Zastosowanie technik biologii molekularnej w diagnostyce

chorób dziedzicznych

Choroba dziedziczna

• schorzenie spowodowane przez mutacje jednego lub więcej genów lub też aberrację chromosomalną przekazywane w rodzinie w kolejnym pokoleniu

• zmiany w DNA zostają przekazane w gametach rodziców bądź też pojawiają się we wczesnych etapach rozwoju zarodkowego (jako mutacje de novo)

Test genetyczny

• analiza ludzkiego DNA, RNA, chromosomów, białek i określonych metabolitów

• umożliwia identyfikację odpowiednich genotypów, mutacji, fenotypów lub kariotypu

• wykonywany do celów klinicznych i poradnictwa genetycznego

Cel wykonywania testu genetycznego

• zdiagnozowanie genetycznej przyczyny choroby

lub• wykazanie, że osoba posiada jedna lub więcej zmian

genetycznych:– mogących spowodować rozwój choroby lub– mogących wywołać chorobę u potomstwa lub– mających znaczenie dla postępowania leczniczego.

Testy genetyczne oparte na analizie DNA

• niezależne od znajomości patogenezy choroby

• niezależne od ekspresji badanego genu

• wynik testu niezależny od momentu wystąpienia objawów klinicznych czy zmian w środowisku mogących wpływać na ujawnienie się kliniczne genotypów

• wynik testu stały w ciągu całego życia

Materiał do badań DNA

- krew obwodowa,- hodowla fibroblastów skóry,- plamy krwi, - komórki nabłonka jamy ustnej,- cebulki włosowe,

do badań prenatalnych:- komórki płynu owodniowego,- komórki trofoblastu (możliwość analizy w I trymetrze

ciąży)

Specyficzność analizy nie zależy od rodzaju tkanki użytej do badania.

Strategie metodyczne w diagnostyce molekularnej

bezpośrednia

analiza mutacji

analiza sposobu dziedziczenia danego genu (analiza sprzężeń)

Analiza sposobu dziedziczenia (analiza sprzężeń)

• polega na na śledzeniu w rodzinie przekazywania określonego markera genetycznego sprzężonego ze zmutowanym genem

• wykorzystuje fakt kosegregacji loci markera i genu powodującego chorobę – marker i gen ze względu na bliskie położenie na chromosomie dziedziczą się wspólnie

Markery genetyczne stosowane w analizie sprzężeń

Marker genetyczny – dowolna sekwencja DNA możliwa do identyfikacji, występująca w co najmniej dwóch formach allelicznych

1. SNP - Southern blotting, - PCR-RFLP,- PCR-ASO, - sekwencjonowanie,- mikromacierze

2. Sekwencje powtórzone (np. mikrosatelitarne) - ocena wielkości produktu PCR w żelu

poliakrylamidowym

Analiza sposobu dziedziczenia (analiza sprzężeń)

• możliwa nawet przy brak znajomości/możliwości bezpośredniej identyfikacji mutacji chorobotwórczej

• konieczność badania rodziców chorego

• nie służy do weryfikacji rozpoznania klinicznego(opiera się na nim)

• umożliwia wykrycie nosicielstwa u krewnych chorego

• obciążona ryzykiem błędu wynikającego ze zjawiska rekombinacji (badanie co najmniej dwóch markerów)

Analiza sposobu dziedziczenia markera XV2C sprzężonego z genem CFTR w rodzinie ryzyka mukowiscydozy.

Strategie metodyczne w diagnostyce molekularnej

bezpośrednia

analiza mutacji

analiza sposobu dziedziczenia danego genu (analiza sprzężeń)

Bezpośrednia analiza mutacji

• weryfikuje rozpoznanie kliniczne

• brak ryzyka błędu diagnostycznego wynikającego ze zjawiska rekombinacji

• konieczna znajomość mutacji powodującej chorobę

Współczesna rutynowa diagnostyka molekularna

– głównie analiza znanych mutacji.

Bezpośrednia analiza mutacji

przeszukiwanie genu poszukiwanie konkretnej mutacji/grupy mutacji

• nie wiadomo, która z licznych mutacji powoduje defekt genu

• w populacji brak mutacji specyficznych o dużej częstości występowania

sekwencjonwanie, poprzedzone badaniem metodą przesiewową (SSCP, HA, DGGE)

Przeszukiwanie genu

Bezpośrednia analiza mutacji

przeszukiwanie genu poszukiwanie konkretnej mutacji/grupy mutacji

Poszukiwanie konkretnej mutacji - mutacje punktowe

1) analiza restrykcyjna

- PCR-RFLP

- Southern blotting

2) PCR-ASO

3) sekwencjonowanie

4) mikromacierze DNA

Analiza mutacji punktowej w genie -globiny powodującej anemię sierpowatokrwinkową (Southern blotting).

Poszukiwanie konkretnej mutacji

– insercje, delecje, duplikacje

1) analiza wielkości produktu PCR – małe delecje

2) Southern blotting – duże delecje lub duplikacje,

– duże powtórzenia trójnukleotydowe,

Analiza delecji 508 w rodzinie ryzyka mukowiscydozy (analiza długości produktu PCR)

1. Czym spowodowane są choroby dziedziczne?

2. Co to jest test genetyczny i do czego służy?

3. Jaki materiał stosuje się do badania DNA w diagnostyce chorób dziedzicznych?

4. Na czym polega i do czego służy analiza sposobu dziedziczenia?

5. Na czym polega przeszukiwanie genu? Jakie techniki się tu wykorzystuje?