BIAŁKA W DIAGNOSTYCE LABORATORYJNEJ

Karolina SłapekGr. A/BIII OAM

Białka związki zbudowane z

aminokwasów (min. 100) połączonych wiązaniem

peptydowym -CONH-

FUNKCJE BIAŁEK katalityczna – enzymy strukturalna – np. kolagen, elastyna,

keratyna ochronna – immunoglobuliny skurcz – aktyna, miozyna transport – albumina (kw. tłuszczowe),

hemoglobina (tlen), transferyna (żelazo) regulacja hormonalna – insulina regulacja genowa - histony

BIAŁKA W DIAGNOSTYCE LABORATORYJNEJ

• OSOCZE/SUROWICA• MOCZ• PMR

OSOCZE/SUROWICARola białek osocza: dystrybucja płynów krew/przestrzeń

pozakomórkowa hemostaza i koagulacja funkcje transportowe (nośniki hormonów,

metabolitów, metali, leków) enzymy, regulatory białka ukł. odpornościowego składniki ukł. buforowego hormony i receptory składniki ukł. tkanki łącznej materiał odżywczy

OSOCZE/SUROWICAPowstawanie białek: albumina – wątroba immunoglobuliny – limfocyty hormony, enzymy, apoproteiny – różne narządy

Utrata białek: katabolizowane w wątrobie albuminy – rozkład w skórze trawienie w przewodzie pokarmowym (5g/dobę) filtracja nerkowa (20-80mg białka, w tym nie

więcej niż 30mg albuminy; większość resorbowana)

OSOCZE/SUROWICA

Stężenie białka całkowitego w osoczu w warunkach

prawidłowych wynosi 66-87g/l (w surowicy – brak

fibrynogenu – wynosi 65-82g/l).

OSOCZE/SUROWICA

Prawidłowy poziom białka całkowitego zależy głównie od równowagi między syntezą i

degradacją dwóch głównych frakcji białkowych: albumin i

immunoglobulin. Inne frakcje białka nie wpływają znacząco na

poziom białka całkowitego.

OSOCZE/SUROWICAHipoproteinemie: obniżenie poziomu białek w wyniku utraty

białek, zahamowania ich syntezy lub rozcieńczenia krwi

główną przyczyną jest zmniejszenie stężenia albuminy w łożysku naczyniowym (rzadko niedobór immunoglobulin)

obniżenie wartości stosunku albumina/globulina obserwujemy w:• marskości wątroby• zespole nerczycowym• niektórych chorobach infekcyjnych• szpiczaku mnogim

OSOCZE/SUROWICAHiperproteinemie: powstają w wyniku zwiększonej

produkcji jednej lub wielu klas Ig zwiększeniu stężenia

immunoglobulin często towarzyszy obniżenie poziomu albuminy

hiperproteinemia z hiperalbuminemią mogą być wywołane odwodnieniem lub artefaktem (zbyt długo zaciśnięta staza)

OSOCZE/SUROWICAPrzyczyny hiperproteinemi: hipergammaglobulinemie monoklonalne�• szpiczak mnogi, • makroglobulinemia Waldenströma,• nowotwory układu chłonnego,

hipergammaglobulinemie poliklonalne • przewlekłe stany zapalne, • choroby autoimmunologiczne,

przewlekłe choroby wątroby • marskość, • wirusowe zapalenia,

błędy w pobieraniu krwi

OSOCZE/SUROWICAOdczyn Biernackiego a białka

osocza?

Szybkość OB jest wypadkową składu osocza oraz właściwości

erytrocytów. Zwiększenie stężenia fibrynogenu, białek

ostrej fazy oraz spadek stężenia albuminy powodują wzrost OB.

OSOCZE/SUROWICAPrawidłowy skład frakcji białkowych

surowicy w rozdziale elektroforetycznym

FRAKCJA % BIAŁKAalbuminy 55.0 – 70.0 albumina

α1 1.1 – 4.2 α1-antytrypsyna, α1-kw. glikoproteina, α-lipoproteina

α2 4.4 – 13.0 α2-makroglobulina, haptoglobina

β 7.3 – 13.5 transferyna, β-lipoproteina, frakcja C3 dopełniacza

γ 8.1 – 19.9 Immunoglobuliny, białko C-reaktywne

OSOCZE/SUROWICA

Elektroforeza białek surowicy

Polega na rozdziale białek surowicy w polu elektrycznym na różnego rodzaju

podłożach w buforze o zasadowym pH. W tych warunkach większość białek jest anionami i wędruje w kierunku anody (zwłaszcza białka

mniejsze – albuminy i α-globuliny).

OSOCZE/SUROWICA

OSOCZE/SUROWICA

OSOCZE/SUROWICA

OSOCZE/SUROWICA

OSOCZE/SUROWICA

OSOCZE/SUROWICAAlbumina: prawidłowa zawartość – 40-52g/l synteza w wątrobie, rozkład w skórze bisalbuminemia analbuminemia niespecyficzny system transportowy

(hormony, witaminy, Ca, Mg, kw. tłuszczowe, leki, bilirubina, lipidy)

OSOCZE/SUROWICABiałka ostrej fazy: grupa białek syntetyzowanych w wątrobie,

których poziom wzrasta w przebiegu stanów zapalnych, chorób zakaźnych, urazów, nowotworów oraz procesów martwiczych

czynniki aktywujące syntezę białek: produkty rozpadu uszkodzonych tkanek, cytokiny

zaliczamy:• α1-antytrypsynę (AAT)• α1-kwaśną glikoproteinę (AAG)• haptoglobinę• ceruloplazminę (CER)• fibrynogen• białko C-reaktywne

OSOCZE/SUROWICAUjemne białka ostrej fazy:

Albumina� Transferryna� Prealbumina�

Dodatnie białka ostrej fazy: fibrynogen� � α1- antytrypsyna (AAT) ceruloplazmina� haptoglobina (HP)� białko C-reaktywne (CRP)� surowicze amyloidowe białko A (SAA)� laktoferryna� białka układu dopełniacza�

OSOCZE/SUROWICA α1-antytrypsyna – inhibitor proteaz; inhibicja elastazy

uwalnianej podczas fagocytozy przez granulocyty wielojądrzaste;

α1-glikoproteina – odpowiada za wiązanie i transport progesteronu; wzrost w stanach zapalnych, spadek w ciężkich uszkodzeniach wątroby;

haptoglobina – odpowiada za wiązanie i transport Hb pozakrwinkowej;

ceruloplazmina – katalizuje utlenianie Fe2+ do Fe3+

fibrynogen – ważne białko układu krzepnięcia białko C-reaktywne – jego poziom wzrasta w zakażeniach

bakteryjnych, rozległych urazach, chorobach nowotworowych, oparzeniach oraz martwicach narządowych;

α2-makroblobulina – drugi po AAT inhibitor proteaz takich jak trypsyna, chymotrypsyna, trombina, plazmina i kalikreina;

transferyna – transportuje jony Fe3+ do szpiku kostnego; białka układu dopełniacza – zespół ok. 20 różnych białek; jego

działanie polega na aktywacji kaskady enzymatycznej, doprowadzającej do szeregu zjawisk mających istotne znaczenie w przebiegu odpowiedzi immunologicznej i reakcji zapalnej.

OSOCZE/SUROWICAImmunoglobuliny: syntetyzowane przez limfocyty B mają zdolność do swoistego

rozpoznawania antygenu

OSOCZE/SUROWICA IgG – główne przeciwciała wtórnej odpowiedzi

centralnego systemu odpornościowego IgD – mało poznane przeciwciała receptorowe

występujące na powierzchni limfocytów B IgE – wysoko cytofilne przeciwciała alergicznej

odpowiedzi typu 1 (alergia anafilaktyczna); występują w krążeniu w niewielkiej ilości, opłaszczone są gł. na bazofilach i mastocytach

IgA – występują w 2 podklasach:• IgA1 – niewielka grupa przeciwciał monomerycznych

występujących w krążeniu• IgA2 – przeciwciała dimeryczne; uczestniczą w we wtórnej

odpowiedzi śluzówkowej systemu MALT IgM – główne przeciwciała pierwotnej fazy odpowiedzi

humoralnej; są pentamerami (rzadziej heksamerami)

OSOCZE/SUROWICA

OSOCZE/SUROWICAHipogammaglobulinemie: nabyte:• nowotwory układu chłonnego• po usunięciu śledziony• jelitowe i nerkowe zespoły utraty białka• leczenie cytostatykami lub

promieniowaniem jonizującym• niedokrwistość złośliwa, hemoglobinopatie• zaburzenia dojrzewania immunoglobulin u

dzieci

OSOCZE/SUROWICA Wrodzone• izolowane niedobory IgA lub IgM• agammaglobulinemia związana z

płcią (chłopcy – wszystkie Ig ↓↓)• kombinowany zespół niedoboru

immunologicznego (IgG ↓, limfopenia, deaminaza adenozyny ↓)• niedobór przeciwciał z niezbornością

naczyniakową• niedobór immunologiczny z trombocytopenią

OSOCZE/SUROWICAHipergammaglobulinemia: reakcja organizmu na różnego typu zakażenia odpowiedź poliklonalna – Ag mikroorganizmów

powodują stymulację licznych linii limfocytarnych• ostre stany zapalne• ostre WZW• marskość wątroby• AIDS

odpowiedź monoklonalna – w wyniku chorób nowotworowych ukł. chłonnego dochodzi do rozrostu pojedynczych linii limfocytów B• przewlekłe białaczki limfatyczne• szpiczaki• chłoniaki

MOCZW warunkach fizjologicznych nerki wydalają

niewielką ilość białka – do 150mg/24h.

Podwyższona ilość białka pojawia się najczęściej w chorobach nerek przy

zwiększonej przepuszczalności kłębuszków nerkowych.

Mikroalbuminuria to zwiększone wydalanie albumin (powyżej 30mg/24h) przy nie

ujawniającym się białku w moczu. Służy do wczesnego wykrywania nefropatii.

MOCZRodzaje białkomoczu

Rodzaj białkomoczu Ilość białkaprawidłowy <150mg/24h

znikomy <500mg/24hmierny 0.5 – 3.5g/24h

masywny >3.5g/24h

MOCZRodzaje białkomoczu:1. przednerkowy

gammapatie monoklonalne zespoły hemolityczne mioglobinemie

2. kłębkowy kłębkowe zapalenie nerek (dzieci) nadciśnienie gammapatie monoklonalne

3. kanalikowy przeszczepy nerek choroby układowe

4. pozanerkowy zapalenie dróg moczowych nowotwory uszkodzenia mechaniczne

PMR

Białko całkowite w PMR wynosi 0,15 – 0,45g/l, z czego 80% pochodzi z surowicy a 20% powstaje lokalnie

w przestrzeni wewnątrzczaszkowej.

PMRBadanie elektroforetyczne PMR ma

duże znaczenie w diagnostyce stanów zapalnych mózgu oraz

przy zaburzeniach przepuszczalności ścian splotu

naczyniowego.

Przed rozdziałem elektroforetycznym PMR musi

być 100-200-krotnie zagęszczony!

PMRPrawidłowy obraz elektroforetyczny

PMR:- obecne wszystkie frakcje

występujące w surowicy- duża zawartość β-globulin- zmniejszona zawartość γ-globulin- frakcja V-prealbuminy oraz frakcja τ

znajdują się między β i γ-globulinami- brak fibrynogenu

PMR

Głównym celem badań poziomu białka całkowitego i białek specyficznych jest ocena

przepuszczalności bariery krew-PMR oraz wykrywanie

wewnątrzpłynowej syntezy immunoglobulin.

PMRI = albumina PMR(mg/dl)/albumina

surowica(g/dl) ~<9

I<9 – prawidłowa bariera krew-PMRI=9-14 – lekkie upośledzenieI=14-30 – umiarkowane upośledzenieI=30-100 – poważne upośledzenieI>100 – całkowite załamanie bariery

PMRI=IgG PMR/albumina PMR ~<0.27

Wartość współczynnika wyższa niż 0.27 wskazuje na

wewnątrzpłynową syntezę IgG.

PMRWskaźnik Linka i Tiblinga

I= [IgG PMR/IgGsur]/[Alb PMR/Albsur] ~<0.7

IgG PMR – stężenie IgG w PMR IgGsur - stężenie IgG w surowicy Alb PMR – stężenie albuminy w PMR Albsur– stężenie albuminy w surowicy

Wartości wyższe niż 0,7 świadczą o syntezie IgG w PMR.

METODY OZNACZANIA BIAŁEK

Metoda biuretowa Metoda Lowry’ego (Folin-Ciocalteu) Metoda z użyciem kwasu bis-

cynchoninowego Metoda Bradforda Absorbancja w nadfiolecie Metoda nefelometryczna Metoda turbidymetryczna

METODY OZNACZANIA BIAŁEK

Metoda biuretowaOdczynniki: CuSO4, winian sodowo-potasowy,

NaOH, KIPomiar absorbancji: 540nmZakres liniowości metody: 2-15g/lZasada metody: reakcja jonów Cu2+ z wiązaniem

peptydowymZastosowanie: pomiar białka całkowitego w

surowicy

METODY OZNACZANIA BIAŁEK

Metoda Lowry’egoOdczynniki: CuSO4, winian sodowo-potasowy,

NaOH, Na2CO3, odczynnik Folin-CiocalteuPomiar absorbancji: 750nmZakres liniowości metody: 10mg/l-1g/lZasada metody: 1) reakcja aminokwasów z

odczynnikiem Folina 2) reakcja biuretowa

Materiał: mocz, PMR

METODY OZNACZANIA BIAŁEK

Metoda z użyciem kwasu bis-cynchoninowego (BCA)

Odczynniki: Na2CO3, NaOH, winian sodowy, CuSO4, BCA

Pomiar absorbancji: 562nmZakres liniowości metody: 0.1-1g/l (mikrometoda) lub

0.5-10mg/l (makrometoda)Zasada metody: w alkalicznym środowisku niektóre

składniki białek (tyrozyna, tryptofan, cysteina, cystyna) redukują jony Cu2+ do Cu1+ (które tworzą barwny kompleks z BCA)

METODY OZNACZANIA BIAŁEK

Metoda BradfordaOdczynniki: Coommassie Brillant Blue G-250 (CBB

G250), 95% etanol, 85% kwas fosforowyPomiar absorbancji: 595nmZakres liniowości metody: 1-10μg (mikrometoda) lub

10-100μg (makrometoda)Zasada metody: w metodzie wykorzystuje się

zdolność wiązania barwnika błękitu brylantowego - CBB G250 z grupami aminowymi białek.

METODY OZNACZANIA BIAŁEK

Absorbancja w nadfiolecie

Pomiar absorbancji roztworu białka przy dł. fali 280nm

Metoda używana do oszacowania stężenia białka.

METODY OZNACZANIA BIAŁEK

Metoda nefelometryczna

Polega na pomiarze natężenia światła rozproszonego pod kątem różnym od 180

stopni w stosunku do kąta padania światła.

Nie nadaje się do oznaczeń w roztworach wstępnie mętnych.

METODY OZNACZANIA BIAŁEK

Metoda turbidymetryczna

Odczynniki: kwas trichlorooctowy (TCA), kwas sulfosalicylowy, chlorek benzetonium, NaOH

Zakres liniowości metody: 2-200mg/dlZastosowanie: pomiar białka całkowitego w

moczu i PMR

Dziękuję za uwagę