Chuyển gen eGFP ở gà
-
Upload
mai-huu-phuong -
Category
Education
-
view
281 -
download
8
description
Transcript of Chuyển gen eGFP ở gà
Sinh viên thực hiện
1. Mai Hữu Phương
2. Nguyễn Duy Hải
3. Ngô Thị Hoài Diễm
4. Lê Thị Thu Trang
5. Nguyễn Thanh Như
6. Lê Thị Hằng
Friday, November 14, 2014 1
Quy trình và các phương pháp chuyển gen ở động vật
Mô hình chuyển gen ở gà
Thử nghiệm chuyển gen GFP trên Gà (Gallus Gallus domesticus)
1
2
3
Friday, November 14, 2014 2
Friday, November 14, 2014 3
1.1. Quy trình chuyển gen ở động vật
1
2
3
5
6
Chuyển gen
vào tinh trùng
Chuyển gen
qua liposome
Phương pháp
vi tiêm
Chuyển gen
nhờ virus
Chuyển gen
nhờ xung điện4
Chuyển gen nhờ sử
dụng tế bào gốc phôi
Friday, November 14, 2014 4
1.2. Phương pháp chuyển gen ở động vật
2.1. Giới thiệu
Quá trình chuyển gen ở động vật đã được tiến hành thành công trên nhiều
đối tượng khác nhau. Đặc biệt, ở gà, do cấu tạo và sinh lý có nhiều ưu thế để tiến
hành chuyển gen. Đây chính là đối tượng tuyệt vời để sản xuất protein tái tổ hợp
trong trứng. Đây là một bước quan trọng để tiến đến mục tiêu nhân giống gà mái
có thể đẻ những “quả trứng vàng” mang protein dược phẩm.
Friday, November 14, 2014 5
2.2. Những thuận lợi và khó khăn khi sử dụng gà làm đối tượng
chuyển gen
Thuận lợi
Thời gian thế hệ ngắn, tốc độ sinh trưởng nhanh.
Năng suất trứng cao.
Kích thước thích hợp
Trứng có môi trường vô trùng tự nhiên.
TP protein đơn giản.
Sự di cư của tế bào mầm.Friday, November 14, 2014 6
2.2. Những thuận lợi và khó khăn khi sử dụng gà làm đối tượng
chuyển gen
Khó khăn
Trứng gà ngay khi vừa được đẻ ra, phôi đã bắt đầu phát triển và chứa
khoảng 40.000-60.000 tế bào.
Trứng lớn, dễ vỡ và khó thao tác.
Khó tiếp cận giai đoạn phôi sớm của chúng.
Friday, November 14, 2014 7
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Sản lượng trứng một năm khoảng 250 - 270
quả.
Trứng to, nặng 60 - 65 g.
Tỉ lệ lòng trắng so với lòng đỏ cao.
Vỏ trứng màu trắng, dễ kiểm tra phôi trong
quả trứng ấp.
Gà Leghorn là giống chuyên trứng cao sản nhất thế giới hiện nay:
Friday, November 14, 2014 8
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Gà Leghorn là giống chuyên trứng cao sản nhất thế giới hiện nay
Gà Leghorn là đối tượng rất thuận lợi cho các
nghiên cứu chuyển gen ở gia cầm với mục
đích sản xuất protein dược liệu trong lòng
trắng trứng.
Friday, November 14, 2014 9
3.2. Vector pT2/BH-CVpf-SB11
Friday, November 14, 2014 10
Vector transposon Sleeping Beauty (SB)
Hệ thống transposon SB chứa một gen
đơn mã hóa cho enzyme transposase và
một transposon chứa đầu tận cùng lặp lại
tại vị trí liên kết với transposase.
3.2. Vector pT2/BH-CVpf-SB11
Friday, November 14, 2014 11
Friday, November 14, 2014 12
Nhân dòng
vector pT2/BH-
CVpf-SB11
Tạo phức hợp
lipoplex (ADN-
liposome)
Chuyển gen
bằng PP vi tiêm
Chuyển gen qua
tinh trùng
Kiểm tra sự có
mặt của gen cần
chuyển
3.2. Nhân dòng E.coli mang vector pT2/BH-CVpf-SB11
Vector pT2/BH-CVpf-SB11 được biến nạp vào E.coli nhờ xung điện →
Nuôi cấy vi khuẩn E.coli mang gen biến nạp.
Tách chiết, thu nhận plasmid từ E.coli. Plasmid sẽ được điện di kiểm tra trên
gel agarose 0.8 %.
Friday, November 14, 2014 13
Friday, November 14, 2014 14
3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp
3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp
3.4.1. Phương pháp rèn kim tiêm
Ống mao quản thủy tinh, d = 1 mm
Máy kéo kim để kéo được đầu kim tiêm có
đường kính 30 – 40 8 μm
Bẻ đầu nhọn để có chiều dài và độ vát phù
hợp
Friday, November 14, 2014 15
3.4.2. Phương pháp tạo phức hợp lipoplex (ADN- liposome)
Lắc nhẹ LipofectaminTM 2000, nhỏ 2 μl lên bề mặt của 100
μl môi trường Opti-MEM.
Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Nhỏ 0,8 μg ADN lên vị trí nhỏ LipofectaminTM 2000 ở trên.
Ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng để tạo thành phức hệ ADN-
Liposome.
Friday, November 14, 2014 16
3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp
3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp
3.4.3. Phương pháp mở cửa sổ
Chuẩn bị vỏ đậy cửa sổ
Vỏ đá vôi
Dùng máy khoan mini khoan vỏ trứng thành các mảnh
tròn có đường kính 1 cm.
Rửa sạch bụi với cồn 70o → rửa bằng PBS.
Bảo quản trong PBS để sử dụng cho các TN.
Friday, November 14, 2014 17
Chuẩn bị vỏ đậy cửa sổ
Màng vỏ
Tách màng vỏ ra khỏi màng đá vôi.
Rửa như mảnh vỏ đá vôi và bảo
quản trong PBS để dùng cho các TN
sau.
Friday, November 14, 2014 18
3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp
3.4.3. Phương pháp mở cửa sổ
Mở cửa sổ kết hợp
vi tiêm DNA
Friday, November 14, 2014 19
3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp
3.4.3. Phương pháp mở cửa sổ
Mở cửa sổ kết hợp vi tiêm DNA
Trứng gà được khử trùng bằng cách xông KMnO4
+ formon và đặt nằm ngang trước khi tiến hành vi
tiêm ít nhất 2h.
Dùng máy khoan mini cắt một vòng tròn nhỏ có
đường kính 0,5 cm trên phần vỏ đá vôi của trứng.
Friday, November 14, 2014 20
3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp
3.4.3. Phương pháp mở cửa sổ
Mở cửa sổ kết hợp vi tiêm DNA
Bôi paraffin xung quanh mép cửa sổ.
Gắp phần vỏ đá vôi đã khoan ra và nhỏ 1 giọt
PBS lên cửa sổ.
Trứng được đưa vào buồng thao tác vô trùng và
được xé rách màng vỏ bằng panh.
Friday, November 14, 2014 21
3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp
3.4.3. Phương pháp mở cửa sổ
Mở cửa sổ kết hợp vi tiêm DNA
Sử dụng kim vi tiêm tiêm 2 μl ADN vào
xoang dưới phôi (chú ý không để bọt khí đi
vào phôi).
Friday, November 14, 2014 22
3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp
3.4.3. Phương pháp mở cửa sổ
Mở cửa sổ kết hợp vi tiêm DNA
Lấy 1 miếng màng vỏ đậy lên cửa sổ.
Đậy tiếp 1 mảng đá vôi lên màng vỏ đã đậy.
Hàn kín cửa sổ bằng keo Duco.
Trứng được đem đi ấp và đặt theo chiều
thẳng đứng với đầu tù quay lên trên.
Friday, November 14, 2014 23
3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp
3.4.3. Phương pháp mở cửa sổ
3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp
3.4.4. Phương pháp ấp trứng
Trứng 0 giờ ấp sẽ được xông khử trùng bằng KMnO4 và focmon.
Trứng sau khi đã khử trùng được xếp vào khay với đầu tù quay lên trên.
Khay trứng được chuyển vào tủ ấp với chế độ ấp như sau:
Nhiệt độ: 37,8 oC.
Đảo trứng: 2h/lần. 10-12 lần/ngày.
Thông thoáng: vận tốc gió 77 cm/giây; tốc độ quạt: 300 vòng/phút.
Friday, November 14, 2014 24
Friday, November 14, 2014 25
3.5. Chuyển gen GFP bằng PP chuyển gen qua tinh trùng
Friday, November 14, 2014 26
3.5. Chuyển gen GFP bằng PP chuyển gen qua tinh trùng
3.5.1. Phương pháp lấy tinh trùng gà
Thực hiện thao tác gây xuất tinh ở gà
trống → cong đuôi lên → ngón cái và
ngón trỏ bóp nhẹ vào vùng lỗ huyệt và hơi
ấn vào bụng dưới lỗ huyệt để tăng thêm
kích thích.
Dùng một tay vén ngược đuôi gà lên để lộ
vùng huyệt → hứng tinh dịch.
Friday, November 14, 2014 27
3.5. Chuyển gen GFP bằng PP chuyển gen qua tinh trùng
3.5.2. Phương pháp xác định nồng độ tinh trùng
Pha loãng tinh dịch: Dùng ống trộn hồng cầu hút tinh dịch nguyên đến vạch
0.5, sau đó hút tiếp dung dịch NaCl 3% (để giết chết tinh trùng) đến vạch 101,
lắc nhẹ trong 2 - 3 phút để trộn đều dung dịch.
Bỏ 3 - 4 giọt đầu, rồi nhỏ 1 giọt lên buồng đếm hồng cầu, đậy lamen.
Friday, November 14, 2014 28
3.5. Chuyển gen GFP bằng PP chuyển gen qua tinh trùng
3.5.2. Phương pháp xác định nồng độ tinh trùng
Kết quả số lượng tế bào được tính theo công thức:
710.80
4000000.200.n
nC
Trong đó:
C: Nồng độ tinh trùng (tinh trùng/ml)
n: Số lượng tinh trùng có trong 80 ô vuông nhỏ
200: Số lần pha loãng tinh dịch
4.000 000: Thể tích 1 ô vuông nhỏ:1/4000000 cm3.(ml)
80: Tổng số ô vuông nhỏ đã đếm.
3.5.3. Phương pháp tạo phức hợp lipoplex (ADN- liposome)
Lắc nhẹ LipofectaminTM 2000, nhỏ 20 μl lên bề mặt của
100 μl môi trường Opti-MEM.
Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Nhỏ 8 μg ADN lên vị trí nhỏ LipofectaminTM 2000 ở trên.
Ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng để tạo thành phức hệ ADN-
Liposome.
Friday, November 14, 2014 29
3.5. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp
Friday, November 14, 2014 30
3.5. Chuyển gen GFP bằng PP chuyển gen qua tinh trùng
Lấy 1-1,5 ml tinh dịch thu được pha loãng với 4 ml môi trường DMEM không
có FBS (tỉ lệ pha loãng thích hợp nhất của tinh dịch và môi trường là 1:3).
Trộn đều phức hợp lipoplex với tinh dịch vừa thu được (tổng khoảng 6ml), ủ
20 - 50 phút rồi tiến hành TTNT cho gà mái.
3.5.4. Phương pháp chuyển phức hợp lipoplex vào tinh trùng
Friday, November 14, 2014 31
3.5. Chuyển gen GFP bằng PP chuyển gen qua tinh trùng
3.5.5. Phương pháp thụ tinh nhân tạo
3.6. Phương pháp thu nhận DNA từ gà mang gen chuyển
Phương pháp tách tế bào
phôi 7 ngày ấp và nuôi
cấy nguyên bào sợi
Friday, November 14, 2014 32
Phương pháp thu nhận
DNA từ tế bào hồng cầu
và nội quan gà
3.6.1. Phương pháp tách tế bào phôi 7 ngày ấp và nuôi cấy
nguyên bào sợi
Tách tế bào phôi 7 ngày ấp
Khử trùng trứng bằng cách lau cồn 70 độ.
Lấy phôi ra khỏi trứng và cho vào đĩa petri
đựng dung dịch muối sinh lý.
Rửa sạch 2, 3 lần bằng dung dịch sinh lý cho
sạch máu, lòng trắng và lòng đỏ trứng.
Friday, November 14, 2014 33
Tách tế bào phôi 7 ngày ấp
Chuyển phôi vào buồng thao tác vô trùng và rửa bằng PBS khoảng 2 lần.
Chuyển sang ống Eppendorf, cắt nhỏ trong 0,5ml trypsin 0.25% trong 2 phút.
Thêm 1 ml môi trường nuôi cấy để bất hoạt Trypsin.
Loại bỏ cặn to, thu dịch tế bào và dùng để nuôi cấy.
Friday, November 14, 2014 34
3.6.1. Phương pháp tách tế bào phôi 7 ngày ấp và nuôi cấy
nguyên bào sợi
Nuôi cấy đơn dòng
Đếm số lượng tế bào trong dịch huyền phù.
Hút dịch huyền phù tế bào chia vào 4 giếng đã có sẵn 0,5 ml MT nuôi cấy.
Sau 24 giờ, kiểm tra và thay môi trường cho các giếng nuôi cấy.
Sau 72 giờ, cấy chuyển và nuôi cấy in vitro → mật độ tế bào > 90% và tiến
hành sàng lọc puromycin để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển.
Friday, November 14, 2014 35
3.6.1. Phương pháp tách tế bào phôi 7 ngày ấp và nuôi cấy
nguyên bào sợi
Sàng lọc tế bào mang gen chuyển bằng kháng sinh puromycin
Stock Puromycin (10 μg/ml) → 1 μg/ml, 2 μg/ml và 3 μg/ml.
Friday, November 14, 2014 36
0 μg/ml
3 μg/ml
ĐC TN1 TN2 TN3 TN4 TN5
3.6.1. Phương pháp tách tế bào phôi 7 ngày ấp và nuôi cấy
nguyên bào sợi
Sàng lọc tế bào mang gen chuyển bằng kháng sinh puromycin
Sau 24 giờ - 48 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào đạt khoảng 0,5x106 tế bào/giếng, xử
lý bằng puromycin trên 2 lô: lô TN và lô ĐC.
Sau khi bổ sung puromycin vào các giếng nuôi cấy, lắc nhẹ để puromycin hoà
lẫn với môi trường và tiếp tục nuôi trong tủ ấm 37oC, 5% CO2.
Sau 24h bổ sung puromycin, mang mẫu quan sát và đếm số lượng tế bào.
Friday, November 14, 2014 37
3.6.1. Phương pháp tách tế bào phôi 7 ngày ấp và nuôi cấy
nguyên bào sợi
Đếm số lượng tế bào
Pha loãng huyền phù tế bào 200 lần bằng PBS sau đó dùng pipet nhỏ 1 giọt lên
buồng đếm hồng cầu, đậy lamen.
Nồng độ tế bào được tính theo công thức sau:
Friday, November 14, 2014 38
C = 80
000.000.4200xxn = n x 10 x 106
C - nồng độ tế bào (tế bào/ml dịch mẫu tế bào)
n - số lượng tế bào đếm được (trong 80 ô nhỏ)
200 - số lần pha loãng mẫu dịch tế bào
4.000.000 - thể tích của 1 ô con tính bằng cm3 (ml)
80 - tổng số ô con được đếm
3.6.1. Phương pháp tách tế bào phôi 7 ngày ấp và nuôi cấy
nguyên bào sợi
Phá vỡ tế bào
Tế bào sau khi lấy từ các giếng nuôi cấy sẽ được li tâm thu cặn tế bào.
Tế bào trong các giếng được cho vào khoảng 10 μ𝑙 dung dịch TE.
Để hỗn hợp tế bào trong TE vào nước ở 94oC trong khoảng 10 phút.
Friday, November 14, 2014 39
3.6.1. Phương pháp tách tế bào phôi 7 ngày ấp và nuôi cấy
nguyên bào sợi
Thu nhận DNA từ tế bào hồng cầu
Lấy máu gà 10 ngày tuổi.
Ly tâm với tốc độ 1200 RPM, trong 15 phút.
Loại bỏ huyết tương, thu hồng cầu.
Bổ sung thêm 0,5 ml TE.
Sau đó sử dụng bộ kit để tách ADN.
Friday, November 14, 2014 40
3.6.2. Phương pháp thu nhận DNA từ tế bào hồng cầu và nội
quan gà
Thu nhận DNA từ nội quan gà
Gà con khoảng 1 tháng tuổi.
Tách nội tạng của gà (gan, lách, ruột, phổi, tủy xương, tụy…) để riêng vào các
ống eppendorf có chứa dung dịch PBS.
Chuyển các nội quan sang các ống eppendorf có chứa sẵn dung dịch TE,
nghiền nát các nội quan.
Sử dụng bộ kit để tách ADN.Friday, November 14, 2014 41
3.6.2. Phương pháp thu nhận DNA từ tế bào hồng cầu và nội
quan gà
Sử dụng kĩ thuật Multiplex PCR với hai cặp mồi đặc hiệu cho eGFP.
Cặp mồi này sẽ khuếch đại đoạn ADN có kích thước 418 bp của gen eGFP.
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn ADN có kích thước 321 bp của
gen ribosome 18S ở gà để chứng minh sự hiện diện của hệ gen gà trong mẫu thí
nghiệm.
Friday, November 14, 2014 42
3.7. Phương pháp kiểm tra sự có mặt của DNA ngoại lai
3.7.1 Khuyếch đại bằng PCR
Friday, November 14, 2014 43
3.7. Phương pháp kiểm tra sự có mặt của DNA ngoại lai
3.7.1 Khuyếch đại bằng PCR
Tên mồi Trình tự mồi Nhiệt độ bắt cặp
GFPfor 5’ – ACA AGT TCA GCG TGT CCG – 3’ 55,3 0 C
GFPrev 5’ – TTC ACC TTG ATG CCG TTC – 3’ 55,2 O C
Tên mồi Trình tự mồi Nhiệt độ bắt cặp
18Sfor 5’ – GTC GGC GTC CAA CTT CTT – 3’ 55,4 0 C
18Srev 5’ – CGA TCC GAG GAC CTC ACT – 3’ 55,7 O C
Cặp mồi khuếch đại đoạn ADN có kích thước 418 bp của gen eGFP
Cặp mồi khuếch đại đoạn ADN có kích thước 321 bp của gen ribosome 18S
Friday, November 14, 2014 44
3.2.4. Phương pháp kiểm tra sự có mặt của DNA ngoại lai
3.7.1 Khuyếch đại bằng PCR
Thành phần Thể tích
H2O 13.75 μl
dNTP (10mM) 0.5 μl
Buffer 10X for Taq 2 μl
Taq (1 unit/μl) 1.5 μl
eGFP (primer) (10 μM) 1 μl
18S (primer)(10 μM) 0.25 μl
Template 1 μl
∑ 20 μl
Thành phần phản ứng PCR như sau:
Friday, November 14, 2014 45
3.7. Phương pháp kiểm tra sự có mặt của DNA ngoại lai
3.7.1 Khuyếch đại bằng PCR
Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian
1 94 7 phút
2 94 30 giây
3 59 1 phút
4 72 30 giây
5 Trở lại bước 2 35 chu kì
6 72 7 phút
7 4 60 phút
Chu kì nhiệt của phản ứng PCR như sau:
Friday, November 14, 2014 46
3.7. Phương pháp kiểm tra sự có mặt của DNA ngoại lai
3.7.2. Điện di kiểm tra sự có mặt của DNA ngoại lai
Chuẩn bị Gel Agarose
1,5 g agarose + 100 ml dung dịch đệm TBE 1X.
Đun sôi cho agarose tan hoàn toàn.
Để nguội xuống khoảng 50oC rồi đổ dung dịch agarose vào khay đã cài sẵn
lược. Sau khoảng 1h khi gel, gỡ lược ra và đặt bản gel vào bể điện di. Đổ đệm
TBE vào bể để dung dịch ngập mặt gel từ 1 - 2 mm.
Friday, November 14, 2014 47
3.7. Phương pháp kiểm tra sự có mặt của DNA ngoại lai
3.7.2. Điện di kiểm tra sự có mặt của DNA ngoại lai
Tra mẫu DNA
Lấy 10 μl sản phẩm PCR tra vào các giếng trong bản gel.
Chạy điện di ở hiệu điện thế 70 V, trong khoảng thời gian 45 phút.
Sau đó, tiếp tục chạy ở hiệu điện thế 90 V trong 10 phút.
Friday, November 14, 2014 48
3.7. Phương pháp kiểm tra sự có mặt của DNA ngoại lai
3.7.2. Điện di kiểm tra sự có mặt của DNA ngoại lai
Nhuộm ADN bằng Ethidium Bromide (EtBr)
Bản gel được nhẹ nhàng lấy ra khỏi khuôn và cho vào ngâm trong dung dịch EtBr
nồng độ 2 μg/ml trong khoảng 10 phút. Sau đó lấy bản gel ra tráng nước rồi quan
sát và chụp ảnh.
3.8. Kết quả
Friday, November 14, 2014 49
Gà chuyển gen GFP (bên trái và
gà thường (bên phải)
3.8. Kết quả
Friday, November 14, 2014 50
Kết quả điện di sản phẩm multiplex
PCR kiểm tra sự có mặt của gen
eGFP trong nguyên bào sợi gà
3.8. Kết quả
Friday, November 14, 2014 51
Kết quả điện di ADN thu được từ máu gà chuyển gen
Chuyển gen qua tinh trùng Vi tiêm
3.8. Kết quả
Friday, November 14, 2014 52
Kết quả điện di ADN thu từ các nội quan của gà con chuyển gen
Chuyển gen qua tinh trùng Vi tiêm