DIPARTIMENTO DI FARMACOLOGIA PRECLINICA E CLINICA PROGETTO
Monitoraggio della terapia enzimatica sostitutiva (ERT) nella malattia di
Anderson-Fabry
RESPONSABILE SCIENTIFICO: Prof. Gloriano Moneti COLLABORATORI: F. Boscaro, G. La Marca, G. Bartolucci, G. Pieraccini.
E’ stato messo a punto un metodo per il dosaggio dei livelli plasmatici ed urinari di
globotriaosylceramide (Gb3) in pazienti colpiti dalla malattia di Anderson-Fabry.
L’analisi prevede l’uso della tecnica Flow Injection Analysis-Electrospray
Ionization-Tandem Mass Spectrometry (FIA-ESI-MS/MS). Essendo il metodo molto
sensibile, la preparazione dei campioni di plasma ed urine è molto rapida, infatti i
campioni sono solo diluiti 50 volte ed iniettati. La quantificazione degli analiti
avviene in uno strumento a triplo quadrupolo (QqQ), con la modalità Multiple
Reaction Monitoring (MRM). Sono stati presi in considerazione i seguenti
parametri: la linearità della risposta degli standard di calibrazione, la precisione
delle analisi, l’accuratezza e il limite di rivelazione del metodo. La procedura
proposta permette una rapido ed accurato dosaggio della globotriaosylceramide in
campioni biologici. I dati ottenuti da volontari sani e da pazienti colpiti dalla malattia
di Anderson-Fabry suggeriscono un ruolo potenziale di questa tecnica per
monitorare l’efficacia della terapia sostitutiva con enzima prodotto da DNA
ricombinante (ERT).
DIPARTIMENTO DI FARMACOLOGIA PRECLINICA E CLINICA
DIPARTIMENTO DI FARMACOLOGIA DIPARTIMENTO DI FARMACOLOGIA PRECLINICA E CLINICAPRECLINICA E CLINICA
TITOLO DEL PROGETTO:
RESPONSABILE SCIENTIFICO: Prof. Gloriano Moneti
COLLABORATORI: F. Boscaro, F. Luceri, G. la Marca, G.Bartolucci e G. Pieraccini.
Monitoraggio della terapia enzimatica sostitutiva (ERT) nella malattia di Anderson-FabryMonitoraggio della terapia enzimatica sostitutiva (ERT) nella malattia di Anderson-Fabry
Ospedale di Ospedale di CareggiCareggi, Firenze, FirenzeUnitUnitàà di Citogenetica e Geneticadi Citogenetica e GeneticaDr. F. Dr. F. TorricelliTorricelli
UniversitUniversitàà di Firenzedi FirenzeCISMCISMProf. G. MonetiProf. G. Moneti
Ospedale di Ospedale di CareggiCareggi, Firenze, FirenzeUnitUnitàà di Neuropsichiatriadi NeuropsichiatriaDr. M.R. ScordoDr. M.R. Scordo
Ospedale di Ospedale di CareggiCareggi, Firenze, FirenzeUnitUnitàà di Cardiologiadi CardiologiaDr. M. Dr. M. CiaccheriCiaccheri
UniversitUniversitàà di Firenzedi FirenzeDipartimento di NeurologiaDipartimento di NeurologiaDr. W. BorsiniDr. W. Borsini
UniversitUniversitàà di Firenzedi FirenzeDipartimento di OftalmologiaDipartimento di OftalmologiaDr. A. SodiDr. A. Sodi
Ospedale di Ospedale di CareggiCareggi, Firenze, FirenzeUnitUnitàà di di NefrologiaNefrologia (Coordinatore)(Coordinatore)Dr. F. Dr. F. MartinelliMartinelli
Centro di riferimento della Toscana per la malattia di
Anderson-Fabry
Centro di riferimento della Centro di riferimento della Toscana per la malattia di Toscana per la malattia di
AndersonAnderson--FabryFabry
©© Blackwell Science Ltd.Blackwell Science Ltd.
William Anderson (1842–1900)William Anderson (1842–1900) Johannes Fabry (1860–1930)Johannes Fabry (1860–1930)
Malattia di ANDERSON - FABRYMalattia di ANDERSON Malattia di ANDERSON -- FABRYFABRY
EREDITARIETA’EREDITARIETA’
x y xx*
x x x y xx* x*y
x*y x x
xx* x y xx* x y
incidenza stimata:incidenza stimata:1 : 40,000 maschi1 : 40,000 maschi
In Italia:In Italia:500 : 20 M maschi500 : 20 M maschi
Human Globotriaosylceramide (Gb3)Human Globotriaosylceramide (Gb3)OOH
OHHO O
CH2OH
OH2CH
HO OH
O OH2CH
HO OH
O
O O
CH
2CH CH
NH
C
O
2CH( )
)(CH214-24 3
CH
OH
CH CH 12 3CH
α–Galactosidase A
• L’ assenza o la ridotta attività dell’enzima è responsabile di un difetto metabolico che si manifesta nella sindrome di Anderson-Fabry
• la mancata idrolisi del legame α galactosidico comporta un accumulo di Gb3 prevalentemente nei fluidi biologici e nelle cellule endotelialidei vasi sanguigni
• questo accumulo puo’ manifestarsi anche dopo molto tempo con patologie a danno di vari organi
gangli e celluleperineurali del SNA
cellule epitelialidella cornea e del rene
cellule del tessutoconnettivo, miocardicoe reticoloendoteliale
fluidi biologicicellule muscolari lisce del sistema
cardiovascolare -renale
lisosomi dell’endotelio vascolare
Malattia di Malattia di AndersonAnderson--FabryFabry
Angiocheratoma Opacità della cornea
FIA-ESI-TOF (MARINER)
FIA-ESI-TOF (MARINER)
Mass (m/z)1126.0 1137.4 1148.8 1160.2 1171.6 1183.0
50
100%
Inte
nsity
OOH
OHHO O
CH2OH
OH2CH
HO OH
O OH2CH
HO OH
O
O O2CH CH
NH
C
O
2CH( )
2 )(CH
CH
OH
CH CH 12 3CH
R
1156.77081166.5732
1130.7537
1154.7546
1128.7435
1158.7747
R=22:1
R=22:0
R=24:2
R=24:1 R=24:0C55H80N11O17
1172.75931174.7758
ISIS
Measured m/z Calculate m/z Error (ppm) DBE Formula1128,74351 1128,73804 4,84793 5,5 C58H107NO18Na1130,75378 1130,75369 0,08136 4,5 C58H109NO18Na1154,75466 1154,75369 0,84173 6,5 C60H109NO18Na1156,77084 1156,76934 1,29837 5,5 C60H111NO18Na1158,77476 1158,78499 -8,82670 4,5 C60H113NO18Na1172,75931 1172,76425 -4,21461 5,5 C60H111NO19Na1174,77583 1174,77991 -3,46688 4,5 C60H113NO19Na
LCLC--ESIESI--MS/MSMS/MS
HPLCElectrospray
Interface
Triple QuadrupoleMS/MS
Q1 Q2 Q3Autosampler
Flow Injection Analysis(FIA)
HPL
C C o
lum
n
4 6 8 10 12
5 10 15 20 25 30 35
Time, min
HPLCPlasma
FIA - Plasmacalibration curve
Time, min
1 Sample
15 Samples2.5 µg/mL
5 µg/mL
10 µg/mL
20 µg/mL
0 µg/mL
C16:0
C18:0
C20:0C22:1C24:2
C22:0C24:1
C24:0
MRM
1158.7 996.71156.7 994.71154.7 992.71130.7 968.71128.71102.71074.71046.7
966.7940.7912.7884.7
C24:0
C16:0
C24:1C24:2C22:0C22:1C20:0C18:0
980µL ofAcetone : MeOH : H2O
45 : 45 : 10 v/v
20 µL of plasma
+980µL of
Acetone : MeOH : H2O45 : 45 : 10 v/v
20 µL of urine
+
PLASMAPLASMA
Proteine Precipitation
and centrifugation10.000 g x 5 min
800 µL liquid phase
800 µL liquid phase
FIAFIA--ESIESI--MS/MSMS/MS( PE SCIEX API 365 )
0.2 µL Inj. 0.2 µL Inj.
1:50 Dilution 1:50 Dilution
URINEURINE
4 6 8 10 12 Time, min
1000
2000
3000
4000
Inte
nsity
, cps
4 6 8 10 12 Time, min
1000
2000
3000
Inte
nsity
, cps 2 weeks therapy
Basal
C16:0
C18:0C20:0C22:1C24:2
C22:0C24:1
C24:0
Plasma
UrineBasal
2 weeks therapy
Gb3 in AFD male biological fluidsGb3 in AFD male biological fluids
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
Gb3
(µg/
mL)
0 0 0 0 2 4 8 12 16 20 25 28 30 32 34 38 40 42 46 50Weeks
Plasma Gb3: AFD Male (V.A.) TKT
0,02,04,0
6,08,0
10,012,0
14,016,018,0
Gb3
(mg/
24h)
0 0 0 2 4 8 12 16 20 25 28 30 32 34 36 38 40 42 46 50
Weeks
Urine Gb3: AFD Male (V.A.) TKT
0,0
2,04,06,08,0
10,0
12,0
14,016,018,0
Gb3
(mg/
24h)
0 1 4 8 12 24 28 32 36 40 48 60 84 100
weeks
Urine Gb3: AFD Female (C.G.) TKT
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
Gb3
ug/
mL
0 1 4 8 12 24 28 32 36 40 48 60 84Weeks
Plasma Gb3: AFD Female (C.G.) TKT
ERT follow upERT follow up
3,00
8,00
13,00
18,00
23,00Gb3 Plasma (µg/mL)Gb3 Plasma (µg/mL)
Basa
le4
Mes
e
Basa
le
5 M
ese
7 m
ese
6,5
mes
e6
mes
e
9 m
ese
1 M
ese
1 Se
ttim
ana
2 M
ese
3 M
ese
.
♂Fa
bry
♀Ca
rrier
♂F a
bry
♂Fa
bry
♂Fa
b ry
♂Fa
b ry
♀Ca
rrier
♀Ca
rrier
♀Ca
rrier
♀Ca
rrier
♀Ca
rrier
♀Ca
rrier
Gb3 Urine (nmoli/g Creatinine)Gb3 Urine (nmoli/g Creatinine)
0,00
4,00
8,00
12,00
16,00
20,00
1 M
ese
9 M
ese
Basa
le
Basa
le 4 M
ese
7 M
ese
6,5
Mes
e
1 Se
ttim
ana
2 M
ese
3 M
ese
♂Fa
bry
♀Ca
rrier
♂F a
bry
♀Ca
rrier
♀Ca
rrier
♀Ca
rrier
♀Ca
rrier
♀Ca
rrier
♂Fa
bry
♀Ca
rrier
♀Ca
rrier
♀Ca
rrier
♂Fa
b ry
♂Fa
b ry
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