ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-----*-----

NGUYỄN TIẾN LUYỆN

XÁC ĐỊNH CHẤT CẤM SIBUTRAMINE

TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG GIẢM BÉO

BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

HÀ NỘI – 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-----*-----

NGUYỄN TIẾN LUYỆN

XÁC ĐỊNH CHẤT CẤM SIBUTRAMINE

TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG GIẢM BÉO

BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Chuyên ngành : Hóa phân tích

Mã số : 60440118

Người hướng dẫn : TS. Lê Thị Hồng Hảo

HÀ NỘI – 2014

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Lê Thị Hồng Hảo,

Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia – Bộ Y tế, đã giao đề

tài, hướng dẫn, đóng góp những ý kiến và tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em

trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá

học, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá phân tích, đã cho em những

kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho em được học tập và nghiên cứu trong thời

gian vừa qua.

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện kiểm

nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để

tôi được học tập và hoàn thành đề tài này.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các anh, chị và các bạn đồng nghiệp tại

labo Hóa – Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã giúp đỡ

tôi rất nhiều trong quá trình làm thực nghiệm.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động

viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi.

Hà Nội, năm 2014 Học viên

Nguyễn Tiến Luyện

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU – TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................ 1

Chương 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 2

1.1. Giới thiệu về thực phẩm chức năng giảm béo ......................................... 2

1.2. Thực trạng sử dụng thực phẩm chức năng giảm béo chứa sibutramine ... 3

1.3. Tổng quan về Sibutramine...................................................................... 4

1.3.1 Tính chất lý hóa của Sibutramine ............................................................ 4

1.3.2 Tính chất dược lý của Sibutramine .......................................................... 5

1.3.3 Một số phương pháp xác định sibutramine .............................................. 7

1.3.3.1 Phương pháp sắc ký khí khối phổ GC-MS ............................................ 7

1.3.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS .................................... 8

1.3.3.3 Phương pháp điện di mao quản CE ...................................................... 10

1.3.3.4 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC ......................... 11

1.3.3.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ................................... 12

1.4 Tổng quan về HPLC .................................................................................. 14

Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 17

2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu ............................................................. 17

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ............................................................................. 17

2.1.2 Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................... 17

2.2 Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 17

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu ............................................................................. 17

2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu .......................................................................... 18

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích ......................................................... 19

2.4 Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................... 23

2.5 Hóa chất, thiết bị ....................................................................................... 23

2.5.1 Hóa chất ................................................................................................. 23

2.5.2 Thiết bị, dụng cụ ..................................................................................... 24

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. ...................................................... 25

3.1 Tối ưu điều kiện tách và xác định Sibutramine bằng HPLC ....................... 26

3.1.1 Lựa chọn bước song hấp thụ ánh sáng .................................................... 26

3.1.2 Lựa chọn một số điều kiện sắc ký.. ......................................................... 27

3.1.3 Khảo sát pha động .................................................................................. 27

3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu..................................................................... 33

3.2.1 Khảo sát dung môi chiết với viên nang cứng .......................................... 34

3.2.2 Khảo sát dung môi chiết với viên nang mềm .......................................... 35

3.2.3 Khảo sát thời gian chiết mẫu .................................................................. 36

3.2.4 Khảo sát quy trình loại béo trong mẫu thực phẩm chức năng .................. 39

3.3 Thẩm định phương pháp phân tích ............................................................ 41

3.3.1 Độ đặc hiệu, độ chọn lọc ........................................................................ 41

3.3.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng ................................................. 43

3.3.3 Khoảng tuyến tính .................................................................................. 44

3.3.4 Độ lặp lại của hệ thống ........................................................................... 46

3.3.5 Độ đúng của phương pháp ...................................................................... 47

3.3.6 Độ lặp lại của phương pháp .................................................................... 49

3.4 Kết quả xác định sibutramine trong một số sản phẩm thực phẩm chức

năng giảm béo ................................................................................................. 51

Chương 4. KẾT LUẬN .................................................................................. 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO… ........................................................................... 57

PHỤ LỤC.. ..................................................................................................... 61

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU- TỪ VIẾT TẮT

Ký hiệu Tiếng anh Tiếng việt

AOAC Association of Official

Analytical Community

Hiệp hội cộng đồng phân tích

chính thức

CE Capillary Electrophoresis Điện di mao quản

ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử

FDA Food and Drug Adminstration Cục quản lý thực phẩm và

dược phẩm Hoa Kỳ

GC-MS Gas Chromatography Mass

Spectrometry Sắc ký khí khối phổ

HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPTLC High Performance Thin Layer

Chromatography

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng

cao

KN

ATVSTPQG

National institute for food

control

Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh

thực phẩm quốc gia

LC-MS/MS Liquid Chromatography tandem

Mass Spectrometry

Sắc ký lỏng ghép khối phổ

hai lần

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng

R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi

SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn

DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng Trang

Bảng 1.1 Thử nghiệm lâm sàng dài hạn với sibutramine 4

Bảng 3.1 Thành phần hệ dung môi pha động 27

Bảng 3.2 Chương trình gradient của hệ pha động amoni acetat -

methanol 28

Bảng 3.3 Chương trình gradient của hệ pha động đệm phosphate -

methanol 30

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát dung môi chiết sibutramine cho mẫu

viên nang cứng 34

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát dung môi chiết sibutramine cho mẫu

viên nang mềm 35

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu 37

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát dung môi loại béo 39

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 44

Bảng 3.9 Độ lệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường

chuẩn 46

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ lặp lại của hệ thống 47

Bảng 3.11 Độ thu hồi của phương pháp với viên nang mềm 47

Bảng 3.12 Độ thu hồi của phương pháp với viên nang cứng 48

Bảng 3.13 Độ lặp lại của phương pháp với viên nang cứng 50

Bảng 3.14 Độ lặp lại của phương pháp với viên nang mềm 50

Bảng 3.15 Kết quả phân tích sibutramine trong một số mẫu thực

phẩm chức năng giảm béo. 51

DANH MỤC CÁC HÌNH

Tên hình Trang

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của sibutramine 4

Hình 1.2 Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao. 14

Hình 2.1 Quy trình phân tích mẫu dự kiến 19

Hình 2.2 Thiết bị HPLC Shimadzu (LC 20AD) 25

Hình 3.1 Sắc ký đồ PDA của sibutramine 26

Hình 3.2 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramine với pha động 1 28

Hình 3.3 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với pha động 1 29

Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramine với pha động 2 29

Hình 3.5 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với pha động 2 30

Hình 3.6 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramine với pha động 3 31

Hình 3.7 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với pha động 3 31

Hình 3.8 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramine với pha động 4 32

Hình 3.9 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với pha động 4 32

Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn diệu quả chiết sibutramine trong mẫu viên nang cứng

34

Hình 3.11 Biểu đồ biểu diễn diệu quả chiết sibutramine trong mẫu viên nang mềm

36

Hình 3.12 Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng TPCN them chuẩn siêu âm trong 5 phút

37

Hình 3.13 Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng TPCN them chuẩn siêu âm trong 10 phút

38

Hình 3.14 Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng TPCN them chuẩn siêu âm trong 15 phút

38

Hình 3.15 Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng TPCN them chuẩn siêu âm trong 20 phút

38

Hình 3.16 Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng TPCN them chuẩn siêu âm trong 25 phút

39

Hình 3.17 Sắc ký đồ phân tích mẫu TPCN nang mềm chưa loại béo 40

Hình 3.18 Sắc ký đồ phân tích mẫu TPCN nang mềm đã loại béo 40

Hình 3.19 Sắc ký đồ phân tích mẫu TPCN nang mềm thêm chuẩn 200µg/ml loại béo bằng n-Hexan (H+)

41

Hình 3.20 Sắc ký đồ dung dịch đánh giá độ phân giải 42

Hình 3.21 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramine 200µg/ml 42

Hình 3.22 Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng TPCN giảm béo 43

Hình 3.23 Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng TPCN thêm chuẩn sibutramine 200µg/ml

43

Hình 3.24 Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng TPCN thêm chuẩn sibutramine 0,5 µg/ml

44

Hình 3.25 Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng TPCN thêm chuẩn sibutramine 0,2 µg/ml

44

Hình 3.26 Khoảng tuyến tính sự phụ thuộc giữa diện tích pic vào nồng độ của sibutramine

45

Hình 3.27 Đường chuẩn sự phụ thuộc giữa diện tích pic vào nồng độ của sibutramine

45

Hình 3.28 Biểu đồ phân tích mẫu thực tế 55

ĐẶT VẤN ĐỀ

Béo phì hiện không còn là vấn đề của riêng các nước phát triển mà

nay còn là vấn nạn của cả các nước đang phát triển. Báo cáo mới nhất của

WHO đã chỉ ra rằng khoảng 1,5 tỉ người trưởng thành có độ tuổi trên 20 được

xếp vào nhóm thừa cân. Trong số đó hơn 200 triệu nam giới và gần 300 triệu

nữ giới ở trạng thái đã béo phì. Theo ước tính đến năm 2015 sẽ có khoảng 2,3

tỉ người thừa cân và trên 700 triệu người béo phì. Một số liệu khác cho thấy

gần 43 triệu trẻ em dưới 5 tuổi đã bị thừa cân tính đến năm 2010 [25]. Chính

vì thế nhu cầu giảm béo cũng theo đó mà tăng lên. Phương pháp điều trị giảm

béo thường được áp dụng là ăn kiêng, kết hợp hoạt động thể lực. Nhưng

phương pháp này thường khó thực hiện và kém hiệu quả. Vì vậy, mọi người

thường tìm đến các loại thuốc giảm béo để tăng cường tác dụng giảm cân.

Nắm bắt được nhu cầu cấp thiết này, nhiều công ty sản xuất thực phẩm chức

năng đã chớp thời cơ đưa ra các sản phẩm phục vụ cho nhu cầu này. Để tăng

tác dụng của sản phẩm, các công ty đã không ngần ngại đưa vào sản phẩm các

chất có tác dụng nhanh và mạnh, nhằm tiêu thụ sản phẩm một cách nhanh

chóng. Trong nhóm các chất thường được cho thêm để tăng hiệu quả giảm

béo một cách bất hợp pháp có hoạt chất Sibutramine. Nó có tác động đến hệ

thần kinh trung ương, làm tăng lượng serotonin và noradrenalin trong não, từ

đó tạo cảm giác no và không thèm ăn. Chất này đã bị cấm sử dụng ở nhiều

nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam [4], [12], [16]. Do đó việc phát hiện

được sibutramine có mặt trái phép trong thực phẩm chức năng giúp giảm béo

là một yêu cầu thực tiễn trong kiểm soát tính an toàn của loại sản phẩm này.

Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn kể trên, chúng tôi đã nghiên cứu chọn đề tài

“Xác định hàm lượng chất cấm sibutramine trong thực phẩm chức năng giảm

béo bằng phương pháp HPLC”. Đây là phương pháp phân tích hiện đại, có độ

chính xác cao và có khả năng ứng dụng rộng rãi tại Việt Nam.

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về thực phẩm chức năng giảm béo

Thực phẩm chức năng giảm béo là những sản phẩm của quá trình chế

biến thực phẩm hay thảo dược đã được các nhà sản xuất nghiên cứu để bổ

sung và thay đổi một số thành phần dinh dưỡng có tác dụng tốt cho sức khoẻ.

Các loại thực phẩm chức năng giảm béo đa số được sản xuất dưới dạng viên

nén, viên nang, dạng bột, dạng cao hay dạng trà nhưng không được coi như

một loại thuốc chữa bệnh, đây có thể coi là một dạng thực phẩm giảm cân

nhanh. Hiện nay trên thị trường có rất nhiều loại thực phẩm chức năng giảm

béo giúp người béo phì lấy lại vóc dáng cân đối.

Để tăng tác dụng của sản phẩm, các công ty sản xuất đã đưa vào sản

phẩm các chất có tác dụng nhanh và mạnh, nhằm tiêu thụ sản phẩm một cách

nhanh chóng. Những chất giảm béo sử dụng đầu tiên gồm có nhóm các chất

cường adrenalin (phentermin, benzphetamin, phendimetrazin, mazindol,

diethylpropion, phenylpropanolamin) và nhóm chất cường serotonin

(fenfluramin, dexfenfluramin). Tuy nhiên, phenylpropanolamin - một tác

nhân thuộc nhóm cường adrenalin đã bị cấm lưu hành tại thị trường Mỹ vào

tháng 10 năm 2000 do các nghiên cứu cho thấy nó làm tăng nguy cơ tai biến

mạch máu não như xuất huyết đột quỵ khi nó được sử dụng như một chất

giảm cân ở phụ nữ [14]. Cũng như vậy, các chất cường serotonin mặc dù cũng

có hiệu quả trong việc hỗ trợ giảm cân nhưng chúng cũng đã bị cấm lưu hành

trên thị trường Mỹ từ tháng 9 năm 1997 do các nghiên cứu cho thấy nó làm

thay đổi van tim và tăng huyết áp động mạch phổi [15]. Sibutramine (thuộc

nhóm chất ức chế tái thu hồi serotonin-noradrenalin) chính thức được lưu

hành tại Mỹ từ tháng 2 năm 1998, sau đó nó đã được sử dụng cho điều trị béo

phì trong khoảng 40 quốc gia trên thế giới.

Sibutramine đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc điều trị béo

phì. Một số nghiên cứu lâm sàn ngắn hạn cho thấy sibutramine có tác dụng

giảm cân có thể do sự kết hợp của giảm sự thèm ăn, gây cảm giác no và có thể

cảm ứng của sinh nhiệt. Hiệu quả ban đầu của nó làm giảm cân vì vậy nó

được coi như là một phương thức tiếp cận để giảm cân hiệu quả [21]. Tuy

nhiên sibutramine lại có những tác dụng phụ trầm trọng liên quan đến hệ thần

kinh trung ương, làm tăng nhịp tim, tăng huyết áp, thậm chí là nhồi máu cơ

tim [24], do đó nó đã bị cấm lưu hành trên nhiều thị trường như thị trường

châu Âu [12], Mỹ [16] và cả thị trường Việt Nam [4].

1.2 Thực trạng sử dụng thực phẩm chức năng giảm béo chứa

sibutramine

Theo Cơ quan Quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA), các

sản phẩm thực phẩm chức năng giúp giảm béo có chứa một số thành phần hóa

chất khác không được nhà sản xuất công bố rõ ràng và sử dụng cao hơn mức

quy định. Các chất này gây độc cho hệ tim mạch, thận và gan của người nếu

sử dụng dài ngày, đồng thời rất nguy hiểm với người cao huyết áp, người mắc

bệnh động mạch vành, xung huyết, loạn nhịp tim, tăng nhãn áp, tai biến hoặc

đột quỵ.

Sibutramine được biết đến dưới dạng biệt dược Sibutral. Đây là loại

thuốc chỉ bán theo chỉ định của bác sĩ, làm giảm cảm giác thèm ăn, tác dụng

vào trung tâm nhận thức về đói và no ở não, thường được sử dụng như thuốc

chống trầm cảm, chán sống. Một thời gian sau khi uống, nó làm giảm trung

bình 5% trọng lượng cơ thể. Sibutramine được Cơ quan Quản lý Dược phẩm

và Thực phẩm Hoa Kỳ cấp phép từ tháng 11-1997. Được bán tại Pháp từ năm

2001 nhưng ngay lập tức, y học đã nhận ra những tác dụng phụ qua 2 trường

hợp tử vong tại Italia. Năm 2002, Italia cấm bán loại thuốc có chứa

Sibutramine. Đến năm 2007, Pháp cũng cấm bán. Năm 2009, các nhà khoa

học Mỹ nhận ra người uống Sibutramin còn có nguy cơ tự tử - là hiện tượng

thường xảy ra với những loại thuốc điều trị chứng chán đời.

Tại Singapore, Cơ quan Khoa học Y tế (HAS) cũng đã cấm lưu hành

Oxy Elite Pro. Tiến hành thí nghiệm, HAS nhận thấy Oxy Elite Pro có chứa

Sibutramine chứ không phải được chiết xuất từ thảo dược như lời quảng cáo.

Năm 2011, Cơ quan dược phẩm Thụy Sỹ đã phân tích các mẫu sản phẩm thảo

dược giảm cân, kết quả cho thấy có tới 8/13 mẫu, trong đó có thuốc giảm cân

2Day Diet, 3X Slimming Power bị phát hiện chứa hoạt chất Sibutramine với

hàm lượng 21,5 mg, vượt quá 43% liều lượng cho phép sử dụng hằng ngày.

Tại Việt Nam, mặc dù Cục quản lý Dược – Bộ Y Tế đã ban hành Quyết

định số: 120/QĐ-QLD ngày 14/4/2011 về việc rút số đăng ký của thuốc do

phản ứng có hại, theo đó tất cả các thuốc có chứa hoạt chất Sibutramine ra

khỏi danh mục các loại thuốc được cấp số đăng ký thông hành trên thị trường

Việt Nam tuy nhiên, qua đợt kiểm tra mới đây của các cơ quan chức năng đã

phát hiện trên địa bàn thành phố Hà Nội vẫn đang hiện diện một số loại thuốc

và thực phẩm chức năng có chưa hoạt chất nguy hiểm này.

Theo thông tin từ Cục an toàn thực phẩm Bộ Y tế, rất nhiều trường hợp

sau khi sử dụng thực phẩm chức năng có chứa thành phần hoạt chất

Sibutramine đã phải nhập viện trong tình trạng sức khỏe và tính mạng bị đe

dọa. Hoạt chất Sibutramine có tác dụng giúp những người béo phì giảm cân,

nhưng lại đặc biệt nguy hiểm với người tiêu dùng, nhất là những người có tiền

sử bệnh huyết áp và tim mạch. Các sản phẩm này gây nhiều chứng rối loạn

nguy hiểm cho cơ thể chúng đe dọa sức khỏe và tính mạng người sử dụng.

Theo TS. Nguyễn Hùng Long, Phó cục trưởng Cục An toàn thực phẩm

Bộ Y tế phân tích: “Đối với người có tiền sử bệnh tim mạch, loại sản phẩm

này gây rối loạn và làm tăng nhịp tim. Như vậy, nó làm cho người mắc bệnh

về tim mạch sẽ thêm nặng. Thậm chí nếu sử dụng liều cao, nó còn có thể gây

rối loạn nặng nề hơn ở hệ thống tim mạch”. Cơ quan chức năng cảnh báo

rằng, thuốc giảm cân hay thực phẩm chức năng có chứa Sibutramine trên thị

trường hiện nay có hoạt chất rất độc hại và thực tế đã có nhiều người sử dụng

phải nhập viện trong tình trạng sức khỏe nguy kịch.

1.3. Tổng quan về sibutramine

1.3.1. Tính chất lý hóa của sibutramine

- Công thức phân tử: C17H26ClN (Khối lượng phân tử: 297,5 đvC)

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của sibutramine

- Danh pháp quốc tế: (+/-)-1-(p-chlorophenyl)-α-isobutyl-N,N-dimethyl-

cyclobutan-methylamin [5].

- Trong các chế phẩm chúng thường tồn tại ở dạng Sibutramine hydroclorid

monohydrat.

- Độ tan: Độ tan của sibutramine hydrochlorid monohydrat trong nước là 5,2

mg/mL. Sibutramine kiềm tan nhiều hơn trong alcol, độ tan tăng dần theo

độ dài mạch C từ methanol đến octhanol [5].

- Nhiệt độ nóng chảy: Sibutramine kiềm có nhiệt độ nóng chảy là 55,15oC và

enthalpy là 60,75 J/mol; Sibutramine hydroclorid monohydrat có nhiệt độ

nóng chảy ở 1190C [5].

- Sibutramine base hấp thụ ánh sáng trong vùng UV-VIS. Cực đại hấp thụ tại

bước sóng 225 nm [23].

1.3.2. Tính chất dược lý của Sibutramine

Sibutramine hấp thu tốt qua đường tiêu hóa (77%). Thời gian để thuốc

đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương là 1 giờ và thời gian bán thải là 1,1 giờ.

Sibutramine phân bố nhanh chóng và rộng rãi đến các mô. Khi dùng đường

uống sibutramine bị chuyển hóa đáng kể khi qua gan lần đầu. Sibutramine

được chuyển hóa bởi cytochrom P450 CYP3A4 thành hai amin (gọi là chất

chuyển hóa có hoạt tính 1 và 2) với chu kỳ bán rã tương ứng là 14 giờ và 16

giờ. Nồng độ đỉnh trong huyết tương của chất chuyển hóa có hoạt tính 1 và 2

đạt được sau 3-4 giờ. Các chất chuyển hóa thải trừ chủ yếu qua nước tiểu

[13].

Sibutramine đã được đánh giá như một thuốc chống trầm cảm tiềm tàng

do các cơ chế đã được chứng minh là tác động đó cũng tương tự như các

thuốc chống trầm cảm ba vòng, chẳng hạn như amitriptylin. Tuy nhiên,

sibutramine không có tác dụng phụ của thuốc chống trầm cảm ba vòng bao

gồm buồn ngủ, tác dụng kháng acetylcholin thế đứng [21].

Sibutramine là một hoạt chất có tác động đến hệ thần kinh trung ương,

làm gia tăng lượng serotonin và noradrenalin trong não, từ đó tạo cảm giác no

và không thèm ăn [21].

Trong cơ thể, sibutramine chuyển hóa nhanh chóng thành các chất

chuyển hóa desmethyl: M1 (mono-desmethyl sibutramin) và M2 (di-

desmethyl sibutramin) và sibutramine tác động dược lý chủ yếu thông qua 2

chất chuyển hóa này để gây ra tác dụng giảm cân [11], [8].

Thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh sibutramine có hiệu quả như một

chất giảm cân với liều lượng khác nhau, từ 10 đến 20 mg/ngày [21].

Bảng 1.1: Thử nghiệm lâm sàng dài hạn với sibutramine

Thời gian

thử nghiệm

Liều

( mg/ngày) Chế độ ăn

Cân nặng được giảm

(kg)

6 tháng 10 30 kcal/kg S=7,52

pl= 3,56

6 tháng 15 30 kcal/kg S=10,27

pl=1,26

1 năm 10 220 – 800

kcal/ngày

S= 5,2b

pl= 0,5

1 năm 10 và 15

Chế độ ăn

theo lời

khuyên

S (10)= 4

S(15)= 6

pl=1,6

1 năm 20 NR S= 4,4e

pl= 0,5

2 năm 10 – 20 600

kcal/ngày

S=10

pl = 4,7

S: Sibutramine, pl: placebo, NR: không có báo cáo

a= ± SD; b: P=0,004; e: P < 0,05 với placebo

Tác dụng không mong muốn: Sibutramine đồng thời cũng kích thích

quá mức hệ thần kinh trung ương và ảnh hưởng một vài khía cạnh như bồn

chồn, khô miệng, đau đầu, tê liệt và những dị cảm (Cảm giác khác thường

như bị châm chích, kiến bò) có thể xảy ra. Hơn thế nữa, nó còn liên quan đến

tăng nguy cơ tim mạch như tăng áp lực máu, nhịp tim và thường tăng nguy cơ

đau tim cũng như đột quỵ [20]. Do những nguy cơ này, sibutramine đã bị cấm

lưu hành trên thị trường châu Âu từ ngày 21/1/2010 [12]. Từ tháng 8 năm

2010, Mỹ đã chống chỉ định mới cho các bệnh nhân trên 65 tuổi do các tác

dụng phụ thực tế qua các nghiên cứu lâm sàng của sibutramine [17]. Tại Việt

Nam, các chế phẩm chứa sibutramine đã bị rút số đăng ký lưu hành theo

Quyết định số 120/QĐ-QLD ngày 14/4/2011 của Cục quản lý Dược – Bộ Y tế

[4]. Tuy nhiên, do nhu cầu giảm béo của những người thừa cân nên hiện nay,

nhiều loại thuốc giảm béo dưới mác thực phẩm chức năng có chứa

sibutramine vẫn được bán tràn lan trên thị trường.

1.3.3. Một số phương pháp xác định Sibutramine

Trên thế giới, đã có rất nhiều nghiên cứu đưa ra các phương pháp xác

định sibutramine với nhiều kỹ thuật phân tích khác nhau như: Sắc ký khí khối

phổ GC-MS [22], Sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS [10]; Điện di mao quản

CE [28]; Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC [7]; Sắc ký lỏng hiệu năng

cao HPLC [23], [7], [6], [26];

1.3.3.1 Phương pháp sắc ký khí khối phổ GC-MS

Trong phương pháp sắc ký khí khối phổ, sau khi qua cột tách, các hợp

chất hữu cơ trung hoà bị ion hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân

tử mang điện dương hoặc âm, các gốc tự do trong điều kiện áp suất thấp. Sau

đó, các ion đựơc đưa sang bộ phận tách theo khối lượng. Từ các tín hiệu thu

được, dựa vào khối lượng ion phân tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh ion

phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ liệu các ion và mảnh

ion, người ta định tính và định lượng được chất phân tích một cách chính xác.

Tác giả Sabina Strano-Rossi và cộng sự [22] đã phát triển phương pháp

sắc ký khí khối phổ sibutramine trong các mẫu viên nén, viên nang, trà túi.

Mẫu được hòa trong nước, kiềm hóa bằng Natri carbonat đến pH =10. Chiết

bằng methyl chloride, làm khô, bốc hơi dung môi rồi phân tích bằng GC-MS.

Quá trình tách sắc ký khí được thực hiện trên cột HP-5-MS (30m × 0,25mm),

chương trình nhiệt độ bắt đầu ở 110oC, tăng 10oC/phút đến 280oC và duy trì

trong 3 phút, sử dụng khí mang He với tốc độ 0,6 ml/phút, phổ khối thu được

trong khoảng khối lượng 40-400 a.m.u.

Đây là một phương pháp phân tích hiện đại, được sử dụng có hiệu quả

cao, độ phân giải và độ nhạy cao, tiết kiệm dung môi. Tuy nhiên, chi phí cho

thiết bị rất lớn, quy trình chiết mẫu phức tạp chưa phổ biến cho các phòng thí

tại Việt Nam nên việc ứng dụng khó khăn.

1.3.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS

Đây là một phương pháp nhanh, nhạy và được phát triển nhiều hiện

nay. Sau khi qua cột tách, chất phân tích được hóa hơi, các hợp chất hữu cơ

trung hoà bị ion hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang

điện dương hoặc âm, các gốc tự do. Sau đó, các ion đựơc đưa sang bộ phận

tách theo khối lượng. Từ các tín hiệu thu được, dựa vào khối lượng ion phân

tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và

dựa vào ngân hàng dữ liệu các ion và mảnh ion, người ta định tính và định

lượng được chất phân tích một cách chính xác.

Nhóm tác giả thuộc trường đại học Fudan, Thượng Hải [10] đã phát

triển phương pháp sắc ký lỏng khối phổ ion hóa phun điện tử (LC-ESI/MS)

để xác định đồng thời sibutramine và các chất chuyển hóa trong huyết tương.

Mẫu được chiết từ huyết tương bằng tert-butyl ether, thêm chất chuẩn nội

propranolol hydroclorid, bay hơi dung môi và hòa cặn trong pha động, phân

tích trên thiết bị LC-ESI/MS. Điều kiện sắc ký: cột ODS MS với pha động

acetonitril chứa 0,1% trifloacetic acid. Khoảng tuyến tính của sibutramine

trong khoảng 0,328-32,8 ng/ml trên nền mẫu huyết tương và độ chụm dưới

19,9%. Phương pháp có độ nhạy và độ chụm phù hợp để ứng dụng trong các

nghiên cứu dược động học.

Tác giả Sabina Strano-Rossi và cộng sự đã phát triển phương pháp sắc

ký lỏng khối phổ phân giải cao LC-HRMS để nhận biết và định lượng đồng

thời các chất kích thích (ephedrines, cafein), các chất giảm cân (phentermine,

phendimetrazine, phenmetrazine, fenfluramine, benfluorex, mephentermine,

fencanfamine, sibutramine) và các chất cường dương nhóm PDE5 (sildenafil,

vardenafil, tadalafil) trong thực phẩm chức năng sử dụng phổ khối Orbitrap.

Detector khối phổ với khả năng phân giải 100.000 (FWHM tại m/z 200) hoạt

động ở chế độ full scan và chế độ ion hóa phun điện tử ESI. Các chất phân

tích được nhận biết dựa vào thời gian lưu, phổ khối, và tỉ lệ tương quan của

các đồng vị. Giới hạn phát hiện của các chất từ 1-25 ng/g, giới hạn định lượng

là 50ng/g. Phương pháp có độ tuyến tính cho tất cả các chất trong khoảng 50-

2000 ng/g với hệ số tương quan >0,99. Phương pháp có độ chụm tốt, hệ số

biến thiên CV % luôn thấp hơn 15%. Các tác giả đã ứng dụng phương pháp

để phân tích 36 mẫu thực phẩm chức năng, phát hiện sự có mặt của

ephedrine/pseudoephedrine trong 4 mẫu, cafein trong 8 mẫu, sildenafil trong

4 mẫu.

Nhóm tác giả Ying Shi, Chengiun và cộng sự đã phát triển phương

pháp sắc ký lỏng khối phổ ion hóa phun điện tử (HPLC-ESI-MS/MS) để xác

định đồng thời 8 chất cấm (ephedrine, norpseudoephedrine, fenfluramine,

sibutramine, clopamide, emodin, rhein, and chrysophanol) trong thực phẩm

chức năng giảm cân. Các chất phân tích được chiết ra khỏi nền mẫu bằng

phương pháp chiết siêu âm với dung dịch 70% methanol, ly tâm và tiêm vào

hệ thống sắc ký. Các chất được tách trên cột sắc ký Hypersil Gold column

(2.1 mm × 150 mm, 5 μm) sử dụng chương trình rửa giải gradient, pha động

gồm hỗn hợp dung dịch đệm amoni format (pH 3,50) và acid formic 0,02% và

methanol, tốc độ dòng 0,25ml, nhiệt độ buồng cột 25oC. Nhận biết định tính

các chất dựa vào các ion đặc trưng và thời gian lưu sử dụng chế độ SRM.

Clenbuterol và ibuprofen được sử dụng làm nội chuẩn lần lượt cho chế độ ion

dương và ion âm. Hiêu suất thu hồi cho 3 khoảng nồng độ khác nhau từ 80,2

– 94,5%. Giới hạn phát hiện từ 0,03 – 0,66 mg/kg (ngoại trừ chrysophnol 1,6

mg/kg). Phương pháp đã được ứng dụng để xác định chất cấm trong 4 loại

thực phẩm chức năng giảm cân. Các kết quả thống kê cho thấy sibutramin và

hoặc fenfluramine là thành phần chất cấm chín trong các sản phẩm với hàm

lượng lần lượt là 6,1 – 1,3 × 103 mg/kg and 1,9 – 9,7 × 103 mg/kg.

Tác giả Ramakrishna và các cộng sự, đã phát triển phương pháp sắc ký

lỏng 2 lần khối phổ LC-MS/MS để xác định sibutramine trong mẫu huyết

tương người. Phương pháp có độ chọn lọc và hiệu suất thu hồi cao. Sử dụng

chiết lỏng – lỏng và chất phân tích tách bằng chế độ đẳng dòng isocractic trên

cột sắc ký pha đảo. Sau đó được phân tích trên thiết bị MS/MS. Khoảng tuyến

tính của sibutramine trong khoảng 30 – 6000 pg/ml trên nền mẫu huyết tương

người. Phương pháp có giới hạn phát hiện là 30 pg/ml với độ lệch chuẩn dưới

4%. Thời gian phân tích cho mỗi lần là 3,2 phút và có thể phân tích hơn 250

mẫu huyết tương người mỗi ngày. Phương pháp đã được thẩm định và được

sử dụng phân tích sibutramine trong các mẫu huyết tương người cho ứng

dụng trong việc kết hợp với một chế độ ăn uống để giảm cân.

Tác giả Li Ding và cộng sự đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng khối

phổ phun điện tử (LC-ESI-MS) có độ nhạy và đọ chính xác cao để xác định

sibutramine và 2 chất chuyển hóa N-desmethyl của nó trong huyết tương

người sử dụng phenoprolamine hydrochloride làm nội chuẩn. Sau khi kiềm

hóa với natri bicarbonate, các mẫu huyết tương được chiết với cyclohexane và

tiêm vào hệ thống HPLC, quá trình tách trên cột pha đảo C18 với pha động

đệm acetat 10mM (pH 3,5) và methanol (25/75). Các chất phân tích được xác

định sử dụng chế độ ion hóa phun điên tử trong detector khối phổ 1 tứ cực.

Lc-ESI-MS được thực hiện trong chế độ chọn lọc ion (SIM) sử dụng các ion

đặc trưng m/z = 228 cho sibutramine, m/z = 266 cho N-mono-

desmethysibutramine (chất chuyển hóa 1), m/z = 252 cho N-di-

desmethylsibutramine (chất chuẩn hóa 2) và m/z = 344 cho nội chuẩn. Các

đường chuẩn tuyến tính trong khoảng 0,05 – 20 µg/L cho sibutramine, 0,02 -

20 µg/L cho chất chuyển hóa 1 và 0,1 – 30 µg/L cho chất chuyển hóa 2. Giá

trị độ lặp lại trong ngày nhỏ hơn 7,6% cho sibutramine, 8,9 % cho chất

chuyển hóa 1 và 5,5% cho chất chuyển hóa 2. Giá trị độ lặp lại giữa các ngày

là nhỏ hơn 11,8% cho sibutramine, 12,7% cho chất chuyển hóa 1 và 9,4% cho

chất chuyển hóa 2. Hiệu suất chiết các mẫu huyết tương lần lượt cho

sibutramine, chất chuyển hóa 1 và chất chuyển hóa 2 là 90,2%, 90,9% và

91,0%. Phương pháp được ứng dụng thành công để nghiên cứu dược động

học của sibutramine và các chất chuyển hóa cho những người tình nguyện

nam ở Trung Quốc.

Đây là phương pháp phân tích hiện đại, có độ nhạy và độ chính xác

cao. Tuy nhiên, đây là một phương pháp khó, thiết bị phức tạp, đắt tiền và

không phải phòng thí nghiệm nào cũng có điều kiện để thực hiện phương

pháp này.

1.3.3.3 Phương pháp điện di mao quản (CE)

Đây là phương pháp tách các chất phân tích là các ion hoặc các chất

không ion nhưng có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản

hẹp chứa đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trường. Do độ linh độ điện di của

các ion khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi

nhau.

Nhóm tác giả Yang Li và các cộng sự [28] đã phát triển phương pháp

điện di mao quản hiệu năng cao để xác định đồng thời 07 hoạt chất trong mẫu

thực phẩm chức năng là fenfluramin, pseudoephedrine, norpseudoephedrine,

amfepramone, sibutramine, sildenafil và strychnine. Sử dụng hỗn hợp đệm

của natri tetraborate 20 mM, natri dodecyl sulfat 10 mM và acetonitrile 5%

(pH = 9,0) và phân tích được thực hiện tại một bước sóng phát hiện 195 nm

dưới một điện áp tách 17 kV ở 25°C. Với giới hạn vi tuyến tính là 100 mg/l,

với hệ số tương quan R lớn hơn 0,998. Độ lệch chuẩn tương đối dao động từ

4,5% và 7,9% (n = 7). Và độ thu hồi trung bình trong khoảng 79,6% -112,0%.

Các giới hạn phát hiện (S/N = 3) nằm trong khoảng 0,16 và 0,65 mg/l.

Phương pháp phân tích tương đối đơn giản, nhanh chóng, chọn lọc và chính

xác. Phương pháp đã được áp dụng thành công cho việc xác định 7 hoạt chất

trong mẫu thực phẩm chức năng.

1.3.3.4 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC

Đây là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di

chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất

hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp

mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha

động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ

lệ phù hợp cho từng chất cần phân tích. Trong quá trình di chuyển qua lớp

hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử nghiệm được di chuyển trên lớp

mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, thu được

một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ,

phân bố, trao đổi ion, sàng lọc kích thước phân tử hay sự phối hợp đồng thời

của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi

pha động.

Tác giả Etil Ariburnu và cộng sự đã phát triển phương pháp HPTLC để

xác định sibutramine được bổ sung trái phép trong các sản phẩm giảm cân tự

nhiên. Sau khi chiết trong hỗn hợp Acetonitril và nước, chất phân tích được

tách HPTLC sử dụng bản mỏng thủy tinh phủ silicagel 60 F254, pha động n-

hexan-aceton-amoniac (10:1:0,1). Quét phổ ở bước sóng 225 nm. Nguồn bức

xạ là đèn deuteri phát ra một quang phổ UV liên tục từ 200 nm và 400 nm, tốc

độ quét 10 mm/giây. Đường chuẩn HPTLC tuyến tính trong khoảng 250-2000

ng/spot-1. Phương pháp được thẩm định về độ đúng, độ chụm, khoảng tuyến

tính, độ thu hồi và độ ổn định giữa các ngày đạt yêu cầu.

Nhóm nghiên cứu tại phòng thí nghiệm của hãng Camag cũng đã

nghiên cứu phát triển phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao ghép nối

detector khối phổ (HPTLC-MS) để xác định sibutramine cho trái phép vào

các sản phẩm giảm cân có nguồn gốc thảo dược. Mẫu được chiết với

methanol, lắc, rung siêu âm, ly tâm, lọc và chấm sắc ký lớp mỏng sử dụng

bản mỏng silicagel 60 GF254 (20x10). Quá trình khai triển sắc ký tự động

trong buồng khai triển ADC2 với pha động toluene-methanol (9:1), bão hòa

dung môi 20 phút, độ ẩm được kiểm soát bằng dung dịch bão hòa MgCl2, thời

gian sấy khô 5 phút. Quá trình nhận biết và định lượng sắc ký sử dụng phổ

khối Q-trap chế độ ESI. Các mảnh phổ đặc trưng: 280,2 -> 125,0 và 280,2 ->

139,0.

Đây là phương pháp phân tích hiện đại, có độ chính xác cao. Tuy nhiên,

phương pháp có sử dụng nhiều dung môi hữu cơ rất độc hại, chi phí lớn. Hơn

nữa, đây là thiết bị không phổ biến cho các phòng thí nghiệm tại Việt Nam

nên khó ứng dụng rộng rãi.

1.3.3.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Sibutramine hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại. Sau khi qua cột

tách, nó được phát hiện bởi detector UV, độ hấp thụ tỉ lệ với nồng độ là cơ sở

cho sự định lượng.

Tác giả A.P. SuThar và cộng sự [23] đã phát triển và thẩm định phương

pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo để phân tích định lượng sibutramine

hydrochloride monohydrate trong các mẫu viên nang. Quá trình tách sắc ký

được thực hiện trên cột Phenyl Hypersil (C-18, 250 x 4,6 mm, 5μm), pha

động Acetonitrile: Amonium dihydrogen phosphat pH = 6,0 với detector UV

225 nm. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,09 µg/mL, giới hạn định

lượng là 0,26 µg/mL. Hiệu suất thu hồi trong khoảng 99,87-100,45%.

Tác giả Etil Ariburnu và cộng sự [7] đã so sánh phương pháp HPLC và

HPTLC để xác định sibutramine được bổ sung trái phép trong các sản phẩm

giảm cân tự nhiên. Quá trình tách HPTLC được thực hiện trên bản mỏng thủy

tinh phủ silicagel 60 F254, sử dụng pha động n-hexan-aceton-amoniac

(10:1:0,1). Quá trình phân tích trên HPLC sử dụng cột Phenyl (5,0µm,

150mm×4,6mm, i.d), pha động Acetonitrile: Nước: Acid formic (pH 3,0;

0,19M) (45:55:0,78; v:v:v), detector huỳnh quang, Ex = 316nm, Em = 225nm.

Đường chuẩn HPTLC tuyến tính trong khoảng 250-2000ng/spot-1, đường

chuẩn HPLC trong khoảng 5-200µg/ml. Cả 2 phương pháp đều được thẩm

định về độ đúng, độ chụm, khoảng tuyến tính, độ thu hồi và độ ổn định giữa

các ngày. Các phương pháp đều hiệu quả cho phân tích hàng ngày trong các

sản phẩm bổ sung trái phép sibutramine.

Nhóm nghiên cứu thuộc trường đại học Dược, Bucharest, Rumani [6]

đã phát triển phương pháp HPLC để xác định đồng thời sibutramine và

phenolphthalein trong các sản phẩm giảm cân có nguồn gốc thảo dược. Các

điều kiện sắc ký bao gồm: Cột CN Nucleosil (100-5 CN, 125 x 4,6 mm), pha

động Acetonitrile: Kali dihydrogen phosphat pH = 4,0 (35:65, v:v), detector

DAD ở 225 nm. Nhóm tác giả đã tìm thấy hàm lượng trung bình của

sibutramine là 24,71 mg/viên, phenolphthalein là 48,20 mg/viên.

Tác giả Zhou Yu và cộng sự [26] đã phát triển một phương pháp

HPLC-DAD đơn giản để xác định đồng thời 4 chất được bổ sung trái phép

trong thực phẩm chức năng: orlistat, cetilistat, sibutramine và rimonabant.

Các chất phân tích được tách và định lượng bằng HPLC-DAD tại bước sóng

222 nm. Quá trình tách được thực hiện trên cột C18 với chương trình rửa giải

gradient gồm acetonitril và acid phosphoric 0,02 mol/L. Hiệu suất thu hồi

trong khoảng 96,1-97,2%. Độ lặp lại trong ngày và độ tái lập giữa các ngày

<1%. Giới hạn phát hiện là 189 ng/mL và đường chuẩn tuyến tính với hệ số

tương quan R2>0,999. Phương pháp với nhiều ưu điểm: đơn giản, nhanh, dễ

dàng áp dụng và có thể sử dụng để phân tích hàng ngày.

Tác giả E.Deconinck và cộng sự đã phát triển và thẩm định phương

pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng UHPLC để phát hiện và định lượng các chất

cấm trong thực phẩm chức năng giảm cân, bao gồm: sibutramine, modafinil,

ephedrine, nor-ephedrine, metformin, theophyllin, caffeine, diethylpropion

and orlistat. Quá trình tách sắc ký sử dụng cột Vision HT C18-B

(2 mm × 100 mm, 1.5 μm), rửa giải gradient với pha động là đệm acetat pH

5,0 và acetonitril. Các đường chuẩn tuyến tính cho tất cả các chất trong

khoảng nghiên cứu. Độ chệch và độ lệch chuẩn tương đối lần lượt nhỏ hơn

3% và 1,5% cho tất cả các chất.

Trong các kỹ thuật phân tích đã được ứng dụng để phân tích

sibutramine, HPLC là kỹ thuật phổ biến nhất, dễ áp dụng và có độ chính xác

cao. Ngoài ra thiết bị HPLC được trang bị rộng rãi tại các phòng thí nghiệm ở

Việt Nam. Vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp HPLC được lựa để

phân tích sibutramine trong thực phẩm chức năng giảm béo.

1.4. Tổng quan về HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance Liquid Chromatography

– HPLC) là kỹ thuật tách sắc ký trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha

động là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tùy thuộc vào

ái lực của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển với

tốc độ khác nhau, do đó thứ tự rửa giải khác nhau. Thành phần pha động đưa

chất phân tích ra khỏi cột được thay đổi để rửa giải các chất với thời gian hợp

lý [1]

Hình 1.2. Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao.

a. Hệ thống cung cấp pha động:

- Nguốn cấp pha động: pha động trong sắc ký lỏng thường là 2 dung môi

hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp, được chứa

trong bình thủy tinh hoặc thép không rỉ.

- Bộ phận loại khí (degasser): trước khi sử dụng cần lọc (màng lọc 0,45 µm)

và đuổi khí hòa tan trong pha động để tránh việc khí hòa tan có thể làm biến

dạng pic, giảm hiệu lực cột, làm nhiễu đường nền. Có thể loại khí hòa tan

bằng cách: chạy siêu âm, sục khí trơ….

- Bộ phận trộn pha động (mixer): trộn các dung môi ở áp suất thấp hoặc áp

suất cao

- Bơm: về mặt kết cấu có 3 loại thường gặp: Bơm đẩy một pittong, bơm làm

đầy nhanh và bơm kép đẩy kéo.

b. Bộ phận tiêm mẫu:

- Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu

cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu. Vòng

chứa mẫu có dung tích khác nhau: thường dùng loại 0,50÷20 µL. Có vòng

chứa mẫu lớn hơn.

- Ngoài ra, đôi khi người ta tiêm mẫu bằng bơm tiêm qua tấm đệm ở đầu cột.

Khi tiêm phải dừng dòng và áp suất trong cột không cao. Cách tiêm này có độ

lặp lại thấp, sai số lớn hơn so với khi dùng van tiêm.

- Hiện nay hay dùng van tiêm mẫu vì có ưu điểm là sẽ dễ dàng tự động hóa,

cột không bị tắc hay bị làm bẩn bởi các mảnh của vách ngăn, thể tích đưa vào

cột hằng định nên độ lặp lại cao.

c. Cột sắc ký

- Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ,

thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10-30 cm, đường kính trong 4-10 mm.

Cột nhồi thường có hạt cỡ 5-10 µm. Ưu điểm của cột có cột nhồi có hạt cỡ

nhỏ là chạy tốn ít dung môi và ít thời gian và số đĩa lý thuyết lớn.

- Để bảo vệ cột sắc ký, người ta sử dụng cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký

để loại các chất có mặt trong pha động và trong mẫu phân tích làm giảm tuổi

thọ cột. Cột bảo vệ ngắn hơn cột sắc ký, được nhồi hạt cùng loại nhưng kích

thước hạt lớn hơn.

- Sắc ký lỏng phân bố là kỹ thuật sử dụng phổ biến nhất hiện nay. Loại pha

tĩnh phổ biến nhất được chế tạo từ silic dioxid (silica). Nhóm OH trên bề mặt

silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan.

Bề mặt silica Dẫn chất clorosilan Dẫn chất siloxan

Dựa vào độ phân cực tương đối của pha tĩnh và pha động đã hình thành

hai loại sắc ký phân bố là sắc ký phân bố pha thuận và sắc ký phân bố pha đảo.

d. Detector

Trong nghiên cứu này, để quy trình xây dựng được có khả năng ứng

dụng rộng, chúng tôi lựa chọn detector PDA, loại detector phổ biến trong cấu

hình tiêu chuẩn của thiết bị HPLC hiện tại. Về bản chất, đây là một detector

UV-Vis cho phép đồng thời ghi nhận tín hiệu hấp thụ đồng thời trên toàn dải

phổ UV gần và Vis. Dải bức xạ UV-Vis (thường các detector PDA có dải

bước sóng trong khoảng 190 – 800 nm) sau khi đi qua tế bào đo được đưa đến

một cách tử để phân thành các tia đơn sắc đi đến một mảng diod quang. Mỗi

diod quang đón nhận một phần dải bức xạ tương ứng với một khoảng bước

sóng hẹp. Như vậy, mỗi một diod có thể phát hiện một sự hấp thu ở một bước

sóng nhất định. Toàn bộ dãy diod được quét nhiều lần trong 1 giây bởi bộ

phận vi xử lý. Kết quả phổ có thể hiện trên màn hình máy tính hoặc được lưu

trữ để in ra dưới dạng bản phổ bằng máy in.

Ưu điểm của detector này là tạo được phổ UV của các chất phân tích

trong khoảng bước sóng đã chọn, kiểm tra sự tinh khiết của sản phẩm và định

danh được sản phẩm bằng cách so sánh phổ tương ứng của đỉnh sắc ký với

phổ của một ngân hàng dữ liệu hoặc với phổ của chất chuẩn biết trước.

e. Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu

Bộ phận lưu trữ dữ liệu của các thiết bị HPLC hiện nay thường là các

máy vi tính hiện đại có khả năng ghi nhận, lưu giữ, biên tập, xử lý các thông

tin hết sức hiệu quả

Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

- Các mẫu thực phẩm chức năng giảm béo với dạng bào chế: Viên

nang cứng và viên nang mềm

2.1.2. Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu các điều kiện tách, xác định sibutramin bằng HPLC;

- Đánh giá giá trị sử dụng của phương pháp

- Phân tích một số mẫu thực phẩm chức năng giảm béo trên thị

trường Hà Nội;

2.2. Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát lựa chọn các điều kiện tiến hành chạy máy HPLC trong

phân tích sibutramine.

- Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách chiết sibutramine

trong thực phẩm chức năng.

- Đánh giá quy trình phân tích và xử lý mẫu.

+ Tính đặc hiệu và chọn lọc của phương pháp (Specifility/Selectivity)

+ Giới hạn phát hiện (Limit of Detection – LOD)

+ Giới hạn định lượng (Limit of Quatification – LOQ)

+ Khoảng tuyến tính và đường chuẩn (Linearity and Calibration)

+ Độ lặp lại (Repeatability)

+ Độ thu hồi (Recovery)

- Áp dụng quy trình đã xây dựng để xác định chất cấm sibutramine

trong một số sản phẩm thực phẩm chức năng giảm béo bán trên thị trường Hà

Nội.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp lấy mẫu

- Mẫu thực phẩm chức năng giảm béo được lấy ngẫu nhiên trên thị trường

Hà Nội dưới dạng bào chế viên nang cứng và nang mềm.

2.2.2. Phương pháp xử lý mẫu

Dựa vào khả năng hòa tan của sibutramine và tham khảo nhiều bài báo,

nghiên cứu [23], [7], [16], [26], chúng tôi khảo sát khả năng chiết sibutramine

từ nền mẫu bằng các loại các dung môi sau đây: Methanol, ethanol, nước,

acetonitril, aceton.

Quy trình chiết sibutramine trong mẫu thực phẩm chức năng giảm béo

dưới dạng viên nang cứng và viên nang mềm dự kiến gồm các bước sau: cho

đối tượng phân tích là thực phẩm chức năng giảm béo dạng viên nén, viên

nang cứng và nang mềm dự kiến gồm các bước sau:

Đồng nhất mẫu, xác định khối lượng trung bình viên thuốc. Cân chính

xác một lượng mẫu sau khi đồng nhất (cân khoảng 0,3 đến 0,5 mg) vào ống ly

tâm 50 mL.

Thêm khoảng 20 mL dung môi chiết vào ống ly tâm.

Lắc xoáy ống ly tâm 5 - 10 phút, sau đó lắc siêu âm 15-30 phút ở nhiệt

độ phòng.

Ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút. Gạn lấy phần dịch, định mức 25

mL bằng cùng dung môi và lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Tiêm vào hệ sắc ký HPLC (pha loãng nếu cần).

- Sibutramine được chiết ra khỏi nền mẫu bằng các dung môi khác nhau

- Quy trình chiết sibutramine trong mẫu thực phẩm chức năng giảm béo

dưới dạng viên nang cứng và viên nang mềm dự kiến gồm các bước sau: cho

đối tượng phân tích là thực phẩm chức năng giảm béo dạng viên nén, viên

nang cứng và nang mềm dự kiến gồm các bước sau:

Đồng nhất mẫu, xác định khối lượng trung bình viên thuốc. Cân chính

xác một lượng mẫu sau khi đồng nhất (cân khoảng 0,3 đến 0,5 mg) vào ống ly

tâm 50 mL.

Thêm khoảng 15 ml dung môi chiết vào ống ly tâm.

Lắc xoáy ống ly tâm 5 - 10 phút, sau đó lắc siêu âm 15-30 phút ở nhiệt

độ phòng.

Ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút. Gạn lấy phần dịch, định mức

25ml bằng cùng dung môi và lọc qua màng lọc 0,45µm.

Tiêm vào hệ sắc ký HPLC (pha loãng nếu cần)

Hình 2.1. Quy trình phân tích mẫu dự kiến

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích

- Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp xác định sibutramine trong mẫu

thực phẩm chức năng giảm béo tại PTN với các thông số:

Mẫu TPCN chứa chất béo Mẫu TPCN không chứa chất béo

Loại béo

Chiết lặp

HPLC

Cặn

Gạn dịch chiết vào bình định mức

Lắc vortex

Ly tâm 6000 vòng/phút /5 phút

Lọc

Mẫu đã loại chất béo

+ Dung môi chiết

Rung siêu âm + Dung

môi

+ Dung môi

Cân mẫu vào ống ly tâm 50 ml

a. Tính chọn lọc, đặc hiệu

Tính chọn lọc nói lên khả năng xác định đúng chất phân tích khi có mặt

các tạp chất hoặc các chất khác tiến hành như sau.

Để xác định tính đặc hiệu/chọn lọc đối với sắc ký chúng tôi đã tiến

hành phân tích các mẫu trắng phải không cho tín hiệu phân tích, mẫu trắng có

thêm chất chuẩn.

b. Khoảng tuyến tính

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở

đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân

tích. Khoảng làm việc của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ

giữa giới hạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích, tương ứng với nồng độ

chất phân tích có mặt trong nền mẫu.

Sau khi xác định khoảng tuyến tính cần xây dựng đường chuẩn và xác

định hệ số tương quan (R2). Trong phân tích thực tế, có thể xây dựng các

đường chuẩn ngắn, trùm lên vùng nồng độ trong mẫu, không nhất thiết phải

lập đường chuẩn toàn bộ khoảng tuyến tính. Nồng độ trong mẫu không được

vượt ra ngoài giới hạn cao nhất và thấp nhất của đường chuẩn và tốt nhất phải

nằm ở vùng giữa đường chuẩn.

Có nhiều loại đường chuẩn khác nhau tùy thuộc vào các phương pháp

và kỹ thuật khác nhau. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành xây

dựng đường chuẩn với chuẩn tinh khiết.

- Cách xây dựng đường chuẩn trên chuẩn tinh khiết như sau:

Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn, xác định các giá trị tín hiệu y đo được

tương ứng với nồng độ x. Nếu sự phụ thuộc là tuyến tính, ta có khảo sát

đường biểu diễn là một phương trình đường thẳng: y = ax + b.

Trong đó: a là giá trị độ dốc slope

b là giá trị hệ số chặn intercept

c. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện LOD (Limit of detection) là nồng độ thấp nhất của

chất phân tích có thể xác định được nhưng không nhất thiết phải định lượng

được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể. Trong sắc ký LOD có thể được xác

định là nồng độ của chất phân tích mà tại đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân

tích và tín hiệu nền bằng 3 (S/N =3).

Hoặc có thể tính LOD dựa vào độ lệch chuẩn như sau:

Tính giá trị nồng độ trung bình xtb, độ lệch chuẩn SD (S)

LOD = 3.S

1

1

2

N

xx

S

N

ii

Để đánh giá LOD đã tính được ta kiểm tra qua giá trị R = xtb

LOD

Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch đem thử là phù hợp và giá trị

LOD tính được là đáng tin cậy.

Giới hạn định lượng LOQ (Limit of quantification) là nồng độ thấp

nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được về mặt định

lượng với độ đúng và độ chụm nhận được. Trong sắc ký LOQ có thể được xác

định là nồng độ của chất phân tích mà tại đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân

tích và tín hiệu nền bằng 10 (S/N =10). Có thể tính LOQ theo LOD theo công

thức: LOQ = 10/3 * LOD.

d. Độ lặp lại

Độ lặp lại thể hiện sự gần nhau của các kết quả đo, là mức độ thống

nhất của các kết quả thử riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp

lại trên cùng một mẫu. Độ lặp lại được thể hiện bằng độ lệch chuẩn tương đối

RSD. Tiến hành thí nghiệm lặp lại 6 lần. Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD%

của hàm lượng chất phân tích. Các công thức tính toán như sau:

Tiến hành thí nghiệm n lần lặp lại.

+ Giá trị trung bình :

n

1iix

n

1x

Trong đó x là giá trị trung bình số học của tập hợp các giá trị xi còn xi

là giá trị kết quả của mỗi lần thí nghiệm.

+ Độ lệch chuẩn :

1n

)xx(

SD

2n

1ii

+ Độ lệch chuẩn tương đối: 100

X

SDRSD

e. Độ đúng

Độ đúng đánh giá sự phù hợp của kết quả thực nghiệm so với giá trị

thực (true value) hoặc được chấp nhận thực (accepted value).

- Phân tích mẫu chuẩn (vật liệu chuẩn): Mẫu đã biết trước nồng độ của

chất phân tích. Kết quả tính ra độ chệch:

Độ chệch =

xx 100

x : kết quả phân tích được

: giá trị đúng của chất phân tích

Trong trường hợp tham gia phân tích các mẫu thử nghiệm liên phòng

thí nghiệm, có thể đánh giá kết quả thông qua giá trị Zscore. Zscore được tính như

sau:

Zscore =

x

Trong đó: là độ lệch chuẩn tham chiếu

Nếu |Zscore| ≤ 2: Kết quả được chấp nhận

2 < |Zscore| ≤ 3: Kết quả có nghi ngờ

|Zscore| > 3: Kết quả có sai lệch.

f. Khảo sát độ thu hồi: Độ thu hồi được xác định dựa trên kĩ thuật thêm

chuẩn. Lượng chất chuẩn thêm vào mẫu phân tích phải đảm bảo sao

cho nồng độ của chất cần nghiên cứu sau khi thêm chuẩn nằm trong

khoảng đã khảo sát. Độ thu hồi (R%) được tính như sau:

100C

CC%R

c

mcm

Trong đó: Cm+c: Nồng độ trong mẫu thêm chuẩn

Cm: Nồng độ trong mẫu

Cc: Nồng độ chuẩn thêm

2.4. Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả thu được trong quá trình tiến hành nghiên cứu đều được xử

lí bằng các phần mềm có sẵn trong thiết bị HPLC

Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích nhờ các hàm

toán học, thống kê có sẵn trong phần mềm tin học Microsoft Office Excel để

tính toán: kết quả trung bình, độ lệch, độ lệch chuẩn, phương sai, độ lệch

chuẩn tương đối, hệ số biến thiên, độ thu hồi khi xử lý các kết quả thực

nghiệm và đánh giá thẩm định phương pháp.

2.5. Hóa chất, thiết bị

2.5.1. Hóa chất

- Chất đối chiếu sibutramine hydroclorid monohydrat (Sigma - Adrich)

(Số kiểm soát: MFCD04039806; hàm lượng: ≥98% (HPLC)).

- Chất đối chiếu furosemid (Số kiểm soát: MFCD00010549; hàm

lượng: 99%).

- Chất đối chiếu phenolphthalein (Số kiểm soát: MFCD00070132; hàm

lượng: ≥85% (TLC) ).

- Dung môi loại tinh khiết cho HPLC: Methanol, acetonitril,

tetrahydrofuran (Merck).

- Dung môi loại tinh khiết phân tích: Ethanol, aceton (Merck)

- Hóa chất tinh khiết phân tích: Kali dihydrophosphat (Merck), amoni

acetat (Merck).

- Nước cất 2 lần

- Dung dịch chuẩn sibutramine gốc 500 µg/ml: Cân chính xác một

lượng chất đối chiếu sibutramine hydroclorid monohydrat tương đương

khoảng 50,0 mg sibutramine vào cốc có mỏ 50 ml, hòa tan bằng 20 ml

methanol và chuyển vào bình định mức 100 ml, dùng methanol tráng cốc,

chuyển dịch tráng cốc vào cùng bình định mức, thêm methanol vừa đủ đến

vạch, lắc kỹ. Bảo quản trong tủ lạnh.

- Dung dịch chuẩn làm việc: Hút chính xác 40,0 ml dung dịch chuẩn

gốc vào bình định mức 100 ml, thêm methanol vừa đủ (dung dịch chuẩn làm

việc có nồng độ sibutramine 200 µg/ml).

- Các dung dịch chuẩn sibutramine có nồng độ nhỏ hơn được pha từ

dung dịch chuẩn làm việc.

- Dung dịch đánh giá độ phân giải: Chuẩn bị dung dịch hỗn hợp

sibutramine, furosemid và phenolphthalein trong methanol có nồng độ mỗi

chất là sibutramine 200 µg/mL, furosemid 100 µg/mL, phenolphthalein 100

µg/mL.

- Dung dịch đệm amoni acetat 0,05 M (pH = 3,5): Cân chính xác

khoảng 1,93 g muối amoni acetat hoà tan vào khoảng 400 mL nước, chỉnh

đến pH = 3,5, định mức 500 mL, lọc qua màng lọc 0,2 µm.

- Dung dịch đệm kali dihydrophosphat 0,05M (pH 4,0): Cân chính xác

khoảng 3,4 g muối kali dihydrophosphat, hòa tan vào khoảng 400 mL nước,

thêm 5mL tetrahydrofuran, chỉnh đến pH 4,0 bằng dung dịch acid phosphoric

5%, định mức bằng nước cất 2 lần tới 500 mL, lọc qua màng lọc 0,2 µm.

2.5.2.Thiết bị, dụng cụ

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu (LC 20AD)

trang bị detector PDA.

- Cột sắc ký C18 Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm; 5 µm).

- Cân kỹ thuật XT1200c.

- Cân phân tích Mettler Toledo có độ chính xác 0,0001 g và 0,00001 g.

- Máy đo pH: pH Meter 744.

- Máy lắc siêu âm Elma.

- Máy ly tâm Hermle Z383K

- Máy lắc Vortex IKA

- Dụng cụ thủy tinh các loại: Bình định mức 20 ml, 50 ml, cốc có mỏ,

pipet các loại, autopipet 1000 μl, 200 μl.

- Ống ly tâm 50 ml

- Phễu lọc, giấy lọc, màng lọc 0,45 µm, 0,2µm.

Hình 2.2. Thiết bị HPLC Shimadzu (LC 20AD)

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tối ưu các điều kiện tách và xác định Sibutramine bằng HPLC

3.1.1. Lựa chọn bước sóng hấp thụ ánh sáng

Dựa vào tính chất của sibutramine hấp thụ ánh sáng trong vùng tử

ngoại, tiến hành quét phổ bằng detector PDA để chọn bước sóng phù hợp cho

nghiên cứu. Phổ Sibutramine được quét từ bước sóng 192 nm đến 360 nm thu

được sắc đồ như sau:

Hình 3.1 : Sắc ký đồ PDA của sibutramine

Qua kết quả tại hình 3.1 ta thấy sibutramine có cực đại hấp thụ ở

190nm và 225nm với độ tinh khiết pic > 99 %. Tuy nhiên, để giảm nhiễu tạp

chúng tôi chọn bước sóng 225nm để định lượng, với bước sóng này có thể

dùng detector UV để thay thế trong trường hợp không có detector PAD.

Việc dùng detector PDA không những dùng để định lượng mà trong

quá trình phân tích để khẳng định sự có mặt của chất phân tích chúng ta có

thể kết hợp được đồng thời xem dải bước sóng và xem được hình dạng phổ

của chất phân tích. Đặc biệt, trong nhóm các hoạt chất TPCN giảm béo có

chứa rất nhiều các chất thuộc nhóm giảm béo có khả năng hấp thụ tại bước

sóng 225 nm, nếu chỉ dựa vào thời gian lưu để khẳng định chất đó là

sibutramine có thể dễ bị nhầm lẫn. Vì vậy, khi kết hợp giữa thời gian lưu và

hình dạng phổ hấp thụ có thể khẳng định chính xác chất cần phân tích. Do đó,

trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng detector PDA để xác định chất

phân tích.

3.1.2. Lựa chọn một số điều kiện sắc ký

Qua tham khảo một số nghiên cứu của các tác giả trên thế giới và tiến

hành thử nghiệm sơ bộ tại phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn được một số

điều kiện phân tích trên HPLC như sau:

- Cột C18 Symestry: dài 250mm; đường kính cột: 4,6 mm; cỡ hạt: 5µm

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Thể tích tiêm mẫu: 50 µl

- Detector: PDA quét dải phổ từ bước sóng 200 nm đến 450 nm

- Bước sóng phát hiện: 225 nm

- Nhiệt độ cột: 300C

Các thông số này sẽ được giữ cố định khi thực hiện các thí nghiệm

khảo sát để lựa chọn điều kiện pha động để tách sibutramine.

3.1.3 Khảo sát pha động

Các hoạt chất có nguy cơ bổ sung vào phẩm thực phẩm chức năng giảm

béo ngoài sibutramine còn có thể là furosemid và phenolphthalein. Qua tham

khảo tài liệu và nghiên cứu sơ bộ cho thấy, sibutramine khi chạy ở chế độ

đẳng dòng khó tách được khỏi hỗn hợp có furosemid và phenolphthalein. Vì

vậy, việc tiến hành nghiên cứu các điều kiện gradient với các loại dung môi

khác nhau để có tách được chất phân tích tốt. Qua tham khảo các tài liệu

nghiên cứu trên thế giới chúng tôi lựa chọn 4 hệ dung môi với các thành phần

như bảng 3.1 để khảo sát:

Bảng 3.1 Thành phần hệ dung môi pha động

Thành phần pha động

Hệ pha động 1 Kênh A: Amoni acetat (0,05 M, pH = 3,5)

Kênh B: Methanol

Hệ pha động 2 Kênh A: Amoni acetat (0,05 M, pH = 3,5)

Kênh B: Acetonitril

Hệ pha động 3 Kênh A: Kali dihydrophosphat (0,05M, pH = 4,0)

Kênh B: Methanol

Hệ pha động 4 Kênh A: Kali dihydrophosphat (0,05 M, pH = 4,0)

Kênh B: Acetonitril

Tiến hành khảo sát khả năng tách của riêng sibutramine và tách

sibutramine khi có mặt cả furosemid và phenolphthalein bằng cách chuẩn bị

dung dịch chuẩn sibutramine 100 µg/ml và hỗn hợp chứa sibutramine,

furosemid, phenolphthalein với các nồng độ tương ứng, sử dụng chương trình

gradient như bảng 3.2 với các hệ pha động khác nhau thu được các kết quả

như sau:

- Hệ pha động 1: Kênh A: Amoni acetat (0,05 M, pH = 3,5)

Kênh B: Methanol với gradient theo bảng .

Bảng 3.2 Chương trình gradient của hệ pha động Amoni acetat - methanol

Thời gian (phút)

Tỷ lệ pha động (%)

Kênh A : Amoni acetat

(hoặc đệm phosphat)

Kênh B : Acetonitril

(hoặc methanol)

0,1 80 20

1 80 20

3 60 40

11 50 50

12 50 50

13 80 20

17 80 20

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

0

100

200

mAU225nm,4nm (1.00)

/14.6

68/6

094832

sibutramin

Hình 3.2: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramine với hệ pha động 1

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

0

250

500

750

1000

mAU225nm,4nm (1.00)

/10.6

54/1

7033625

/12.1

36/2

0092699

/14.8

00/7

233554

Hình 3.3: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với hệ pha động 1

Qua kết quả khảo sát (hình 3.2) và (hình 3.3) cho thấy sibutramine

được tách khỏi hỗn hợp chứa furosemid và phenolphthalein nhưng tín hiệu

đường nền không được tốt, pic sibutramine bị doãng chân và kéo đuôi

- Hệ pha động 2: Kênh A: Amoni acetat (0,05 M, pH = 3,5)

Kênh B: Acetonitril

Tiến hành khảo sát theo chương trình gradient bảng 3.2.

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

-100

0

100

200

mAU225nm,4nm (1.00)

/12.1

42/5

195574

Hình 3.4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramine với hệ pha động 2

sibutramin

sibutramin

phenolphtalein

furosemid

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

0

500

1000

1500mAU

225nm,4nm (1.00)

/8.5

89/1

4460208

/9.8

55/1

8460828

/12.1

51/6

869873

Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với hệ pha động 2

Kết quả khảo sát (hình 3.4) và (hình 3.5) cho thấy sibutramine tách

được ra khỏi hỗn hợp chứa furosemid và phenolphthalein nhưng tín hiệu

đường nền vẫn không được tốt, pic sắc ký sibutramine vẫn bị doãng chân và

bị kéo đuôi.

- Hệ pha động 3: Kênh A: Kali dihydrophosphat (0,05M, pH = 4,0)

Kênh B: Methanol

Tiến hành khảo sát đối với dung dịch chuẩn sibutramine 100 µg/ml và

hỗn hợp chuẩn chứa sibutramine, furosemid và phenolphthalein với nồng độ

tương ứng với chương trình gradient như bảng 3.3 kết quả thu được như sau:

Bảng 3.3 Chương trình Gradient hệ pha động đệm phosphat - methanol

Thời gian (phút) Thành phần pha động (%)

Kênh A: Đệm phosphat Kênh B: Metanol

0,1 80 20

1 80 20

3 50 50

9 20 80

11 20 80

12 80 20

16 80 20

sibutramin

phenolphtalein

furosemid

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min

0

50

100

150

200

mAU225nm,4nm (1.00)

/13.4

22/3

600172

Hình 3.6: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramine với pha động 3

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min

0

500

1000

mAU225nm,4nm (1.00)

/10.4

08/7506226

/11.5

67/2

2165545

/13.3

64/3441493

Hình 3.7: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với hệ pha động 3

Kết quả khảo sát cho thấy pic sibutramine thu được gọn, cân xứng và

trong hỗn hợp các chất phân đã tách ra khỏi nhau hoàn toàn (hình 3.6 và hình

3.7). Tuy nhiên, trong quá trình thực nghiệm chúng tôi nhận thấy với hệ pha

động này áp suất hệ thống tăng khá cao vậy chúng tôi tiếp tục nghiên cứu thay

methanol bằng acetonitril với hệ pha động 4 như sau:

- Hệ pha động 4: Kênh A: Kali dihydrophosphat (0,05 M, pH = 4,0)

Kênh B: Acetonitril

Tương tự như trên, tiến hành khảo sát đối với dung dịch chuẩn

sibutramine 100 µg/ml và hỗn hợp chuẩn chứa sibutramine, furosemid và

phenolphthalein với chương trình gradient như bảng 3.2 thu được kết quả như

sau:

sibutramin

sibutramin furosemid

phenolphtalein

Hình 3.8: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn với hệ pha động 4

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

0

250

500

750

1000mAU

225nm,4nm (1.00)

/9.4

62/7

171036

/12.6

29/2

2074439

/14.7

56/3

320950

Hình 3.9: Sắc ký đồ dung dịch đánh giá độ phân giải với hệ pha động 4

Kết quả khảo sát cho thấy pic sibutramine thu được gọn, cân xứng như

hệ pha động 3, đồng thời sibutramine cũng được tách riêng khỏi furosemid và

phenolphthalein (Hình 3.9).

Kết luận: Trong 04 hệ pha động được khảo sát, hệ pha động 4 với

kênh A là kali dihydrophosphat (0,05 M, pH = 4,0) và kênh B là acetonitril,

với chương trình gradient như ở bảng 3.2 cho thấy sibutramine tách tốt ra

khỏi hỗn hợp chứa furosemid và phenolphtalein. Đồng thời píc của

sibutramine gọn, cân xứng và áp suất của hệ thống ổn định. Do đó, chúng tôi

chọn hệ pha động 4 với chương trình gradient (bảng 3.2) trong quá trình phân

tích định lượng sibutramine.

Từ các lựa chọn và kết quả khảo sát trên, tổng hợp các điều kiện để

phân tích sibutramine trên hệ thống sắc ký HPLC như sau:

- Cột C18 Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm; 5 µm).

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

0

100

200

300

400

500

600

700

mAU225nm4nm (1.00)

/14.41

5/807

9449

sibutramin furosemid

phenolphtalein

- Sử dụng chế độ gradient với thành phần như (bảng 3.2), cùng với pha

động: Kênh A là kali dihydrophosphat (0,05 M; pH = 4,0) và kênh B là

acetonitril.

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Thể tích tiêm mẫu: 50 µl

- Detector: PDA quét dải phổ từ bước sóng 200 nm đến 450 nm

- Bước sóng phát hiện: 225 nm

- Nhiệt độ cột: 300C

3.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu

Để khảo sát quy trình chiết sibutramine tiến hành hành khảo sát dung

môi chiết, thời gian chiết và khảo sát điều kiện loại béo với loại viên nang

mềm cụ thể thực hiện như sau:

Để khảo sát chiết sibutramine ra khỏi nền mẫu bằng các dung môi khác

nhau như: nước, methanol (MeOH), ethanol (EtOH), aceton và acetonitril

(ACN) với hai dạng bào chế, mỗi loại sử dụng một mẫu đại diện như sau:

viên nang cứng mẫu mã số NC07 và viên nang mềm mẫu mã số NM07 các

mẫu này qua khảo sát sơ bộ được biết có chứa sibutramine trái phép đem khảo

sát để đánh giá hiệu quả chiết tách của 05 loại dung môi trên.

Mẫu sau khi chiết, được rung siêu âm và ly tâm. Dịch chiết được gộp

vào bình định mức 25 ml, lọc và được phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng

hiệu năng cao với detector PDA, với quy trình phân tích như sơ đồ (hình 2.1).

3.2.1. Khảo sát dung môi chiết với viên nang cứng

Mẫu viên nang cứng NC07 (đã xác định sơ bộ có chứa sibutramine) sau

khi chiết bằng các dung môi khác nhau được thể hiện ở bảng 3.4.

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát dung môi chiết sibutramine cho mẫu viên nang

cứng

Dung môi

Lượng

cân

mẫu

(g)

Thể tích

dung

môi

(ml)

Hệ số

pha

loãng

Diện tích

pic

(mAU.s)

Nồng độ

sibutramine

trong dung

dịch thử

(µg/ml)

Hàm lượng

Sibutramine

trong mẫu

(mg/g)

Hàm

lượng TB

(mg/g)

Aceton-01 0,3161 25 5 2432033 50,3 19,9 21,6

Aceton-02 0,3489 25 5 3130751 64,8 23,2

MeOH-01 0,2978 25 5 3162134 65,4 27,5 26,4

MeOH-02 0,3001 25 5 2933162 60,7 25,3

ACN-01 0,3432 25 5 2616370 54,1 19,7 20,8

ACN-02 0,3599 25 5 3038800 62,9 21,8

EtOH-01 0,3159 25 5 2984704 61,8 24,4 22,2

EtOH-02 0,3597 25 5 2767511 57,26 19,9

Nước-01 0,3048 25 5 981681 20,31 8,3 8,5

Nước-02 0,3227 25 5 1081464 22,38 8,7

Hình 3.10: Biểu đồ biểu diễn hiệu quả chiết sibutramine trong mẫu

viên nang cứng

Từ kết quả khảo sát trên cho thấy, viên nang cứng chứa sibutramine

được chiết bằng dung môi MeOH cho hiệu quả chiết cao nhất. Do đó, chúng

tôi chọn dung môi chiết là MeOH đối với mẫu viên nang cứng.

3.2.2 Khảo sát dung môi chiết với viên nang mềm

Tiến hành khảo sát tương tự với viên nang cứng như kết quả khảo sát

thông qua mẫu viên nang mềm NM07 (đã xác định sơ bộ có chứa

sibutramine) thu được kết quả như bảng 3.5 và biểu đồ hình 3.11.

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát dung môi chiết sibutramine mẫu viên nang mềm

Dung môi

Lượng

cân

mẫu

(g)

Thể

tích

dung

môi

(ml)

Hệ số

pha

loãng

Diện tích

pic

(mAU.s)

Nồng độ

sibutramin

trong dung

dịch thử

(µg/ml)

Hàm lượng

sibutramine

trong mẫu

(mg/g)

Hàm

lượng

TB

(mg/g)

EtOH-01 0,4324 25 5 4650782 88,7 25,7 26,3

EtOH-02 0,4546 25 5 5138888 98,1 26,9

MeOH-01 0,4505 25 5 5478145 104,5 29,0 29,9

MeOH-02 0,4476 25 5 5982226 110,1 30,7

ACN-01 0,4613 25 5 5206367 99,4 26,9 26,6

ACN-02 0,4472 25 5 4922718 93,9 26,3

Aceton-01 0,4379 25 5 4698056 89,7 25,6 26,4

Aceton-02 0,4325 25 5 4928119 94,0 27,2

Nước-01 0,4730 25 5 3316977 63,3 16,7 17,6

Nước-02 0,4543 25 5 3525240 67,3 18,5

Hình 3.11: Biểu đồ biểu diễn hiệu quả chiết sibutramine trong mẫu

viên nang mềm

Từ kết quả khảo sát trên cho thấy, viên nang mềm chứa sibutramine

được chiết bằng dung môi MeOH cho hiệu quả chiết cao nhất.

Kết luận: Qua khảo sát thực nghiệm cho thấy ở cả viên nang cứng và

viên nang mềm khi chiết bằng dung môi methanol cho hiệu quả chiết

sibutramine ra khỏi mẫu là cao nhất. Hơn nữa trong quá trình chiết với

methanol, mẫu cũng trong nhất và ít cắn nhất.

3.2.3 Khảo sát thời gian chiết mẫu

Cân chính xác khoảng 0,5g mẫu trắng sau khi đã được đồng nhất cho

vào ống ly tâm 50ml, thêm một lượng chuẩn xác định rồi lắc đều và để yên

khoảng 30 phút. Sau đó thêm 15ml Methanol, đậy kín nắp, lắc đều, đem rung

siêu âm. Đem ly tâm và gạn lấy lớp dịch trong phía trên. Chiết lại lần 2 với

10ml methanol. Gộp dịch chiết và định mức đủ 25ml. Lọc lấy dịch và phân

tích trên hệ thống HPLC. Tiến hành khảo sát tại các khoảng thời gian khác

nhau. Kết quả thu được như sau:

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu

STT Thời gian (phút) Spic thu được Trung bình

01 5

836577 831703

02 826829

03 10

912515 923391

04 934267

05 15

963057 979067

06 996157

07 20

1022851

1029493 08 1036134

09 25

1044910 1033827

10 1022743

Hình 3.12. Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng TPCN thêm chuẩn siêu âm trong 5 phút

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

mAU225nm,4nm (1.00)

/14.02

2/836

577

Hình 3.13. Sắc đồ phân tích mẫu trắng TPCN thêm chuẩn siêu âm trong 10 phút

Hình 3.14. Sắc đồ phân tích mẫu trắng TPCN thêm chuẩn siêu âm trong 15 phút

Hình 3.15. Sắc đồ phân tích mẫu trắng TPCN thêm chuẩn siêu âm trong 20 phút

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

mAU225nm,4nm (1.00)

/14.

153/

1036

134

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225mAU

225nm,4nm (1.00)

/14.13

4/996

157

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225mAU

225nm,4nm (1.00)

/14.

021/

9125

15

Hình 3.16. Sắc đồ phân tích mẫu trắng TPCN thêm chuẩn siêu âm trong 25 phút

Kết quả khảo sát cho thấy, khoảng thời gian từ 20 phút đến 25 phút

cho hiệu quả chiết tốt nhất, khoảng thời gian từ 5 phút đến 15 phút cho hiệu

quả chiết kém hơn. Tuy nhiên nếu thời gian chiết mẫu từ 25 phút sẽ không

tàm tăng đáng kể hiệu quả chiết mà có thể bị nhiều tạp chất chiết cùng. Vì vậy

chúng tôi lựa chọn thời gian rung siêu âm để chiết chất phân tích sibutramine

trong thực phẩm chức năng giảm béo là 20 phút.

Tuy nhiên với viên nang mềm do có chứa béo cao nên nếu không loại

béo trước pic dễ bị ảnh hưởng bởi nền dẫn đến kết quả không chính xác vì

vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu thêm việc loại béo với viên nang mềm

3.2.4 Khảo sát quy trình loại béo trong mẫu thực phẩm chức năng

Các dạng thực phẩm chức năng viên nang mềm chứa rất nhiều chất

béo, cần được loại bỏ để làm sạch mẫu. Chúng tôi lựa chọn quy trình xử lý

mẫu giống như với viên nang cứng và có khảo sát thêm một số điều kiện loại

béo. Kết quả thực nghiệm thu được như sau:

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

mAU225nm,4nm (1.00)

/14.

166/

1044

910

Bảng 3.7. Kết quả khảo sát dung môi loại béo

TT Dung môi Spic thu được Trung bình

01 n-Hexan

833710 837711

02 841711

03 diethyl ether

853924 857146

04 860367

05 n-Hexan (trong môi trường HCl)

1037413 1024595

06 1011787

07 Diethyl ether (trong môi trường HCl)

1048246 1038394

08 1028542

Hình 3.17. Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng TPCN nang mềm chưa loại béo

Hình 3.18. Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng TPCN nang mềm đã loại béo

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

-500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000mAU

225nm,4nm (1.00)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

-500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

mAU225nm,4nm (1.00)

Hình 3.19. Sắc ký đồ mẫu trắng TPCN nang mềm thêm chuẩn 200 µg/ml loại béo bằng n-Hexan (H+)

Nhận xét: Khi loại béo bằng dung môi hữu cơ (n-hexan và diethyl

ether) kết hợp với acid hóa dung dịch chiết mẫu (bằng acid HCl) sẽ cho hiệu

quả chiết tốt hơn nhiều so với khi chỉ loại béo bằng dung môi hữu cơ. Điều

này có thể giải thích do sibutramine có có gốc N nên mang tính kiềm yếu. Vì

vậy trong môi trường acid thì chất phân tích sibutramin tồn tại dưới dạng

muối hydrochlorid, hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ loại béo.

Với hiệu quả tương đương nhau nên chúng tôi lựa chọn dung môi n-hexan để

loại béo vì dung môi diethyl ether có mùi khó chịu độc hơn, dễ bay hơi và dễ

cháy nổ hơn.

3.3. Thẩm định phương pháp phân tích

3.3.1. Độ đặc hiệu, độ chọn lọc.

Để đánh giá độ đặc hiệu của quy trình phân tích và xử lý mẫu, chúng

tôi đã tiến hành phân tích trong điều kiện lựa chọn và khảo sát tối ưu như ở

mục 3.1.1 Các dung dịch chuẩn sibutramine, dung dịch đánh giá độ phân giải,

mẫu thực phẩm chức năng không chứa sibutramine và mẫu thực phẩm chức

năng không chứa sibutramine được thêm chuẩn sibutramine (02 mẫu sau được

xử lý theo quy trình ở mục 3.2). Kết quả phân tích cho thấy, sắc ký đồ của

dung dịch đánh giá độ phân giải cho 3 pic của sibutramine, furosemid và

phenolphthalein được tách riêng biệt (Hình 3.20); trên sắc ký đồ của mẫu thực

phẩm chức năng không chứa sibutramine không xuất hiện pic nào có cùng

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

mAU225nm,4nm (1.00)

/15.10

2/101

1787

thời gian lưu với pic của sibutramine trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn

sibutramine (Hình 3.22). Đồng thời trên sắc ký đồ của mẫu thực phẩm chức

năng thêm chuẩn sibutramine xuất hiện pic sibutramine được tách riêng rẽ

(Hình 3.23). Như vậy, quy trình đã thiết lập đáp ứng được yêu cầu về độ đặc

hiệu khi phân tích sibutramine.

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

0

500

1000

mAU225nm,4nm (1.00)

/9.1

56/9

594887

/12.4

68/2

6377525

/14.4

39/7

519153

Hình 3.20: Sắc ký đồ dung dịch đánh giá độ phân giải.

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

0

100

200

300

mAU225nm,4nm (1.00)

/14.4

15/8

079449

Hình 3.21: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramine 200 µg/ml

sibutramin

phenolphtalein

furosemid

sibutramin

0.0 5.0 10.0 15.0 min

0

50

100

150

200

250

mAU225nm,4nm (1.00)

Hình 3.22: Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng TPCN giảm béo.

0.0 5.0 10.0 15.0 min

-25

0

25

50

75

100

125

150

mAU225nm,4nm (1.00)

/14.29

0/250

1293

Hình 3.23: Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng TPCN thêm chuẩn

sibutramine 200µg/ml.

3.3.2. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

Trong phương pháp phân tích này để phù hợp với mục đích phát hiện

sibutramine trong các thực phẩm giảm béo ta tiến hành xác định LOD như sau

pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc nhiều lần bằng dung dịch

methanol cho đến khi không còn thu được đáp ứng pic của sibutramine trên

sắc ký đồ. Kết quả thực nghiệm cho thấy, ở mức nồng độ sibutramine lần lượt

là 0,2 µg/ml và 0,5 µg/ml (nồng độ dung dịch tiêm sắc ký), trên sắc ký đồ cho

pic sibutramine có đáp ứng cao khoảng gấp 3 lần (Hình 3.25) và 10 lần (Hình

3.24) dao động đường nền. Như vậy, phương pháp đã xây dựng có giới hạn

phát hiện (LOD) là 0,2 µg/ml, còn giới hạn định lượng (LOQ) là 0,5 µg/ml,

tính theo nồng độ dung dịch tiêm sắc ký.

sibutramin

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

-10

0

10mAU

225nm,4nm (1.00)

/14.5

41/4

8677

Hình 3.24 Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng TPCN thêm chuẩn sibutramine

0,5 µg/ml.

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

-10

-5

0

5

mAU225nm,4nm (1.00)

/14.5

83/1

9893

Hình 3.25 Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng TPCN thêm chuẩn sibutramine

0,2 µg/ml

3.3.3. Khoảng tuyến tính

Mối quan hệ giữa nồng độ sibutramine trong dung dịch tiêm sắc ký và

đáp ứng pic đã được khảo sát trong khoảng nồng độ từ 1 µg/ml đến 400

µg/ml. Kết quả đánh giá thực nghiệm (Bảng 3.8) cho thấy tại nồng độ 200

µg/ml đường tuyến tính có xu hướng cong (Hình 3.26). Do đó ta xây dựng

đường chuẩn trong khoảng từ 1 µg/ml đến 200 µg/ml (Hình 3.27).

Bảng 3.8. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính

Nồng độ

(µg/ml) 1 2 5 10 20

Diện tích pic

(mAU.s) 101474 190029 445807 802296 1619762

Nồng độ

(µg/ml) 50 100 200 300 400

Diện tích pic

(mAU.s) 3941470 7980841 15731022 21450329 25742737

Hình 3.26 Khoảng tuyến tính sự phụ thuộc giữa diện tích pic vào nồng độ

của sibutramine

y = 78625x + 25766

R2 = 0.9999

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

16000000

18000000

0 50 100 150 200 250

C

Diện

tích

pic

Hình 3.27 Đường chuẩn sự phụ thuộc giữa diện tích pic vào nồng độ

của sibutramine

Ngoài ra, để khảo sát thêm độ phù hợp của đường chuẩn, từ đường

chuẩn thu được và từ diện tích pic chúng tôi đã tính lại nồng độ tương ứng

của sibutramine, từ đó xác định các giá trị độ lệch so với điểm chuẩn ban đầu.

Kết quả được thể hiện ở bảng 3.9.

Bảng 3.9: Độ lệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn

Nồng độ ban đầu (µg/ml)

Diện tích pic (mAU.s)

Nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm

chuẩn (µg/ml)

Độ lệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường

chuẩn (%)

200 15731022 199,75 -0,13

100 7980841 101,18 1,18

50 3841470 48,5 -2,94

20 1619762 20,27 1,37

10 802296 9,87 -1,24

5 445807 5,34 6,85

2 190029 2,09 4,46

1 101474 0,96 -,3,7

Nhận xét: Từ các kết quả ở bảng và hình 3.26 trên ta thấy: đường chuẩn

có R2=0,9999, các giá trị độ lệch so với điểm chuẩn ban đầu cũng đều nằm

trong giới hạn ±15% theo yêu cầu của nhiều tổ chức Mỹ, Canada, AOAC [3].

Như vậy, đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic với

nồng độ sibutramine tương ứng là đạt yêu cầu và được chấp nhận.

3.3.4. Độ lặp lại của hệ thống

Bớm 6 lần dung dịch chuẩn sibutramine 200 µg/ml vào máy HPLC.

Kết quả phân tích (Bảng 3.10) cho thấy độ lặp lại tốt với pic sibutramine cả về

thời gian lưu (RSD = 0,01%) và diện tích pic (RSD = 0,02 %), trong khi yêu

cầu của AOAC là nhỏ hơn 5,3% [3]. Như vậy, hệ thống sắc ký với các điều

kiện đã thiết lập thích hợp cho việc phân tích sibutramine.

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ lặp lại của hệ thống

Lần phân

tích

Thời gian lưu

(phút)

Diện tích pic

(mAU.s)

Lần 1 14,415 8079449

Lần 2 14,419 8079268

Lần 3 14,418 8079027

Lần 4 14,416 8079052

Lần 5 14,417 8078427

Lần 6 14,418 8075040

TB 14,417 8078377

SD 0,0015 1670,884

RSD (%) 0,01 0,02

3.3.5. Độ đúng của phương pháp

Độ đúng của phương pháp được đánh giá bằng cách thêm chuẩn

sibutramine vào nền mẫu thực phẩm giảm béo không chứa sibutramine qua

đánh giá sơ bộ và xác định tỷ lệ (%) thu hồi của chuẩn sibutramine khi xử lý

mẫu và phân tích theo quy trình đã xây dựng. Độ đúng của phương pháp được

thẩm định trên 1 nền mẫu nang mềm NM01 và 1 nền mẫu nang cứng NC01.

Kết quả phân tích thực nghiệm được thể hiện trong Bảng 3.11 với nền mẫu

nang mềm và Bảng 3.12 với nền mẫu nang cứng.

Bảng 3.11 Độ thu hồi của phương pháp với viên nang mềm

Lần phân

tích

Lượng

chuẩn

sibutramin

thêm vào

(g)

Diện tích

(mAU.s)

Lượng

chuẩn

sibutramin

tìm lại được

(g)

Độ thu hồi

(%)

01 10,00 897905 9,9 99,3

02 10,00 902320 9,98 99,8

03 10,00 903748 9,99 99,9

04 10,00 902215 9,97 99,7

05 10,00 903151 9,98 99,8

06 10,00 853924 9,44 94,4

07 10,00 859866 9,51 95,1

08 10,00 841711 9,30 93,1

Trung bình 9,76

SD 0,29

RSD (%) 3,0

Bảng 3.12 Độ thu hồi của phương pháp với viên nang cứng

Lần phân

tích

Lượng chuẩn

sibutramine

thêm vào (g)

Diện tích

(mAU.s)

Lượng chuẩn

sibutramine

tìm lại được

(g)

Độ thu hồi

(%)

01 10,00 926473 10,12 101,2

02 10,00 943482 10,29 103,0

03 10,00 943339 10,29 102,9

04 10,00 937114 10,23 102,3

05 10,00 897459 9,82 98,3

06 10,00 891379 9,76 97,6

07 10,00 977657 10,64 106,5

08 10,00 964331 10,51 105,1

09 10,00 930577 10,16 101,6

10 10,00 893733 9,79 97,9

Trung bình 10,16

SD 0,3

RSD (%) 3,0

Nhận xét: Theo AOAC, tại mức nồng độ 100 ppb-10 µg/mL, độ thu

hồi của phương pháp phải đạt là 80-110% [3]. Từ bảng kết quả trên ta thấy

sibutramin có hiệu suất thu hồi đều nằm trong giới hạn cho phép. Như vậy

phương pháp có độ thu hồi đạt yêu cầu của AOAC khi phân tích sibutramin

trong viên nang.

3.3.6. Độ lặp lại của phương pháp

Khảo sát trên 1 nền mẫu nang cứng (NC07) và 1 nền mẫu nang mềm

(NM07) có phát hiện sibutramin. Xử lý mẫu và tiêm mẫu vào hệ thống HPLC

ở các điều kiện đã chọn. Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua

độ lệch chuẩn và độ lệch chuẩn tương đối. Kết quả phân tích thực nghiệm

được tập hợp trong Bảng 3.13 với nền mẫu nang cứng và Bảng 3.14 với nền

mẫu nang mềm.

Bảng 3.13 Độ lặp lại của phương pháp với viên nang cứng

Lần

phân

tích

Khối

lượng

cân

(g)

Thể tích

dung môi

chiết (mL)

Hệ số

pha

loãng

Diện tích

pic

(mAU.s)

Nồng độ

trong dung

dịch

(µg/mL)

Hàm

lượng

(mg/g)

01 0,2666 25 5 5406378 71,4 33,5

02 0,3148 25 5 6298576 83,7 33,3

03 0,2629 25 5 5256054 69,4 33,0

04 0,2650 25 5 5397384 71,3 33,6

05 0,2622 25 5 5032518 66,3 31,6

06 0,2404 25 5 4681806 61,5 32,0

TB (mg/g) 32,8

SD 0,8

RSD (%) 2,6

Bảng 3.14 Độ lặp lại của phương pháp với viên nang mềm

Lần

phân

tích

Khối

lượng

cân (g)

Thể tích

dung môi

chiết (mL)

Hệ số

pha

loãng

Diện tích

(mAU.s)

Nồng độ

trong

dung dịch

(µg/mL)

Hàm

lượng

trong

mẫu

(mg/g)

01 0,4498 25 5 11772725 159,2 44,2

02 0,4577 25 5 12752861 172,7 47,2

03 0,4409 25 5 11614992 157,0 44,5

04 0,4420 25 5 11816802 159,8 45,2

05 0,4573 25 5 12845036 173,9 47,6

06 0,4703 25 5 13027837 176,5 46,9

TB (mg/g) 45,9

SD 1,5

RSD(%) 3,2

Nhận xét: Theo AOAC, tại mức nồng độ 100 µg/mL, độ lặp tối đa chấp

nhận có giá trị RSD(%) là 5,3, còn tại mức 0,1% thì giá trị tối đa của RSD(%)

là 3,7 [3]. Từ bảng kết quả trên ta thấy sibutramine có độ lặp đều nằm trong

giới hạn cho phép. Như vậy phương pháp có độ lặp đạt yêu cầu của AOAC

khi phân tích sibutramine trong viên nang mềm.

3.4. Kết quả xác định sibutramine trong một số sản phẩm thực phẩm

chức năng giảm béo

Chúng tôi đã tiến hành thu thập ngẫu nhiên 34 sản phẩm thực phẩm

chức năng giảm béo trên thị trường. Mẫu được xử lý theo quy trình phân tích

và xác định hàm lượng sibutramine theo phương pháp đã tối ưu trên, thu được

kết quả như ở bảng 3.15.

Bảng 3.15 Kết quả phân tích sibutramine trong một số mẫu thực phẩm chức

năng giảm béo

STT Mã hóa Tên mẫu Tình trạng mẫu, nhà sản

xuất

Hàm lượng

sibutramine

(mg/viên)

1 NM01

Thực phẩm

chức năng giảm

béo không nhãn

mác

Đựng trong lọ nhựa, không

rõ nguồn gốc KPH

2 NC01

COMPLEBIOL

SLIM 8+ -

Breakthrough

Slimming

Formula

Nguyên lọ, NSX: 5/2014 –

HSD: 4/2017. Xuất xứ: Mỹ KPH

3 NC02 Nang cứng Trong lọ nhựa, Không rõ

xuất xứ 11,0

4 NC03 Nang cứng

Nguyên hộp, nhà sản xuất:

Yunan Baian Medicinal

Science& Technology co.,ltd

KPH

5 NM02 Nang mềm Nguyên lọ, Không rõ nguồn

gốc 13,7

6 NC04 Viên nang cứng Nguyên hộp , nhà sản xuất

USA O&K trading KPH

7 NM03 Viên nang Lọ nhựa không nhãn mác 20,8

8 NC05 TPCN Best

slim

Nguyên lọ 40 viên, số lô

108200 17,5

9 NC06 Nang cứng Trong lọ nhựa, Không rõ

xuất xứ 28,2

10 NM04 TPCN giảm

béo

Trong lọ nhựa, nhà sản xuất:

Arkopharma KPH

11 NM05 Nang mềm Trong lọ nhựa, Không rõ

xuất xứ KPH

12 NC07 Viên nang giảm

béo Nguyên lọ, không nhãn mác 26,6

13 NM06 Nang mềm NKH Laboratories (USA) KPH

14 NM07 Nang mềm Trong lọ nhựa, không xuất

xứ 14,5

15 NC08 Viên nang giảm

béo Phục Linh

Nguyên hộp 36 viên, số lô:

20120901 19,6

16 NC09 TPCN Green

Oake Nguyên lọ 60 viên KPH

17 NC10

TPCN Doctor’s

Choice Slim &

Slim

Nguyên lọ 40 viên, nhà sản

xuất: Dramerico group llc KPH

18 NC11 Beautiful Slim

body

Nguyên lọ 36 viên, số lô

20100126 KPH

19 NC12

Cellifore brule

graisse

Laboratoires

JuVa Sante

Ngyên hộp, Số lô:

250161315113. HSD:

01/5/2016

KPH

20 NC13 Best Slim Nguyên lọ 60 viên, HSD:

01/06/2016 KPH

21 NC14 TPCN không

nhãn mác Lọ nhựa không nhãn mác 19,7

22 NC15 Fat Burner

(AVALON) Nguyên hộp, HSD: 6/2016 KPH

23 NC16 Resyze curve

sculptor Nguyên hộp, HSD: 02/2016 KPH

24 NC17 TrῡAge Body

Sugar Stop

Nguyên hộp, NSX-HSD:

Không có KPH

25 NC18

TPCN Viên

nang giảm béo

Phục Linh

Nguyên hộp, NSX:

01/7/2013 – HSD:

30/6/2015. số lô: 20130701

KPH

26 NC19 TPCN S Slim Nguyên lọ 40 viên, HSD:

31/12/2017 KPH

27 NC20 Perfect Slim Trong túi nilon không nhãn 34,6

USA mác

28 NC21

Thực phẩm

chức năng niên

nang LIC

Nguyên lọ 60 viên. NSX:

30/4/2014 – HSD: 29/9/2017 KPH

29 NC22 Thực phẩm

chức năng FIX

Nguyên lọ, số lô: 13360.

HSD: 12/2015 KPH

30 Dạng bột TPCN trà Tam

Thanh

Hộp 20 gói x 2,2 gr

NSX: 20/5/2014 – HSD:

20/5/2016

KPH

31 NC23 Viên nang màu

xanh

Mẫu đựng trong lọ nhựa

không nhãn mác KPH

32 NC24 Viên nang màu

đỏ

Nguyên lọ. Số lô: DRC

409011 KPH

33 NC25 Viên giảm cân

ô mai

Nguyên lọ, số lô: 140618

NSX: 18/6/2014 – HSD:

17/6/2016

24,4

34 NC26 Vita Helth Slim

QQ

Nguyên lọ, NSX-HSD:

Không có KPH

Trong đó: VN: Viên nén

NC: Nang cứng

NM: Năng mềm

KPH: Không phát hiện (dưới LOD của phương pháp).

Từ bảng kết quả trên nhận thấy: Trong 34 mẫu phân tích được đánh giá

phát hiện 11 mẫu (32%) chứa chất cấm sibutramin với hàm lượng từ 11,0 –

34,6mg/viên. Các mẫu dương tính tập chung chủ yếu ở dạng viên nang cứng,

không có nhãn mác, xuất xứ. Các sản phẩm này có thể bị làm nhái hoặc bị

làm giả. Vì vậy, khuyến cáo người tiêu dùng nên sử dụng các sản phẩm có

nguồn gốc xuất xứ rõ ràng, mua tại các nhà thuốc uy tín. Qua đây cũng kiến

nghị các đơn vị quản lý nên thắt chặt thanh kiểm tra mặt hàng thực phẩm chức

năng giảm béo lưu thông trên thị trường.

32%

68%

Mẫu không chứa sinutramine

Mẫu chứa sinutramine

Hình 3.28: Biểu đồ kết quả phân tích mẫu thực tế

Chương 4. KẾT LUẬN

Sau khi hoàn thành nghiên cứu này, trên cơ sở nghiên cứu các điều kiện

thực nghiệm, với mục đích ứng dụng phương pháp HPLC để xác hàm lượng

sibutramine trong mẫu thực phẩm chức năng giảm béo, chúng tôi thu được kết

quả như sau:

- Tối ưu được các điều kiện xác định sibutramine trên hệ thống sắc ký

lỏng hiệu năng cao HPLC với detector PDA:

Pha tĩnh: Cột C18 Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm; 5 µm)

Bước sóng phát hiện là 225 nm

Pha động: chạy theo chương trình gradient nồng độ

Kênh A: Kali dihydrophosphat 0,05M; pH = 4,0

Kênh B: Acetonitril

Nhiệt độ cột: 300C

Tốc độ dòng: 1 ml/phút

Thể tích nạp cột: 50 µl

- Xây dựng được quy trình xử lý mẫu xác định sibutramine trong mẫu

thực phẩm chức năng giảm béo:

+ Sử dụng dung môi chiết là methanol

+ Thời gian chiết mẫu là 20 phút

+ Loại béo bằng dung môi n-hexan (acid hoá bằng HCl)

- Phương pháp xây dựng đã được thẩm định qua các thông số:

+ Độ đặc hiệu, độ chọn lọc đáp ứng tốt

+ Giới hạn phát hiện LOD = 0,2 µg/ml

+ Giới hạn định lượng LOQ là 0,5 µg/ml

+ Độ lặp lại và độ thu hồi đáp ứng yêu cầu của AOAC.

- Phân tích 34 mẫu thực phẩm chức năng giảm béo, phát hiện 11 mẫu

có chứa chất cấm sibutramine.

Từ các kết quả thu được cho thấy phương pháp HPLC là phù hợp để

xác định sibutramine trong mẫu thực phẩm chức năng giảm béo.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Trần Tử An và cộng sự. (2007), Hóa phân tích- tập 2- Phân tích dụng cụ,

Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

2. Trần Tử An và cộng sự. (2010), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản Y

học, Hà Nội.

3. Trần Cao Sơn và cộng sự. (2010), Thẩm định phương pháp trong phân

tích hóa học & vi sinh vật, Nxb Khoa Học và Kỹ Thuật.

4. Bộ Y Tế, Quyết định số 120/QĐ-QLD: Quyết định về việc rút số đăng ký

thuốc do thông tin về phản ứng có hại.

Tài liệu tiếng Anh

5. Aceves-Hernández Juan M., Inés Nicolás Vázquez , Jaime Hinojosa-

Torres, Guillermo Penieres Carrillo , Gabriel Arroyo Razo, René Miranda

Ruvalcaba (2013), “Sibutramine characterization and solubility, a

theoretical study”, Journal of Molecular Structure 1038, 163–169.

6. Ancuceanu R., Mihaela Dinu, Corina arama, “Weight loss food

supplements: Adulteration and multiple quality issus in two products of

Chinese origin”, Farmacia (2013), Vol.61(1), 28-42.

7. Ariburnu Etil, Mehmet Fazli Uludag, Huseyin Yalcinkaya, Erdem

Yesilada (2012), “Comparative determination of sibutramine as an

adulterant in natural slimming products by HPLC and HPTLC

densitometry ”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 64–

65 (2012) 77– 81.

8. Bailey C.J., Turner S.H., Jones R.B (2000). “Sibutramine metabolites

increase glucose transport by cultured rat muscle cells”, International

Journal of Obesity (2001), 25, 478-485.

9. Blachut D., A.Siwinska-Ziolkowska, B.Szukalski, K.Wojtassiewicz, Z.

Czarnocki, A.Kobylecka, M. Bykas-Strekowska (2007), “Identification of

N-desmethylsibutramine as a new ingredient in Chinese herbal dietary

supplements”, Problems of Forensic Sciences LXX , 225–235.

10. Jun Chen, Wei Lu, Qizhi Zhang, Xinguo Jiang (2002), “Determination of

the active metabolite of sibutramine by liquid chromatography-

electrospray ionization tandem mass spectrometry”, Journal of

Chromatography B, 785(2003) 197-203.

11. Colectta D.K, Bates S.H., Jones R.B., Bailey C.J. “The sibutramine

metabolite M2 improves muscle glucose uptake and reduces hepatic

glucose output: preliminary data”, Diabetes Vasc Dis Res (2006), 3, 186-

188.

12. European Medicines Agency (EMEA), EMEA recommends suspension of

marketing authorizations for sibutramine.

(http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Press

release/2010/01/WC500069995.pdf).

13. FDA,http://www.fda.gov/downloads/Drugs/DrugSafety/PublicHealthAdvi

sories/UCM130745.pdf

14. FDA, Phenylpropanolamin information page.

(http://www.fda.gov/drugs/drugsafety/informationbydrugclass/ucm150738

.htm)

15. FDA announces withdrawal of fenfluramine and dexfenfluramine.

(http://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/PostmarketDrugSafetyInformation

forPatientsandProviders/ucm179871.htm).

16. FDA, Meridia (sibutramine): Market Withdrawal Due to Risk of Serious

Cardiovascular Events.

(http://www.fda.gov/safety/medwatch/safetyinformation/safetyalertsforhu

manmedicalproducts/ucm228830.htm).

17. The FDA August 2010 drugs safety update.

(http://www.fda.gov/Safety/MedWatch/SafetyInformation/ucm225956.ht

m).

18. Lu Feng, Li Shu, Le Jian, Chen Guiliang, Cao Yan, Qi Yunpeng, Chai

Yifeng, Wu Yutian (2007), “A new method for testing synthetic drugs

adulterated in herbal medicines based on infrared spectroscopy”, Analytica

Chimica Acta 589, 200-207.

19. Guyton A.C., Hall J.E. (2006), Textbook of Medical Physiology, eleventh

ed., W. B. Saunders company, Philadelphia, Pennsylvania.

20. Julia Jung, Maren Hermanns-Clausen, Wolfgang Weinmann (2006),

“Anorectic sibutramine detected in Chinese herbal drug for weight loss”,

Forensic Science International 161 (2006) 221-222.

21. Luque Carla A., Rey Jose A., (2001), “The discovery and status of

sibutramine as an anti-obesity drug”, European Journal of Pharmacology,

440 (2002) 119-128.

22. Sabina Strano-Rossi, Cristiana Colamonici and Francesco Botre (2006),

“Detection of sibutramine administration: a gas chromatography/ mass

spectrometry study of the main urinary metabolite”, Rapid

communications in Mass spectrometry (2007) 79-88.

23. Suthar A.P., Dubey S.A. and Patel S.R., “A validated Specific Reverse

Phase Liquid Chromatographic Method for the estimation of Sibutramine

Hydrochloride Monojydrate in bulk drug and capsule dosage forms”,

International Journal of Chemtech Research, Vol.1, No.4, 793-801.

24. Scheen André j. et al, “Sibutramine on Cardiovascular Outcome”,

Diabetes Care vol. 34, 114-119.

25. World Health Organization (WHO), 2010. Obesity and overweight

(http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs311/en/index.html).

26. Zhou Yu, Qiang Wei, Qingsheng Fan, and Chunhua Wan (2010), “A

simple and convenient method for simultaneous determination of four

major species of illegal additives in slimming health food”, Journal of

Liquid Chromatography & Related Technologies 33, 452–461.

27. Ying Shi, Chengjun Sun, Bo Gao, Aimin Sun (2011) “Development of a

liquid chromatography tandem mass spectrometry method for

simultaneous determination of eight adulterants in slimming functional

foods” Advanced Food Analysis, Pages 7655–7662

28. Sabina Strano-Rossi, Sara Odoardi, Erika Castrignanò, Giovanni

Serpelloni, Marcello Chiarotti (2014) “Liquid chromatography–high

resolution mass spectrometry (LC–HRMS) determination of stimulants,

anorectic drugs and phosphodiesterase 5 inhibitors (PDE5I) in food

supplements” Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis

PHỤ LỤC

Phụ lục A: Quy định của AOAC về độ lặp lại và độ thu hồi

Phụ lục A1. Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau

TT Hàm lượng % Tỷ lệ chất Đơn vị RSD (%)

1 100 1 100% 1,3

2 10 10-1 10% 1,8

3 1 10-2 1% 2,7

4 0,1 10-3 0,1% 3,7

5 0,01 10-4 100ppm 5,3

6 0,001 10-5 10ppm 7,3

7 0,0001 10-6 1 ppm 11

8 0,00001 10-7 100ppb 15

9 0,000001 10-8 10ppb 21

10 0,0000001 10-9 1ppb 30

Phụ lục A2. Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau theo AOAC

TT Hàm lượng (%) Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi (R%)

1 100 1 100% 98-102

2 10 10-1 10% 98-102

3 1 10-2 1% 97-103

4 0,1 10-3 0,1% 95-105

5 0,01 10-4 100ppm 90-107

6 0,001 10-5 10ppm 80-110

7 0,0001 10-6 1 ppm 80-110

8 0,00001 10-7 100ppb 80-110

9 0,000001 10-8 10ppb 60-115

10 0,0000001 10-9 1ppb 40-120

Phụ lục B: Sắc ký đồ khảo sát loại béo mẫu thực phẩm chức năng

Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng TPCN nang mềm chưa loại béo

Hình 3.18. Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng TPCN nang mềm đã loại béo

Hình 3.17. Sắc đồ mẫu trắng TPCN nang mềm thêm chuẩn sibutramine 200 µg/ml loại béo bằng n-Hexan

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

-500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000mAU

225nm,4nm (1.00)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

-500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

mAU225nm,4nm (1.00)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

mAU225nm,4nm (1.00)

/14.

619/

8417

11

Hình 3.19. Sắc ký đồ mẫu trắng TPCN nang mềm thêm chuẩn sibutramine 200 µg/ml loại béo bằng n-Hexan (H+)

Hình 3.18. Sắc đồ mẫu trắng TPCN nang mềm thêm chuẩn sibutramine 200 µg/ml loại béo bằng diethyl ether

Hình 3.20. Sắc đồ mẫu trắng TPCN nang mềm thêm chuẩn sibutramine

200 µg/ml loại béo bằng diethyl ether (H+)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

mAU225nm,4nm (1.00)

/15.10

2/101

1787

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

mAU225nm,4nm (1.00)

/15.24

9/104

8246

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

mAU225nm,4nm (1.00)

/14.77

8/853

924

Phụ lục C: Sắc ký đồ của một số mẫu thực tế

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

-500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000mAU

225nm,4nm (1.00)

Sắc ký đồ mẫu thực phẩm chức năng giảm béo NM01 không chứa

sibutramine

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

mAU225nm,4nm (1.00)

/15.10

2/101

1787

Sắc ký đồ mẫu thực phẩm chức năng giảm béo NM01 thêm chuẩn

sibutramine 200µg/ml

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

mAU225nm,4nm (1.00)

/14.03

2/826

829

Sắc ký đồ mẫu thực phẩm chức năng giảm béo NC01 thêm chuẩn

sibutramine 200µg/ml

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min

0

250

500

750

1000

1250

mAU225nm,4nm (1.00)

Sắc ký đồ mẫu thực phẩm chức năng giảm béo NC04

Sắc ký đồ mẫu thực phẩm chức năng giảm béo NC07

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min

0

50

100

150

mAU225nm,4nm (1.00)

/14

.29

0/2

50

12

93

Sắc ký đồ mẫu thực phẩm chức năng giảm béo NC14