MTODOS PARA QUANTIFICAR O
CRESCIMENTO MICROBIANO
Instituto de Cincias e Tecnologia de Alimentos
Patrcia da Silva Malheiros
Investigar presena / ausncia de micro-organismos
Quantificar os micro-organismos de interesse
Identificar diferentes espcies microbianas presentes
Analise microbiolgica de alimentos:
MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO
QUANTIFICAO DIRETA:
Contagem em placas
Filtrao
Mtodo do nmero mais provvel
Contagem direta ao microscpio QUANTIFICAO INDIRETA:
Turbidimetria
Atividade metablica
Peso seco
MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO
QUANTIFICAO DIRETA
CONTAGEM EM PLACAS
- tcnica mais utilizada na determinao do tamanho da
populao bacteriana;
VANTAGEM: qualificao de clulas viveis
DESVANTAGEM: tempo
Diluio seriada
Diluentes:
soluo peptona 0,1%
soluo salina 0,85%
tampo fosfato pH 7,2
Inculo
original
Diluies
9 mL de
diluente em
cada tubo
Semeadura
meio de cultura
(45 50oC)
0,1 mL
Fonte: Madigan MT, Martinko JM, Parker J. Microbiologia de Brock. 10 Ed. Editora Person, 624p., 2008.
Aps a incubao, a contagem das colnias efetuada
Inculo
original
Diluies
9 mL de
diluente em
cada tubo
Plaqueamento
Selecionar as placas com 25 a 250 colnias para contagem.
O nmero de Unidades Formadores de Colnias (UFC) por grama ou
mililitro da amostra ser o nmero de colnias contadas multiplicado
pelo inverso da diluio inoculada
O inverso da diluio 10-1 101, o inverso da 10-2 102 e assim por
diante...
Duas placas por diluio (duplicata) mdia aritmtica da contagem obtida em cada uma das placas da duplicata.
Resultado final
Usar notao exponencial.
Usar uma casa decimal depois da vrgula.
Contagem das colnias e clculo dos
resultados
Ex: Plaqueamento em profundidade (1 mL)
http://www.youtube.com/watch?v=bCI-O9vCmHM
Diluio 10-3
85 colnias
65 colnias (duplicata)
Fonte: http://skylinecollege.net/case/biol240/pourplate.html
Contagem das colnias e clculo dos
resultados
Resultado:
85 x 103 + 65 x 103 =
2
75 x 103 = 7,5 x 104 UFC/g
Ex: Plaqueamento em superfcie (0,1 mL)
Diluio 10-3 85 colnias
65 colnias (duplicata)
Fonte: http://skylinecollege.net/case/biol240/pourplate.html
Contagem das colnias e clculo dos
resultados
Resultado:
85 x 103 + 65 x 103 =
2
75 x 103 = 7,5 x 105 UFC/g 10 x
AUTOMAO LABORATORIAL
Utilizado nas etapas da analise:
a . Pesagem- Por ex, atravs de um
aparelho chamado DILUTER -
ajustado que ao colocar a amostra,
pesa a alquota desejada, e j dilui
acrescentando o diluente
necessria para a diluio!
AUTOMAO LABORATORIAL
b . Homogeneizao- Uso do stomacher homogeneizador de pisto no mais os liquidificadores que cortam as clulas microbianas injuriando-as na anlise!!!
AUTOMAO LABORATORIAL
c. Semeadura Utilizao de um aparelho chamado spiral plater amostra semeada na placa, atravs de uma cnula, que verte o inculo, e a placa fica numa superfcie que gira.
http://www.youtube.com/watch?v=pRChN3QHuqo&hd=1
FILTRAO
MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO
QUANTIFICAO DIRETA
Fonte: Tortora GJ, Funke BR, Case CL. Microbiology: An Introduction. 960 p. 9th ed. Benjamin Cummings: California. 2006.
Clulas bacterianas na superfcie da membrana (poros)
Membrana filtrante colocada sobre o
meio de cultura e placa incubada.
MTODO DO NMERO MAIS PROVVEL (NMP)
- utilizado para micro-
organismos que no
crescem bem em meio
slido.
MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO
QUANTIFICAO DIRETA
Diluio
Diluio
Diluio
10 mL de inculo
1 mL de inculo
0,1 mL de inculo
5 tubos positivos
3 tubos positivos
1 tubos positivos
CONTAGEM DIRETA AO MICROSCPIO
- um volume conhecido de suspenso bacteriana
colocado em uma rea definida da lmina de microscpio.
- a amostra pode ser corada ou analisada a fresco.
DESVANTAGENS: - no separa clulas mortas e vivas
- pode haver erros de contagem
- difcil contagem para bactrias mveis
MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO
QUANTIFICAO DIRETA
Fonte: Pelczar JR, Chan ECS, Krieg NR. N.R. Microbiologia. 1 Ed. Editora Makron Books, 556p. 2004.
MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO
QUANTIFICAO DIRETA
Sistemas prontos para uso:
Placas de Petrifilm-3M, Placas de Simplate e diversos
gares adicionados de substratos cromognicos ou
fluorognicos.
Petrifilme Anlise de Escherichia coli
6
3 2
4 5
1
ATIVIDADE METABLICA
- quantidade de um certo produto (como cido ou CO2)
diretamente proporcional ao nmero de clulas
bacterianas.
MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO
QUANTIFICAO INDIRETA
PESO SECO
- principalmente para fungos filamentosos
TURBIDIMETRIA
- monitoramento do crescimento bacteriano atravs da
turbidez;
- espectrofotmetro (660 nm).
MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO
QUANTIFICAO INDIRETA
- A quantidade de luz que atravessa o detector inversamente
proporcional ao n. de bactrias.
Fonte: Tortora GJ, Funke BR, Case CL. Microbiology: An Introduction. 960 p. 9th ed. Benjamin Cummings: California. 2006.
Origem de luz
Suspenso bacteriana
Percentagem de
luz transtmitida
Percentagem de
luz transtmitida
Branco Detector de luz
Espectrofotmetro
TCNICA ASSPTICA
- Cuidado com contaminaes!
TCNICA DE ESGOTAMENTO
- Obteno de colnias puras.
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