DETERMINAZIONE DELL’ATP DETERMINAZIONE DELL’ATP IN IN
BIOLUMINESCENZA BIOLUMINESCENZA
METODO DI SCREENING PER IL CONTROLLO METODO DI SCREENING PER IL CONTROLLO
MICROBIOLOGICO DELLE ACQUE PROFONDEMICROBIOLOGICO DELLE ACQUE PROFONDE
Dr.ssa E.Ciccarelli
Laboratorio Dip. Perugia ARPA UMBRIA
SCOPO DELLA SPERIMENTAZIONEScopo dello studio è stato quello di valutare il possibile utilizzo di indicatori di contaminazione microbiologica, proposti da IRSA-CNR, nella sorveglianza del rischio di inquinamento degli acquiferi e di verificare l’applicabilità di tali metodologie analitiche più rapide direttamente in situ.
Determinazione del contenuto globale di microrganismi presenti nelle acque profonde mediante misura dell’ATP con il metodo bioluminometrico. Determinazione sugli stessi campioni dei parametri microbiologici con i metodi colturali tradizionali.Comparazione secondo criteri statistici dei risultati ottenuti.
ATTIVITA’ SPERIMENTALE
PERCHE’ L’ATP?
L’ATP è una molecola presente in tutti le cellule metabolicamente attive , siano di origine procariotica che eucariotica, in quanto fornisce l’energia necessaria per le diverse attività cellulari .La misura dell’ATP è utilizzata pertanto come indicatore del contenuto di cellule vitali presenti in una determinata matrice.
PRINCIPIO DEL METODOPRINCIPIO DEL METODOLa misura dell’ ATP presente nelle cellule batteriche, concentrate mediante filtrazione su membrana, viene determinata utilizzando l’enzima luciferasi di lucciola, che catalizza in modo specifico l’idrolisi dell’ATP. La quantità di luce prodotta da questa reazione enzimatica è direttamente proporzionale alla quantità di ATP presente nel campione ed è misurata con un luminometro.
APPLICAZIONIAPPLICAZIONILa determinazione dell’ATP trova applicazione nel controllo diLa determinazione dell’ATP trova applicazione nel controllo diqualità nell’ industria alimentare, farmaceutica e cosmetica, nequalità nell’ industria alimentare, farmaceutica e cosmetica, nel l monitoraggio dell’igiene degli impianti e della qualità delle mamonitoraggio dell’igiene degli impianti e della qualità delle materie terie prime. prime. E’ stato proposto un metodo APAT IRSAE’ stato proposto un metodo APAT IRSA--CNR (9030) che prevede la CNR (9030) che prevede la misura dell’ATP ai fini della valutazione della misura dell’ATP ai fini della valutazione della biomassa biomassa totale in totale in ambienti acquatici.ambienti acquatici.
L’attivita’ sperimentale è stata svolta su campioni di acque sotterranee prelevati in 2 aree del reticolo di monitoraggio regionale.Gli acquiferi controllati microbiologicamente per tale progetto sono caratterizzati da una qualità delle acque piuttosto scadente a causa dell’elevato impatto antropico presente in tali aree.
Sono state eseguite 3 campagne di prelievo : la prima nel 2000-2001(solo Conca Eugubina) la seconda nel 2003 e l’ultima nel 2005. I campioni esaminati sono stati complessivamente 65. Per alcuni campioni la misura dell’ATP è stata eseguita sia in campo che inLaboratorio.
CONCA EUGUBINACONCA EUGUBINA
MEDIA VALLE DEL TEVEREMEDIA VALLE DEL TEVERE
MATERIALI E STRUMENTAZIONE
LUMINOMETRO (Pallchek-PALL)
Funnel sterili da 0.45μm
Reagenti per estrazione ATP Complesso enzimatico luciferina/luciferasiSoluzione di riferimento di ATP
Pipette con volume regolabileMateriale monouso sterile: puntali-spatole-supporti-vials-pinzette-provette-
guantiFrigorifero (2-8°C)Acqua distillata sterilePompa e beuta da vuotoBottiglie sterili
PROCEDURA OPERATIVAPROCEDURA OPERATIVAPrelievo dei campioni in condizioni di sterilitàPrelievo dei campioni in condizioni di sterilità(APAT (APAT IRSAIRSA--CNRCNR MetMet 6010 Man 29/03)6010 Man 29/03)
Trasporto e conservazione a 4Trasporto e conservazione a 4--10°C10°CTaratura strumento(Curva ATP standard)Taratura strumento(Curva ATP standard)
Controllo materiali e reattivi (ATP standardControllo materiali e reattivi (ATP standard--acqua acqua distillata sterile)distillata sterile)
y = 0,9753x - 0,5683R2 = 0,9974
0,00000
2,000004,00000
6,00000
8,00000
0,00000 1,00000 2,00000 3,00000 4,00000 5,00000 6,00000 7,00000 8,00000
ATP
RL
U
Filtrazione di un’aliquota del campione su membrana Filtrazione di un’aliquota del campione su membrana con con funnel funnel sterilisterili
Posizionamento della membrana con pinzette sterili su Posizionamento della membrana con pinzette sterili su apposita piastra con supportoapposita piastra con supporto
Estrazione dell’ATP Estrazione dell’ATP intracellulare intracellulare (aggiunta (aggiunta ExtractantExtractant))
Aggiunta Aggiunta complesso enzimatico complesso enzimatico luciferinaluciferina//luciferasiluciferasi
reazione di bioluminescenza
+ O2 ++ O2 + DD--luciferinaluciferina ++ luciferasiluciferasi ossiluciferinaossiluciferina +AMP +CO2 + +AMP +CO2 + LUCELUCE
Misurazione emissione luminosa in RLU(Unità Misurazione emissione luminosa in RLU(Unità di Luminescenza Relative) e registrazione dei di Luminescenza Relative) e registrazione dei dati su apposita scheda di campodati su apposita scheda di campo
ATPATP
SCHEDA REGISTRAZIONE DATI BIOLUMINOMETRO IN CAMPOProgetto: Progetto APAT 99Unità Ambientale: Pozzo Localizzazione___________________________________________________________________
Comune_________________________________________________________________________
Cod. __________________________ Cod. LIMS___________________________________
Reattivi ricostituiti il: ATPreagent Exstractant KitATPStandard
Controlli:Piastra= RLU…………………………………………………………………………(<20RLU)
Piastra+ Supporto = RLU……………………………………………………………(<20RLU)
Piastra+ Supporto+ Exstractant100μl + ATPReagent100μl=RLU……………………………(<80RLU)
Controllo Negativo con lettura su membrana (Acqua MilliQ sterile 100ml +100ml di lavaggio+ Exstractant150μl+ ATPReagent100μl):
RLU……………………………. ……………………………………………..(<150RLU)Controllo Positivo (ATP):ATP non dil. RLU =
1°dil. RLU = 2°dil. RLU = 3°dil. RLU =
4°dil. RLU = 5°dil. RLU = 6°dil. RLU =
CAMPIONE I° replica RLU………………………………………………………………………..
CAMPIONE II° replica RLU……………………………………………………………………….NOTE:
DATA________________________ORA__________________________________N°_____________
Operatori:_____________________________________RAPP. DI PROVA N°____________________
Semina campioni per esame colturale Semina campioni per esame colturale secondo metodi utilizzati normalmente secondo metodi utilizzati normalmente per il controllo microbiologico delle per il controllo microbiologico delle acqueacque
PARAMETRI MICROBIOLOGICI DETERMINATI CONPARAMETRI MICROBIOLOGICI DETERMINATI CON
METODI COLTURALIMETODI COLTURALI
Escherichia Escherichia coli coli (MPN/100ml)(MPN/100ml)
CARICA MICROBICA A 22CARICA MICROBICA A 22°° (UFC/ml)(UFC/ml)
CARICA MICROBICA A 37CARICA MICROBICA A 37°° (UFC/ml)(UFC/ml)
COLIFORMI FECALI COLIFORMI FECALI (UFC/100ml)(UFC/100ml)
COLIFORMI TOTALI COLIFORMI TOTALI (UFC(UFC--MPN/100ml)MPN/100ml)
ENTEROCOCCHI ENTEROCOCCHI (UFC/100ml)(UFC/100ml)
I metodi di riferimento utilizzati ( Rapporti ISTISAN, APAT IRSA-CNR, UNI EN ISO ) prevedono per la determinazione dei microrganismi indicatori di inquinamento (coliformi totali, coliformi fecali,enterococchi e Escherichia coli ) la tecnica delle membrani filtranti (MF) e dei tubi multipli (MPN) e per il conteggio della carica microbica la tecnica dell’inclusione su agar.
Elaborazione dati e comparazione dei valori Elaborazione dati e comparazione dei valori di RLU ottenuti con i dati microbiologicidi RLU ottenuti con i dati microbiologici
Correlazione CB 37°C/RLU
y = 0,4894x + 4,0416R2 = 0,6041
0,0000
1,0000
2,0000
3,0000
4,0000
5,0000
6,0000
0,0000 0,5000 1,0000 1,5000 2,0000 2,5000
Confronto fra Cariche microbiche e i valori di RLU
1,0E+00
1,0E+01
1,0E+02
1,0E+03
1,0E+04
1,0E+05
1,0E+06
RL
U-150
50
250
450
650
850
1050
1250
1450
1650
1850
RLUCB 37°CCB 22°C
UF
C/M
L
Il metodo bioluminometrico utilizzato per la determinazione dell’ATP è risultato dal punto di vista operativo:
Di facile applicazioneDi facile applicazioneRapido rispetto ai metodi tradizionali (circa Rapido rispetto ai metodi tradizionali (circa
30min. a campione )30min. a campione )Strumentazione richiesta non ingombrante e Strumentazione richiesta non ingombrante e
facilmente trasportabile con alimentazione a facilmente trasportabile con alimentazione a batteriabatteria
Eseguibile anche in campo Eseguibile anche in campo (laboratorio mobile fornito di frigorifero 2-8°C e di un piano di appoggio che possa essere sottoposto a pulizia/disinfezione)
Costo reattivi circa 11€ ad analisiCosto reattivi circa 11€ ad analisi
LABORATORIO MOBILE
I risultati ottenuti sono stati sottoposti ad analisi statistica mediante l’applicazione del test di correlazione.
Grafici di correlazione
RISULTATI E DISCUSSIONE
Carica microbica 22°C/ ATP
y = 0,0001x + 151,03R2 = 0,114
0
500
1000
1500
2000
0,0E+00 1,0E+06 2,0E+06 3,0E+06 4,0E+06 5,0E+06 6,0E+06
RLU
ufc
/ml
Carica microbica 37°C/ ATP
y = 9E-05x + 61,129R2 = 0,0774
0
500
1000
1500
2000
0,0E+00 1,0E+06 2,0E+06 3,0E+06 4,0E+06 5,0E+06 6,0E+06
RLU
ufc
/ml
dati relativi a 64 campioni dati relativi a 64 campioni
Escherichia coli /ATP
y = -0,00000x + 1,86571R2 = 0,00001
05
101520253035
0,0E+00 5,0E+04 1,0E+05 1,5E+05 2,0E+05 2,5E+05 3,0E+05 3,5E+05 4,0E+05 4,5E+05
RLU
MP
N/1
00
ml
Coliformi totali/ ATP
y = -9E-05x + 339,77R2 = 0,006
01000200030004000500060007000
0,0E+00 1,0E+06 2,0E+06 3,0E+06 4,0E+06 5,0E+06 6,0E+06
RLU
ufc
/100m
lColiformi fecali/ ATP
y = 4E-06x + 16,592R2 = 0,0027
0
100
200
300
400
500
0,0E+00 1,0E+06 2,0E+06 3,0E+06 4,0E+06 5,0E+06 6,0E+06
RLU
ufc
/100
ml
Enterococchi /ATP
y = -5E-07x + 8,5641R2 = 0,0004
020
4060
80100
120140
0,0E+00 1,0E+06 2,0E+06 3,0E+06 4,0E+06 5,0E+06 6,0E+06
RLU
ufc
/100
ml
dati relativi a 48 campioni
dati relativi a 61 campionidati relativi a 61 campioni
dati relativi a 24 campioni
I valori di luminescenza (RLU) ottenuti per le acque sotterranee controllate con il metodo bioluminometriconon sono risultati correlabili in maniera significativanon sono risultati correlabili in maniera significativacon i parametri microbiologici ricercati,con i parametri microbiologici ricercati, neanche con la conta dei batteri mesofili e termofili.L’assenza di correlazione può essere spiegata tenendo conto sia dell’ aspecificitàaspecificità che caratterizza la misura dell’ATP sia delle caratteristiche dei metodi colturali. Infatti il metodo metodo bioluminometricobioluminometrico rileva una risposta biologica complessiva mentre i metodi colturalimetodi colturali , anche quelli meno selettivi, come quelli utilizzati per la carica a 37 e 22°C, permettono di evidenziare non tutti i microrganismi presenti, ma solo quelli per i quali le condizioni ambientali da noi selezionate (temperatura, composizione terreno, tempi di incubazione ecc…) risultano ottimali.
Nell’interpretazione di tali risultati c’è da considerare inoltre che il contenuto di ATP estratto risulta dipendente non solo dalla concentrazione numericadella flora microbica presente nella matrice acquosa, ma anche dalla sua composizione. Infatti i parametri microbiologici (CB 37°,CB 22°,CT,CF) che sono stati correlati con i valori di RLU, rappresentano gruppi eterogenei di microrganismi aerobi e anaerobi facoltativi , costituiti da specie con differenti capacitàmetaboliche e quindi con una diversa capacità di produrre ATP. Questo può contribuire a spiegare i diversi casi riscontrati durante tale sperimentazione, in cui a valori luminometrici paragonabili sono corrisposte concentrazioni di cariche microbiche differenti.
In questo grafico relativo al confronto dei dati di ATP (RLUIn questo grafico relativo al confronto dei dati di ATP (RLU) con i valori) con i valoridelle cariche microbiche ottenuti per i pozzi monitorati nel 200delle cariche microbiche ottenuti per i pozzi monitorati nel 2005, è possibile osservare 5, è possibile osservare infatti, come a valori di luminosità dello stesso ordine di graninfatti, come a valori di luminosità dello stesso ordine di grandezza corrispondono dezza corrispondono ampie oscillazioni dei conteggi della carica a 37°C e a 22°C (aampie oscillazioni dei conteggi della carica a 37°C e a 22°C (ai 14 valori di RLU i 14 valori di RLU dell’ordine di 10dell’ordine di 104 4 corrispondono valori di carica microbica che oscillano da 1 a corrispondono valori di carica microbica che oscillano da 1 a 1840ufc 1840ufc per quella a 37°C e da 6 a 1780ufc per quella a 22°C ).per quella a 37°C e da 6 a 1780ufc per quella a 22°C ).
Confronto fra Cariche microbiche e i valori di RLU
1,0E+00
1,0E+01
1,0E+02
1,0E+03
1,0E+04
1,0E+05
1,0E+06
MVT12
MVT13
MVT16
MTV18MTV19MVT2
0MVT2
1MVT2
3MTV27
CEU2CEU13CEU15CEU16CEU21CEU22CEU11CEU18
CEU6CEU19MVT1
5MVT1
4MVT1
6MVT1
7MVT2
4
RLU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800RLUCB 37°CCB 22°C
UFC
/ML
L’assenza di una correlazione statisticamente significativa non L’assenza di una correlazione statisticamente significativa non ha permessoha permesso
pertanto di individuare valori di luminescenza (RLU) ai quali popertanto di individuare valori di luminescenza (RLU) ai quali possano essere ssano essere
associate concentrazioni microbiche ben definite, utilizzabili passociate concentrazioni microbiche ben definite, utilizzabili per discriminare il er discriminare il
grado di contaminazione degli acquiferi e individuare situazionigrado di contaminazione degli acquiferi e individuare situazioni di rischio.di rischio.
Le considerazioni fatte per i dati ottenuti per l’ATP con il metodo bioluminometricovalgono anche per gli indicatori microbiologici aspecifici determinati con metodi colturali , infatti dai grafici di correlazione riportati (dati 2003-2005), si può notare che anche le cariche microbiche a 37°e a 22°C, pur fornendo importanti indicazioni sul contenuto totale di microrganismi e sulle variazioni della qualità dell’acqua non risultano correlate in maniera statisticamente significativa, con nessuno dei tre gruppi specifici di microrganismi utilizzati normalmente per valutare il grado di inquinamento delle acque e la presenza di possibili patogeni.
CB 22°C/Coliformi totali
y = 0,1975x + 392,94R2 = 0,0036
0
2000
4000
6000
8000
0 500 1000 1500 2000
CB22°C/Coliformi fecali
y = 0,0278x + 15,395R2 = 0,0166
0
100
200
300
400
500
0 500 1000 1500 2000
CB22°C/Enterococchi
y = 0,0035x + 5,8673R2 = 0,0074
020406080
0 500 1000 1500 2000
CB 37°C/Coliformi fecali
y = -0,0042x + 22,59R2 = 0,0003
0
100
200
300
400
500
0 500 1000 1500 2000
CB37°C/Enterococchi
y = -0,0048x + 9,8569R2 = 0,0042
0
50
100
150
0 500 1000 1500 2000
CB 37°C /Coliformi totali
y = -0,0837x + 443,88R2 = 0,0005
01000200030004000500060007000
0 500 1000 1500 2000
Durante la sperimentazione 24 campioni di acque sotterranee sono stati analizzati in doppio, sia in campo che in laboratorio. I grafici riportati sotto ,evidenziano l’assenza di correlazione significativa fra le due serie di dati luminometrici ottenuti, anche se nel 60% dei casi sono risultati dello stesso ordine di grandezza.
Confronto RLU in campo/RLU in laboratorio
1,0E+03
1,0E+04
1,0E+05
1,0E+06
1,0E+07
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 0 2 1 22 23 24
campioni
RL
U
in campo
in laboratorio
Correlazione RLU in campo /in laboratorio
y = 0,1548x + 158887R2 = 0,089
0,00E+00
5,00E+05
1,00E+06
1,50E+06
2,00E+06
2,50E+06
3,00E+06
3,50E+06
0,0E+00 1,0E+06 2,0E+06 3,0E+06 4,0E+06 5,0E+06 6,0E+06
L’elaborazione dei risultati ottenuti ha permesso di ottenere oltre ad informazioni sulla correlazione del metodo bioluminometrico con i parametri microbiologici tradizionali, alcune utili indicazioni che potranno essere sviluppate ed approfondite da tutti coloro che volessero applicare tale metodo nel controllo delle acque.
Una prima indicazione è riferita al ”livello di background” individuato analizzando con il metodo bioluminometrico campioni di acqua sterile nelle stesse condizioni operative deicampioni esaminati . In base alla nostra esperienza tale livello è risultato per le misure in campo a < 1000 RLU, infatti i valori medi ottenuti per i controlli negativi nelle tre campagne di prelievo oscillano da 320 a 960 RLU. Tale valore è piuttosto elevato in quanto risente di tutte quelle interferenze ambientali, che in campo risultano più difficili da tenere sotto controllo rispetto al Laboratorio ( valore medio acqua sterile 300 RLU), come la contaminazione delle superfici e dell’aria.
Valori RLU determinati nelle acque profonde monitorate nelle 3 campagne di prelievo 2001- 2005
1,0
10,0
100,0
1000,0
10000,0
100000,0
1000000,0
10000000,0
MVT12MVT13MVT16MTV18MTV19MVT20MVT21MVT23MTV27MVT15MVT14MVT16MVT17MVT24
CEU1CEU12CEU17
CEU8CEU10CEU14MVT26
CEU3CEU6CEU2CEU13CEU15CEU16CEU21CEU22CEU11CEU18
CEU6CEU19
pozzi
RLU/
500m
l
200120032005
VALORI CONTROLLO ACQUA STERILE
3,2E24,0E29,6E2
Nel grafico sopra, è possibile osservare che tutti i valori di bioluminescenza registrati per i 34 pozzi esaminati, risultano > di 1000 RLU. Tale valore sembrerebbe quindi rappresentare, nella valutazione del grado di contaminazione delle acque sotterranee esaminate il valore soglia inferiore per il metodo bioluminometrico. Si può inoltre notare come la maggior parte dei 64 valori di RLU ottenuti si collocano nell’intervallo fra 10.000 – 1.000.000 RLU (52 campioni pari al 81,2% )Modesto è invece il numero di campioni per i quali sono stati registrati valori compresi fra 1.000-10.000 RLU (9 campioni 14,1%) e >1.000.000 RLU (3 campioni 4,7%).
Distribuzione dei valori RLU determinati nelle acque profonde monitorate dal 2001-2005
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
10000000
MVT12
MVT13
MVT16
MVT18
MVT19
MVT20
MVT21
MVT23
MVT27
MVT15
MVT14
MVT16
MVT17
MVT24
CEU1CEU12CEU17
CEU8CEU10CEU14MVT2
6CEU3
MVT30
CEU2CEU13CEU15CEU16CEU21CEU22CEU11CEU18
CEU6CEU19
pozzi
RLU
/500
ml
2001 2003 2005
4,7 %4,7 %
81,2 %81,2 %
14,1%14,1%
0 %0 %
27,7 %27,7 %
53,5 %53,5 %
Ci è sembrato interessante valutare anche la qualità microbiologica complessiva dei campioni analizzati rispetto ai dati luminometrici ottenuti. A tale scopo è stata riportata nella tabella sotto la distribuzione nei diversi range di luminosità dei campioni conformi e di quelli non conformi rispetto ai limiti definiti dal D.L. 31/2001 sulle acque potabili per gli indicatori fecali.
L’ampiezza dell’ intervallo (da 10.000 a 1.000.000 RLU) in cui sono collocati la prevalenza dei campioni non conformi(87,1%) e la distribuzione nello stesso intervallo anche della maggior parte dei campioni non fecalizzati (77,4%), conferma la non idoneità di indicatori aspecifici, come la misura dell’ATP , per screening in situazioni di emergenza.
3 0>1.000.00011(35,5%) 11(35,5%)da 100.000-1.000.00016(51,6%) 13(41,9%)da 10.000-100.000
1 7 Da 1.000-10.000
Campioni conformi
Campioni Non Conformi
Intervalli RLU
50%.50%
Conformi Non conformi
In conclusione non si possono che riassumere alcuni punti già evidenziati nel corso della presentazione
Il metodo bioluminometrico è risultatorapido
di facile esecuzioneapplicabile anche in campo
ma aspecifico
Per la sua aspecificità il metodo bioluminometrico per la determinazione dell’ATP è risultato non adeguato per discriminare il grado di contaminazione degli acquiferi e come screening per individuare situazioni di rischio microbiologico.
CONCLUSIONICONCLUSIONI
Grazie per l’attenzioneGrazie per l’attenzione
Un ringraziamento al personale del Un ringraziamento al personale del Laboratorio e ai collaboratori che Laboratorio e ai collaboratori che
hanno permesso la realizzazione della hanno permesso la realizzazione della sperimentazione.sperimentazione.
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