Download - Chuyển gen eGFP ở gà

Sinh viên thực hiện

1. Mai Hữu Phương

2. Nguyễn Duy Hải

3. Ngô Thị Hoài Diễm

4. Lê Thị Thu Trang

5. Nguyễn Thanh Như

6. Lê Thị Hằng

Friday, November 14, 2014 1

Quy trình và các phương pháp chuyển gen ở động vật

Mô hình chuyển gen ở gà

Thử nghiệm chuyển gen GFP trên Gà (Gallus Gallus domesticus)

1

2

3



1.1. Quy trình chuyển gen ở động vật

1

2

3

5

6

Chuyển gen

vào tinh trùng

Chuyển gen

qua liposome

Phương pháp

vi tiêm

Chuyển gen

nhờ virus

Chuyển gen

nhờ xung điện4

Chuyển gen nhờ sử

dụng tế bào gốc phôi


1.2. Phương pháp chuyển gen ở động vật

2.1. Giới thiệu

Quá trình chuyển gen ở động vật đã được tiến hành thành công trên nhiều

đối tượng khác nhau. Đặc biệt, ở gà, do cấu tạo và sinh lý có nhiều ưu thế để tiến

hành chuyển gen. Đây chính là đối tượng tuyệt vời để sản xuất protein tái tổ hợp

trong trứng. Đây là một bước quan trọng để tiến đến mục tiêu nhân giống gà mái

có thể đẻ những “quả trứng vàng” mang protein dược phẩm.


2.2. Những thuận lợi và khó khăn khi sử dụng gà làm đối tượng

chuyển gen

Thuận lợi

Thời gian thế hệ ngắn, tốc độ sinh trưởng nhanh.

Năng suất trứng cao.

Kích thước thích hợp

Trứng có môi trường vô trùng tự nhiên.

TP protein đơn giản.

Sự di cư của tế bào mầm.Friday, November 14, 2014 6

2.2. Những thuận lợi và khó khăn khi sử dụng gà làm đối tượng

chuyển gen

Khó khăn

Trứng gà ngay khi vừa được đẻ ra, phôi đã bắt đầu phát triển và chứa

khoảng 40.000-60.000 tế bào.

Trứng lớn, dễ vỡ và khó thao tác.

Khó tiếp cận giai đoạn phôi sớm của chúng.


3.1. Đối tượng nghiên cứu

Sản lượng trứng một năm khoảng 250 - 270

quả.

Trứng to, nặng 60 - 65 g.

Tỉ lệ lòng trắng so với lòng đỏ cao.

Vỏ trứng màu trắng, dễ kiểm tra phôi trong

quả trứng ấp.

Gà Leghorn là giống chuyên trứng cao sản nhất thế giới hiện nay:


3.1. Đối tượng nghiên cứu

Gà Leghorn là giống chuyên trứng cao sản nhất thế giới hiện nay

Gà Leghorn là đối tượng rất thuận lợi cho các

nghiên cứu chuyển gen ở gia cầm với mục

đích sản xuất protein dược liệu trong lòng

trắng trứng.


3.2. Vector pT2/BH-CVpf-SB11


Vector transposon Sleeping Beauty (SB)

Hệ thống transposon SB chứa một gen

đơn mã hóa cho enzyme transposase và

một transposon chứa đầu tận cùng lặp lại

tại vị trí liên kết với transposase.

3.2. Vector pT2/BH-CVpf-SB11



Nhân dòng

vector pT2/BH-

CVpf-SB11

Tạo phức hợp

lipoplex (ADN-

liposome)

Chuyển gen

bằng PP vi tiêm

Chuyển gen qua

tinh trùng

Kiểm tra sự có

mặt của gen cần

chuyển

3.2. Nhân dòng E.coli mang vector pT2/BH-CVpf-SB11

Vector pT2/BH-CVpf-SB11 được biến nạp vào E.coli nhờ xung điện →

Nuôi cấy vi khuẩn E.coli mang gen biến nạp.

Tách chiết, thu nhận plasmid từ E.coli. Plasmid sẽ được điện di kiểm tra trên

gel agarose 0.8 %.



3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp


3.4.1. Phương pháp rèn kim tiêm

Ống mao quản thủy tinh, d = 1 mm

Máy kéo kim để kéo được đầu kim tiêm có

đường kính 30 – 40 8 μm

Bẻ đầu nhọn để có chiều dài và độ vát phù

hợp


3.4.2. Phương pháp tạo phức hợp lipoplex (ADN- liposome)

Lắc nhẹ LipofectaminTM 2000, nhỏ 2 μl lên bề mặt của 100

μl môi trường Opti-MEM.

Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.

Nhỏ 0,8 μg ADN lên vị trí nhỏ LipofectaminTM 2000 ở trên.

Ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng để tạo thành phức hệ ADN-

Liposome.




3.4.3. Phương pháp mở cửa sổ

Chuẩn bị vỏ đậy cửa sổ

Vỏ đá vôi

Dùng máy khoan mini khoan vỏ trứng thành các mảnh

tròn có đường kính 1 cm.

Rửa sạch bụi với cồn 70o → rửa bằng PBS.

Bảo quản trong PBS để sử dụng cho các TN.


Chuẩn bị vỏ đậy cửa sổ

Màng vỏ

Tách màng vỏ ra khỏi màng đá vôi.

Rửa như mảnh vỏ đá vôi và bảo

quản trong PBS để dùng cho các TN

sau.




Mở cửa sổ kết hợp

vi tiêm DNA




Mở cửa sổ kết hợp vi tiêm DNA

Trứng gà được khử trùng bằng cách xông KMnO4

+ formon và đặt nằm ngang trước khi tiến hành vi

tiêm ít nhất 2h.

Dùng máy khoan mini cắt một vòng tròn nhỏ có

đường kính 0,5 cm trên phần vỏ đá vôi của trứng.





Bôi paraffin xung quanh mép cửa sổ.

Gắp phần vỏ đá vôi đã khoan ra và nhỏ 1 giọt

PBS lên cửa sổ.

Trứng được đưa vào buồng thao tác vô trùng và

được xé rách màng vỏ bằng panh.





Sử dụng kim vi tiêm tiêm 2 μl ADN vào

xoang dưới phôi (chú ý không để bọt khí đi

vào phôi).





Lấy 1 miếng màng vỏ đậy lên cửa sổ.

Đậy tiếp 1 mảng đá vôi lên màng vỏ đã đậy.

Hàn kín cửa sổ bằng keo Duco.

Trứng được đem đi ấp và đặt theo chiều

thẳng đứng với đầu tù quay lên trên.





3.4.4. Phương pháp ấp trứng

Trứng 0 giờ ấp sẽ được xông khử trùng bằng KMnO4 và focmon.

Trứng sau khi đã khử trùng được xếp vào khay với đầu tù quay lên trên.

Khay trứng được chuyển vào tủ ấp với chế độ ấp như sau:

Nhiệt độ: 37,8 oC.

Đảo trứng: 2h/lần. 10-12 lần/ngày.

Thông thoáng: vận tốc gió 77 cm/giây; tốc độ quạt: 300 vòng/phút.



3.5. Chuyển gen GFP bằng PP chuyển gen qua tinh trùng



3.5.1. Phương pháp lấy tinh trùng gà

Thực hiện thao tác gây xuất tinh ở gà

trống → cong đuôi lên → ngón cái và

ngón trỏ bóp nhẹ vào vùng lỗ huyệt và hơi

ấn vào bụng dưới lỗ huyệt để tăng thêm

kích thích.

Dùng một tay vén ngược đuôi gà lên để lộ

vùng huyệt → hứng tinh dịch.



3.5.2. Phương pháp xác định nồng độ tinh trùng

Pha loãng tinh dịch: Dùng ống trộn hồng cầu hút tinh dịch nguyên đến vạch

0.5, sau đó hút tiếp dung dịch NaCl 3% (để giết chết tinh trùng) đến vạch 101,

lắc nhẹ trong 2 - 3 phút để trộn đều dung dịch.

Bỏ 3 - 4 giọt đầu, rồi nhỏ 1 giọt lên buồng đếm hồng cầu, đậy lamen.



3.5.2. Phương pháp xác định nồng độ tinh trùng

Kết quả số lượng tế bào được tính theo công thức:

710.80

4000000.200.n

nC

Trong đó:

C: Nồng độ tinh trùng (tinh trùng/ml)

n: Số lượng tinh trùng có trong 80 ô vuông nhỏ

200: Số lần pha loãng tinh dịch

4.000 000: Thể tích 1 ô vuông nhỏ:1/4000000 cm3.(ml)

80: Tổng số ô vuông nhỏ đã đếm.

3.5.3. Phương pháp tạo phức hợp lipoplex (ADN- liposome)

Lắc nhẹ LipofectaminTM 2000, nhỏ 20 μl lên bề mặt của

100 μl môi trường Opti-MEM.

Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.

Nhỏ 8 μg ADN lên vị trí nhỏ LipofectaminTM 2000 ở trên.

Ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng để tạo thành phức hệ ADN-

Liposome.





Lấy 1-1,5 ml tinh dịch thu được pha loãng với 4 ml môi trường DMEM không

có FBS (tỉ lệ pha loãng thích hợp nhất của tinh dịch và môi trường là 1:3).

Trộn đều phức hợp lipoplex với tinh dịch vừa thu được (tổng khoảng 6ml), ủ

20 - 50 phút rồi tiến hành TTNT cho gà mái.

3.5.4. Phương pháp chuyển phức hợp lipoplex vào tinh trùng



3.5.5. Phương pháp thụ tinh nhân tạo

3.6. Phương pháp thu nhận DNA từ gà mang gen chuyển

Phương pháp tách tế bào

phôi 7 ngày ấp và nuôi

cấy nguyên bào sợi


Phương pháp thu nhận

DNA từ tế bào hồng cầu

và nội quan gà

3.6.1. Phương pháp tách tế bào phôi 7 ngày ấp và nuôi cấy

nguyên bào sợi

Tách tế bào phôi 7 ngày ấp

Khử trùng trứng bằng cách lau cồn 70 độ.

Lấy phôi ra khỏi trứng và cho vào đĩa petri

đựng dung dịch muối sinh lý.

Rửa sạch 2, 3 lần bằng dung dịch sinh lý cho

sạch máu, lòng trắng và lòng đỏ trứng.


Tách tế bào phôi 7 ngày ấp

Chuyển phôi vào buồng thao tác vô trùng và rửa bằng PBS khoảng 2 lần.

Chuyển sang ống Eppendorf, cắt nhỏ trong 0,5ml trypsin 0.25% trong 2 phút.

Thêm 1 ml môi trường nuôi cấy để bất hoạt Trypsin.

Loại bỏ cặn to, thu dịch tế bào và dùng để nuôi cấy.



nguyên bào sợi

Nuôi cấy đơn dòng

Đếm số lượng tế bào trong dịch huyền phù.

Hút dịch huyền phù tế bào chia vào 4 giếng đã có sẵn 0,5 ml MT nuôi cấy.

Sau 24 giờ, kiểm tra và thay môi trường cho các giếng nuôi cấy.

Sau 72 giờ, cấy chuyển và nuôi cấy in vitro → mật độ tế bào > 90% và tiến

hành sàng lọc puromycin để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển.



nguyên bào sợi

Sàng lọc tế bào mang gen chuyển bằng kháng sinh puromycin

Stock Puromycin (10 μg/ml) → 1 μg/ml, 2 μg/ml và 3 μg/ml.


0 μg/ml

3 μg/ml

ĐC TN1 TN2 TN3 TN4 TN5


nguyên bào sợi

Sàng lọc tế bào mang gen chuyển bằng kháng sinh puromycin

Sau 24 giờ - 48 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào đạt khoảng 0,5x106 tế bào/giếng, xử

lý bằng puromycin trên 2 lô: lô TN và lô ĐC.

Sau khi bổ sung puromycin vào các giếng nuôi cấy, lắc nhẹ để puromycin hoà

lẫn với môi trường và tiếp tục nuôi trong tủ ấm 37oC, 5% CO2.

Sau 24h bổ sung puromycin, mang mẫu quan sát và đếm số lượng tế bào.



nguyên bào sợi

Đếm số lượng tế bào

Pha loãng huyền phù tế bào 200 lần bằng PBS sau đó dùng pipet nhỏ 1 giọt lên

buồng đếm hồng cầu, đậy lamen.

Nồng độ tế bào được tính theo công thức sau:


C = 80

000.000.4200xxn = n x 10 x 106

C - nồng độ tế bào (tế bào/ml dịch mẫu tế bào)

n - số lượng tế bào đếm được (trong 80 ô nhỏ)

200 - số lần pha loãng mẫu dịch tế bào

4.000.000 - thể tích của 1 ô con tính bằng cm3 (ml)

80 - tổng số ô con được đếm


nguyên bào sợi

Phá vỡ tế bào

Tế bào sau khi lấy từ các giếng nuôi cấy sẽ được li tâm thu cặn tế bào.

Tế bào trong các giếng được cho vào khoảng 10 μ𝑙 dung dịch TE.

Để hỗn hợp tế bào trong TE vào nước ở 94oC trong khoảng 10 phút.



nguyên bào sợi

Thu nhận DNA từ tế bào hồng cầu

Lấy máu gà 10 ngày tuổi.

Ly tâm với tốc độ 1200 RPM, trong 15 phút.

Loại bỏ huyết tương, thu hồng cầu.

Bổ sung thêm 0,5 ml TE.

Sau đó sử dụng bộ kit để tách ADN.


3.6.2. Phương pháp thu nhận DNA từ tế bào hồng cầu và nội

quan gà

Thu nhận DNA từ nội quan gà

Gà con khoảng 1 tháng tuổi.

Tách nội tạng của gà (gan, lách, ruột, phổi, tủy xương, tụy…) để riêng vào các

ống eppendorf có chứa dung dịch PBS.

Chuyển các nội quan sang các ống eppendorf có chứa sẵn dung dịch TE,

nghiền nát các nội quan.

Sử dụng bộ kit để tách ADN.Friday, November 14, 2014 41

3.6.2. Phương pháp thu nhận DNA từ tế bào hồng cầu và nội

quan gà

Sử dụng kĩ thuật Multiplex PCR với hai cặp mồi đặc hiệu cho eGFP.

Cặp mồi này sẽ khuếch đại đoạn ADN có kích thước 418 bp của gen eGFP.

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn ADN có kích thước 321 bp của

gen ribosome 18S ở gà để chứng minh sự hiện diện của hệ gen gà trong mẫu thí

nghiệm.


3.7. Phương pháp kiểm tra sự có mặt của DNA ngoại lai

3.7.1 Khuyếch đại bằng PCR




Tên mồi Trình tự mồi Nhiệt độ bắt cặp

GFPfor 5’ – ACA AGT TCA GCG TGT CCG – 3’ 55,3 0 C

GFPrev 5’ – TTC ACC TTG ATG CCG TTC – 3’ 55,2 O C

Tên mồi Trình tự mồi Nhiệt độ bắt cặp

18Sfor 5’ – GTC GGC GTC CAA CTT CTT – 3’ 55,4 0 C

18Srev 5’ – CGA TCC GAG GAC CTC ACT – 3’ 55,7 O C

Cặp mồi khuếch đại đoạn ADN có kích thước 418 bp của gen eGFP

Cặp mồi khuếch đại đoạn ADN có kích thước 321 bp của gen ribosome 18S


3.2.4. Phương pháp kiểm tra sự có mặt của DNA ngoại lai


Thành phần Thể tích

H2O 13.75 μl

dNTP (10mM) 0.5 μl

Buffer 10X for Taq 2 μl

Taq (1 unit/μl) 1.5 μl

eGFP (primer) (10 μM) 1 μl

18S (primer)(10 μM) 0.25 μl

Template 1 μl

∑ 20 μl

Thành phần phản ứng PCR như sau:




Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian

1 94 7 phút

2 94 30 giây

3 59 1 phút

4 72 30 giây

5 Trở lại bước 2 35 chu kì

6 72 7 phút

7 4 60 phút

Chu kì nhiệt của phản ứng PCR như sau:



3.7.2. Điện di kiểm tra sự có mặt của DNA ngoại lai

Chuẩn bị Gel Agarose

1,5 g agarose + 100 ml dung dịch đệm TBE 1X.

Đun sôi cho agarose tan hoàn toàn.

Để nguội xuống khoảng 50oC rồi đổ dung dịch agarose vào khay đã cài sẵn

lược. Sau khoảng 1h khi gel, gỡ lược ra và đặt bản gel vào bể điện di. Đổ đệm

TBE vào bể để dung dịch ngập mặt gel từ 1 - 2 mm.




Tra mẫu DNA

Lấy 10 μl sản phẩm PCR tra vào các giếng trong bản gel.

Chạy điện di ở hiệu điện thế 70 V, trong khoảng thời gian 45 phút.

Sau đó, tiếp tục chạy ở hiệu điện thế 90 V trong 10 phút.




Nhuộm ADN bằng Ethidium Bromide (EtBr)

Bản gel được nhẹ nhàng lấy ra khỏi khuôn và cho vào ngâm trong dung dịch EtBr

nồng độ 2 μg/ml trong khoảng 10 phút. Sau đó lấy bản gel ra tráng nước rồi quan

sát và chụp ảnh.

3.8. Kết quả


Gà chuyển gen GFP (bên trái và

gà thường (bên phải)

3.8. Kết quả


Kết quả điện di sản phẩm multiplex

PCR kiểm tra sự có mặt của gen

eGFP trong nguyên bào sợi gà

3.8. Kết quả


Kết quả điện di ADN thu được từ máu gà chuyển gen

Chuyển gen qua tinh trùng Vi tiêm

3.8. Kết quả


Kết quả điện di ADN thu từ các nội quan của gà con chuyển gen

Chuyển gen qua tinh trùng Vi tiêm