Dasar Teori PCR

8/17/2019 Dasar Teori PCR

1/8

Pendahuluan

Sulit untuk menjelaskan secara luas dampak dari PCR. PCR, metode cepat

dan mudah untuk mengenerasikan copy fragmen DNA yang tidak terbatas

jumlahnya, adalah salah satu ilmiah. PCR yang baru saja ditemukan dapat

mengubah kehidupan ilmu science secara nyata. Dari praktekpraktek sehariharitentang diagnosis medis hingga teori, PCR mampu menganalisis sejumlah kecil

materi genetic, bahkan materi genetic yang rusak menjadi suatu le!el yang lebih

detail"teliti dan suatu realita. PCR adalah teknologi ilmiah yang paling penting yang

ada setelah sekian ratus tahun lamanya dan ilmu science telah mengakui nya

karena PCR jauh lebih simple dan lebih murah dari teknikteknik sebelumnya yang

pernah ada dalam menduplikasikan DNA, PCR telah mendemotrasikan panelitian

genetic, digunakan semua ahli biologi dan tentunya di bidang biologi molekuler.

#akta ilmiah mengatkan bah$a PCR sangat berguna karena materi genetic

tinggal disetiap sekuenssekuens baik pada tumbuhan maupun pada he$an, bakteri

atau !irus dalam bangunan nukleotidanya%umumnya DNA atau RNA& yang memangunik dan spesi'k di setiap indi!idu yang berbeda. (ariasi unik ini membuatnya

dapat kembali ke materi genetic asalnya, mengidenti'kasi dengan presisi paling

tidak dari mana organisme spesies ini datang dan bagian partikuler dari spesies

tersebut.

Dalam melakukan )n!estigasi bagaimanapun juga dengan mempelajari DNA

yang ada semua bias untuk dianalisis. PCR mengeploitasi fungsi alami yang dapat

dikenali dari en*im yang dikenal dengan polymerase. +n*imen*im ini berada di

semua makhluk hidup dan tugas mereka adalah mengkopy materi genetic dan juga

proread, serta mengkoreksi copycopy. -adangkadang dikenal juga fotocopy

molekuler, PCR dapat mengenal karakter atau karakteristik, menganalisis danmensintesis DNA"RNA spesi'k. PCR berkerja atau melakukan mitures yang sangat

sulit, mencari tahu, mengidenti'kasikan, dan menduplikasikan materi genetic

particular dari darah rambut atau jaringan specimen dari mikroba,he$an,tumbuhan,

beberapa dari mereka ribuan atau jutaan tahun lamanya.

Polymerase Chain Reaction %PCR juga bias diartikan sebagai suatu metode

untuk memperbanyak suatu potongan sekuens secara in !itro. Proses PCR

ditemukan oleh -ary /ullis pada April 0123 yang saat itu bekerja pada Cetus

Corporation. Deskripsi mengenai prosedur pemeriksaan dari metode ini untuk

pertama kali di publikasikan pada tahun 0124 dan /ullis memperoleh penghargaan

Nobel pada tahun 0113 untuk karyanya ini.

Saat pertama kali diperkenalkan, en*im yang dipakai adalah -leno$. Suatu

en*im polymerase dari E. coli. en*im ini aktif pada suhu 35oC, tetapi segera dirusak

pada suhu tinggi. Ditemukannya en*im polymerase yang berasal dari Thermus

Aquaticus, yang tidak mudah rusak pada suhu tinggi serta alat otomatis yang dapat


2/8

menaikkan suhu %Thermocycler &, membuat metode PCR ini menjadi mudah

dikerjakan.

Sejak saat itu, PCR telah menjadi metode pemeriksaan dasar dan penting

untuk laboratorium riset dan analitik.

Dasardasar PCR telah dimanfaatkan secara luas dan telah pula diaplikasikan

untuk berbagai macam spesialistik seperti karakterisasi gen, kloning dan

ekspresinya dan juga diagnostik DNA dimana PCR dimanfaatkan untuk deteksi

organisme patogen, mengidenti'kasi mutasimutasi yang bertanggung ja$ab

terhadap berbagai penyakit keturunan. Selain itu DNA fngerprinting telah

dimanfaatkan untuk keperluan dunia kedokteran dan kedokteran forensik.

Polymerase Chain Reaction %PCR& merupakan suatu metode sintesis

en*imatis sekuens DNA spesi'k menggunakan dua buah primer oligonukleotida

target yang menghibridisasi rantai yang berla$anan dari sisi DNA in vitro. Reaksi ini

terdiri atas tiga tahap yang merupakan suatu siklus berulang. PCR dimulai dengan

tahap denaturasi rantai ganda DNA target dengan pemanasan sehingga terbentuk

DNA rantai tunggal, kemudian annealing yaitu penempelan primer pada daerah

yang sesuai dan dilanjutkan dengan sintesis DNA komplementer baru oleh en*im

polymerase sehingga terbentuk kembali DNA rantai ganda. Pada setiap siklus kedua

rantai cetakan akan menghasilkan dua molekul baru, dan terus berganda sehingga

jumlah yang didapatkan akan bertambah secara deret ukur %6n, n 7 jumlah siklus&.

Reaksi ini memerlukan bahan DNA yang berperan sebagai cetakan DNA atau DNA

target, sepasang primer oligonukleotida sintetik, en*im DNA polimerase dengan

bufer reaksi yang sesuai, campuran deoksinukleotidatrifosfat %dN8Ps& yangdiperlukan untuk pembentukan rantai DNA, dan suatu alat pemanas yang dapat

diatur kenaikan temperaturnya. 9asil akhir PCR adalah rantai ganda dengan ukuran

yang diketahui.

Reaksi tiga tahap berlangsung di dalam suatu alat yang dapat secara

otomatis mengubahubah suhu sesuai program PCR yang disebut Thermal Cycler

atau mesin PCR. Tahap 1 : panas mendenaturasi DNA rantai ganda dengan

kehadiran primer, empat dN8P, PCRbuer dan Thermostable DNA polymerase.

Suhu denaturasi 130;; oC. Tahap 2 : Penempelan primer oligonukleotida ke acuan

%template& yang telah didenaturasi dengan menurunkan suhu 35


3/8

/etode PCR saat ini banyak digunakan untuk mendeteksi berbagai sekuans

DNA yang ada dalam jumlah kecil. >ila materi genetik yang akan dideteksi adalah

suatu RNA, maka dapat juga dilakukan pemeriksaan PCR setelah proses

pembentukan cDNA dari RNA terlebih dahulu. /etode ini dikenal dengan nama

Reverse Transcriptase PCR %R8PCR&.

?ntuk !isualisasi produk tersebut masih terus dikembangkan teknik

pe$arnaan. Diantaranya dengan menggunakan etidium bromida akan

memperlihatkan pita DNA dengan ukuran tertentu yang diketahui dengan bantuan

petanda berat molekul. Deteksi atau kon'rmasi terhadap identitas produk PCR

dapat dilakukan dengan teknik Sounthern blot hybridiation, teknik ini lebih sensitif.

@angkah pertama dari proses PCR adalah sangat sederhana, yaitu : membuat

larutan PCR mi yang terdiri atas !"A template atau !"A sample, # set oligo

primer yang cocok, 8a= DNA Polymerase, deoyribonucleoside triphospate %dN8P&

dan bufer. -emudian, PCR mi ini diampli'kai berulangulang %biasanya 3; kali atau

lebih sesuai kebutuhan& melalui suhu yang memungkinkan untuk denaturation$annealing dan synthesis. Produk PCR kemudian dapat di!isualisasi dengan

elektroforesis gel dan diperiksa hasil dan spesi'sitasnya.

Bahan dan cara pembuatannya

>ahan yang akan digunakan adalah sebagai berikut :

DNA template/sample

DNA template adalah DNA dari sample yang hendak diampli'lkasi.

-andungan DNA yang optimum dari suatu sample utuk analisis PCR tergantung dari

kemurnian dan tujuan dari pemeriksaan. ?ntuk analisi gen diperlukan suatu jumlah

standar dari DNA yaitu 0;;4;; ng. >ila memakai primer yang dilabel, jumlah DNA

yang dibutuhkan sebagai template"acuan jauh lebih sedikit.

Taq DNA polimerase dan Bufer

8a= DNA polimerase adalah en*im yang berfungsi utuk mengkatalisasi

pemanjangan rantai DNA template%sample. 8a= DNA polimerase berasal dari

Thermus Aquaticus yang tidak mudah rusak pada suhu tinggi.

Konsentrasi enim

Rentang konsentrasi en*im ta= DNA polimerase %Perkin +lmer Cetus& yang

dianjurkan adalah antar 06,4 unit %SA 7 6; units"pmol& per reaksi 0;; l. Balaupun

demikian, kebutuhan en*im disesuaikan dengan target template secara indi!idual

atau primers.


4/8

Apabila konsentrasi en*im terlampau tinggi, maka akan terjadi produk PCR

dengan latar belakang nonspesi'k %pita nonspesi'k&, apabila terlalu rendah, akan

diperoleh suatau jumlh produk PCR yang tidak memadahi.

Bufer

-omponen 0; buer %stock& yang biasanya mengandung :

0;; m/ 8ris9Cl, p9 %suhu kamar&

4;; m/ -Cl

04m/ /gCl6 ;,;0 %$"!& gelatin

Deo!ynucleotide Triphosphate "dNTP#

dN8P adalah bahan dasar yang dibutuhkan untuk pemanjangan dari DNA

tersebut. dN8P yang cocok untuk PCR adalah suatu campuran yang terdiri atas

dA8P, dC8P, d8P, dan d88P dengan konsentrasi yang seimbang dari keempat N8P

tersebut. 9al ini perlu dilakukan untuk menghindari terjadinya kesalahan"kekeliruan

penempelan pada DNA template %misincorporation errors&.

Penggunaan konsentrasi dN8P yang rendah dapat meningkatkan spesi'kasi

dan kemurnian %fdelity & dari PCR dengan mengurangi mispriming pada non target

site dan kemiripan dari nukleotida yang salah cetak pada proses pemanjangan.

-onsetrasi dN8P antara 6;6;; n/ membuahkan hasil pemeriksaan dengan

spesi'tas dan kemurniahn yang optimal.

Konsentrasi $a%nesium

Salah satu hal yang sangat penting untuk diperhatikan adalah konsentrasi

magnesium. -onsentrasi /g dapat mempengaruhi primer annealing, disosiasi ruang

DNA sample. Produk PCR dan spesi'tas produk, formasi dari artefak dan akti!itas

en*im serta kemurniannya. /g mempengaruhi akti!itas en*im 8a= DNA polimerase.

?ntuk mendapatkan hasil pemeriksaan yang optimal konsentrasi /g yang

diperlukan adalah sekitar ;,4 m/ 4 m/.

Primers

?ntuk keperluan PCR pada umumnya, primers didesain secra tepat dan

bersifat komplementer terhadap !"A template, desain dari oligonukleotida

dilakukan menggunakan auan yang sederhana meskipun banyak program komputer

telah banyak membantu desain primer. Secara umum primers yang digunkan untuk

PCR memilki panjang sekitar 6;3; nukleotida. Primer sepanjang ini memungkinkan

penggunaan suhu annealing yang tinggi.


5/8

Primers yang lebih panjang dari 3; nukleotida tidak meningkatkan spesi'tas.

Primer hendaknya didesain secara seimbang dalam jumlah dari keempat basa

tersebut. Dalam hal ini terutama harus diperhatikan kandungan C %E;erguna untuk

mendeteksi !irus A)DS sesegera mungkin selama minggu pertama. Sesudah infeksi,

dibandingkan tes standard +@)SA. PCR memperlihatkan DNA unik dari !irus,

dikarenakan dari metode yg dikerjakan oleh tes standard, yg memperlihatkan

e!idensi secara tak langsung bah$a !irus yg ada sekarang, mencari antibody yg

dibuat tubuh untuk mela$an dirinya.

PCR memberikan hasil yg lebih akurat dari tes standard. Fang terlihat dari

perbedaan keakuratannya, seperti contohnya dalam infeksi kuping tengah yang

dikenal dengan otitis media. 8eknik ini dapat mendeteksi bah$a DNA bakteri yang

ada dicairan kuping tengah member sinyal berupa infeksi aktif, lalu metode kultur

gagal untuk mendeteksi hal ini. Penyakit @yme berupa peradangan sendi yang

menyakitkan yang disebabkan oleh bakteri yang ditramisikan menuju "menjadi

giigitan per detik, yang biasanya berupa diagnose dasar dari motif gejala. 8api PCR


6/8

dapat menghilangkan dari penyakit DNA organisme yang terkandung dalam cairan

sendi , dengan menghasilkan pengobatan yang cepat dan yang dapat mencegah

komplikasi serius.PCR adalah tes yang paling spesi'k dan sensiti!e untuk

helicobacter pylori, jadi organisme penyebab penyakit sekarang diketahui dapat

menyebabkan ulkus dilambung. 8ak seperti pada tes sebelumnya, PCR dapat

mendeteksi 3 organisme transmisi penyebab penyakit kelamin dalam satuproses%herpes,papiloma !irus,clamydia& dan dapat menghilangkan rantai partikel

dari papiloma !irus yang berpotensi untuk menjadi kanker, dimana tes lain belum

dapat melakukannya %hanya PCR yang bisa&

8erdapat lebih dari


7/8


8/8

besar. >erterima kasih atas PCR, kita dapat mempelajari genetic baik yang lampau

maupun genetic yang baru untuk tahun G tahun kedepan.

Dasar Teori PCR

Documents

Transcript of Dasar Teori PCR