DETERMINAZIONE DELL’ATP DETERMINAZIONE DELL’ATP IN IN

BIOLUMINESCENZA BIOLUMINESCENZA

METODO DI SCREENING PER IL CONTROLLO METODO DI SCREENING PER IL CONTROLLO

MICROBIOLOGICO DELLE ACQUE PROFONDEMICROBIOLOGICO DELLE ACQUE PROFONDE

Dr.ssa E.Ciccarelli

Laboratorio Dip. Perugia ARPA UMBRIA

SCOPO DELLA SPERIMENTAZIONEScopo dello studio è stato quello di valutare il possibile utilizzo di indicatori di contaminazione microbiologica, proposti da IRSA-CNR, nella sorveglianza del rischio di inquinamento degli acquiferi e di verificare l’applicabilità di tali metodologie analitiche più rapide direttamente in situ.

Determinazione del contenuto globale di microrganismi presenti nelle acque profonde mediante misura dell’ATP con il metodo bioluminometrico. Determinazione sugli stessi campioni dei parametri microbiologici con i metodi colturali tradizionali.Comparazione secondo criteri statistici dei risultati ottenuti.

ATTIVITA’ SPERIMENTALE

PERCHE’ L’ATP?

L’ATP è una molecola presente in tutti le cellule metabolicamente attive , siano di origine procariotica che eucariotica, in quanto fornisce l’energia necessaria per le diverse attività cellulari .La misura dell’ATP è utilizzata pertanto come indicatore del contenuto di cellule vitali presenti in una determinata matrice.

PRINCIPIO DEL METODOPRINCIPIO DEL METODOLa misura dell’ ATP presente nelle cellule batteriche, concentrate mediante filtrazione su membrana, viene determinata utilizzando l’enzima luciferasi di lucciola, che catalizza in modo specifico l’idrolisi dell’ATP. La quantità di luce prodotta da questa reazione enzimatica è direttamente proporzionale alla quantità di ATP presente nel campione ed è misurata con un luminometro.

APPLICAZIONIAPPLICAZIONILa determinazione dell’ATP trova applicazione nel controllo diLa determinazione dell’ATP trova applicazione nel controllo diqualità nell’ industria alimentare, farmaceutica e cosmetica, nequalità nell’ industria alimentare, farmaceutica e cosmetica, nel l monitoraggio dell’igiene degli impianti e della qualità delle mamonitoraggio dell’igiene degli impianti e della qualità delle materie terie prime. prime. E’ stato proposto un metodo APAT IRSAE’ stato proposto un metodo APAT IRSA--CNR (9030) che prevede la CNR (9030) che prevede la misura dell’ATP ai fini della valutazione della misura dell’ATP ai fini della valutazione della biomassa biomassa totale in totale in ambienti acquatici.ambienti acquatici.

L’attivita’ sperimentale è stata svolta su campioni di acque sotterranee prelevati in 2 aree del reticolo di monitoraggio regionale.Gli acquiferi controllati microbiologicamente per tale progetto sono caratterizzati da una qualità delle acque piuttosto scadente a causa dell’elevato impatto antropico presente in tali aree.

Sono state eseguite 3 campagne di prelievo : la prima nel 2000-2001(solo Conca Eugubina) la seconda nel 2003 e l’ultima nel 2005. I campioni esaminati sono stati complessivamente 65. Per alcuni campioni la misura dell’ATP è stata eseguita sia in campo che inLaboratorio.

CONCA EUGUBINACONCA EUGUBINA

MEDIA VALLE DEL TEVEREMEDIA VALLE DEL TEVERE

MATERIALI E STRUMENTAZIONE

LUMINOMETRO (Pallchek-PALL)

Funnel sterili da 0.45μm

Reagenti per estrazione ATP Complesso enzimatico luciferina/luciferasiSoluzione di riferimento di ATP

Pipette con volume regolabileMateriale monouso sterile: puntali-spatole-supporti-vials-pinzette-provette-

guantiFrigorifero (2-8°C)Acqua distillata sterilePompa e beuta da vuotoBottiglie sterili

PROCEDURA OPERATIVAPROCEDURA OPERATIVAPrelievo dei campioni in condizioni di sterilitàPrelievo dei campioni in condizioni di sterilità(APAT (APAT IRSAIRSA--CNRCNR MetMet 6010 Man 29/03)6010 Man 29/03)

Trasporto e conservazione a 4Trasporto e conservazione a 4--10°C10°CTaratura strumento(Curva ATP standard)Taratura strumento(Curva ATP standard)

Controllo materiali e reattivi (ATP standardControllo materiali e reattivi (ATP standard--acqua acqua distillata sterile)distillata sterile)

y = 0,9753x - 0,5683R2 = 0,9974

0,00000

2,000004,00000

6,00000

8,00000

0,00000 1,00000 2,00000 3,00000 4,00000 5,00000 6,00000 7,00000 8,00000

ATP

RL

U

Filtrazione di un’aliquota del campione su membrana Filtrazione di un’aliquota del campione su membrana con con funnel funnel sterilisterili

Posizionamento della membrana con pinzette sterili su Posizionamento della membrana con pinzette sterili su apposita piastra con supportoapposita piastra con supporto

Estrazione dell’ATP Estrazione dell’ATP intracellulare intracellulare (aggiunta (aggiunta ExtractantExtractant))

Aggiunta Aggiunta complesso enzimatico complesso enzimatico luciferinaluciferina//luciferasiluciferasi

reazione di bioluminescenza

+ O2 ++ O2 + DD--luciferinaluciferina ++ luciferasiluciferasi ossiluciferinaossiluciferina +AMP +CO2 + +AMP +CO2 + LUCELUCE

Misurazione emissione luminosa in RLU(Unità Misurazione emissione luminosa in RLU(Unità di Luminescenza Relative) e registrazione dei di Luminescenza Relative) e registrazione dei dati su apposita scheda di campodati su apposita scheda di campo

ATPATP

SCHEDA REGISTRAZIONE DATI BIOLUMINOMETRO IN CAMPOProgetto: Progetto APAT 99Unità Ambientale: Pozzo Localizzazione___________________________________________________________________

Comune_________________________________________________________________________

Cod. __________________________ Cod. LIMS___________________________________

Reattivi ricostituiti il: ATPreagent Exstractant KitATPStandard

Controlli:Piastra= RLU…………………………………………………………………………(<20RLU)

Piastra+ Supporto = RLU……………………………………………………………(<20RLU)

Piastra+ Supporto+ Exstractant100μl + ATPReagent100μl=RLU……………………………(<80RLU)

Controllo Negativo con lettura su membrana (Acqua MilliQ sterile 100ml +100ml di lavaggio+ Exstractant150μl+ ATPReagent100μl):

RLU……………………………. ……………………………………………..(<150RLU)Controllo Positivo (ATP):ATP non dil. RLU =

1°dil. RLU = 2°dil. RLU = 3°dil. RLU =

4°dil. RLU = 5°dil. RLU = 6°dil. RLU =

CAMPIONE I° replica RLU………………………………………………………………………..

CAMPIONE II° replica RLU……………………………………………………………………….NOTE:

DATA________________________ORA__________________________________N°_____________

Operatori:_____________________________________RAPP. DI PROVA N°____________________

Semina campioni per esame colturale Semina campioni per esame colturale secondo metodi utilizzati normalmente secondo metodi utilizzati normalmente per il controllo microbiologico delle per il controllo microbiologico delle acqueacque

PARAMETRI MICROBIOLOGICI DETERMINATI CONPARAMETRI MICROBIOLOGICI DETERMINATI CON

METODI COLTURALIMETODI COLTURALI

Escherichia Escherichia coli coli (MPN/100ml)(MPN/100ml)

CARICA MICROBICA A 22CARICA MICROBICA A 22°° (UFC/ml)(UFC/ml)

CARICA MICROBICA A 37CARICA MICROBICA A 37°° (UFC/ml)(UFC/ml)

COLIFORMI FECALI COLIFORMI FECALI (UFC/100ml)(UFC/100ml)

COLIFORMI TOTALI COLIFORMI TOTALI (UFC(UFC--MPN/100ml)MPN/100ml)

ENTEROCOCCHI ENTEROCOCCHI (UFC/100ml)(UFC/100ml)

I metodi di riferimento utilizzati ( Rapporti ISTISAN, APAT IRSA-CNR, UNI EN ISO ) prevedono per la determinazione dei microrganismi indicatori di inquinamento (coliformi totali, coliformi fecali,enterococchi e Escherichia coli ) la tecnica delle membrani filtranti (MF) e dei tubi multipli (MPN) e per il conteggio della carica microbica la tecnica dell’inclusione su agar.

Elaborazione dati e comparazione dei valori Elaborazione dati e comparazione dei valori di RLU ottenuti con i dati microbiologicidi RLU ottenuti con i dati microbiologici

Correlazione CB 37°C/RLU

y = 0,4894x + 4,0416R2 = 0,6041

0,0000

1,0000

2,0000

3,0000

4,0000

5,0000

6,0000

0,0000 0,5000 1,0000 1,5000 2,0000 2,5000

Confronto fra Cariche microbiche e i valori di RLU

1,0E+00

1,0E+01

1,0E+02

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

RL

U-150

50

250

450

650

850

1050

1250

1450

1650

1850

RLUCB 37°CCB 22°C

UF

C/M

L

Il metodo bioluminometrico utilizzato per la determinazione dell’ATP è risultato dal punto di vista operativo:

Di facile applicazioneDi facile applicazioneRapido rispetto ai metodi tradizionali (circa Rapido rispetto ai metodi tradizionali (circa

30min. a campione )30min. a campione )Strumentazione richiesta non ingombrante e Strumentazione richiesta non ingombrante e

facilmente trasportabile con alimentazione a facilmente trasportabile con alimentazione a batteriabatteria

Eseguibile anche in campo Eseguibile anche in campo (laboratorio mobile fornito di frigorifero 2-8°C e di un piano di appoggio che possa essere sottoposto a pulizia/disinfezione)

Costo reattivi circa 11€ ad analisiCosto reattivi circa 11€ ad analisi

LABORATORIO MOBILE

I risultati ottenuti sono stati sottoposti ad analisi statistica mediante l’applicazione del test di correlazione.

Grafici di correlazione

RISULTATI E DISCUSSIONE

Carica microbica 22°C/ ATP

y = 0,0001x + 151,03R2 = 0,114

0

500

1000

1500

2000

0,0E+00 1,0E+06 2,0E+06 3,0E+06 4,0E+06 5,0E+06 6,0E+06

RLU

ufc

/ml

Carica microbica 37°C/ ATP

y = 9E-05x + 61,129R2 = 0,0774

0

500

1000

1500

2000

0,0E+00 1,0E+06 2,0E+06 3,0E+06 4,0E+06 5,0E+06 6,0E+06

RLU

ufc

/ml

dati relativi a 64 campioni dati relativi a 64 campioni

Escherichia coli /ATP

y = -0,00000x + 1,86571R2 = 0,00001

05

101520253035

0,0E+00 5,0E+04 1,0E+05 1,5E+05 2,0E+05 2,5E+05 3,0E+05 3,5E+05 4,0E+05 4,5E+05

RLU

MP

N/1

00

ml

Coliformi totali/ ATP

y = -9E-05x + 339,77R2 = 0,006

01000200030004000500060007000

0,0E+00 1,0E+06 2,0E+06 3,0E+06 4,0E+06 5,0E+06 6,0E+06

RLU

ufc

/100m

lColiformi fecali/ ATP

y = 4E-06x + 16,592R2 = 0,0027

0

100

200

300

400

500

0,0E+00 1,0E+06 2,0E+06 3,0E+06 4,0E+06 5,0E+06 6,0E+06

RLU

ufc

/100

ml

Enterococchi /ATP

y = -5E-07x + 8,5641R2 = 0,0004

020

4060

80100

120140

0,0E+00 1,0E+06 2,0E+06 3,0E+06 4,0E+06 5,0E+06 6,0E+06

RLU

ufc

/100

ml

dati relativi a 48 campioni

dati relativi a 61 campionidati relativi a 61 campioni

dati relativi a 24 campioni

I valori di luminescenza (RLU) ottenuti per le acque sotterranee controllate con il metodo bioluminometriconon sono risultati correlabili in maniera significativanon sono risultati correlabili in maniera significativacon i parametri microbiologici ricercati,con i parametri microbiologici ricercati, neanche con la conta dei batteri mesofili e termofili.L’assenza di correlazione può essere spiegata tenendo conto sia dell’ aspecificitàaspecificità che caratterizza la misura dell’ATP sia delle caratteristiche dei metodi colturali. Infatti il metodo metodo bioluminometricobioluminometrico rileva una risposta biologica complessiva mentre i metodi colturalimetodi colturali , anche quelli meno selettivi, come quelli utilizzati per la carica a 37 e 22°C, permettono di evidenziare non tutti i microrganismi presenti, ma solo quelli per i quali le condizioni ambientali da noi selezionate (temperatura, composizione terreno, tempi di incubazione ecc…) risultano ottimali.

Nell’interpretazione di tali risultati c’è da considerare inoltre che il contenuto di ATP estratto risulta dipendente non solo dalla concentrazione numericadella flora microbica presente nella matrice acquosa, ma anche dalla sua composizione. Infatti i parametri microbiologici (CB 37°,CB 22°,CT,CF) che sono stati correlati con i valori di RLU, rappresentano gruppi eterogenei di microrganismi aerobi e anaerobi facoltativi , costituiti da specie con differenti capacitàmetaboliche e quindi con una diversa capacità di produrre ATP. Questo può contribuire a spiegare i diversi casi riscontrati durante tale sperimentazione, in cui a valori luminometrici paragonabili sono corrisposte concentrazioni di cariche microbiche differenti.

In questo grafico relativo al confronto dei dati di ATP (RLUIn questo grafico relativo al confronto dei dati di ATP (RLU) con i valori) con i valoridelle cariche microbiche ottenuti per i pozzi monitorati nel 200delle cariche microbiche ottenuti per i pozzi monitorati nel 2005, è possibile osservare 5, è possibile osservare infatti, come a valori di luminosità dello stesso ordine di graninfatti, come a valori di luminosità dello stesso ordine di grandezza corrispondono dezza corrispondono ampie oscillazioni dei conteggi della carica a 37°C e a 22°C (aampie oscillazioni dei conteggi della carica a 37°C e a 22°C (ai 14 valori di RLU i 14 valori di RLU dell’ordine di 10dell’ordine di 104 4 corrispondono valori di carica microbica che oscillano da 1 a corrispondono valori di carica microbica che oscillano da 1 a 1840ufc 1840ufc per quella a 37°C e da 6 a 1780ufc per quella a 22°C ).per quella a 37°C e da 6 a 1780ufc per quella a 22°C ).

Confronto fra Cariche microbiche e i valori di RLU

1,0E+00

1,0E+01

1,0E+02

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

MVT12

MVT13

MVT16

MTV18MTV19MVT2

0MVT2

1MVT2

3MTV27

CEU2CEU13CEU15CEU16CEU21CEU22CEU11CEU18

CEU6CEU19MVT1

5MVT1

4MVT1

6MVT1

7MVT2

4

RLU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800RLUCB 37°CCB 22°C

UFC

/ML

L’assenza di una correlazione statisticamente significativa non L’assenza di una correlazione statisticamente significativa non ha permessoha permesso

pertanto di individuare valori di luminescenza (RLU) ai quali popertanto di individuare valori di luminescenza (RLU) ai quali possano essere ssano essere

associate concentrazioni microbiche ben definite, utilizzabili passociate concentrazioni microbiche ben definite, utilizzabili per discriminare il er discriminare il

grado di contaminazione degli acquiferi e individuare situazionigrado di contaminazione degli acquiferi e individuare situazioni di rischio.di rischio.

Le considerazioni fatte per i dati ottenuti per l’ATP con il metodo bioluminometricovalgono anche per gli indicatori microbiologici aspecifici determinati con metodi colturali , infatti dai grafici di correlazione riportati (dati 2003-2005), si può notare che anche le cariche microbiche a 37°e a 22°C, pur fornendo importanti indicazioni sul contenuto totale di microrganismi e sulle variazioni della qualità dell’acqua non risultano correlate in maniera statisticamente significativa, con nessuno dei tre gruppi specifici di microrganismi utilizzati normalmente per valutare il grado di inquinamento delle acque e la presenza di possibili patogeni.

CB 22°C/Coliformi totali

y = 0,1975x + 392,94R2 = 0,0036

0

2000

4000

6000

8000

0 500 1000 1500 2000

CB22°C/Coliformi fecali

y = 0,0278x + 15,395R2 = 0,0166

0

100

200

300

400

500

0 500 1000 1500 2000

CB22°C/Enterococchi

y = 0,0035x + 5,8673R2 = 0,0074

020406080

0 500 1000 1500 2000

CB 37°C/Coliformi fecali

y = -0,0042x + 22,59R2 = 0,0003

0

100

200

300

400

500

0 500 1000 1500 2000

CB37°C/Enterococchi

y = -0,0048x + 9,8569R2 = 0,0042

0

50

100

150

0 500 1000 1500 2000

CB 37°C /Coliformi totali

y = -0,0837x + 443,88R2 = 0,0005

01000200030004000500060007000

0 500 1000 1500 2000

Durante la sperimentazione 24 campioni di acque sotterranee sono stati analizzati in doppio, sia in campo che in laboratorio. I grafici riportati sotto ,evidenziano l’assenza di correlazione significativa fra le due serie di dati luminometrici ottenuti, anche se nel 60% dei casi sono risultati dello stesso ordine di grandezza.

Confronto RLU in campo/RLU in laboratorio

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

1,0E+07

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 0 2 1 22 23 24

campioni

RL

U

in campo

in laboratorio

Correlazione RLU in campo /in laboratorio

y = 0,1548x + 158887R2 = 0,089

0,00E+00

5,00E+05

1,00E+06

1,50E+06

2,00E+06

2,50E+06

3,00E+06

3,50E+06

0,0E+00 1,0E+06 2,0E+06 3,0E+06 4,0E+06 5,0E+06 6,0E+06

L’elaborazione dei risultati ottenuti ha permesso di ottenere oltre ad informazioni sulla correlazione del metodo bioluminometrico con i parametri microbiologici tradizionali, alcune utili indicazioni che potranno essere sviluppate ed approfondite da tutti coloro che volessero applicare tale metodo nel controllo delle acque.

Una prima indicazione è riferita al ”livello di background” individuato analizzando con il metodo bioluminometrico campioni di acqua sterile nelle stesse condizioni operative deicampioni esaminati . In base alla nostra esperienza tale livello è risultato per le misure in campo a < 1000 RLU, infatti i valori medi ottenuti per i controlli negativi nelle tre campagne di prelievo oscillano da 320 a 960 RLU. Tale valore è piuttosto elevato in quanto risente di tutte quelle interferenze ambientali, che in campo risultano più difficili da tenere sotto controllo rispetto al Laboratorio ( valore medio acqua sterile 300 RLU), come la contaminazione delle superfici e dell’aria.

Valori RLU determinati nelle acque profonde monitorate nelle 3 campagne di prelievo 2001- 2005

1,0

10,0

100,0

1000,0

10000,0

100000,0

1000000,0

10000000,0

MVT12MVT13MVT16MTV18MTV19MVT20MVT21MVT23MTV27MVT15MVT14MVT16MVT17MVT24

CEU1CEU12CEU17

CEU8CEU10CEU14MVT26

CEU3CEU6CEU2CEU13CEU15CEU16CEU21CEU22CEU11CEU18

CEU6CEU19

pozzi

RLU/

500m

l

200120032005

VALORI CONTROLLO ACQUA STERILE

3,2E24,0E29,6E2

Nel grafico sopra, è possibile osservare che tutti i valori di bioluminescenza registrati per i 34 pozzi esaminati, risultano > di 1000 RLU. Tale valore sembrerebbe quindi rappresentare, nella valutazione del grado di contaminazione delle acque sotterranee esaminate il valore soglia inferiore per il metodo bioluminometrico. Si può inoltre notare come la maggior parte dei 64 valori di RLU ottenuti si collocano nell’intervallo fra 10.000 – 1.000.000 RLU (52 campioni pari al 81,2% )Modesto è invece il numero di campioni per i quali sono stati registrati valori compresi fra 1.000-10.000 RLU (9 campioni 14,1%) e >1.000.000 RLU (3 campioni 4,7%).

Distribuzione dei valori RLU determinati nelle acque profonde monitorate dal 2001-2005

1

10

100

1000

10000

100000

1000000

10000000

MVT12

MVT13

MVT16

MVT18

MVT19

MVT20

MVT21

MVT23

MVT27

MVT15

MVT14

MVT16

MVT17

MVT24

CEU1CEU12CEU17

CEU8CEU10CEU14MVT2

6CEU3

MVT30

CEU2CEU13CEU15CEU16CEU21CEU22CEU11CEU18

CEU6CEU19

pozzi

RLU

/500

ml

2001 2003 2005

4,7 %4,7 %

81,2 %81,2 %

14,1%14,1%

0 %0 %

27,7 %27,7 %

53,5 %53,5 %

Ci è sembrato interessante valutare anche la qualità microbiologica complessiva dei campioni analizzati rispetto ai dati luminometrici ottenuti. A tale scopo è stata riportata nella tabella sotto la distribuzione nei diversi range di luminosità dei campioni conformi e di quelli non conformi rispetto ai limiti definiti dal D.L. 31/2001 sulle acque potabili per gli indicatori fecali.

L’ampiezza dell’ intervallo (da 10.000 a 1.000.000 RLU) in cui sono collocati la prevalenza dei campioni non conformi(87,1%) e la distribuzione nello stesso intervallo anche della maggior parte dei campioni non fecalizzati (77,4%), conferma la non idoneità di indicatori aspecifici, come la misura dell’ATP , per screening in situazioni di emergenza.

3 0>1.000.00011(35,5%) 11(35,5%)da 100.000-1.000.00016(51,6%) 13(41,9%)da 10.000-100.000

1 7 Da 1.000-10.000

Campioni conformi

Campioni Non Conformi

Intervalli RLU

50%.50%

Conformi Non conformi

In conclusione non si possono che riassumere alcuni punti già evidenziati nel corso della presentazione

Il metodo bioluminometrico è risultatorapido

di facile esecuzioneapplicabile anche in campo

ma aspecifico

Per la sua aspecificità il metodo bioluminometrico per la determinazione dell’ATP è risultato non adeguato per discriminare il grado di contaminazione degli acquiferi e come screening per individuare situazioni di rischio microbiologico.

CONCLUSIONICONCLUSIONI

Grazie per l’attenzioneGrazie per l’attenzione

Un ringraziamento al personale del Un ringraziamento al personale del Laboratorio e ai collaboratori che Laboratorio e ai collaboratori che

hanno permesso la realizzazione della hanno permesso la realizzazione della sperimentazione.sperimentazione.