è l’espansibilità delle sue funzioni,attraverso delle soluzioni denominate toolbox. Tali toolbox sonocollezioni complete di funzioni Matlab per risolvere particolaricategorie di problemi.
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I toolbox
Statistica
Elaborazione di immagini
Elaborazione di segnali
Pattern recognition
Bioinformatica
Sistemi di comunicazione
Sistemi di controllo
Economia & Finanza
Calcolo parallelo
. . .
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Applicazioni per la bioinformatica
1 Analisi di sequenzeAllineamento, primer design, identificazione di motivi
2 Analisi di dati microarrayAnalisi di immaginiNormalizzazione dei datiClustering & data mining
3 ProteomicaAnalisi di dati da spettrometria di massa
4 Systems BiologySimulazione di pathway metabolici
5 Filogenesi
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DNA Microarray
Che cos’è
Tecnologia capace di misurare simultaneamentel’espressione di migliaia di geni.Sono analizzate differenti condizioni sperimentali:
Diversi tessuti (es. da individui sani/malati)Diverse condizioni di crescitaDiversi istanti di tempo
Enorme quantità di dati, da analizzare con strumentiinformatici.
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DNA Microarray (2)
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DNA Microarray (3)
ProblematicheDesign delle sondeProblematiche di Image Processing:
Segmentazione spotRimozione rumoreRilevamento della qualità degli spotQuantificazione del segnale
Analisi dei dati:Riduzione della dimensionalitàCluster analysisVisualizzazione scientifica
Interscambio di formati
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DNA Microarray (4)
ProblemaA seconda del tipo di esperimento edella piattaforma utilizzata, i dati checi vengono forniti possono averediversi formati.
Qualche esempio
.cel (Affymetrix)
.chp (Affymetrix)
.gpr (GenePix)
.soft (Dataset GEO)
.txt...
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L’interfaccia grafica
Sotto Applicazioni −→ Programmazione
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Un tipico comando Matlab
data_mouse = gprread(
’mouse_a1pd.gpr’)
;
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Un tipico comando Matlab
Risultato
data_mouse = gprread(
’mouse_a1pd.gpr’)
;
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Un tipico comando Matlab
Risultato
data_mouse = gprread(
’mouse_a1pd.gpr’)
;
Nome del comando
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Un tipico comando Matlab
Risultato
data_mouse = gprread(
’mouse_a1pd.gpr’)
;
Nome del comando
Argomenti in input
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Un tipico comando Matlab
Risultato
data_mouse = gprread(
’mouse_a1pd.gpr’)
;
Nome del comando
Argomenti in input
NotaPer i comandi di visualizzazione non è necessario specificareun risultato.
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Lavorare con una singola ibridazione
Esempio
Dati di espressione di topo in cui è stato indottofarmacologicamente il morbo di Parkinson.
Ogni chip contiene l’espressione in una regione (voxel) delcervello.
Dati grezzi: file in formato .gpr oppure soft (GEOaccession GSE30).
File .gpr già presente come demo Matlab.
Caricare i datipd = gprread(’mouse_a1pd.gpr’);
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Strutture in Matlab
struct()
Tipo di dato che raggruppa più campi in un unico oggetto.
Un campo può memorizzare informazioni di vario tipo.
Accesso ai campi con variabile.nomeCampo.
NotaFormati di file microarraydiversi avranno campicon nomi diversi (mal’informazione contenutaè sostanzialmente lastessa).
Header: [1x1 struct]Data: [9504x38 double]
Blocks: [9504x1 double]Columns: [9504x1 double]
Rows: [9504x1 double]Names: {9504x1 cell}...
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Cosa ci interessa
Campi
Il campo Data è una matrice che contiene i dati.
Il campo Names contiene i nomi dei geni (le righe).
Il campo ColumnNames contiene i nomi delle colonne.
All’interno del campo ColumnNames:
’F635 Median’ intensità del canale rosso (cy5,λ = 635nm).
’F635 Median - B635’, come sopra ma consottrazione del background.
’F532 Median - B532’ intensità del canale verde (cy3,λ = 532nm).
La mediana è uno stimatore robusto dell’intensità dei pixel.
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Sottrazione del background
Background: fluorescenza che puòcontribuire all’intensità misurata manon è dovuta all’ibridazione del target.
Può dipendere da polvere, molecoleisolate, imperfezioni nel sistema diacquisizione, rumore, ...
Il background varia lungo il supporto eva stimato localmente.
B532 Median
Provare a visualizzare il bg del canale verde con il comandomaimage(pd, ’B532 Median’);
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Salvare in variabili separate i campi di interesse
Sintassi
cy5Data = magetfield(pd,’F635 Median - B635’);cy3Data = magetfield(pd,’F532 Median - B532’);genes = pd.Names;
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Scatter plot: R vs G
Dati “osservati”: {(R,G)i}
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Scatter plot: log2 R vs log2 G
Dati “osservati”: {(log2 R, log2 G)i}
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Scatter plot: I vs R
Dati “osservati”:{(
log10(R · G), log2
(RG
))
i
}
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In Matlab
Per creare uno scatter plot del tipo log R vs log G:
maloglog(cy5Data,cy3Data,’labels’,genes);
Per creare uno scatter plot del tipo I vs R:
mairplot(cy5Data,cy3Data,’labels’,genes);
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In Matlab
Per creare uno scatter plot del tipo log R vs log G:
maloglog(cy5Data,cy3Data,’labels’,genes);
Per creare uno scatter plot del tipo I vs R:
mairplot(cy5Data,cy3Data,’labels’,genes);
EsercizioProvare a disegnare uno scatter plot “a mano”:
Dato un vettore x , il logaritmo delle sue componenti sicalcola con il comando: variabile = log10(x);Un qualsiasi scatter plot (non microarray-specifico) sidisegna con il comando: scatter(x,y);
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Ricapitolando...
» pd = gprread(’mouse_a1pd.gpr’);
» maimage(pd, ’B532 Median’);
» cy5Data = magetfield(pd,’F635 Median - B635’);
» cy3Data = magetfield(pd,’F532 Median - B532’);
» genes = pd.Names;
» maloglog(cy5Data,cy3Data,’labels’,genes)
» mairplot(cy5Data,cy3Data,’labels’,genes)
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Idea: combinare dati provenienti da diverse ibridazioni
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Cluster analysis
Passi (a grandi linee)
Identificare geni differenzialmente espressi:t-test se il problema è a due classi.Altri indici per selezionare geni “rilevanti” (varianza,entropia, ...).
Definire una distanza tra profili di espressione.
Scegliere un algoritmo di clustering.
Validare il risultato.
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Esempio: Serie temporali di lievito
ProblemaInvestigare come variano nel tempo i livelli di espressionedel lievito (Saccharomyces cerevisiae).
Si è interessati alla riprogrammazione metabolica nelpassaggio dalla fermentazione alla respirazione.
IdeaCercare di raggruppare geni con profili di espressione“simili”.
Cercare di caratterizzare ciascun gruppo attraverso ilprocesso biologico cui i geni prendono parte.
Caricare i datiload yeastdata;
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Plottare un profilo di espressione
plot(
times, yeastvalues(
15 , :)
)
;
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Plottare un profilo di espressione
Matrice dei dati
plot(
times, yeastvalues(
15 , :)
)
;
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Plottare un profilo di espressione
Matrice dei dati
plot(
times, yeastvalues(
15 , :)
)
;
Seleziono la quindicesima riga=gene
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Plottare un profilo di espressione
Matrice dei dati
plot(
times, yeastvalues(
15 , :)
)
;
Seleziono la quindicesima riga=gene
Seleziono tutte le colonne=tempi
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Gene Selection
Scartare i geni “non informativi”
Geni a bassa varianza.
Geni con basso valore assoluto in ogni istante temporale.
Geni a bassa entropia informativa.
Sintassi» [mask, yeastvalues, genes] =genevarfilter(yeastvalues, genes);
» [mask, yeastvalues, genes] =genelowvalfilter(yeastvalues, genes, ’absval’, log2(3));
Quanti geni rimangono dopo la selezione?
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Introduzione: Cluster Analysis
Una possibile definizione
Il clustering rappresenta l’organizzazione di un insieme di entitàin gruppi (clusters) sulla base della similarità.
Il concetto di cluster è vago:
Dipendentemente dalle misure di similarità utilizzatecambia il risultato.La scelta della misura di similarità è cruciale
Dovrebbe essere fatta in modo da inglobare la maggiorquantità possibile di informazione a priori.
Il risultato può cambiare anche a seconda dellametodologia utilizzata per fare clustering.
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Clustering partizionale vs gerarchico
Clustering partizionale
Il risultato è una singola partizione dei dati.
Tipicamente il numero di cluster deve essere dato a priori.
Esempio: K-means.
Clustering gerarchico
Il risultato è una serie di partizioni innestate (undendrogramma).
Non è necessario settare a priori il numero di cluster.
Più informativo del clustering partizionale ma improponibileper dataset molto grandi.
Esempi: Complete link, single link, ...
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Clustering gerarchico
Funzione clustergram
clustergram(data, ’Linkage’, ’tipo’, ’rowlabels’, genes);
Dove:data: matrice di espressione.’tipo’: Algoritmo di clustering gerarchico.
’single’: Algoritmo Single Link’complete’: Algoritmo Complete Link’average’: UPGMA...
genes: identificativi dei geni.
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Clustering partizionale
K-meansAlgoritmo più famoso di clustering partizionale.
Ogni gene è un punto in uno spazio n-dimensionale (nnumero di esperimenti).
Ogni cluster è rappresentato dalla sua media.Idea:
L’algoritmo è iterativo: si “assesta” in più passi.Si parte da una clusterizzazione iniziale, e ad ogniiterazione si assegna ogni gene alla media più vicina.Si riaggiornano le medie.Si ripete fino a convergenza.
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K-means clustering
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K-means clustering (2)
Funzione kmeans
[cidx, ctrs] = kmeans(data, K, ’dist’, ’tipo’);
Input:
data: matrice di espressione.
K : numero di cluster. Per questo esempio K=16.’tipo’: Distanza da utilizzare.
’sqEucl’: Distanza euclidea’corr’: Distanza di correlazione statistica...
Output:
cidx: indica, per ogni gene, il cluster a cui appartiene.
ctrs: centri dei cluster – profilo “medio” di espressione.
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Visualizzare i risultati
Funzione maplot
Per visualizzare i profili appartenenti ad ogni cluster:
maplot(times, yeastvalues, cidx)
Per visualizzare il profilo medio di espressione in ognicluster:
maplot(times, yeastvalues, ctrs)
Quale/i cluster rappresenta geni che si esprimono solo durantela respirazione cellulare?
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Validare i risultati: GOstat
Una volta individuato un cluster di interesse x , esportare inun file di testo i geni che lo compongono:cluster = genes(cidx==x);dlmwrite(’cluster.txt’, char(cluster), ’’);
Carico il file su GOstat:Nel campo “Gene-association database” mettere sgd(lievito)(Opzionale) Nel campo “Subset of GO hierarchy” metterebiological_process (siamo interessati al pathway cui igeni nel cluster prendono parte)
In output ho i termini GO che meglio descrivono i geniall’interno del mio cluster.
Che informazioni riesco a dedurre?
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Ricapitolando...
» load yeastdata
» plot(times, yeastvalues(15,:))
» [mask, yeastvalues, genes] =genevarfilter(yeastvalues, genes);
» [mask, yeastvalues, genes] =genelowvalfilter(yeastvalues,genes,’absval’,log2(3));
» clustergram(yeastvalues,’Linkage’,’complete’, ...’rowlabels’,genes)
» [cidx, ctrs] = kmeans(yeastvalues, 16, ’dist’,’corr’);
» maplot(times, yeastvalues, cidx)
» maplot(times, yeastvalues, ctrs)
» cluster = genes(cidx==1);
» dlmwrite(’cluster.txt’, char(cluster), ’’);
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Principal Component Analysis (PCA)
MotivazioniRidurre la dimensione dei dati (qui ogni dato è un genecaratterizzato da 7 numeri)...
per visualizzare il dataset;per ridurre il carico computazionale delle tecnicheapplicate;per eliminare possibile ridondanza;
Mettere in evidenza particolari strutture presenti nei dati.
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PCA (2)
IdeaPresentare i dati nel riferimento che evidenziamaggiormente la loro struttura.
Estrarre le direzioni di massima varianza dei dati.
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PCA (3)
Idea: eliminare le direzioni a bassa varianzaIn questo modo si comprimono i dati minimizzando laperdita di informazione.
Per trasformare ogni punto: formule e nozioni derivantidall’algebra lineare (autovalori e autovettori della matrice dicovarianza...).
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PCA (4)
Vantaggi
Migliore tecnica di compressione dei datiMigliore in senso di errore quadratico medio
Svantaggi
Non è detto in tutti i casi che le direzioni a varianzamaggiore siano le direzioni ottimali;
Si perde l’interpretabilità delle grandezze rappresentate.
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PCA in Matlab
Funzione princomp
[pc, comp] = princomp(data);
Input:
data: matrice di espressione.
Output:
pc: coefficienti della trasformazione.
comp: coordinate dei punti nello spazio trasformato,ordinate per importanza decrescente.
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PCA in Matlab (2)
Plottare le prime due o tre componenti per visualizzare i datitrasformati.
Il comando è sempre scatter:scatter(comp(:,1),comp(:,2));
o, in alternativa:scatter3(comp(:,1),comp(:,2),comp(:,3));
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Esercizio
Effettuare un clustering k-means sui dati trasformati,prendendo solo le prime due o tre componenti principali;
Ad es, per prendere solo le prime due componenti
data_pca = comp(1:2,:);
K = 2;
Vengono separati i due cluster?
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Ricapitolando...
» [pc, comp] = princomp(yeastvalues);
» scatter(comp(:,1),comp(:,2));
» scatter3(comp(:,1),comp(:,2),comp(:,3));
» pca_data = comp(:,1:2);
» [pca_idx, pca_ctrs] = kmeans(pca_data, 2,
’dist’, ’sqEucl’);
» scatter(pca_data(:,1), pca_data(:,2), 4,
pca_idx);
NotaMatlab offre un help molto semplice e dettagliato!