UNIVERSIDADE PARANAENSE
ANÁLISE QUANTITATIVA E MORFOMETRIA DE NEURÔNIOS DO PLEXO MIENTÉRICO DO ÍLEO E
CÓLON DESCENDENTE DE RATOS INFECTADOS POR Toxoplasma gondii
ELAINE YAE YAMASHITA SUGAUARA
UMUARAMA, 2008
UNIVERSIDADE PARANAENSE - UNIPAR Mestrado em Ciência Animal
ANÁLISE QUANTITATIVA E MORFOMETRIA DE NEURÔNIOS DO PLEXO MIENTÉRICO DO ÍLEO E
CÓLON DESCENDENTE DE RATOS INFECTADOS POR Toxoplasma gondii
ELAINE YAE YAMASHITA SUGAUARA
Orientador: Prof. Dr. EDUARDO JOSÉ DE ALMEIDA ARAÚJO
Dissertação apresentada a Universidade Paranaense como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal.
UMUARAMA - PR
FEVEREIRO DE 2008
S947a Sugauara, Elaine Yae Yamashita Análise quantitativa e morfométrica de neurônios do plexo
mientérico do íleo e cólon descendente de ratos infectados por toxoplasma gondii / Elaine Yae Yamashita Sugauara.
Umuarama: Universidade Paranaense - UNIPAR, 2008. 72 f.
Orientador: Prof. Dr.Eduardo José de Almeida Araújo.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Paranaense - UNIPAR
1. Ciências médicas 2. Toxoplasmose. 3.
Sistema nervoso
1.
entérico. 4. Morfologia. I. Universidade Paranaense
2.
UNIPAR. II. Título. 3.
(21 ed) CDD:
Bibliotecária Responsável Inês Gemelli CRB 9/966
UNIVERSIDADE PARANAENSE - UNIPAR Mestrado em Ciência Animal
ELAINE YAE YAMASHITA SUGAUARA
ANÁLISE QUANTITATIVA E MORFOMETRIA DE NEURÔNIOS DO PLEXO MIENTÉRICO DO ÍLEO E
CÓLON DESCENDENTE DE RATOS INFECTADOS POR Toxoplasma gondii
ORIENTADOR: Prof. Dr. Eduardo José de Almeida Araújo
Aprovada em: 27/02/2008
EXAMINADORES:
Prof. Dr. Eduardo José de Almeida Araújo - Presidente ________________________ Profa. Dra. Sandra Regina Stabille ________________________________________ Profa. Dra. Sônia Lucy Molinari ___________________________________________
Umuarama, 27 de Fevereiro de 2008
Dedico este trabalho ao esposo Takeshi e
as minhas filhas Regina, Rosângela e Elisângela, que foram à essência da minha luta e perseverança.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeço a Deus por ter me dado a oportunidade de estar no mundo, abençoar-me, iluminando o caminho trilhado, dado a sabedoria durante todo este período, assim como condições de superar dificuldades e contemplar a vitória.
Aos meus pais Hissayoshi e Yoshino (in memoriam) por ter me dado a vida e, proporcionado uma educação.
A toda minha família, principalmente, ao meu esposo Takeshi, minhas filhas Regina, Rosângela e Elisângela, que representaram para mim a união nos momentos
importantes, ampararam-me e acompanharam todo o desenvolvimento deste trabalho, incentivando e tornando possível a realização desse sonho.
Ao meu orientador Prof. Dr. Eduardo José de Almeida Araújo, que foi mais que um orientador, foi um amigo, com quem aprendi o verdadeiro significado de
companheirismo, tendo compartilhado minhas angústias nos momentos de dificuldades, durante estes dois últimos anos, incentivando-me a ser persistente diante das dificuldades, das minhas limitações, orientando-me com dedicação, com demonstrações de amor e confiança, para a concretização deste sonho que se torna realidade.
Ao Prof. Dr. Aristeu Vieira da Silva, como exemplo de pessoa, com uma forma toda especial pela atenção e prestatividade no esclarecimento de dúvidas e na valiosa contribuição para a realização deste trabalho.
À Profa. Dra. Débora de Mello Gonçales Sant Ana, de argüir as idéias dos artigos apresentados neste trabalho, com a sua valiosa contribuição.
Ao Prof. Dr. José Ricardo Pachaly, pela importante contribuição na anestesia dos animais.
Ao Prof. Jean Michel Rezende pela tradução dos artigos para a língua inglesa.
À Profa. Tatiane Henrique Sousa Machado pela revisão da língua portuguesa. À Sra. Inês Gemelli, bibliotecária da Universidade Paranaense, pela confecção
da ficha catalográfica. A todo o corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da
UNIPAR. À minha amiga Susiana Galli, com seu jeito meigo de ser, foi uma
incentivadora durante esse período. Aos secretários da Pós-Graduação Stricto Sensu pela atenção e dedicação. À colaboração da Ana Lucia Sartori pela ajuda na formatação da dissertação,
com dedicação e entusiasmo. Aos alunos de iniciação científica do Laboratório de Neurogastroenterologia
Experimental da UNIPAR: Anderson, Barbara, Elisângela, Elton, Janaina e Neide, pelo
auxílio na coleta de dados. Meus sinceros agradecimentos, sem vocês não seria possível à concretização deste trabalho.
Meus agradecimentos especiais a Universidade Paranaense (UNIPAR), campus sede (Umuarama), pela oportunidade concedida ao ingresso neste programa
de mestrado.
A todos que colaboraram direta ou indiretamente para a concretização desta pesquisa, expresso minha eterna gratidão. Essa pesquisa não seria realizada sem a significativa contribuição de vocês. Muito Obrigada!
A cada dia que nasce levanta-se um
grupo de pessoas que estão dando de si para fazer uma significativa diferença neste mundo. Elas estão apresentando novas idéias, buscando soluções e evidenciando uma força de compromisso incomum. Essas pessoas simplesmente não sabem o que é desistir; mesmo quando diante de
uma iminente derrota, continuam a persistir com os olhos fixos no forte senso de
alcançar a tão desejada realização. São essas pessoas que movem o
mundo em vanguarda. Elas não são pessoas famosas e nem trazem consigo a aurora dos astros e das estrelas. Em sua
grande maioria continuarão a permanecer no anonimato e sem nenhuma celebração especial. Elas são aquelas pessoas que estão fazendo o que devem fazer. Elas têm a habilidade de ver as possibilidades e simplesmente não conseguem ficar estáticas e, persistentemente, correm em busca das possibilidades que estão à sua
frente. Nós podemos ver com clareza e
evidência a realização do trabalho dessas pessoas através do seu compromisso e das suas realizações. Essa gente é gente muito especial. Elas são especiais porque sinceramente estão buscando por uma real e significativa diferença e estão a pagar o preço por criar um legado significativo e de máximo valor.
Essa gente especial nos ensina que coisas significativas e valiosas é aquilo que
qualquer pessoa pode fazer, bastando simplesmente a evidência de um
compromisso para com esse fim.
(Gilson Hino)
UNIVERSIDADE PARANAENSE - UNIPAR Mestrado em Ciência Animal
SUGAUARA, E. Y. Y., ARAÚJO, E. J. A. Análise quantitativa e morfométrica de neurônios do plexo mientérico do íleo e cólon descendente de ratos infectados por Toxoplasma gondii. DISSERTAÇÃO (MESTRADO) MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL. UNIVERSIDADE PARANAENSE, 2008, 72p.
RESUMO
Objetivou-se avaliar as alterações causadas por duas cepas de Toxoplasma gondii, uma do tipo II e outra do tipo III, sobre os neurônios do plexo mientérico do íleo terminal e do cólon descendente de ratos através de quantificação e morfometria. Para tanto, utilizou-se vinte e seis ratos (Rattus norvegicus) Wistar machos com sessenta dias de idade mantidos em caixas com grades individuais num biotério com temperatura constante de 25º C e alternância de ciclos claro-escuro de 12 horas. Todos os animais receberam ração comercial para roedores (NUVITAL®) e água ad libitum. Os animais foram divididos em seis grupos. Quatro grupos participaram do experimento com infecção aguda e crônica causada por uma cepa genótipo III (Experimento A): grupo controle agudo (GCA, n = 4), grupo experimental agudo (GEA, n = 4), grupo controle crônico (GCC, n = 5) e grupo experimental crônico (GEC, n = 5). Os animais do GEA e GEC receberam 104 taquizoítos por via oral. Dois grupos participaram do experimento com infecção aguda causada por uma cepa genótipo II (Experimento B): grupo controle (GC, n = 4) e grupo experimental (GE, n = 4), sendo este inoculado por via oral com 20 cistos teciduais da cepa ME-49. Os animais pertencentes aos grupos GCA e GEA do Experimento A, assim como todos os grupos do experimento B, foram submetidos à eutanásia 24 horas após a infecção (fase aguda), e os grupos GCC e GEC do Experimento A 30 dias após a infecção (fase crônica). No momento da eutanásia, cada animal foi anestesiado visando laparotomia para retirada do íleo terminal e do cólon descendente, e colheita de sangue através de punção através do plexo retro-orbital, no caso dos animais do GCC e GEC. Através do método de aglutinação direta, o sangue coletado foi processado para detecção da presença de anticorpos anti-T. gondi. Após retirada, os segmentos intestinais descritos acima foram lavados e fixados utilizando formol acético. Em seguida, foram dissecados, com retirada da túnica mucosa e tela submucosa, restando preparados totais formados pela túnica muscular e serosa, os quais foram corados pela técnica de Giemsa. De cada animal foi contado o número total de neurônios mientéricos em 120 campos microscópicos (ampliados 400 vezes) distribuídos uniformemente por toda a circunferência intestinal. Além disso, foi mensurado a área do pericário, do núcleo ecitoplasma de 300 neurônios do plexo mientérico de cada animal. Os dados foram submetidos ao teste de Kolmogorov-Smirnov para verificar o tipo de distribuição, sendo expressos como média ± desvios-padrão, os dados de distribuição normal e os demais como mediana e percentis 25 e 75 (P25 e P75). Para comparar os dados entre os grupos controle e experimental, utilizou-se o teste t de Student para dados com
distribuição normal e o teste de Mann-Whitney para os de distribuição livre. De
acordo com o exame sorológico, todos os animais do GEC tiveram resultado positivo para presença de anti-T. gondii, enquanto os do GCC tiveram resultado negativo. Quanto aos resultados, para o experimento A: não foram observadas alterações nas dimensões dos segmentos intestinais coletados, exceto redução no comprimento, largura e área do jejuno-íleo dos animais do grupo GEC (p
UNIVERSIDADE PARANAENSE - UNIPAR
Mestrado em Ciência Animal
SUGAUARA, E. Y. Y., ARAÚJO, E. J. A. Morphometric and quantitative analyses of neurons of the myenteric plexus in the ileum and descending colon of rats infected by
Toxoplasma gondii. DISSERTAÇÃO (MESTRADO) MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL. UNIVERSIDADE PARANAENSE, 2008, 72p.
ABSTRACT Alterations caused by two Toxoplasma gondii strains
type II and III
on the neurons of the myenteric plexus in the terminal ileum and descending colon of rats through quantification and morphometrics were assessed. Therefore, 26 male 60-day-old Wistar rats were kept in boxes with individual grids in a bioterium constantly at 25°C with 12-hr light/12-hr dark alternate cycles. All animals received rat chow-fed (NUVITAL®) and water ad libitum. They were divided into six groups. Four groups with acute or chronic infection caused by the genotype III strain (Experiment A) took part in the experiment: Acute Control Group (ACG, n = 4); Acute Experimental Group (AEG, n = 4); Chronic Control Group (CCG, n = 5), and the Chronic Experimental Group (CEG, n = 5). The animals from the ACG and ECG received 104 tachyzoites orally. Two groups with acute infection caused by a genotype II strain (Experiment B) took part in the experiment: Control Group (CG, n = 4) and Experimental Group (EG, n = 4), which was orally inoculated with 20 tissue cysts from the ME-49 strain. Animals belonging to the ACG and GEA from Experiment A, as well as all the groups from Experiment B, were submitted to euthanasia 24 hour after the infection (acute phase), and the CCG and ECG from Experiment A 30 days after the infection (chronic phase). At the moment of euthanasia, each animal was anesthetized for laparotomy in order to remove the terminal ileum and descending colon, as well as collecting blood by puncture through the retro-orbital plexus for the animals from the CCG and ECG. The collected blood was processed for the detection of the presence of anti-T. gondii antibodies by the direct agglutination method. After the removal, the intestinal segments described above were washed and fixed by using acetic formol. Then, they were dissected; the mucosa and submucosa were removed, leaving the whole mounted formed by the muscle and serous which were stained with Giemsa. The total number of myenteric neurons of each animal was cut into 120 microscopic fields (extended 400 times) was counted and distributed uniformly all around the intestinal circumference. Besides, the nucleus, cytoplasm and soma areas from 300 neurons in the myenteric plexus of each animal were measured. Data were submitted to the Kolmogorov-Smirnov test in order to verify the distribution type being expressed as mean ± standard deviation, and the normal distribution data and others were expressed as median and percentiles 25 and 75 (P25 and P75). In order to compare data among the control and experimental groups, the Student-t test was used for normal distribution data, and the Mann-Whitney test for the free distribution data. According to the serologic, all the animals from the ECG presented positive results regarding the presence of anti-T.gondii, whereas the CCG presented negative results. With respect to the results for Experiment A: alterations on the dimensions of the collected intestinal segments were not observed, except the reduction of the length, width, and area of the ileum-jejunum from the animals from
ECG (p
SUMÁRIO / SUMMARY
Paper I - ALTERATIONS OF THE MYENTERIC PLEXUS OF THE ILEUM AND THE DESCENDING COLON CAUSED BY Toxoplasma gondii (GENOTYPE III)
p. 12
Artigo I - ALTERAÇÕES DO PLEXO MIENTÉRICO DO ÍLEO E CÓLON DESCENDENTE CAUSADAS POR Toxoplasma gondii (GENÓTIPO III)
p. 28
Paper II - HYPERTROPHY OF THE NEURONS IN THE ILEUM FROM RATS INFECTED WITH CYSTS OF Toxoplasma gondii (GENOTYPO II)
p. 44
Artigo II - HIPERTROFIA DE NEURÔNIOS DO ÍLEO DE RATOS INFECTADOS COM CISTOS DE Toxoplasma gondii (GENÓTIPO II)
p. 59
Paper presented as part of the first author´s dissertation to the UNIPAR Animal Science Master; Experimental Neurogastroenterology Laboratory
UNIPAR, Umuarama, PR, Brazil; 2 Preventive Veterinary Medicine Laboratory
UNIPAR, Umuarama, PR, Brazil. Financial Support: UNIPAR.
Dr. Eduardo José de Almeida Araújo
Experimental Neurogastroenterology Lab. Universidade Paranaense (UNIPAR) Praça Mascarenhas de Moraes s/n 87502-210 Umuarama PR Brazil.
12
ALTERATIONS OF THE MYENTERIC PLEXUS OF THE ILEUM AND THE DESCENDING COLON CAUSED BY Toxoplasma gondii (GENOTYPE III)
Elaine Yae Yamashita Sugauara1, Débora de Mello Gonçales Sant Ana1, Elton Carlos de Almeida1; Anderson Brunetti Reis1; Aristeu Vieira da Silva2, Eduardo José de Almeida Araújo1
ABSTRACT
Alterations caused by a genotype III strain of Toxoplasma gondii were assessed with respect to the number and the morphometry of the myenteric neurons in the terminal ileum and the descending colon. Eighteen rats were divided into four groups: Acute Control Group (ACG, n = 4); Acute Experimental Group (AEG, n = 4); Chronic Control Group (CCG, n=5) and Chronic Experimental Group (CEG, n = 5). NaCl solution was administered through gavage to the animals in the ACG and CCG. Toxoplasma gondii tachyzoites (104) from a genotype III strain were orally administered to the AEG and CEG. Acute Groups were submitted to euthanasia after 24 hours, and the Chronic Groups after 30 days. Neuronal loss was not observed in both organs. The neurons atrophied in the terminal ileum as the opposite occurred with the neurons at the descending colon during the chronic phase of infection.
KEY WORDS: Enteric Nervous System; Toxoplasmosis; Morphology.
Alterações do plexo mientérico do íleo e cólon descendente causadas por Toxoplasma gondii (genótipo III)
RESUMO
Objetivou-se avaliar as alterações causadas por uma cepa genótipo III de Toxoplasma gondi, sobre o número e a morfometria de neurônios mientéricos, do íleo terminal e do cólon descendente. Dividiu-se dezoitos ratos em quatro grupos: controle agudo (GCA, n = 4), experimental agudo (GEA, n = 4), controle crônico (GCC, n = 5) e experimental crônico (GEC, n = 5). Os animais do GCA e GCC receberam solução de NaCl por gavagem, e os animais do GEA e GEC 104 taquizoítos de uma cepa genótipo III de T. gondii por via oral. Os grupos agudos após 24 horas foram submetidos à eutanásia e os crônicos após 30 dias. Observou-se que não houve perda neuronal em ambos os órgãos. No íleo terminal, os neurônios atrofiaram-se, enquanto o oposto ocorreu com os do cólon descendente durante a fase crônica da infecção.
PALAVRAS-CHAVE: Sistema Nervoso Entérico; Toxoplasmose; Morfologia.
13
The Enteric Nervous System (ENS) is a complex net of intramural innervation of the
digestive tube capable of regulating the motility reflexes and coordinating the processes including
secretion and absorption, controlling the blood flow and modulating the immune and endocrine
functions. Besides, it presents a number of plexus, two ganglionic: myenteric and submucosal. The
ENS distinguishes itself from the rest of the peripheral nervous system as it presents a great deal of
neurons (similar to those found at the spinal cord) which form circuits capable of interacting with
the internal environment of the digestive tube independently of the central nervous system (CNS).
This is due to its having sensitive neurons, intrinsic primary afferent neurons, interneurons, and
excitatory and inhibitory motor neurons, structurally interconnected even more complexly by
considering the animals evolutionary scale1. Neurons are cells which may have their functioning
altered by elements of the diet and by inflammatory processes which may develop focalized
necrosis2 and/or alter its metabolism3. There are reports of some parasites which can break out
some of these problems within the ENS such as Trypanosoma Cruzi4, Schistosoma mansoni5 e, and
Schitosoma japonicum6. On the other hand, there are no descriptions of studies assessing the
consequences of infections by Toxoplasma gondii for enteric neurons even though there a number
of researches and clinical reports indicating the pathogenicity of this parasite for the CNS
neurons2.
The Toxoplasma gondii is a protozoan phylum apicomplexa which may be located at
the intestinal epithelium of felidae (definite hosts) and in different tissue of homeothermic animals,
including men. The felidae are the only definite hosts as they are the only animals presenting an
enteroepithelial cycle with sexual reproduction of the parasite, with the formation of oocytes which
are eliminated through the feces. Millions of oocytes may be eliminated at a single evacuation,
remaining viable at the environment for a long period depending on the environmental conditions
and humidity. Another cycle of the development of the parasite is the extraintestinal manifestation
either for the definite host or the intermediary here there is asexual development of the parasite
14
with the formation of tachyzoites and bradyzoites. The intermediary host is infected by ingesting
raw or undercooked meat containing tissue cysts as well as by ingesting water or food
contaminated with oocytes. After ingestion, the walls of the cysts or oocytes are ruptured by the
enzymatic degradation and the infectious form of the parasite is released within the intestinal
lumen, which quickly invades and multiplies inside the host cells, where they differ into
tachyzoites7. The T. gondii holds a population structure highly clonal8 based on the three lines I, II,
and III. Strains isolated in Brazil have demonstrated that Genotypes I and III are highly virulent9.
The initial symptoms of toxoplasmosis may include skin irritation, fever, increase of
lymph node, and visual perturbation, such as chorioretinitis and uveitis10. With respect to the
congenital infection, it usually occurs when the woman is exposed to the infection during
pregnancy as the parasites easily cross the placenta. As most of these infections are asymptomatic,
a few of the cases may result in abortion, stillbirths, or lesions of the fetal nervous system.
Children severely taken ill present chorioretinitis and brain necrosis and there may be
hepatosplenomegaly, hepatic insufficiency, convulsions, and hydrocephalus11. It is an
opportunistic infection which strikes immunocompromised individuals such as those infected with
the HIV7. In animals
such as cats and dogs, toxoplasmosis primarily affects the nervous system,
the gastrointestinal tube, the ocular region, and the respiratory system; besides other clinical
manifestations including fever, depression, diarrhea, respiratory difficulty, convulsion,
hyperexcitability, tremor, psychological weakness, vomiting, and oral ulceration12. Myocarditis,
lynphonopathy, chorioretinitis, pancreatitis, anemia, intestinal granuloma were associated with
toxoplasmosis12. It may also cause abortion in sheep, pigs, and rabbits infected during pregnancy7.
Rats infected with T. gonddi develop good humoral and cell immune response within a short
length of time13. In relation to the clinical evolution and the placental transmission, toxoplasmosis
in rats and humans is alike; therefore, infection in rats may be used as a model for human
toxoplasmosis14.
15
As a result of such neurological and gastrointestinal alterations caused by T. gondii,
this paper assesses the possible alterations caused by the Genotype III strain of this parasite in the
number and morphometry of the myenteric neurons of the terminal ileum and the descending colon
of rats.
METHOD
Experimental Groups
The experimental protocol was previously approved by the UNIPAR Ethics
Committee in Researches Involving Animal Experimentation.
Eighteen male, 60-day-old Wistar rats (288.3 ± 74.6g), kept in boxes with individual
grids, in a bioterium constantly at 25°C with 12-hr light/12-hr dark alternate cycles, were used. All
the animals received rat chow (NUVITAL®) and water ad libitum.
The animals were divided into 4 groups: Acute Control Group (ACG, n = 4); Acute
Experimental Group (AEG, n =4); Chronic Control Group (CCG, n=5) and Chronic Experimental
Group (CEG, n = 5). NaCl solution was administered through gavage to the animals in the ACG
and CCG. Toxoplasma gondii tachyzoites (104) from a Genotype III strain isolated from dog brains
with neurological symptomatology9 were orally administered to the AEG and CEG. Acute Groups
were submitted to euthanasia after 24 hours, and the Chronic Groups after 30 days.
The animals were intramuscularly anesthetized at the moment of the euthanasia by
using the following protocol: Acepram® 1,26 mL/kg + Ketalar® (10 mL) 1,26 mL/kg + Rompum®
(2%) 0,42 mL/kg + Atropina® (1%) 0,22 mL/kg15 in order to collect blood by puncturing the retro-
orbital plexus (only from CCG and CEG groups), and laparotomy for the removal of the terminal
ileum and the descending colon. The terminal ileum was considered as the distal portion to the
initial ileocecal fold Then, the animals were submitted to euthanasia by anesthetic deepening.
16
The blood collected was centrifuged and the serum was used to detect the presence of
antibodies against T. gondii by the direct agglutination method16.
Obtaining the Whole-Mount Preparations
The terminal ileum and the descending colon from each animal were measured with
respect to length and width by using a tape measure and a millimetric ruler as they were removed.
Because of the difficulty on automatically distinguishing the terminal ileum of the jejunum, these
measurements were made by considering these two organs together. Then, they were washed in a
9%-NaCl solution, filled and immersed in a fixation solution containing acetic formol for 48 hours.
Next, they were dissected with the aid of a stereomicroscope by removing the mucosa and the
submucosa. The whole-mounted
consisting of serous and mucosa
were stained according with
the Giemsa technique17.
Quantitative Analysis
The total number of myenteric neurons was counted in 120 microscopic fields,
uniformly distributed all over the intestinal circumference of each specimen, totalizing an area of
25.2mm2 per animal. For that, a Motic BL220A binocular microscope with 40x objective was
used. The neurons positioned at the edges of each field were counted in alternated fields.
Morphometric Analysis
The area of the soma, cytoplasm, and the nucleus of 300 neurons of the myenteric
plexus of the terminal ileum and the descending colon (uniformly distributed all over the intestinal
circumference) of the animals from each group was measured with the software Image Motic Plus,
version 2.0. A microscope with a 2.0 Megapixel digital camera (MOTICAM 2000) connected to a
17
computer was used for that. From these values, neurons were divided into classes by considering
the soma area (50µm2 interval) and the nucleus-soma ratio (0.10 intervals).
Statistic Analysis
All the data were initially submitted to the Kolmogorov-Smirnov test for the
verification of their distribution type. Normal distribution data were expressed as mean±standard
deviation, and the free distribution ones were expressed as median and percentiles 25 and 75 (P25;
P75). The Student s test (normal distribution data) and Mann-Whitney (free distribution data)
were used in order to compare Control and Experimental Group, by considering P
18
clonal lines: I, II and III18. There is a prevalence of Genotype I, followed by III, in isolated from
pigs19, dogs9, and cats20 in Brazil. Genotype III strains isolated in the North Hemisphere have
presented low virulence enabling the development of a chronic infection with the formation of
tissue cysts in mice8; on the other hand, the ones isolated in Brazil are might be lethal for them9.
Besides, in vitro, bradyzoites develop spontaneously within the neurons, astrocytes, and microglias
isolated from rats central nervous system fetus indicating that these three cellular types may be
hosts for the of the parasite encystation21. However, there are no reports on the literature whether
the neurons and/or glias of the enteric nervous system are also affected by the T. gondii. Thus, this
study assesses possible alterations of the myenteric rats infected by an isolated Genotype III strain
from dogs with neurological symptomatology in Brazil9.
The dimensions of the ileum jejunum and the total colon, as well as the total number of
myenteric neurons of these intestinal segments, observed in this study during the acute phase of the
infection (24hr after inoculation), were not altered. On the other hand, it was observed that, in the
terminal ileum, the nucleus of the myenteric neurons tended to occupy a smaller portion of the
soma (p
19
of ~30.8% of the soma area, ~23.6% of the area of the nucleus and of ~ 35.1% of the area of the
cytoplasm (p
20
of the ones smaller than 100µm2 and an increase in the numbers of neurons between 151 and
250µm2 in the descending colon.
The distribution of the frequency by considering the nucleus-soma area ratio, that is, the
proportion that the nucleus occupies in the soma, most of the neurons in the terminal ileum
presented nuclei occupying 30-40% of the soma; in the descending colon, the area the nuclei
occupied 41-60%. There were no significant differences among the experimental groups.
Thus, in general, it was observed that the myenteric neurons of the terminal ileum
suffered more morphometric alterations than those of the descending colon, what may be related to
the organization of the immune system of these organs. It is extremely common to observe
lymphoid nodules (Peyer s patches) in the terminal ileum in relation to the colon. Considering the
immune system, studies have noted that the intraperitonial infection with T. gondii recruits
inflammatory cells (especially neutrophils) in the inoculation area22. Molecularly, it is reported that
the NF- transcription factor has a central role on the regulation of the immune, antiapoptotic and
inflammatory response in animals infected with T. gondii18. It is worth pointing out that the
activation of the NF- translocation by the T. gondii is a controversial area, that is, depending on
the strain, host cell and species, the T. gondii may block the NF- translocation and inhibit the
transcription of the genes involved with the inflammatory response, mainly the 12p40 interleukin
(IL) and the tumor necrosis factor (TNF- )18, thus it is possible to observe the differences
regarding the virulence of the parasite.
There are a number of reports on the literature that the increase of the immunological
effector cells and their products are responsible for alterations in the neuronal elements5,6. In the
central nervous system, the microglias attack T. gondii with the dependent mechanisms of the
interferon (IFN- ) and the nitric oxide (NO)21. The IFN-
is a key cytosine for the resistance
against T. gondii23.
21
Most of the studies related to the immune system/enteric nervous system interaction
involves the irritable bowel syndrome. Through them, it is known that a number of products
released from the infiltrated and/or resident leukocytes have demonstrated potential to sensibilize,
and even directly activate myenteric neurons and primary afferent intestinal neurons24. Within the
resident group are the mast cells and muscle macrophages. Mast cells produce bradykinin which
eases the enteric secretion of acetylcholine25, besides increasing the excitability of the myenteric
neurons26 and primary intestinal afferents27. The muscle macrophages secrete cytokines such as IL-
1 and IL-6, which act directly on the increase of the excitability of the myenteric neurons28 and
module the secretion of norepinephrine29. Moreover, the intestinal inflammation induces the
secretion of cytokines such as IL-1 , TNF- , IFN- , and TGF- from the myenteric neurons;
however, the identity of the cells which secrete cytokines, neuronal and glias, is not known24. It is
worth pointing out that the vasoactive intestinal peptide (VIP) plays an important neuroprotector
role, either for the central30 or enteric31 neurons.
This study demonstrated that rats infected either for 24 or 30 hours did not present
myenteric neuron loss; however, these cells became atrophic in the terminal ileum whereas the
opposite happened in the descending colon. By considering the possibility of the T. gondii infect
cells from the ENS, as well as these cells being morphologically altered by the cells secreted by
the immune system, or even by themselves because of the infection. Complementary studies are
necessary in order to understand the mechanisms involved which explain the morphometric
alterations observed on the myenteric neurons overviewed in this study.
REFERÊNCIAS
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parasite genotype with human disease. J Infect Dis 1995;172:1561-1566.
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25
Table 1
Length, width and area of the ileum-jejunum and the total colon from healthy rats
(Control Group
CG) and submitted to infection by a Genotype III T. gondii strain (Experimental
Group EG).
Organ Group Lenght (cm) Width (cm) Area (cm2)
ACG 107.25 2.36 0.08 8.27
AEG 102.75 3.77 0.15 15.77
CCG 109.16 5.62* 0.08* 11.92*
Ileum-
jejunum
CEG 100.94 3.31* 0.12* 151.18 9.26*
ACG 15.45 1.32 2.15 0.37 33.11 5.74
AEG 14.88 2.78 1.73 0.30 26.15 9.38
CCG 15.86 1.18 2.16 0.29 34.31 5.84 Total Colon
CEG 16.08 3.13 2.10 0.30 33.93 8.54
Values presented as mean±standard deviation. Values denoted by asterisks on the same column are significantly different (p
26
Table 3
Soma area, nucleus area, cytoplasm area, and the nucleus-soma area ratio of myenteric
neurons of the terminal ileum and descending colon from healthy rats (Control Group
CG) and
the submitted to a Genotype III T. gondii strain (Experimental Group EG).
Organ Group Soma area ( m2)
Nucleus area ( m2)
Cytoplasm area ( m2)
Soma-nucleus area ratio
ACG 238.9 (134.2; 826.5) 95.3 (47.8; 330.2) 145.3 (79.9; 466.0) 0.39 (0.31; 0.49)* AEG 258.4 (134.3; 828.2) 99.0 (48.6; 290.8) 155.2 (78.9; 496.2) 0.38 (0.29; 0.48)*
CCG 333.2 (164.4; 845.2)* 123.81 (58.4; 309.5)* 207.7 (100.0; 511.8)* 0.37 (0.30; 0.46)
Terminal ileum
CEG 161.5 (95.7; 515.8)* 56.4 (33.2; 202.5)* 104.2 (58.7; 289.5)* 0.36 (0.29; 0.45)
ACG 135.0 (98.3; 185.4)* 69.8 (50.7; 94.6)* 60.9 (42.4; 94.2)* 0.52 (0.44; 0.59)* AEG 124.4 (87.6; 170.1)* 62.9 (43.8; 84.8)* 57.7 (39.7; 88.7)* 0.50 (0.42; 0.58)*
CCG 120.2 (74.1; 182.9)* 60.5 (38.0; 86.1)* 55.8 (34.9; 93.9)* 0.49 (0.41; 0.57)
Descending colon
CEG 157.3 (115.8; 209.9)* 74.8 (55.3; 97.8)* 75.4 (50.8; 114.3)* 0.49 (0.40; 0.57)
Values presented as median (P25; P75). Values denoted by asterisks on the same column are significantly different (p
27
0
5
10
15
20
25
30
35
40
1001
Classes ( m 2)
Rel
ativ
e F
req
uen
cy (
%)
GCA GEA GCC GEC
Figure 1
Histogram of the soma area of the myenteric neurons of the terminal ileum from
healthy rats (Control Group
CG) and the infected by a Genotype III T. gondii strain
(Experimental Group - EG). Columns with asterisks differ significantly (*p
28
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0.71
Classes
Rel
ativ
e F
req
uen
cy (
%)
ACG AEG CCG CEG
Figure 3 Histogram of the nucleus-soma are ratio of the myenteric neurons of the terminal ileum
from healthy rats (Control Group) and the infected by a Genotype III T. gondii strain
(Experimental Group). Columns with asterisks differ significantly (*p
Este trabalho é parte da dissertação apresentada ao Mestrado em Ciência Animal da Universidade Paranaense (UNIPAR) da primeira autora. 1Laboratório de Neurogastroenterologia Experimental. Universidade Paranaense (UNIPAR)
Umuarama PR, Brasil; 2Laboratório de Medicina Veterinária Preventiva. Universidade Paranaense (UNIPAR) Umuarama PR, Brasil. Apoio financeiro: UNIPAR.
Dr. Eduardo José de Almeida Araújo
Laboratório de Neurogastroenterologia Experimental, Universidade Paranaense (UNIPAR) Praça Mascarenhas de Moraes s/n 87502-210 Umuarama PR Brasil.
29
ALTERAÇÕES DO PLEXO MIENTÉRICO DO ÍLEO E CÓLON DESCENDENTE
CAUSADAS POR Toxoplasma gondii (GENÓTIPO III)
Elaine Yae Yamashita Sugauara1, Débora de Mello Gonçales Sant Ana1, Elton Carlos de
Almeida1; Anderson Brunetti Reis1; Aristeu Vieira da Silva2, Eduardo José de Almeida Araújo1
RESUMO
Objetivou-se avaliar as alterações causadas por uma cepa genótipo III de Toxoplasma
gondi, sobre o número e a morfometria de neurônios mientéricos, do íleo terminal e do cólon
descendente. Dividiu-se dezoitos ratos em quatro grupos: controle agudo (GCA, n = 4),
experimental agudo (GEA, n = 4), controle crônico (GCC, n = 5) e experimental crônico (GEC, n
= 5). Os animais do GCA e GCC receberam solução de NaCl por gavagem, e os animais do GEA e
GEC 104 taquizoítos de uma cepa genótipo III de T. gondii por via oral. Os grupos agudos após 24
horas foram submetidos à eutanásia e os crônicos após 30 dias. Preparados totais do íleo terminal e
cólon descendente foram corados com Giemsa. Observou-se que não houve perda neuronal em
ambos os órgãos, tanto nos grupos agudos como nos crônicos. No íleo terminal, os neurônios
atrofiaram-se, enquanto o oposto ocorreu com os do cólon descendente durante a fase crônica da
infecção.
PALAVRAS-CHAVE: Sistema Nervoso Entérico; Toxoplasmose; morfologia.
O sistema nervoso entérico (SNE) é uma complexa rede de inervação intramural do
tubo digestório, capaz de regular os reflexos de motilidade e coordenar os processos que incluem
secreção e absorção, controlar o fluxo sanguíneo e modular as funções imune e endócrina. Além
disso, possui vários plexos, sendo que dois são ganglionares: mientérico e submucoso. O SNE
destaca-se em relação ao restante do sistema nervoso periférico, por possuir um grande número de
neurônios (semelhante ao encontrado na medula espinhal) que formam circuitos capazes de
30
interagir com o ambiente interno do tubo digestório, de forma independente do sistema nervoso
central (SNC). Isto se deve ao fato de possuírem neurônios sensitivos, neurônios aferentes
primários intrínsecos, interneurônios e neurônios motores excitatórios e inibitórios, estruturalmente
interconectados de forma cada vez mais complexa, considerando a escala evolutiva dos animais1.
Os neurônios são células que podem ter seu funcionamento alterado por elementos da dieta e por
processos inflamatórios, que podem desenvolver necrose focalizada2 e/ou alterar seu
metabolismo3. Há relatos de alguns parasitos que podem desencadear no SNE alguns destes
problemas, como o Trypanosoma cruzi4, Schistosoma mansoni5 e Schistosoma japonicum6. Por
outro lado, não há descrição de estudos, avaliando as conseqüências da infecção por Toxoplasma
gondii para os neurônios entéricos, mesmo havendo pesquisas e relatos clínicos apontando a
patogenicidade deste parasito para neurônios do SNC2.
O Toxoplasma gondii é um protozoário do filo Apicomplexa, que se aloja no epitélio
intestinal dos felídeos (hospedeiros definitivos) e em diferentes tecidos de animais homeotérmicos,
incluindo o homem. Os felídeos são os únicos hospedeiros definitivos, pois somente nesses
animais há ciclo enteroepitelial com reprodução sexuada do parasito, com formação de oocistos
que são eliminados pelas fezes. Os oocistos podem ser eliminados aos milhões numa só evacuação,
permanecendo viáveis no ambiente por um longo período dependendo das condições ambientais e
umidade. O outro ciclo de desenvolvimento do parasito é o extra-intestinal de ocorrência, tanto no
hospedeiro definitivo como nos intermediários, neste caso há desenvolvimento assexuado do
parasito, com formação de taquizoítos e bradizoítos. O hospedeiro intermediário infecta-se por via
oral, por intermédio da ingestão de carne crua ou mal-cozida contendo cistos teciduais, e também
por ingestão de água ou alimentos contaminados com oocistos. Depois da ingestão, as paredes dos
cistos ou oocistos são rompidas pela degradação enzimática e a forma infectante do parasito é
liberada dentro do lúmem intestinal, que invade rapidamente e se multiplica dentro das células,
onde se diferenciam em taquizoítos7. O T. gondii possui uma estrutura populacional altamente
31
clonal8, que consiste de três linhagens designadas I, II e III. Cepas isoladas no Brasil têm
demonstrado que os genótipos I e III são altamente virulentos9.
Os sintomas iniciais da toxoplasmose podem incluir irritação na pele, febre, aumento
de linfonodos e perturbações visuais, tais como coriorretinite e uveíte10. Em relação à infecção
congênita, geralmente ocorre quando a mulher é exposta à infecção durante a gestação, pois os
parasitos têm facilidade de cruzar a placenta. Enquanto a maioria dessas infecções é assintomática,
poucos casos podem resultar em abortos, natimortos ou lesões do sistema nervoso do feto. As
crianças gravemente acometidas apresentam coriorretinite e necrose cerebral e pode haver
hepatoesplenomegalia, insuficiência hepática, convulsões e hidrocefalia11. É uma doença
oportunista, que acomete indivíduos imunocomprometidos, como aqueles infectados pelo vírus
HIV7. Já nos animais, como cães e gatos, a toxoplasmose afeta primariamente o sistema nervoso,
tubo gastrointestinal, região ocular e sistema respiratório. Além de outras manifestações clínicas
incluindo febre, depressão, diarréia, dificuldade respiratória, convulsão, hiperexcitabilidade,
tremores, debilidade, vômito e ulceração oral12. Miocardite, linfonopatia, coriorretinites,
pancreatites, anemia e granuloma intestinal foram associadas também com toxoplasmose12. Ainda
pode causar aborto em ovelhas, cabras, porcas e coelhas se infectadas durante a prenhez7. Ratos
infectados por T. gondii desenvolvem boa resposta imune humoral e celular dentro de um curto
período13. Em relação à evolução clínica e a transmissão placentária, a toxoplasmose em ratos e
humanos é similar, portanto, a infecção em ratos pode servir como um modelo para toxoplasmose
humana14.
Em função das alterações neurológicas e gastrointestinais causadas pelo T. gondii,
objetivou-se neste estudo avaliar as possíveis alterações causadas por uma cepa genótipo III deste
parasito, sobre o número e a morfometria de neurônios mientéricos do íleo terminal e do cólon
descendente de ratos.
32
MÉTODO
Grupos Experimentais
Todo protocolo experimental foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa Envolvendo Experimentação Animal (CEPEEA) da Universidade Paranaense (UNIPAR).
Utilizaram-se dezoito ratos (Rattus norvegicus) Wistar jovens machos com 60 dias de
idade (288,3
74,6 g), mantidos em caixas com grades individuais, num biotério com temperatura
constante de 25ºC e alternância de ciclos claro-escuro de 12 horas. Todos os animais receberam
ração comercial para roedores (NUVITAL®) e água ad libitum.
Os animais foram divididos em quatro grupos: controle agudo (GCA, n = 4),
experimental agudo (GEA, n = 4), controle crônico (GCC, n = 5) e experimental crônico (GEC, n
= 5). Os animais do GCA e GCC receberam solução de cloreto de sódio por gavage e os animais
do GEA e GEC receberam, por via oral, 104 taquizoítos de uma cepa genótipo III de Toxoplasma
gondii isolada do cérebro de cães com sintomatologia neurológica9. Os grupos agudos após 24
horas foram submetidos à eutanásia e os crônicos após 30 dias.
No momento da eutanásia, os animais foram anestesiados pela via intramuscular,
utilizando o seguinte protocolo: Acepram® 1,26 mL/kg + Ketalar® (10 mL) 1,26 mL/kg +
Rompum® (2%) 0,42 mL/kg + Atropina® (1%) 0,22 mL/kg15, visando colheita de sangue através
de punção do plexo retro-orbital (apenas dos animais dos grupos GCC e GEC) e laparotomia para
retirada do íleo terminal e do cólon descendente. Considerou-se como íleo terminal, a porção distal
ao início da prega íleo-cecal. Em seguida, os animais foram submetidos à eutanásia por
aprofundamento anestésico.
O sangue coletado foi centrifugado e o soro foi utilizado para detectar a presença de
anticorpos contra T. gondii pelo método de aglutinação direta16.
33
Obtenção dos Preparados Totais
Logo que retirados, o íleo terminal e o cólon descendente de cada animal foram
mensurados quanto ao comprimento e largura, utilizando fita métrica e régua milimetrada. Em
função da dificuldade de distinguir anatomicamente o íleo terminal do jejuno, estas medidas foram
feitas considerando estes dois órgãos sem separá-los. Em seguida, foram lavados em solução de
NaCl 0,9%, preenchidos e imersos numa solução fixadora contendo formol acético por 48 horas. A
seguir foram dissecados com auxílio de um estereomicroscópio, retirando a túnica mucosa e a tela
submucosa. Os preparados totais, formados pela túnica muscular e serosa, foram corados segundo
a técnica de Giemsa17.
Análise Quantitativa
Foi contado o número total de neurônios mientéricos em 120 campos microscópicos,
distribuídos uniformemente por toda a circunferência intestinal de cada espécime, totalizando uma
área de 25,2 mm2 por animal. Para tanto, utilizou-se um microscópio binocular Motic BL220A
através da objetiva de 40X. Neurônios posicionados nos limites de cada campo foram contados em
campos alternados.
Análise Morfométrica
A área do pericário, do citoplasma e do núcleo de 300 neurônios do plexo mientérico
do íleo terminal e cólon descendente (distribuídos uniformemente por toda a circunferência
intestinal) de todos os animais de cada grupo, foi medida por intermédio do software analisador de
imagens Image Motic Plus, versão 2.0. Para isso, utilizou-se um microscópio equipado com
câmera digital (MOTICAM 2000, 2.0 Megapixel) acoplado a um microcomputador. A partir
desses valores, os neurônios foram divididos em classes, considerando a área do pericário
(intervalos de 50 m2) e a razão entre a área do núcleo e do pericário (intervalos de 0,10).
34
Análise Estatística
Todos os dados foram inicialmente submetidos ao teste de Kolmogorov-Smirnov,
para verificação do tipo de distribuição. Dados com distribuição normal foram expressos como
média
desvio-padrão, e os de distribuição livre foram expressos como mediana e percentis 25 e
75 (P25; P75). Para comparar dados entre os grupos controle e experimental, utilizou-se teste t de
Student (para dados que tinham distribuição normal) e Mann-Whitney (para os que tinham
distribuição livre), considerando-se significantes valores de P menores que 0,05.
RESULTADOS
De acordo com o exame sorológico, os animais do GEC tiveram resultado positivo
para presença de anti-T. gondii, enquanto os do GCC tiveram resultado negativo. Os valores
obtidos quanto às dimensões dos órgãos coletados, a análise quantitativa e morfométrica dos
neurônios mientéricos estão apresentados, respectivamente, nas Tabelas 1, 2 e 3. O grau de
correlação entre área do pericário, núcleo e citoplasma mesurada dos neurônios mientéricos está
apresentado na Tabela 4. As Figuras 1 e 2 apresentam a distribuição de freqüência dos neurônios
mientéricos, divididos em classes de acordo com a área do pericário e, nas Figuras 3 e 4, de acordo
com a razão entre a área do núcleo e a área do pericário.
DISCUSSÃO
O Toxoplasma gondii é um dos protozoários parasitos mais bem sucedidos devido sua
habilidade de manipular o sistema imune e estabelecer uma infecção crônica. Há várias cepas de T.
gondii, sendo que a maioria foi identificada na Europa e América do Norte, enquadrando-se em
três linhagens clonais distintas: I, II e III18. No Brasil, isolados de suínos19, cães9 e gatos20 têm
demonstrado maior prevalência do genótipo I, seguido do III. Cepas genótipo III isoladas no
35
hemisfério norte têm apresentado baixa virulência, permitindo o desenvolvimento de uma infecção
crônica com formação de cistos teciduais em camundongos8. Já as isoladas no Brasil podem ser
letais ou não para camundongos9. Além disso, in vitro, bradizoítos se desenvolvem
espontaneamente dentro de neurônios, astrócitos e micróglias isolados do sistema nervoso central
de feto de ratos, indicando que estes três tipos celulares podem servir como hospedeiros para
encistamento do parasito21. Contudo, não há relatos na literatura se neurônios e/ou glias do sistema
nervoso entérico também são infectadas pelo T. gondii. Em função disto, avaliou-se no presente
estudo as possíveis alterações de neurônios mientéricos de ratos infectados por uma cepa genótipo
III isolada de cães com sintomatologia neurológica no Brasil9.
Observou-se neste estudo que durante a fase aguda da infecção (24 horas após a
inoculação), as dimensões do jejuno-íleo e do cólon total, assim como o número total de neurônios
mientéricos destes segmentos intestinais, não foram alterados. Por outro lado, observou-se que, no
íleo terminal, o núcleo dos neurônios mientéricos tenderam a ocupar uma menor proporção do
pericário (p
36
(p
37
enquanto que no cólon descendente houve uma redução do número de neurônios menores que 100
m2 e um aumento do número de neurônios entre 151 e 250 m2.
Já a distribuição de freqüência considerando a razão entre a área do núcleo e a área do
pericário, ou seja, a proporção que o núcleo ocupa no pericário, no íleo terminal a maior parte dos
neurônios possuem núcleos que ocupam entre 30 e 40% do pericário, já no cólon descendente os
núcleos ocupam entre 41 a 60%. Não houve diferença significativa entre os grupos experimentais.
Assim, de uma forma geral, observa-se que os neurônios mientéricos do íleo terminal
sofreram mais alterações morfométricas do que os do cólon descendente, o que pode estar ligado à
organização do sistema imune destes órgãos. No íleo terminal é extremamente comum se observar
nódulos linfóides (placas de Peyer), diferentemente do cólon. Considerando-se o sistema imune,
vários estudos têm notado que a infecção intraperitoneal com T. gondii recruta células
inflamatórias (especialmente neutrófilos) no local da inoculação22. Molecularmente relata-se, que o
fator de transcrição NF-
tem um papel central na regulação da resposta inflamatória, imune e
anti-apoptótica em animais infectados por T. gondii18. Vale destacar que a ativação da translocação
NF-
pelo T. gondii é uma área controversa, ou seja, dependendo da cepa, célula hospedeira e
espécie, o T. gondii pode bloquear a translocação de NF-
e inibir a transcrição de genes
envolvidos na resposta proinflamatória, sobretudo a interleucina (IL)-12p40 e o fator de necrose
tumoral TNF- 18 e desta forma pode-se observar diferenças na virulência do parasito.
Há vários relatos na literatura de que um aumento de células imunologicamente efetoras
e seus produtos, sejam responsáveis por alterações em elementos neurais5,6. No sistema nervoso
central, micróglias combatem o T. gondii através de mecanismos dependentes de interferon IFN-
e óxido nítrico (NO)21. O INF- é uma citocina chave na resistência para infecção de T. gondii23.
A maioria dos estudos relacionados à interação entre o sistema imune e o sistema
nervoso entérico, envolve a síndrome do intestino irritável. Através destes, sabe-se que vários
produtos liberados a partir de leucócitos infiltrados e/ou residentes têm demonstrado potencial em
38
sensibilizar e até ativar diretamente neurônios mientéricos e neurônios aferentes primários
intestinais24. Dentro do grupo dos residentes, estão os mastócitos e os macrófagos musculares. Os
mastócitos produzem bradicinina, a qual facilita a secreção entérica de acetilcolina25, além de
aumentar a excitabilidade de neurônios mientéricos26 e aferentes primários intestinais27. Os
macrófagos musculares secretam citocinas como IL-1
e IL-6, as quais agem diretamente
aumentando a excitabilidade de neurônios mientéricos28 e modula a secreção de norepinefrina29.
Além disso, a inflamação intestinal induz a secreção de citocinas tais como IL-1 , TNF- , IFN- e
TGF-
a partir de gânglios mientéricos, contudo não se sabe ainda a identidade das células
secretoras dessas citocinas: neurônios ou glias24. Vale ainda destacar que o peptídeo vasoativo
intestinal (VIP) tem um importante papel neuroprotetor, tanto para neurônios centrais30 como
entéricos31.
No presente estudo demonstrou-se que ratos infectados tanto por 24 horas como por 30
dias não tiveram perda de neurônios mientéricos, contudo no íleo terminal estas células se
tornaram atróficas, enquanto o oposto ocorreu no cólon descendente. Considerando a possibilidade
do T. gondii infectar células do SNE, assim como destas células serem alteradas
morfofisiologicamente por moléculas secretadas pelo sistema imune, ou mesmo por si próprias, em
função da infecção, estudos complementares se fazem necessários, no intuito de compreender os
mecanismos envolvidos, que expliquem as alterações morfométricas observadas nos neurônios
entéricos visualizadas neste estudo.
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42
Tabela 1
Comprimento, largura e área do jejuno-íleo e do cólon total de ratos hígidos (Grupo
Controle
GC) e submetidos à infecção por uma cepa genótipo III de T. gondii (Grupo
Experimental GE).
Órgão Grupo Comprimento (cm) Largura (cm) Área (cm2)
GCA 107,25 2,36 0,08 8,27
GEA 102,75 3,77 0,15 15,77
GCC 109,16 5,62* 0,08* 11,92*Jejuno-íleo
GEC 100,94 3,31* 0,12* 151,18 9,26*
GCA 15,45 1,32 2,15 0,37 33,11 5,74
GEA 14,88 2,78 1,73 0,30 26,15 9,38
GCC 15,86 1,18 2,16 0,29 34,31 5,84 Cólon Total
GEC 16,08 3,13 2,10 0,30 33,93 8,54
Valores apresentados como média desvio-padrão. Valores marcados numa mesma coluna são significativamente diferentes (p
43
Tabela 3 Área do pericário, área do núcleo, área do citoplasma e razão entre a área do núcleo e o
pericário de neurônios mientéricos do íleo terminal e cólon descendente de ratos hígidos (Grupo
Controle
GC) e submetidos à infecção por uma cepa genótipo III de T. gondii (Grupo
Experimental GE).
Órgão Grupo Área do pericário
( m2) Área do Núcleo
( m2) Área do
citoplasma ( m2)
Razão entre a área do núcleo e do pericário
GCA 238,9 (134,2; 826,5) 95,3 (47,8; 330,2) 145,3 (79,9; 466,0) 0,39 (0,31; 0,49)*
GEA 258,4 (134,3; 828,2) 99,0 (48,6; 290,8) 155,2 (78,9; 496,2) 0,38 (0,29; 0,48)*
GCC 333,2 (164,4; 845,2)* 123,81 (58,4; 309,5)* 207,7 (100,0; 511,8)* 0,37 (0,30; 0,46)
Íleo terminal
GEC 161,5 (95,7; 515,8)* 56,4 (33,2; 202,5)* 104,2 (58,7; 289,5)* 0,36 (0,29; 0,45)
GCA 135,0 (98,3; 185,4)* 69,8 (50,7; 94,6)* 60,9 (42,4; 94,2)* 0,52 (0,44; 0,59)* GEA 124,4 (87,6; 170,1)* 62,9 (43,8; 84,8)* 57,7 (39,7; 88.7)* 0,50 (0,42; 0,58)*
GCC 120,2 (74,1; 182,9)* 60,5 (38,0; 86,1)* 55,8 (34,9; 93,9)* 0,49 (0,41; 0,57)
Cólon descendente
GEC 157,3 (115,8; 209,9)* 74,8 (55,3; 97,8)* 75,4 (50,8; 114,3)* 0,49 (0,40; 0,57)
Valores apresentados como mediana (P25; P75). Valores marcados numa mesma coluna são significativamente diferentes (p
44
Todos os valores são significativos considerando 5% como nível de significância.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
1001
Classes ( m2)
Fre
qü
ênci
a R
elat
iva
(%)
GCA GEA GCC GEC
Figura 1
Histograma da área do pericário de neurônios mientéricos do íleo terminal de ratos
hígidos (Grupo Controle
GC) e infectados por uma cepa genótipo III de Toxoplasma gondii
(Grupo Experimental
GE). Colunas marcadas com asterisco diferem significativamente (*p <
0,05).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
501
Classes ( m2)
Fre
qü
ênci
a R
elat
iva
(%)
GCA GEA GCC GEC
Figura 2
Histograma da área do pericário de neurônios mientéricos do cólon descendente de
ratos hígidos (Grupo Controle GC) e infectados por uma cepa genótipo III de Toxoplasma gondii
*
*
*
*
*
45
(Grupo Experimental
GE). Colunas marcadas com asterisco diferem significativamente (*p <
0,05).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0,71
Classes
Fre
qü
ênci
a R
elat
iva
(%)
GCA GEA GCC GEC
Figura 3
Histograma da razão entre a área do núcleo e a área do pericário de neurônios
mientéricos do íleo terminal de ratos hígidos (Grupo Controle) e infectados por uma cepa genótipo
III de Toxoplasma gondii (Grupo Experimental). Colunas marcadas com asterisco diferem
significativamente (*p < 0,05).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0,71
Classes
Fre
qü
ênci
a R
elat
iva
(%)
GCA GEA GCC GEC
Figura 4
Histograma da razão entre a área do núcleo e a área do pericário de neurônios
mientéricos do cólon descendente de ratos hígidos (Grupo Controle) e infectados por uma cepa
46
genótipo III de Toxoplasma gondii (Grupo Experimental). Colunas marcadas com asterisco
diferem significativamente (*p < 0,05).
47
HYPERTROPHY OF THE NEURONS IN THE ILEUM FROM RATS INFECTED 1
WITH CYSTS OF Toxoplasma gondii (GENOTYPO II) 2
3
Toxoplasmosis and enteric neurons 4
5
Elaine Yae Yamashita Sugauara1, Débora de Mello Gonçales Sant Ana1, Aristeu Vieira da 6
Silva2, Elisângela Aparecida de Souza1, Eduardo José de Almeida Araújo1 7
8
Paper presented as part of the first author s MA dissertation submitted to the UNIPAR 9
Animal Science Master. 1Experimental Neurogastroenterology Laboratory. Universidade 10
Paranaense (UNIPAR)
Praça Mascarenhas de Moraes s/n
87502-210 Umuarama PR
11
Brasil; 2Preventive Veterinary Medicine Laboratory. Universidade Paranaense (UNIPAR)
12
Umuarama PR, Brasil. Financial Support: UNIPAR. Author for correspondence: 13
15
ABSTRACT. This paper verified possible alterations caused by a genotype II Toxoplasma 16
gondii strain with respect to the total number and morphometry of the myenteric neurons in 17
the terminal ileum and descending colon of rats. Eight rats were divided into two groups: 18
control (n = 4) and experimental (n = 4). This group was inoculated orally with 20 tissue cysts 19
of T. gondii from a genotype II strain (ME-49). Whole mounted from the terminal ileum and 20
the descending colon were stained with Giemsa. There was not any neuronal loss on both 21
organs. The neurons became hypertrophied in the terminal ileum, whereas morphometric 22
alterations were not observed for the neurons in the descending colon. 23
Key words: Enteric Nervous System; Toxoplasmosis; Morphology. 24
25
RESUMO. Hipertrofia de neurônios do íleo de ratos infectados com cistos de 26
Toxoplasma gondii (genótipo II). Objetivou-se verificar as possíveis alterações causadas por 27
uma cepa genótipo II de Toxoplasma gondii, sobre o número total e a morfometria de 28
neurônios do plexo mientérico, do íleo terminal e do cólon descendente de ratos. Oito ratos 29
foram divididos em dois grupos: controle (n = 4) e experimental (n = 4), sendo este inoculado, 30
por via oral, com 20 cistos teciduais de T. gondii de uma cepa genótipo II (ME-49). 31
Preparados totais do íleo terminal e cólon descendente foram corados com Giemsa. Não 32
houve perda neuronal em ambos os órgãos. Os neurônios se tornaram hipertróficos no íleo 33
48
terminal, enquanto nenhuma alteração morfométrica foi observada nos neurônios do cólon 34
descendente. 35
Palavras-chave: Sistema Nervoso Entérico; Toxoplasmose; Morfologia. 36
37
INTRODUCTION 38
Toxoplasmosis is concerned by public health and animal production. It is usually 39
asymptomatic in humans; however, it may cause blindness, severe neurological disorders, 40
hepatitis, and pneumonia in immunocompromised patients, as well as severe damage to 41
fetuses (Ascenzi et. Al., 2005). On animals such as dogs, toxoplasmosis may cause fever 42
associated with lassitude, anorexia, diarrhea, pneumonia, and neurological manifestations. In 43
small ruminants, clinical toxoplasmosis is associated with fever, dyspnea, nervous 44
symptomatology, and abortion, generally in sheep and perinatal mortality in lambs (Urquhart, 45
1998) whereas it presents diarrhea, cough, and dyspnea in pigs (Wingstrand et al., 1997). 46
This disease is caused by an obligate intracellular protozoan parasite named 47
Toxoplasma gondii, which is world-widely scattered (Dubey & Beattie, 1988). Its life cycle is 48
facultatively heteroxen: Felidae are definite hosts where the sexual reproduction of the 49
parasite occurs with the formation of oocytes which are eliminated via feces. All 50
homoeothermic animals are to be intermediary hosts, where the asexual reproduction of the 51
parasite occurs with the formation of tachyzoites and bradyzoites (Jacobs, 1967; Dubey, 52
1994). Tachyzoites present a high proliferation rate, what favors their dissemination within 53
the host, characterizing the acute phase of the disease. Tissue cysts, full of bradyzoites, last 54
for a long amount of time, sometimes the entire life of the host, what characterizes the chronic 55
phase of the disease (Ferreira et al., 2003). 56
The infection by T. gondii may occur as a result of: (1) ingestion of food or 57
water contaminated with oocytes from cat feces, (2) ingestion of tissue cysts in raw or 58
undercooked meat, (3) via transplacentary (Barragan & Sibey, 2003), (4) blood transfusion 59
(Dubey & Beattie, 1988), or (5) accidental inoculation during laboratorial manipulation. 60
When oral infection occurs, the parasite crosses the intestinal epithelium, disseminates to 61
other tissues, and may cross other biological barriers such as the placenta and the 62
hematoencephalic barrier, and reach immunologically privileged sites. The course of the 63
parasitic infection is highly variable mainly according to the type of host, immunological 64
situation, the path and level of the infection, and the parasite constitution (Johnson, 1984). 65
The T. gondii presents a highly clonal population structure (Howe & Sibley, 66
1995), which predominantly consists of three lines named type I, II, and III. As type I samples 67
49
are often isolated from infections in human being, samples from infections in animals are 68
predominantly from either type II or III (Howe & Sibley, 1995; Howe et al., 1997; 69
Mondragon et al., 1998; Owen & Trees, 1999). Type II strains present low virulence (Howe 70
& Sibley, 1995) and high prevalence
either for human or animals
all around the world 71
(Howe et al., 1997; Mondragon et al., 1998; Fuenes et al., 2001). There is a considerable 72
interest in determining how genotypes of T. gondii may differ concerning the capacity to 73
induce pathologies or their occurrence in a certain animal species (Saeij et al., 2005). 74
It is common to observe signs and symptoms of alterations in the Central 75
Nervous System (CNS) from patients infected with T. gondii; most of all, headache, focal 76
neurologic signs, confusion attacks evolving to coma, coriorretinitis, hydrocephalus, and 77
encephalitis (Daubener & Hadding, 1997). Moreover, the tissue cyst rupture may release the 78
parasite and destroy the nervous tissue resulting in meningoencephalitis (Gazzinelli et al., 79
1993). On the other hand, it is also common to observe diarrhea in animals infected by T. 80
gondii (Hass et al., 1989; Urquhart, 1998). Thus, a possible alteration caused by the parasite 81
on the Enteric Nervous System (ENS)
responsible for the digestive tube intrinsic 82
innervation (Furness, 2006)
may be related to the diarrhea pathophysiology. Therefore, this 83
study was carried out in order to assess possible alterations caused by a genotype II 84
Toxoplasma gondii strain on the total number and morphometry of the neurons of the 85
myenteric plexus in the terminal ileum and the descending colon of rats. 86
87
MATERIAL AND METHODS 88
Experimental Groups 89
The experimental protocol as previously approved by the UNIPAR Ethics 90
Committee in Researches Involving Animal Experimentation. 91
Eight male 60-day-old Wistar rats (220.2±24.5g) were kept inside boxes with 92
individual grids in a bioterium constantly at 25°C with 12-hr light/12-hr dark alternate cycles 93
were used. Animals were divided into two groups: Control (n = 4) and Experimental (n =4). 94
In this, twenty genotype II (ME-49) Toxoplasma gondii strain tissue cysts were orally 95
administered. All animals received rat chow (NUVITAL®) and water ad libitum. After 24 96
hours, each specimen was anesthetized intramuscularly by using the following protocol: 97
Acepram® 1.26 mL/kg + Ketalar® (10 ml) 1.26 mL/kg + Rompum® (2%) 0.42 mL/kg + 98
Atropina® (1%) 0.22 mL/kg (Pachaly et al., 2003), for the removal of the terminal ileum and 99
descending colon by laparotomy. The distal portion towards the ileocecal fold was considered 100
50
as the terminal ileum. Then, the animals were submitted to euthanasia by anesthetic 101
deepening. 102
103
Collecting Whole Mount Preparations 104
The terminal ileum and the descending colon from each animal were measured 105
with respect to its length and width by using a millimetric ruler right after being removed. As 106
a result of the difficulty of anatomically distinguishing the terminal ileum of the jejunum, 107
these measurements were performed by considering these two organs together. Then, they 108
were washed in a 0.9%-NaCl solution, filled and immersed in a fixing solution containing 109
ascetic formal for 48 hours. They were thus dissected with the aid of a stereomicroscope by 110
removing the mucosa and the submucosa. The whole mounted
composed by muscle and 111
serous were stained according to the Giemsa technique (Barbosa, 1978). 112
113
Quantitative Analysis 114
The total number of myenteric neurons in 120 microscopic fields, uniformly 115
distributed around the entire intestinal circumference of each specimen, totalizing 25.5mm2 116
per animal, was counted. Therefore, a Motic BL220A binocular microscope with 40x 117
objective was used. The neurons positioned at the edges of each field were counted in 118
alternated fields. 119
120
Morphometric Analysis 121
The area of the soma, cytoplasm, and the nucleus of 300 neurons of the 122
myenteric plexus of the terminal ileum and the descending colon (uniformly distributed all 123
over the intestinal circumference) of the animals from each group was measured with the 124
software Image Motic Plus, version 2.0. A microscope with a 2.0 Megapixel digital camera 125
(MOTICAM 2000) connected to a computer was used for that. From these values, neurons 126
were divided into classes by considering the soma area (100µm2 interval) and the nucleus-127
soma ratio (0.10 intervals). 128
129
Statistic Analysis 130
51
All data were first submitted to the Kolmogorov-Smirnov test in order to verify 131
the type of distribution. Data with normal distribution were expressed in mean ± standard 132
deviation. Data with free distribution were expressed as median and percentiles 25 and 75 133
(P25; P75). In order to compare the data among the Control Group and the Experimental 134
Group, Student t- test (normal distribution data) and Mann-Whitney (free distribution data) 135
were used by considering significant P-values lower than 0.05. 136
137
RESULTS 138
The results of the measure of the dimensions of the collected organs through the 139
quantitative and morphometric analysis are presented on Tables 1, 2, and 3, respectively. The 140
number of neurons was divided in classes according to the soma area and according to soma-141
nucleus area ratio is presented on Figures 1 and 2, respectively. 142
143
Table 1
Length, width, and area of the ileum-jejunum and the total colon of healthy rats 144
(Control Group
CG) and the submitted to the infection by a genotype II T. gondii strain 145
(Experimental Group EG). 146
Organ Group Lenght (cm) Width (cm) Area (cm2)
CG 107.25 ± 2.36 1.40 ± 0.08 150.10 ± 8.27 Ileum-
jejunum EG 102.75 ± 3.77 1.33 ± 0.13 136.40 ± 16.97
CG 15.45 ±1.32 2.15 ±0.37 33.11 ±5.74 Total colon
EG 14.75 ± 1.55 1.98 ± 0.34 28.75 ± 2.54
Values presented as mean ± standard deviation. Values denoted by asterisks in the same 147
column are significantly different (p
52
EG colon 4,772.3 200.8
153
Table 3
Soma area, nucleus area, cytoplasm area, and the nucleus-soma area ratio of the 154
myenteric neurons in the terminal ileum and descending colon of healthy rats (Control Group 155
CG) and the submitted to the infection by a genotype II T. gondii strain (Experimental 156
Group EG). 157
158
Organ Group Soma area
( m2)
Nucleus area
( m2)
Cytoplasm area
( m2)
Nucleus- soma
area ratio
CG 238.9 (134.2; 826.5)* 95.3 (47.8; 330.2)* 145.3 (79.9; 466.0)* 0.39 (0.31; 0.49) Terminal
ileum EG 309.2 (142.3; 900.0)* 119.7 (55.3; 326.0)* 191.9 (85.5; 544.2)* 0.38 (0.31; 0.47)
CG 135.0 (98.3; 183.4) 69.9 (50.7; 94.6) 60.9 (42.8; 94.2) 0.52 (0.44; 0.59) Descending
colon EG 132.1 (88.3; 216.4) 69.4 (46.7; 101.2) 60.2 (36.4; 121.6) 0.52 (0.42; 0.61)
Values presented as mean ± standard deviation. Values denoted by asterisks in the same 159
column are significantly different (p
53
0
20
40
60
80
100
120
140
0.71
Classes
Ab
solu
te F
req
uen
cy
CG (Ileum) GE (Ileum) CG (Descending colon) EG (Descending colon)
167
Figure 2
Histogram of the nucleus-soma area ratio of the myenteric neurons in the terminal 168
ileum and descending colon of healthy rats (Control Group
CG) and the infected by a 169
genotype II T. gondii strain (Experimental Group
EG). Columns denoted by asterisks differ 170
significantly (*p
54
well as the number of the myenteric neurons in these organs. That is possibly due to the fact 189
that the organs were collected after being infected for 24 hours, therefore, there was not 190
enough time to cause a proliferative inflammatory response which would release an increase 191
of the intestinal area, mostly its width. Thus, it is possible to consider that the time of 192
infection did not result in either necrosis or apoptosis of the nervous cells, what would be 193
plausible since the immunological effector cells and their products are responsible for 194
alterations in the nervous cells (Szabo & Feher, 1991; Bela et al., 1997; Bogers et al., 2000; 195
Galeazzi et al., 2000; Balemba et al., 2001; Furness, 2006). Perhaps this is a peculiar 196
characteristic of T. gondii as in experimental studies on rat colitis a loss of up to 50% of the 197
myenteric neurons between 48 hours and 35 days after the disease induction is observed 198
(Sanovic et al., 1999). 199
On the other hand, significant increase of the cytoplasm and nucleus area 200
resulting from the increase of the soma and the myenteric neurons in the terminal ileum was 201
observed (p
55
organs probably occurred by an action of the immune system, and not by a direct action of the 222
parasite on the neurons. Moreover, the experiment length of time (24 hours) might have been 223
enough so that the infection would have altered the immune system of the descending colon 224
as to module its ENS. Thus, it is worth remarking that a little is known of the nature of the 225
interactions between the ENS and the gastrointestinal tube; however, it is notorious that the 226
response of the ENS is not uniform towards different stimuli of an inflammatory process 227
(Lomax et al., 2005). For instance, in patients with Crohn disease and ulcerative colitis, 228
alterations in enteric ganglions such as neuronal hypertrophy and glial hyperplasia were 229
observed (Geboes & Collins, 1998). 230
With respect to T. gondii, the NF-
transcription factor plays a core part 231
regarding the inflammatory, immune, and antiapoptotic response. The (type II) ME-49 strain 232
induces the translocation of the NF-
to the nucleus of the splenocytes of mice (Dobbin et 233
al., 2002) and macrophages from the bone marrow (Robben et al., 2004), thus stimulating the 234
transcription of the genes involved in the proinflammatory response such as those which 235
codify the Tumoral Necrosis Factor TNF- (Sinai et al., 2004), decreasing its pathogenicity. 236
TNF-
is mainly produced by macrophages and monocytes, and secondarily stimulates the 237
production of several other cytokines such as IL-6, IL-12 and IL-18 by developing a crucial 238
role in the initialization and amplification of the inflammatory reactions. 239
Genotype II T. gondii strains also induces high levels of IL-10, IL-1
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