Sergi Maicas PrietoDepartamento de Microbiología y EcologíaUniversitat de València
Lección 6.1. Introducción al Módulo 6
Biología molecular. Bases y aplicacionesMódulo 6. Aplicaciones de la biología
molecular en agricultura
Con el desarrollo de la biología molecular, algunas tecnologías basadas en el
DNA nos permiten:
• la mejora de cultivos p.e. aumento de productividad, mejora calidad
organoléptica, resistencia a sequia, plagas, …
• Identificación y conservación de las especies
vegetales en bancos de germoplasma
Algunas técnicas moleculares puestas a punto en otras áreas
(PCR, RFLP, RAPD, SNP, AFLP o SRAP)
fueron rápidamente implementadas para su uso en agricultura
Aplicaciones de la biología molecular en plantas para el aumento de
productividad (incremento o eliminación del número de semillas).
Micotoxinas
Entre los problemas de inocuidad de los alimentos, la presencia de especies
fúngicas capaces de producir metabolitos tóxicos en los productos
agroalimentarios ha adquirido una especial atención.
Las micotoxinas, compuestos de bajo peso molecular, son el resultado del
metabolismo secundario de los hongos toxigénicos.
Pueden tener actividad tóxica hacia las plantas, pero sobre todo representan
un serio riesgo para la salud humana y animal, ya que pueden acumularse en
muchos productos finales de cultivos y tienen una amplia gama de actividades
biológicas tóxicas.
O
OO
O O
OCH3H
H
Aflatoxin B11961
N O
OO
H
COOH
Cl
OH
HCH
Ochratoxin A (OTA)1965
O
O
OH
O
Patulin1941
• Alimento básico un enorme impacto económico y social.
• La comunidad científica requiere de nuevas herramientas de diagnóstico y
un conocimiento más profundo de la biología y la genética de los hongos
toxigénicos.
• Según un estudio de la Organización de las Naciones
Unidas para la Agricultura y la Alimentación,
aproximadamente el 25% de la producción mundial de
alimentos y piensos está contaminada por micotoxinas.
• Los cereales son los cultivos más
sensibles a la colonización de
especies fúngicas toxigénicas.
Acumulación de las micotoxinas en
los granos.
Control de plagas
• Bacillus thuringiensis (Bt) es conocido como el insecticida microbiano más
exitoso contra diferentes órdenes de plagas de insectos en la agricultura
• Alternativa biológica a los plaguicidas
• Los genes de toxina Bt también se han utilizado eficientemente para
aumentar la resistencia a plagas de insectos en cultivos modificados
genéticamente
• Ventajas
• El nivel de la expresión de toxinas puede ser
muy elevado. De esta manera se puede
suministrar una dosis adecuada a la plaga.
• La expresión de toxinas está dentro del
sistema de la planta, por lo que únicamente
afectan a aquellos insectos que se alimentan
de ella.
• La expresión de toxinas puede ser modulada
a través de promotores específicos de tejido,
y puede reemplazar el uso de plaguicidas
sintéticos.
Control biológico con bacterias o bacteriófagos
• Otra manera de combatir las plagas es con el uso de bacterias o
bacteriófagos.
• La aplicación de la biología molecular en este campo ha permitido el
desarrollo de estrategias innovadoras que facilitan el control de patógenos
bacterianos siendo además respetuosas con el medio ambiente.
• 2 lecciones diferentes estrategias moleculares aplicadas sobre bacterias
y fagos
• 6.2. Biología molecular con plantas
• 6.3. Identificación y cuantificación de hongos en el control de micotoxinas
• 6.4. Control de plagas
• 6.5. Biocontrol de enfermedades bacterianas de plantas mediante
bacteriófagos
• 6.6. Control biológico de bacteriosis en plantas mediado por agentes
bacterianos
Imágenes tomadas de www.wikipedia.org, www.pixabay.com y www.google.es
Biología molecular. Bases y aplicaciones
María Dolores Gómez JiménezInstituto de Biología Molecular y Celular de PlantasIBMCP (CSIC)
Lección 6.2. Biología molecular con plantas
Biología molecular. Bases y aplicacionesMódulo 6. Aplicaciones de la biología
molecular en agricultura
¿Cómo utilizamos la Biología Molecular en el avance de
conocimiento en Biología Vegetal?
BiosíntesisGAs
GAs
Óvulo de Arabidopsis thaliana
ATS
DELLAs
ATSDELLAs
La Biología Molecular nos permite establecer
modelos como éste donde se refleja cómo la
hormona giberelina (GA), junto con reguladores
(DELLAs) y factores transcripcionales (ATS),
participa en el control del desarrollo de los
óvulos de Arabidopsis thaliana.
Técnicas como qPCR, Hibridación in situ de
mRNA , Y2H o BiFC son indispensables para
establecer las interacciones genéticas y
moleculares que se establecen en el esquema.
Giberelinas (GAs) DELLAs(GAI, RGA)
Respuesta a GAsen la planta
DATOS PREVIOS:
¿Cómo llegamos a establecer este modelo?
1.
2. Mutante ats-1ATS es un factor transcripcional
implicado en el desarrollo
adecuado de 5 capas celulares del
óvulo llamadas integumentos (i).
ats-1 produce óvulos con
integumentos más cortos que la
planta wild type (WT).
WildType
i
Mutante dellaOBSERVACIONES:
1. Los mutantes nulos della presentan un fenotipo
de óvulo similar al de ats-1.
2. Las plantas ats-1 germinan antes que las WT
por lo que podrían sintetizar más GAs.
HIPÓTESIS:
Teniendo en cuenta que las proteínas DELLA ejercen su función uniéndose a factores
transcripcionales (FTs) y que esta interacción permite o impide que los FTs se unan al
DNA, es posible que las proteínas DELLA interaccionen con el factor ATS posibilitando
su unión a sus genes diana.
EXPERIMENTOS PARA COMPROBAR HIPÓTESIS Y RESULTADOS:
SD/-Leu-Trp SD/-Leu-Trp-Ade-His
ATS.1 vs. GAIvs. RGA
vs. --
ATS.2 vs. GAIvs. RGA
vs. --
B
ATS.2
ATS.1 STOP
STOPATG
ATG
A
1. ¿Interaccionan físicamente las proteínas DELLA y el factor transcripcional ATS?
ATS.1 corresponde a la proteína
completa ATS y ATS.2, que utilizaremos
como control negativo en el Y2H, es la
proteína ATS truncada.
Y2H
La proteína completa (no ATS.2) interacciona
con las proteínas DELLA GAI y RGA
BiFC
100 µm 100 µmYFPN43-ATS.1 YFPN43-ATS.2
YFPC43-GAI
YFPC43-RGA
La interacción entre ATS y las proteínas DELLA también es positiva con BiFC lo
cual nos confirma que ambas proteínas podrían unirse para participar en el
desarrollo del óvulo.
2. ¿El mutante ats-1 tiene más GAs?
Ler
ats-1
RGA-GFP en óvulos
Expr
esió
n re
lativ
a
Lerats-1
0
1
2
3
4
GA20ox1 GA20ox2 GA3ox1 GA3ox2
ats-1 muestra incrementada la expresión de los genes de biosíntesis de GAs. Las GAs
provocan la degradación de las proteínas DELLAs por lo que en los óvulos ats-1 se observa
menor cantidad de la DELLA RGA marcada con GFP.
qPCR Microscopía confocal
• La suma de los resultados nos posibilita la creación del modelo inicial y apoyándonos
en éste, aumentar en trabajos posteriores el conocimiento sobre la formación de los
óvulos en una planta modelo. Si somos capaces de controlar el número de óvulos,
controlaremos el de semillas, característica importantes en cultivos de interés
agronómico.
GAsATS
ATSDELLAs
Resultados Modelo
Y2H y BiFC
qPCR y Microscopía confocal
Referencias bibliográficas y enlaces
Gómez et al. (2016) Plant Physiology 172, 2403-2415DOI: 10.1104/pp.16.01231
Lección 6.3. Identificación y cuantificación de hongos en el control de micotoxinas
Biología molecular. Bases y aplicacionesMódulo 6. Aplicaciones de la biología
molecular en agricultura
Pedro Vicente Martínez CulebrasDepartamento de Medicina PreventivaUniversitat de València
Incorporación a la cadena alimentaria
ContaminaciónHongos
VIA PRIMARIA
VIA SECUNDARIA
Hongo filamentoso Micotoxinas(metabolitos secundarios)
Inmunotóxicas Genotóxicas Neurotóxicas Nefrotóxicas Carcinogénicas
¿Qué son las micotoxinas?
Consumo por el hombre
Piensos contaminados
Efectos tóxicos
1
1
Son acumulativas y el daño se produce a largo plazo
Aspergillus
Penicillium
Fusarium
Hongos productores y micotoxinasMás de 300 micotoxinas producidas por más de 150 hongos diferentes.
3 géneros de hongos producen las micotoxinas de mayor relevancia
CH3CH3
O
OOHO
HO
O
OOHO
HO
O
O
OH
OH OH
NH2
Fumonisin FB11988
O
OO
O O
OCH3H
H
Aflatoxin B11961
N O
OO
H
COOH
Cl
OH
HCH
Ochratoxin A (OTA)1965
k !
O
O
OH
O
Patulin1941
N O
OO
H
COOH
Cl
OH
HCH
Ochratoxin A (OTA)1965
k !
Cereales Frutos secos Café y cacaoUva
ManzanaCereales
Cereales
Aflatoxinas Ocratoxina
Patulina
Fumonisinas ZearalenonaTricotecenos
Operaciones Cultivo
Operaciones postcosecha
(almacenamiento)
Operaciones industriales
Control de micotoxinas
Prácticas agrícolas
Tratamientos fitosanitarios
SecadoLimpieza
- Control temperatura- Control humedad- Control de insectos
SelecciónLimpiezaMolienda
Descontaminación y detoxificación-Físicos: calor, irradiación, absorción-Químicos y biotecnológicos
Variedades resistentes
Control de los hongos productores
1. Determinar la distribución de especies responsables de la contaminación
a) Identificación de los hongos productores a nivel de especie
b) Evaluación de la capacidad productora de micotoxinas
2. Detección y cuantificación de los hongos productores
Una vez en la cadena alimentaria es difícil de eliminarlasLa mejor medida de control es la prevención de la contaminación
Phialides
Conidiophore
MetulaeVesicle
Foot cell
PhialidesConidia
Morfología y color de las colonias Tamaño y forma de los conidióforos Tamaño y forma de los conidios
Identificación de hongos
Criterios clásicos Métodos moleculares
Identificación de especies rápida y precisaEs necesario mucho tiempo y no es posible diferenciar entre algunas especies
Ejemplo: especies de Aspergillus negros productoras de OTA en vino
A. niger A. tubingensis A. tubingensis-like A. aculeatus A. carbonarius
Extracción DNA
PCR región ITS del rDNA Digestión del fragmento amplificado
Detección y cuantificación de la producción de ocratoxina A (OTA) de las cepas aisladas
Identificación de especies Incidencia y % cepas productoras
Aspergillus carbonarius es el mayor responsable de la contaminación del vino con OTA
Producción de OTA
Detección y cuantificación de Aspergillus carbonarius mediante qPCR
Real Time PCR
A. carbonarius
A. nigerA. tubingesnisA. aculetusA. foetidusA. helicotrixA. phoenicis
Se podría utilizar para la detección y cuantificación temprana de A. carbonarius con fines preventivos, y así optimizar el momento de efectuar los tratamientos fitosanitarios.
Baltasar Escriche SolerDepartamento de GenéticaUniversitat de València
Lección 6.4. Control de plagas
Biología molecular. Bases y aplicacionesMódulo 6. Aplicaciones de la biología
molecular en agricultura
Las plagas
• La agricultura ha generado ecosistemas
vegetales con pocas o una sola especie.
• Las plantas tienen numerosos sistemas de
defensa, de tal forma que los fitófagos están
especializados.
• En un cultivo, los fitófagos de esa especie
vegetal se ven favorecidos de forma que
incrementan su número exponencialmente
constituyendo lo que denominamos una
plaga.
• Las plagas son debidas principalmente a
artrópodos (especialmente insectos) por sus
características biológicas.
Control de plagas
• Los daños originados en el cultivo pueden
ser directos o indirectos.
• El umbral económico resulta transcendental
para el tratamiento de una plaga.
• El control de plagas se realiza mediante
diferentes estrategias (directas o indirectas).
• Actualmente se intentan combinar varias
estrategias con sistemas de control
integrados.
• El control directo se realizó inicialmente con
diferentes sustancias hasta la revolución de
los insecticidas de síntesis química.
Control de plagas
• Se observaron efectos nocivos en la salud y
el ambiente tras el uso masivo de productos
de síntesis.
• Se han usado diferentes alternativas ante
esta situación, entre las que destaca el uso
de patógenos naturales específicos de las
plagas.
• Especialmente en insectos, ha resultado de
una enorme eficacia el uso de preparados
basados en la bacteria Bacillus thuringiensis.
Bacillus thuringiensis
• B. thuringiensis es una bacteria gram+
presente en todos los lugares que cuando
esporula produce un acumulo proteico con
actividad principalmente insecticida.
• Esta especie fue aislada a principios del siglo
XX de larvas de insectos con síntomas de
infección.
• Rápidamente se inició su uso comercial que
fue temporalmente desplazado por los
insecticidas de síntesis.
• Actualmente, esta considerado el producto
biológico con mayor cuota de mercado.
Proteínas Cry
• Cada proteína Cry es tóxica para un limitado
número de especies, característica muy
importante para evitar efectos en especies
no diana.
• Su efecto se basa en producir daños en el
intestino de los insectos que finalmente
originan su muerte.
• Se ha determinado la existencia de al menos
70 familias diferentes proteínas Cry.
• Las bacterias pueden ser modificadas para
que expresen combinaciones de proteínas
para plagas específicas.
• Las proteínas pueden ser modificadas para
mejorar su efectividad y espectro de acción.
Plantas mejoradas
• El uso de agentes externos para el control
de plagas resulta mejorado por su
producción por la propia planta para
autoprotegerse.
• Las técnicas de mejora vegetal basadas en
procesos naturales como es la infección por
Agrobacterium permiten la producción en la
planta de estos compuestos.
• El empleo desde hace 20 de años de
cultivos de este tipo ha permitido una
reducción considerable del empleo de
productos de síntesis y una mejora de la
productividad.
Futuras plantas mejoradas
• Diferentes proteínas de tipo Cry y Vip se
encuentran expresándose en los cultivos
actuales.
• Se está evaluando la expresión de otras
proteínas de origen vegetal (p.e. lectinas) o
bacteriano (p.e. quitinasas).
• Desde hace una década se están
estudiando nuevas aproximaciones, como es
la expresión de iRNA para silenciar genes
vitales de las plagas o inhibir sus mecanismo
de tolerancia a productos tóxicos de la
planta.
Caballero, P. & J. Ferré. 2001. Bioinsecticidas: fundamentos y aplicaciones de Bacillusthuringiensis en el control integrado de plagas. Phytoma-España y Universidad Pública deNavarra, Valencia y Pamplona.Chakroun, M., Banyuls, N., Bel, Y., Escriche, B. & Ferre, J. 2016. Bacterial VegetativeInsecticidal Proteins (Vip) from Entomopathogenic Bacteria. Microbiology and MolecularBiology Reviews 80: 329-350.Li, Y., Hallerman, E.M., Liu, Q. & Wu, K. 2016. The development and status of Bt rice in China.Plant Biotechnology Journal14: 839–848Peng, Y. Melo, A. L., Soccol, V. T., & Soccol, C. R. 2016. Bacillus thuringiensis: mechanism ofaction, resistance, and new applications: a review. Critical Reviews in Biotechnology 36: 317-326Kim, Y. H., Soumaila Issa, M., Cooper, A. M. & Zhu, K.Y. 2015. RNA interference: Applicationsand advances in insect toxicology and insect pest management. Pesticide Biochemistry andPhysiology 120:109–117Vilas-Bôas, G.T., A.P. Peruca & O.M. Arantes. 2007. Biology and taxonomy of Bacillus cereus,Bacillus anthracis, and Bacillus thuringiensis. Canadian Journal of Microbiology, 53: 673-687.Williams, G.M., A. Faraji, I. Unlu, S.P. Healy, M. Farooq, R. Gaugler, G. Hamilton & D.M.Fonseca. 2014. Area-wide group applications of Bacillus thuringiensis var. israelensis forcontrol of Aedes albopictus in residential neighborhoods: from optimization to operation. PLoSOne, 9(10): e110035.
Referencias bibliográficas y enlaces
Elena González BioscaDepartamento de Microbiología y EcologíaUniversitat de València
Lección 6.5. Biocontrol de enfermedades bacterianas de plantas mediante bacteriófagos
Biología molecular. Bases y aplicacionesMódulo 6. Aplicaciones de la biología
molecular en agricultura
Impacto de las enfermedades bacterianas de plantas
• Las bacterias patógenas de plantas son una de las
principales limitaciones de la producción agrícola
mundial y una grave amenaza para la sostenibilidad
del suministro de alimentos.
Impacto de las enfermedades bacterianas de plantas
• Las bacterias patógenas de plantas son una de las
principales limitaciones de la producción agrícola
mundial y una grave amenaza para la sostenibilidad
del suministro de alimentos.
• Estas bacterias causan efectos devastadores en el
crecimiento y desarrollo de las plantas y en sus
frutos, siendo responsables de importantes
pérdidas económicas en distintos cultivos.
Impacto de las enfermedades bacterianas de plantas
• Las bacterias patógenas de plantas son una de las
principales limitaciones de la producción agrícola
mundial y una grave amenaza para la sostenibilidad
del suministro de alimentos.
• Estas bacterias causan efectos devastadores en el
crecimiento y desarrollo de las plantas y en sus
frutos, siendo responsables de importantes
pérdidas económicas en distintos cultivos.
• El desarrollo de estrategias innovadoras de
control de estos patógenos bacterianos
respetuosas con el medio ambiente constituye un
desafío a alcanzar en el siglo XXI.
Principales bacterias patógenas de plantas (Mansfield et al., 2012).
Posición Patógeno bacteriano Enfermedad
1 Pseudomonas syringae Manchas foliares, necrosis y chancros en numerosos huéspedes
2 Ralstonia solanacearum Marchitez bacteriana ypodredumbre parda de la patata y
otras solanáceas3 Agrobacterium tumefaciens Tumores de frutales y rosal
4 Xanthomonas oryzae pv. oryzae Bacteriosis vascular del arroz
5 Xanthomonas campestris Manchas foliares, necrosis y chancros en numerosos huéspedes
Tumores en raíz(Clemson University,
Wikimedia Commons)
Manchas foliares(Scot Nelson,
Wikimedia Commons)
Necrosis en frutos(Chris Smart.
Wikimedia Commons)
Marchitez bacteriana(EG Biosca)
Bacteriosis del arroz(Donald Groth
Wikimedia Commons)
Posición Patógeno bacteriano Enfermedad
6 Xanthomonas axonopodispatovares
Chancros y manchas bacterianas de distintos cultivos. Cancrosis.
7 Erwinia amylovora Fuego bacteriano de las rosáceas
8 Xylella fastidiosa Enfermedad de Pierce en viña, clorosis variegada en cítricos, decaimiento rápido del olivo, ...
9 Dickeya dadantii y D. solani Marchitez y podredumbre blanda de patata y otras hortícolas
10 Pectobacterium carotovorum y P. atrosepticum
Podredumbre blanda de patata y otras especies hortícolas
Fuego bacteriano en peral (Ninjata-coshell, Wikimedia Commons)
Clorosis variegada en cítricos(A. Purcelll, Wikimedia Commons)
Podredumbre blanda (Scot Nelson, Flickr)
Cancrosis de los cítricos(Scot Nelson, Flickr)
Principales bacterias patógenas de plantas (Mansfield et al., 2012).
Métodos de control de bacteriosis de plantas• El control de las enfermedades bacterianas
(bacteriosis) de plantas mediante tratamientos
químicos o físicos:
• no suele ser eficaz
• genera resistencias a agroquímicos
• es costoso
• tiene gran impacto ambiental
Métodos de control de bacteriosis de plantas• El control de las enfermedades bacterianas
(bacteriosis) de plantas mediante tratamientos
químicos o físicos:
• no suele ser eficaz
• genera resistencias a agroquímicos
• es costoso
• tiene gran impacto ambiental
• Son necesarios nuevos métodos de control
eficaces y respetuosos con el medio ambiente como
el control biológico basado en bacteriófagos.
Métodos de control de bacteriosis de plantas• El control de las enfermedades bacterianas
(bacteriosis) de plantas mediante tratamientos
químicos o físicos:
• no suele ser eficaz
• genera resistencias a agroquímicos
• es costoso
• tiene gran impacto ambiental
• Son necesarios nuevos métodos de control
eficaces y respetuosos con el medio ambiente como
el control biológico basado en bacteriófagos.
• Bacteriófagos (fagos): virus que sólo infectan
bacterias (no afectan a células animales ni
vegetales). Son predadores naturales de bacterias.
Métodos de control de bacteriosis de plantas• El control de las enfermedades bacterianas
(bacteriosis) de plantas mediante tratamientos
químicos o físicos:
• no suele ser eficaz
• genera resistencias a agroquímicos
• es costoso
• tiene gran impacto ambiental
• Son necesarios nuevos métodos de control
eficaces y respetuosos con el medio ambiente como
el control biológico basado en bacteriófagos.
• Bacteriófagos (fagos): virus que sólo infectan
bacterias (no afectan a células animales ni
vegetales). Son predadores naturales de bacterias.
La mayoría de bacteriófagos
tienen cápsidas (cabezas
icosaédricas con genomas de
DNA de doble cadena) y
cola.
Placa basal
Cápsida
Cola
Fibras de la cola
Biocontrol de bacteriosis de plantas basado en fagos
• Los fagos, según su ciclo de vida, pueden ser:
• líticos o virulentos, se multiplican dentro de la
bacteria huésped que infectan y la destruyen
por lisis.
fago bacteria huésped
Lisis bacteria y liberación fagos
fago lítico
Biocontrol de bacteriosis de plantas basado en fagos
• Los fagos, según su ciclo de vida, pueden ser:
• líticos o virulentos, se multiplican dentro de la
bacteria huésped que infectan y la destruyen
por lisis.
• lisogénicos o atemperados, integran su
genoma en el de la bacteria huésped,
pudiéndole transferir genes no deseados.
fago bacteria huésped
Lisis bacteria y liberación fagos
No causan lisis bacteria
fago lítico
fago lisogénico
Biocontrol de bacteriosis de plantas basado en fagos
• Los fagos, según su ciclo de vida, pueden ser:
• líticos o virulentos, se multiplican dentro de la
bacteria huésped que infectan y la destruyen
por lisis.
• lisogénicos o atemperados, integran su
genoma en el de la bacteria huésped,
pudiéndole transferir genes no deseados.
• Los bacteriófagos líticos son interesantes como
potenciales agentes antimicrobianos frente a
patógenos bacterianos debido a su efecto
bactericida.
fago bacteria huésped
Lisis bacteria y liberación fagos
fago lítico
fago lisogénico
fago lítico
bacteria huésped
lisis
efectobactericida
aumento númerofagos en presencia
bacteria diana
No causan lisis bacteria
Biocontrol de bacteriosis de plantas basado en fagos
• Los fagos deben ser específicos de la especie bacteriana diana para no causar
efectos adversos sobre la microbiota del huésped a proteger ni sobre el medio
ambiente.
Fago lítico y específico de una bacteria patógena
lisisAcción lítica específica
Biocontrol de bacteriosis de plantas basado en fagos
• Los fagos deben ser específicos de la especie bacteriana diana para no causar
efectos adversos sobre la microbiota del huésped a proteger ni sobre el medio
ambiente.
Fago lítico y específico de una bacteria patógena
lisis
• Los fagos líticos y específicos frente a un patógeno bacteriano pueden ser
utilizados para la eliminación selectiva del mismo.
Acción lítica específica
Biocontrol de bacteriosis de plantas basado en fagos
• Ventajas:
1. Antimicrobianos naturales con acción bactericida
2. Alta especificidad por la bacteria huésped.
3. Multiplicación sólo en la bacteria huésped.
4. Inocuidad para otros seres vivos, incluida microbiota
beneficiosa de plantas a proteger.
5. Menor impacto ambiental.
6. Costes reducidos de producción.
7. Cóctel de fagos minimiza aparición de resistencias.
8. Menores restricciones legales para su uso.
9. Pueden combinarse con otras estrategias de control y/o
biocontrol.
10. Agricultura más ecológica y sostenible
Biocontrol de bacteriosis de plantas basado en bacteriófagos: ejemplos
Patógeno Huésped Reducción enfermedad
Referencia
E. amylovora manzano 56%(+antagonista) Boulé et al., 2011P. carotovorum patata 80-95% Czajkowski et al., 2015
R. solanacearumª tomate 50% Bhunchoth et al., 2015 R. solanacearum tomate 100% González-Biosca et al., 2017
X. fastidiosa vid significativa Das et al., 2015ª Ensayos realizados con cepas no pertenecientes a la actual especie R. solanacearum (Álvarez & Biosca, 2017).
Biocontrol de bacteriosis de plantas basado en bacteriófagos: ejemplos
Patógeno Huésped Reducción enfermedad
Referencia
E. amylovora manzano 56%(+antagonista) Boulé et al., 2011P. carotovorum patata 80-95% Czajkowski et al., 2015
R. solanacearumª tomate 50% Bhunchoth et al., 2015 R. solanacearum tomate 100% González-Biosca et al., 2017
X. fastidiosa vid significativa Das et al., 2015
Plantas de vid inoculadas con X.
fastidiosa tratadas (A) o no (B) con
fagos frente al patógeno (Das et al.,
2015)
A B B
ª Ensayos realizados con cepas no pertenecientes a la actual especie R. solanacearum (Álvarez & Biosca, 2017).
Otras aplicaciones biotecnológicas:
• Terapia fágica en medicina y veterinaria
• La aparición de bacterias patógenas multirresistentes a la
mayoría de los antibióticos supone una grave amenaza para la
salud pública y animal.
• La terapia fágica (uso de fagos como agentes terapéuticos
frente a infecciones bacterianas del ser humano y animales) es
una alternativa prometedora y respetuosa con la microbiota
propia beneficiosa y el medio ambiente.
Otras aplicaciones biotecnológicas:
• Terapia fágica en medicina y veterinaria
• La aparición de bacterias patógenas multirresistentes a la
mayoría de los antibióticos supone una grave amenaza para la
salud pública y animal.
• La terapia fágica (uso de fagos como agentes terapéuticos
frente a infecciones bacterianas del ser humano y animales) es
una alternativa prometedora y respetuosa con la microbiota
propia beneficiosa y el medio ambiente.
• Biocontrol de patógenos en alimentos con fagos
• Para reducir el riesgo de contaminación de alimentos con
bacterias patógenas, particularmente en productos frescos.
• Ejemplo de productos comerciales basados en fagos:
• Listex™ P100: reduce presencia de Listeria
monocytogenes en distintos alimentos frescos.
Abedon et al., 2017. Front Microbiol. doi: 10.3389/fmicb.2017.00981.
Álvarez & Biosca, 2017. Front. Plant Sci. doi: 10.3389/fpls.2017.01218
Bhunchoth et al. 2015. J. Appl. Microbiol. 118: 1023-1033. doi: 10.1111/jam.12763.
Boulé et al. 2011. Can.J.Plant Pathol. 33:308-317. doi: 10.1080/07060661.2011.588250
Buttimer et al. 2017. Front. Microbiol. 8: 1-15. doi: 10.3389/fmicb.2017.00034
Colavecchio & Goodridge. 2017. Microbiol Spectr. doi: 10.1128/microbiolspec.PFS-0017-2017
Czajkowski et al. 2015. PLoS One. 10(3):e0119812. doi: 10.1371/journal.pone.0119812.
Das et al. 2015: doi: 10.1371/journal.pone.0128902PMCID: PMC4479439
González-Biosca E, López M M, Álvarez B. 2017. Patente ES2592352 B2.
Kazi & Annapure. 2016. J Food Sci Technol. 53(3):1355-62. doi: 10.1007/s13197-015-1996-8.
Mansfield et al., 2012. Mol Plant Pathol. 13(6):614-29. doi: 10.1111/j1364-3703.2012.00804.x.
http://www.bancodepatentes.gva.es/patentes/-/asset_publisher/xoxK0ZQPxN2u/content/procedimiento-de-control-biologico-de-la-marchitez-causada-por-ralstonia-solanacearum-a-traves-del-uso-de-bacteriofagos-especificos-para-ello
Las imágenes y figuras utilizadas son propias o libres de derechos de autor.
Referencias bibliográficas y enlaces
Belén ÁlvarezDepartamento de Investigación Aplicada y Extensión AgrariaInstituto Madrileño de Investigación y Desarrollo Rural, Agrario y Alimentario (IMIDRA)
Biología molecular. Bases y aplicacionesMódulo 6. Aplicaciones de la biología
molecular en agricultura
Lección 6.6. Control biológico de bacteriosis en plantas mediado por agentes bacterianos
Introducción• Las estrategias de control de enfermedades vegetales
por acción de bacterias pueden ser muy diferentes y cabe
destacar que el desarrollo de la Biología Molecular ha
contribuido a muchas de ellas.
• La obtención de mutantes avirulentos derivados del tipo salvaje patógeno proporciona
agentes de control biológico adaptados al mismo nicho ecológico que la cepa parental,
que pueden desplazar al patógeno de su huésped susceptible.
• La Biología Molecular permite la comprensión de los
mecanismos de patogénesis bacteriana y los genes
implicados, posibilitando el desarrollo de nuevos agentes
de control biológico, genéticamente modificados a partir
del tipo salvaje patógeno, por eliminación o adición de
uno o más genes.
• Las propiedades antagonistas de un agente de control biológico se pueden incrementar
haciendo que exprese nuevos productos antimicrobianos efectivos contra el patógeno.
Control biológico de tumores causados por Agrobacterium (I)
• Agrobacterium tumefaciens es una especie bacteriana
que produce tumores en más de 600 especies de
plantas, con distribución mundial.
• Suele penetrar en la planta a través de las raíces.
Durante la infección, un fragmento de ADN (el ADN-T)
presente en un plásmido de virulencia (plásmidoTi) de
la bacteria, se transfiere al ADN de la planta.
• Este ADN integrado codifica enzimas que catalizan la
sobreproducción de auxinas y citoquininas en las
células vegetales transformadas, resultando en una
división celular desregulada y formación del tumor.
• Además, el ADN-T integrado codifica enzimas para la
síntesis de opinas, que sirven como fuente de nutrientes
para el patógeno, facilitando su multiplicación.
Control biológico de tumores causados por Agrobacterium (II)• En muchos casos, los tumores se pueden controlar con la cepa
K84 de Agrobacterium radiobacter, una bacteria no patógena
estrechamente relacionada con A. tumefaciens.
• La capacidad de control se debe principalmente a la biosíntesis
de una bacteriocina, la agrocina 84, junto con una eficiente
colonización de la raíz del huésped.
• Tanto los genes de la biosíntesis de la agrocina 84, como los
que confieren inmunidad a ésta y los genes que confieren
capacidad de transferencia por conjugación (genes tra), se
localizan en un plásmido de 47,7 kb de la cepa K84,
denominado pAgK84.
• La agrocina 84 es un análogo estructural del nucleósido de
adenosina, entra en la célula del patógeno a través de una
permeasa de agrocinopina y actúa inhibiendo la síntesis del
ADN.
Control biológico de tumores causados por Agrobacterium (III)
• Sin embargo, la transferencia de pAgK84 desde la cepa K84 a A. tumefaciens podría
producir cepas del patógeno resistentes a la agrocina 84.
• Para evitarlo, se construyó la cepa K1026 de
A. radiobacter, en la que se suprimió la región
tra del pAgK84.
• Se observó que la capacidad de la cepa
K1026 de colonizar raíces y controlar tumores
en planta era la misma que la de la cepa K84.
Control biológico de tumores causados por Agrobacterium (IV)
• Además de la agrocina 84, las cepas K84 y
K1026 de A. radiobacter también producen
agrocina 434, un análogo estructural del
nucleósido de citidina, constituyendo un factor
adicional al control biológico de los tumores.
• Este control biológico podría
incluso mejorarse si se
incrementara el número de
agrocinas producidas por las
cepas K84 y K1026, o bien si
se creara una nueva cepa
que fuera capaz de producir
más agrocinas.
Control biológico de marchitez causada por Ralstonia solanacearum (I)• Ralstonia solanacearum es una especie bacteriana
que produce marchitez en más de 400 especies de
plantas, entre ellas cultivos básicos para la
alimentación humana.
CitosolBacteriano
Factores de patogenicidad
Enzimashidrolíticas
Exopolisacárido Sistema de secreciónde tipo III
Genes de respuestahipersensible y patogenicidad (hrp)
EfectoresMotilidad
• Es un patógeno vascular que entra en el huésped a
través de las raíces, se multiplica a medida que
asciende por el xilema y marchita por colapso de los
vasos conductores.
• Para ello, cuenta con numerosos factores de
patogenicidad que forman parte de una compleja red
coordinada por el regulador transcripcional PhcA.
• La mayor parte de los genes de patogenicidad que
codifican para estos factores se encuentran en un
megaplásmido que, junto con el cromosoma,
conforman la totalidad del genoma de este patógeno.
Control biológico de marchitez causada por Ralstonia solanacearum (II)• Se ha ensayado el control biológico de esta bacteria con
mutantes avirulentos, tanto naturales como inducidos en
alguno de los genes de estos factores de patogenicidad.
• Lo más frecuente ha sido inducir una mutación en los
genes hrp, más de 20 genes agrupados en una región de
20-25 kb del megaplásmido bacteriano.
• Los mutantes hrp- fueron invasivos, pero colonizaron
menos que la cepa parental virulenta.
• En mezclas de cepas virulentas y sus mutantes, las
virulentas no pudieron colonizar eficientemente.
• El pretratamiento con mutantes hrp- redujo la
incidencia de la enfermedad.
• La capacidad para excluir cepas patógenas de su
huésped sugiere que los mutantes hrp- podrían ser
utilizados como agentes endófitos de control biológico.
Control biológico de marchitez causada por Ralstonia solanacearum (III)• También se ha propuesto para el control
biológico de esta bacteria el tratamiento con
cepas patógenas que, tras la infección con un
bacteriófago lisogénico, han perdido su
virulencia.
• Así, se observó que el marco abierto de lectura
orf15 del bacteriófago ϕRSM3 puede reprimir el
gen phcA del patógeno, impidiendo la aparición
de la enfermedad.
• La aplicación en planta de determinadas cepas
del patógeno infectadas con los bacteriófagos
lisogénicos ϕRSM1 o ϕRSM3 se ha patentado
para prevenir la marchitez bacteriana, ya que
las plantas tratadas con estas cepas avirulentas
son más resistentes al patógeno.
• Addy HS, Askora A, Kawasaki T, Fujie M & Yamada T. 2012. Loss of virulence of the phytopathogen
Ralstonia solanacearum through infection by ϕRSM filamentous phages. Phytopathology. 102: 469-477.
• Feng DX, Tasset C, Hanemian M, Barlet X, Hu J, Trémousaygue D, Deslandes L & Marco Y. 2012.
Biological control of bacterial wilt in Arabidopsis thaliana involves abscissic acid signalling. New
Phytologist. 194: 1035–1045 doi: 10.1111/j.1469-8137.2012.04113.x
• Frey P, Prior P, Marie C, Kotoujansky A, Trigalet-Demery D & Trigalet A. 1994. Hrp- mutants of
Pseudomonas solanacearum as potential biocontrol agents of tomato bacterial wilt. Appl. Environ.
Microbiol. 60: 3175-3181.
• Gunasekaran M & Weber DJ. (Eds). 1995. Molecular Biology of the Biological Control of Pests and
Diseases of Plants. CRC Press. ISBN 9780849324420.
• Kerr A. 2016. Biological control of crown gall. Australas. Plant Pathol. 45(1): 15–18.
• Penyalver R, Vicedo B y López MM. 2000. Use of the genetically engineered Agrobacterium strain
K1026 for biological control of crown gall. Eur. J. Plant Pathol. 106: 801-810.
• Yamada T, Fujie M & Kawasaki T. 2012. Agent for preventing bacterial wilt disease, and method for
preventing bacterial wilt disease. Japanese Patent WO/2012/147928. Tokyo: Japan Patent Office.
Imágenes tomadas de www.wikipedia.org y www.google.es free use.
Referencias bibliográficas y enlaces
Top Related