Participação dos neurônios noradrenérgicos da região A5 no ...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Jlio de Mesquita Filho
PROGRAMA INTERINSTITUCIONAL DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FISIOLGICAS
ASSOCIAO AMPLA UFSCar/UNESP de Araraquara
CAMILA LINHARES TAXINI
PARTICIPAO DOS NEURNIOS NORADRENRGICOS DA REGIO A5 NO CONTROLE CARDIORRESPIRATRIO DURANTE A HIPERCAPNIA E HIPXIA
EM RATOS
Jaboticabal
2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Jlio de Mesquita Filho
PROGRAMA INTERINSTITUCIONAL DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FISIOLGICAS
ASSOCIAO AMPLA UFSCar/UNESP de Araraquara
CAMILA LINHARES TAXINI
PARTICIPAO DOS NEURNIOS NORADRENRGICOS DA REGIO A5 NO
CONTROLE CARDIORRESPIRATRIO DURANTE A HIPERCAPNIA E HIPXIA
EM RATOS
Dissertao de Mestrado apresentada ao
Programa Interinstitucional de Ps
Graduao em Cincias Fisiolgicas com
associao ampla UFSCar/UNESP
Araraquara como parte dos requisitos para a
obteno do ttulo de Mestre em Cincia
Fisiolgicas.
Orientadora: Profa. Dra. Luciane Helena Gargaglioni Batalho
Co-Orientador: Prof. Dr. Thiago dos Santos
Moreira
Jaboticabal
2016
Ficha catalogrfica elaborada pelo DePT da Biblioteca Comunitria UFSCar Processamento Tcnico
com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
Taxini, Camila Linhares
T235p Participao dos neurnios noradrenrgicos da regio
A5 no controle cardiorrespiratrio durante a
hipercapnia e hipxia em ratos / Camila Linhares
Taxini. -- So Carlos : UFSCar, 2016.
69 p.
Dissertao (Mestrado) -- Universidade Federal de
So Carlos, 2012.
1. Hipxia. 2. Hipercapnia. 3. Sistema nervoso
autnomo. 4. Neurnios noradrenrgicos. 5.
Quimiorrecepo. I. Ttulo.
DEDICATRIA
minha famlia e amigos que fizeram parte dessa etapa, me servindo de exemplo, me
ajudando nos momentos difceis e compartilhando felicidades, demonstrando todo
amor e afeto.
AGRADECIMENTOS
Hoje eu sei que a aprendizagem e a fora de vontade so essenciais, aprendi que o
esforo vale a pena sempre. Nada na vida conquistamos sozinhos, sempre precisamos de
outras pessoas para alcanar os nossos objetivos.
Este espao dedico queles que deram a sua contribuio para que este trabalho fosse
realizado. A todos deixo aqui o meu agradecimento sincero.
Agradeo primeiramente Deus por me amparar nos momentos difceis, me dar fora
interior para superar as dificuldades, mostrar os caminhos nas horas incertas e me suprir em
todas as minhas necessidades. Por ter me dado serenidade para aceitar as coisas que no posso
mudar, coragem para mudar aquilo que sou capaz e sabedoria para ver a diferena.
minha orientadora Profa Dr
a Luciane Helena Gargaglioni pela oportunidade
oferecida. Obrigada por acreditar no meu potencial, por me mostrar o caminho da cincia,
pela orientao, incentivo, me encorajar nas horas difceis e me aplaudir nos momentos de
glria, por me atender em qualquer dia e em qualquer horrio, por ter me dado suporte
emocional quando mais precisei, pelo bom convvio tanto no ambiente de trabalho como fora
dele, e principalmente por ser exemplo de profissional e de mulher que sempre seguirei.
Ao Profo Dr
o Thiago dos Santos Moreira pela co-orientao excelente, pois quando
precisei sempre estava presente para ajudar, tirar dvidas, orientar e discutir o andamento do
trabalho enriquecendo meu conhecimento cientfico e pessoal, por ter me recebido em seu
laboratrio e pela pacincia para me ensinar o que nunca imaginei aprender, tambm pela boa
convivncia e disponibilidade.
Profa Dr
a Knia Cardoso Bcego por dividir o ambiente de trabalho, experincias,
conhecimentos, por ajudar sempre que foi preciso e pela amizade.
Profa Dr
a Ana Carolina Thomaz Takakura que muito me ajudou no desenvolver do
trabalho, me acolheu em seu ambiente de trabalho me ensinando, ajudando e orientando em
tudo o que foi preciso, por sempre estar disposta a tirar dvidas, a discutir os resultados e pela
boa companhia.
Aos meus pais, Carlos e Jara que no me deram apenas a vida, mas principalmente a
alegria de viver, minha educao, condies de estudo e me ensinaram a fazer tudo da melhor
forma possvel com dignidade, confiando em mim e apoiando para que conseguisse realizar
meus sonhos.
minha irm Carla pela amizade, companheirismo, cumplicidade, compreenso,
conselhos, alegrias, por sempre torcer pelo meu sucesso e me ajudar no que foi preciso.
equipe do laboratrio, que sem dvida alguma merecem o louvor desse trabalho tanto
quanto eu, pois no conseguiria sem eles, foram eles que estavam sempre do meu lado quando
acontecia algum imprevisto e precisava de ajuda, quem passou horas sentados do meu lado
para ajudar ou mesmo para fazer companhia, fosse durante a semana ou nos finais de semana,
foram quem me ouviam reclamar da dificuldade em trabalhar com metodologias novas, com a
dificuldade em conseguir terminar meus protocolos, mas sempre estavam me apoiando, me
dando esperana e oferecendo ajuda que muitas vezes no tinha como darem, mas estavam ali.
s meninas de casa por me acolherem, por me deixarem fazer parte de suas vidas e
principalmente por me ajudarem a escrever uma parte da minha, e essa fase foi a que eu mais
cresci, mais aprendi, mais lutei, mais chorei, mais ri, que eu vivi de verdade e sem vocs tudo
isso no seria a mesma coisa. Vocs so minha segunda famlia, me ensinaram lidar com
diferenas e igualdades, me aconselharam, me deram broncas e me ajudaram em tudo.
Aos amigos que conquistei em So Paulo, que fizeram do pouco tempo que passei com
eles inesquecveis e uma amizade que ficou para sempre. repblica do 112D, que aceitaram
a amiga da agregada por terem um bom corao e foi essa, entre outras, qualidades que
fizeram de vocs o que hoje posso chamar, sem dvida alguma, de amigas. Foi por pouco
tempo, mas foi intenso e verdadeiro, obrigada pelos bons momentos na cidade grande.
Ao Euclides por sempre manter a ordem e o bem estar dos nossos animais e do nosso
ambiente de trabalho, por me auxiliar quando precisei e por todo seu trabalho essencial para o
desenvolvimento dos demais.
Ao Jaci Airton Castania, pela pacincia em me auxiliar nos procedimentos cirrgicos e
pela ajuda, pois sem ele no seria capaz de finalizar parte do trabalho, por passar horas
operando e ressuscitado os animais e por no ter desistido.
Ao Prof. Dr. Hlio Cesar Salgado pela colaborao e pela disponibilidade em ajudar no
desenvolvimento desse trabalho.
Ao secretrio Alexandre Prata Vieira Chiva por sanar todas as dvidas e ajudar em
todos os processos buricrticos do programa de ps graduao.
Aos amigos do mestrado pela boa convivncia durante as disciplinas, as expectativas e
pensamento positivo para que esse trabalho desse certo, pelas estadias fora de casa,
companhia e amizade dentro e fora do mbito acadmico, posso dizer que nada por acaso e
no foi diferente com a gente.
todos meus amigos, de perto ou de mais longe, os mais antigos, os mais novos, que
me apoiaram, acreditaram em mim, por entenderem a minha ausncia, e fizeram dessa etapa
uma fase de crescimento pessoal e muito feliz.
Aos animais os quais no foram apenas material de estudo, mas contriburam para o
desenvolvimento da pesquisa.
Finalmente, ao suporte financeiro da FAPESP, CNPq e INCT-Fis. Comp. para que
esse trabalho fosse realizado.
A persistncia o caminho do xito. (Charles Chaplin)
RESUMO
O grupamento noradrenrgico A5 representa um importante conjunto de neurnios
localizado na ponte ventrolateral e recebe projees de vrias reas do bulbo relacionadas
com a regulao cardiorrespiratria. A regio A5 contribui para a maturao do sistema
respiratrio antes do nascimento e em ratos adultos esses neurnios esto conectados com a
rede neural responsvel pela ritmognese respiratria. Os neurnios da regio A5 apresentam
um importante envolvimento no controle autonmico, pois envia e recebe projees de vrias
regies envolvidas no controle cardiovascular, alm de enviar projees diretamente para a
coluna intermdio lateral. Assim, testamos a hiptese de que os neurnios noradrenrgicos da
regio A5 participam das respostas cardiorrespiratrias produzidas pela hipercapnia ou
hipxia, em ratos anestesiados e no anestesiados. Em animais no anestesiados, sem e com
desnervao sino-artica, a leso dos neurnios noradrenrgicos da regio A5 com anti-
dopamina -hidroxilase-saporina (anti-DH-SAP; 4,2 ng) promoveu uma reduo do volume
corrente da resposta ventilatria hipercapnia (7% CO, 30 minutos) e hipxia aguda (7% O, 30 minutos), mas no alterou a resposta cardiovascular. Em animais anestesiados, durante a hipercapnia aguda (5% a 10% CO, 5 minutos), a microinjeo bilateral de muscimol (agonista GABA-A; 2 mM) e a leso qumica com anti-DH-SAP na regio A5
reduziram o aumento da presso arterial mdia (PAM), atividade simptica esplncnica
(sSNA), frequncia e amplitude do nervo frnico produzidas por hipercapnia. Durante a
hipxia aguda (8-10% O2, 30 segundos) a microinjeo bilateral de muscimol na regio A5
atenuou o aumento da PAM e da sSNA promovido pela hipxia, sem afetar a atividade do
nervo frnico, porm a leso qumica da regio A5 no alterou as respostas promovidas pela
hipxia. Os resultados do presente trabalho demonstram que a participao da regio A5 na
resposta cardiorrespiratria depende do estado do animal, anestesiado ou no, bem como os
nveis de CO2 e O2. Em animais no anestesiados, os neurnios noradrenrgicos da regio A5
exercem uma modulao excitatria no controle do volume corrente em resposta
hipercapnia e hipxia. Enquanto em animais anestesiados, essa regio estimula a resposta
cardiorrespiratria hipercapnia, aumentando a amplitude e frequncia do nervo frnico, e
atividade simptica.
Palavras-chave: Sistema noradrenrgico. Quimiorrecepo. Sistema nervoso autnomo.
ABSTRACT
The noradrenergic A5 group is an important group of neurons located in the
ventrolateral pons and receives projections from several medullar areas related to
cardiorespiratory regulation. The A5 region contributes to the maturation of the respiratory
system before birth and in adult rats these neurons are connected with the neural network
responsible for respiratory rhythmogenesis. The A5 neurons have an important involvement in
autonomic control, these neurons send and receive projections from various regions involved
in cardiovascular control, and send projections directly to the intermidial column lateral.
Thus, we tested the hypothesis that noradrenergic neurons of A5 region participate in
cardiorespiratory responses produced by hypercapnia or hypoxia in anesthetized and
ananesthetized rats. In ananesthetized animals without and sino-aortic denervation, the lesion
of the noradrenergic neurons in the A5 region with anti-dopamine -hydroxylase-saporin
(anti-DH-SAP, 4.2 ng) promoted a decrease of tidal volume response to acute hypercapnia
(7% CO, 30 minutes) and acute hypoxia (7% O, 30 minutes), but did not alter the
cardiovascular response. In anesthetized animals during the acute hypercapnia (5% to 10%
CO, 5 minutes), the bilateral microinjection of muscimol (GABA-A agonist; 2 mM) and the
chemical injury with anti-DH-SAP on the A5 region reduced the increase of mean arterial
pressure (MAP), splanchnic sympathetic activity (sSNA), frequency and amplitude of phrenic
nerve produced by hypercapnia. During acute hypoxia (8-10% O2, 30 seconds) the bilateral
microinjection of muscimol in the A5 region attenuated the increase in MAP and sSNA
promoted by hypoxia without affecting the activity of the phrenic nerve, but the chemical
injury of A5 region not altered responses promoted by hypoxia. The results of this study show
that the participation of the A5 region in cardiorespiratory response depends on the animal's
condition, anesthetized or not, as well as CO2 and O2 levels. In animals ananesthetized, the
noradrenergic neurons of A5 region exert an excitatory modulation in control of tidal volume
in response to hypercapnia and hypoxia. While in anesthetized animals, this region stimulates
the cardiorespiratory response to hypercapnia, increasing the amplitude and frequency of the
phrenic nerve, and sympathetic activity. Key words: Noradrenergic system. Chemoreception. Autonomic nervous system.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Fotomicrografia de seces coronais do tronco enceflico mostrando os corpos
celulares de neurnios noradrenrgicos na regio A5 marcados com tirosina hidroxilase em
ratos no anestesiados 32
Figura 2 Mdia do nmero dos neurnios noradrenrgicos na regio A5 imunorreativos
para tirosina hidroxilase 33 Figura 3 Variao da resposta hipercapnia (7% CO2) nas variveis respiratrias em
animais no anestesiados 35 Figura 4 Variao da resposta hipercapnia (7% CO2) nas variveis cardiovasculares em
animais no anestesiados 37 Figura 5 Variao da resposta hipxia (7% O2) nas variveis respiratrias em animais no
anestesiados 39 Figura 6 Variao da resposta hipxia (7% O2) nas variveis cardiovasculares em animais
no anestesiados 41
Figura 7 Locais de injeo na ponte ventrolateral em ratos anestesiados 42
Figura 8 Efeitos cardiorrespiratrios produzidos pela ativao de quimiorreceptores
centrais em ratos anestesiados aps a microinjeo de muscimol 44
Figura 9 Efeitos cardiorrespiratrios produzidos pela ativao de quimiorreceptores
perifricos em ratos anestesiados aps a microinjeo de muscimol 46
Figura 10 Identificao imuno-histoqumica de neurnios noradrenrgicos da regio A5 em
ratos anestesiados 48
Figura 11 Ao seletiva de anti dopamina beta hidroxilase em neurnios positivos para
tirosina hidroxilase 49
Figura 12 Efeito da leso dos neurnios noradrenrgicos da regio A5 no sistema
cardiorrespiratrio aps ativao dos quimiorreceptores centrais em ratos anestesiados 50
Figura 13 Efeito da leso dos neurnios noradrenrgicos da regio A5 no sistema
cardiorrespiratrio aps ativao dos quimiorreceptores perifricos em ratos anestesiados 52
LISTA DE TABELAS Tabela 1 Mdia dos valores do pH e da presso parcial de CO2, O2 no sangue arterial
durantea normxia (0% CO2) e durante a hipercapnia (7% CO2) em ratos no anestesiados 36
Tabela 2 Mdia dos valores da presso parcial de CO2, O2 e pH no sangue arterial durante a
normxia (21% O2) e durante a hipxia (7% O2) em ratos no anestesiados 40
SUMRIO DEDICATRIA ...................................................................................................................2
AGRADECIMENTOS .........................................................................................................3
RESUMO ...............................................................................................................................6
ABSTRACT ..........................................................................................................................7
LISTA DE FIGURAS ...........................................................................................................8
LISTA DE TABELAS ..........................................................................................................8
1 INTRODUO ...............................................................................................................13
1.1 Quimiorrecepo central e integrao cardiorrespiratria durante ativao dos
quimiorreceptores centrais ............................................................................................13
1.2 Quimiorrecepo perifrica e integrao cardiorrespiratria durante ativao
dos quimiorreceptores perifricos .................................................................................15
1.3 Regio noradrenrgica A5 .......................................................................................16 2 OBJETIVOS ....................................................................................................................19
2.1 Animais no anestesiados .........................................................................................19
2.2 Animais anestesiados ................................................................................................19
3 MATERIAIS E MTODOS ...........................................................................................20
3.1 Animais no anestesiados .........................................................................................20
3.1.1 Procedimentos cirrgicos, anestesia e aquisio de dados ......................................20
3.1.1.1 Leses qumicas da regio A5 ..........................................................................20
3.1.1.2 Implante de cnulas arteriais e sensores de temperatura ..................................21
3.1.1.3 Desnervao sino-artica ..................................................................................21
3.1.1.4 Medidas da temperatura corporal .....................................................................22
3.1.1.5 Registro da presso arterial e frequncia cardaca ............................................22
3.1.1.6 Determinao dos gases sanguneos e pH ........................................................22
3.1.1.7 Determinao da Ventilao .............................................................................23
3.1.1.8 Mistura gasosas.................................................................................................23
3.1.1.9 Avaliao da localizao e efetividade da leso ...............................................24
3.1.1.10 Anlise dos Dados ..........................................................................................24 3.2 Animais anestesiados ................................................................................................25
3.2.1 Procedimentos cirrgicos, anestesia e aquisio de dados ......................................25
3.2.1.1 Leses qumicas da regio A5 ..........................................................................25
3.2.1.2 Procedimentos cirrgicos e anestesia ...............................................................26
3.2.1.3 Microinjees cerebrais de agonista GABA-A na regio A5 ...........................27
3.2.1.4 Registro da presso arterial e da frequncia cardaca .......................................27
3.2.1.5 Medida da atividade do nervo frnico e do nervo esplncnico ........................28
3.2.1.6 Testes do quimiorreflexo central e perifrico ...................................................29
3.2.1.7 Histologia cerebral para confirmao dos pontos de injeo central ...............29 3.2.1.8 Imunohistoqumica ...........................................................................................29
3.2.2 Anlise dos resultados .............................................................................................31 4 RESULTADOS ................................................................................................................32
4.1 Animais no anestesiados .........................................................................................32
4.1.1 Imunohistoqumica ..................................................................................................32 4.1.2 Desnervao sino-rtica ..........................................................................................33
4.1.3 Efeito da leso na regio A5 utilizando a toxina saporina conjugada com anti-
dopamina -hidroxilase sobre a ventilao, gases sanguneos e presso arterial durante a
hipercapnia em ratos no anestesiados intactos ou com desnervao sino-artica. .........34
4.1.4 Efeito da leso na regio A5 utilizando a toxina saporina conjugada com anti- dopamina -hidroxilase sobre a ventilao, gases sanguneos e presso arterial durante a
hipxia em ratos no anestesiados com desnervao sino-artica ou intactos. ................38
4.2 Animais anestesiados ................................................................................................42
4.2.1 A anlise histolgica ................................................................................................42 4.2.2 Respostas respiratrias e da atividade simptica ativao do quimiorreflexo
central aps injeo bilateral de muscimol na regio A5 .................................................43
4.2.3 Respostas respiratrias e da atividade simptica ativao do quimiorreflexo
perifrico aps injeo bilateral de muscimol na regio A5 ............................................44
4.2.4 Leso seletiva de neurnios TH da regio A5 com anti-DH-SAP ........................47
4.2.5 Respostas respiratrias e da atividade simptica ativao do quimiorreflexo
central aps a inibio bilateral da regio A5 com anti-DH-SAP ..................................49
4.2.6 Respostas respiratrias e da atividade simptica ativao do quimiorreflexo
perifrico aps a inibio bilateral da regio A5 com anti-DH-SAP .............................51 5 DISCUSSO ....................................................................................................................53
5.1 Efeito da desnervao sino-artica em ratos no anestesiados sobre os parmetros cardiorrespiratrios ...................................................................................53
5.2 Participao da regio A5 no controle respiratrio ..............................................54
5.3 Participao da regio A5 no controle cardiovascular .........................................56
5.4 Participao da regio A5 no controle da atividade simptica ............................58
CONCLUSES ...................................................................................................................59
REFERNCIAS..................................................................................................................60
APENDICE .........................................................................................................................69
13
1 INTRODUO
O sistema respiratrio responsvel por manter constante as presses parciais arteriais
de CO2 (PaCO2) e O2 (PaO2) frente a qualquer variao na demanda de O2 e na produo de
CO2 (HALDANE; PRIESTLEY, 1905). Em relao s respostas as variaes de CO2, os
quimiorreceptores sensveis ao CO2/pH podem ser classificados como perifricos (localizados
bilateralmente na bifurcao das artrias cartidas e nos corpos articos) e centrais
(localizados no sistema nervoso central - SNC). Esses sensores centrais apresentam papel
predominante na resposta ventilatria ao CO2 comparado aos quimiorreceptores perifricos,
estudos indicam que os corpos carotdeos so responsveis por cerca de 30% da resposta
ventilatria hipercapnia sistmica (DEMPSEY; FORSTER, 1982; FORSTER et al., 2008;
PAN et al., 1998), sendo o restante realizado pelos quimiorreceptores centrais (FORSTER et
al., 2008; FORSTER; SMITH, 2010). Estudo de Smith e colaboradores (2010) demonstrou
que as informaes provenientes dos quimiorreceptores perifricos tm um pronunciado efeito
sinrgico e hiperaditivo na sensibilidade dos quimiorreceptores centrais, demonstrando que
esses sensores interagem entre si, dessa forma a resposta ventilatria hipercapnia depende
dos quimiorreceptores perifricos e centrais.
Em relao queda da presso parcial do O2, o organismo quando exposto hipxia
apresenta um aumento da ventilao pulmonar mediado pela ativao dos quimiorreceptores
perifricos. A informao dos quimiorreceptores perifricos ascende para o tronco enceflico
(principalmente ncleos respiratrios bulbares), onde ocorre integrao das aferncias com
neurnios de reas especficas do bulbo, essas regies fazem parte do processamento deste
sinal e da modulao da resposta (LI; NATTIE, 2006; TAKAKURA et al., 2006), resultando
em um aumento da ventilao (GONZALEZ et al., 1995).
1.1 Quimiorrecepo central e integrao cardiorrespiratria durante ativao dos
quimiorreceptores centrais
A PaCO2 do encfalo detectada via mudanas no pH (LOESCHCKE, 1982).
Entretanto, como e onde o pH detectado e, ainda, como a acidificao do SNC pode alterar
as variveis cardiorrespiratrias (quimiorreflexo central) ainda motivo de vrias
controvrsias. Atualmente existem duas teorias a respeito de como e quais grupamentos
neuronais estariam envolvidos no controle da quimiorrecepo central.
14
Uma primeira teoria, chamada de teoria quimiorreceptora especializada (GUYENET;
STORNETTA; BAYLISS, 2008; MULKEY et al., 2004). Essa teoria postula que, em
situaes in vivo, os neurnios responsveis pelo ritmo respiratrio no so sensveis ao pH,
mas recebem projees de um grupamento especializado de neurnios excitatrios, localizados
na superfcie ventral do bulbo em um ncleo denominado ncleo retrotrapezide, que seria
considerado o principal local onde estariam localizados as clulas sensveis ao CO2/pH
(MULKEY et al., 2004; TAKAKURA et al., 2006).
Por outro lado, uma segunda teoria postula que a quimiorrecepo central est
distribuda em todo SNC (NATTIE; LI, 2009). Muitos so os neurnios candidatos
envolvidos, dentre os quais podem se incluir os grupamentos monoaminrgicos (adrenrgicos
e serotonrgicos), neurnios localizados na superfcie ventral, nos ncleos do trato solitrio
(NTS), neurnios da medula espinhal e do cerebelo, e neurnios orexinrgicos localizados no
hipotlamo e do cerebelo (ABBOTT et al., 2009; BIANCARDI et al., 2008; DEAN;
LAWING; MILLHORN, 1989; DENG et al., 2007; JOHNSON; HAXHIU; RICHERSON,
2008; LI; NATTIE, 2006; MULKEY et al., 2004; RICHERSON, 2004; STORNETTA et al.,
2006; TAKAKURA et al., 2007). Nesse caso, a quimiorrecepo central seria resultado de um
efeito cumulativo do pH nesses neurnios, resultando em uma resposta final (KAWAI;
ONIMARU; HOMMA, 2006; LI; NATTIE, 2006).
Do incio dos anos 60 at o incio dos anos 80, estudos mostravam a superfcie ventral
do bulbo como principal regio quimiossensvel no SNC (KONIG; SELLER, 1991;
LOESCHCKE, 1982). As evidncias celulares mostrando a participao da superfcie ventral
do bulbo na quimiossemsibilidade caminharam de maneira lenta at o incio da dcada de 80.
Posteriormente experimentos in vitro mostraram que vrios neurnios da superfcie ventral do
bulbo respondiam s variaes no pH do meio, e tambm eram responsveis mediante sua
excitao ou inibio qumica (BALLANTYNE; SCHEID, 2001; BAYLISS et al., 2001;
FELDMAN; MITCHELL; NATTIE, 2003; KAWAI et al., 1996; KAWAI; ONIMARU;
HOMMA, 2006; RICHERSON, 2004), sendo uma importante evidncia da distribuio dos
quimiorreceptores no SNC.
O aumento da presso parcial de CO2 promovido pela hipercapnia ocasiona o aumento
da presso arterial, da atividade simptica eferente e da atividade ventilatria, mesmo aps a
remoo dos barorreceptores e dos quimiorreceptores perifricos, indicando que os
quimiorreceptores centrais podem ser os principais responsveis pelos efeitos do CO2 no
sistema cardiorrespiratrio (MILLHORN, 1986; MOREIRA et al., 2006; OIKAWA et al.,
2005)
15
Em gatos e ratos vagotomizados e com os barorreceptores desnervados, o aumento da
presso parcial de CO2 ativa o componente fsico da atividade simptica cervical e
esplncnica, o qual sincronizado com o aumento da atividade respiratria (MILLHORN,
1986; MOREIRA et al., 2006). Esses resultados sugerem que, a ativao dos
quimiorreceptores centrais aumenta a atividade simptica via neurnios que fazem parte da
rede respiratria bulbar ou de neurnios que esto em sincronia com a rede respiratria bulbar.
A interao dos neurnios que controlam a ventilao com os quimiorreceptores centrais
influenciando a atividade simptica e cardiovascular muito pouco documentada. Entretanto
essa ideia no pode ser descartada, pois durante a hipercapnia (5-10% CO2) ratos com inibio
da rede respiratria apresentam um aumento ainda maior na atividade simptica (MOREIRA
et al., 2006; OIKAWA et al., 2005), e adicionalmente sabe-se que a hipercapnia, 5-10 e 10%
CO2 promove um aumento da presso arterial de gatos e bezerros, respectivamente (BLOOM;
EDWARDS; HARDY, 1977; TENNEY, 1956).
1.2 Quimiorrecepo perifrica e integrao cardiorrespiratria durante ativao dos
quimiorreceptores perifricos
Por muitos anos, acreditava-se que as alteraes na ventilao associada hipxia e
hipercapnia eram efeitos da estimulao direta, dos at ento chamados centros respiratrios,
no encfalo. Esse ponto de vista foi modificado aps as descobertas da ao dos
quimiorreceptores carotdeos e articos responsveis pelo aumento da ventilao em resposta
demanda de uma presso parcial de O2 menor (HEYMANS; BOUCKAERT, 1930).
Atualmente sabe-se que a hipxia estimula os quimiorreceptores dos corpos carotdeo e
artico, e a transmisso dessas alteraes ao tronco enceflico feitas por neurnios
sensoriais primrios, cujos axnios esto no nervo do seio carotdeo (FINLEY; POLAK;
KATZ, 1992), gerando mudana na taxa de sntese ou liberao de neurotransmissores no
encfalo (GUNER et al., 2008) a fim de promover respostas compensatrias.
Os quiorreceptores carotdeos so essenciais para o aumento imediato da ventilao e
da presso arterial durante a hipoxemia induzida por hipxia aguda, e tambm tem uma
importante contribuio para compensao respiratria para distrbios agudos do equilbrio
cido-base. Os quimiorreceptores carotdeos medeiam toda ou a maior parte da resposta
ventilatria hipxia aguda, e isso tem sido demonstrado em vrias espcies animais j
estudados (DAMASCENO; TAKAKURA; MOREIRA, 2014; FRANCHINI; KRIEGER,
16
1993; GOURINE, 2005; NATTIE; LI, 2009; OREGAN; MAJCHERCZYK, 1982;
WENKER et al., 2013; ZHANG et al., 2012).
Os quimiorreceptores perifricos tambm participam das respostas ventilatrias
compensatrias hipercapnia, principalmente os do corpo carotdeos (WHIPP;
WASSERMAN, 1980). Pelo fato da troca de H+ e HCO3
- atravs da barreira
hematoenceflica ser mais lenta, os quimiorreceptores carotdeos respondem mais
prontamente aos distrbios agudos do equilbrio cido-base, em contrapartida, em condies
crnicas sua contribuio menos proeminente (OREGAN; MAJCHERCZYK, 1982).
No controle cardiovascular os quimiorreceptores perifricos tm pouca influncia em
condies normais, porm so importantes para ajustar a presso arterial e redistribuir o fluxo
sanguneo durante alteraes acido-base metablicas (OREGAN; MAJCHERCZYK, 1982).
Estudos mostram que hipoxemia hipxia exerce influncias nas vias autonmicas reflexas, no
corao e nos vasos sanguneos atenuando os ajustes cardiovasculares mediados pelos
quimiorreceptores perifricos (HEISTAD; ABBOUD, 1980).
A estimulao dos quimiorreceptores perifricos provoca um aumento na presso
arterial devido ao aumento da resistncia perifrica total, porm h uma vasodilatao na
circulao coronariana a qual depende parcialmente da ativao de fibras vagais colinrgicas
vasodilatadoras (HEISTAD; ABBOUD, 1980; VATNER; RUTHERFORD, 1981). Contudo, a
vasoconstrio perifrica, durante estimulao dos quimiorreceptores carotdeos, pode ser
diminuda ou revertida por efeitos decorrentes de uma hiperpnia (OREGAN; MAJCHERCZYK, 1982). Assim, a integridade dos quimiorreceptores perifricos e suas vias
reflexas so importantes para respostas hiperpneica e hipertensiva durante episdios agudos
de hipxia (HEYMANS, 1958). Em humanos, assim como em outros animais, foi observado
que aps alguns meses ou anos da remoo dos corpos carotdeos h uma recuperao parcial
das respostas ventilatrias hipxia devido ao aumento da sensibilidade dos corpos articos
inativos (SMITH; MILLS, 1980).
1.3 Regio noradrenrgica A5
Os grupamentos noradrenrgicas localizados na regio pontinea so classificados em
quatro grupos: A4, A5, A6 e A7. Esses grupamentos noradrenrgicos esto envolvidos em
vrias funes neurovegetativas como o sono, termorregulao, controle cardiovascular e
respiratrio (GUYENET, 1991). Dentre essas regies, a regio A5 recebe influncia de vrias
17
reas bulbares envolvidas no controle cardiorrespiratrio (GUYENET et al., 1993;
GUYENET; STORNETTA; BAYLISS, 2010).
O grupamento noradrenrgico da regio A5 est localizado na ponte ventrolateral
entre a raiz do nervo facial e o ncleo olivar caudal superior, neurnios noradrenrgicos dessa
regio enviam projees diretas para a medula espinhal e tambm para reas bulbares
envolvidas com o controle cardiorrespiratrio (BYRUM; GUYENET, 1987; JANSEN;
WESSENDORF; LOEWY, 1995; MAIOROV; MALPAS; HEAD, 2000). Marcao
retrgrada e antergrada da regio A5 mostrou que essa regio recebe projees hipotalmicas
como da rea perifornical e ncleo paraventricular, como tambm do Klliker-Fuse,
Parabraquial dorsal, ncleo do trato solitrio (NTS) caudal e intermedirio, e de formaes
reticulares bulbar ventral como A1 e B1. Suas projees estendem-se para o ncleo central da
amdala, rea perifornical do hipotlamo, substncia cinzenta periaquedutal (PAG),
parabraquial, ncleo NTS, ncleo paraventricular do tlamo, leito dos ncleos das estrias
terminais, reas hipotalmicas dorsais, formao reticular ventrolateral do bulbo e para a
coluna intermdio lateral.
Virtualmente todas as reas conectadas com a regio A5 esto envolvidas no controle
cardiovascular, alm de receber projees do maior centro regulatrio cardiovascular
(BYRUM; GUYENET, 1987). Vrias evidncias na literatura tm mostrado a participao da
regio A5 no controle das variveis cardiorrespiratrias. A regio A5 constitui a principal
fonte de excitao noradrenrgica (aproximadamente 40%) dos neurnios pr-ganglionares
simpticos da coluna intermdio-lateral da medula espinhal, formando juntamente com o RVL
os dois grandes grupamentos neuronais responsveis pelo controle da atividade simptica
eferente (BYRUM; STORNETTA; GUYENET, 1984; LOEWY et al., 1979, 1986; STRACK
et al., 1989).
A participao dos neurnios noradrenrgicas da regio A5 no controle cardiovascular
ainda controversa. Estudo envolvendo a estimulao eltrica da regio A5 em coelhos
anestesiados promove o aumento da presso arterial (WOODRUFF; BAISDEN;
WHITTINGTON, 1986), enquanto a estimulao qumica da regio A5 em ratos anestesiados
diminui a presso arterial (NEIL; LOEWY, 1982; STANEK et al., 1984). Os neurnios
noradrenrgicos da regio A5 aumentam sua atividade mediante a ativao de reflexos
cardiovasculares como a ativao do quimiorreflexo perifrico, ou diminuem sua atividade
atravs da ativao do barorreflexo (ANDRADE; AGHAJANIAN, 1982; ERICKSON;
MILLHORN, 1994; GUYENET, 1984; GUYENET et al., 1993; HIROOKA et al., 1997;
HUANGFU; KOSHIYA; GUYENET, 1991).
18
A regio A5 tambm importante para a maturao do sistema respiratrio antes do
nascimento (HILAIRE et al., 2004), a integridade de regies noradrenrgicas pontineas
necessria para a maturao adequada do sistema respiratrio (VIEMARI et al., 2005), visto
que animais knock-out para o gene Ret (gene que codifica o receptor transmembrana de
tirosina hidroxilase) no so capazes de apresentar atividade rtmica do nervo frnico, in vitro. Estudos do final da dcada de 80 mostraram que aps a inibio do grupamento A5, em
neonatos, os neurnios responsveis pelo controle do ritmo respiratrio foram deprimidos
mediante um mecanismo dependente de receptores 2 adrenrgicos, alm do mais a ativao
desse mecanismo promoveu uma diminuio da frequncia respiratria (ERRCHIDI;
HILAIRE; MONTEAU, 2009; HERBERT; MOGA; SAPER, 1990; HILAIRE; MONTEAU;
ERRCHIDI, 1989). Adicionalmente, estudos in vitro e em ratos anestesiados mostram que a
regio A5 parece estar envolvida no controle do ritmo respiratrio, alm de se conectar,
reciprocamente, com o NTS e a regio ventrolateral do bulbo (RVL), regies envolvidas com
o controle da ventilao (HILAIRE; MONTEAU; ERRCHIDI, 1989; HERBERT; MOGA;
SAPER, 1990; HILAIRE et al., 2004; HUANGFU; GUYENET, 1997a, 1997b).
Os neurnios noradrenrgicos da regio A5 parecem estar envolvidos, no apenas em
condies basais, mas tambm na modulao da resposta s alteraes da PaCO2 e PaO2. A
hipercapnia aumenta a expresso da protena Fos nas clulas noradrenrgicas da regio A5,
indicando a ativao dessas clulas (HAXHIU et al., 1996; TEPPEMA et al., 1997). Leses
qumicas dos neurnios catecolaminrgicos do tronco enceflico atenuou a resposta
hipercapnia durante o sono e a viglia, sugerindo que os neurnios noradrenrgicos do tronco
enceflico participam da quimiorrecepo central, onde 78% dos neurnios noradrenrgicos
da regio A5 foram lesados (LI; NATTIE, 2006). Portanto, h evidncias de que os neurnios
noradrenrgicos da regio A5 podem contribuir nas alteraes cardiorrespiratrias
promovidas em uma situao de hipercapnia.
Segundo Guyenet e colaboradores (1993), os neurnios da regio A5 so responsivos
tambm hipxia. Os autores demonstraram que a seco do nervo do seio carotdeo diminui,
mas no elimina, a atividade dos neurnios A5 dando maior suporte hiptese de que esses
neurnios podem ser inerentemente sensveis hipxia. A utilizao da protena Fos como
indicador de ativao neuronal tambm sugere que os neurnios dessa regio so ativados em
resposta hipxia (ERICKSON; MILLHORN, 1994).
Desta forma, diante do que foi discutido, torna-se importante tambm averiguar e
estudar os mecanismos cardiovasculares e respiratrios promovidos pela hipercapnia e
hipxia aps leses seletivas dos neurnios noradrenrgicos do grupamento A5.
19
2 OBJETIVOS
Em vista das evidncias expostas, o presente estudo foi realizado em animais no
anestesiados e anestesiados e teve como principais objetivos:
2.1 Animais no anestesiados
2.1.1 Avaliar os parmetros cardiorrespiratrios basais; 2.1.2 Averiguar a participao dos neurnios noradrenrgicos da regio A5 nas
respostas cardiorrespiratrias induzidas por hipercapnia, por meio de leso seletiva dos
neurnios noradrenrgicos com a toxina saporina conjugada com anti-dopamina -
hidroxilase (anti-DH-SAP);
2.1.3 Investigar a influncia dos quimiorreceptores perifricos na resposta
cardiorrespiratria induzidas por hipercapnia aps a leso seletiva dos neurnios
noradrenrgicos da regio A5 com a toxina anti-DH-SAP;
2.1.4 Avaliar a participao dos neurnios noradrenrgicos da regio A5 nas respostas
cardiorrespiratrias induzidas por hipxia, por meio de leso seletiva dos neurnios
noradrenrgicos com a toxina saporina conjugada com anti-DH-SAP;
2.1.5 Investigar a influncia dos quimiorreceptores perifricos na resposta
cardiorrespiratria induzidas por hipxia aps a leso seletiva dos neurnios
noradrenrgicos da regio A5 com a toxina anti-DH-SAP.
2.2 Animais anestesiados
2.2.1 Investigar o efeito da microinjeo bilateral de muscimol na regio A5 sobre a
presso arterial mdia (PAM), atividade simptica esplncnica (sSNA); frequncia e
amplitudedo nervo frnico durante a hipercapnia;
2.2.2 Investigar o efeito da microinjeo bilateral de muscimol na regio A5 sobre a
PAM, sSNA, frequncia e amplitude do nervo frnico durante a hipxia;
2.2.3 Avaliar a participao dos neurnios noradrenrgicos da regio A5 sobre a PAM,
sSNA, frequncia e amplitude do nervo frnico durante a hipercapnia, por meio de leso
seletiva dos neurnios noradrenrgicos com a toxina saporina conjugada com anti-dopamina -hidroxilase (DH-SAP);
2.2.4 Avaliar a participao dos neurnios noradrenrgicos da regio A5 sobre a PAM,
sSNA, frequncia e amplitude do nervo frnico durante a hipxia, por meio de leso seletiva
dos neurnios noradrenrgicos com a toxina saporina conjugada com anti-dopamina -
hidroxilase (DH-SAP).
20
3 MATERIAIS E MTODOS
3.1 Animais no anestesiados
No total foram utilizados 70 ratos Wistar, adultos, com peso variando entre 290 e 360
gramas, procedentes do biotrio Central da UNESP de Botucatu. Aproximadamente 24%dos
animais tiveram a localizao correta da leso e sobreviveram at o final do experimento,
desta forma foram includos na anlise. Os animais receberam gua e rao ad libitum e foram
mantidos em cmara ventilada (ALESCO, Monte Mor, SP) com temperatura e umidade
controladas. O ciclo claro-escuro do biotrio foi mantido com 12 horas cada. Os protocolos
experimentais esto de acordo com os Princpios ticos de Experimentao Animal adotado
pelo Colgio Brasileiro de Experimentao Animal (COBEA) e foram aprovados pela
Comisso de tica em Experimentao Animal (CEEA) da FCA-UNESP em 10 de maro de
2010 (Protocolo n 004449/10).
3.1.1 Procedimentos cirrgicos, anestesia e aquisio de dados
3.1.1.1 Leses qumicas da regio A5
Em todos procedimentos cirrgicos foram utilizados mtodos asspticos para evitar os
riscos de infeces. Os animais foram, inicialmente, anestesiados intraperitonealmente (i.p)
com quetamina (80 mg/kg) e xilazina (7 mg/kg) e adaptados a um aparelho estereotxico Kopf
(Kopf Instruments, Kent, Inglaterra). Aps uma inciso longitudinal na pele e no tecido
subcutneo para a exposio da calota craniana, o lambda e o bregma foram utilizados como
referncia para nivelar as cabeas dos animais, bem como para localizao da regio A5, os
parmetros estereotaxicos foram de acordo com o atlas de Paxinos e Watson (PAXINOS;
WATSON, 1998). As injees foram realizadas 10,0 mm caudal ao bregma, 2,3 mm lateral a
linha mdia e 9,9 mm abaixo da superfcie do osso craniano. As injees bilaterais (volume de
100 nL) de saporina conjugada anti dopamina -hidroxilase (anti-DH-SAP, 4,2 ng -
Advanced Targeting Systems, San Diego, CA) ou IgG-Saporina (controle - Advanced
Targeting Systems, San Diego, CA) (MADDEN; SVED, 2003; SCHREIHOFER; GUYENET,
2000) na regio A5 foram realizadas utilizando-se pipetas de vidro (dimetro interno 25-40
21
m, Sutter Instrument Co, CA) acopladas a uma seringa Hamilton (5 L). A microinjeo foi
feita utilizando-se uma bomba de microinjeo (modelo 310, Stoelting Co. Il, EUA) ao longo
de 2 minutos para minimizar a difuso da droga. Aps as injees da toxina, as cabeas dos
animais foram suturadas, os animais receberam uma dose profiltica subcutnea (sc) de
enrofloxacina (10mg/kg, Schering-Plough) e de flunixina meglumina (2,5mg/kg, Schering-
Plough). Aps a recuperao os animais foram acomodados e mantidos por 1 semana em
cmara ventilada (ALESCO, Monte Mor, SP) com temperatura e umidade controladas, com
ciclo claro-escuro do biotrio mantido em 12 horas cada. Os animais receberam gua e rao
ad libitum.
3.1.1.2 Implante de cnulas arteriais e sensores de temperatura
Um dia antes dos experimentos, para evitar infeces, os ratos foram anestesiados com
quetamina (80 mg/kg, i.p) e xilasina (7 mg/kg, i.p), e ento um transmissor de telemetria foi
implantado na cavidade abdominal e o cateter foi inserido na artria femoral direita para
aquisio da presso arterial pulstil e frequncia cardaca da aorta abdominal (MLE1022
Telemetry SNA and Pressure Transmitter (TR46SP), ADInstruments, Austrlia). Em alguns
animais, para coletar amostras sanguneas utilizadas na anlise de gases sanguneos, a
canulao da aorta abdominal foi feita inserindo um tubo de polietileno na artria femoral
direita (PE-10 conectado a um PE-50 - Clay Adams, Parsippany, NJ), o cateter foi
transpassado subcutaneamente e sua extremidade livre foi exteriorizada e fixada na rea inter-
escapular, dessa forma o animal estava consciente e livre para movimentar-se no interior da
cmara de pletismografia no dia seguinte. No mesmo dia, um sensor e registrador de
temperatura integrado (data-loggers - SubCue, Calgary, AT, CA) foi implantado na
cavidade abdominal.
3.1.1.3 Desnervao sino-artica
No dia anterior ao experimento, juntamente com a canulao da aorta abdominal
descrita anteriormente, um grupo de animais tiveram os barorreceptores articos e carotdeos
desnervados. Atravs de uma inciso mediana na regio cervical anterior do rato, os msculos
pr-traqueais, esterno-hiideo e esternocleidomastideo foram afastados e a bifurcao da
cartida foi visualizada. O nervo larngeo superior e o tronco simptico cervical foram
22
isolados da artria cartida comum e seccionados, ento o nervo carotdeo juntamente com o
corpsculo carotdeo foram removidos (KRIEGER, 1964). A desnervao sino-artica foi
realizada bilateralmente e sua eficcia foi avaliada aps os experimentos pela ausncia de
bradicardia em reposta administrao intravenosa (i.v.) de fenilefrina (5 g/kg).
3.1.1.4 Medidas da temperatura corporal
Um sensor e registrador de temperatura integrado (dataloggers - SubCue, Calgary, AT,
CA) foi conectado, via conexo ptica, a um computador para a programao da coleta de
dados ao longo do experimento com leituras de temperatura a cada 5 min, utilizando o
programa SubCue temperature data logger software. Os dados de temperatura foram
utilizados para o clculo do volume corrente.
3.1.1.5 Registro da presso arterial e frequncia cardaca
Os sinais fisiolgicos das variveis cardiovasculares foram transmitidos via wireless do
transmissor de telemetria para um receptor (MLE1162 SNA and Pressure Master Receiver
Controller (TR162), ADInstruments, Austrlia) que converte o sinal analgico em digital para
o sistema de aquisio de dados (Power Lab 16/30, ADIinstruments, Austrlia). O software
utilizado foi LabChart que acompanha o sistema da ADIntruments.
3.1.1.6 Determinao dos gases sanguneos e pH
Amostras de sangue arterial foram obtidas de ratos durante normocapnia, hipercapnia e
hipxia nos grupos de animais controle (IgG-Saporina) e no grupo dos animais com leso
seletiva (anti-DH-SAP), sem desnervao. Para tal, duas gotas de sangue foram colhidos em
um cartucho (EG7+) para anlise imediata do pH arterial (pHa), presso parcial de dixido de
carbono (PaCO2) e presso parcial de oxignio arterial (PaO2) atravs do analisador porttil de
gases sanguneos i-STAT (i-STAT Analyzer, Abbott Laboratories, EUA, NY).
23
3.1.1.7 Determinao da Ventilao
A ventilao foi medida por pletismografia de corpo inteiro em sistema fechado
(BARTLETT; TENNEY, 1970). Durante a realizao de cada medida de ventilao, o fluxo
de ar foi interrompido e a cmara do animal permaneceu totalmente vedada por curtos
perodos de tempo (~2 min). As oscilaes da temperatura do ar da cmara causadas pela
respirao foram medidas como oscilaes de presso, pelo fato do volume de ar corrente
inspirado ser aquecido da temperatura da cmara Tc e saturado com vapor de gua,
enquanto que o volume de ar corrente expirado ser novamente esfriado at a temperatura da
cmara. Sinais de um transdutor de presso, conectado cmara do animal e a uma cmara de
referncia so coletados por um espirmetro e enviados para o sistema de aquisio de dados
(Power Lab 16/30, ADIinstruments, Austrlia). O software utilizado foi LabChart. A
calibrao do volume foi obtida durante cada experimento, injetando um volume conhecido
de ar dentro da cmara do animal (1mL) com o uso de uma seringa graduada. Duas variveis
respiratrias sero medidas, a freqncia respiratria (fR) e o volume corrente (VT), o ltimo
calculado atravs da frmula: VT=PT/PK x VK x TA/Tamb x (PB-PA)/PB-TA/TC (PB-PC) VK: volume de ar injetado na cmara do animal para calibrao;
PT: deflexo de presso associada com cada volume de ar corrente; PK: deflexo de presso associada com cada volume de ar injetado para
calibrao, TC: temperatura corporal; Tamb: temperatura ambiente;
TA: temperatura do ar dentro da cmara;
PB: presso baromtrica; PC: presso de vapor dgua temperatura corporal;
PA: presso de vapor dgua temperatura da cmara.
A ventilao foi medida pelo produto de fR por VT. A ventilao e o VT foram
apresentados nas condies de presso baromtrica ambiente, Tc e saturados com vapor
dgua (BTPS).
3.1.1.8 Mistura gasosas
Na hipercapnia, os animais foram submetidos a uma mistura gasosa de 7% CO2,
balanceada com 21% O2 e N2 (White Martins, Jaboticabal, SP) durante 30 minutos. Os
24
parmetros cardiorrespiratrios foram analisados aos 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos aps o
incio da hipercapnia.
J para a hipxia, a mistura gasosa utilizada foi de 7% O2 balanceada N2 (White Martins,
Jaboticabal, SP), o protocolo foi o mesmo utilizado na hipercapnia.
3.1.1.9 Avaliao da localizao e efetividade da leso
Ao final dos experimentos, os animais foram anestesiados profundamente e perfundidos
atravs do corao (corte no trio direito) com tampo fosfato (PBS, 0,1 M com pH de 7,4),
seguido por paraformaldedo 4 % em PB. Os encfalos foram removidos da caixa craniana,
armazenados no mesmo fixador 4 C por 4 horas e posteriormente mantidos em soluo de
sacarose 30% dissolvida em tampo fosfato 0,1 M com pH 7,4 4 C por 48 horas. O tecido
ento foi submerso em 2-metilbutano (Sigma) congelado no gelo seco (1 min, -30C),
posteriormente o tecido foi embebido em Tissue Tek O.C.T., e ento cortado no criostato
(Leica CM 1850) 30m. Para verificar a localizao e a efetividade da leso foi utilizada
imunorreatividade para tirosina hidroxilase (TH), que um marcador de neurnios
catecolaminrgicos (XU et al., 2003) atravs do mtodo de imunohistoquimica free floating (KANG et al., 2007). Para este fim, os cortes foram incubados por 48 horas com anticorpo
policlonal de rato anti-TH (1:10000, Sigma Chemical CO. St. Luis, MO, EUA), passando a
seguir por 1 hora de incubao com anticorpo secundrio biotinilado de coelho (1:1000,
Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). O anticorpo biotinilado foi complexado com
avidina DH: peroxidase biotinilada (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), e o
complexo foi revelado pela adio de cromognio di-hidrocloreto de diaminobenzidina (DAB)
para visualizar a marcao dos neurnios catecolaminrgicos.
3.1.1.10 Anlise dos Dados
Os valores so expressos como mdia erro padro da mdia. Alteraes na ventilao,
presso arterial e frequncia cardaca, gases sanguneos, temperatura, consumo de O2 e
produo de CO2 foram avaliadas por anlise de varincia (ANOVA) para medidas repetidas
seguida pelo teste de mltiplas comparaes de Tukey-Kramer. Valores de P
25
3.2 Animais anestesiados
Os experimentos com animais anestesiados foram realizados em 30 ratos Wistar (250-
280 g) proveninetes do biotrio da USP de So Paulo. Os animais receberam gua e rao ad
libitum e foram mantidos com temperatura e umidade controladas. O ciclo claro-escuro do
biotrio foi mantido com 12 horas cada. Os protocolos experimentais esto de acordo com os
Princpios ticos de Experimentao Animal adotado pelo Colgio Brasileiro de
Experimentao Animal (COBEA) e foram aprovados pela Comisso de tica em
Experimentao Animal do Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo.
3.2.1 Procedimentos cirrgicos, anestesia e aquisio de dados
3.2.1.1 Leses qumicas da regio A5
Em todos procedimentos cirrgicos foram utilizados mtodos asspticos para evitar os
riscos de infeces. Os animais foram, inicialmente, anestesiados intraperitonealmente (i.p)
com quetamina (80 mg/kg, i.p) e xilasina (7 mg/kg, i.p) e adaptados a um aparelho
estereotxico Kopf (Modelo 1760). Aps uma inciso longitudinal na pele e no tecido
subcutneo, a calota craniana foi exposta e o lambda e o bregma foram utilizados como
referncia para nivelar a cabea do animal, bem como para a localizao da regio A5,
utilizando os parmetros estereotaxicos presentes no atlas de Paxinos e Watson (PAXINOS;
WATSON, 1998). Os animais tambm receberam uma inciso superficial na pele, na regio
da mandbula, para insero de um eletrodo de estimulao bipolar no ramo mandibular do
nervo facial (ANSELMO-FRANCI et al., 1998; TAKAKURA et al., 2006). As injees
bilaterais (volume de 100 nl) de saporina conjugada com anti dopamina -hidroxilase (anti-
DH-SAP, 4,2ng - Advanced Targeting Systems, San Diego, CA) ou IgG-Saporina (controle -
Advanced Targeting Systems, San Diego, CA) (MADDEN; SVED, 2003; SCHREIHOFER;
GUYENET, 2000) na regio A5 foram realizadas sob presso com nitrognio, utilizando-se
pipetas de vidro (dimetro interno 25-40 m, Sutter Instrument Co, CA) acopladas ao
aparelho PicoSpritzer II (General Valve Corporation, NJ). As pipetas de vidro permitiram o
registro do potencial antidrmico do ncleo facial, facilitando as injees corretas na regio
A5. Aps as injees da toxina, as cabeas dos animais foram suturadas, os animais
26
receberam uma profiltica dose subcutnea (sc) de enrofloxacina (10mg/kg, Schering-Plough)
e de flunixina meglumina (2,5mg/kg, Schering-Plough). Aps a recuperao os animais foram
acomodados e mantidos por 1 semana em salas com temperatura, umidade e luminosidade
controladas, com ciclo claro-escuro do biotrio mantido em 12 horas cada. Os animais
receberam gua e rao ad libitum.
3.2.1.2 Procedimentos cirrgicos e anestesia
Uma semana aps a injeo bilateral da toxina saporina conjugada com anti dopamina
-hidroxilase (anti-DH-SAP) ou do controle (IgG-SAP) na regio A5, os animais foram
anestesiados com a mistura de 5% halotano em 100% de oxignio. Os animais foram
inicialmente traqueostomizados e colocados em ventilao artificial com 1,4 - 1,5% de
halotano em 100% de oxignio para continuao dos procedimentos cirrgicos. Em todos
experimentos foram realizados os seguintes procedimentos cirrgicos:
A) Canulao da artria femoral para registro de presso arterial (PAM) e
frequncia cardaca (FC);
B) Canulao da veia femoral para administrao de drogas;
C) Acomodao do animal no aparelho estereotxico para localizao e exposio
do nervo frnico e do nervo esplncnico, via posio dorsolateral
(MOREIRA et al., 2006, 2007; TAKAKURA et al., 2006, 2007, 2008);
D) Vagotomizao bilateral de todos os animais, a fim de prevenir uma influncia
da ventilao na atividade do nervo frnico.
Alguns animais (n = 17) sofreram desnervao bilateral dos baro e quimiorreceptores,
o nervo larngeo superior e o tronco simptico cervical foram isolados da artria cartida
comum e seccionados, ento o nervo carotdeo juntamente com o corpsculo carotdeo foram
removidos (KRIEGER, 1964), a fim de se estudar apenas os efeitos da estimulao dos
quimiorreceptores centrais, ao final dos experimentos a efetividade da desnervao foi testada
atravs da administrao intravenosa (i.v) de fenilefrina (5 g/kg).
Aps a finalizao dos procedimentos cirrgicos, o anestsico halotano foi substitudo
pelo anestsico endovenoso uretano (1,2 g/kg).
Todos os animais foram ventilados com 100% de oxignio durante todo o perodo
experimental, sendo registrado
27
37C, utilizando-se um colcho com resistncia interna para aquecimento. O ndice de CO2-
expirado foi monitorado durante todo o experimento por meio de um capnmetro (Columbus
Instruments, Ohio, USA). O nvel da anestesia foi constantemente monitorado testando-se a
ausncia de efeitos no reflexo de retirada, ausncia de mudanas na presso arterial e na
atividade do nervo frnico aps o pinamento da pata do animal. Satisfeitos esses critrios, o
relaxante muscular (pancurnio) foi administrado endovenosamente com uma dose inicial de
1 mg/kg.
3.2.1.3 Microinjees cerebrais de agonista GABA-A na regio A5
A soluo de Muscimol (agonista GABA-A, 2 mM; Sigma, USA) continha 5% de
microesferas de ltex fluorescentes diludas, para averiguar o sitio de microinjeo aps o
experimento (Lumafluor, New City, NY, USA) (MOREIRA et al., 2007). As microinjees
na regio A5 foram realizadas sob presso com nitrognio, utilizando-se pipetas de vidro
(dimetro interno 25-30 m, Sutter Instrument Co, CA) acopladas ao aparelho PicoSpritzer III
(General Valve Corporation, NJ). O volume das injees foi de 50 nL em cada lado (injees
bilaterais para a regio A5). As coordenadas utilizadas para atingir a regio A5 foram
baseadas no potencial antidrmico do ncleo facial. As injees foram realizadas 200 m
rostral a poro anterior do ncleo facial, 2,0 mm lateral a linha mdia e 250 m ventral ao
limite ventral do potencial antidrmico do ncleo facial (KOSHIYA; GUYENET, 1994). Os
registros eletrofisiolgicos foram realizados em um lado e a segunda injeo foi realizada
simetricamente do outro lado baseado nas coordenadas estereotxicas da primeira injeo.
3.2.1.4 Registro da presso arterial e da frequncia cardaca
Para o registro das variveis cardiovasculares, os animais foram submetidos
canulao da artria femoral direita com tubo de polietileno (PE-10 conectado a um PE-50)
para aquisio da presso arterial pulstil, presso arterial mdia e frequncia cardaca da
aorta abdominal. A cnula da artria femoral foi conectada a um transdutor de presso
(Physiological Pressure Transducer mod. MLT844, ADInstruments) acoplado a um pr-
amplificador (Bridge Bio Amplifier mod. ML221, ADInstruments) e ao sistema de registro
computadorizado Cambridge Electronic Design (CED-1401) de 4 canais. Foram registradas,
simultaneamente, a presso arterial pulstil (PAP), PAM e FC. Os animais tambm tiveram a
28
veia femoral canulada com tubo de polietileno (PE-10 conectado a um PE-50) para a infuso
de drogas sistmicas (TAKAKURA et al., 2006, 2011).
3.2.1.5 Medida da atividade do nervo frnico e do nervo esplncnico
Por meio de uma abertura dorsolateral o nervo frnico esquerdo foi exposto e isolado
da diviso ventral do quinto plexo cervical, em seguida o nervo foi cortado distalmente e
colocado em um eletrodo bipolar em forma de gancho, a atividade do nervo frnico foi
filtrada de 30 a 300 Hz. Para obter acesso ao nervo esplncnico foi realizada uma abertura
retroperitoneal, o nervo esplncnico esquerdo foi exposto na sada do gnglio supra-renal, e
ento atividade simptica ps-ganglionar do nervo esplncnico foi registrada utilizando-se um
eletrodo bipolar em forma de gancho em configurao monopolar, a atividade simptica do
nervo esplncnico foi filtrada de 30 a 300 Hz. Os nervos frnico e esplncnico, assim como os
eletrodos de registro, foram cobertos com uma pasta de moldagem dental (Kwik-Cast Sealant,
WPI, USP) para isolar o nervo e eliminar a interferncia de rudos.
O eletrodo bipolar, em que os nervos foram colocados, foi conectado a um conversor
analgico-digital (modelo CED-140; Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK) de 4
canais. Este aparelho possui filtro passa-baixo, ligao AC-DC (corrente direta-alternada),
filtro de corte, permite variao do ganho e possibilita correo da linha de base. A partir
deste aparelho o sinal foi copiado para um sistema de aquisio de dados verso 6 do Spike 2
software (Cambridge Electronic Design). Os resultados foram gravados em CD para posterior
anlise dos resultados.
A integral da atividade do nervo frnico e do nervo esplncnico foi obtida aps a
retificao (=0,015) e refinamento (2s) do sinal original. A amplitude e frequncia do nervo
frnico foram normalizados em cada experimento, atribuindo 100 a saturao do
quimiorreflexo (CO2 elevado) e 0 perodos de apneia. Para a normalizao da atividade do
nervo esplncnico foi atribudo 100 ao perodo de repouso da atividade do nervo e 0 ao valor
mnimo registrado durante a administrao de fenilefrina (5 mg/Kg, i.v.), a qual saturou o
barorreflexo, ou aps o bloqueio ganglionar com hexametnio (10 mg/Kg, i.v.).
29
3.2.1.6 Testes do quimiorreflexo central e perifrico
A hipercapnia foi produzida por adio de CO2 no ar fornecido pela ventilao artificial. Em
cada rato, a adio de CO2 foi monitorizado para atingir no mximo entre 9,5 e 10% de CO2
no final da expirao, a hipercapnia foi mantida durante 5 min e, em seguida, substituda por
O2 a 100%. Cada rato foi submetido a trs sesses de hipercapnia: a primeira foi 10 minutos
aps injees bilaterais de salina na regio A5, a segunda 10 minutos aps injees bilaterais
de salina ou muscimol na regio A5, e a terceira 120 minutos aps a injeo de salina ou
muscimol na regio A5. Da mesma forma, os animais que passaram pela microinjeo de
IgG-SAP ou anti-DH-SAP (4,2ng), na semana anterior, formam submetidos hipercapnia
por um perodo de 5min.
Hipxia foi obtida mudando a mistura de 100% de O2 para 8-10% O2 equilibrado com
N2 por 30 s. As medidas realizadas so iguais s supracitadas no protocolo de hipercapnia.
3.2.1.7 Histologia cerebral para confirmao dos pontos de injeo central
Ao trmino dos experimentos, os ratos foram anestesiados profundamente e perfundidos
atravs de injeo no corao com soluo salina tamponada (50 mL) seguida de soluo de
formalina a 10% (50 mL). Posteriormente, os encfalos foram retirados e fixados em
formalina 10% por dois dias. Cortes transversais (40 m de espessura) foram feitos nos
pontos de injeo com auxlio de um micrtomo vibratomo (Vibratome 1000S Plus, USA). Os
cortes histolgicos, montados em lmina foram corados com cresil violeta e analisados para
localizar os pontos das injees de acordo com o Atlas de Paxinos e Watson (1998).
3.2.1.8 Imunohistoqumica
Ao trmino dos experimentos de leses seletivas da regio A5, os animais foram anestesiados
profundamente e perfundidos atravs do corao com PBS (0,1 M, pH 7,4) seguido de
paraformaldedo (4% em PB 0,1 M, pH 7,4). Os encfalos foram removidos da caixa craniana
e guardados no mesmo fixador por 48 horas a 4C. Os encfalos foram cortados em criostato
numa espessura de 30 m e guardados em soluo crioprotetora anticongelante -20C (20%
de glicerol, 30% de etileno glicol em 50 mM de fosfato, pH 7.4) para preservar as qualidades
do tecido cerebral para posterior tratamento imunohistoqumico (SCHREIHOFER;
30
GUYENET, 1997). Para verificar a localizao e a efetividade da leso foi utilizada
imunorreatividade para tirosina hidroxilase (TH), que um marcador de neurnios
catecolaminrgicos (XU et al., 2003) atravs do mtodo free floating (KANG et al., 2007). Para este fim, os cortes foram incubados por 48 horas com anticorpo policlonal de
camundongo anti-TH (1:10,000, Chemicon, Temecula). Para detectar Phox2b foi utilizado
anticorpo de coelho (1:800, cedido por J.-F. Brunet, Ecole Normale Suprieure, Paris, France).
Os anticorpos primrios foram detectados com a incubao com anticorpo secundrio com
fluorescncia para revelar neurnios marcados com TH (goat anti-mouse, Alexa 488,
Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ou Phox2b (donkey anti-rabbit Cy3, Jackson, West Grove,
PA, USA), ou sem fluorescncia utilizando o anticorpo secundrio biotinilado (donkey anti-
mouse 1:1000, Jackson) complexado com avidina DH: peroxidase biotinilada (Vector
Laboratories, Burlingame, CA, USA), e o complexo foi revelado pela adio de cromognio di-
hidrocloreto de diaminobenzidina (DAB) para visualizar a marcao dos neurnios
catecolaminrgicos. Colina Acetiltransferase (ChAT) foi detectada com o anticorpo de cabra
anti-ChAT (1:50, Chemicon) e revelado com mtodo de fluorescncia (donkey anti-goat CY3,
1:200, Jackson) ou com anticorpo biotinilado (donkey anti-goat, 1:500, Jackson) seguido de
colorao com DAB (KANG et al., 2007; WANG; GERMANSON; GUYENET, 2002).
Um microscpio multifuncional Zeiss Axioskop 2 (campo claro, campo escuro e
epifluorescncia) foi usado para todas as observaes. Os locais de injeo (microesperas
fluorescentes) e os neurnios marcados com TH foram plotados usando uma tcnica descrita
anteriormente de mapeamento assistida por computador baseado no uso de uma fase de
microscpio motorizado controlada pelo software Neurolucida (STORNETTA; GUYENET,
1999). Os arquivos Neurolucida foram exportados para o software NeuroExplorer
(MicroBrightfield, Colchester, VT, USA) para contar os vrios tipos de perfis neuronais
dentro de uma rea definida do tronco enceflico. Quando necessrio, arquivos Neurolucida
selecionados tambm foram exportados para o programa de desenho Canvas 9 software (ACD
Systems of America, Miami, FL, EUA) para modificaes finais. As imagens foram tiradas
com uma cmera SensiCam QE 12 bits CCD cmera (resoluo 1376 1040 pixels,
CookeCorp., Auburn Hills, MI, EUA). A nomenclatura neuroanatmica foi baseada segundo
Paxinos e Watson (1998).
31
3.2.2 Anlise dos resultados
A anlise estatstica foi feita utilizando Sigma Stat verso 3.0 (Jandel Corporation, Point
Richmond, CA). Os dados foram apresentados como mdia erro padro da mdia. Foram
utilizados testes paramtricos, Teste-t pareado e ANOVA de uma via. Quando foi utilizada a
ANOVA, o teste post-hoc (Newman-Keuls mltiplas comparaes) foi usado para todas as
comparaes de pares. Significncia foi estabelecida com p
32
4 RESULTADOS
4.1 Animais no anestesiados
4.1.1 Imunohistoqumica
A figura 1 mostra as fotomicrografias representativas das seces coronais do tronco
enceflico na regio A5 de um animal representativo dos grupos, mostrando a marcao para
neurnios catecolaminrgicos. As figuras 1A e 1C mostram os corpos celulares dos neurnios
positivos para tirosina hidroxilase (TH) do grupo que recebeu leso fictcia com IgG-Saporina,
e as figuras 1B e 1D so representativas do grupo com leso qumica dos neurnios
noradrenrgicos com saporina conjulgada com anti-dopamina -hidroxilase (Anti-DH-SAP,
4,2 ng), mostrando a diminuio das clulas TH-positivas na regio A5 aps a leso qumica.
A
A5 A5
B
A5 A5
C
500m
100m
D
Figura 1 Fotomicrografia de seces coronais do tronco enceflico mostrando os corpos celulares de neurnios noradrenrgicos na regio A5 (crculos pontilhados em A e B) marcados com tirosina
hidroxilase. (A e C) Animal representativo do grupo com leso fictcia (IgG-Saporina) na regio A5. (B e D) Animal representativo com leso qumica na regio A5 com saporina congugada com anti-
dopamina -hidroxilase (Anti-DH-SAP, 4,2 ng). As setas apontam o ncleo de um dos neurnios marcados pela tirosina hidroxilase.
33
Os neurnios noradrenrgicos marcados para tirosina hidroxilase na regio A5 foram
agrupados usando o Bregma como referncia, e quantificados. A mdia dos valores est
representada na figura 2. Observa-se que houve uma diminuio de clulas noradrenrgicas em
todos os segmentos analisados (-9,68, -9,8, -10, 04, -10,30 e -10,52 mm caudal ao bregma),
com maior efetividade em -9,68 e menor efetividade (em torno de 70%) em -10,30 mm em
relao ao bregma. A mdia geral de reduo dos neurnios positivos para tirosina hidroxilase
na regio A5 foi de 80%.
IgG-Saporina (n=5)
Anti-DH-SAP (n=11)
IR
30
de
neu
rn
iosT
H-
re
a A
5 20
10
N
mer
o
0
-9,68 -9,8 -10,04 -10,30 -10,52
Milmitros em relao ao Bregma
Figura 2 Mdia do nmero dos neurnios noradrenrgicos na regio A5 imunorreativos para tirosina hidroxilase (TH-IR) no grupo com leso fictcia (IgG-Saporina) e lesado com saporina conjulgada com anti-dopamina -hidroxilase (Anti-DH-SAP, 4,2 ng) nas seces -9,68, -9,8, -10,04, -10,30 e -10,52
mm em relao ao Bregma.
4.1.2 Desnervao sino-rtica
A efetividade da desnervao sino-artica foi testada com injeo intravenosa de
fenilefrina (5 g/kg). A fenilefrina um vasoconstritor que gera como resposta um aumento
da presso arterial mdia, a ativao dos barorreceptores e quimiorreceptores perifricos pelo
aumento da presso arterial mdia gera uma bradicardia reflexa. Com a desnervao sino-
artica a bradicardia reflexa abolida, assim, a efetividade da desnervao sino-artica
observada quando aps a injeo intravenosa de fenilefrina (5 g/kg) provocou um aumento
34
da presso arterial mdia com ausncia da bradicardia reflexa ( PAM= +9,9 mmHg; FC= -
20,6 BPM).
4.1.3 Efeito da leso na regio A5 utilizando a toxina saporina conjugada com anti-
dopamina -hidroxilase sobre a ventilao, gases sanguneos e presso arterial durante a
hipercapnia em ratos no anestesiados intactos ou com desnervao sino-artica.
A figura 3 apresenta a variao () do volume corrente (VT), frequncia respiratria
(fR) e ventilao (VE), entre a normocapnia (0% CO2) e hipercapnia (7% CO2), do grupo anti-
DH-SAP (DH-SAP) e o grupo IgG-Saporina (IgG-SAP) dos animais sem desnervao sino-
artica (intactos) e animais sino-artico desnervados. A leso dos neurnios noradrenrgicos
da regio A5 no alterou a resposta basal das variveis respiratrias dos animais intactos (VE
= 377,4 19 vs IgG-SAP 444,4 32 mL.kg -1
.min-1
, P>0.05; VT = 4,4 0,2 vs IgG-SAP 5,1
0,3 mL.kg-1
, P>0.05; fR = 86,5 6,3 vs IgG-SAP 87,4 2,5 rpm, P>0.05) e dos animais
sino-artico desnervados (VE = 562,7 102 vs IgG-SAP 564 82 mL.kg -1
.min-1
, P>0.05; VT
= 7,0 1,0 vs IgG-SAP 7,8 1 mL.kg-1
, P>0.05; fR = 70,7 3 vs IgG-SAP 76,2 9 rpm, P>0.05). Durante a hipercapnia, a desnervao sino-artica causou
nos animais controles um aumento da ventilao (P0,05). Portanto, a leso dos
neurnios noradrenrgicos da regio A5 promoveu uma atenuao no aumento do VT
produzido pela hipercapnia, tanto nos animais intactos (Fig. 3B) quando nos animais sino-
articos desnervados (Fig. 3E).
35
A 1500
)
-1
mi
n
1000
-1
(mL
kg
500 E
V
0
B
15
)
-1
10
(mL
kg
T
5 V
0
C 80
(rp
m)
60
40
fR
20
0
Intactos
IgG-SAP DH-SAP
* IgG-SAP DH-SAP IgG-SAP DH-SAP
D 1500
)
- 1
mi
n
1000
-1
(mL
kg
500 E
V
0
E
15
)
-1
10
(mL
kg
T
5 V
0
F 80
(rp
m)
60
40
fR
20
0
Sino-artico
desnervados
IgG-SAP DH-SAP
*
IgG-SAP DH-SAP
IgG-SAP DH-SAP
Figura 3 Variao da resposta hipercapnia (7% CO2) nas variveis respiratrias em animais no
anestesiados. Efeito da leso dos neurnios noradrenrgicos na regio A5 com saporina conjulgada com anti-dopamina -hidroxilase (DH-SAP, 4,2 ng) ou da leso fictcia (IgG-SAP, 100 nL) sobre a
variao da ventilao (VE), do volume corrente (VT), e da frequncia respiratria (fR) em ratos intactos (A, B e C) que no passaram pela desnervao sino-artica, e (D, E e F) animais sino-artico
desnervados. * indica diferena significativa da variao entre os grupos DH-SAP e IgG-SAP (P
36
(IgG-SAP P=0,0002, DH-SAP P=0,0082) e na PaO2 (IgG-SAP P=0,0199, DH-SAP
P=0,0307). Nenhuma das condies experimentais teve efeito significativo no bicarbonato
plasmtico.
Tabela 1 Mdia dos valores do pH e da presso parcial de CO2, O2 no sangue arterial do grupo sem desnervao sino-artica (intacto) que sofreu leso fictcia com IgG-Saporina (IgG-SAP) ou leso dos neurnios noradrenrgicos com saporina conjulgada com anti-dopamina -hidroxilase (DH-SAP) na regio A5, durante a normxia (0% CO2) e durante a hipercapnia (7% CO2).
Intacto Intacto IgG-SAP DH-SAP
(n = 4) (n = 5 )
0% CO2 7% CO2 0% CO2 7% CO2
pHa 7,50,01 7,30,01###
7,40,04 7,20,06##
PaCO2 40,81,22 58,71,01###
34,11,17 54,45,29##
(mmHg)
PaO2 751,41 106,33,73
# 959,76 119,810,49
# (mmHg)
#Indica diferena significativa dos valores normocpnicos e hipercpnicos.
# P0,05) nem dos animais
sino-artico desnervados (PAM = 129 13,1 vs IgG-SAP 117,2 9,3 mmHg, P>0,05; FC =
410,5 25,7 vs IgG-SAP 376,9 6,7 bpm, P>0,05). A desnervao sino-artica causou um
aumento na frequncia cardaca basal dos animais com neurnios noradrenrgicos da regio
A5 ausentes, consequentemente um aumento na resposta hipercapnia P0,05) enquanto nos animais controle com desnervao sino-artica a
hipercapnia aumentou a PAM e diminuiu nos animais lesados com a desnervao sino-artica
37
(Fig. 4C) (PAM= -13,9 17,8 vs IgG-SAP +7,7 5,3 mmHg, P>0,05). A FC dos animais
intactos diminuiu frente ao estmulo hipercapnico (Fig. 4B) (FC= -19,4 40,8 vs IgG-SAP -
13,1 12,8 bpm, P>0,05), a mesma resposta foi observada nos animais lesados sino-artico
desnervados, enquanto nos animais controles houve um aumento da FC (Fig. 4D) (FC= -9,9 27,7 vs IgG-SAP 7,7 5,5 bpm, P>0,05).
P
AM
(m
mH
g)
Intactos Sino-artico
desnervados
20
20
10
(mm
Hg)
10
0
0
-10
PA
M
-10
-20 -20
-30 -30
-40
-40
-50
IgG-SAP DH-SAP
-50
IgG-SAP
DH-SAP
)
) 0
- 1
F C ( b a t i m e n t o s . m i n
F C ( b a t i m e n t o s . m i n
-1
-20
-40
-60 IgG-SAP DH-SAP
20
0
-20
-40
-60
IgG-SAP DH-SAP
Figura 4 Variao da resposta hipercapnia (7% CO2) nas variveis cardiovasculares em animais
no anestesiados. Efeito da leso dos neurnios noradrenrgicos da regio A5 com saporina conjulgada com anti-dopamina -hidroxilase (DH-SAP, 4,2 ng) ou da leso fictcia com IgG-
Saporina (IgG-SAP, 100 nL) na regio A5, em animais intactos (A e B), sem desnervao sino-artica, e com desnervao sino-artica (C e D), sobre a presso arterial mdia (PAM) e a frequncia cardaca
(FC).
F
C (
ba
tim
ento
s.m
in-1
)
F
C (
ba
tim
ento
s.m
in-1
)
P
AM
(m
mH
g)
A
B
C
D
38
4.1.4 Efeito da leso na regio A5 utilizando a toxina saporina conjugada com anti-
dopamina -hidroxilase sobre a ventilao, gases sanguneos e presso arterial durante a
hipxia em ratos no anestesiados com desnervao sino-artica ou intactos.
A figura 5 apresenta a variao () da ventilao (VE), volume corrente (VT) e frequncia
respiratria (fR), entre a normocapnia (0% O2) e hipxia (7% O2), do grupo Anti-DH-SAP
(DH-SAP) e o grupo IgG-Saporina (IgG-SAP), dos animais sem desnervao sino-artica
(intactos) e animais sino-artico desnervados. A leso dos neurnios noradrenrgicos da regio
A5 no alterou a resposta basal das variveis respiratrias dos animais intactos (VE = 368,3
24,1vs IgG-SAP 467,6 50,1 mL.kg -1
.min-1
, P>0,05; VT = 4,5
0,2 vs IgG-SAP 5,2 0,5 mL.kg-1
, P>0,05; fR = 82,7 7,1 vs IgG-SAP 90,4 4,2 rpm,
P>0,05), e sino-artico desnervados (VE = 562,7 102,1vs IgG-SAP 518,5 88,4 mL.kg -
1.min
-1, P>0,05; VT = 7,0 1,1 vs IgG-SAP 7,2 1,5, P>0,05; fR = 79,4 9,7 vs IgG-SAP
76,4 11,6 rpm, P>0,05). Durante a hipxia, a desnervao sino-artica causou nos animais
controles um aumento da ventilao (P0,05; VT = +5,9 1,2 vs IgG-SAP
+5,5 0,8 mL.kg-1
, P>0,05; fR = +31,8 11,8 vs IgG-SAP +64,6,4 9,7 rpm, P>0,05).
Dessa forma, a leso dos neurnios noradrenrgicos da regio A5 promoveu uma atenuao
no aumento do VT produzido pela hipxia, apenas nos animais intactos (Fig. 5B)
39
Intactos
A
) 2000
-1
mi
n 1500
-1
k g
1000
(m L
E
500
V
0
IgG-SAP
DH-SAP
D 2000
)
- 1
mi
n 1500
-1
kg
1000
(mL
500 E
V
0
Sino-artico
desnervados
IgG-SAP DH-SAP
B
)
8
6
- 1
k g
(m L 4
T
V
2 *
0
IgG-SAP DH-SAP
C
)
80
- 1
(bre
ath
s.m
in
60
40
f
R
20
0
IgG-SAP
DH-SAP
E 8
)
6
- 1
k g
( m L
4
T
V
2
0 IgG-SAP DH-SAP
F
80
)
- 1
(bre
aths
.mi
n 60
40
f
R
20
0 IgG-SAP DH-SAP
Figura 5 Efeito da leso dos neurnios noradrenergicos com saporina conjulgada com anti - dopamina -hidroxilase (DH-SAP, 4,2 ng) ou leso fictcia com saporina conjulgada com anti-dopamina -hidroxilase (IgG-SAP, 100 nL) na regio A5 sobre o volume corrente (VT), a frequncia
respiratria (fR) e a ventilao (VE), em ratos no anestesiados intactos e sino-articos desnervados durante a hipxia. * indica diferena significativa entre os grupos IgG-SAP e DH-SAP (* P
40
Tabela 2 Mdia dos valores da presso parcial de CO2, O2 e pH no sangue arterial do grupo sem desnervao sino-artica (intacto) que sofreu leso fictcia com IgG-Saporina (IgG-SAP) ou leso dos neurnios noradrenrgicos com saporina conjulgada com anti-dopamina -hidroxilase (DH-SAP) na regio A5, durante a normxia (21% O2) e durante a hipxia (7% O2).
Intacto Intacto IgG-Saporina Anti DH-SAP
(n =4 ) (n =5 )
21% O2 7% O2 21% O2 7% O2
pHa 7,50,01 7,60,03#
7,40,04 7,60,04#
PaCO2 40,81,22 19,61,60
### 34,11,17 13,51,47
## (mmHg)
PaO2 751,41 21,30,89
### 959,76 36,810,09
# (mmHg)
#Indica diferena significativa dos valores normocpnicos e hipxicos.
# P0,05) nem dos animais sino-artico desnervados (PAM = 129 13,1 vs
IgG-SAP 117,2 9,3 mmHg, P>0,05; FC = 410,5 25,7 vs IgG-SAP 376,9 6,7 bpm,
P>0,05). A desnervao sino-artica provocou uma queda na presso arterial mdia nos
animais controles durante a hipxia P0,05) quando do grupo
desnervado (PAM = -27,3 9,0 vs IgG-SAP 47,5 12,8 mmHg, P>0,05), e a frequncia
cardaca foi aumentada em ambos os grupos, (Fig. 6B e D) intactos (FC = +58,4 23,8 vs
IgG-SAP 33,4 19,8 bpm, P>0,05) e sino-articos desnervados (FC = +56,8 36,5 vs IgG-
SAP 48,3 26,9 bpm, P>0,05).
41
PA
M (
mm
Hg)
Intactos
0
-10
-20
-30
-40
-50
IgG-SAP DH-SAP
Sino-artico
desnervados 0
(mm
Hg
) -10
-20
P
AM
-30
-40
-50
IgG-SAP DH-SAP
F
C (
ba
tim
ento
s.m
in -
1)
150
100
50
0
IgG-SAP DH-SAP
150
100
50
0
IgG-SAP DH-SAP
Figura 6 Variao da resposta hipxia (7% O2) nas variveis cardiovasculares em animais no anestesiados. Efeito da leso dos neurnios noradrenrgicos da regio A5 com saporina conjulgada
com anti-dopamina -hidroxilase (DH-SAP, 4,2 ng) ou da leso fictcia com IgG-Saporina (IgG-SAP, 100 nL) na regio A5, em animais intactos (A e B), sem desnervao sino-artica, e com desnervao
sino-artica (C e D), sobre a presso arterial mdia (PAM) e a frequncia cardaca (FC).
A
B
C
D
F
C (
ba
tim
ento
s.m
in-1
)
42
4.2 Animais anestesiados
4.2.1 A anlise histolgica
A Figura 7 mostra as injees realizadas regio A5. O centro de injees na regio A5
foi localizado 10,0 milmetros abaixo da superfcie dorsal do encfalo e 200 m rostral
extremidade rostral do ncleo motor facial. A figura 7A apresenta as microesferas localizadas
na regio correspondente localizao dos neurnios da regio A5. Injees Peri foram
consideradas quando localizadas na regio parapiramidal no mesmo plano da regio A5,
representadas na Figura 7B.
1mm
Grupo 1mm hipercapnia Grupo
hipxia
Grupo peri
Figura 7 Locais de injeo na ponte ventrolateral. (A) Fotomicrografia representativa de uma seco
coronal mostrando microinjees bilaterais na regio A5. (B) Esquema mostrando o centro dos locais de injeo revelado pela presena de microesferas fluorescentes. Abreviaes: LSO, oliva superior
lateral; py, pirmide; 7n, raiz do ncleo facial. A seta indica o local da injeo. Os pontos pretos e cinzas representam os locais de microinjees na regio A5 e os pontos vazios indicam os centros dos
locais de microinjees nas regies vizinhas (peri) da regio A5.
Gupo hipercapnia
Grupo hipxia
Grupo peri
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4.2.2 Respostas respiratrias e da atividade simptica ativao do quimiorreflexo
central aps injeo bilateral de muscimol na regio A5
As injees bilaterais de muscimol (2 mM - 50 nL) na regio A5 foram feitas em ratos
completamente desnervados. O muscimol na regio A5 no produziu nenhum efeito sobre a
presso arterial mdia (PAM= 121 3 mmHg vs salina 119 6 mmHg, P>0,05) e atividade
do nervo simptico (sSNAM= 96 11% do controle, P>0,05) em repouso.
Contudo, a injeo bilateral de muscimol na regio A5 atenuou o aumento da presso
arterial mdia (PAM= +19 3 mmHg vs salina +33 4 mmHg, P
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Figura 8 Microinjeo Muscimol (2 mM - 50 nL) na regio A5 atenuou os efeitos
cardiorrespiratrios produzidos pela ativao de quimiorreceptores centrais em ratos anestesiados com desnervao sino-artica. (A) Registro representativo que mostra o efeito da injeo de muscimol na
regio A5 nas alteraes na presso arterial (PA), na atividade simptica do nervo esplncnico (sSNA), e na atividade do nervo frnico (PNA) provocadas por um aumento de 5 a 10% de CO2 da expirao
final. As respostas foram registradas 10 min aps a injeo bilateral de soluo salina na regio A5, e 10 min aps a injeo bilateral de muscimol (2 mM, 50 nL de cada lado) na regio A5. (B) presso
arterial mdia (PAM), (C) sSNA ( sSNA), (D) frequncia PNA ( PNA freq) e (E) amplitude PNA ( ampl PNA) provocada pela expirao final de 5-10% de CO2 durante injees de salina ou
muscimol na regio A5. Diferenas expressas como percentagem da resposta provocada pelo CO2 durante a injeo de salina. * diferente da salina (P < 0,05), n = 8 ratos.
4.2.3 Respostas respiratrias e da atividade simptica ativao do quimiorreflexo
perifrico aps injeo bilateral de muscimol na regio A5
A injeo bilateral de muscimol (2 mM - 50 nL) na regio A5, em 7 ratos
vagotomizados anestesiados com uretano e com os nervos do seio carotdeo intactos, no
alterou a presso arterial mdia (PAM= 125 7 mmHg vs salina 122 5 mmHg, P>0,05) e
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atividade do nervo simptico (sSNA= 98 4% do controle) no repouso. A injeo bilateral de
muscimol na regio A5 bloqueou o aumento da presso arterial mdia (PAM= 5 4 mmHg
vs salina +20 3 mmHg, P0,05) produzido por hipxia (Fig. 10A, D e E).
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Figura 9 Injeo Muscimol na regio A5 atenuou os efeitos cardiorrespiratrios produzidos pela
ativao de quimiorreceptores perifricos em ratos anestesiados intactos. (A) Registro representativo que mostra o efeito da injeo de muscimol na regio A5 nas mudanas na presso arterial (PA), a
atividade do nervo simptico esplncnico (sSNA), e da atividade do nervo frnico (PNA) provocada pela hipxia (8-10% O2, 30 s). As respostas foram registradas 10 min aps a injeo bilateral de salina
na A5, e 10 min aps a injeo bilateral de muscimol (2 mM, 50 nL de cada lado) na A5. Alteraes
na (B) presso arterial mdia (PAM), (C) sSNA ( sSNA), (D) frequncia da PNA ( PNA freq) e (E) amplitude da PNA ( PNA ampl) causada pela hipxia durante injeo de salina ou muscimol na regio A5. Diferenas expressas como uma porcentagem da resposta provocadas pelo O2 durante a injeo de soluo salina. * diferente de soluo salina (P
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4.2.4 Leso seletiva de neurnios TH da regio A5 com anti-DH-SAP
A toxina Anti-DH-SAP (injeo de 100 nL contendo 4,2 ng de toxina) foi
administrada bilateralmente na regio A5. Os neurnios imunorreativos Phox2b e TH foram
examinados na ponte ventrolateral em todos os animais que receberam injeo de anti-DH-
SAP, a fim de avaliar o efeito da toxina sobre os neurnios positivos para TH e neurnios
Phox2b prximos. Os neurnios positivos para TH, com ou sem Phox2b foram plotados e
contados em sete seces coronais por rato e cada seco foi separada por 180 uM. A Figura
10A uma foto representativa de um rato que recebeu 4,2 ng de anti-DH-SAP. Os neurnios
positivos para TH e negativos para Phox2b estavam ausentes na regio A5 em ratos
lesionados, mas o nmero de neurnios negativos para TH e positivos para Phox2b foi
aproximadamente o mesmo nos animais controles e lesionados (Fig.