Lietuvos hidrobiologų draugija
TVIRTINU: ………………………
Lietuvos Hidrobiologų draugijos prezidentė
dr. Eugenija Milerienė
2012 m. ……………………mėn. …..d.
AKVAKULTŪROS PLĖTRA
HORMONINIO PREPARATO PREGNILO PANAUDOJIMAS
LYDEKŲ DIRBTINIAM VEISIMUI
2012 M. GALUTINĖ ATASKAITA
Tyrimo vadovas
(dr.Vida Žiliukienė)
Vilnius
2012
2
Vykdytojų sąrašas
Dr. Vida Žiliukienė – atsakingas vykdytojas
Dr. Valdemaras Žiliukas
3
TURINYS
psl.
1. Įvadas 4
2. Tyrimo objektas ir metodai 5
2.1. Gonadotropiniai hormonai ir jų įtaka ikrų vystymuisi 5
2.2. Žmogaus chorioninio gonadotropino paruošimas injekcijoms 6
2.3. Reproduktorių gaudymas 7
2.4. Lydekos patelių subrendimo įvertinimas 8
2.5. Reproduktorių laikymas 10
2.6. Lydekos patelių injekavimas 11
2.7. Ikrų apvaisinimas ir inkubavimas 13
3. Tyrimų rezultatai 14
3.1 Tyrimams panaudotų lydekos reproduktorių biologinė charakteristika 14
3.2. Įvairių pregnilo dozių įtaka skirtingų stadijų oocitų subrendimui 15
3.3 Nesubrendusių patelių laikymo iki pirmos injekcijos trukmės įtaka
pregnilo veikimo efektyvumui
16
3.4. Injekuotų patelių ikrų gyvybingumas ir kokybė 17
4. Išvados 18
5. Rekomendacijos 19
Literatūra 20
Priedas 22
4
ĮVADAS
Oogenezės proceso reguliavimas – vienas svarbiausių uždavinių dirbtinio žuvų veisimo
procese. Jį įvaldžius veislynuose subrendusių ikrų surinkimas vyksta ne tik planingai, bet ir
sinchroniškai. Jau praeito šimtmečio ketvirtame dešimtmetyje buvo žinoma, kad ikrų vystymąsi
galima skatinti hipofizio injekcijomis. Šio metodo pradininkai – Houssay (1931) ir von Ihering
(1935, 1937). Iki šių dienų lytinių produktų subrendimo stimuliavimui patelės injekuojamos
gonadotropino hormonu, išskirtu iš įvairių žuvų, dažniausiai karšio, hipofizio. Nors hipofizio
injekcijos plačiai taikomos visame pasaulyje, tačiau, tobulėjant žuvų dirbtinio veisimo
biotechnikai, vis dažniau pereinama prie naujų hormoninių preparatų, pavyzdžiui ovaprimo,
ovopelo, gonazono, nerestino, žmogaus chorioninio gonadotropino ir kt. Jų panaudojimo
galimybės tiriamos ant įvairių žuvų rūšių (Ohta & Tanaka, 1997; Demska- Zakęś & Zakęś, 2002;
Zakęś & Demska- Zakęś, 2004; Zakęś & Szczepkowski, 2004; Metwally & Eouand, 2008;
Brzuska, 2008).
Žmogaus chorioninis gonadotropinas – sutrumpintai ŽCHG, angl. human chorionic
gonadotropin (hCG), farmacijos pramonės leidžiamas įvairiais pavadinimais „Pregnyl“,
„Choriogonin“, „Biogonadyl“, „Novarel“, „Chorex“, „Ovidrel“, ‚Profasi“. Šis hormonas
sėkmingai naudojamas kai kurių žuvų, tame tarpe sterkų (Zakęś, 2003, Zakęś & Demska- Zakęś,
2004; Zakęś & Demska- Zakęś, 2005; Zakęś & Szczepkowski, 2004; Zakęś, 2007, 2009),
dirbtiniam veisimui. Jo dozės, priklausomai nuo žuvų rūšies, oocitų subrendimo stadijos,
svyruoja nuo 60 iki 6000 tarptautinių vienetų (TV) kg kūno masės. Tačiau yra žuvų, kurioms
ŽCHG injekcijos tik stimuliuoja oocitų vystymąsi, bet nesukelia ovuliacijos, pavyzdžiui baltajam
amūrui (Веригин, 1982).
Lietuvoje lydekos dirbtinai pradėtos veisti beveik prieš keturiasdešimt metų. Pirmieji
žingsniai buvo sunkūs ir ne visada sėkmingi. 1974 m. Žuvininkystei priklausančios žuvivaisos
įmonės išaugino vos 60 tūkst. lydekaičių, o žvejai mėgėjai – 32 tūkst (Juodžius, 1978). Tačiau
2000 m. į valstybinės reikšmės bei neišnuomotinus vandens telkinius jau buvo išleista virš 20
milijonų dirbtinai išveistų lydekos lervučių ir virš 223 tūkst. šiųmetukių (Kindurys ir kt., 2002).
Literatūroje nurodoma, kad lydekos nelaisvėje nesiveisia, todėl jų ovuliacija turi būti
skatinama hormonais (Szabó, 2008). Lietuvoje taip pat tarp lydekų, sugautų neršto sezono metu
tvenkiniuose ar natūraliuose vandens telkiniuose, pasitaiko žuvų neduodančių ikrų , dėl ko
nesurenkamas pakankamas jų kiekis inkubavimui.
Šio darbo tikslas nustatyti hormoninio preparato pregnilo („Pregnyl“), kurio veiklioji
medžiaga yra žmogaus chorioninis gonadotropinas (ŽCHG), panaudojimo lydekos patelių
subrendimui skatinti galimybes bei ištirti jo įtaką ikrų gyvybingumui.
5
2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI
2.1. Gonadotropiniai hormonai ir jų įtaka ikrų vystymuisi
Oogenezė tai sudėtingas ir ilgas procesas, lydimas visos eilės fiziologinių ir
biocheminių pokyčių , kuomet iš patelės lytinių ląstelių (oocitų) gonadose išsivysto subrendę
ikrai, tinkami apvaisinimui. Gonadotropiniai hormonai, tame tarpe žmogaus chorioninis
gonadotropinas, skatina ikrų vystymąsi ir sukelia ovuliaciją.
Visa eilė aplinkos veiksnių, kaip dienos ilgumas, vandens temperatūra, meteorologinės
sąlygos, tinkamų nerštaviečių buvimas ir kt., siunčia signalą smegenims gaminti gonadotropiną
atpalaiduojantį hormoną (GnRH). Šis hormonas skatina gonadotropino išsiskyrimą iš hipofizio,
kuris ir kontroliuoja oocitų vystymąsi. Jo veikimo schema parodyta 1 pav. Oocitą supančios
folikulo ląstelės, stimuliuojamos gonadotropino, pradeda gaminti estrogeną, kuris nurodo
kepenims išskirti vitelogeniną (trynio analogą). Jis pamažu kaupiasi oocite. Tai vadinamas
vitelogenezės procesas. Jo pabaigoje oocito diametras labai padidėja. Po vitelogenezės folikulo
ląstelės toliau stimuliuojamos gonadotropino pradeda išskirti jau progesteroną. Jo veikiama suyra
branduolio membrana, oocitas išsilaisvina iš folikulo, įvyksta ovuliacija ir ikrai lengvai pradeda
tekėti iš lytinės angos.
1 pav. Hipofizyje gaminamo gonadotropino veikimo schema
Analogiškai veikia žmogaus chorioninis gonadotropinas (ŽCHG), kadangi jis taip pat
skatina estrogeno ir progesterono išsiskyrimą. Šį gonadotropinį hormoną gamina nėščių moterų
placenta. Nuo hipofizio gonadotropino jis skiriasi amino rūgščių eiliškumu, todėl jo veikimo
efektyvumas įvairių rūšių žuvims yra skirtingas. Pavyzdžiui, dvi dozės po 200 TV ŽCHG
6
sėkmingai naudojamos sterko patelių ikrų vystymuisi skatinti ir sinchroniniam ikrų surinkimui
net ne neršto sezono metu (Zakęś & Demska- Zakęś, 2004; Zakęś & Demska- Zakęś, 2005). Tuo
tarpu maišažiaunio šamo Heteropneustes fossilis subrendusių ikrų gavimui naudojamos gerokai
didesnės dozės – 1000- 2000-3000 TV ( Metwally & Fouad, 2008).
2.2. Žmogaus chorioninio gonadotropino paruošimas injekcijoms
Tiriant žmogaus chorioninio gonadotropino poveikį lydekoms, buvo naudojamas
farmacijos pramonėje gaminamas ir Lietuvoje platinamas pregnilas („Pregnyl“), kuris priklauso
vaistų, vadinamais gonadotropiniais, grupei ir kurio veiklioji medžiaga yra žmogaus chorioninis
gonadotropinas (ŽCHG). Į jo pakuotę įeina dvi ampulės: viena – su milteliais, turinčiais 5000
TV (tarptautinių vienetų) ŽCHG, ir kita – su tirpikliu (9 mg natrio chlorido + 1 ml injekcinio
vandens) injekcijoms ruošti (2 pav.). Viena tokia „ Pregnyl“ pakuotė vaistinėse kainuoja apie 32
Lt. Kaip matyti „Priedo“ 1 pav., tarp pramonės gaminamų įvairių hormoninių preparatų, skirtų
žuvų injekavimui, yra ir žmogaus chorioninis gonadotropinas, tačiau jo kaina apie pusantro karto
didesnė lyginant su pregnilo, t.y. 5000 TV ŽCHG kainuoja 49 lt.
2 pav. Lietuvoje platinamo „Pregnyl“, kurio veiklioji medžiaga žmogaus chorioninis
gonadropinas (ŽCHG), pakuotė
Lydekų ikrų subrendimui skatinti buvo naudojamos įvairios pregnilo dozės – nuo 200,
iki 1600 TV/kg KM (kūno masės). Kad hormoninį preparatą būtų lengviau dozuoti, mes vienos
ampulės miltelius, ištirpintus tirpiklyje (1 ml), dar praskiesdavom fiziologiniu tirpalu (0,9 %
7
NaCl) iki 10 ml. Taigi vienas ml paruošto tirpalo injekcijoms turėjo 500 TV ŽCHG. Pregnilą
laikėme šaldytuve.
2.3. Reproduktorių gaudymas
Lydekos reproduktoriai tyrimams buvo žvejojami Rubikių ež. ir Laukystos žuvų
veislyne kovo-balandžio mėn. Rubikių ež. tinklus pradėdavom statyti dar esant ledui, kad
surinktume kuo daugiau nesubrendusių patelių (3 A pav.). Žvejyba buvo tęsiama ir jam nutirpus.
Tuomet pagrindinai gaudėsi tekančios patelės. Laukystos veislyno tvenkinyje lydekų žvejyba
buvo organizuojama dar neprasidėjus jų nerštui (3 B pav.).
A
B
3 pav. Reproduktorių gaudymas: A – Rubikių ež., B – Laukystos žuvų veislyno tvenkinyje
8
Lydeka yra labai jautri žuvis. Nors jos
nepuola saprolegnija taip kaip sterką, tačiau dėl
aplinkos pokyčių ar mechaninio streso, gali sustoti
oocitų vystymasis ir prasidėti jų rezorbcija.
Literatūroje nurodoma (Кох ir kt.,1980), kad
dirbtiniam veisimui lydekų negalima gaudyti
elektros agregatu, nes patelių lytinė anga elektros
lauke užsidaro, ir ji nebeduoda ikrų. Todėl su
lydekos patelėmis negalima elgtis kaip su
prekinėmis žuvimis (4 pav.). Jas reikia stengtis
kuo mažiau traumuoti. Mes išimtas iš tinklų
lydekas iš kart perkeldavom į gabenimui skirtus
polietileninius maišus su vandeniu.
Eksperimentui panaudotų žuvų kiekis
parodytas 1 lentelėje. Sugautas žuvis pasverdavom
išmatuodavom jų ilgius ir paimdavom žvynus
amžiaus nustatymui. Gauti duomenys buvo surašomi į lentelę (žr. „Priedą“, 1 lent.).
1 lentelė. Eksperimentui panaudotų žuvų kiekis (vnt.)
Lytis
Oocitų subrendimo
stadija
Metai
Viso 2011 2012
Nesubrendusios patelės (injekavimui) I 5 3 8
II 4 12 16
III 6 8 14
IV 2 4 6
Nesubrendusios patelės (kontrolei) I 2 2 4
II 2 2 4
III 2 2 4
IV 2 2 4
Subrendusios patelės (kontrolei) 3 2 5
Patinėliai 22 14 36
2.4. Lydekos patelių subrendimo įvertinimas
Sugautas nesubrendusias pateles iš maišų su vandeniu perkeldavom į vonias su
anestetiku (5 ml 2-phenoxyethanol ištirpinta 10 l vandens). Iš užmigdytų žuvų, prieš tai atlikę
biologinę analizę, kateterio pagalba atsargiai paimdavom nedidelį kiekį ikrų, išsivystymo stadijai
nustatyti (5 pav.). Po to juos supildavom į mėgintuvėlius su Stockardo tirpalu (50 ml formalino,
4 pav. Netinkamas elgesys su lydekų
patelėmis
9
40 ml ledinės acto rūgšties, 60 ml glicerino, 850 ml distiliuoto vandens). Šiame tirpale
nepermatomi ikrai nuskaidrėja, todėl po mikroskopu geriau matosi jų išsivystymo stadija.
5 pav. Ikrų paėmimas iš patelės kateterio pagalba
Lydekos patelių subrendimą vertinome pagal branduolio padėtį ikrelyje (Bruzka,
Bieniarz, 1977). Pasibaigus vitelogenezei, ikrelio vidury esantis branduolys pradeda migruoti
link animaliniame poliuje esančios mikropilės. Išskiriamos 4 ikrų subrendimo stadijos (6 pav.):
I stadija – branduolys yra centre. Ikrai šviesiai gelsvos spalvos, nepermatomi, Stockardo
tirpale nuskaidrėja po 2-5 min.;
II stadija –branduolys pradeda judėti iš centro link periferijos. Ikrai Stockardo tirpale
nuskaidrėja po 2-3 min.
III stadija – branduolys visai priartėja prie periferijos. Ikrai pradeda skaidrėti, todėl
Stockardo tirpale juos pakanka laikyti 1-3 min.;
IV stadija – branduolio nebematyti, nes, pasiekus periferiją, suyra jo membrana. Todėl
ikrai , Stockardo tirpale laikomi 0,5-2 min
Pasibaigus IV stadijai, ikrai išsilaisvina iš folikulo, įvyksta ovuliacija ir patelė pradeda
duoti ikrus.
I-IV subrendimo stadijos ikrai, patalpinti į Stockardo tirpalą išlaiko savo apvalią formą.
Jei ikrai minėtame tirpale subliūkšta, vadinasi prasidėjo ovuliacija arba jų rezorbcija.
Nustatytas patelių ikrų subrendimo stadijas surašydavom į lentelę (žr. „Priedą“, 1 lent.)
kartu su biologiniais rodikliais.
10
6 pav. Ikrų subrendimo stadijos: I stadija – branduolys centre; II stadija– branduolys pradeda
judėti link periferijos; III stadija – branduolys visai arti periferijos ; IV stadija – branduolio
nebematyti, nes, pasiekus periferiją, suyra jo membrana. Po šios stadijos seka ovuliacija
2.5. Reproduktorių laikymas
Po biologinės analizės ir ikrų bandinių paėmimo lydekos buvo perkeliamos į varžas.
Pateles laikėme atskirai nuo patinėlių. Subrendusias pateles iki ikrų paėmimo laikydavom
neilgiau 3-4 dienų, kad neperbręstų ikrai. Kiekvienai nesubrendusiai patelei buvo skirta atskira
varža, kurios numeris sutapo su duomenų lentelėje (žr. priedą) nurodytu žuvies numeriu.
Pav. 7 A parodytos kubo formos varžos skirtos lydekų laikymui, įrengtos viename iš
Laukystos tvenkinių. Kad žuvys neiššokinėtų, jos būdavo uždengiamos vieliniu tinklu (7 pav. B).
7 pav. Lydekos reproduktorių laikymas Laukystos žuvų veislyne: A – varžos įrengtos viename iš
tvenkinių; B – varžos uždengtos tinkline medžiaga, kad neiššokinėtų žuvys
11
Rubikių ežere sugautas lydekas laikėme pailgose tinklinėse varžose (8 pav. A),
pastatytose ežero pakrašty. Kadangi žvejybos pradžioje ežeras dar būdavo užšalęs, jas į vandenį
nuleisdavom per iškirstas eketes (8 pav. B). Atšutus pakraščiams, varžas statydavom įsibridę į
vandenį 0,5–1 m gylyje (8 pav. C).
8 pav. Lydekos reproduktorių laikymas Rubikių ež.: A – varža žuvų laikymui; B – Varžos
statymas eketėje, C – varžos statymas atšutus pakraščiams
2.6. Lydekos patelių injekavimas
Nustačius ikrų subrendimo stadiją, patelės buvo injekuojamos pregnilu. Vieni literatūros
šaltiniai nurodo, kad žuvis geriau injekuoti į raumenis, kiti – į pilvo ertmę. Pavyzdžiui veidrodinį
karpį rekomenduojama injekuoti į raumenis žemiau nugarinio peleko, o paprastąjį – į pilvo ertmę
už pilvinių pelekų. Tačiau literatūroje (Thalathiah ir kt., 1988) nurodoma, kad ŽCHG dažniausiai
leidžiamas į nugaros raumenis virš šoninės linijos. Mes pregnilą leidome taip pat į raumenis.
Lydekos patelės labai ramios, todėl prieš injekcijas jų nebeužmigdydavom. Varžą kartu
su lydeka iškeldavom iš vandens, atsargiai nunešdavom į krantą, kur suleisdavom pregnilą (9
pav.). Didesnių patelių net neišimdavom iš varžos. Po to varžą su injekuota žuvimi vėl
pernešdavom į vandenį. Taip pat darydavom, kai norėdavom patikrinti ar patelės subrandino
ikrus.
12
Priklausomai nuo oocitų
subrendimo stadijos lydekos buvo
injekuojamos įvairiomis pregnilo
dozėmis. Žuvims buvo daroma viena
arba dvi pregnilo injekcijos. Antrą
kartą žuvys buvo injekuojamos po
dviejų dienų. Dozių dydis ir injekcijų
skaičius pateiktas 10 pav. Be to,
norėdami išsiaiškinti, kokią įtaką
pregnilo veikimo efektyvumui turi
sugautų žuvų laikymo trukmė iki
pirmos injekcijos, dalį sugautų patelių
injekuodavom valandos bėgyje, prieš
tai nustatę oocitų subrendimo stadiją, dalį po pusės paros (2 grupė) ir dalį po paros (3 gr.). 2011
m, , laukdami kol vandens temperatūra pakils iki 7OC, nesubrendusias lydekos pateles laikėme
net 12 d. ir tik tada injekavome 800 TV/kg KM pregnilo doze.
10 pav. Pregnilo dozių ir injekcijų skaičius, panaudotas lydekos patelių subrendimui skatinti
Oocitų subrendimo
stadijos
I
II
III
1-ma injekcija
200 TV/kg
1-ma injekcija 200 TV/kg
IV
2-ra injekcija
200 TV/kg
1-ma injekcija 400 TV/kg
1-ma injekcija
400 TV/kg
2-ra injekcija
400 TV/kg
1-ma injekcija 400 TV/kg
2-ra injekcija 800 TV/kg
1-ma injekcija 800 TV/kg
2-ra injekcija 800 TV/kg
2-ra injekcija
400 TV/kg
1-ma injekcija 200 TV/kg
2-ra injekcija 800 TV/kg
1-ma injekcija
400 TV/kg
2-ra injekcija
200 TV/kg
2-ra injekcija
400 TV/kg
1-na injekcija
200 TV/kg
1-na injekcija
200 TV/kg
9 pav. Lydekos patelės injekavimas pregnilu
13
2.7. Ikrų apvaisinimas ir inkubavimas
Subrendusios patelės ikrus apvaisindavom kelių patinėlių pieniais sausuoju metodu.
Apvaisinimui naudojome 0,7% valgomosios druskos HCl (6.5 g HCl ištirpinta 1 litre vandens) ir
karbamido CO(NH2)2 (15 g CO(NH2)2 ištirpinta 10 l vandens) tirpalų mišinį santykiu 1:1. Po
apvaisinimo ikrai kelis kartus buvo perplaunami švariu vandeniu, kad išsiplautų gleivės ir pienių
likučiai. Lipnumui pašalinti naudojome tanino tirpalą (1 g tanino ištirpinta 1 l vandens). Švarius
ikrus užpildavom tanino rūgšties tirpalu santykiu 1:2 lipnumui pašalinti. Šiame tirpale juos
atsargiai maišydavom 2 min. Po to kelis kartus perplaudavom švariu vandeniu.
Dalį taip paruoštų patelės ikrų supildavom į Petri lėkštelę. Juos paskleisdavom vienu
sluoksniu per visą dugną. Kiekviena Petri lėkštelė turėjo atskirą numerį, kuris atitiko tos žuvies,
numerį lentelėje (žr. „Priedą“, 1 lent).
A C
B
11 pav. Ikrų inkubavimas: A – kaskadomis
įrengtos vonelės; B – ant tinkline mežiaga
aptraukto medinio rėmelio išdėliotos Petri
lėkštelės su ikrais; C – tarp dviejų rėmelių
suspaustos Petri lėkštelės, panardintos į vandenį
Ikrus inkubavome kaskadomis įrengtose vonelėse (11 pav. A). Ant tinkline medžiaga
aptraukto rėmelio išdėliodavom neuždengtas Petri lėkšteles su ikrais (11 pav. B). Kad ikrai
14
neišsiplautų, ant viršaus uždėdavom kitą tokį pat rėmelį. Abu rėmelius suspausdavom ir
nuleisdavom į vandenį (11 pav. C). Į voneles pastoviai iš viršaus smulkiomis srovelėmis buvo
tiekiamas vanduo. Jo temperatūra svyravo nuo 9 iki 11OC. Kiekvieną dieną suskaičiuodavom
pabalusius negyvus ikrus, kuriuos pašalindavom, kad neįsimestų saprolegnija. Apie ikrų kokybę
spręsdavom iš jų išeigos akutės stadijoje.
3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1. Tyrimams panaudotų lydekos reproduktorių biologinė charakteristika
Viso tyrimams panaudota 65 patelės ir 36 patinėliai. Žuvų biologiniai rodikliai pateikti
2 lent. Lydekų amžius svyravo nuo 3 iki 12 metų. Didžiausia sugauta patelė svėrė 7600 g.
Kadangi dirbtiniam veisimui tinkamiausi vidutinio dydžio reproduktoriai – patinėliai, sveriantys
1–1,5 kg, patelės – 1-3 kg, daugumos tyrimams atrinktų žuvų amžius buvo 4–6 metai.
2 lentelė. Tyrimams panaudotų lydekos reproduktorių biologiniai rodikliai
Amžius N,
vnt.
Bendras ilgis (L), cm Kūno ilgis (l), cm Masė, g
Vidurkis Min-max Vidurkis Min-max Vidurkis Min-max
Nesubrendusios patelės injekavimui
3 3 44,2 44,0-44,5 39,1 38,5-40,0 492 420-556
4 15 53,5 50,0-59,5 47,5 45,0-52,0 981 820-1200
5 11 57,3 52,0-59,5 50,9 48,0-57,0 1275 1000-1650
6 10 65,1 55,0-70,0 57,5 47,0-62,0 1869 1650-2050
7 2 76,0 73,0-79,0 69,0 66,5-71,5 2600 2500-2700
9 1 84,0 75,0 3700
11 1 100,0 90,0 6000
12 1 107 96 7600
Nesubrendusios patelės kontrolei
3 7 42,7 39,0-44,0 37,3 34,0-38,7 467 400-550
4 9 53,6 51,5-56,0 47,1 45,5-48,5 980 920-1200
Subrendusios patelės kontrolei
3 1 44,0 38,5 500
4 4 53,9 51,5-59,0 48,0 45,5-53,5 940 860-1100
Patinėliai
4 3 45,3 46,0-44,5 40,2 39,0-41,0 667 600-700
5 21 51,3 50,0-56,0 45,2 44,0-49,5 1010 900-1200
6 12 59,6 55,0-64,0 52,9 47,0-58,0 1620 1550-1700
15
3.2. Įvairių pregnilo dozių įtaka skirtingų stadijų oocitų subrendimui
Gauti tyrimų duomenys pateikti 3 lent. Pirmos grupės patelės buvo injekuojamos
valandos bėgyje po sugavimo. Priklausomai nuo oocitų subrendimo stadijos, pregnilo dozės
svyravo nuo 200 iki 1600 TV/kg KM. Lydekų, sugautų kovo mėn. prieš neršto sezoną, oocitai
buvo I-os subrendimo stadijos ir tik viena patelė, sugauta neršto sezono metu balandžio
pradžioje, taip pat dar turėjo šią stadiją. Jų injekavimas dviem pregnilo dozėm, kurių bendra
suma buvo 1200 ir 1600 TV/kg KM nedavė jokių rezultatų. Įtakos galėjo turėti žemos vandens
temperatūros telkiniuose, kurios tyrimo metu neviršijo 5OC. Žuvis laikyti talpose prie aukštesnių
temperatūrų neturėjome galimybės. Taigi, kol neprasidėjusi branduolio migracija link periferijos,
šios tirtos pregnilo dozės patelėms prie minėtų vandens temperatūrų ovuliacijos nesukėlė.
Kadangi vandens temperatūra turi įtakos ikrų vystymuisi, manome, kad po pirmos injekcijos
lydekų laikymas talpose, kur vandens temperatūra yra 7-9OC, gali padidinti pregnilo veikimo
efektyvumą. Tam išsiaiškinti reikalingi papildomi tyrimai.
3 lentelė. Įvairių pregnilo dozių efektyvumas lydekos patelių, turinčių įvairias oocitų subrendimo
stadijas, ovuliacijai
Patelių
grupė
Laiko tarpas tarp
sugavimo ir
pirmos injekcijos,
val.
Oocitų
subrendimo
stadija
Patelių
skaičius,
vnt.
Pirmos
injekcijos
dozė,
TV/kg KM
Antros
injekcijos
dozė,
TV/kg KM
Ovuliavusių
patelių,
%
1 0-1 I 1 400 800 0
3 800 800 0
II 5 200 200 40
6 400 400 83
III 4 200 75
4 200 200 100
IV 4 200 100
2 12 II 2 400 400 0
III 2 200 200 0
2 400 400 50
IV 2 200 100
3 24 II 2 400 400 0
1 200 800
0
III 2 400 400 0
Pirmos grupės patelės, sugautos neršto sezono metu, kurios turėjo II-os subrendimo
stadijos oocitus, buvo injekuotos dviem pregnilo dozėm – po 200 ir 400 TV/kg, t,y, bendroje
16
sumoje jos sudarė atitinkamai 400 ir 800 TV/kg KM. Gauti tyrimų duomenys parodė, kad 40 %
patelių, gavusių 400 TV/kg KM, ir 83 % patelių, gavusių 800 TV/kg KM, subrandino ikrus.
Kaip matyti 3 lent., 75 % patelių, turinčių III–čios subrendimo stadijos oocitus,
ovuliavo po vienos 200 TV/kg KM pregnilo injekcijos, o visos – po dviejų tokio pat dydžio
injekcijų. Tuo tarpu lydekos, kurių oocitai buvo IV-os stadijos, ikrus subrandino po vienos 200
TV/kg KM pregnilo dozės.
Lyginant pregnilo veikimo efektyvumą įvairaus amžiaus patelėms, statistiškai patikimų
skirtumų nenustatyta (p>0,05).
Pažymėtina, kad visos kontrolei paliktos nesubrendusios patelės, kurioms nebuvo
daromos pregnilo injekcijos, ikrų nesubrandino.
Žuvų veislynuose ne visada yra galimybės nustatyti dirbtiniam veisimui sugautų
lydekos patelių oocitų subrendimo stadijas. Praktika parodė, kad jei patelėms stipriau paspaudus
pilvą, kaip ir patinėliams, plona srove ištrykšta šlapimas, oocitai yra dar tik I–os stadijos.
Kuomet paspaudus pilvą, pasirodo keletą matinių gelsvų ikrelių – oocitai yra II–os stadijos. Jei
ikrai dar labai sunkiai spaudžiasi, bet jau nuskaidrėję – oocitai yra III–os ar net IV stadijos.
Taigi atlikti tyrimai parodė, kad pregnilas, gali būti naudojamas lydekos patelių
subrendimui skatinti. Žuvys, turinčios II-ros stadijos oocitus, turi būti injekuojamos dviem
pregnilo dozėm po 400 TV/kg KM; turinčios III-čios stadijos oocitus, – viena 200 TV/kg KM
doze, o jei po jos dar nesubrandina ikrų, antra tokia pat dydžio pregnilo doze; turinčios IV-tos
stadijos oocitus, – viena 200 TV/kg KM doze.
3.3 Nesubrendusių patelių laikymo iki pirmos injekcijos trukmės įtaka pregnilo veikimo
efektyvumui
2011 m. keturios patelės, sugautos prieš nerštą, buvo laikomos varžose kol vandens
temperatūra nuo 5O C pakilo iki 7
O C, t.y. 12 dienų, ir tik tada injekuotos 400 TV/kg KM
pregnilo doze. Po dviejų dienų, joms nesubrandinus ikrų, buvo suleista antra tokio pat dydžio
pregnilo dozė. Nei viena patelė nedavė ikrų, nors varžose buvo laikomos dar visą savaitę, prie
nerštui palankios vandens temperatūros. Gali būti, kad šio hormoninio preparato veikimui
neigiamos įtakos galėjo turėti patelių ilgas laikymas nelaisvėje prieš injekavimą. Norėdami
nustatyti, kokią įtaką pregnilo veikimo efektyvumui turi sugautų žuvų laikymo trukmė iki pirmos
injekcijos, dalį nesubrendusių patelių injekavome ne valandos bėgyje po sugavimo (1-ma grupė),
o praėjus 12 val. (2-ra grupė). Kaip matyti 3 lent., šios lydekos, turinčios II-rą oocitų subrendimo
stadiją, injekuotos dviem pregnilo dozėm po 400 TV/kg KM, ikrų nesubrandino, nors daugumai
1-os grupės patelių tokio pat dydžio injekcijos sukėlė ovuliaciją.
17
Antros grupės patelių, turinčių III-os stadijos oocitus, dvi pregnilo dozės po 200 TV/kg
KM taip pat nepaveikė (3 lent.). Tik dvigubai didesnė dozė (dvi injekcijos po 400 TV/kg KM)
pusei patelių sukėlė ovuliaciją. Tuo tarpu patelėms turinčioms IV-tos stadijos oocitus, 12 val.
laikymas įtakos neturėjo. Jos po vienos 200 TV/kg KM injekcijos pradėjo duoti ikrus.
Trečios grupės lydekos buvo laikomos 24 val iki pirmos injekcijos. Pregnilo dozės,
kurių bendra suma patelėms, turinčioms II-ros stadijos oocitus, siekė 800 ir 1000 TV/kg KM, o
patelėms, turinčioms III-čios stadijos oocitus, – 800 TV/kg KM, teigiamų rezultatų nedavė.
Gauti tyrimų rezultatai parodė, kad sugautos nesubrendusios lydekos patelės pregnilu
turi būti injekuojamos kiek galima greičiau, rekomenduojama valandos bėgyje.
3.4. Injekuotų patelių ikrų gyvybingumas ir kokybė
Injekuotas lydekas tikrinom kiekvieną dieną. Dalies ovuliavusių patelių ikrai buvo
dirbtinai apvaisinti tą pačią dieną, kitų – po dviejų parų. Ikrų, paimtų iš ką tik ovuliavusių
patelių, išeiga akutės stadijoje, buvo mažiausia (svyravo nuo 49 iki 56%, vidutinė – 52,5%). Tuo
tarpu ikrų, paimtų po dviejų dienų, išeiga svyravo nuo 70 iki 74% (vidutinė – 71,8%). Statistinė
duomenų analizė parodė, kad ji nepriklausė nei nuo pradinės oocitų subrendimo stadijos, nei nuo
pregnilo dozės ir statistiškai patikimai nesiskyrė (p > 0,05) nuo neinjekuotų kontrolinių
subrendusių patelių ikrų išeigos, kuri svyravo nuo 70 iki 75% (vidutinė – 72,2%). Gauti tyrimų
rezultatai parodė, kad ikrai iš injekuotų subrendusių patelių turi būti imami po dviejų dienų.
18
4. IŠVADOS
1. Įvairiomis hormoninio preparato „Pregnyl“ dozėmis, kurios svyravo nuo 200 iki 1600
TV/kg kūno masės (KM), buvo injekuotos 44 nesubrendusios lydekos patelės. Nustatyta, kad
pregnilas, kurio veiklioji medžiaga yra žmogaus chorioninis gonadotropinas (ŽCHG), gali būti
naudojamas lydekos patelių II, III ir IV subrendimo stadijų oocitų vystymuisi skatinti ir jų
ovuliacijai sukelti.
2. Gauti tyrimų duomenys parodė, kad pregnilo dozių dydis, sukeliantis oocitų
ovuliaciją, priklausė nuo jų subrendimo stadijos. Ikrus subrandino 83 % patelių, kurių oocitai
buvo II-ros stadijos, injekuotos dviem pregnilo dozėm po 400 TV/kg KM. Viena 200 TV/kg KM
pregnilo dozė sukėlė ovuliaciją 75 % patelių, kurių oocitai buvo III-os stadijos, ir dvi tokio pat
dydžio dozės – visoms patelės. Lydekoms, kurių oocitai buvo IV-os stadijos, ikrus subrandino po
vienos 200 TV/kg KM pregnilo dozės.
3. Nesubrendusių patelių laikymo iki pirmos injekcijos trukmė turi neigiamos įtakos
pregnilo veikimo efektyvumui. Ikrus subrandino 83 % patelių, turinčių III-os stadijos oocitus,
injekuotos valandos bėgyje po sugavimo, 50 % patelių, injekuotų, praėjus 12 val. po sugavimo, ir
nei viena patelė nedavė ikrų, injekuota praėjus 24 val. po sugavimo, kurios buvo gavusios 800
TV/kg KM pregnilo dozę.
4. Ikrų, paimtų iš ką tik ovuliavusių patelių, išeiga akutės stadijoje svyravo nuo 49 iki
56% (vidutinė – 52,5%). Tuo tarpu ikrų, paimtų po dviejų parų, išeiga svyravo nuo 70 iki 74%
(vidutinė – 71,8%).
5. Statistinė duomenų analizė parodė, kad injekuotų patelių ikrų išeiga akutės stadijoje
nepriklausė nei nuo pradinės oocitų subrendimo stadijos, nei nuo pregnilo dozės ir statistiškai
patikimai nesiskyrė (p > 0,05) nuo neinjekuotų kontrolinių subrendusių patelių ikrų išeigos, kuri
svyravo nuo 70 iki 75% (vidutinė – 72,2%).
19
5. REKOMENDACIJOS
Norint paruošti tirpalą injekcijoms, kurio 1 ml turėtų 500 TV žmogaus chorioninio
gonadropino (ŽCHG), „Pregnil“ pakuotėje vienoje ampulėje esančius miltelius reikia sumaišyti
su kitoje ampulėje esančiu 1 ml tirpalu, ir po to dar praskiesti fiziologiniu tirpalu (0,9 % NaCl)
iki 10 ml. Likęs nuo injekcijų tirpalas laikomas šaldytuve, bet neilgiau kaip savaitę.
Reproduktoriai natūraliuose vandens telkiniuose gaudomi prasidėjus lydekų nerštui,
tvenkiniuose – kuomet vandens temperatūra pasiekia 7OC arba pastebėjus neršiančias žuvis.
Kadangi lydekos patelės yra labai jautrios mechaniniams stresams, dėl ko gali sustoti
ikrų vystymasis ir net prasidėti jų rezorbcija, su jomis negalima elgtis, kaip su prekinėmis
žuvimis. Visos operacijos atliekamos kiek galima mažiau traumuojant žuvis.
Sugautas nesubrendusias lydekos pateles rekomenduojama injekuoti pregnilu valandos
bėgyje.
Patelės, kurių oocitai yra II-os subrendimo stadijos, injekuojamos dviem pregnilo
dozėm po 400 TV/kg kūno masės (KM).
Patelės, kurių oocitai yra III-os subrendimo stadijos, injekuojamos viena 200 TV/kg
KM doze, o jei po dviejų parų dar nesubrandina ikrų, antra tokia pat dydžio pregnilo doze;
Patelės, kurių oocitai yra IV-os subrendimo stadijos, injekuojamos viena 200 TV/kg
KM pregnilo doze.
Antrą kartą pregnilu patelės injekuojamos po dviejų parų.
Nesant galimybei nustatyti kokios stadijos yra oocitai, sugautos nesubrendusios patelės
injekuojamos viena 400 TV/kg KM pregnilo doze, o jei po dviejų parų neduoda ikrų – antra 400
TV/kg KM pregnilo doze.
Injekuotas pateles rekomenduojama laikyti 7-9OC temperatūroje. Jas tikrinti reikia kas
antrą dieną. Iš ovuliavusių patelių ikrai imami po dviejų parų.
Esant dabartinėm „Pregnyl“ kainom, vienos patelės, sveriančios 1 kg, injekavimas viena
400 TV/kg KM doze kainuoja apie 2,5 Lt.
20
LITERATŪRA
Brzuska E., 2008. Efektywność rozrodu suma europejskiego (Silurus glanis) po stymulowaniu
owulacji homogenatem przysadki mózgowej karpia, Ovopelem, LHRH-a lub Ovaprimem.
Biotechnologia w akwakulturze.Olsztyn, IRIS:129-137.
Brzuska E., Bieniarz K., 1977. Metoda preżyciowego określania dojrzałości płeiowej samic
karpia w związku z iniekcjami homogenatu przysadki mózgowej karpia. Broszura IRS, nr.
105, Olsztyn.
Demska- Zakęś K., Zakęś Z., 2002. Controlled spawning of pikeperch Stizostedion lucioperca
(L.), in lake cages. Czech J. Anim. Sci., 47 (6): 230-238.
Hodson R., Sullivan C.V., 1993. Induced maturation and spawning of domestic and wild striped
bass, Morone saxatilis (Walbaum), broodstok with implanted GnRH analogue and injected
hCG.Aquacult. Fish Manage. 24: 389-398.
Houssay, B.A., 1931 Action sexuelle de l'hypophyse sur les poissons et les reptiles. C.R. Soc.
Biol. Paris, 106:377-8
Metwally M.A.A., Fouand I.M., 2008. Some biochemical changes associated with injection of
grass carp (Ctenopharyngodon idellus) with Oviaprim and Pregnyl for induction of
artificial spawning. Global Veterinaria 2 (6): 320-326.
Ohta H., Tanaka H., 1997. Relationship between serum levels of human chorionic gonadropin
(hCG) and 11-ketotestoterone after a single injection of hCG and induced maturity in the
Japanese eel, Anquilla japonica. Aquaculture, 153:123-134.
Szabó T., 2008. Use of Carbopol resin for carp pituitary administration improves the fertilization
percentage of northern pike (Esox lucius Linnaeus) eggs in commercial hatcheries.
Hydrobiologia. 601: 91-97.
von Ihering, R., 1935 Die wirkung von hypophyseninjektion auf den laichakt von fischen. Zool.
Anz., 111:273-79
von Ihering, R., 1937. A method for inducing fish to spawn. Prog. Fish-Cult., 34:15-6.
Zakęś Z., 2003. Wybrane aspekty rozrodu I podchowu sandacza w warunkach kontrolowanych.
Ryby drabieżne:rozród, podchów, profilaktyka. Olsztyn, IRS: 7-20.
Zakęś Z., 2007. Out-of+season spawning of cultured pikeperch [Sander lucioperca (L.)].
Aquaculture research. 38: 1419-1427.
Zakęś Z., 2009. Controlled reproduction of pikeperch Sander lucioperca (L.). A review.
Archivesof Polish Fisheries. 17 (4): 153-170.
21
Zakęś Z., Demska-Zakęś K., 2004. Induces spawning in pikeperch, Sander lucioperca (L.), using
GNRH analog and human chorionic gonadotropin. XI European congres of ishthyology.
Estonia. – P. 166-167.
Zakęś Z., Demska-Zakęś K., 2005. Artifical spawning of pikeperch (Sander lucioperca (L.))
stimulated with human chorionic gonadotropin (hCG) and mammalian GnRH analogue
with dopamine inhibitor. Archives of Polish Fisheries. 13:63-75.
Zakęś Z., Szczepkowski M., 2004. Induction of out-of-season spawning of pikerperch, Sander
lucioperca (L.). Aquaculture International. 12:11-18.
Juodžius P., 1978. Ar turėsime daugiau lydekų. Mūsų gamta. 2: 19.
Веригин Б., 1982. Рыбоводство и рыболовство. 8: 15
Кох В., Банк О., Йенс Г., 1980. Рыбоводство. Москва: 216 с.
SUDERINTA: ………………………
Taikomųjų.mokslinių tyrimų priežiūros
komisijos pirmininkas
2012 m. ……………………mėn. …..d.
22
P R I E D A S
23
1 pav. Pramonės gaminami įvairūs hormoniniai preparatai žuvų injekavimui
24
1 lentelė. Duomenys apie lydekos reproduktorius ir injekcijų dozes
Žuvie
s
Nr.
Sugav
imo
dat
a/val
.
Am
žius,
met
ais
Mas
ė,
g
Ilgis
(L
),
cm
Ooci
tų
subre
ndim
o
stad
ija
I injekcija II injekcija Ovuliacija
Dat
a/val
.
Pre
gnil
o
dozė
,
TV
/kg
Dat
a/val
.
Pre
gnil
o
dozė
,
TV
/kg
Įvyko
Neį
vyko
Nesubrendusios patelės
Subrendusios patelės
Patinėliai
Top Related