BIAŁKA W DIAGNOSTYCE LABORATORYJNEJ
Karolina SłapekGr. A/BIII OAM
Białka związki zbudowane z
aminokwasów (min. 100) połączonych wiązaniem
peptydowym -CONH-
FUNKCJE BIAŁEK katalityczna – enzymy strukturalna – np. kolagen, elastyna,
keratyna ochronna – immunoglobuliny skurcz – aktyna, miozyna transport – albumina (kw. tłuszczowe),
hemoglobina (tlen), transferyna (żelazo) regulacja hormonalna – insulina regulacja genowa - histony
BIAŁKA W DIAGNOSTYCE LABORATORYJNEJ
• OSOCZE/SUROWICA• MOCZ• PMR
OSOCZE/SUROWICARola białek osocza: dystrybucja płynów krew/przestrzeń
pozakomórkowa hemostaza i koagulacja funkcje transportowe (nośniki hormonów,
metabolitów, metali, leków) enzymy, regulatory białka ukł. odpornościowego składniki ukł. buforowego hormony i receptory składniki ukł. tkanki łącznej materiał odżywczy
OSOCZE/SUROWICAPowstawanie białek: albumina – wątroba immunoglobuliny – limfocyty hormony, enzymy, apoproteiny – różne narządy
Utrata białek: katabolizowane w wątrobie albuminy – rozkład w skórze trawienie w przewodzie pokarmowym (5g/dobę) filtracja nerkowa (20-80mg białka, w tym nie
więcej niż 30mg albuminy; większość resorbowana)
OSOCZE/SUROWICA
Stężenie białka całkowitego w osoczu w warunkach
prawidłowych wynosi 66-87g/l (w surowicy – brak
fibrynogenu – wynosi 65-82g/l).
OSOCZE/SUROWICA
Prawidłowy poziom białka całkowitego zależy głównie od równowagi między syntezą i
degradacją dwóch głównych frakcji białkowych: albumin i
immunoglobulin. Inne frakcje białka nie wpływają znacząco na
poziom białka całkowitego.
OSOCZE/SUROWICAHipoproteinemie: obniżenie poziomu białek w wyniku utraty
białek, zahamowania ich syntezy lub rozcieńczenia krwi
główną przyczyną jest zmniejszenie stężenia albuminy w łożysku naczyniowym (rzadko niedobór immunoglobulin)
obniżenie wartości stosunku albumina/globulina obserwujemy w:• marskości wątroby• zespole nerczycowym• niektórych chorobach infekcyjnych• szpiczaku mnogim
OSOCZE/SUROWICAHiperproteinemie: powstają w wyniku zwiększonej
produkcji jednej lub wielu klas Ig zwiększeniu stężenia
immunoglobulin często towarzyszy obniżenie poziomu albuminy
hiperproteinemia z hiperalbuminemią mogą być wywołane odwodnieniem lub artefaktem (zbyt długo zaciśnięta staza)
OSOCZE/SUROWICAPrzyczyny hiperproteinemi: hipergammaglobulinemie monoklonalne�• szpiczak mnogi, • makroglobulinemia Waldenströma,• nowotwory układu chłonnego,
hipergammaglobulinemie poliklonalne • przewlekłe stany zapalne, • choroby autoimmunologiczne,
przewlekłe choroby wątroby • marskość, • wirusowe zapalenia,
błędy w pobieraniu krwi
OSOCZE/SUROWICAOdczyn Biernackiego a białka
osocza?
Szybkość OB jest wypadkową składu osocza oraz właściwości
erytrocytów. Zwiększenie stężenia fibrynogenu, białek
ostrej fazy oraz spadek stężenia albuminy powodują wzrost OB.
OSOCZE/SUROWICAPrawidłowy skład frakcji białkowych
surowicy w rozdziale elektroforetycznym
FRAKCJA % BIAŁKAalbuminy 55.0 – 70.0 albumina
α1 1.1 – 4.2 α1-antytrypsyna, α1-kw. glikoproteina, α-lipoproteina
α2 4.4 – 13.0 α2-makroglobulina, haptoglobina
β 7.3 – 13.5 transferyna, β-lipoproteina, frakcja C3 dopełniacza
γ 8.1 – 19.9 Immunoglobuliny, białko C-reaktywne
OSOCZE/SUROWICA
Elektroforeza białek surowicy
Polega na rozdziale białek surowicy w polu elektrycznym na różnego rodzaju
podłożach w buforze o zasadowym pH. W tych warunkach większość białek jest anionami i wędruje w kierunku anody (zwłaszcza białka
mniejsze – albuminy i α-globuliny).
OSOCZE/SUROWICA
OSOCZE/SUROWICA
OSOCZE/SUROWICA
OSOCZE/SUROWICA
OSOCZE/SUROWICA
OSOCZE/SUROWICAAlbumina: prawidłowa zawartość – 40-52g/l synteza w wątrobie, rozkład w skórze bisalbuminemia analbuminemia niespecyficzny system transportowy
(hormony, witaminy, Ca, Mg, kw. tłuszczowe, leki, bilirubina, lipidy)
OSOCZE/SUROWICABiałka ostrej fazy: grupa białek syntetyzowanych w wątrobie,
których poziom wzrasta w przebiegu stanów zapalnych, chorób zakaźnych, urazów, nowotworów oraz procesów martwiczych
czynniki aktywujące syntezę białek: produkty rozpadu uszkodzonych tkanek, cytokiny
zaliczamy:• α1-antytrypsynę (AAT)• α1-kwaśną glikoproteinę (AAG)• haptoglobinę• ceruloplazminę (CER)• fibrynogen• białko C-reaktywne
OSOCZE/SUROWICAUjemne białka ostrej fazy:
Albumina� Transferryna� Prealbumina�
Dodatnie białka ostrej fazy: fibrynogen� � α1- antytrypsyna (AAT) ceruloplazmina� haptoglobina (HP)� białko C-reaktywne (CRP)� surowicze amyloidowe białko A (SAA)� laktoferryna� białka układu dopełniacza�
OSOCZE/SUROWICA α1-antytrypsyna – inhibitor proteaz; inhibicja elastazy
uwalnianej podczas fagocytozy przez granulocyty wielojądrzaste;
α1-glikoproteina – odpowiada za wiązanie i transport progesteronu; wzrost w stanach zapalnych, spadek w ciężkich uszkodzeniach wątroby;
haptoglobina – odpowiada za wiązanie i transport Hb pozakrwinkowej;
ceruloplazmina – katalizuje utlenianie Fe2+ do Fe3+
fibrynogen – ważne białko układu krzepnięcia białko C-reaktywne – jego poziom wzrasta w zakażeniach
bakteryjnych, rozległych urazach, chorobach nowotworowych, oparzeniach oraz martwicach narządowych;
α2-makroblobulina – drugi po AAT inhibitor proteaz takich jak trypsyna, chymotrypsyna, trombina, plazmina i kalikreina;
transferyna – transportuje jony Fe3+ do szpiku kostnego; białka układu dopełniacza – zespół ok. 20 różnych białek; jego
działanie polega na aktywacji kaskady enzymatycznej, doprowadzającej do szeregu zjawisk mających istotne znaczenie w przebiegu odpowiedzi immunologicznej i reakcji zapalnej.
OSOCZE/SUROWICAImmunoglobuliny: syntetyzowane przez limfocyty B mają zdolność do swoistego
rozpoznawania antygenu
OSOCZE/SUROWICA IgG – główne przeciwciała wtórnej odpowiedzi
centralnego systemu odpornościowego IgD – mało poznane przeciwciała receptorowe
występujące na powierzchni limfocytów B IgE – wysoko cytofilne przeciwciała alergicznej
odpowiedzi typu 1 (alergia anafilaktyczna); występują w krążeniu w niewielkiej ilości, opłaszczone są gł. na bazofilach i mastocytach
IgA – występują w 2 podklasach:• IgA1 – niewielka grupa przeciwciał monomerycznych
występujących w krążeniu• IgA2 – przeciwciała dimeryczne; uczestniczą w we wtórnej
odpowiedzi śluzówkowej systemu MALT IgM – główne przeciwciała pierwotnej fazy odpowiedzi
humoralnej; są pentamerami (rzadziej heksamerami)
OSOCZE/SUROWICA
OSOCZE/SUROWICAHipogammaglobulinemie: nabyte:• nowotwory układu chłonnego• po usunięciu śledziony• jelitowe i nerkowe zespoły utraty białka• leczenie cytostatykami lub
promieniowaniem jonizującym• niedokrwistość złośliwa, hemoglobinopatie• zaburzenia dojrzewania immunoglobulin u
dzieci
OSOCZE/SUROWICA Wrodzone• izolowane niedobory IgA lub IgM• agammaglobulinemia związana z
płcią (chłopcy – wszystkie Ig ↓↓)• kombinowany zespół niedoboru
immunologicznego (IgG ↓, limfopenia, deaminaza adenozyny ↓)• niedobór przeciwciał z niezbornością
naczyniakową• niedobór immunologiczny z trombocytopenią
OSOCZE/SUROWICAHipergammaglobulinemia: reakcja organizmu na różnego typu zakażenia odpowiedź poliklonalna – Ag mikroorganizmów
powodują stymulację licznych linii limfocytarnych• ostre stany zapalne• ostre WZW• marskość wątroby• AIDS
odpowiedź monoklonalna – w wyniku chorób nowotworowych ukł. chłonnego dochodzi do rozrostu pojedynczych linii limfocytów B• przewlekłe białaczki limfatyczne• szpiczaki• chłoniaki
MOCZW warunkach fizjologicznych nerki wydalają
niewielką ilość białka – do 150mg/24h.
Podwyższona ilość białka pojawia się najczęściej w chorobach nerek przy
zwiększonej przepuszczalności kłębuszków nerkowych.
Mikroalbuminuria to zwiększone wydalanie albumin (powyżej 30mg/24h) przy nie
ujawniającym się białku w moczu. Służy do wczesnego wykrywania nefropatii.
MOCZRodzaje białkomoczu
Rodzaj białkomoczu Ilość białkaprawidłowy <150mg/24h
znikomy <500mg/24hmierny 0.5 – 3.5g/24h
masywny >3.5g/24h
MOCZRodzaje białkomoczu:1. przednerkowy
gammapatie monoklonalne zespoły hemolityczne mioglobinemie
2. kłębkowy kłębkowe zapalenie nerek (dzieci) nadciśnienie gammapatie monoklonalne
3. kanalikowy przeszczepy nerek choroby układowe
4. pozanerkowy zapalenie dróg moczowych nowotwory uszkodzenia mechaniczne
PMR
Białko całkowite w PMR wynosi 0,15 – 0,45g/l, z czego 80% pochodzi z surowicy a 20% powstaje lokalnie
w przestrzeni wewnątrzczaszkowej.
PMRBadanie elektroforetyczne PMR ma
duże znaczenie w diagnostyce stanów zapalnych mózgu oraz
przy zaburzeniach przepuszczalności ścian splotu
naczyniowego.
Przed rozdziałem elektroforetycznym PMR musi
być 100-200-krotnie zagęszczony!
PMRPrawidłowy obraz elektroforetyczny
PMR:- obecne wszystkie frakcje
występujące w surowicy- duża zawartość β-globulin- zmniejszona zawartość γ-globulin- frakcja V-prealbuminy oraz frakcja τ
znajdują się między β i γ-globulinami- brak fibrynogenu
PMR
Głównym celem badań poziomu białka całkowitego i białek specyficznych jest ocena
przepuszczalności bariery krew-PMR oraz wykrywanie
wewnątrzpłynowej syntezy immunoglobulin.
PMRI = albumina PMR(mg/dl)/albumina
surowica(g/dl) ~<9
I<9 – prawidłowa bariera krew-PMRI=9-14 – lekkie upośledzenieI=14-30 – umiarkowane upośledzenieI=30-100 – poważne upośledzenieI>100 – całkowite załamanie bariery
PMRI=IgG PMR/albumina PMR ~<0.27
Wartość współczynnika wyższa niż 0.27 wskazuje na
wewnątrzpłynową syntezę IgG.
PMRWskaźnik Linka i Tiblinga
I= [IgG PMR/IgGsur]/[Alb PMR/Albsur] ~<0.7
IgG PMR – stężenie IgG w PMR IgGsur - stężenie IgG w surowicy Alb PMR – stężenie albuminy w PMR Albsur– stężenie albuminy w surowicy
Wartości wyższe niż 0,7 świadczą o syntezie IgG w PMR.
METODY OZNACZANIA BIAŁEK
Metoda biuretowa Metoda Lowry’ego (Folin-Ciocalteu) Metoda z użyciem kwasu bis-
cynchoninowego Metoda Bradforda Absorbancja w nadfiolecie Metoda nefelometryczna Metoda turbidymetryczna
METODY OZNACZANIA BIAŁEK
Metoda biuretowaOdczynniki: CuSO4, winian sodowo-potasowy,
NaOH, KIPomiar absorbancji: 540nmZakres liniowości metody: 2-15g/lZasada metody: reakcja jonów Cu2+ z wiązaniem
peptydowymZastosowanie: pomiar białka całkowitego w
surowicy
METODY OZNACZANIA BIAŁEK
Metoda Lowry’egoOdczynniki: CuSO4, winian sodowo-potasowy,
NaOH, Na2CO3, odczynnik Folin-CiocalteuPomiar absorbancji: 750nmZakres liniowości metody: 10mg/l-1g/lZasada metody: 1) reakcja aminokwasów z
odczynnikiem Folina 2) reakcja biuretowa
Materiał: mocz, PMR
METODY OZNACZANIA BIAŁEK
Metoda z użyciem kwasu bis-cynchoninowego (BCA)
Odczynniki: Na2CO3, NaOH, winian sodowy, CuSO4, BCA
Pomiar absorbancji: 562nmZakres liniowości metody: 0.1-1g/l (mikrometoda) lub
0.5-10mg/l (makrometoda)Zasada metody: w alkalicznym środowisku niektóre
składniki białek (tyrozyna, tryptofan, cysteina, cystyna) redukują jony Cu2+ do Cu1+ (które tworzą barwny kompleks z BCA)
METODY OZNACZANIA BIAŁEK
Metoda BradfordaOdczynniki: Coommassie Brillant Blue G-250 (CBB
G250), 95% etanol, 85% kwas fosforowyPomiar absorbancji: 595nmZakres liniowości metody: 1-10μg (mikrometoda) lub
10-100μg (makrometoda)Zasada metody: w metodzie wykorzystuje się
zdolność wiązania barwnika błękitu brylantowego - CBB G250 z grupami aminowymi białek.
METODY OZNACZANIA BIAŁEK
Absorbancja w nadfiolecie
Pomiar absorbancji roztworu białka przy dł. fali 280nm
Metoda używana do oszacowania stężenia białka.
METODY OZNACZANIA BIAŁEK
Metoda nefelometryczna
Polega na pomiarze natężenia światła rozproszonego pod kątem różnym od 180
stopni w stosunku do kąta padania światła.
Nie nadaje się do oznaczeń w roztworach wstępnie mętnych.
METODY OZNACZANIA BIAŁEK
Metoda turbidymetryczna
Odczynniki: kwas trichlorooctowy (TCA), kwas sulfosalicylowy, chlorek benzetonium, NaOH
Zakres liniowości metody: 2-200mg/dlZastosowanie: pomiar białka całkowitego w
moczu i PMR
Dziękuję za uwagę
Top Related