8/17/2019 Dasar Teori PCR
1/8
Pendahuluan
Sulit untuk menjelaskan secara luas dampak dari PCR. PCR, metode cepat
dan mudah untuk mengenerasikan copy fragmen DNA yang tidak terbatas
jumlahnya, adalah salah satu ilmiah. PCR yang baru saja ditemukan dapat
mengubah kehidupan ilmu science secara nyata. Dari praktekpraktek sehariharitentang diagnosis medis hingga teori, PCR mampu menganalisis sejumlah kecil
materi genetic, bahkan materi genetic yang rusak menjadi suatu le!el yang lebih
detail"teliti dan suatu realita. PCR adalah teknologi ilmiah yang paling penting yang
ada setelah sekian ratus tahun lamanya dan ilmu science telah mengakui nya
karena PCR jauh lebih simple dan lebih murah dari teknikteknik sebelumnya yang
pernah ada dalam menduplikasikan DNA, PCR telah mendemotrasikan panelitian
genetic, digunakan semua ahli biologi dan tentunya di bidang biologi molekuler.
#akta ilmiah mengatkan bah$a PCR sangat berguna karena materi genetic
tinggal disetiap sekuenssekuens baik pada tumbuhan maupun pada he$an, bakteri
atau !irus dalam bangunan nukleotidanya%umumnya DNA atau RNA& yang memangunik dan spesi'k di setiap indi!idu yang berbeda. (ariasi unik ini membuatnya
dapat kembali ke materi genetic asalnya, mengidenti'kasi dengan presisi paling
tidak dari mana organisme spesies ini datang dan bagian partikuler dari spesies
tersebut.
Dalam melakukan )n!estigasi bagaimanapun juga dengan mempelajari DNA
yang ada semua bias untuk dianalisis. PCR mengeploitasi fungsi alami yang dapat
dikenali dari en*im yang dikenal dengan polymerase. +n*imen*im ini berada di
semua makhluk hidup dan tugas mereka adalah mengkopy materi genetic dan juga
proread, serta mengkoreksi copycopy. -adangkadang dikenal juga fotocopy
molekuler, PCR dapat mengenal karakter atau karakteristik, menganalisis danmensintesis DNA"RNA spesi'k. PCR berkerja atau melakukan mitures yang sangat
sulit, mencari tahu, mengidenti'kasikan, dan menduplikasikan materi genetic
particular dari darah rambut atau jaringan specimen dari mikroba,he$an,tumbuhan,
beberapa dari mereka ribuan atau jutaan tahun lamanya.
Polymerase Chain Reaction %PCR juga bias diartikan sebagai suatu metode
untuk memperbanyak suatu potongan sekuens secara in !itro. Proses PCR
ditemukan oleh -ary /ullis pada April 0123 yang saat itu bekerja pada Cetus
Corporation. Deskripsi mengenai prosedur pemeriksaan dari metode ini untuk
pertama kali di publikasikan pada tahun 0124 dan /ullis memperoleh penghargaan
Nobel pada tahun 0113 untuk karyanya ini.
Saat pertama kali diperkenalkan, en*im yang dipakai adalah -leno$. Suatu
en*im polymerase dari E. coli. en*im ini aktif pada suhu 35oC, tetapi segera dirusak
pada suhu tinggi. Ditemukannya en*im polymerase yang berasal dari Thermus
Aquaticus, yang tidak mudah rusak pada suhu tinggi serta alat otomatis yang dapat
8/17/2019 Dasar Teori PCR
2/8
menaikkan suhu %Thermocycler &, membuat metode PCR ini menjadi mudah
dikerjakan.
Sejak saat itu, PCR telah menjadi metode pemeriksaan dasar dan penting
untuk laboratorium riset dan analitik.
Dasardasar PCR telah dimanfaatkan secara luas dan telah pula diaplikasikan
untuk berbagai macam spesialistik seperti karakterisasi gen, kloning dan
ekspresinya dan juga diagnostik DNA dimana PCR dimanfaatkan untuk deteksi
organisme patogen, mengidenti'kasi mutasimutasi yang bertanggung ja$ab
terhadap berbagai penyakit keturunan. Selain itu DNA fngerprinting telah
dimanfaatkan untuk keperluan dunia kedokteran dan kedokteran forensik.
Polymerase Chain Reaction %PCR& merupakan suatu metode sintesis
en*imatis sekuens DNA spesi'k menggunakan dua buah primer oligonukleotida
target yang menghibridisasi rantai yang berla$anan dari sisi DNA in vitro. Reaksi ini
terdiri atas tiga tahap yang merupakan suatu siklus berulang. PCR dimulai dengan
tahap denaturasi rantai ganda DNA target dengan pemanasan sehingga terbentuk
DNA rantai tunggal, kemudian annealing yaitu penempelan primer pada daerah
yang sesuai dan dilanjutkan dengan sintesis DNA komplementer baru oleh en*im
polymerase sehingga terbentuk kembali DNA rantai ganda. Pada setiap siklus kedua
rantai cetakan akan menghasilkan dua molekul baru, dan terus berganda sehingga
jumlah yang didapatkan akan bertambah secara deret ukur %6n, n 7 jumlah siklus&.
Reaksi ini memerlukan bahan DNA yang berperan sebagai cetakan DNA atau DNA
target, sepasang primer oligonukleotida sintetik, en*im DNA polimerase dengan
bufer reaksi yang sesuai, campuran deoksinukleotidatrifosfat %dN8Ps& yangdiperlukan untuk pembentukan rantai DNA, dan suatu alat pemanas yang dapat
diatur kenaikan temperaturnya. 9asil akhir PCR adalah rantai ganda dengan ukuran
yang diketahui.
Reaksi tiga tahap berlangsung di dalam suatu alat yang dapat secara
otomatis mengubahubah suhu sesuai program PCR yang disebut Thermal Cycler
atau mesin PCR. Tahap 1 : panas mendenaturasi DNA rantai ganda dengan
kehadiran primer, empat dN8P, PCRbuer dan Thermostable DNA polymerase.
Suhu denaturasi 130;; oC. Tahap 2 : Penempelan primer oligonukleotida ke acuan
%template& yang telah didenaturasi dengan menurunkan suhu 35
8/17/2019 Dasar Teori PCR
3/8
/etode PCR saat ini banyak digunakan untuk mendeteksi berbagai sekuans
DNA yang ada dalam jumlah kecil. >ila materi genetik yang akan dideteksi adalah
suatu RNA, maka dapat juga dilakukan pemeriksaan PCR setelah proses
pembentukan cDNA dari RNA terlebih dahulu. /etode ini dikenal dengan nama
Reverse Transcriptase PCR %R8PCR&.
?ntuk !isualisasi produk tersebut masih terus dikembangkan teknik
pe$arnaan. Diantaranya dengan menggunakan etidium bromida akan
memperlihatkan pita DNA dengan ukuran tertentu yang diketahui dengan bantuan
petanda berat molekul. Deteksi atau kon'rmasi terhadap identitas produk PCR
dapat dilakukan dengan teknik Sounthern blot hybridiation, teknik ini lebih sensitif.
@angkah pertama dari proses PCR adalah sangat sederhana, yaitu : membuat
larutan PCR mi yang terdiri atas !"A template atau !"A sample, # set oligo
primer yang cocok, 8a= DNA Polymerase, deoyribonucleoside triphospate %dN8P&
dan bufer. -emudian, PCR mi ini diampli'kai berulangulang %biasanya 3; kali atau
lebih sesuai kebutuhan& melalui suhu yang memungkinkan untuk denaturation$annealing dan synthesis. Produk PCR kemudian dapat di!isualisasi dengan
elektroforesis gel dan diperiksa hasil dan spesi'sitasnya.
Bahan dan cara pembuatannya
>ahan yang akan digunakan adalah sebagai berikut :
DNA template/sample
DNA template adalah DNA dari sample yang hendak diampli'lkasi.
-andungan DNA yang optimum dari suatu sample utuk analisis PCR tergantung dari
kemurnian dan tujuan dari pemeriksaan. ?ntuk analisi gen diperlukan suatu jumlah
standar dari DNA yaitu 0;;4;; ng. >ila memakai primer yang dilabel, jumlah DNA
yang dibutuhkan sebagai template"acuan jauh lebih sedikit.
Taq DNA polimerase dan Bufer
8a= DNA polimerase adalah en*im yang berfungsi utuk mengkatalisasi
pemanjangan rantai DNA template%sample. 8a= DNA polimerase berasal dari
Thermus Aquaticus yang tidak mudah rusak pada suhu tinggi.
Konsentrasi enim
Rentang konsentrasi en*im ta= DNA polimerase %Perkin +lmer Cetus& yang
dianjurkan adalah antar 06,4 unit %SA 7 6; units"pmol& per reaksi 0;; l. Balaupun
demikian, kebutuhan en*im disesuaikan dengan target template secara indi!idual
atau primers.
8/17/2019 Dasar Teori PCR
4/8
Apabila konsentrasi en*im terlampau tinggi, maka akan terjadi produk PCR
dengan latar belakang nonspesi'k %pita nonspesi'k&, apabila terlalu rendah, akan
diperoleh suatau jumlh produk PCR yang tidak memadahi.
Bufer
-omponen 0; buer %stock& yang biasanya mengandung :
0;; m/ 8ris9Cl, p9 %suhu kamar&
4;; m/ -Cl
04m/ /gCl6 ;,;0 %$"!& gelatin
Deo!ynucleotide Triphosphate "dNTP#
dN8P adalah bahan dasar yang dibutuhkan untuk pemanjangan dari DNA
tersebut. dN8P yang cocok untuk PCR adalah suatu campuran yang terdiri atas
dA8P, dC8P, d8P, dan d88P dengan konsentrasi yang seimbang dari keempat N8P
tersebut. 9al ini perlu dilakukan untuk menghindari terjadinya kesalahan"kekeliruan
penempelan pada DNA template %misincorporation errors&.
Penggunaan konsentrasi dN8P yang rendah dapat meningkatkan spesi'kasi
dan kemurnian %fdelity & dari PCR dengan mengurangi mispriming pada non target
site dan kemiripan dari nukleotida yang salah cetak pada proses pemanjangan.
-onsetrasi dN8P antara 6;6;; n/ membuahkan hasil pemeriksaan dengan
spesi'tas dan kemurniahn yang optimal.
Konsentrasi $a%nesium
Salah satu hal yang sangat penting untuk diperhatikan adalah konsentrasi
magnesium. -onsentrasi /g dapat mempengaruhi primer annealing, disosiasi ruang
DNA sample. Produk PCR dan spesi'tas produk, formasi dari artefak dan akti!itas
en*im serta kemurniannya. /g mempengaruhi akti!itas en*im 8a= DNA polimerase.
?ntuk mendapatkan hasil pemeriksaan yang optimal konsentrasi /g yang
diperlukan adalah sekitar ;,4 m/ 4 m/.
Primers
?ntuk keperluan PCR pada umumnya, primers didesain secra tepat dan
bersifat komplementer terhadap !"A template, desain dari oligonukleotida
dilakukan menggunakan auan yang sederhana meskipun banyak program komputer
telah banyak membantu desain primer. Secara umum primers yang digunkan untuk
PCR memilki panjang sekitar 6;3; nukleotida. Primer sepanjang ini memungkinkan
penggunaan suhu annealing yang tinggi.
8/17/2019 Dasar Teori PCR
5/8
Primers yang lebih panjang dari 3; nukleotida tidak meningkatkan spesi'tas.
Primer hendaknya didesain secara seimbang dalam jumlah dari keempat basa
tersebut. Dalam hal ini terutama harus diperhatikan kandungan C %E;erguna untuk
mendeteksi !irus A)DS sesegera mungkin selama minggu pertama. Sesudah infeksi,
dibandingkan tes standard +@)SA. PCR memperlihatkan DNA unik dari !irus,
dikarenakan dari metode yg dikerjakan oleh tes standard, yg memperlihatkan
e!idensi secara tak langsung bah$a !irus yg ada sekarang, mencari antibody yg
dibuat tubuh untuk mela$an dirinya.
PCR memberikan hasil yg lebih akurat dari tes standard. Fang terlihat dari
perbedaan keakuratannya, seperti contohnya dalam infeksi kuping tengah yang
dikenal dengan otitis media. 8eknik ini dapat mendeteksi bah$a DNA bakteri yang
ada dicairan kuping tengah member sinyal berupa infeksi aktif, lalu metode kultur
gagal untuk mendeteksi hal ini. Penyakit @yme berupa peradangan sendi yang
menyakitkan yang disebabkan oleh bakteri yang ditramisikan menuju "menjadi
giigitan per detik, yang biasanya berupa diagnose dasar dari motif gejala. 8api PCR
8/17/2019 Dasar Teori PCR
6/8
dapat menghilangkan dari penyakit DNA organisme yang terkandung dalam cairan
sendi , dengan menghasilkan pengobatan yang cepat dan yang dapat mencegah
komplikasi serius.PCR adalah tes yang paling spesi'k dan sensiti!e untuk
helicobacter pylori, jadi organisme penyebab penyakit sekarang diketahui dapat
menyebabkan ulkus dilambung. 8ak seperti pada tes sebelumnya, PCR dapat
mendeteksi 3 organisme transmisi penyebab penyakit kelamin dalam satuproses%herpes,papiloma !irus,clamydia& dan dapat menghilangkan rantai partikel
dari papiloma !irus yang berpotensi untuk menjadi kanker, dimana tes lain belum
dapat melakukannya %hanya PCR yang bisa&
8erdapat lebih dari
8/17/2019 Dasar Teori PCR
7/8
8/17/2019 Dasar Teori PCR
8/8
besar. >erterima kasih atas PCR, kita dapat mempelajari genetic baik yang lampau
maupun genetic yang baru untuk tahun G tahun kedepan.
Top Related