Laboratorio Professionalizzantedi Spettroscopia
Prof. Lorenzo Stella
Settore 5 Livello 1 Stanza 4
Tel.: 06-7259-4463
E-mail: [email protected]
La luminescenzaLuminescenza: emissione di luce da atomi, molecole o cristalli
eccitati elettronicamente.
Eccitazione luminosa:
~ns:fluorescenza
~ms:fosforescenza
Eccitazione chimica:Chemiluminescenza
Spettroscopia di fluorescenza:Vantaggi sperimentali
Elevatissima sensibilità (fino alla singola molecola).Flessibilità di campionamento (anche misure “in vivo”).Basso costo e semplicità della strumentazione.
Informazioni ottenibiliConcentrazione della sonda fluorescente (fluoroforo), fino a nM.
Ambiente chimico ed accessibilità al solvente del fluoroforo.
Dinamica dell’ambiente del fluoroforo.
Dinamica conformazionale e diffusionale della (macro)molecola fluorescente (nei ps-ns).
Numero e popolazione di specie presenti in soluzione.
Distanza tra due fluorofori
Alcuni esempi:•Processi di associazione, transizioni conformazionali, transizioni di fase, struttura di peptidi, dinamica di proteine, rilascio di farmaci, sensori e biosensori, pH intracellulare, imaging di cellule, etc. …
Il diagramma di Jablonski
ConseguenzeStokes shift (spostamento ad energie più basse).Regola di Kasha (invarianza spettrale con la lunghezza d’onda di eccitazione).Regola dell’immagine speculare.Sensibilità alla dinamica.
Tempo di vita dello stato eccitato
kr= costante di decadimento radiativo
kn.r.= costante di decadimento attraverso i processi non radiativi
N*= numero di molecole nello stato eccitato
dN *
dt (kr knr )N *
dN *
N * (kr knr )dt
dN *
N *N0
*
N*
(kr knr ) dt0
t
lnN *
N 0*
(kr knr )t
N *
N 0*e (kr knr ) t
N * N 0*e (kr knr ) t
t
I
I kr N *
I I0e
t
1
kr knr
tempo di vita
Fluorofori
Tutte le molecole assorbono.
In fase condensata (solidi, soluzione) sono fluorescenti solo molecole con probabilità di transizione radiativa molto elevata: sistemi ad elevata coniugazione.
Vantaggio per la sensibilità e la selettività della tecnica.
Il fluorimetroLampada
Monocromatore di eccitazione
Beam splitter
Lente
Lente
Monocromatore di emissione
ecc.
ecc.
Campione
PMT“segnale”
PMT“riferimento”
Computer
Osservabili: intensitàDipende da:
Concentrazione di fluoroforoEfficienza dell’assorbimento di radiazione ()Efficienza dell’emissione radiativa (resa quantica)
resa quanticafotoni emessi
fotoni assorbiti
decadimenti radiativi
totale decadimenti
kr
kr knr
F fotoni emessi = (fotoni assorbiti)
(I0 ' I ') (I0 ' I0 '10 A ' ) (1 10 A ' )
per A '1
(1 10 A ' )A ' ln10
F A C l
F A C l
Ecc.
Em.
10 A 10 A A0
ddA
(10 A )
A0
A 1 A ddA
e ln(10 A )
A0
1 Ad
dAe A ln10
A0
1 A ln10e A ln10 A0
1 Aln10
1 10 A A ln10
Osservabili: intensità e resa quantica
F
A0
F0
A0
F
A
A0
F0
0
F
A0
F0
A0
F
A
A0
F0
0
•L’intensità di fluorescenza è una misura relativa, perché dipende anche da:
•Intensità della lampada•Efficienza dei monocromatori•Banda passante utilizzata•Sensibilità del tubo fotomoltiplicatore
•Ossia dipende dallo strumento con cui è stata determinata
•Al contrario,•l’assorbanza è una misura assoluta [A=log(I0/I)]•la resa quantica è una misura assoluta [=kr/(kr+knr)]
Filtro interno
Ecc.
Em.
Ecc.
Em.
Campione diluito Campione concentrato
F I(centro cella )I010 A (ecc . )
2
A(ecc. )0.03 10 0.03
2 0.97
Assorbanza contro fluorescenza
Inoltre: l’assorbimento è un processo istantaneo, la fluorescenza no•sensibilità molto maggiore all’ambiente del cromoforo (processi non radiativi)•Sensibilità alla dinamica.
Osservabili: spettro di emissioneecc. fissa.
em. variabile.
F in funzione di em..
Rilassamento del solvente
H2OEtOHDMFc-Hex
Eh h
S0
S1 S1’
S0’
Ass.Em.
Esempi
Osservabili: spettro di eccitazioneem. fissa.
ecc. variabile.
F in funzione di ecc..
Se:unico fluoroforo
indipendente da ecc.
(unico stato eccitato).A<<1
Allora F(ecc.) A(ecc.)
•Altrimenti: separazione dei diversi cromofori
Smorzamento della fluorescenza (quenching)
Alcune molecole (quenchers), se si trovano in prossimità del fluoroforo eccitato, sono in grado di causare il suo decadimento non radiativo.
Misurando l’efficienza di smorzamento della fluorescenza si può determinare l’accessibilità del fluoroforo al quencher.
][1][1
][1
][][1
][
][
00
0
00
0
0
QKQk
k
Qk
kQ
k
k
k
kk
k
Qkkk
Qkkk
k
Qkkk
r
q
r
q
r
q
r
nrr
r
qnrr
qnrr
r
qnrnr
F0
F1K[Q ]
1a Esperienza
Spettri di assorbimento, emissione ed eccitazione.
Intervallo di dipendenza lineare di F da C.
Solvatocromismo
Processi di associazione
Il fluoroforo: PRODAN
d = 2.8 Debye
d = 10 Debye
6-propionil-2-(N,N-dimetilammino)naftalene(PRODAN)
H2OEtOHDMFc-Hex
Le ciclodestrine
•Molecole cicliche formate da unità glucopiranosio (6, 7, 8).
•Si ottengono per conversione enzimatica dell’amido.
Complessi di inclusione• La struttura 3-D delle ciclodestrine è a
tronco di cono, con una cavità apolare.• In soluzione acquosa formano complessi di
inclusione con molecole idrofobe.• Questa proprietà viene utilizzata per
modificare le proprietà della molecola ospite:
– solubilità– volatilità– tossicità– resistenza alla biodegradazione.
• I complessi di inclusione hanno inoltre molteplici applicazioni in campo catalitico e separativo.
• Poiché la ciclodestrina è chirale, i complessi di inclusione sono enantioselettivi.
Complessazioneciclodestrina-PRODAN
0
5
10
15
0 20 40 60 80 100 120
F-F
0
[-CD] (mM)
Applicazione: sensori a fluorescenza.
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