ĐẶT VẤN ĐỀ PHƢƠNG PHÁP/ KẾT QUẢ

MỤC TIÊU

TÀI LIỆU THAM KHẢO KẾT LUẬN

PHƢƠNG PHÁP/ KẾT QUẢ

Phân lập vi khuẩn từ một số chủng tuyến trùng EPN nguồn gốc Việt Nam.

Khảo sát vi khuẩn phân lập và định danh.

Khảo sát độc lực của các chủng phân lập trên sâu khoang Spodoptera litura.

Vật liệu

Tuyến trùng Steinernema guangdongense XT và Heterorhabditis indica CP 16 do TS. Nguyễn Ngọc Châu, Viện Sinh thái Tài

nguyên Sinh vật VN cung cấp.

Ấu trùng sâu khoang Spodoptera litura được nuôi trên thức ăn nhân tạo (Nguyễn Thị Hai và nnk, 2013).

HỘI NGHỊ CÔNG NGHỆ SINH HỌC TOÀN QUỐC KHU VỰC PHÍA NAM LẦN III - 2013

Nguyễn Hoài Hương*, Nguyễn Hoàng Anh Kha, Nguyễn Hiếu Dân, Nguyễn Thị Hai

Đại học Công nghệ TP. HCM

Tiểu ban: Công nghệ Vi sinh

Mã số báo cáo: P1-16

TÓM TẮT Hai chủng vi khuẩn được phân lập từ tuyến trùng diệt sâu (EPN) Steinernema guangdongense XT và Heterorhabditis indica CP16 giải phóng từ xác sâu (Spodoptera litura). Kết quả định danh bằng phương pháp nuôi cấy cũng như giải trình tự gene

rDNA 16S cho thấy chúng đều thuộc loài Serratia marcescens. Độc lực của các chủng vi khuẩn này trên Spodoptera litura cũng được khảo sát bằng phương pháp cho ăn và tiêm vào xoang máu. Kết quả cho thấy độc lực của các vi khuẩn tương tự như

vi khuẩn cộng sinh của tuyến trùng diệt sâu.

Từ khóa: giải trình tự gene rRNA 16S, độc lực trên sâu, tiêm xoang máu, tuyến trùng EPN, vi khuẩn cộng sinh.

Hình 3. Vai trò của VKCS: cộng sinh với tuyến

trùng và gây bệnh côn trùng (Goodrich-Blair, 2007) Hình 1. Vòng đời của EPN trong cơ

thể côn trùng và trong đất (Herbert et

al., 2007)

Hình 2. Ấu trùng

cảm nhiễm IJ chứa

khoảng 200 vi

khuẩn/IJ

(Steinernema

carpocapsae (trái),

Heterorhabditis

bacteriophora (phải)

Tuyến trùng gây bệnh côn trùng (EPN) ở pha IJ (ấu trùng cảm nhiễm) chứa vi khuẩn cộng sinh (VKCS) khi xâm nhập côn trùng

(miệng, hậu môn, lỗ thở), phóng thích VKCS vào xoang máu, diệt côn trùng, enzyme VKCS phân hủy xác côn trùng làm thức ăn

nuôi EPN (hình 1, 2, 3).

VKCS tuyến trùng EPN được khám phá cho đến nay bao gồm:

Xenorhabdus spp. cộng sinh Steinernema spp.

Photorhabdus luminescence cộng sinh Heterorhabditis spp. (Akhurst RJ. et al., 1980).

Serratia nematodiphia cộng sinh Heterorhabditidoides chongmingensis (Zhang CX. et al., 2008).

Serratia marcescens cộng sinh Caenorhabditis briggsae (Abebe E. et al., 2010).

Chúng tổng hợp nhiều enzyme protease, lipase, chitinase, protein độc và hợp chất thứ cấp. Bên cạnh nghiên cứu sản xuất EPN

chứa VKCS làm tác nhân trừ sâu sinh học, nghiên cứu khai thác riêng các VKCS của tuyến trùng cũng được quan tâm.

Giải trình tự gene rRNA 16S của các chủng phân lập và định danh

Chủng phân lập

SS1 (từ S.

guangdongense

XT)

SH1 (từ H. indica

CP16)

Kích thƣớc khuẩn lạc

trên nutrient agar, mm 1,5 – 2,0 2,5 – 3,0

Trạng thái khuẩn lạc/

màu sắc Nhớt/ đỏ Nhớt/ đỏ

Gram - -

Hình thái Que ngắn Que ngắn

Di động + +

TSI Glc+, Lac/Suc+,

H2S, sinh hơi-

Glc+, Lac/Suc+, H2S,

sinh hơi-

Lên men lactose - -

Indol, H2S - -

Catalase + +

Khử nitrate + +

Lipase trên thạch

Tween 20, CaCl2 + +

Protease trên thạch

gelatine + +

Protease trên thạch

casein + +

Chitinase trên thạch

1% dung dịch keo

chitin

+ +

Hình 5. Cây phát sinh loài được thiết lập theo giải

thuật NJ (neighbor joining) xác định mối quan hệ giữa

các chủng phân lập SS1 và SH1 với các chủng Serratia

spp. và vi khuẩn cộng sinh tuyến trùng truyền thống

theo Suzuki et al., 1996 (trong ngoặc đơn là mã số truy

cập trên http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

Hình 8. Thí nghiệm tiêm trực tiếp tế bào các chủng phân lập

vào sâu khoang Spodoptera litura. A, E) Sâu khoang chết do

tuyến trùng H. CP16 và S. XT ; B, F) Sâu khoang chết sau khi

tiêm SH1 và SS1; C,G) Chủng SH1 và SS1 phân lập từ H.

CP16 và S. XT và từ sâu chết do tiêm vi khuẩn trên thạch

NBTA ; D, H) Khả năng di động của SH1 và SS1 trên thạch NA.

Phân lập vi khuẩn từ tuyến trùng Steinernema guangdongense XT và

Heterohabditis indica CP16

Hai chủng SS1 và SH1 tình cờ được phân lập từ tuyến trùng EPN nguồn gốc Việt Nam Steinernema guangdongense XT và

Heterorhabditis indica CP 16. Khảo sát hình thái khuẩn lạc, thử nghiệm sinh lý và sinh hóa cho thấy các chủng này không phải là vi

khuẩn cộng sinh tuyến trùng truyền thống Xenorhabdus spp. và Photorhabdus luminescens. Giải mã trình tự gene rRNA 16S khẳng

định các chủng phân lập thuộc loài Serratia marcescens. Khả năng diệt sâu ở nồng độ thấp trong thời gian ngắn và dấu hiệu sâu chết

sau thử nghiệm vi khuẩn bằng phương pháp tiêm trực tiếp vào xoang máu và cho ăn cho thấy các chủng này có thể liên quan đến

hoạt lực diệt sâu của tuyến trùng nguồn phân lập của chúng. Những nghiên cứu tiếp theo đang tiến hành nhằm xác định mối quan hệ

giữa các vi khuẩn này và tuyến trùng, cũng như hoạt tính sinh học của các sản phẩm trao đổi chất khác của chúng .

* 475A Điện Biên Phủ, P. 25, Q. BT, E-mail: nh.huong@hutech.edu.vn

Hình 4. Khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào của SS1

(ABCD) và SH1 (EFGH); A, E : Hoạt tính lipase trên thạch

Tween 20 và CaCl2; B,F : Hoạt tính phân giải gelatin; C, G : hoạt

tính phân giải casein; D, F : hoạt tính phân giải chitin.

Bảng 1. Bảng tóm tắt đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa các

chủng phân lập

Phản ứng PCR:

Mồi 16S-F: AGA GTT TGA TCC

TGG CTC AG và 16S-R: ACG

GCT ACC TTG TTA CGA CTT

Chu kỳ luân nhiệt: 1 chu kỳ

95oC/5 phút và 40 chu kỳ gồm

94oC/30giây, 56oC/30 giây;

72oC/1 phút; cuối cùng 1 chu kỳ

72oC/10phút.

Giải trình tự trên máy 3130

Genetic Analyzer (Applied

Biosystems) do Cty Nam Khoa

Biotek thực hiện.

(KF534509)

(KF534508)

So sánh trên GENBANK:

SH1 trùng SS1 99,8%,

Serratia marcescens 99,7-

100%, S. nematodiphia

99,6%, S. entomophila

96,7%, Photorhabdus spp.

và Xenorhabdus spp. 89-

90%, cho thấy hai chủng

SH1 và SS1 có thể xếp vào

loài Serratia marcescens.

Tái phân lập vi khuẩn từ sâu chết thu đƣợc các vi

khuẩn đƣa vào, đặc trƣng ở màu đỏ của prodigiosin,

một hợp chất thứ cấp của S. marcescens. Cần làm rõ

vai trò SS1 và SH1 đối với EPN, hội sinh

(commensalism) hay tƣơng hỗ (mutualism) và nghiên

cứu ứng dụng chúng trong bảo vệ thực vật.

Độc lực của vi khuẩn phân lập trên sâu

Sau 30 giờ gần 100% sâu chết ở nồng độ 23 cfu

SH1/sâu và 43 cfu SS1/sâu (hình 6). Tiêm châu

chấu với E.coli K-12 HB101 > 106 cfu/con, tỉ lệ

chết chỉ là 5% sau 72 giờ (Khan & Goldsworthy,

2007). Tiêm S. nematodiphia DZ0503SBS1 vào

Galleria mellonella, LD50 = 50 tế bào/con sau 48

giờ (Zhang et al., 2008).

SS1 và SH1 đều có hoạt lực diệt sâu mạnh.

Trên thức ăn nhân tạo 12 cfu/mm2 SH1 và 22 cfu/mm2 SS1 gây sâu chết 50% sau 110 giờ. Trên lá thầu dầu ở

nồng độ tƣơng đƣơng (16,97 cfu/mm2 SH1) sâu chết 70% sau 110 giờ (hình 7). Dấu hiệu sâu chết là bụng

sâu chuyển sang màu đỏ, giống khi tiêm vi khuẩn, cũng giống trƣờng hợp sâu khoang chết do EPN nguồn

phân lập của các vi khuẩn này (hình 8).

Hình 7. Tỷ lệ chết của sâu

khoang khi A, B) SS1 và SH1

nhiễm trên bề mặt thức ăn

nhân tạo, C) SH1 nhiễm trên

bề mặt lá thầu dầu.

Hình 6. Tỷ lệ chết của sâu khoang Spodoptera litura khi tiêm S. marcescens SH1 (A) và

S. marcescens SS1 (B) vào xoang máu

Điểm khác biệt cơ bản giữa VK phân lập và Xenorhabdus spp. và Photorhabdus spp. (VKCS truyền thống của

Steinernema spp. và Heterorhabditis spp.) thể hiện ở hình thái, màu sắc khuẩn lạc, catalase+, khử nitrate+. Điểm giống

nhau quan trọng là ở hoạt tính enzyme và khả năng di động.

Abebe E, Jumba M, Bonner K, Gray V, Morris K, Thomas WK., 2010. An entomopathogenic Caenorhabditis briggs.. J Exp Biol., 213: 3223-

3229.

Akhurst R., Boemare N., 2006. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. In: Dworkin M (ed) The Prokaryotes, 6. Springer Science and

Business Media LLC Prokaryotes, 451-494.

Goodrich-Blair H, Clarke DJ., 2007. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Mol

Microbiol. 64:260-268.

Herbert EE & Goodrich-Blair H (2007). Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nature Reviews Microbiology, 5, 634–646.

Nguyễn Thị Hai, Nguyễn Thị Ngọc Hạnh, Nguyễn Ngọc Phong, Lê Thị Tiền, Hồ Hoàng Đăng Khoa, 2013. Xác định phổ ký chủ và khả năng

phòng trừ sâu hại của tuyến trùng Heterorhabditis indica CP16 và Steinernema guangdongense XT. Hội nghị CNSH toàn quốc lần III-2013 ngày

22.11.2013, P1-22.

Zhang C. X., Yang S. Y., Xu M. X., Sun J., Liu H., Kan F., Sun J., Lai R., Zhang K. Y., 2008. Serratia nematodiphila sp. nov., associated

symbiotically with the entomopathogenic nematode Heterorhabditidoides chongmingensis (Rhabditida: Rhabditidae), Int J Syst Evol Microbiol, 59:

1603-1638.