Vol 7, Núm 1, 2016

Triticale variedad Secano TCL 96.Fotografía tomada por:Héctor Eduardo VillaseñorMir. Concurso de fotografíaINIFAP 2010.

II

REVISTA MEXICANA DE CIENCIAS PECUARIAS

Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias is a open accesspeer-reviewed and refereed scientific and technicaljournal, which publishes results of research carried outin any scientific or academic institution, especially relatedto different areas of veterinary medicine and animalproduction. Papers on disciplines different from thoseshown in Editorial Committee can be accepted, if relatedto livestock research.

The journal publishes three types of papers: ResearchArticles, Technical Notes and Review Articles (pleaseconsult Instructions for authors). Authors are responsiblefor the content of each manuscript, which, owing to thenature of the experiments described, may containreferences, in some cases, to commercial names of certainproducts, which however, does not denote preference forthose products in particular or of a lack of knowledge ofany other which are not mentioned, nor does it signify inany way an advertisement or an endorsement of thereferred products.

All contributions will be carefully refereed for academicrelevance and quality. Submission of an article isunderstood to imply that the research described is uniqueand unpublished. Rev. Mex. Cienc. Pecu. is publishedquarterly in Spanish/English bilingual format. Total feecharges are US $ 300.00 per article in both printedlanguages.

Part of, or whole articles published in this Journal maybe reproduced, stored in a retrieval system or transmittedin any form or by any means, electronic, mechanical,photocopying or otherwise, provided the source is properlyacknowledged.

Manuscripts should be submitted to: Associate Editor, RevistaMexicana de Ciencias Pecuarias, Calle 36 No. 215 x 67 y 69Colonia Montes de Amé, C.P. 97115 Mérida, Yucatán, México. Tel/Fax +52 (999) 941-5030. E-mail: [email protected].

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V��

Artículos completos desde el año 2000 a la fecha y Notas al autor en: http://cienciaspecuarias.inifap.gob.mx

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Full articles from year 2000 to date and Instructions for authors can be accessed via the site http://cienciaspecuarias.inifap.gob.mx

La Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias es un órganode difusión científica y técnica de acceso abierto, revisadapor pares y arbitrada. Su objetivo es dar a conocer losresultados de las investigaciones realizadas por cualquierinstitución científica, relacionadas particularmente con lasdistintas disciplinas de la Medicina Veterinaria y la Zootecnia.Además de trabajos de las disciplinas indicadas en su ComitéEditorial, se aceptan también para su evaluación y posiblepublicación, trabajos de otras disciplinas, siempre y cuandoestén relacionados con la investigación pecuaria.

Se publican en la revista tres categorías de trabajos:Artículos Científicos, Notas de Investigación y RevisionesBibliográficas (consultar las Notas al autor); laresponsabilidad de cada trabajo recae exclusivamente enlos autores, los cuales, por la naturaleza misma de losexperimentos pueden verse obligados a referirse enalgunos casos a los nombres comerciales de ciertosproductos, ello sin embargo, no implica preferencia porlos productos citados o ignorancia respecto a los omitidos,ni tampoco significa en modo alguno respaldo publicitariohacia los productos mencionados.

Todas las contribuciones serán cuidadosamente evaluadaspor árbitros, considerando su calidad y relevanciaacadémica. Queda entendido que el someter un manuscritoimplica que la investigación descrita es única e inédita.La publicación de Rev. Mex. Cienc. Pecu. es trimestral enformato bilingüe Español e Inglés. El costo total por

publicar es de $ 5,600.00 por manuscrito ya editado enambos idiomas.

Se autoriza la reproducción total o parcial del contenidode los artículos si se cita la fuente.

La correspondencia con relación a los trabajos para publicar enesta revista deberá dirigirse al primer Editor Adjunto a la siguientedirección: Calle 36 No. 215 x 67 y 69 Colonia Montes de Amé,C.P. 97115 Mérida, Yucatán, México. Tel/Fax +52 (999) 941-5030.Correo electrónico (C-ele): [email protected].

La correspondencia relativa a suscripciones, asuntos de intercambioo distribución, deberá dirigirse al Editor en Jefe de la RevistaMexicana de Ciencias Pecuarias, C�� obiología Animal,Km 15.5 Carretera México-Toluca, Col. Palo Alto, D.F. C.P. 05110,México; Tel: +52(55) 3871-8700 ext. 80316;[email protected] o [email protected].

Precio de cada ejemplar MEX$ 125.00Suscripción anual MEX$ 400.00

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Inscrita en la base de datos de EBSCO Host y la Red de RevistasCientíficas de América Latina y el Caribe, España y Portugal(RedALyC) (www.redalyc.org), en la Red Iberoamericana de RevistasCientíficas de Veterinaria de Libre Acceso (www.veterinaria.org/revistas/ revivec), indizada en el “Journal Citation Report” ScienceEdition del ISI (http://thomsonreuters.com/) y en los ÍndicesSCOPUS y EMBASE de Elsevier (www.elsevier.com)

III

REVISTA MEXICANA DE CIENCIAS PECUARIAS

REV. MEX. CIENC. PECU. VOL. 7 No. 1 ENERO-MARZO-2016

CONTENIDO

ARTÍCULOS Pág.

Análisis genético para vida productiva en ganado Holstein de México

Genetic analysis of productive life in Holstein cattle in Mexico

José R. Abadía Rojas, Felipe de Jesús Ruíz López, Vicente E. Vega Murillo, Hugo H. Montaldo ............. 1

Curvas de lactancia individuales en vacas Siboney de Cuba

Individual lactation curves in Siboney dairy cows of Cuba

Alejandro Palacios Espinosa, Dianelys González-Peña Fundora, Danilo Guerra Iglesias,José Luis Espinoza Villavicencio, Ricardo Ortega Pérez, Ariel Guillén Trujillo, Narciso Ávila Serrano .......15

Actividad biológica e inmunológica de las isoformas de carga de la hormonaluteinizante bovina

Biological and immunological activity in bovine luteinizing hormone charge isoforms

Álvaro Ortega, Aleida Olivares, Clara Murcia, Daniel Díaz, Everardo González-Padilla,Arnulfo Montero, Gabriel Gutiérrez Ospina, Gerardo Perera-Marín ..........................................................29

Estudio morfométrico de los epidídimos durante el desarrollo postnatal decorderos Barbados Blackbelly

Morphometric study of the epididymides during the postnatal development in BarbadosBlackbelly ram lambs

Anahy Danae Vargas-Velázquez, Héctor Jiménez-Severiano ...................................................................53

Tipología de las explotaciones ganaderas de bovinos doble propósito enSinaloa, México

Typology of dual-purpose cattle production farms in Sinaloa, Mexico

Venancio Cuevas Reyes, Alfredo Loaiza Meza, José Antonio Espinosa García,Alejandra Vélez Izquierdo, María Denisse Montoya Flores .....................................................................69

Propiedades de crecimiento de las líneas celulares DH82 y RF/6A bajocondiciones normales de laboratorio

Growth properties of DH82 and RF/6A cell lines under standard laboratory conditions

Samara Machuca Figueroa, Gabriela Granjeno Colín, Sergio Darío Rodríguez Camarillo,Carlos Agustín Vega y Murguía ............................................................................................................85

IV

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

Requerimientos energéticos de ovinos de pelo en las regiones tropicales deLatinoamérica. Revisión

Energy requirements of hair sheep in the tropical regions of Latin America. Review

Alfonso Juventino Chay-Canul, Juan Gabriel Magaña-Monforte, Mario Luiz Chizzotti,Angel Trinidad Piñeiro-Vázquez, Jorge Rodolfo Canul-Solís, Armin Javier Ayala-Burgos,Juan Carlos Ku-Vera, Luis Orlindo Tedeschi ........................................................................................ 105

NOTAS DE INVESTIGACIÓN

Adaptación de Mycobacterium smegmatis ante el agotamiento de nutrientesy su efecto en la expresión de esat-6

Adaptation of Mycobacterium smegmatis to nutrient depletion and its effect onesat-6 expression

Héctor M. López-Pérez, Sixto Velarde-Félix, Idalia Enriquez-Verdugo, Rosa Xicotencatl-Palacios,Soila M. Gaxiola-Camacho ................................................................................................................. 127

V

La Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias se editacompleta en dos idiomas (español e inglés) y publica trescategorías de trabajos: Artículos científicos, Notas deinvestigación y Revisiones bibliográficas.

Los autores interesados en publicar en esta revista deberánajustarse a los lineamientos que más adelante se indican,los cuales en términos generales, están de acuerdo conlos elaborados por el Comité Internacional de Editores deRevistas Médicas (CIERM) Bol Oficina Sanit Panam1989;107:422-437.

1. Sólo se aceptarán trabajos inéditos. No se admitiránsi están basados en pruebas de rutina, ni datosexperimentales sin estudio estadístico cuando éstesea indispensable. Tampoco se aceptarán trabajos quepreviamente hayan sido publicados condensados o inextenso en Memorias o Simposio de Reuniones oCongresos (a excepción de Resúmenes).

2. Todos los trabajos estarán sujetos a revisión de unComité Científico Editorial, conformado por Pares dela Disciplina en cuestión, quienes desconocerán elnombre e Institución de los autores proponentes. ElEditor notificará al autor la fecha de recepción de sutrabajo.

3. El manuscrito deberá someterse a través del portalde la Revista en la dirección electrónica: http://cienciaspecuarias.inifap.gob.mx, consultando el"Instructivo para envío de artículos en la página dela Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias". Para suelaboración se utilizará el procesador de MicrosoftWord, con letra Arial a 12 puntos, a doble espacio.Asimismo se deberá remitir una carta de presentaciónfirmada por todos los autores, aceptando el orden deco-autoría, remitiéndola en forma digitalizada comoarchivo complementario; en ella se indicará elresponsable de la correspondencia con la Revista,indicando dirección (no apartado postal), teléfono ydirección electrónica.

4. Por ser una revista con arbitraje, y para facilitar eltrabajo de los revisores, todos los renglones de cadapágina deben estar numerados; asimismo cada páginadebe estar numerada, inclusive cuadros, ilustracionesy gráficas.

5. Los artículos tendrán una extensión máxima de 20cuartillas a doble espacio, sin incluir páginas de Título,y cuadros o figuras (los cuales no deberán excederde ocho). Las Notas de investigación tendrán una

extensión máxima de 15 cuartillas y 6 cuadros o

figuras. Las Revisiones bibliográficas una extensiónmáxima de 30 cuartillas y 5 cuadros.

6. Los manuscritos de las tres categorías de trabajos

que se publican en la Rev. Mex. Cienc. Pecu.deberán contener los componentes que a continuaciónse indican, empezando cada uno de ellos en página

aparte.

Página del títuloResumen en español

Resumen en inglésTextoAgradecimientos

Literatura citadaCuadros y gráficas

7. Página del Título. Debe contener a) el título del

trabajo, que debe ser conciso pero informativo; b)nombre(s) y apellidos completos de cada autor,acompañados de su afiliación institucional; c) nombre

del departamento o departamentos y la institución oinstituciones a los que se debe atribuir el trabajo; d)nombre y dirección del autor a quien deben dirigirse

la correspondencia, y f) origen del apoyo recibido en

forma de subvenciones, equipo y otros (opcional).

8. Resumen en español. En la segunda página se

debe incluir un resumen que no pase de 250 palabras.

En él se indicarán los propósitos del estudio o

investigación; los procedimientos básicos y la

metodología empleada; los resultados más importantes

encontrados, y de ser posible, su significación

estadística y las conclusiones principales. A

continuación del resumen, en punto y aparte, agregue

debidamente rotuladas, de 3 a 8 palabras o frases

cortas clave que ayuden a los indizadores a clasificar

el trabajo, las cuales se publicarán junto con el

resumen.

9. Resumen en inglés. Anotar el título del trabajo en

inglés y a continuación redactar el “abstract” con las

mismas instrucciones que se señalaron para el

resumen en español. Al final en punto y aparte, se

deberán escribir las correspondientes palabras clave

(“key words”).

10. Texto. Las tres categorías de trabajos que se publicanen la Rev. Mex. Cienc. Pecu. consisten en losiguiente:

NOTAS AL AUTOR

Actualización: enero, 2016

VI

a) Artículos científicos. Deben ser informes de trabajosoriginales derivados de resultados parciales o finalesde investigaciones. El texto del Artículo científico sedivide en secciones que llevan estos encabezamientos:

IntroducciónMateriales y MétodosResultadosDiscusiónConclusiones e implicaciones

En los artículos largos puede ser necesario agregarsubtítulos dentro de estas divisiones a fin de hacermás claro el contenido, sobre todo en las seccionesde Resultados y de Discusión, las cuales tambiénpueden presentarse como una sola sección.

b) Notas de investigación. Consisten en modificacionesa técnicas, informes de casos clínicos de interésespecial, preliminares de trabajos o investigacioneslimitadas, descripción de nuevas variedades de pastos;así como resultados de investigación que a juicio delos editores deban así ser publicados. El textocontendrá la misma información del métodoexperimental señalado en el inciso a), pero suredacción será corrida del principio al final del trabajo;esto no quiere decir que sólo se supriman lossubtítulos, sino que se redacte en forma continua ycoherente.

c) Revisiones bibliográficas. Consisten en eltratamiento y exposición de un tema o tópico derelevante actualidad e importancia; su finalidad es lade resumir, analizar y discutir, así como poner adisposición del lector información ya publicada sobreun tema específico. El texto se divide en: Introducción,y las secciones que correspondan al desarrollo deltema en cuestión.

11. Agradecimientos. Siempre que corresponda, se

deben especificar las colaboraciones que necesitan

ser reconocidas, tales como a) la ayuda técnica

recibida; b) el agradecimiento por el apoyo financiero

y material, especificando la índole del mismo; c) las

relaciones financieras que pudieran suscitar un

conflicto de intereses. Las personas que colaboraron

pueden ser citadas por su nombre, añadiendo su

función o tipo de colaboración; por ejemplo: “asesorcientífico”, “revisión crítica de la propuesta para elestudio”, “recolección de datos”, etc.

12. Literatura citada. Numere las referenciasconsecutivamente en el orden en que se mencionanpor primera vez en el texto. Las referencias en eltexto, en los cuadros y en las ilustraciones se debenidentificar mediante números arábigos entreparéntesis, sin señalar el año de la referencia. Evitehasta donde sea posible, el tener que mencionar enel texto el nombre de los autores de las referencias.Procure abstenerse de utilizar los resúmenes como

referencias; las “observaciones inéditas” y las“comunicaciones personales” no deben usarse comoreferencias, aunque pueden insertarse en el texto(entre paréntesis).

Reglas básicas para la Literatura citada

Nombre de los autores, con mayúsculas sólo lasiniciales, empezando por el apellido paterno, luegoiniciales del materno y nombre(s). En caso de apellidoscompuestos se debe poner un guión entre ambos,ejemplo: Elías-Calles E. Entre las iniciales de un autorno se debe poner ningún signo de puntuación, niseparación; después de cada autor sólo se debe poneruna coma, incluso después del penúltimo; despuésdel último autor se debe poner un punto.

El título del trabajo se debe escribir completo (en suidioma original) luego el título abreviado de la revistadonde se publicó, sin ningún signo de puntuación;inmediatamente después el año de la publicación,luego el número del volumen, seguido del número(entre paréntesis) de la revista y finalmente el númerode páginas (esto en caso de artículo ordinario derevista).

Puede incluir en la lista de referencias, los artículosaceptados aunque todavía no se publiquen; indiquela revista y agregue “en prensa” (entre corchetes).

En el caso de libros de un solo autor (o más de uno,pero todos responsables del contenido total del libro),después del o los nombres, se debe indicar el títulodel libro, el número de la edición, el país, la casaeditorial y el año.

Cuando se trate del capítulo de un libro de variosautores, se debe poner el nombre del autor delcapítulo, luego el título del capítulo, después el nombrede los editores y el título del libro, seguido del país,la casa editorial, año y las páginas que abarca elcapítulo.

En el caso de tesis, se debe indicar el nombre delautor, el título del trabajo, luego entre corchetes elgrado (licenciatura, maestría, doctorado), luego elnombre de la ciudad, estado y en su caso país,seguidamente el nombre de la Universidad (no el dela escuela), y finalmente el año.

Emplee el estilo de los ejemplos que aparecen acontinuación, los cuales están parcialmente basadosen el formato que la Biblioteca Nacional de Medicinade los Estados Unidos usa en el Index Medicus.

Revistas

Artículo ordinario, con volumen y número. (Incluyael nombre de todos los autores cuando sean seis omenos; si son siete o más, anote sólo el nombre delos seis primeros y agregue “et al.”).

VII

I) Basurto GR, Garza FJD. Efecto de la inclusión degrasa o proteína de escape ruminal en elcomportamiento de toretes Brahman en engorda. TécPecu Méx 1998;36(1):35-48.

Sólo número sin indicar volumen.

II) Stephano HA, Gay GM, Ramírez TC. Encephalomielitis,reproductive failure and corneal opacity (blue eye) inpigs associated with a paramyxovirus infection. VetRec 1988;(122):6-10.

III) Chupin D, Schuh H. Survey of present status oftheuse of artificial insemination in developing countries.World Anim Rev 1993;(74-75):26-35.

No se indica el autor.

IV) Cancer in South Africa [editorial]. S Afr Med J1994;84:15.

Suplemento de revista.

V) Hall JB, Staigmiller RB, Short RE, Bellows RA, BartlettSE. Body composition at puberty in beef heifers asinfluenced by nutrition and breed [abstract]. J AnimSci 1998;71(Suppl 1):205.

Organización, como autor.

VI) The Cardiac Society of Australia and New Zealand.Clinical exercise stress testing. Safety and performanceguidelines. Med J Aust 1996;(164):282-284.

En proceso de publicación.

VII)Scifres CJ, Kothmann MM. Differential grazing use ofherbicide treated area by cattle. J Range Manage [inpress] 2000.

Libros y otras monografías

Autor total.

VIII) Steel RGD, Torrie JH. Principles and procedures ofstatistics: A biometrical approach. 2nd ed. New York,USA: McGraw-Hill Book Co.; 1980.

Autor de capítulo.

IX) Roberts SJ. Equine abortion. In: Faulkner LLC editor.Abortion diseases of cattle. 1rst ed. Springfield,Illinois, USA: Thomas Books; 1968:158-179.

Memorias de reuniones.

X) Loeza LR, Angeles MAA, Cisneros GF. Alimentaciónde cerdos. En: Zúñiga GJL, Cruz BJA editores.Tercera reunión anual del centro de investigacionesforestales y agropecuarias del estado de Veracruz.Veracruz. 1990:51-56.

XI) Olea PR, Cuarón IJA, Ruiz LFJ, Villagómez AE.Concentración de insulina plasmática en cerdasalimentadas con melaza en la dieta durante la

inducción de estro lactacional [resumen]. Reuniónnacional de investigación pecuaria. Querétaro, Qro.

1998:13.

XII) Cunningham EP. Genetic diversity in domesticanimals: strategies for conservation and

development. In: Miller RH et al. editors. Proc XXBeltsville Symposium: Biotechnology’s role in geneticimprovement of farm animals. USDA. 1996:13.

Tesis.

XIII) Alvarez MJA. Inmunidad humoral en la anaplasmosisy babesiosis bovinas en becerros mantenidos en

una zona endémica [tesis maestría]. México, DF:Universidad Nacional Autónoma de México; 1989.

XIV) Cairns RB. Infrared spectroscopic studies of solid

oxigen [doctoral thesis]. Berkeley, California, USA:University of California; 1965.

Organización como autor.

XV) NRC. National Research Council. The nutrientrequirements of beef cattle. 6th ed. Washington,DC, USA: National Academy Press; 1984.

XVI) SAGAR. Secretaría de Agricultura, Ganadería yDesarrollo Rural. Curso de actualización técnica parala aprobación de médicos veterinarios zootecnistas

responsables de establecimientos destinados alsacrificio de animales. México. 1996.

XVII) AOAC. Oficial methods of analysis. 15th ed.

Arlington, VA, USA: Association of Official AnalyticalChemists. 1990.

XVIII)SAS. SAS/STAT User’s Guide (Release 6.03). CaryNC, USA: SAS Inst. Inc. 1988.

XIX) SAS. SAS User´s Guide: Statistics (version 5 ed.).

Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 1985.

Publicaciones electrónicas

XX) Jun Y, Ellis M. Effect of group size and feeder typeon growth performance and feeding patterns in

growing pigs. J Anim Sci 2001;79:803-813. http://jas.fass.org/cgi/reprint/79/4/803.pdf. Accessed Jul30, 2003.

XXI) Villalobos GC, González VE, Ortega SJA. Técnicaspara estimar la degradación de proteína y materiaorgánica en el rumen y su importancia en rumiantesen pastoreo. Téc Pecu Méx 2000;38(2): 119-134.http : / /www.tecn icapecuar ia .o rg/ t raba jos/200212175725.pdf. Consultado 30 Ago, 2003.

XXII) Sanh MV, Wiktorsson H, Ly LV. Effect of feedinglevel on milk production, body weight change,feed conversion and postpartum oestrus ofcrossbred lactating cows in tropical conditions.Livest Prod Sci 2002;27(2-3):331-338. http://

VIII

www.sciencedirect.com/science/journal/03016226.Accessed Sep 12, 2003.

13. Cuadros, Gráficas e Ilustraciones. Es preferibleque sean pocos, concisos, contando con los datosnecesarios para que sean autosuficientes, que seentiendan por sí mismos sin necesidad de leer eltexto. Para las notas al pie se deberán utilizar lossímbolos convencionales.

14 Versión final. Es el documento en el cual los autoresya integraron las correcciones y modificacionesindicadas por el Comité Revisor. Los trabajos deberánser elaborados con Microsoft Word. Las gráficas yfiguras se deberán elaborar en Word, Power Point,Corel Draw y enviadas en archivo aparte (nuncainsertarlas como imágenes en el texto). Los cuadrosno deberán contener ninguna línea vertical, y lashorizontales solamente las que delimitan losencabezados de columna, y la línea al final del cuadro.

15. Una vez recibida la versión final, ésta se mandarápara su traducción al idioma inglés o español, segúncorresponda. Si los autores lo consideran convenientepodrán enviar su manuscrito final en ambos idiomas.

16. Tesis. Se publicarán como Artículo o Nota deInvestigación, siempre y cuando se ajusten a lasnormas de esta revista.

17. Los trabajos no aceptados para su publicación seregresarán al autor, con un anexo en el que seexplicarán los motivos por los que se rechaza o lasmodificaciones que deberán hacerse para serreevaluados.

18. Abreviaturas de uso frecuente:

cal caloría (s)

cm centímetro (s)

°C grado centígrado (s)

DL50 dosis letal 50%

g gramo (s)

ha hectárea (s)

h hora (s)

i.m. intramuscular (mente)

i.v. intravenosa (mente)

J joule (s)

kg kilogramo (s)

km kilómetro (s)

L litro (s)

log logaritmo decimal

Mcal megacaloría (s)

MJ megajoule (s)

m metro (s)

msnm metros sobre el nivel del mar

µg microgramo (s)

µl microlitro (s)

µm micrómetro (s)(micra(s))

mg miligramo (s)

ml mililitro (s)

mm milímetro (s)

min minuto (s)

ng nanogramo (s)

P probabilidad (estadística)

p página

PC proteína cruda

PCR reacción en cadena de la polimerasa

pp páginas

ppm partes por millón

% por ciento (con número)

rpm revoluciones por minuto

seg segundo (s)

t tonelada (s)

TND total de nutrientes digestibles

UA unidad animal

UI unidades internacionales

vs versus

xg gravedades

Cualquier otra abreviatura se pondrá entre paréntesis

inmediatamente después de la(s) palabra(s)

completa(s).

19. Los nombres científicos y otras locuciones latinas se

deben escribir en cursivas.

IX

INSTRUCTIONS FOR AUTHORS

Update: January, 2016

Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias is a scientificjournal published in a bilingual format (Spanish andEnglish) which carries three types of papers: ResearchArticles, Technical Notes, and Reviews. Authors interestedin publishing in this journal, should follow the below-mentioned directives which are based on those set downby the International Committee of Medical Journal Editors(ICMJE) Bol Oficina Sanit Panam 1989;107:422-437.

1. Only original unpublished works will be accepted.

Manuscripts based on routine tests, will not be

accepted. All experimental data must be subjected to

statistical analysis. Papers previously published

condensed or in extenso in a Congress or any other

type of Meeting will not be accepted (except for

Abstracts).

2. All contributions will be peer reviewed by a scientific

editorial committee, composed of experts who ignore

the name of the authors. The Editor will notify the

author the date of manuscript receipt.

3. Papers will be submitted in the Web site http://

cienciaspecuarias.inifap.gob.mx, according the “Guide

for submit articles in the Web site of the Revista

Mexicana de Ciencias Pecuarias”. Manuscripts should

be prepared, typed in a 12 points font at double

space (including the abstract and tables), At the time

of submission a signed agreement co-author letter

should enclosed as complementary file; co-authors at

different institutions can mail this form independently.

The corresponding author should be indicated together

with his address (a post office box will not be

accepted), telephone and Email.

4. To facilitate peer review all pages should be numbered

consecutively, including tables, illustrations and

graphics, and the lines of each page should be

numbered as well.

5. Research articles will not exceed 20 double spaced

pages, without including Title page and Tables and

Figures (8 maximum). Technical notes will have a

maximum extension of 15 pages and 6 Tables and

Figures. Reviews should not exceed 30 pages and 5

Tables and Figures.

6. Manuscripts of all three type of articles published in

Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias should

contain the following sections, and each one should

begin on a separate page.

Title pageAbstractTextAcknowledgmentsReferencesTables and Graphics

7. Title page. This section should include: a) Title,which should be concise but informative; b) Eachauthor’s name, accompanied by their institutionalaffiliation; c) Departments and institutions to whomthe work should be attributed; d) Name and addressof the author responsible for correspondence relatedto the manuscript; and f) Origin of funding.

8. Abstract. On the second page a summary of no

more than 250 words should be included. This abstract

should start with a clear statement of the objectives

and must include basic procedures and methodology.

The more significant results and their statistical value

and the main conclusions should be elaborated briefly.

At the end of the abstract, and on a separate line,

a list of up to 10 key words or short phrases that

best describe the nature of the research should be

stated.

9. Text. The three categories of articles which are

published in Revista Mexicana de Ciencias

Pecuarias are the following:

a) Research Articles. They should originate in primaryworks and may show partial or final results ofresearch. The text of the article must include thefollowing parts:

IntroductionMaterials and MethodsResultsDiscussionConclusions and implications

In lengthy articles, it may be necessary to add othersections to make the content clearer. Results andDiscussion can be shown as a single section ifconsidered appropriate.

b) Technical Notes. They should be brief and beevidence for technical changes, reports of clinical casesof special interest, complete description of a limitedinvestigation, or research results which should bepublished as a note in the opinion of the editors. Thetext will contain the same information presented in

X

the sections of the research article but without section

titles.

c) Reviews. The purpose of these papers is to summarize,

analyze and discuss an outstanding topic. The text of

these articles should include the following sections:

Introduction, and as many sections as needed that

relate to the description of the topic in question.

10. Acknowledgements. Whenever appropriate,

collaborations that need recognition should be

specified: a) Acknowledgement of technical support;

b) Financial and material support, specifying its nature;

and c) Financial relationships that could be the source

of a conflict of interest.

People which collaborated in the article may be named,

adding their function or contribution; for example:

“scientific advisor”, “critical review”, “data collection”,

etc.

11. References. All references should be quoted in their

original language. They should be numbered

consecutively in the order in which they are first

mentioned in the text. Text, tables and figure

references should be identified by means of Arabic

numbers. Avoid, whenever possible, mentioning in

the text the name of the authors. Abstain from using

abstracts as references. Also, “unpublished

observations” and “personal communications” should

not be used as references, although they can be

inserted in the text (inside brackets).

Key rules for references

a. The names of the authors should be quoted

beginning with the last name spelt with initial capitals,

followed by the initials of the first and middle name(s).

In the presence of compound last names, add a dash

between both, i.e. Elias-Calles E. Do not use any

punctuation sign, nor separation between the initials

of an author; separate each author with a comma,

even after the last but one.

b. The title of the paper should be written in full,

followed by the abbreviated title of the journal without

any punctuation sign; then the year of the publication,

after that the number of the volume, followed by the

number (in brackets) of the journal and finally the

number of pages (this in the event of ordinary article).

c. Accepted articles, even if still not published, can

be included in the list of references, as long as the

journal is specified and followed by “in press” (in

brackets).

d. In the case of a single author’s book (or more

than one, but all responsible for the book’s contents),

the title of the book should be indicated after the

names(s), the number of the edition, the country,

the printing house and the year.

e. When a reference is made of a chapter of book

written by several authors; the name of the author(s)

of the chapter should be quoted, followed by the title

of the chapter, the editors and the title of the book,

the country, the printing house, the year, and the

initial and final pages.

f. In the case of a thesis, references should be

made of the author’s name, the title of the research,

the degree obtained, followed by the name of the

City, State, and Country, the University (not the

school), and finally the year.

Examples

The style of the following examples, which are partly

based on the format the National Library of Medicine

of the United States employs in its Index Medicus,

should be taken as a model.

Journals

Standard journal article (List the first six authorsfollowed by et al.)

I) Basurto GR, Garza FJD. Efecto de la inclusión de

grasa o proteína de escape ruminal en el

comportamiento de toretes Brahman en engorda. Téc

Pecu Méx 1998;36(1):35-48.

Issue with no volume

II) Stephano HA, Gay GM, Ramírez TC. Encephalomielitis,

reproductive failure and corneal opacity (blue eye) in

pigs associated with a paramyxovirus infection. Vet

Rec 1988;(122):6-10.

III) Chupin D, Schuh H. Survey of present status of the

use of artificial insemination in developing countries.

World Anim Rev 1993;(74-75):26-35.

No author given

IV) Cancer in South Africa [editorial]. S Afr Med J

1994;84:15.

Journal supplement

V) Hall JB, Staigmiller RB, Short RE, Bellows RA, Bartlett

SE. Body composition at puberty in beef heifers as

influenced by nutrition and breed [abstract]. J Anim

Sci 1998;71(Suppl 1):205.

Organization, as author

VI) The Cardiac Society of Australia and New Zealand.

Clinical exercise stress testing. Safety and performance

guidelines. Med J Aust 1996;(164):282-284.

XI

In press

VII) Scifres CJ, Kothmann MM. Differential grazing useof herbicide-treated area by cattle. J Range Manage[in press] 2000.

Books and other monographs

Author(s)

VIII) Steel RGD, Torrie JH. Principles and procedures ofstatistics: A biometrical approach. 2nd ed. New York,USA: McGraw-Hill Book Co.; 1980.

Chapter in a book

IX) Roberts SJ. Equine abortion. In: Faulkner LLC editor.Abortion diseases of cattle. 1rst ed. Springfield,Illinois, USA: Thomas Books; 1968:158-179.

Conference paper

X) Loeza LR, Angeles MAA, Cisneros GF. Alimentaciónde cerdos. En: Zúñiga GJL, Cruz BJA editores.Tercera reunión anual del centro de investigacionesforestales y agropecuarias del estado de Veracruz.Veracruz. 1990:51-56.

XI) Olea PR, Cuarón IJA, Ruiz LFJ, Villagómez AE.Concentración de insulina plasmática en cerdasalimentadas con melaza en la dieta durante lainducción de estro lactacional [resumen]. Reuniónnacional de investigación pecuaria. Querétaro, Qro.1998:13.

XII) Cunningham EP. Genetic diversity in domesticanimals: strategies for conservation anddevelopment. In: Miller RH et al. editors. Proc XXBeltsville Symposium: Biotechnology’s role in geneticimprovement of farm animals. USDA. 1996:13.

Thesis

XIII) Alvarez MJA. Inmunidad humoral en la anaplasmosisy babesiosis bovinas en becerros mantenidos enuna zona endémica [tesis maestría]. México, DF:Universidad Nacional Autónoma de México; 1989.

XIV) Cairns RB. Infrared spectroscopic studies of solidoxigen [doctoral thesis]. Berkeley, California, USA:University of California; 1965.

Organization as author

XV) NRC. National Research Council. The nutrientrequirements of beef cattle. 6th ed. Washington,DC, USA: National Academy Press; 1984.

XVI) SAGAR. Secretaría de Agricultura, Ganadería yDesarrollo Rural. Curso de actualización técnica parala aprobación de médicos veterinarios zootecnistasresponsables de establecimientos destinados alsacrificio de animales. México. 1996.

XVII) AOAC. Official methods of analysis. 15th ed.Arlington, VA, USA: Association of Official AnalyticalChemists. 1990.

XVIII) SAS. SAS/STAT User’s Guide (Release 6.03). CaryNC, USA: SAS Inst. Inc. 1988.

XIX) SAS. SAS User´s Guide: Statistics (version 5 ed.).Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 1985.

Electronic publications

XX) Jun Y, Ellis M. Effect of group size and feeder typeon growth performance and feeding patterns ingrowing pigs. J Anim Sci 2001;79:803-813. http://jas.fass.org/cgi/reprint/79/4/803.pdf. Accesed Jul30, 2003.

XXI) Villalobos GC, González VE, Ortega SJA. Técnicaspara estimar la degradación de proteína y materiaorgánica en el rumen y su importancia en rumiantesen pastoreo. Téc Pecu Méx 2000;38(2): 119-134.http : / /www.tecn icapecuar ia .o rg/ t raba jos/200212175725.pdf. Consultado 30 Jul, 2003.

XXII) Sanh MV, Wiktorsson H, Ly LV. Effect of feedinglevel on milk production, body weight change,feed conversion and postpartum oestrus ofcrossbred lactating cows in tropical conditions.Livest Prod Sci 2002;27(2-3):331-338. http://www.sciencedirect.com/science/journal/03016226.Accesed Sep 12, 2003.

12. Tables, Graphics and Illustrations. It is preferablethat they should be few, brief and having thenecessary data so they could be understood withoutreading the text. Explanatory material should be placedin footnotes, using conventional symbols.

13. Final version. This is the document in which theauthors have incorporated all the corrections andmodifications asked for by the editors. Graphs andfigures should be submitted separately in MicrosoftWord, MS Power Point, or Corel Draw. Figures mustnot be inserted as images within the text. In Tablesdo not use internal horizontal or vertical lines.

14. Once accepted, the final version will be translatedinto Spanish or English, although authors should feelfree to send the final version in both languages. Nocharges will be made for style or translation services.

15. Thesis will be published as a Research Article or asa Technical Note, according to these guidelines.

16. Manuscripts not accepted for publication will bereturned to the author together with a note explainingthe cause for rejection, or suggesting changes whichshould be made for re-assessment.

17. List of abbreviations:

cal calorie (s)

cm centimeter (s)

XII

°C degree Celsius

DL50 lethal dose 50%

g gram (s)

ha hectare (s)

h hour (s)

i.m. intramuscular (..ly)

i.v. intravenous (..ly)

J joule (s)

kg kilogram (s)

km kilometer (s)

L liter (s)

log decimal logarithm

Mcal mega calorie (s)

MJ mega joule (s)

m meter (s)

µl micro liter (s)

µm micro meter (s)

mg milligram (s)

ml milliliter (s)

mm millimeter (s)

min minute (s)

ng nanogram (s)

P probability (statistic)

p page

CP crude protein

PCR polymerase chain reaction

pp pages

ppm parts per million

% percent (with number)

rpm revolutions per minute

sec second (s)

t metric ton (s)

TDN total digestible nutrients

AU animal unit

IU international units

vs versus

xg gravidity

The full term for which an abbreviation stands should

precede its first use in the text.

18. Scientific names and other Latin terms should bewritten in italics.

1

ANÁLISIS GENÉTICO PARA VIDA PRODUCTIVA EN GANADO HOLSTEIN DE MÉXICORev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):1-14

Análisis genético para vida productiva en ganadoHolstein de México

Genetic analysis of productive life in Holstein cattlein Mexico

José R. Abadía Rojasa, Felipe de Jesús Ruíz Lópezb, Vicente E. Vega Murilloc,Hugo H. Montaldod

RESUMEN

Se usó la metodología de análisis de supervivencia con un modelo de riesgos proporcionales de Weibull para estudiarla duración de vida productiva funcional (DVPF) de ganado Holstein en México, usando un modelo padre-abuelomaterno con el software Survival Kit V3.12. La DVPF se calculó como el número de días entre la fecha de primer partoy la fecha de desecho o censura, con un crédito máximo de 305 días por lactación. Los datos analizados se obtuvieronde la Asociación Holstein de México. El archivo final constó de 36,507 registros para DVPF de vacas que parieron porprimera vez entre 1995 y 2008. El modelo incluyó la función de riesgo basal de Weibull y los siguientes efectos fijos:edad al primer parto, número de lactación por fase de lactación con cortes en los días 29, 249 y 305 y nivel deproducción estandarizado con 10 clases con cambios en cada lactación, incluidas como variables tiempo dependientesy los efectos aleatorios de hato-año de parto y efectos genéticos de padre y abuelo materno. El porcentaje de censurafue de 25.54 %. Todos los efectos fijos analizados fueron significativos (P<0.0001) y tuvieron una influencia importanteen el riesgo de desecho de los animales. Las heredabilidades calculadas en escalas logarítmica, original, efectiva yequivalente resultaron de 0.08, 0.13, 0.12 y 0.10 respectivamente, indicando que este carácter se puede integrarefectivamente a los programas de mejoramiento genético como se ha hecho en otras poblaciones de ganado Holstein.

PALABRAS CLAVE: Análisis de supervivencia, Modelo de Weibull, Variable tiempo dependiente, Heredabilidades.

ABSTRACT

Methodology survival analysis model with Weibull proportional hazards was used to study Holstein cattle duration offunctional productive life (FPL) in Mexico, using a model sire-maternal grandsire with Survival Kit V3.12 software.The FPL was calculated as the number of days between the date of first calving and the date of culling or censored,with a maximum credit of 305 d per lactation. The FPL was defined as the length of time between first calving and

date of culling or death and a maximum of 305 d lactation. The data analyzed were obtained from the HolsteinAssociation of Mexico. The final file consisted of 36,507 records for FPL of cows that calved for the first time between1995 and 2008. The model included baseline hazard function of Weibull and the following fixed effects: age at firstcalving, lactation number by stage of lactation with cuts 29, 249 y 305 and standardized production level, with 10classes with changes in each lactation period included as dependent variables and random effects of herd-year ofcalving and genetic effects of sire and maternal grandsire. Percentage of censored data was 25.54 %. All analyzedfixed effects were significant (P<0.0001) and had a significant risk of animal culling influence. The heritabilitycalculated logarithmic, original, effective and equivalent scales were 0.08, 0.13, 0.12 and 0.10 respectively, indicating

that this character can effectively integrate breeding programs as has been done in other locations of Holstein cattle.

KEY WORDS: Survival analysis, Weibull model, Variable time dependent, Heritability.

Recibido el 25 de junio de 2013. Aceptado el 15 de agosto de 2013.

a Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Veracruzana. Miguel Ángel de Quevedo s/n esq. Yáñez Col. Unidad Veracruzana, 91710 Veracruz,Ver. México.

b Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Fisiología y Mejoramiento Animal, INIFAP. México. [email protected]. Correspondencia al segundo autor.

c Centro de Investigación Regional Golfo Centro, INIFAP. México.

d Universidad Nacional Autónoma de México. México.

Este trabajo es parte de la tesis de maestría del primer autor.

Esta investigación fue apoyada por la Asociación Holstein de México, el CONACYT, el CONARGEN y el Programa Nacional de Mejoramiento Genético Holstein-SAGARPA.

2

José R. Abadía Rojas, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):1-14

INTRODUCCIÓN

La longevidad en bovinos lecheros puede

medirse como el tiempo que transcurre desde

el primer parto hasta el desecho o muerte del

animal, lo que también es conocido como

duración de vida productiva (DVP). La DVP de

una vaca productora de leche puede estar

determinada por su nivel de producción,

fertilidad, salud, etc. De particular interés es el

proceso de desecho involuntario, es decir, el

desecho por causas fuera del control del

ganadero como son enfermedades o problemas

reproductivos, y cuando este proceso incluye el

nivel de producción de la vaca en el modelo

con el fin de corregir para el desecho voluntario;

esta característica es conocida como duración

de vida productiva funcional (DVPF)(1,2).

El uso de técnicas de análisis de supervivencia

para estudiar la DVPF tiene la ventaja de que

permite incorporar covariables dependientes del

t iempo, uti l izar registros incompletos

(censurados), analizar grandes bases de datos

y aplicar modelos mixtos que permiten a su

vez realizar evaluaciones genéticas nacionales,

aunque la forma de evaluar y los modelos

utilizados varían de acuerdo a las circunstancias

de utilización(3,4,5).

En estudios previos a partir de información en

México, se analizó el efecto de nivel de

producción de leche sobre la DVP, con base en

un estimador Kaplan-Meier y un modelo de

regresión de Weibull(6), o se analizó la

longevidad como la capacidad de permanencia

a los 48 meses y como duración de vida

productiva hasta la tercera lactación, empleando

modelos lineales mixtos(7). Sin embargo, no se

han realizado estudios que aborden el uso de

técnicas de supervivencia en la predicción de

valores genéticos en la población Holstein de

México bajo control de producción. Esto resulta

necesario para el desarrollo de sistemas eficaces

de evaluación genética para esta característica

en toros de inseminación artificial usados en

INTRODUCTION

Longevity in dairy cows can be measured as

the time from first parturition to animal cull or

death, an interval called productive life (PL). In

a producing dairy cow, PL is influenced by

production level, fertility, health, etc. Of

particular interest is involuntary culling, that is,

for reasons beyond the control of the farmer

(e.g. disease or reproductive problems). This

process is known as functional productive life

(FPL) when it includes cow production level in

the model in an effort to correct for voluntary

culling(1,2).

The study of FPL using survival analysis

techniques allows incorporation of time-

dependent covariables, use of incomplete(censured) records, analysis of large data basesand application of mixed models that permitnational level genetic evaluations. However, theway these evaluations are done and the modelsused to do so, can vary depending oncircumstances(3,4,5).

Previous studies using data from Mexico haveanalyzed the effect of milk production level onPL either based on a Kaplan-Meier estimatorand a Weibull regression model(6), or usingmixed linear models and treating longevity asthe ability to remain in the herd at 48 mo ofage with a PL extending to the third lactation(7).No studies have been done, however, addressingthe use of survival analysis in predicting geneticvalues in a Holstein population in Mexico undermilk recording. Genetic values are needed todevelop effective genetic improvement systemsfor this trait on artificial insemination bulls usedin Mexico. This trait is vital to geneticimprovement of dairy cows for reasons ofeconomy (e.g. production system sustainability)and animal health (improved PL reduces risk of

disease)(6,7).

The present study objectives were to estimate

heritabilities and predict genetic values for FPL

by applying a proportional risk model with a

3

ANÁLISIS GENÉTICO PARA VIDA PRODUCTIVA EN GANADO HOLSTEIN DE MÉXICO

México, dado que se trata de una característica

de gran importancia para la mejora genética de

los bovinos productores de leche, considerando

tanto aspectos económicos, como de la

sostenibilidad de los sistemas de producción e

incluso del bienestar animal, al contribuir el

mejoramiento de la DVP por una reducción

de los riesgos de enfermedad(6,7).

Los objetivos del presente estudio fueron estimar

heredabilidades y predecir valores genéticos para

DVPF, aplicando una distribución Weibull y

utilizando un modelo de riesgos proporcionales

en ganado Holstein de México.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se utilizó información de vacas Holstein queparieron por primera vez entre 1995 y 2008,proporcionada por la Asociación Holstein deMéxico a partir del control lechero oficial y delregistro genealógico. La DVP se calculó comoel número de días entre la fecha de primerparto y la fecha de desecho o censura, con uncrédito máximo de 305 días por lactación ydefiniéndose como censurados los registros deanimales que se vendieron vivos para produccióna otros ranchos, aquéllos de vacas vivas cuandoel hato dejó de estar en control de producción,o lactaciones no consecutivas de un mismoanimal. Para obtener una mejor precisión yasegurar la convergencia de los modelos seeliminaron lactaciones: con producciones deleche estandarizadas fuera del intervalo de 2,500y 17,000 kg correspondientes a los porcentiles1 y 99 respectivamente por considerarlasanormales; datos de vacas sin información deprimeras lactaciones; datos de vacas con edadesal primer parto menores de 17 meses y datosde vacas hijas de sementales con menos decinco hijas. El archivo final constó de 36,507registros para DVP.

Las estimaciones de los parámetros y laspredicciones de los valores genéticos secalcularon usando el programa Survival Kit

V3.12(8,9), empleando un modelo de riesgos

Weibull distribution in a Holstein population inMexico.

MATERIAL AND METHODS

Data was for Holstein cows with first parturitionbetween 1995 and 2008, and was provided bythe Mexican Holstein Association (AsociaciónHolstein de México) from official milk recordingand genealogical records. Productive life (PL)was calculated as the number of days betweendate of first parturition and date of culling orcensure. Maximum credit for lactation was 305 dand censured animals were defined as recordsof cows sold to other farms for production, oflive cows in a herd when its production stoppedbeing recorded, or of cows with non-consecutivelactations. For greater accuracy, and to ensuremodel convergence, lactations were eliminatedfor any one of four reasons: 1) Abnormalstandardized milk production, i.e. <2,500 kg(1st percentile) or >17,000 kg (99th percentile);2) No data for first lactation; 3) First lactationat <17 mo of age; and 4) Daughters of sireswith less than five daughters. The final databaseconsisted of 36,507 PL records.

Parameter estimations and genetic valuepredictions were calculated with the SurvivalKit ver. 3.12 program(8,9). A sire-maternalgrandsire proportional risk model was used inwhich a Weibull distribution was assumed forthe basic risk function. The FPL analysis modelwas:

h( t )=( t )-1exp {HY j( t )+APk( t)+LPlm( t )+MPLn (t)+Sq+0.5smg}

In this model, )(th represents a cow eliminationrisk in time t. The basic risk function is

1)( t , where is the distribution shapeparameter and corresponds to the distributionscale parameter. )(tHYj is the random effectof the j-th herd-year of first parturition. Thishad a log-gamma function associated withparameter , included to acknowledge that animalelimination is a decision made by comparinganimals within similar or contemporaneous

4


proporcionales padre-abuelo materno, en el que

se supuso una distribución de Weibull para la

función de riesgo basal. El modelo de análisis

(DVPF) fue el siguiente:

h( t )=( t )-1exp {HY j( t )+APk( t)+LP lm( t )+MPLn (t)+Sq+0.5smg}

Donde: )(th , representa el riesgo de eliminación

de una vaca en el tiempo t. 1)( t es la

función de riesgo basal, donde es el

parámetro de forma de la distribución y corresponde al parámetro de escala de la

distribución. )(tHAj , es el efecto aleatorio del

j-ésimo hato-año de primer parto, asociado a

una distribución log-gamma con parámetro ,incluido para reconocer que la eliminación de

un animal es una decisión que se toma al

comparar animales dentro de grupos similares

o contemporáneos, su efecto no se explica en

este estudio(8). )(tEPk es el efecto de la

k-ésima edad al primer parto en meses con

cuatro clases (1 (23 meses), 2 (24,25 meses),

3 (26,27 meses) y 4 (28 meses). )(tFLlm es

el efecto tiempo-dependiente de la l-ésima fase

de la lactación con cambios en los tiempos:1-29, 30-249 y 250-305 días después del parto,

dentro de la m-ésima lactación: 1, 2, 3, 4,

suponiendo que el riesgo no cambia dentro de

cada segmento. )(tNPn es el efecto del n-ésimonivel de producción dentro del hato-año de

primer parto. Los niveles de producción se

obtuvieron ordenando los registros productivos

en forma ascendente para que acto seguido, se

obtuviera la media y la desviación estándar.

Finalmente con base en la distribución normal

se calcularon los deciles que representaron el

nivel de producción para cada lactación, con 10

clases, siendo el nivel de producción 1 el más

bajo y el nivel 10 el más alto. Padre ( qs ) y

abuelo materno ( ams ), son los efectos

aleatorios de los ancestros y para su análisis se

agruparon en un solo vector S suponiendo que

siguen una distribución normal multivariada con

matriz de varianzas y covarianzas 2sA .

groups, the effect of which is not explained in

this study(8). )(tAPk is the k-th effect of age

at first parturition in months, divided into four

categories (1, 23 mo; 2, 24-25 mo; 3, 26-27

mo; and 4, 28 mo). )(tLPlm is the time-

dependent effect of the l-th lactation phase,

divided into three times (1-29, 30-249 and 250-

305 d after parturition), within the m-th

lactation (i.e. 1, 2, 3 and 4), assuming that

risk does not change within each segment.)(tMPLn is the effect of the n-th milk

production level within herd-year of first

parturition; production levels were calculated

by organizing production records in ascending

order to generate the mean and standard

deviation. Finally, deciles were calculated basedon normal milk production to represent

production level per lactation, divided into ten

categories, 1 being the lowest and 10 the

highest. Sire ( qs ) and maternal grandsiree

( mgs ) were random ancestor effects and weree

grouped into one vector ( S ) for analysis,assuming that they followed a normal

multivariate distribution with 2sA as the

variance - covariance matrix.

Heritabilities were calculated on a logarithmicscale (hlog

2)(4,9), that is, the transformation of

time (T) in a logarithmic scale, and in the

original scale (ho2), following Ducrocq(10) as

described in Chirinos et al(4):

)6

)var(4

5(

)var(42

1

2log

s

sh

h

Where: h1 , is the trigamma function

evaluated in h ; var(s) is sire’s variance; and

6

2 is the extreeme value distribution’s variance.

2log

2

2 1exp hvho

2log

2

2 1exp hvho

5


Las heredabilidades sobre una escala logarítmica

(hlog2

)(4,9), es decir, la transformación de la

variable tiempo (T) en una escala logarítmica y

en la escala original ( ho2 ), se calcularon

siguiendo la metodología de Ducrocq(10)

mencionada por Chirinos et al(4) de la siguiente

manera:

)6

)var(4

5(

)var(42

1

2log

s

sh

h

Donde: h1 , es la función trigamma evaluada

en h , Var (s) es la varianza del padre, y 6

2

es la varianza de la distribución del valor

extremo.

2log

2

2 1exp hvho

2log

2

2 1exp hvho

Donde: es la esperanza de la distribución

del valor extremo: v= negativo del número de

Euler; es la forma de la función de riesgo

basal; 2logh es la heredabilidad sobre una escala

logarítmica.

Con el objeto de verificar si la expresión de la

heredabilidad en la escala original dependía de

los estimadores de la distribución Weibull como

lo mencionaron Chirinos et al(4) y Ducrocq(10),

la heredabilidad efectiva y equivalente se calculó

como:

)1)var((

)var(41

2

s

sh

h

ef

)/1)var((

)var(41

2)(

ps

sh

h

te

Donde p es la proporción de registros

completos; esta última se aplica en este estudio.

Where: is the negative Euler number; isthe shape of the basic risk function; and

2logh

is the heritability on a logarithmic scale.

To confirm that the original scale heritability

expression depended on the Weibull distribution

estimators as reported elsewhere(4,10), effective

and equivalent heritability were calculated as

follows:

)1)var((

)var(41

2

s

sh

h

ef

)/1)var((

)var(41

2)(

ps

sh

h

te

Where p is the proportion of complete records,

which is applied in the present study.

The reliability of the predicted genetic values

for sires was calculated based on records of

their daughters(10):

4)1(

2

2

.

hh

e

e

N

NR

Where: R is the genetic value reliability of sires;

N is the number of daughters with recorded

FPL; and 2eh is the equivalent heritability..

Model effects were tested with a partial

likelihood ratio test, and estimation was done

using the maximum likelihood method(8).

RESULTS

In the total sample of 36,507 FPL records,

censoring rate was 25.5 %, cows had an

average of 2.23 lactations, average time to cull/

death was 615 d and average time to censoring

was 731 d. The data included the daughters of

1,116 sires and 1,684 maternal grandsires.

In terms of relative risk (average risk= 1) under

the influence of environmental and genetic

6


Las confiabilidades de los valores genéticos

predichos de los padres se calcularon con base

en los registros observados de sus hijas, de la

manera siguiente(10):

4)1(2

2

.

hh

e

e

N

NR

Donde: R es la confiabilidad de los valores

genéticos del padre con N hijas, N es el número

de hijas con DVPF observada y 2eh es la

heredabilidad equivalente.

Los efectos del modelo se probaron por medio

del test de razón de verosimilitudes de manera

parcial y la estimación se efectuó por el método

de máxima verosimilitud(8).

RESULTADOS

El porcentaje de censura en los 36,507 registrosde DVPF fue de 25.5 % y los tiempos promedioal desecho/muerte o censura fueron de 615 y731 días, respectivamente, con un promediode 2.23 lactaciones. Los datos incluyeroninformación de hijas de 1,116 padres y 1,684

abuelos maternos.

effects, the youngest cows (categ. 1, 23 mo)

had a greater culling risk than the cows in

lactation categories 2, 3 and 4. Age at first

parturition apparently had no effect on FPL

(Table 1, Figure 1).

Cuadro 1. Proporción y número de observaciones porfase dentro de lactación

Table 1. Proportion (%) and number (N) of observationsby phase within lactation categories and phases

Lactation

Category Phase (days) % N

1-29 0.67 181

1 30-249 11.70 3182

250-365 22.74 6181

1-29 1.30 353

2 30-249 18.00 4894

250-365 14.18 3856

1-29 1.24 337

3 30-249 12.12 3296

250-365 8.95 2434

1-29 0.77 209

4 30-249 6.33 1721

250-365 1.99 541

Figura 1. Riesgo relativo de desecho (RR) de la edad al primer parto en meses, con cuatro clases en ganado Holsteinde México

Figure 1. Relative culling risk (RR) in four categories of age (in months) at first parturition for Holstein cattle in Mexico

7


Las proporciones y número de muertes detectadas

dentro de cada FL y nivel de NPE se muestran en

los Cuadros 1 y 2 respectivamente. Para las

variables independientes incluidas en el modelo

utilizado en este estudio, todos los efectos

fueron significativos (P<0.0001).

Para facilitar la interpretación de los efectos,

los resultados se expresaron en riesgo relativo,

bajo la influencia de efectos ambientales y

genéticos, donde el riesgo promedio es 1.

Las vacas más jóvenes (clase 1, 23 meses)

presentaron un riesgo de desecho mayor que

las clases 2, 3 y 4; la edad al primer parto no

parece tener un efecto sobre la DVPF (Cuadro

1, Figura 1).

El efecto del nivel de producción estandarizado

se muestra en la Figura 2. Las vacas dentro de

los niveles de producción 1, 2 y 3 (vacas con

menores producciones estandarizadas) tuvieron

49, 5 y 2 veces mayor probabilidad de ser

desechadas que una vaca promedio (clase 6)

respectivamente, después de este nivel el riesgo

tendió a disminuir, habiendo un incremento del

Standardized production level (SPL) data showed

the cows in the lowest levels as more likely to

be culled than a cow with an average SPL

(categ. 6); this was 49 times more probable in

SPL 1, 5 times greater in SPL 2 and twice as

likely in SPL 3 (Table 2, Figure 2). Risk

diminished in levels 7, 8 and 9, and then

Cuadro 2. Proporción y número de observaciones dentrode cada nivel de producción estandarizado (SPL)

Table 2. Proportion (%) and number (N) of observationsin each standardized production level (SPL)

SPL % N

1 6.06 1648

2 5.94 1616

3 8.95 2434

4 12.81 3482

5 15.10 4105

6 15.98 4343

7 13.01 3536

8 9.66 2626

9 6.62 1801

10 5.86 1594

Figura 2. Riesgo relativo (RR) de desecho para los niveles de producción estandarizados (SPL), con 10 clases: laclase 1, representa el nivel de producción más bajo y la clase 10 el nivel más alto

Figure 2. Relative culling risk (RR) in ten standardized production levels (SPL); 1 is lowest production level and 10is highest

8


riesgo en el nivel 10, que corresponde a los

animales más altos productores.

El efecto de la fase de la lactación se muestraen la Figura 3, en una vaca con lactanciasconsecutivas. Se puede observar que el riesgode desecho tiende a incrementarse conformetranscurren los días en leche y el número delactación, alcanzando su máximo a los 305 díasdespués del parto e indicando un desechointensivo durante la tercera fase.

El parámetro Rho (ñ) de la distribución deWeibull, las varianzas del padre y el parámetrogamma para el efecto hato-año de primer parto,la heredabilidad en las escalas logarítmica,original, efectiva y equivalente se presentan elCuadro 3.

Los estimadores de los valores genéticospredichos variaron de -0.68 a 1.62, con unamedia de cero. El riesgo relativo de desechopara DVPF de las hijas de los padres estudiadospresentó un rango de 0.51 a 5.03. Valoresgenéticos negativos indicaron bajo riesgo dedesecho para las hijas de un semental y por

tanto, el incremento de su DVPF.

increased in level 10, the most productive

animals.

In cows with consecutive lactations, relative risk

of discard tended to increase concurrently with

milking days and lactation number, reaching a

maximum of 305 d after parturition (Figure 3).

The culling rate was particularly intense during

the third lactation phase (LP; 250-305 d).

Figura 3. Riesgo relativo (RR) de desecho en las fases de lactación de un animal con lactancias consecutivas:lactaciones 1, 2, 3 y 4 por tres fases de 0-29, 30-249 y 250-305 días

Figure 3. Relative culling risk (RR) in cows with consecutive lactations (1, 2, 3 and 4); each lactation is divided intothree phases (0-29, 30-249 and 250-305 d)

Cuadro 3. Parámetros genéticos estimados del análisisde supervivencia en ganado Holstein de México

Table 3. Estimated genetic parameters values for survivalof Holstein cattle in Mexico

Parameters Values

2.37

Herd-birth year effect 4.28

2 variance of father 0.0395

h2 heritability, logarithmic scale 0.08

h2 heritability, original scale 0.13

h2 effective heritability 0.12

h2 equivalent heritability 0.10

9


En los 2,800 padres analizados, la confiabilidad

de los valores genéticos osciló entre 0 y 0.95

y 179 padres contaron con una confiabilidad

mayor o igual a 0.50. En la Figura 4, se puede

observar la distribución de las confiabilidades

de los valores genéticos para los machos

evaluados.

Las tendencias genéticas para DVPF de

sementales Holstein mexicanos de acuerdo con

su año de nacimiento se muestran en la Figura

5. Las tendencias mostraron un incremento del

riesgo del año 1997 al 2002 y una ligera

disminución del riesgo en el 2003.

DISCUSIÓN

El bajo promedio de número de lactaciones por

vida obtenida en este estudio nos indica que a

esta edad las vacas pudieran no haber llegado

a expresar su máximo potencial de

producción(11,12,13), lo cual implica que son

desechadas poco después que éstas han

completado dos lactaciones, resultados similares

fueron reportados por otros investigadores(14-17).

The estimators for the predicted genetic valuesvaried from -0.68 to 1.62, with a mean of zero.Relative risk of culling for FPL in the daughtersof the studied sires ranged from 0.51 to 5.03.Negative genetic values indicated a low cullrisk for the daughters of a sire and consequentlyhigher FPL. Among the 2,800 analyzed sires,genetic value reliability varied from 0 to 0.95,with 179 sires having a level 0.50 (Figure 4).

Genetic tendencies for FPL of the studiedMexican Holstein sires by birth year showedincreasing risk from 1997 to 2003, followed bya slight decrease in 2003 (Figure 5).

DISCUSSION

Lactations per PL was low on average in thepresent data, suggesting that the cows had notyet expressed their maximum productivepotential(11,12,13). This implies that they werediscarded shortly after completing two lactations,

which coincides with previous reports(14-17).

The 25.5 % censoring rate in the records due

to incomplete data is within the 9.4 to 73.4 %

Figura 4. Distribución de las confiabilidades de los valores genéticos (GV) de los sementales en estudio de acuerdocon el número de hijas con observaciones completas

Figure 4. Genetic value (GV) reliabilities for studied sires based on number of daughters with complete records

10


range reported in other studies using the same

methodology in Holstein populations(3,4,5).

All the effects analyzed in the model were

significant (P<0.0001), although SPL and LP

made the greatest contribution to calculating

culling risk. Age at first parturition made a lesser

contribution. In other studies, this effect has

not demonstrated a clear tendency to explain

relative culling risk(4,11). However, in the present

data, it did show a slight increase in cows with

first parturition at 23 mo. This may be due to

the fact that this group includes cows that gave

birth at young ages because they were pregnantbefore 14 mo of age, as well as those that didnot complete the full 9 mo of their firstgestation, which can cause problems in later

parturitions. In older age categories, age at

first parturition had no apparent effect on FPL,

as has been reported for other Holstein

populations(4,8).

Relative culling risk associated with standardized

production levels (SPL) showed the lowest levels

(1, 2 and 3) to have the highest risk. Voluntary

culling in response to low SPL is clearly

significant in this population. Previous studies

done with data from the same population and

En este estudio, el 25.5 % de los registros no

contaba con información completa, es decir son

datos censurados, lo cual se encuentra dentro

del rango de 9.4 a 73.4 %, que reportan otros

trabajos que usaron la misma metodología en

poblaciones Holstein(3,4,5).

Todos los efectos analizados en el modelo fueron

importantes, teniendo NPE y FL una mayor

contribución a la determinación del riesgo de

desecho de un animal que la edad al primer

parto, característica que no ha presentado en

otras poblaciones una tendencia clara que

explique el riesgo relativo de desecho de los

animales(4,11).

El efecto de la edad al primer parto mostró un

ligero incremento en las vacas con partos 23

meses, lo que se puede deber a que en este

grupo se agruparon no sólo los animales queparieron a edades jóvenes por haber quedadogestantes antes de los 14 meses de edad, sinoque además incluyó a vaquillas que nocompletaron los 9 meses en su primeragestación, pudiendo esto provocar problemas

en los partos siguientes. Después de este límite,

la edad al primer parto no tuvo efecto aparente

sobre la DVPF, lo que resulta similar a los

Figura 5. Tendencias genéticas para los valores genéticos estimados (EGV) para duración de vida productiva funcionalen sementales Holstein mexicanos nacidos entre los años 1995 y 2003

Figure 5. Genetic trends of estimated genetic values (EGV) for length of functional productive life in Mexican Holsteinsires born between 1995 and 2003

11


resultados encontrados en otras poblacionesHolstein(4,8).

Al analizar los riesgos relativos asociados conlos niveles de producción, los mayores riesgosse presentaron en los niveles más bajos (1, 2y 3), indicando que el desecho voluntario porbaja producción de leche es importante en estapoblación. Lo anterior coincide con otrosestudios realizados anteriormente en la mismapoblación y en otras poblaciones Holstein, dondelos animales menos productivos presentaronincrementos en el riesgo de desecho(4,11). Porotro lado, a partir del NPE 8, el riesgoincrementó ligeramente, sugiriendo que vacasaltas productoras probablemente estén bajo unmanejo fisiológico más intenso que las vacasmenos productoras, lo que repercute sobre suDVPF(8,9).

Para las lactaciones analizadas, el riesgo dedesecho en los últimos días de la lactación deuna vaca con lactaciones consecutivas fuemayor, lo que no es sino un reflejo de laseliminaciones de las vacas no gestantes queocurren al final de la lactación, lo que a su vezse puede deber a problemas reproductivos ode salud de la vaca(16,17). Estas tendencias deriesgo relativo de desecho son similares a losresultados publicados por Ducrocq(9) y Chirinoset al(4), donde se observó un incremento dedesecho al final de cada lactación. Es importantemencionar que por la manera en que se definela FL, los primeros niveles de esta variable seránsiempre más homogéneos que los últimos, yaque se van adicionando efectos de edad nocontabilizada en el cálculo de vida productivapor los días en lactación superiores a 305 días,o a los periodos interparto que no se contabilizancon esta metodología.

El parámetro ñ estimado en este estudio fue2.37 y se encuentra dentro del rango de valoresestimados en otras poblaciones Holstein quevarían entre 0.36 a 5.0(4,9,10). Este resultadoes coherente con lo observado, ya que un valorde superior a 1, indica que el riesgo de

desecho incrementa con la edad del animal.

other Holstein populations also documentedgreater culling risk in less productiveanimals(4,11). Risk also increased slightlybeginning at SPL 8, suggesting that highproducing cows experience more intensephysiological stress than lower producers, whichcan affect their FPL(8,9).

Culling risk also increased in the final days ofa lactation in cows with consecutive lactations.This reflects elimination of non-gestating cowsat the end of lactation, possibly due toreproductive or health problems(16,17). Thesetendencies coincide with previous studiesreporting increased culling rates at the end ofeach lactation. The way LP is defined caninfluence these results since the first LP levelwill always be more homogeneous than thelast ones. At later LP levels, age effects beginto accumulate but this are not included incalculation of the PL by days in lactation beyond305 d, nor in inter-parturition periods, whichare not part of this methodology.

The estimated parameter was 2.37, a valuewithin the 0.36 to 5.0 reported for other Holsteinpopulations(4,9,10). This value supports therecorded data since values greater than 1indicate increased culling risk as animals age.The gamma parameter represents the variancewithin herd-year. Values greater than 1indicate heterogeneity in culling practices(8).The 4.28 gamma value in the present studyis similar to those reported in other Holsteinpopulations(3,4,13). Variation in cull ingpractices may be related to varying levels ofmechanization throughout Mexico, an aspectrequiring further research.

Heritabilities in this study were 0.08 in thelogarithmic scale, 0.13 in the original scale,0.12 in the effective scale and 0.10 forequivalent heritability. All these are withinpublished ranges: 0.02 to 0.11 for thelogarithmic scale and 0.038 to 0.22 for theoriginal scale(3,4,8); and 0.048 to 0.108 for theeffective and equivalent scales(4,10,18). However,the estimators were higher than reported in a

12


El parámetro gamma corresponde a la varianzadentro de cada hato-año y se considera que unvalor mayor a 1 indica que existeheterogeneidad en las prácticas de desecho delos ganaderos(8). En este estudio el valor degamma fue 4.28, resultado que es similar alreportado en otras poblaciones Holstein(3,4,13).Este resultado indica que las prácticas dedesecho podrían estar relacionadas condiferentes niveles de tecnificación en diferentespartes de México, lo que deberá ser evaluadoen futuros trabajos.

Las heredabilidades calculadas en este estudiofueron 0.08 en una escala logarítmica, 0.13 enla escala original, 0.12 en la escala efectiva y0.10 para la heredabilidad equivalente. Estosvalores están dentro del rango de los publicadospor otros investigadores, los cuales han osciladoentre 0.02 y 0.11 cuando fueron expresados enuna escala logarítmica y de 0.038 a 0.22 sobreuna escala original(3,4,8), 0.048 a 0.108 parauna escala efectiva y equivalente(4,10,18). Sinembargo, los estimadores obtenidos fueronsuperiores a los reportados por un trabajoanterior en la misma población utilizandomodelos lineales(7). Esta diferencia en lasheredabilidades estimadas se debe a que elmodelo de supervivencia del presente estudiofue superior para explicar los efectosambientales, y en consecuencia aislar los efectosgenéticos aditivos que están asociados con elcarácter de interés, resultando ser mejor paraestimar parámetros genéticos y predecir valoresgenéticos de DVPF. Los cálculos realizados conestos procedimientos dieron como resultado unaheredabilidad similar a la que ha sido reportadaen otros estudios(8,10,18). Recientesinvestigaciones muestran extensiones de lasfórmulas a otros modelos para los efectosgenéticos de otras especies animales(19), queno dependen del parámetro ñ y del valorextremo de la distribución, y que no se utilizanen este estudio.

La confiabilidad de los valores genéticos paralos padres varió de 0.0 a 0.96. Esta variabilidadse debe a que la confiabilidad de las predicciones

previous study in the same population usinglinear models(7). These discrepancies inheritabilities occur because the survival modelused in the present study is superior to previousmodels for explaining environmental effects.It can consequently isolate the additive geneticeffects associated with the trait of interest,and is better for estimating genetic parametersand predicting FPL genetic values. Calculationsdone using these procedures producedheritability values similar to those reportedelsewhere(8,10,18). Recent research hasdemonstrated extensions of the formulas toother models for the genetic effects of otheranimal species(19). These do not depend on ñor the extreme value distribution, which wasnot used in the study.

Reliability of the sires’ genetic values rangedfrom 0.0 to 0.96. This variability is caused bythe fact that the reliability of genetic predictionsmade using survival models is calculated basedon the number of daughters with complete(observed) records and not a sire’s total numberof daughters. Because of this, younger siresmay be at a disadvantage since most of theirdaughters will still be alive at the time ofevaluation, substantially lowering predictionreliability(8,9). The same reliability behavior hasbeen reported in countries such as Spain, Franceand Switzerland(4,10,11), where survival modelshelp produce better predictors of sire FPLgenetic values.

Sire FPL genetic values calculated based ondaughter longevity in Mexico exhibited anincrease in relative culling risk as sire birth yearadvanced. This increase implies an importantdecrease in genetic values that may be due toincreased selection of sires by breeders forpredicted transmission of improved milkproduction in recent years. Aimed at producing

high milk production cows, has affected

daughter FPL since high milk production is

associated with shorter FPL, probably due to

health and fertility problems, as observed in

the present study. These genetic tendencies

13


genéticas utilizando modelos de supervivenciase calcula con base en el número de hijas conobservaciones completas y no a través delnúmero total de hijas. Lo anterior puederepresentar una desventaja para los padresjóvenes, ya que es de esperase que la mayoríade sus hijas se encuentren vivas al momentode la evaluación y por ello la confiabilidad desu predicción genética sea muy baja(8,9). Estecomportamiento de las confiablidades es similara lo reportado en otros países como España,Francia y Suiza(4,10,11) donde, como en esteestudio, los modelos de supervivenciapermitieron obtener mejores predictores de losvalores genéticos de los sementales para DVPF.

Los valores genéticos para DVPF de lossementales, calculados con base en lalongevidad de sus hijas en México, mostraronun incremento en los riesgos relativos dedesecho a medida de que el año de nacimientode los mismos aumentaba. El incremento en elriesgo relativo implica la disminución de losvalores genéticos y puede ser debida a quedurante los últimos años, los ganaderos hanseleccionado a los sementales por su habilidadde transmisión predicha para producción deleche, con el objetivo de tener vacas con altasproducciones, y esto a la vez ha afectado laDVPF de las hijas, debido a que la altaproducción de leche está asociada a cortas DVPFprobablemente por problemas de salud ofertilidad como lo indican los resultados en esteestudio. Estas tendencias genéticas sondiferentes a las reportadas para países talescomo Francia, Alemania y Canadá, donde se haencontrado un descenso en el riesgo de desechopara las hijas de los sementales conforme avanzael tiempo, lo que se puede deber a que desdehace varios años, la característica de DVPF seha incluido en los programas de mejoramientogenético(9-12).

CONCLUSIONES E IMPLICACIONES

La magnitud de las heredabilidades estimadasde 0.08 y 0.13 sobre una escala logarítmica yoriginal, respectivamente, 0.12 y 0.10 para una

differ from those reported for countries such as

France, Germany and Canada where culling risk

has declined over time for the daughters ofHolstein sires. Most likely this is in response toinclusion of FPL in genetic improvementprograms for many years(9-12).

CONCLUSIONS AND IMPLICATIONS

The estimated heritabilities observed in thepresent study (0.08 for logarithmic scale; 0.13for original scale; 0.12 for effective scale and

0.10 for equivalent scale) indicate that this traitcan be effectively integrated into geneticimprovement programs, as has occurred in otherHolstein populations. The Weibull distribution

and associated regression model adequatelyrepresented length of functional productive life

for Holstein cattle in Mexico and are useful incalculating heritability and predicting geneticvalues for this trait.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors thank the Asociación Holstein de

México, and Dr. Vincent Ducrocq and Dr. ZuleimaChirinos for assistance with the Survival Kit

program. The research reported here forms partof the project “Aplicación de herramientas

genómicas en el mejoramiento genético de lafertilidad del ganado Holstein productor de

leche” (No. SIGI: 11402733072).

End of english version

escala efectiva y equivalente, respectivamente,indica que esta característica se puede integrarefectivamente a los programas de mejoramientogenético como se ha hecho en otras poblacionesde ganado Holstein, que pueden serconsideradas como elementos de selecciónindirecta para la duración de vida productiva

14


funcional. La distribución de Weibull y el modelode regresión asociado son adecuados pararepresentar la duración de vida productivafuncional de ganado Holstein en México, y paracalcular la heredabilidad y predecir valoresgenéticos para este carácter.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece el apoyo a la Asociación Holsteinde México y al Dr. Vincent Ducrocq y la Dra.Zuleima Chirinos por su ayuda yrecomendaciones con el programa “Survival kit”.El trabajo fue parte del proyecto “Aplicación deherramientas genómicas en el mejoramientogenético de la fertilidad del ganado Holsteinproductor de leche” No. SIGI: 11402733072.

LITERATURA CITADA

1. Ducrocq V, Quaas RL, Pollak EJ, Casella G. Length ofproductive life in dairy cows. 1. Justification of a WeibullModel. J Dairy Sci 1988;71:3061-3070.

2. Ducrocq V, Quaas RL, Pollak EJ, Cassella G. Length ofproductive life of dairy cows. 2. Variance componentestimation and sire evaluation. J Dairy Sci 1988;71:3071-3079.

3. Sewalem A, Kistemaker GJ, Ducrocq V, Van Doormaal BJ.Genetic analysis of herd life in Canadian dairy cattle on alactation basis using a Weibull proportional hazards model.J Dairy Sci 2005;88:368-375.

4. Chirinos Z, Carabaño MJ, Hernandez D. Genetic evaluationof length of productive life in the Spanish Holstein-Friesian

population. Model validation and genetic parametersestimation. Livestock Sci 2007;106:120-131.

5. Roxström A, Ducrocq V, Strandberg E. Survival analysis oflongevity in dairy cattle on a lactation basis. Genet Sel Evol

2003;35:305-318.

6. Ruíz LF, Oltenacu PA, Blake RW. Efecto del nivel deproducción de leche sobre la duración de vida productiva

en ganado Holstein de registro en México. Téc Pecu Méx1994;32(3):105-112.

7. Valencia MP, Ruiz LF, Montaldo VH. Estimación de parámetrosgenéticos para características de longevidad y producción

de leche en ganado Holstein de México. Interciencia2004;(29):52-56.

8. Ducrocq V. Statistical analysis of length of productive life

for dairy cows of the Normande breed. J Dairy Sci1994;77(3):855-866.

9. Ducrocq V. Two years of experience with the French geneticevaluation of dairy bull on production - adjusted longevity

of their daughter. Proc Inter Workshop in EU. Concertedaction for Genetic Improvement of Functional Traits in Cattle(GIFT): Longevity. Jouy-en-Josas, Francia. Interbull Bulletin,

1999;21:60–68.

10. Ducrocq V. An improved model for the French geneticevaluation of dairy bulls on length of productive life of theirdaughters. Anim Sci 2005;80:249-256.

11. Vukasinovic N, Moll J, Casanova L. Implementation of a

routine genetic evaluation for longevity based on survivalanalysis techniques in dairy cattle populations in Switzerland.J Dairy Sci 2001;84:2073-2080.

12. Dürr JW, Monardes HG, Cue RI. Genetic analysis of herdlife in Quebec Holsteins using Weibull models. J Dairy Sci1999;82:2503-2513.

13. Terawaki Y, Katsumi T, Ducrocq V. Development of a survival

model with piecewise Weibull baselines for the analysis oflength of productive life of Holstein cows in Japan. J DairySci 2006;89:4058-4065.

14. Vitela MI, Cruz VC, Ramos PM. identificación de las causas

de desecho en cinco establos lecheros de AguascalientesMéxico. Téc Pecu Mex 2004;42(3):437-444.

15. Bascom SS, Young AJ. A summary of the reasons why

farmers cull cows. J Dairy Sci 1998;81:2299-2305.

16. Weigel KA, Palmer RW, Caraviello DZ. Investigation of factoraffecting voluntary and involuntary culling in expanding dairyherds in Wisconsin using survival analysis. J Dairy Sci

2003;86:1482-1468.

17. Hare E, Norman HD, Wright JR. Survival rates and productiveherd life of dairy cattle in the United States. J Dairy Sci2006;(89):3713-3720.

18. Yazdi MH, Visscher PM, Ducrocq V, Thompson R. Heritability,

reliability of genetic evaluations and response to selectionin proportional hazard models. J Dairy Sci 2002;85:1563-1577.

19. Meszaros G, Pálos J, Ducrocq V, Sölkner J. Heritability oflongevity in Large White and Landrace sows using continuoustime and grouped data models. Genet Select Evol 2010:42:1-

13.

15

CURVAS DE LACTANCIA INDIVIDUALES EN VACAS SIBONEY DE CUBARev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):15-28

Curvas de lactancia individuales en vacas Siboneyde Cuba

Individual lactation curves in Siboney dairy cows of Cuba

Alejandro Palacios Espinosaa, Dianelys González-Peña Fundorab, Danilo Guerra Iglesiasc,

José Luis Espinoza Villavicencioa, Ricardo Ortega Péreza, Ariel Guillén Trujilloa,Narciso Ávila Serranod

RESUMEN

El objetivo fue estudiar y modelar las curvas de lactancia individuales en vacas Siboney, comparando cuatro modelosmatemáticos. En total, 31,631 registros de producción de leche del día de control (PDC) de 3,697 lactancias (1 a 5)

provenientes de 2,632 vacas Siboney de Cuba (5/8 Holstein 3/8 Cebú Cubano) registrados mensualmente entre 1994

y 2003 se ajustaron mediante las funciones de Wood, Wilmink, Ali-Schaeffer y Polinomios de Legendre. Los parámetros

se estimaron usando regresiones no lineales y la bondad de ajuste se midió mediante el coeficiente de determinación

ajustado (R2A). Se obtuvieron valores de R2

A > 0.75 en 23, 24, 28 y 36 % de las lactancias para los modelos de Wood,

Wilmink, Ali-Schaeffer y Polinomios de Legendre, respectivamente. Los modelos de Wood y Wilmink describieron

cuatro tipos de curvas; y los modelos de Ali-Schaeffer y los Polinomios de Legendre 17 y 20, de los 32 grupos teóricos

posibles. Las correlaciones entre los parámetros para la función de Ali-Schaeffer fueron superiores a las estimadaspara los polinomios de Legendre. Las funciones propuestas representaron las diferentes formas entre curvas de

lactancia y en especial, los modelos de cinco parámetros detectaron mayor diversidad que el resto de las funciones.Esto apunta que, aunque formas adicionales pueden considerarse como derivaciones de los dos grupos clásicos decurvas típicas o atípicas, esta práctica podría comprometer la variabilidad entre curvas de lactancia en un hato, por

lo que serán necesarios más estudios.

PALABRAS CLAVE: Vacas, Lactancia, Curvas, Modelos matemáticos.

ABSTRACT

The objective was to study and to model the individual lactation curves in Siboney cows comparing four mathematical

models. In total, 31,631 test day milk production records (TD) of 3,697 lactations (1 to 5) from 2,632 Siboney cows

of Cuba (5/8 Holstein, 3/8 Cebu Cuban) monthly recorded between 1994 and 2003 were adjusted using the functionsof Wood, Wilmink, Ali-Schaeffer and Legendre polynomials. The parameters were estimated using nonlinearregressions and the goodness of fit was measured by the adjusted coefficient of determination (R2

A). Values of

R2A> 0.75 in 23, 24, 28, and 36 % of the lactations for the models of Wood, Wilmink, Ali-Schaeffer and Legendre

polynomials, respectively, were obtained. The models of Wood and Wilmink described four types of curves and

the models of Ali-Schaeffer and the Legendre polynomials 17 and 20 for 32 possible theoretical groups. The

correlations among the parameters of Ali-Schaeffer function were higher than that estimated for the Legendre

polynomials. The proposed functions represented the different shapes among lactation curves and in particular the

five parameters models detected higher diversity related to the rest of the function. This pointed that even if

additional detected shapes can be considered as derivations of the two classical groups of typical or atypical curves,

this practice could compromise the variability among lactation curves inside a herd, therefore further studies are

needed.

KEY WORDS: Cows, Lactation curves, Mathematical models.

Recibido el 23 de octubre de 2014. Aceptado el 24 de noviembre de 2014.

a Universidad Autónoma de Baja California Sur, México. Carr. al Sur, km. 5.5, La Paz, B.C.S. CP 23080. México. [email protected]. Correspondencia al cuarto autor.

b Universidad de Illinois, USA.

c Centro de Investigación para el Mejoramiento Animal de la Ganadería Tropical, La Habana, Cuba.

d Universidad del Mar, Puerto Escondido, Oaxaca, México.

16

Alejandro Palacios Espinosa, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):15-28

INTRODUCCIÓN

La curva de lactancia puede ser definida comoun proceso biológico explicado por una ecuaciónmatemática(1), la cual es útil en el pronósticode la producción total a partir de muestrasparciales. La cantidad de leche producidadepende de la trayectoria de la curva delactancia, la cual es influenciada por factoresgenéticos y ambientales(2). La curva de lactanciaes una herramienta que permite entender yevaluar el comportamiento fisiológico de laproducción de leche y puede usarse paraconocer el potencial genético de un hato o razade ganado lechero(3). El conocimiento de lascurvas de lactancia permite predecir laproducción total de leche con una o variasmediciones realizadas los días de control enlactancias tempranas(4). El potencial genéticopara la producción de leche, así como la formay altura de la curva son influenciadas porlactancias consecutivas, edad al parto, laestación en que ocurre el parto(5), etapa de lapreñez(6) y por la longitud del periodo secoprevio(2). Además, los sistemas de manejo yalimentación diferentes en las distintas zonasgeográficas, regiones y países influyen demanera importante en la producción de las vacaslecheras(7,8,9).

Se han usado varios modelos matemáticos paradescribir las curvas de lactancia y estimar laproducción de leche esperada(2). Algunos estánorientados a un mejor ajuste de las funcionesmatemáticas con una menor consideración dela biología de la lactación(10) y otros estánenfocados a mejorar el entendimiento de losprocesos biológicos(11).

Cuando se ajustan las producciones del día decontrol con ecuaciones de regresión empíricaspueden detectarse varias formas de curvas delactancia; algunas de ellas consisten en ligerasmodificaciones de la curva estándar, porejemplo, por la presencia o ausencia de unpunto de inflexión en la parte decreciente de lalactancia; otras son diferentes, como las curvasque decrecen continuamente y carecen del picode lactancia(12).

INTRODUCTION

A lactation curve is the result of an explanationof a biological process with a mathematicalfunction(1), and is useful in predicting totalproduction from partial samples. Milk productionis represented by the lactation curve trajectory,and is influenced by genetic and environmentalfactors(2). Lactation curves help to understandmilk production physiological behavior and canbe used to research the genetic potential of adairy cattle herd or breed(3). By applyinglactation curves, total milk production can bepredicted with one or a number ofmeasurements taken on control days in earlylactations(4). Milk production genetic potentialand the shape and height of lactation curvesare affected by factors such as the number ofconsecutive lactations, age at parturition, seasonof calving(5), gestation stage(6), and length ofprevious dry period(2). The handling and feedsystems used in different geographic zones,regions and countries can also have a significanteffect on dairy cow milk production(7,8,9).

Many mathematical models have been used todescribe lactation and estimate expected milkproduction(2). Some of these models focus onattaining the best fit for the mathematicalequations and give less weight to lactationbiology(10), while others aim at improvingunderstanding of biological processes(11).

When control day production data are fittedusing empirical regression equations, differentlactation curve shapes can be identified. Someare slight modifications of the standard (typical)curve, for instance, due to the presence orabsence of inflection points in the descendingportion of a lactation curve. Others can differnotably from the standard curve, such as curvesthat decline continually and have no lactationpeak(12).

Most studies using lactation curves are focusedon identifying the curve with the best fit amongaverage curves. That with the best fit is thenused to fit all the lactations in a data set.Applying these criteria to identify the best model

17

CURVAS DE LACTANCIA INDIVIDUALES EN VACAS SIBONEY DE CUBA

En general, los estudios se han dirigido a curvaspromedio para seleccionar aquélla con mejorajuste, y esta función es adoptada para el ajustede todas las lactancias en el conjunto de datos.Estos criterios para seleccionar el mejor modelomuchas veces ignoran los problemas estadísticoso biológicos que pueden ocurrir cuando el ajustees extendido a lactancias individuales. Lasconsecuencias pueden ser estimaciones deparámetros irreales(13).

El concepto primario de los modelos genéticospara producción de leche se basa en que losanimales pueden diferir genéticamente, no soloen la producción de leche total, sino tambiénen la forma de la curva de lactancia(14). Estavariación en la forma de la curva individual deproducción de leche se ha investigado en variasespecies(5,15). Sin embargo, es importanteencontrar para cada circunstancia de producción,la función matemática que mejor describa elfenómeno en cuestión(16). El objetivo de estetrabajo fue estudiar y modelar, a partir de cuatromodelos matemáticos, las curvas de lactanciaindividuales que se presentan en el genotipoSiboney de Cuba.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se utilizó información de ganado bovino Siboney(5/8 Holstein 3/8 Cebú Cubano) de la provinciaPinar del Río, Cuba. En dicha región existendos estaciones claramente definidas, la de lluvias(verano) de mayo a octubre, con 70 a 80 % dela precipitación (960 mm), y la estación seca(invierno) de noviembre a abril (240 mm). Latemperatura media anual es de 23.1 °C, conhumedad relativa de 60 a 70 % durante el díay de 80 a 90 % durante la noche(17).

Se analizaron 31,631 registros de producciónde leche del día de control (PDC) de 3,697lactancias (de la primera a la quinta) controladasmensualmente en 2,632 vacas nacidas entre1987 y 1999. El sistema de alimentación estuvobasado en pastoreo de 12 h al día,aproximadamente. Los pastos utilizados fueronzacate estrella (Cynodon nlemfuensis) y Guinea

often ignores statistical or biological problems

that may occur when the fit is extended to

individual lactations. This can result in inaccurate

parameter estimation(13).

In milk production genetic models, the primary

concept is that animals can differ genetically,

both in terms of total milk production and their

lactation curve shape(14). Variation in milk

production curve shape occurs in different

species(5,15). Given this variation, it is vital to

find the most appropriate mathematical function

that best describes each production situation(16).

The present study objective was to apply four

mathematical models to analyze and model

individual lactation curves in the Siboney

genotype of Cuba.


Data analyzed in this study were from Siboney

cattle (5/8 Holstein, 3/8 Cuban Zebu) from Pinar

del Río province, Cuba. This region has two

clearly defined seasons: a rainy season from

May to October with 70 to 80 % (960 mm) of

yearly rainfall; and a dry season from November

to April (240 mm). Average annual temperature

is 23.1 °C, relative daytime humidity is 60 to

70 % and relative nighttime humidity is 80 to

90 %(17).

A total of 31,631 test day milk yield (TDMY)

records were analyzed from 3,697 monthly

controlled lactations (first to fifth) in 2,632 cowsborn between 1987 and 1999. Feed systemwas daily grazing for approximately 12 h daily.Star grass and Guinea grass were the principalfeed, although the cows also grazed naturally

occurring grasses in the rainy season. The cowswere milked twice daily, and provided a 0.45

kg concentrate supplement beginning at thefourth liter of milk produced. The cows werecorralled at night and fed king grass (Penisetumpurpureum) and sugar cane (Saccharumofficinarum).

18


(Panicum maximum), y durante la estación delluvias las vacas consumieron también pastosnaturales. Las vacas se ordeñaron dos veces aldía y durante cada ordeño se suplementaroncon 0.45 kg de concentrado a partir del cuartolitro de leche producido. Por las noches, losanimales se confinaron y se alimentaron conking grass (Penisetum purpureum) y caña deazúcar (Saccharum officinarum).

Para modelar curvas de lactancia se utilizaronlas siguientes funciones previamente aplicadasy usadas en la población para modelar curvaspromedios:

Wood(10): Yt= a.tb.ect

Wilmink(18): Yt= a+be-kt+ct

Ali y Schaeffer(19): Yt= a+b(t/330)+c(t/330)2+dlog(330/t)+k[log(330/t)]2

Polinomios de Legendre normalizados de cuartoorden(20): Yt= 0xP0+1xP1+2xP2+3xP3

+4xP4

En todos los modelos, Yt es la PDC en el tiempo t,correspondiente a los días en lactancia almomento del pesaje de la leche. Los parámetrosa, b, y c se encuentran asociados al nivel deproducción y el parámetro k está relacionadocon el tiempo al pico de lactancia y usualmentese asume como fijo(18,21). En el modelo deWilmink se asumió que k= 0.10(22). Lasfunciones de tiempo Pj de los modelos queutilizan polinomios de Legendre se calcularoncon los valores publicados por Schaeffer(23).

Clasificación de las curvas de lactancia

En la función de Wood, cuando b>0 y c<0corresponde a una curva estándar (típica). Porel contrario, si b<0 y c>0 se presenta unacurva reversa con una fase inicial decreciente,seguida de un incremento. La combinación deb>0 y c>0 representa una curva que aumentacontinuamente, mientras que la solución b<0 yc<0 describe una curva que decrececontinuamente(24).

Lactation curves were modeled using four

functions applied previously in this populationto model average curves:

Wood(10): Yt= a.tb.ect

Wilmink(18): Yt= a+be-kt+ct

Ali and Schaeffer(19): Yt= a+b(t/330)+c(t/330)2+dlog(330/t)+k[log(330/t)]2

Fourth order, normalized Legendre orthogonalpolynomials(20): Yt= 0xP0+1xP1+2xP2+3xP3

+4xP4

In all four models, Yt is TDMY in time t,corresponding to lactation days at the time ofmilk weighing. Parameters a, b, and c areassociated with production level, and parameter kis linked to time at peak lactation and is usuallyassumed to be fixed(18,21). In the Wilminkmodel, k= 0.10 was assumed(22). Timefunctions (Pj) included in the models usingLegendre polynomials were calculated withvalues published by Schaeffer(23).

Lactation curve classification

In the Wood function, b>0 and c<0corresponded to a standard (typical) curve. Incontrast, if b<0 and c>0, the curve was areverse standard curve with an initiallydecreasing phase followed by an increase. Theb>0 and c>0 combination represents acontinuously increasing curve, while b<0 andc<0 describes a continuously decreasingcurve(24).

The same four curve shapes can be describedby the Wilmink function but with differentparameter values: b<0 and c<0 is a typicalcurve; b>0 and c>0 is a reverse curve with aminimum point; b<0 and c>0 is a continuouslyincreasing curve; and b>0 and c<0 correspondsto a continuously decreasing curve(15).

The Ali-Schaeffer and Legendre polynomialsfunctions describe 32 possible lactation curveshapes(25).

19


Las mismas cuatro formas de curva pueden serdescritas por la función de Wilmink pero condiferente valor de parámetros, ya que si b<0 yc<0 se presenta la forma típica de la curva,mientras que si b>0 y c>0 la curva es reversacon un punto mínimo. Valores de b<0 y c>0resultan en una curva que se incrementacontinuamente, mientras que b>0 y c<0corresponde a una curva decreciente en formacontinua(15).

Las funciones de Ali-Schaeffer y polinomios deLegendre describen 32 posibles formas decurvas de lactancia(25).

La bondad de ajuste de los cuatro modelosutilizados se determinó mediante el R2

A y fueclasificado en cuatro niveles (1<0.24; 2=0.25-0.49; 3=0.50-0.74; 4>0.75) con el objetivo decrear clases que permitieran observar el ajustede los modelos a las diversas curvas de lactanciaindividuales.

Sólo se utilizaron las curvas individuales conR2

A superiores a 0.75. Las curvas de lactanciase agruparon de acuerdo a la combinación delos valores de sus parámetros, calculándose lacorrelación entre los mismos. Los análisis seefectuaron con el procedimiento NLIN delSAS(26).

RESULTADOS

La producción promedio de leche del día de

control fluctuó entre 5.9 ± 3.3 y 3.7 ± 2.0 kgcon una media general de 4.9 ± 2.7 kg entrelas PDC. El 23, 24, 28 y 36 % de las lactanciaspresentaron R2

A superiores a 0.75 para lasfunciones de Wood, Wilmink, Ali-Schaeffer y

polinomios de Legendre (Cuadro 1).

Al seleccionar las curvas con R2A superiores a

0.75, los modelos de tres parámetrosreconocieron los cuatro tipos de curvas posibles(Cuadro 2). El modelo de Wood detectó unmayor número de curvas estándar (61 %) encomparación con el modelo de Wilmink (47 %).

Goodness of fit for all four models was calculatedwith R2

A and classified in four levels (1<0.24;2=0.25-0.49; 3=0.50-0.74; 4>0.75). Theresulting categories helped to observe modelfit to the different individual lactation curves.Only individual curves with R2

A >0.75 wereused. The lactation curves were grouped basedon the combination of the values of theirparameters, and the correlation between themcalculated. All analyses were run with the NLINprocedure in the SAS package(26).

RESULTS

Average TDMY varied from 5.9 ± 3.3 to 3.7 ±2.0 kg, with an overall mean of 4.9 ± 2.7 kg.Values for R2

A were >0.75 in 23 % of lactationsusing the Wood function, 24 % using theWilmink function, 28 % with the Ali-Schaefferfunction, and 36 % when using the Legendrepolynomials function (Table 1). When R2

A curves>0.75 were selected, the three-parametermodels identified four types of curves (Table 2).The Wood model identified more (61 %) standardcurves than the Wilmink model (47 %).

In curves modeled with the Wood function forincreasing b values, estimates during the firstlactation increased (Figure 1a), whereas inatypical curves increases in b did not persist(Figure 1b). With the Wilmink function, in

Cuadro 1. Frecuencias absolutas y porcentajes relativos(en paréntesis) de los ajustes en diferentes clases decoeficientes de determinación ajustados (R2

A)

Table 1. Absolute frequencies and relative percentages(in parentheses) of fits in different classes of fittedcoefficients of determination (R2

A)

Models

R2A Wood Wilmink Ali-Schaeffer Legendre

<0.25 1677 (45.3) 1560 (42.2) 1367 (36.9) 824 (22.4)

0.26-0.50 450 (12.1) 545 (14.7) 490 (13.2) 563 (15.2)

0.51-0.75 707 (19.1) 714 (19.3) 812 (21.9) 969 (26.2)

>0.76 863 (23.3) 878 (23.7) 1028 (27.8) 1341 (36.2)

20


En las curvas típicas modeladas con la funciónde Wood para valores que se incrementan deb, existe una tasa de incremento de lasestimaciones en la primera parte de la lactancia(Figura 1a), mientras que en las curvas atípicas(Figura 1b) los incrementos de b resultan enuna reducida persistencia. En cambio, en las

contrast, the typical curves had a convex shapethat was accentuated by negative b values(Figure 1c), whereas in atypical curves positive bvalues accentuated the curve’s concave shape(Figure 1d). This highlights the difference inmeaning of the b parameter between the twocurve groups within the same model, and

Cuadro 2. Medias y desviaciones estándar de los parámetros para curvas individuales, clasificados de acuerdo con lascuatro formas detectadas por los modelos de Wood y de Wilmink

Table 2. Means and standard deviations of individual curve parameters classified according to the four shapes identifiedby the Wood and Wilmink models

Wood Model Wilmink Model

Shape§ n¶ Log a Log b Log c n¶ Log a Log b Log c

1 523 3.5±3.7 0.64±0.6 -0.01±0.01 409 11.1±3.7 -8.2±7.9 -0.4±02 199 24.3±20.5 -0.21±0.1 -0.01±0.01 380 7.8±3.2 7.2±6.6 -0.02±03 133 52.9±40.2 -0.74±0.4 0.01±0.01 77 2.1±1.1 13.9±11 0.01±04 8 1.8±2.7 0.28±0.1 0.01±0.01 12 4.7±3.1 -5.0±6.2 0.01±0

§ Lactation curve shapes: 1= typical; 2= continuously descending (atypical); 3= reverse standard; 4= continuously increasing.¶ sample size.

Figura 1. Formas de curvas típicas (a y c) y atípicas (b y d) detectadas por los modelos de Wood y de Wilmink,seleccionadas para valores crecientes del parámetro b

Figure 1. Typical (a and c) and atypical (b and d) lactation curve shapes identified by the Wood and Wilmink models;chosen for increasing b parameter values. DIM= days in milk; TDYM= test day yield milk

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330

TD

MY (kg/d

ay)

DIM

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

16.0

30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330

TD

MY

(kg/d

ay)

DIM

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330

TD

MY (kg/d

ay)

DIM

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330

TD

MY (kg/d

ay)

DIM

Wood

Wilmink

a) = 0.09; = 0.52; = 2.24 b) = -0.57; = -0.200; = -0.029

c) = -36.97; = -13.36; = -1.2 d) = 0.09; = 8.39; = 16.7

21


curvas típicas obtenidas con la función deWilmink, la forma convexa se acentúa paravalores negativos de b (Figura 1c), mientrasque en las atípicas, valores positivos de bacentúan la forma cóncava de la curva (Figura1d). Lo anterior resalta la diferencia en elsignificado del parámetro b entre los dos gruposde curvas dentro del mismo modelo;confirmando además la relación entre los valoresde b y la tasa de variación en la primera partede la curva.

Los modelos de Ali-Schaeffer y Legendrereconocieron 17 y 20 tipos de curvas,respectivamente, de los 32 grupos teóricosposibles. Sin embargo, cada grupo puede serconsiderado el resultado de una deformaciónespecífica de las dos formas básicas (típica oatípica), presentándose cierta variabilidad enfunción de la presencia de puntos de inflexiónen los dist intos grupos de curvas. Seconsideraron los cuatro grupos de curvas conmayor frecuencia. Las medias de los valoresabsolutos para los parámetros de las curvasobtenidas con Ali-Schaffer se presentan en elCuadro 3.

Las curvas individuales estimadas para los cuatrogrupos principales con el modelo de Ali Schaefferse presentan en la Figura 2. En el grupo 1(Figura 2a) el incremento del parámetro brepresenta un aumento de la producción deleche al principio de la lactancia. En el grupo 2(Figura 2b) un incremento en b enmarca la

confirms the link between b values and thevariation rate in the first portion of the curve.

Of the 32 theoretically possible groups, the Ali-Schaeffer model identified 17 curve types andthe Legendre polynomials model 20 types.Nonetheless, each group was essentially theresult of a specific deformation of the two basicshapes (typical and atypical). Variability occurredin the form of inflexion points within the twocurve groups. The four curve groups with thehighest frequencies were included in the analysis(Table 3).

Estimates for individual curves were generatedfor each of the four main Ali-Schaeffer modelcurve groups (Figure 2). In group 1, the increasein parameter b represented a rise in milkproduction at the beginning of lactation (Figure2a), whereas in group 2 an increase in b markedthe decline rate of the curve’s initial portion.Inflexion points occurred in both groups at 60 d,a clear consequence of the high flexibility offive-parameter models, which can identifydifferent rates of decreased or increased milkproduction throughout lactation. However, theopposite sign in the parameters means that thesequence of changes in curvature is the oppositein the two groups. The patterns in groups 3(Figure 2c) and 4 (Figure 2d) are examples ofdifferent consequences in response to anincrease in the b parameter. In group 3, thecurvature in the second portion increased whilein group 4 it tended to decline linearly.

Cuadro 3. Distribución de los parámetros (media ± desviación estándar) de curvas individuales clasificadas de acuerdocon los cuatro grupos con mayor frecuencia detectados por Ali Schaeffer

Table 3. Parameter distribution (mean ± standard deviation) of individual curves classified based on the four groupsmost frequently identified by the Ali-Schaeffer model

Group Frequency a b c d e

1 437 -180.2 ± 25.1 296.4 ± 42.0 -131 ± 21.7 113.7 ± 15.8 -19.1 ± 25.2

2 387 186.0 ± 30.3 -290.0 ± 50.9 118 ± 23.2 -107.3 ± 18.4 18.1 ± 31.0

3 51 -29.1 ± 29.6 8.8 ± 12.1 51.9 ± 64.6 29.4 ± 28.2 -5.9 ± 6.8

4 42 4.2 ± 3.5 7.2 ± 5.7 -18.6 ± 14.4 3.3 ± 1.8 -0.7 ± 0.4

22


tasa de declive de la parte inicial de la curva.En ambos grupos se observan puntos deinflexión ubicados a los 60 días, una claraconsecuencia de la alta flexibilidad de losmodelos de cinco parámetros, que son capacesde reconocer las diferentes tasas de incrementoo descenso en la producción de leche a travésde la lactancia. Sin embargo, debido al signoopuesto de los parámetros, la secuencia de loscambios en la curvatura es opuesta en los dos

Among the four groups identified using Legendrepolynomials (Table 4), a contrast in signs waspresent between groups 1 and 2, except forparameter 0, which was positive in both.Individual curves were generated for the fourmain groups for increasing values beginningfrom the term 1 (Figure 3). In group 1,increase in the 1 parameter caused a decreasein curve level and an increase in its curvature,while in group 2 an increase in 1 resulted in

Cuadro 4. Distribución de los parámetros (media ± desviación estándar) de curvas individuales clasificadasde acuerdo con los cuatro principales grupos detectados por los polinomios ortogonales deLegendre

Table 4. Parameter distribution (mean ± standard deviation) of individual curves classified based on the fourmain groups identified by Legendre orthogonal polynomials

Group Frequency 0 1 2 3 4

1 225 6.0 ± 13.2 7.2 ± 17.8 5.8 ± 12.5 2.8 ± 5.3 8.2 ± 14.5

2 217 4.4 ± 3.4 -7.2 ± 6.0 -5.6 ± 8.5 -4.3 ± 7.4 -2.1± 2.9

3 168 -8.6 ± 13.6 -1.2 ± 17.4 -8.8 ± 12.2 -41.3 ± 55.0 -10.9 ±12.8

4 113 7.4 ± 3.7 -2.6 ± 2.1 2.5 ± 3.3 2.2 ± 3.3 1.4 ± 2.0

Figura 2. Ejemplos de formas de curvas del grupo 1 (a), 2 (b), 3 (c) y 4 (d) detectados por el modelo de Ali Schaefferseleccionadas para valores que se incrementan del parámetro b

Figure 2. Examples of curve groups 1(a), 2 (b), 3 (c) and 4 (d) identified using the Ali-Schaeffer model, and selectedfor increasing b parameter values. DIM= days in milk; TDYM= Test day yield milk

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330

TDM

Y (log kg/d

ay)

DIM

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330

TDM

Y (log kg/d

ay)

DIM

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

16.0

30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330

TDM

Y (log kg/d

ay)

DIM

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330

TDM

Y (log kg/d

ay)

DIM

Wood

Wilmink

a) = 7.0; = 167.6; = 187.2 b) = -477.8; = -289.5; = -99

c) = 5.0; = -10.8; = 30.7 d) = 0.59; = 3.5; = 5.3

23


grupos. Los patrones extraídos de los grupos 3y 4 (Figura 2c y Figura 2d, respectivamente)constituyen ejemplos donde el incremento delparámetro b tiene consecuencias diferentes. Enel grupo 3, aumenta la curvatura en la segundaparte mientras que en el 4 muestra unatendencia lineal decreciente.

Los valores de los parámetros de los cuatroprincipales grupos de curvas detectadas conpolinomios de Legendre se presentan en elCuadro 4. Se observó un contraste de signosentre el grupo 1 y 2, excepto para el parámetro0 que fue positivo en ambos grupos.

La Figura 3 representa ejemplos de curvasindividuales de los cuatro principales grupos,para valores que se incrementan del término1. En el grupo 1, el incremento del parámetro1 ocasiona un decremento del nivel de la curva

a lower slope and a more stable curve. Thesame behavior in response to increasing 1values was also observed in groups 3 and 4.

Of the correlations calculated between estimatedparameters for the first two groups classifiedas typical and atypical curves with the Woodand Wilmink models, most were significant(P<0.05). Of the correlations for the first twogroups classified using the Ali-Schaeffer andLegendre polynomials models, significant (P<0.05)correlations were found in all but group 2 ofthe Legendre curves (Table 5).

DISCUSSION

The TDMY values used in the present studywere higher than those reported elsewhere forSiboney Cuba cattle(27,28). In a study of 1,041lactations in this genotype, R2

A values >0.75

Figura 3. Ejemplos de formas de curvas de los grupos: 1 (a), 2 (b), 3 (c) y 4 (d) detectados por lospolinomios ortogonales de Legendre seleccionadas para valores que se incrementan delparámetro 1

Figure 3. Examples of curve groups 1(a), 2 (b), 3 (c) and 4 (d) identified using Legendre orthogonalpolynomials, and selected for increasing 1 parameter values. DIM= Days in milk; TDYM=Test day yield milk

Wilmink

a) = 0.27; = 1.09; = 5.58 b) = -13.6; = -7.36; = -0.49

c) = -4.25; = -2.45; = -0.81 d) = 0.08; = 0.51; = 1.12

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

16.0

18.0

30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330

TD

MY

(lo

g k

g/d

ay)

DIM

-4.0

-2.0

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330TD

MY

(lo

g k

g/d

ay)

DIM

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

16.0

30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330

TD

MY

(lo

g k

g/d

ay)

DIM

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330

TD

MY

(lo

g k

g/d

ay)

DIM

Wood

24


were found in 21 % of the lactations modeledwith the Wood function and 39 % of thosemodeled with the Ali-Schaeffer function(27).

Goodness of fit increased with the number ofparameters included in the function since thisis related to model flexibility(21,29). However,the parameters used in polynomial functions donot necessarily have a clear relationship to thebasic characteristics of lactation curve shape;this is particularly the case for high orderpolynomial functions(30). This makes biologicalinterpretation difficult and leads to negativevalues at curve ends(13).

The a parameter value estimated here with theWood function for the typical lactation curvewas lower than that reported for Holsteincattle(31). This parameter’s scale is directlyrelated to milk production level. The lower valuein the present study was expected since, in

y un aumento de la curvatura, mientras que enel grupo 2, produce menor pendiente y másestabilidad de la curva. Este comportamientopara los valores de 1 que se incrementan esevidente en los grupos 3 y 4.

Las correlaciones entre los parámetrosestimados (P<0.05) para los dos primerosgrupos clasificados como curvas típicas y atípicaspara Wood y Wilmink y los dos primeros grupospara Ali-Schaeffer y Polinomios de Legendre decurvas y en los cuatro modelos estudiados sepresentan en el Cuadro 5.

DISCUSIÓN

Los valores de PDC obtenidos en el presentetrabajo fueron superiores a los encontrados enotros estudios en ganado Siboney deCuba(27,28). En un análisis de 1,041 lactanciasde este genotipo, Fernández(27) determinó que

Cuadro 5. Correlaciones estimadas entre los parámetros de los modelos analizados

Table 5. Correlations estimated between the parameters of the analyzed models

Three-parameter models

Standard Atypical

Parameter b c b c

Wood a -0.65 0.45 -0.79 0.17*b -0.83 -0.30

Wilmink a -0.23 -0.71 -0.03 -0.74b 0.11* 0.17*

Five-parameter models

Group 1 Group 2

b/ 1 c/ 2 d/ 3 k/ 4 b/ 1 c/ 2 d/ 3 k/ 4

Ali-Schaeffer a -0.99 0.91 -0.99 0.99 -0.99 0.97 -0.99 0.99b -0.98 0.99 -0.97 -0.99 0.99 -0.98c -0.94 0.90 -0.96 0.94d -0.99 -0.99

Legendre 0 -0.27 -0.06* 0.18* 0.09* -0.81 -0.53 -0.73 -0.311 -0.13* 0.21 0.08* -0.81 -0.53 -0.732 -0.20* 0.16* 0.49 0.473 0.21 0.58

* Not significant values (P>0.05).

25


el 21 y 39 % de las lactancias modeladas conla función de Wood y Ali-Schaeffer,respectivamente, presentaron R2

A superiores a0.75.

La bondad de ajuste se incrementa con elnúmero de parámetros de la función, ya queestá relacionada con la flexibilidad delmodelo(21,29). Sin embargo, el uso de funcionespolinomiales puede tener como inconvenienteque los parámetros estimados usualmente noposean un significado claro en términos derelación con las características básicas de laforma de la curva de lactancia, especialmentelas funciones polinomiales de órdeneselevados(30). Esto implica una interpretaciónbiológica difícil y la presencia de valoresnegativos en los extremos(13).

El valor del parámetro a, estimado por la funciónde Wood para la forma típica de la curva delactancia fue menor al reportado en estudioscon ganado Holstein(31). La escala de esteparámetro está relacionada directamente conel nivel de producción de leche. Este resultadoera el esperado ya que el genotipo Siboney deCuba, desde el punto de vista productivoresponde a un programa de selección diseñadopara una ganadería de bajos insumos en unclima tropical.

La característica distintiva de Wilmink conrespecto a Wood es la independencia entre laprimera y la segunda parte de la curva,confirmado por el valor inferior de correlaciónentre b y c, tanto para las curvas típicas comolas atípicas. Macciotta et al(22) sugirieron quela dependencia entre parámetros puede ser larazón para la cantidad mayor de curvas estándardetectadas por el modelo de Wood, con respectoal de Wilmink.

Landete-Castillejos y Gallego(32) señalandiferencias en la habilidad de los modelos paradescribir formas de curvas de lactancia. Deacuerdo con la segunda derivada de la funciónde Wood, el valor absoluto de b controla lamagnitud de la curvatura del patrón de lactancia,

terms of production traits, the selection programfor the Siboney of Cuba genotype wasdesigned to result in low input cattle for atropical climate.

Compared to the Wood function, the outstandingelement of the Wilmink function is theindependence of the first and second portionsof the curve. This is confirmed by the lowercorrelation value between b and c in both thetypical and atypical curves. Macciotta et al(22)

suggested that interparameter dependence maybe the reason the Wood model identifies morestandard curves than the Wilmink function.

These two models are known to differ in theirability to describe lactation curve shapes(32).According to the second derivative of the Woodfunction, the absolute value of b controlslactation pattern curvature magnitude, which isthe deviation of a straight line(24). In otherwords, when b is positive the curve is concaveand when it is negative the curve is convex.

Parameters generated with the Wood andWilmink functions need to be analyzed withcaution. A number of authors claim that theoccurrence of peak less lactation curves is mainlydue to results produced from records with nodata for the first days of lactation. For example,the notable presence of negative b parametervalues refers to lactations with initial TDMYweighings at 30 d or more after parturition(24).However, atypical curves are apparently notstrictly linked to the day the first TDMY recordis made(33).

Peakless lactation curves have been describedin dairy cattle(31), sheep(34), lambs(25), andbuffaloes(5). This may be a pattern characteristicof certain livestock breeds, including Siboneyof Cuba, which has reported average lactationcurves exhibiting a slightly flattenedshape(28,35).

High correlation between parameters in the Ali-Schaeffer model means a change in curvaturewith increases in b, and is a known limitation

26


lo cual es la desviación de una línea recta(24),es decir, cuando b es positivo la curva escóncava y resulta convexa para valores negativosde b.

Los parámetros obtenidos a través de lasfunciones de Wood y Wilmink deben seranalizados con precaución. Varios autoressostienen que la ocurrencia de curvas sin picode lactancia se debe a resultados obtenidoscon la ausencia de registros en los primerosdías de la lactancia, principalmente. Por ejemplo,en la función de Wood, una presencia relevantede valores negativos del parámetro b ha sidoreferida para lactancias con los primeros pesajesde PDC a los 30 días o más, después delparto(24). Sin embargo, se ha planteado quelas curvas atípicas no parecen estarestrictamente ligadas a los días en que seefectúa el primer registro de PDC(33).

Las curvas de lactancia sin pico se han descritoen ganado bovino de leche(31), ovejas(34),cabras(25) y búfalos(5). Algunos autores sugierenque puede ser un comportamiento característicode ciertas razas, y éste parece ser el caso delgenotipo Siboney de Cuba, en el cual se hanreportado curvas de lactancia promedios conun comportamiento ligeramente aplanado(28,35).

La alta correlación entre los parámetros significaun cambio en la curvatura para el incrementodel valor de b y es una limitante conocida delmodelo de Ali-Schaeffer(36), el cual puedeenmascarar el proceso de estimaciónespecialmente en análisis genéticos. Esta, entreotras razones, ha ocasionado el abandono delmodelo de Ali-Schaeffer en favor de lospolinomios de Legendre(23).

Al parecer, es común que se presente un efectode borde en los grupos principales dondeaparecen valores estimados negativos para lasPDC en los extremos de la trayectoria de lalactancia(37). Este efecto de borde, característicode las curvas modeladas con Ali-Sheaeffer ypolinomios de Legendre fue visualizado en elgrupo 2.

of this model since it can obscure the estimationprocess, particularly in genetic analyses. Amongother reasons, this has led to abandonment of

the Ali-Schaeffer model in favor of Legendre

polynomials(23).

Apparently, an end effect is common in the

main groups containing negative estimated

TDMY values at the ends of the lactation

trajectory(37). As seen in group 2, this edge

effect is characteristic of curves modeled with

the Ali-Schaeffer and Legendre polynomials

functions.

Using the Legendre polynomials model, the

correlations between estimated parameters were

lower than with the Ali-Schaeffer model.

Schaeffer(23) mentioned this behavior, and

considered it difficult to identify the biological

reasons explaining why the Ali-Schaeffer and

Legendre polynomials functions can detect

different types of curves. However, this behavior

is particularly useful in random regression

analyses searching for individual deviations in

an average fixed curve.


Using control day production data for Siboney

dairy cows of Cuba, the four main mathematical

functions used to predict milk production

throughout lactation generated different lactationcurve shapes, particularly in the five-parametermodels. This shape diversity reflects curvediversity within the herd. Treating them asderivatives of the two classic typical and atypicalcurve groups could compromise variability

among curves, since analyses based on average

curves do not reflect the individuality of lactation

behavior in a population. Use of three-parameter

models as submodels in variance component

estimations using control day production data

should therefore be done with caution.


27


Las correlaciones entre los parámetros estimadospor los Polinomios de Legendre fueron más bajasque las obtenidas para la función de Ali-Schaeffer. Este comportamiento fue referido porSchaeffer(23) quien considera difícil encontrarlas razones biológicas por las cuales lasfunciones de Ali-Schaeffer y Polinomios deLegendre pueden detectar disímiles tipos decurvas, sin embargo, este comportamiento esparticularmente útil para los análisis de regresiónaleatoria, donde se buscan desviacionesindividuales de una curva fija promedio.


De acuerdo con los resultados de este trabajose concluye que las funciones matemáticaspropuestas para describir la curva de producciónde leche a lo largo de la lactancia representarondiferentes formas, en especial los modelos decinco parámetros. Estas formas adicionalesreflejan la diversidad de curvas dentro del hato,por lo que considerarlas derivaciones de losdos grupos clásicos de curvas típicas o atípicaspodría comprometer la variabilidad entre curvas.Por lo tanto, los análisis basados en curvaspromedios no reflejan la individualidad delcomportamiento en la población. Esto sugiereque el uso de modelos de tres parámetros comosubmodelos en estimaciones de componentesde varianza usando PDC debe ser efectuadocon cautela.

LITERATURA CITADA

1. Vinay-Vadillo JC, Villagómez-Cortés JA, Acosta-Rodríguez MR,Rocher C. Shapes of lactation curves of F1 (Holstein XZebu) cows in the humid tropic of Veracruz, México. Int JAnim Veter Adv 2012;4(6):370-377.

2. Jeretina J, Babnik D, Škorjanc D. Modeling lactation curvestandards for test-day milk yield in Holstein, Brown Swissand Simmental cows. J Anim Plant Sci 2013;23(3):754-762.

3. Osorio MM, Segura JC. Factors affecting the lactation curveof dual purpose Bos taurus x Bos indicus cows in the humidtropics of Tabasco, Mexico. Tec Pecu Mex 2005;43(1):127-137.

4. Dijkstra J, López S, Bannink A, Dhanoa MS, Kebreab E,Odongo NE, et al. Evaluation of a mechanistic lactation

model using cow, goat and sheep data. J Agric Sci2010;(148):249-262.

5. Macciotta NPP, Dimauro C, Catillo G, Coletta A, Cappio-Borlino A. Factors affecting individual lactation curve shapein Italian river buffaloes. Livest Sci 2006;104(1-2):33-37.

6. Cole J, Null D, VanRaden P. Best prediction of yields forlong lactations. J Dairy Sci 2009;92(4):1796-1810.

7. Leclerc H, Duclos D, Barbat A, Druet T, Ducrocq V.Environmental effects on lactation curves included in a test-day model genetic evaluation. Animal 2008;(2):344-353.

8. Bebbington M, Lai CD, Zitikis R. Modeling lactation curves:classical parametric models re-examined and modified. JAppl Stat 2009;(2)36:121-133.

9. Andersen F, Østerås O, Reksen O, Toft N, Gröhn YT.Associations between the time of conception and the shapeof the lactation curve in early lactation in Norwegian dairycattle. Acta Vet Scand 2011;53(5):1-8.

10. Wood PDP. Algebraic model of lactation curve in cattle.Nature 1967;(216):164-165.

11. Pollott GE. A biological approach to lactation curve analysisfor milk yield. J Dairy Sci 2000;83(11):2448-2458.

12. Silvestre AM, Martins AM, Santos VA, Ginja MM, Colaço JA.Lactation curves for milk, fat and protein in dairy cows: Afull approach. Livest Sci 2009;122(2-3):308-313.

13. Al Faro LE, Albuquerque LG. Comparação de alguns modelos

matemáticos para o ajuste as curvas de lactação individuaisde vacas da raça Carcacu. Arq Braz Med Vet Zootec2000;54(3):295-302.

14. Macciotta NPP, Dimauro C, Rassu SPG, Steri R, Giuseppe P.The mathematical description of lactation curves in dairycattle. Ital J Anim Sci 2011;10(e51):213-223.

15. Macciotta NPP, Miglior F, Cappio-Borlino A, Schaeffer LR. Fit

of different functions to the individual deviations in randomregression test day models for milk yield in dairy cattle. ItalJ Anim Sci 2007;6(1):153-155.

16. Ramírez R, Núñez R, Ruíz A, Meraz MR. Comparison of

equations to estimate lactation curves with different samplingstrategies in Angus, Swiss and their crosses. Vet Mex2004;35(3):187-201.

17. Hernández I, Milera M, Simón L, Hernández D, Iglesias J,Lamela L et al. Avances en las investigaciones en sistemassilvopastoriles en Cuba. En: Sánchez MD, Rosales M. editors.

Agroforestería para la producción animal en Latinoamérica.Roma: FAO; 1998:47-59.

18. Wilmink JBM. Studies on test-day and lactation milk, fatand protein yield of dairy cows [doctoral thesis].

Landbouwuniversiteit, Wageningen, Netherlands; 1987.

19. Ali TE, Schaeffer LR. Accounting for covariances amongtest day milk yields in dairy cows. Can J Anim Sci1987;67(3):637-644.

20. Kirkpatrick M, Lofsuold D, Bulmer M. Analysis of inheritance,

selection and evolution of growth trajectories. Genetics1990;122(4):979-993.

21. Silvestre AM, Petim-Batista F, Colaco J. The accuracy of

seven mathematical functions in modeling dairy cattlelactation curves based on test-day records from varyingsampling schemes. J Dairy Sci 2006;89(5):1813-1821.

22. Macciotta NPP, Vicario D, Cappio-Barlino A. Detection ofdifferent shapes of lactation curve for milk yields in dairy

28


cattle by empirical mathematical models. J Dairy Sci2005;88(3):1178-1191.

23. Schaeffer LR. Application of random regression models inanimal breeding. Livest Prod Sci 2004;86(1):35-45.

24. Congleton WR, Everett RW. Error and bias of the incompletegamma function to describe lactation curves. J Dairy Sci1980;63(1):101-108.

25. Macciotta NPP, Dimauro C, Steri R, Cappio-Borlino A.Mathematical modelling of goat lactation curves. In: CannasA, Paulina G. editor. Dairy goats feeding and nutrition. 1rsted. UK: CAB International; 2008:31-46.

26. SAS. SAS/STAT User’s Guide (Release 6.08). Cary NC, USA:SAS Inst. Inc. 1995.

27. Fernández L, Menéndez A, Guerra D. Estudio comparativode diferentes funciones para el análisis de la curva delactancia en el genotipo Siboney de Cuba. Rev Cub CienAgríc 2004;38(4):23-27.

28. González-Peña D. Evaluación genética del ganado Siboneyde Cuba empleando la producción del día de control bajoun modelo de regresión aleatoria [tesis doctorado]. LaHabana, Cuba: Universidad Agraria de La Habana; 2006.

29. Steri R. The mathematical description of the lactation curveof ruminants: issues and perspectives [doctoral thesis].Sassari, Italia: Università di Sassari; 2009.

30. Cappio-Borlino A, Macciotta NPP, Pulina GG. Mathematicalmodelling of milk production patterns in dairy sheep. In:

Paulina G. editor. Dairy sheep nutrition. 1rst ed. UK: CABInternational; 2004:13-29.

31. Rekik B, Ben-Gara A. Factors affecting the occurrence ofatypical lactations for Holstein-Friesian cows. Livest ProdSci 2004;87(2):240-245.

32. Landete-Castillejos T, Gallego L. Technical Note: The ability

of mathematical models to describe the shape of lactationcurves. J Anim Sci 2000;78(12):3010-3013.

33. Dimauro C, Vicario D, Canavesi F, Cappio-Borlino A, MacciottaNPP. Analysis of individual variability of the shape of lactation

curve for milk fat and protein contents in Italian Simmentalcows. Proc 8th World Cong Genetics Appl Livest Prod. BeloHorizonte, MG, Brasil. 2006.

34. Franci O, Pugliese C, Acciaioli A, Parisi G, Lucifero M.Application of two models to the lactation curve of Masseseewes. Small Ruminant Res 1999;31(2):91-96.

35. Hernández R, Ponce P. Caracterización de la curva delactancia del genotipo Siboney de Cuba. Rev Cient(Maracaibo) 2008;18(3):291-295.

36. Kettunen A, Mäntysaari EA, Pösö J. Estimation of geneticparameters for milk yield of primiparous Ayrshire cow byrandom regression test day model. Livest Prod Sci2000;66(3):251-261.

37. Pool MH, Meuwissen THE. Reduction of the number ofparameters needed for a polynomials random regressiontest day model. Livest Prod Sci 2000;64(2-3):133-145.

29

ACTIVIDAD DE LAS ISOFORMAS DE CARGA DE LA HORMONA LUTEINIZANTE BOVINARev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):29-51

Actividad biológica e inmunológica de lasisoformas de carga de la hormona luteinizante

bovina

Biological and immunological activity in bovineluteinizing hormone charge isoforms

Álvaro Ortegaa, Aleida Olivaresb, Clara Murciaa, Daniel Díazc, Everardo González-Padillaa,Arnulfo Monteroa, Gabriel Gutiérrez Ospinac, Gerardo Perera-Marína

RESUMEN

La hormona luteinizante (LH) sufre modificaciones postraduccionales que dan origen a isoformas de carga. El estudiodeterminó la actividad biológica (B) e inmunológica (I) de distintas isoformas de LH bovina. Las isoformas se aislaronmediante el cromatoenfoque a partir del extracto glicoprotéico obtenido de lóbulos anteriores de hipófisis de bovino.La actividad biológica se evaluó en un bioensayo in vitro midiendo la producción de AMPc. La actividad inmunológicase midió con un radioinmunoensayo (RIA) específico para LH. El USDA-bLH-B5 se utilizó como referencia. Las isoformasse agruparon tomando como referencia el rango de pH de elución, en básicas (A, pH, 10.75-9.75; B, pH, 9.58-8.41),neutras (C, pH, 7.98-6.89) y ácidas (D, pH, 6.88-5.41; E, pH, 5.36-3.46). El peso molecular del heterodímero de cadaisoforma y del estándar fue similar, estimado en 36.5 kDa. La actividad inmunológica y biológica se comportó deforma dosis-dependiente. Con respecto al estándar, se requirió una mayor concentración de proteína de cada isoformapara obtener el IC50 en la curva de inhibición. En el bioensayo, el valor EC50 para la producción de AMPc fuesignificativamente diferente entre isoformas; la isoforma neutra mostró un EC50 inferior lo que se interpretó comola proteína más bioactiva, en contraste, la isoforma ácida, mostró un valor de EC50 superior y resultó ser la menosbioactiva; la básica tuvo un comportamiento intermedio (P<0.05). En conclusión, los resultados sugieren un efectodiferenciado de las isoformas de carga, sobre la producción cuantitativa de AMPc por unidad de LH inmunoreactiva.

PALABRAS CLAVE: Hormona luteinizante, Actividad biológica, Actividad inmunológica.

ABSTRACT

Luteinizing hormone (LH) undergoes posttranslational modifications that originate different charge isoforms. Thestudy evaluated the differences in biological (B) and immunological (I) activity between isoforms of bovine LH.Isoforms were isolated by chromatofocusing from anterior pituitary glycoprotein extract. The biological activity wasevaluated in an in vitro bioassay. Immunological activity was measured with a radioimmunoassay (RIA) specific forLH. The USDA-bLH-B5 standard was utilized as the reference. LH isoforms were grouped by their pH range of elution,in basic (A, pH, 10.75-9.75; B, pH 9.58-8.41), neutral (C pH, 7.98-6.89) and acidic (D, pH, 6.88-5.41; E, pH 5.36-3.46).The molecular weight of the heterodimer of each isoform was similar to the LH standard, estimated to be 36.5 kDa.Immunological and biological activity behaved in a dose-dependent manner. With respect to the LH standard, allisoforms required higher protein concentration to reach the IC50 of the inhibition curve. In the bioassay EC50 valuefor cAMP production was significantly different among isoforms; the neutral isoform showed a lower EC50 which wasinterpreted as more bioactive, the acidic isoform E showed an EC50 being the least bioactive and the basic wasintermediate (P<0.05). In conclusion, the results suggest a quantitative effect of LH charge isoforms on the cAMPproduction, per unit of immunoreactive LH in the bioassay.

KEY WORDS: Luteinizing hormone, Biological activity, Immunological activity.

Recibido el 9 de julio de 2015. Aceptado el 27 de noviembre de 2015.

a Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México. Circuito exterior de Ciudad Universitaria S/N, CP.04510. Mé[email protected]. Correspondencia al último autor.

b Unidad de Investigación Médica en Medicina Reproductiva, UMAE Hospital de Gineco Obstetricia no. 4 Luis Castelazo Ayala, IMSS, México.

c Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México. México.

Esta investigación se realizó con el soporte económico del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CoNaCyT), México, Proyecto Nº 78811. Gracias al NIH y alDr. Parlow A.F. por proveer la bLH con alta pureza. Álvaro Ortega, Estudiante del posgrado de Ciencias de Producción y Salud Animal, UNAM, México.

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Alvaro Ortega, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):29-51

INTRODUCCIÓN

La hormona luteinizante (LH) es una glicoproteínapresente en el lóbulo anterior de la hipófisis. LaLH participa en la maduración folicular(1), laovulación(2) y la formación y mantenimiento delcuerpo lúteo(3).

Durante el proceso de síntesis, la LH sufremodificaciones post-traduccionales como laincorporación de residuos de oligosacáridos deltipo N-unidos con diferente porcentaje de sulfatoy ácido siálico(4). Esta variación específica seconsidera la principal base bioquímica de ladiferenciación entre las isoformas de carga dela LH intrahipofisaria y circulante(5).

El polimorfismo de las gonadotropinas se hadocumentado en rumiantes(6,7,8) y mediante elcromatoenfoque se han identificado isoformasde la LH en el suero(9,10) como en lahipófisis(11,12) y cuya proporción relativa esdiferente(6). Incluso se sabe que la proporciónde estas isoformas en la circulación es distintaen diversas etapas del ciclo estral(9,10).

La actividad biológica in vivo de distintasisoformas de LH de rumiantes ha generadoresultados inconsistentes, sin embargo seestablece que la mayor bioactividad la presentanlas isoformas ácidas(13,14,15). Esta inconsistenciaen la respuesta biológica se ha atribuido a latasa de depuración de cada isoforma, a la bajasensibilidad del ensayo (se requieren cantidadesde microgramos de proteína) y a la variabilidadbiológica de los animales empleados. Encontraste, con el empleo de bioensayos in vitro,la mayor actividad biológica se presenta en lasisoformas básicas(16,17), cuyo resultado nosiempre es consistente debido al origen de lascélulas de Leydig (rata o ratón) y que cuestionala especificidad de especie cuando se utilizanligandos de otras especies. Una alternativarelativamente reciente ha sido el desarrollo debioensayos basados en la clonación dereceptores para gonadotropinas(18,19). Con lalínea celular estable derivada de célulasembrionarias de riñón humano (HEK-293) y

INTRODUCTION

Luteinizing hormone (LH) is a glycoproteinpresent in the anterior lobe of the hypophysis.It participates in follicular maturation(1),ovulation(2), and luteal body formation andmaintenance(3). During LH synthesis, thehormone experiences post-translationalmodifications such as incorporation of N-typeoligosaccharide residues linked to differentproportions of sulfate and sialic acid(4). Thisspecific variation is considered the principalbiochemical foundation for differentiationbetween hypophysis and circulating LH chargeisoforms(5).

Polymorphism in gonadotropins occurs inruminants(6,7,8). Using the chromatofocusingprotein separation technique, differentproportions of LH isoforms have been identifiedin the serum(9,10) and hypophysis(11,12).Indeed, the proportion of these isoforms incirculation differs in the different stages of theestrus cycle(9,10).

Variability in the in vivo biological activity of LHisoforms in ruminants is the cause of inconsistentresults, although acidic isoforms are regularlyreported to have the highest bioactivity(13,14,15).This variability in biological response has beenattributed to each isoform's depuration rate, lowassay sensitivity (micrograms of protein arerequired), and biological variabil ity inexperimental animals. In in vitro bioassays, thehighest biological activity is present in the basicisoforms(16,17). Results are not always consistentdue to the origin (rat or mouse) of the Leydigcells, since the question remains of how speciesspecific they can be when ligands from otherspecies are used. A recently developedalternative is bioassays based on gonadotropinreceptor cloning(18,19). Using a stable cell linederived from HEK-293 cells transfected with ratLH receptor cDNA, evaluations have been doneof cAMP production associated with distinct rathypophysis extracts at a basic pH(20,21). Thissame biological model has been used to provethe constant affinity of bovine LH to the rat LHreceptor(22).

31

ACTIVIDAD DE LAS ISOFORMAS DE CARGA DE LA HORMONA LUTEINIZANTE BOVINA

transfectada con el cDNA para el receptor de laLH de rata se ha logrado evaluar producción deAMPc asociada con distintos extractoshipofisarios de rata obtenidos a pH básico(20,21);así mismo, con este modelo biológico se hadeterminado la constante de afinidad de la LHbovina al receptor de la LH de rata(22).

Durante la última década, nuestro grupo deinvestigación se ha enfocado a aislar ycaracterizar distintas isoformas de la LH derumiantes para conocer la relación estructura-función, su patrón de secreción en diferentesestadios fisiológicos y su actividad biológica.Sin embargo, debido al bajo rendimiento de lasisoformas de tipo ácido y neutro, sucaracterización biológica ha sido muy limitada.Es por esto que con la disposición del bioensayobasado en la clonación del receptor para LH, seabre la posibilidad de cuantificar la bioactividadde este grupo de isoformas, que por su bajorendimiento es difícil de monitorear.

Por lo tanto, el presente estudio se encaminóa evaluar el patrón de producción de AMPc porlas células HEK-293 transfectadas con el cDNApara el receptor de LH de rata en respuesta adistintas isoformas de la LH bovina hipofisaria.

MATERIAL Y MÉTODOS

Para el desarrollo de este estudio fue necesarioaislar y purificar las distintas isoformas de LHbovina en cantidades suficientes; determinarpor medio del cromatoenfoque el puntoisoeléctrico de cada isoforma, el peso molecularen SDS-PAGE y su caracterización inmunológicapor medio de un radioinmunoensayo específicopara LH y mediante el análisis porinmunotransferencia.

Colección de hipófisis

Se obtuvieron hipófisis de animales adultos sinconsiderar edad, sexo, ni condición fisiológica.Antes del sacrificio, cada animal se aturdió conuna pistola de perno cautivo y después seseparó la cabeza y se extrajo la hipófisis que

Over the last decade, our research group hasfocused on isolating and characterizing differentruminant LH isoforms to study their structure-function relationship, their secretion patterns invarious physiological conditions and theirbiological activity. Biological characterization hasbeen especially challenging due to low yields ofacidic and neutral isoforms. Advent of the LHreceptor cloning bioassay has opened thepossibility of quantifying bioactivity in theseisoform groups, which is difficult to monitordue to their low yield.

The present study objective was to evaluatecAMP production by HEK-293 cells transfectedwith rat LH receptor cDNA in response todifferent bovine hypophysis LH isoforms.


This study involved four main stages: 1)Isolation and purification of sufficient amountsof the different bovine LH isoforms; 2)Identification of each isoform's isoelectric pointusing chromatofocusing; 3) Quantification ofeach isoform's molecular weight by SDS-PAGE;and 4) Immunological characterization using aLH-specific immunoassay and immunotransferenceanalysis.

Hypophysis collection

Hypophyses were extracted from adult bovinesregardless of age, sex and physical condition.Prior to slaughter, each animal was stunnedwith a captive bolt gun. Once dead, the headwas removed from each animal, the hypophysisextracted and deposited in phosphate buffer(0.05 M, pH 7.2). Excess tissue was removedfrom the gland, the posterior lobe discarded,and the anterior lobe lyophilized. All glandextraction and LH purification and isoformisolation steps were done at 4 °C.

Obtaining of glycoprotein extract from thehypophysis anterior lobe

An established protocol(13) was used to extractglycoprotein from 375 anterior lobes. Briefly,

32


se colocó en amortiguador de fosfatos (0.05 M,pH 7.2). De cada glándula se retiró el excesode tejido, se descartó el lóbulo posterior y ellóbulo anterior se liofilizó. Cada paso deextracción y purificación de la LH y sus isoformasse realizó a 4 °C.

Obtención del extracto glicoprotéico (EGP) dellóbulo anterior de la hipófisis

El extracto glicoprotéico se obtuvo de 375lóbulos anteriores de acuerdo al procedimientodescrito para rumiantes(13). En breve, los lóbulosanteriores liofilizados se hidrataron con acetatode amonio al 10%, pH 7.0 que contenía 0.001 Mde fenilsulfonilmetilfluoruro durante un períodode 48 h. Al término se licuaron y sehomogeneizaron con la misma solución, y elextracto obtenido se conservó en agitaciónmecánica por 24 h; al término, el extracto secentrifugó a 10,000 xg por 45 min; el precipitado(R0) se almacenó y el sobrenadante se ajustóa pH 7.0 y recibió gota a gota en agitaciónconstante un volumen de etanol que correspondióal 40 % del volumen total. Después de 16 h deagitación, la mezcla se centrifugó y la fracciónde proteína presente en el precipitado (R1) sealmacenó y el sobrenadante recibió un volumende etanol de forma idéntica a lo previamenteindicado, que correspondió al 85 % del volumentotal. Esta mezcla permaneció en reposo por48 h y al término, las proteínas precipitadas serecuperaron por centrifugación. Este grupo deproteínas se identificó como el extractoglicoprotéico (EGP), que se resuspendió en aguadesionizada, se dializó (Spectra/Por # 4, cut off12-14 kDa) durante 24 h con cambio de aguacada 8 h y después se liofilizó. Una segundaextracción se realizó a partir del R0 de la primeraextracción repitiendo el proceso antes descrito.El segundo extracto glicoprotéico se mezcló conel primero para su purificación.

Purificación de EGP para la obtención de laLH

La LH se obtuvo por la purificación del extractoglicoprotéico en el intercambiador iónico, CM-

lyophilized anterior lobes were hydrated for48 h with 10% ammonium acetate (pH 7.0)containing 0.001 M phenylsulfonyl methylfluoride. They were blended and homogenizedwith the same solution. The resulting extractwas kept under constant agitation for 24 h andcentrifuged at 10,000 xg for 45 min. Theprecipitate (R0) was stored. Supernatant wasadjusted to pH 7.0 and a volume of ethanolequivalent to 40 % total volume added by dropsunder constant agitation. After 16 h agitation,the mixture was centrifuged, and the precipitate(protein fraction; R1) was discarded and stored.A volume of ethanol equal to that in the previousstep was added to the supernatant, althoughin this case it was equal to 85 % of totalvolume. This mixture remained undisturbed for48 h and the precipitated proteins recoveredby centrifugation. This group of proteinsIdentified was named glycoprotein extract (GPE),was re-suspended in deionized water, dialyzed(Spectra/Por # 4, 12-14 kDa cut-off) for 24 hwith the water changed every 8 h, andlyophilized. A second extraction was done tothe R0 precipitate from the first extraction step,following the above process. This second GPEwas mixed with the first before purification.

GPE purification for LH isolation

The GPE was purified in an ionic exchanger(CM-Sepharose) to isolate LH(13). One gramGPE containing 256 mg protein was resuspendedin 0.005 M ammonium acetate (pH 5.1; elutionbuffer), agitated for 24 h, and centrifuged(10,000 xg for 30 min). The protein solutionwas applied to a pre-packed column (27.0 x1.5 cm i.d.) with the cation exchanger previouslyadjusted with elution buffer, and stored at 4 °C.The protein fraction was eluted at a 23 ml/hflow through an ammonium acetate gradient(0.005 M, pH 5.1; 0.1 M, pH 6.8; and 1.0M-glycine 0.1 M, pH 9.5). Two-milliliter fractionswere collected during the chromatography run,and the protein elution pattern monitored at280 nm. When effluent optical density was closeto zero, the buffer was changed. After elution,a 1 M NaCl solution was run through the column.

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Sepharosa(13). Un gramo de extracto quecontenía 256 mg de proteína se resuspendióen acetato de amonio 0.005 M, pH 5.1(amortiguador de elución), se agitó durante24 h y se centrifugó (10,000 xg por 30 min).La proteína en solución se aplicó a una columna(27.0 cm X 1.5 d.i.) pre-empacada con elintercambiador catiónico, equilibrada previamentecon el amortiguador de elución y conservada a4 °C. La fracción de proteína se eluyó con unflujo de 23 ml/h a través de un gradiente deacetato de amonio (0.005 M, pH 5.1; 0.1 M,pH 6.8 y 1.0 M-glicina 0.1 M, pH 9.5) y durantela corrida cromatográfica se colectaronfracciones de 2 ml. El patrón de elución de laproteína se monitoreó a 280 nm. Cada cambiode amortiguador se realizó cuando la densidadóptica del efluente fue cercana a cero. Una vezconcluida la elución, la columna recibió unasolución NaCl 1 M.

Los distintos picos de proteína en que sedistribuyó la elución del extracto glicoprotéicose identificaron de acuerdo a su amortiguador;las fracciones que eluyeron con acetato deamonio 0.005M, pH 5.1 se denominaron CM-1ab, CM-1cd y CM-1ef, respectivamente; el picode proteína que eluyó con 0.1 M, pH 6.8 sedenominó CM-2ab y la proteína que eluyó con1.0 M-glicina 0.1 M, pH 9.5 se identificó comoCM-3ab y correspondió a la LH cruda. La fracciónde proteína recuperada después de NaCl sedenominó pico de sal. Los distintos picos deproteína, se dializaron y liofilizaron para suanálisis.

Purificación de la fracción CM-3ab para laobtención de las isoformas de la LH

Las isoformas de la LH se obtuvieron despuésde la purificación de la fracción CM-3ab; estaproteína recuperada durante la purificación delEGP en CM-Sepharosa se caracterizó por sualto contenido de LH y un patrón electroforéticosimilar al estándar de LH bovina, USDA-bLH-B5. La fracción se sometió a un proceso deseparación de acuerdo a carga eléctrica(8,11).En breve, la proteína (56 mg) se resuspendió

Elution of the GPE produced protein peaksidentified based on the buffer. Fractions elutedwith 0.005 M ammonium acetate (pH 5.1) werecalled CM-1ab, CM-1cd and CM-1ef. The proteineluted with 0.1 M ammonium acetate (pH 6.8)was called CM-2ab, and that eluted with 1.0 Mammonium acetate and 0.1 M glycine (pH 9.5),corresponding to raw LH, was called CM-3ab.The protein peak recovered after the NaCl runwas called the salt peak (S). All the proteinpeaks were dialyzed and lyophilized untilanalysis.

CM-3ab purification for LH isoform isolation

Isolation of LH isoforms was done by purifyingthe CM-3ab fraction. During GPE purification inCM-Sepharose, CM-3ab stood out for its highLH content and for having an electrophoreticpattern similar to that of the bovine LH standard(USDA-bLH-B5). For this reason, it wasprocessed for separation by electricalcharge(8,11). Briefly, 56 mg protein wereresuspended in Pharmalyte (pH 8.0-10.5,Pharmalyte 0.36 meq/ml pH, Pharmacia BiotechPiscataway, NY, USA), diluted to 1:45 withdeionized water and HCl added to adjustsuspension pH to 7.0. This was then added toa column (27 x 0.7 cm i.d.) prepacked withPBE-118 ionic exchanger (Polybuffer exchangerfor chromatofocusing, capacity: 50.4 µmol, pHunit-1 ml-1, Pharmacia, Biotech, Piscataway, NY,USA), balanced with 0.025 M triethylamine-HCl(pH 11.0) and stored at 4 °C. Three millilitersPharmalyte buffer (pH 7.0) were added to thecolumn before protein elution to preventexposure of the sample to an extreme pH.

Protein fraction elution was done at a 7 ml/hflow rate, and 2 ml fractions collected. Eachfraction's pH was measured, and when a pHabove 7.0 was detected in more than tenconsecutive samples the elution buffer waschanged to polybuffer 74 (Pharmacia, Biotech).This was diluted to 1:8 with deionized water,and adjusted to pH 3.5 to elute proteinsbetween pH 7.0 and 3.5. Any protein clingingto the column after elution at pH 3.5 was

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en Pharmalyte (pH 8.0-10.5, Pharmalyte 0.36meq/ml pH, Pharmacia Biotech Piscataway, NY),diluido 1:45 con agua desionizada, el que seajustó con HCl a pH 7.0 y a la suspensión seaplicó a una columna (27 cm x 0.7 cm d.i.)pre-empacada con el intercambiador iónico PBE-118 (Polybuffer exchanger for chromatofocusing,capacity: 50.4 µmol. pH unit-1 ml-1, Pharmacia,Biotech, Piscataway, NY), equilibrada con 0.025M trietilamina-HCl, pH 11.0 y conservada a 4°C. Previo a la elución de la proteína, la columnarecibió 3 ml de amortiguador Pharmalyte, pH7.0 para evitar la exposición de la muestra a unpH extremo.

La fracción de proteína se eluyó con un flujode 7 ml/h y se colectaron fracciones de 2 ml.El pH de cada fracción se midió, y cuando sedetectó el pH de 7.0 en más de 10 fraccionesconsecutivas, el amortiguador de elución secambió por el polybuffer 74 (Pharmacia,Biotech), diluido 1:8 con agua desionizada yajustado a pH 3.5 para obtener proteínas eluídasentre un pH 7.0 a 3.5. La proteína unida a lacolumna después de la elución a pH 3.5 serecuperó por la adición de 1.0 M NaCl. Con elregistro de pH y conocido el patrón de eluciónde la proteína a 280 nm, se procedió aneutralizar cada fracción; las fraccionescolectadas entre pH 11.0 y 7.0 recibieron Tris-HCl, 1.1M, pH 7.4 y las fracciones eluídas entrepH 6.99 y pH 3.5 así como las proteínascolectadas con NaCl 1 M se neutralizaron conImidazol 1.1 M. Una vez neutralizadas el totalde las fracciones de proteína, las fracciones seagruparon en el rango de pH de elución delpico de proteína: básicas (A, pH, 10.75-9.75;B, pH, 9.58-8.41), neutra (C, pH, 7.98-6.89) yácidas (D, pH, 6.88-5.41; E, pH, 5.36-3.46).Los distintos picos de proteínas se dializaronde forma independiente y se liofilizaron hastasu análisis.

Análisis electroforético (SDS-PAGE)

El patrón electroforético y el peso molecular sedeterminaron mediante una electroforesis enplaca con geles de poliacrilamida al 12.5 % a

recovered by adding 1.0 M NaCl. Each fractionwas then neutralized based on the pH recordand the known protein elution pattern at 280nm. Fractions collected between pH 11.0 and7.0 were neutralized with 1.1 M Tris-HCl, andthose eluded between pH 6.99 and 3.5, as wellas those collected with 1 M NaCl, wereneutralized with 1.1 M imidazole. After allfractions were neutralized, they were groupedaccording to the pH range of the elution proteinpeak: basic (A, pH 10.75-9.75; B, pH 9.58-8.41); neutral (C, pH 7.98-6.89); and acidic (D,pH 6.88-5.41; E, pH 5.36-3.46). The differentprotein peaks were dialyzed separately and thenlyophilized.

Electrophoretic (SDS-PAGE) analysis

The protein fractions isolated during LHpurification and their isoforms were analyzedwith SDS-PAGE(23), and their electrophoreticpatterns compared to the LH reference (USDA-bLH-B5). The resulting gels were stainedfollowing manufacturer instructions (Silver StainKit, Bio-Rad Laboratories, Inc.). Prestained, lowmolecular-weight markers were used asreferences (Bio-Rad Laboratories, Inc.).

Total protein quantification

Protein content was quantified in each fractionisolated during the LH purification and theirisoforms, according to Bradford method(24).Bovine serum albumin (BSA) was used as areference standard.

Immunological analysis of LH and itsisoforms

Identification of LH-immunoreactive proteins

The molecular weight of proteins immunoreactive tothe LH was determined through immunoblotting(25)

The reference standard (USDA-bLH-B5), aprotein fraction, or an isoform were analyzedby SDS-PAGE at a concentration of 100 ng ofprotein. At the end of electrophoresis, theproteins present in the gel were transferred(200 mA/75 min: Trans-Blot Semi-Dry, Bio-

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pH 8.6 en presencia de dodecil sulfato desodio(23) en aquellas fracciones de proteínaobtenidas durante la purificación de la LH y susisoformas. El patrón electroforético se comparócon la LH de referencia (USDA-bLH-B5). Unavez concluida la electroforesis, el gel se tiñócon plata siguiendo las especificaciones delestuche comercial (Silver Stain Kit, Bio-Rad,Laboratories, Inc). Como referencia se utilizaronmarcadores preteñidos de bajo peso molecular(Bio-Rad Laboratories, Inc).

Cuantificación de proteínas totales

La concentración de proteína se determinó encada fracción obtenida durante la purificaciónde la LH y sus isoformas por el método deBradford(24). Se utilizó como estándar a laalbúmina sérica bovina (BSA).

Análisis inmunológico de la LH y susisoformas

Identificación de proteínas inmunoreactivas aLH

El peso molecular de las proteínas inmunoreactivasa LH se determinó por medio de lainmunotransferencia(25). El análisis se iniciódespués de concluida la electroforesis en placacon geles de poliacrilamida al 12.5% a pH 8.6en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). En breve, 100 ng de proteína del patrónde referencia USDA-bLH-B5 o de las distintasfracciones obtenidas durante la extracción ypurificación de la LH y sus isoformas setransfirieron (Trans-Blot Semi-Dry (Bio-Rad,USA), 200 mA/75 min) a una membrana denitrocelulosa (0.45 µm trans, blot, Bio-Rad).Transferidas las proteínas a la membrana denitrocelulosa se incubó a 4 °C durante 16 h conel anticuerpo primario generado en conejo (anti-oLH-26) a una dilución 1:1000. Al término, lamembrana se incubó durante 60 min atemperatura ambiente con el anticuerposecundario (anti IgG de conejo generado encabra y conjugado a peroxidasa, JacksonImmuno Research) diluido 1:20,000. El reveladose realizó por quimioluminiscencia (ImmobilonTM

Rad, USA) to a nitrocellulose membrane (0.45µm Trans-Blot, Bio-Rad). The membranes wereincubated at 4 °C for 16 h with a 1:1000 dilutionof rabbit-generated primary antibody (anti-oLH-26). They were then incubated for 60 min atroom temperature with a 1:20,000 dilution ofthe secondary antibody (rabbit anti-IgGgenerated in goat and conjugated to peroxidase;Jackson Immuno Research). The membraneswere viewed with chemiluminscence(ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRPSubstrate, Millipore Corporation, Billerica, MA,USA).

Quantification of immunoreactive LH

Immunoreactive LH was quantified with liquid-phase radioimmunoassay (RIA) after validationwith bovine LH(11). Each protein fraction fromLH purification and their isoforms were analyzedat six doses (0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2 and 6.4 ngprotein/tube), with four replicates per dose. TheLH reference (USDA-bLH-B5) was used as astandard at eight doses (0.01, 0.1, 0.25, 0.5,1.0, 2.5, 5.0 and 10 ng/tube). To create atracer, NaI125 was incorporated into the USDA-bLH-B5 following the IODO-GEN method(11).Primary antibody (anti-oLH-26) was used at a1:40,000 dilution in the presence of normalrabbit serum (1:1600). Precipitation of theantigen-antibody complex occurred after 24 hat 4 °C with the secondary antibody (anti-IgGfrom rabbit generated in burro, 1:80). Afteraddition of 1 ml 0.05 M PBS buffer (pH 7.2)containing 0.1% BSA, the immunoprecipitatedfraction was separated from the unbondedfraction by centrifuging at 1,500 xg for 15 minat 4 °C. A gamma radiation counter was usedto analyze the immunoprecipitated fraction.Assay sensitivity was 0.1 ng/tube. Using thereference curve EC50 as the dose valueparameter, intra-assay variation was 2 % andinterassay variation was 5 %.

Quantitative LH concentration was measuredby calculating IC50, defined as the proteinconcentration (ng protein or LH/tube) thatcaused 50 % inhibition of the %B/Bo response.

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Western Chemiluminescent HRP Sustrate,Millipore Corporation, Billerica, MA, USA).

Cuantificación de la LH inmunoreactiva (irLH)

La determinación cuantitativa de la LHinmunoreactiva se determinó con unradioinmunoensayo (RIA) en fase líquida,validado previamente para la LH bovina(11).Cada fracción obtenida durante la purificaciónde la LH y sus isoformas se analizó a las dosisde 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2 y 6.4 ng de proteína/tubo en cuatro réplicas y como estándar seutilizó al USDA-bLH-B5 a las dosis de 0.01, 0.1,0.25, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 y 10 ng/tubo. El trazadorse formó con la incorporación del NaI125 alUSDA-bLH-B5 mediante el método del IODO-GEN(11). El anticuerpo primario (anti-oLH-26)generado en conejo se utilizó a una dilución detrabajo 1:40,000 en presencia de suero normalde conejo, 1:1600 y la precipitación del complejoantígeno-anticuerpo se obtuvo después de 24 hde incubación a 4 °C con el anticuerpo secundario(anti-IgG de conejo generado en burro, 1:80).Finalmente, la fracción inmunoprecipitada seseparó de la fracción no unida por centrifugación(1,500 xg por 15 min a 4 °C) previa adición de1 ml de amortiguador PBS 0.05M, pH 7.2 quecontenía BSA al 0.1 %. La fraccióninmunoprecipitada se analizó en un contadorde radiaciones gamma. La sensibilidad delensayo fue de 0.1 ng/tubo y el coeficiente devariación intra e interensayo tomando comoparámetro el valor de la dosis al EC50 de lacurva de referencia correspondió al 2 y 5 %,respectivamente.

La concentración cuantitativa de la LH sedeterminó a partir del cálculo del parámetroIC50, definido como la concentración de proteína(ng de proteína o LH/tubo) que causó el 50 %de inhibición en la respuesta del %B/Bo. Paralo anterior se utilizó el programa estadísticoPrism 6.0 (GraphPad Software, Inc., USA) queincluyó la ecuación de Hill. Ambos parámetros,IC50 y la pendiente de Hill se compararon conla prueba F de la suma de cuadrados, probandocomo hipótesis nula que estos parámetros son

This calculation was done using the Prism 6.0(Graph Pad Software, Inc., USA) program, whichincludes the Hill equation. The IC50 and Hillslope (h) values were compared with the sum-squared F-test using a null hypothesis of theparameters being identical between eachevaluated hormone pair; if a P>0.05 value isgenerated the parameter is deemed the samefor both fits(26). A one-way ANOVA and a Tukeymultiple comparison test were applied to identifysignificant differences (P<0.05) between thetested isoforms(27,28).

Measuring LH isoform biological activity

Biological activity was quantified by measuringcAMP production in three replicates per dose inthree independent assays. HEK-293 cells(20)

transfected with rat LH recombinant receptorcDNA (provided by Dr. Mario Ascoli, IowaUniversity, Iowa City, IA,USA) were stimulatedwith the reference pattern (USDA-bLH-B5) orone of the isoforms. These were differentiatedwhen their isoelectric points (IEP) weresufficiently separated between proteins, andeach represented a LH polymorphism. Basedon these criteria, three isoforms were analyzed:basic (B, pH 9.58-8.41); neutral (C, pH 7.98-6.89); and acidic (E, pH 5.36-3.46).

The HEK-293 cells were cultured in a 162 cm2

culture box (Costar, Cambridge, MA, USA)containing high glucose Dulbecco's ModifiedEagle Medium (DMEM) supplemented with5 % lamb fetal serum, 0.002 M L-glutamine,100 µg/ml geneticine, 50 UI/ml penicillin and100 µg/ml streptomycin. Cells with 90%confluence were reseeded in 24-well boxes(Gibco, BRL) at a 5 X 104 concentration perwell and incubated in a 5% CO2 atmospherefor 24 h at 37 °C. The medium was thenremoved and the cells exposed for 24 h toincreasing doses (6.25, 12.5 25.0, 50.0, 100.0and 200.0 ng/ml) of immunoreactive LH fromUSDA-bLH-B5 or an isoform. Each hormone wasdiluted in culture medium containing 0.0125 M3-isobutyl-1-methylxantine (phosphodiesteraseinhibitor).

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idénticos entre cada par de hormonas evaluadas;si se obtiene un valor de P>0.05, se concluyeque el parámetro es el mismo para los dosajustes(26). Adicionalmente, se utilizó ANOVAde una vía seguida de la prueba de comparaciónmúltiple de Tukey para determinar diferenciassignificativas (P<0.05) entre las isoformasensayadas(27,28).

Determinación de la actividad biológica de lasisoformas de la LH

La actividad biológica se determinó midiendo laproducción de AMPc en tres réplicas por dosisen tres ensayos independientes. En breve, lascélulas HEK-293(20) transfectadas con el cDNAdel receptor recombinante de LH de rata(proporcionadas por el Dr. Mario Ascoli, IowaUniversity, Iowa City, IA), se estimularon con elpatrón de referencia (USDA-bLH-B5) o con cadaisoforma, que por su punto isoeléctrico (pI)representó el polimorfismo de la LH y cuyo pIse encontró lo suficientemente alejado entreproteínas; con base en estos criterios seanalizaron las isoformas, básica (B, pH; 9.58-8.41), neutra (C, pH; 7.98-6.89) y ácida (E,pH; 5.36-3.46).

Para ello, las células HEK-293 transfectadas secultivaron en caja de cultivo de 162 cm2 (Costar,Cambridge, MA, EUA) que contenía el medioDMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) altoen glucosa, suplementado con 5 % de suerofetal de ternera, 0.002 M de L-glutamina, 100µg/ml de geneticina 50 UI/ml de penicilina y100 µg/ml de estreptomicina. Las célulasconfluentes en un 90 % se resembraron encajas de 24 pozos (Gibco, BRL) con unadensidad de 5 X 104 células por pozo y seincubaron en una atmósfera de 5 % de CO2por 24 h a 37 °C. Al término, se retiró el medioy las células se expusieron durante 24 h adosis crecientes de LH inmunoreactiva del USDA-bLH-B5 o de cada isoforma (6.25, 12.5 25.0,50.0, 100.0 y 200.0 ng/ml). Cada hormonase diluyó en medio de cultivo que contenía0.0125 M de 3-isobutil-1-metilxantina (inhibidorde la fosfodiesterasa).

Total cAMP content was measured in the culturemedium with liquid phase RIA(21). The cAMPtracer 2-0-monosuccinyl tyrosyl-methyl ester(Sigma) was labelled with Nal125 (AmershamInternational Limited, UK) following thechloramine-T method(29). The primary antibody(anti-cAMP, CV-27, NIADDK, Bethesda, MD, USA)was used at a 1:70,000 dilution in the presenceof 0.005 M sodium and 0.1 % BSA (pH 6.1).Each reaction tube was incubated for 24 h at4 °C, and then the bonded antibody separatedfrom the free cAMP by adding cold ethanol,and then centrifuging at 1,500 xg for 30 min at4 °C. The immunoprecipitated fraction wasanalyzed in a gamma radiation counter. Assaysensitivity was 2.0 pmol/ml with a 2 % intra-assay variation coefficient, and a 5 % interassayvariation coefficient. Production of cAMP wascalculated by interpolating from the cAMP 2-0-monosuccinyl tyrosyl-methyl ester referencecurve.

Each isoform's biological activity was measuredby calculating the EC50 parameter, defined asthe amount of LH (ng/ml) required to generatea response equal to 50 % of the maximumresponse under assay conditions(26,27). For thispurpose, the experimental data were fitted infour-parameter dose-stimulation response curvesin the tested LH immunoreactive dose rangefor the standard and for each isoform. Thesecalculations were done with the Prism 6.0program (GraphPad Software, Inc., USA).

Using the fit curves, statistical comparisons weremade of the EC50 parameters and Hill slope(h). These comparisons were done with thesum-of-squares F-test, testing the nullhypothesis of the parameters being identicalbetween each pair of evaluated hormones; avalue of P>0.05 indicated the parameter wasthe same in both fits(27). A one-way ANOVAand the Tukey multiple comparison test wereapplied to identify significant differences(P<0.05) between the relative bioactivitystrength of each assayed isoform.

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RESULTS

Three fractions were generated during theanterior lobe extraction process. The firstfraction, R0, corresponded to 63.2 % (77.16 g)of the original weight. The second, R1, wasobtained with 40% ethanol with a 9.03 %(11.02 g) yield. The third was the GPE,recovered using 85% ethanol with a 8.24 %(10.06 g) yield and a 226 µg LH/mg proteinconcentration.

Five protein fractions resulted from GPEpurification in the ionic exchanger (Figure 1(I)).Fraction CM-3ab exhibited the highest proteincontent and high immunoreactive LH content(Figure 1(II)). In contrast, fractions CM-1cd andCM-1ef had low LH and protein contents, andwere excluded from the analysis.

In the electrophoresis patterns generated undernon-reducing (NR) conditions (i.e. absence ofβ-mercaptoethanol) (Figure 1(II)), CM-3abexhibited a pattern similar to that of thereference, consisting of two proteins withmolecular weights of 36.5 and 23.4 kDa,respectively (Figure 1(III)). Although both theseproteins were present in the GPE, as well asCM-1ab and CM-2ab, the pattern in the lattertwo fractions was more heterogeneous with anadditional predominant, higher weight (56.0kDa) protein. Under reducing (R) conditions (i.e.presence of β-mercaptoethanol), CM-3abexhibited three proteins with weights of 23.4,20.8 and 17.0 kDa, respectively. Fractions CM-1ab and CM-2ab had a similar pattern, withaddition of an even more dominant protein at72.0 kDa. Based on their patterns, the lattertwo fractions were excluded, and LH chargeisoforms were isolated only from fraction CM-3ab (pH 9.5).

In the PBE-118 ionic exchanger, the CM-3abelution pattern exhibited five protein peaks alongthe pH gradient, each peak corresponding toan isoform (Figure 2(I)). Of the total recoveredimmunoreactive LH, 72.8 % was obtained at abasic pH (≥7.5, fractions A and B), 6.3 % at a

El contenido de AMPc total se midió en el mediode cultivo a través de radioinmunoensayo enfase líquida(21). Para ello el trazador 2-0-monosuccinil tirosil-metil éster de AMPc (Sigma)se radiomarcó con Na125I (AmershamInternational Limite, Reino Unido) mediante elmétodo de la Cloramina-T(29). El anticuerpoprimario (anti-AMPc, CV-27, NIADDK, Bethesda,MD, USA) se utilizó a una dilución de 1:70,000en presencia de acetato de sodio 0.005M yalbúmina sérica bovina al 0.1 %, pH 6.1. Cadatubo de reacción se incubó por 24 h a 4 °C yal término el anticuerpo unido se separó delAMPc libre después de agregar etanol frío yseguido de una centrifugación a 1,500 xg durante30 min a 4 °C. La fracción inmunoprecipitada seanalizó en un contador de radiaciones gamma.La sensibilidad del ensayo fue de 2.0 pmol/mly el coeficiente de variación intra e interensayofue de 2 y 5 %, respectivamente. La producciónde AMPc se calculó por interpolación de losresultados en la curva de referencia de 2-0-monosuccinil tirosil-metil éster de AMPc.

La actividad biológica para cada isoforma sedeterminó a través del cálculo del parámetroEC50, definido como la cantidad requerida deLH (ng/ml) que generó una respuesta al 50 %de la respuesta máxima, bajo las condicionesestablecidas en el ensayo(26,27). Para ello, losdatos experimentales se ajustaron en curvasdosis-respuesta de estimulación de cuatroparámetros, en el rango de la dosis de LHinmunoreactiva probada del estándar y de cadaisoforma, utilizando el programa estadísticoPrism 6.0 (GraphPad Software, Inc., USA).

A partir de las curvas de ajuste se realizaroncomparaciones estadísticas de los parámetrosEC50 y la pendiente de Hill (h). Para lo anteriorse utilizó la prueba F de la suma de cuadrados,probando como hipótesis nula que losparámetros son idénticos entre cada par dehormonas evaluadas; si se obtiene un valor deP>0.05, se concluye que el parámetro es elmismo para los dos ajustes(27). Además, seutilizó ANOVA de una vía seguida de la pruebade comparación múltiple de Tukey para

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Figura 1. I) Patrón de elución del extracto glicoprotéico (GPE) en CM-Sepharosa. II) Concentración de proteína (mg)

y LH inmunoreactiva para cada fracción. III) Patrón electroforético del USDA-bLH-B5, el (CPE) y de las

fracciones con actividad inmunológica de LH. NR, condiciones no reductoras; R, reductoras

Figure1. I) Elution pattern of the glycoproteic extract (GPE) during its cation-exchange chromatography with CM-

Sepharose. II) Table summarizing the protein concentration (mg) and concentration of LH (µg LH/mg

protein) of each fraction. III) Electrophoretic pattern of the reference LH (USDA-bLH-B5), the GPE and the

fractions with LH immunological activity under non-reducing (NR) and reducing (R) conditions. Arrows

indicated at proteins with molecular weights of 72, 60, 36.5, 23.4, 20.8, 17.0 kDa, respectively

226.0

Frac tion Protein (mg) *

Fractions obtained dur ing purificationof glycoproteinextract (GPE)

t g LH/mg protein **

GPE

CM-1ab

CM-1cd

CM-1ef

CM-2ab

CM-3ab

256.0

26.7

6.6

0.8

18.1

55.8

607.0

20.0

11.4

727.5

73.0

* Estimated by Bradford

** Estimated by RIA, equivalent to USDA-bLH-B5

II

0 100 200 300 400 500

0

1

2

3

4

0.1

Mammonium

acetate

,pH

6.8

CM-2ab

CM-1ab

CM-1cd

CM-1ef

CM-3ab

NaCl

1.0

Mammonium

acetate-0.1M

glycine,pH

9.5

I

0.005

Mammonium

acetate

,pH

5.1

Frac tion number

O.D

.280nm

III

USDA -bLH-B 5GP

ECM

-1ab

CM-2ab

CM-3ab

CM-1ab

CM-2ab

CM-3ab

95

72

55

36

28

17

kD a

NR R

72

60

36. 5

23.4

20.8

17.0

kDa

GP

E

CM

-1ab

CM

-2ab

CM

-3ab

CM

-1ab

CM

-2ab

CM

-3ab

40


determinar diferencias significativas (P<0.05)entre la biopotencia relativa de las isoformasensayadas.

neutral pH (7.4 - 6.6, fraction C), and 20.1 % atan acidic pH (≤ 6.5, fractions D and E). Eachisoform had different protein and immunoreactiveLH contents (Figure 2(II)).

Under NR electrophoretic conditions (Figure 3(I),upper panel), each LH isoform exhibited ahomogeneous pattern with two dominant proteinbands (36.5 and 23.4 kDa) in a pattern similarto those of USDA-bLH-B5 and CM-3ab. Althoughthe GPE and isoform E (pH; 5.36-3.46) had apattern similar to those above, they also included

Figura 3. Patrón electroforético (I) y análisis por

inmunotransferencia (II) de cada isoforma de LH bovina.

USDA-bLH-B5, patrón de referencia; GPE, extracto

glicoprotéico; fracción CM-3ab; isoformas, A (pH 10.75-

9.75); B (pH 9.58-8.41); C (pH 7.98-6.89); D (pH 6.88-

5.41); E (pH 5.36-3.46)

Figure 3. Electrophoretic pattern (I) and immunobloting

electrophoretic pattern (II) for the standard bLH (USDA-

bLH-B5), glycoprotein extract (GPE), CM-3ab fraction,

isoform A, pH 10.75-9.75; B, pH 9.58-8.41; C, pH 7.98-

6.89; D, pH 6.88-5.41; E, pH 5.36-3.46 in non-reducing

and reducing conditions

Figura 2. I) Patrón de elución de la fracción CM-3ab en

el cromatoenfoque. Cada pico de proteína se identificó

con una letra, comenzando con la proteína de elución a

pH básico (A) y finalizando con la proteína que eluyó a

pH ácido (E). La fracción S se obtuvo con 1.0M NaCl. II)

Cuadro de rendimiento y concentración de LH/mg de

proteína para cada isoforma

Figure 2. I) Elution pattern of the CM-3ab fraction in

chromatofocusing. Protein was monitored at 280 nm and

each protein peak was identified with a letter, starting

with the elution protein at basic pH (A) and ending with

the eluted protein at acid pH (E). The protein that did not

eluted with the gradient was obtained after, using 1.0M

NaCl and was designated as S. II) Table summarizing the

protein concentration and LH-specific for each isoform

A (10.75-9.75) 1.0 112.5 t 14.1

0 20 40 60 80 100 120 140

4

5

6

7

8

9

10

11

12

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8pH

0.D. 280 nm

A

B C

D

E

S

NaC

l

I

Fraction number

Elu

tion

pH

4°C

O.D

.280

nm

Isoform(pH range)

Protein (mg) *

Purification of bovine LH isoforms from theCM-3ab fraction of GPE

t g LH/mg protein **

B (9.58-8.41)

C (7.98-6.89)

D (6.88-5.41)

E (5.36-3.46)

17.9

6.9

7.9

8.5

673.1 t 37.7

161.3 t 12.9

199.3 t 5.3

232.9 t 13.1

* E stimated by Bradford ** E stimated by RIA

S 0.4 16.0 t 0 .6

II

US

DA

- bL

H-B

5G

PE

CM

-3a

b

LH isoform

55

3628

17

kDa

17

36

28

A B C D E kDaUS

AD

- bL

H-B

5G

PE

CM

- 3a

b

LH isoform

A B C D E

Western-BlotElectrophoresis

kDa

36.5

23.4

17.0

20.8

23.4

17

36

28

55

17

2836

I II

No

n-re

duc

ing

Re

du

cin

g

36.5

23.4

23.4

20.8

20.8

36.5

Re

du

cin

gN

on

-Re

du

cin

g

41


RESULTADOS

Durante el proceso de extracción de los lóbulosanteriores se generaron tres fracciones. El R0que correspondió al 63.2 % (77.16 g) del pesooriginal; el R1, que se obtuvo con el 40 % deetanol, con un rendimiento del 9.03 % (11.02 g)y el extracto glicoprotéico (EGP) que se recuperócon el 85 % de etanol, con un rendimiento del8.24 % (10.06 g) y una concentración de 226µg de LH/mg de proteína.

Del EGP purificado en el intercambiador iónicose obtuvieron cinco fracciones de proteína(Figura 1(I)). La fracción CM-3ab mostró elmayor contenido de proteína y un alto contenidode LH inmunoreactiva (Figura 1(II)); encontraste, las fracciones CM-1cd y CM-1efmostraron un bajo contenido de LH y cantidad

a 55.0 kDa protein. Under R electrophoreticconditions (Figure 3(I), lower panel), all theisoforms exhibited the same pattern as the GPE,CM-3ab and USDA-bLH-B5. Of interest is thepresence of a 17.0 kDa protein in CM-3ab andthe B, C and D isoforms.

Immunotransference analysis under NRconditions (Figure 3(II), upper panel) showedthat the different isoforms maintained a LHimmunoreactive protein pattern similar to thatof USDA-bLH-B5 with the 36.5 kDa protein mostnotable. Under R conditions, this protein almostdisappears while lower weight proteins (23.4and 20.8 kDa) increase in intensity.

When the LH isoform and CM-3ab fraction arecompared to the reference standard in the RIAdisplacement curves (Figure 4), immunological

Figura 4. Curva dosis-respuesta en el sistema de RIA específico para LH. I) USDA-bLH-B5 y la fracción CM-3ab. II)

USDA-bLH-B5 e isoformas básicas (A, pH, 10.75-9.75; B, pH, 9.58-8.41); USDA-bLH-B5 e isoforma neutra

(C, pH, 7.98-6.89); USDA-bLH-B5 e isoformas ácidas (D, pH, 6.88-5.41 y E, pH 5.36-3.46). III) Parámetros

de análisis de la relación B/Bo vs dosis

Figure 4. Inhibitory dose-response curves of a LH-specific RIA for the standard bLH (USDA-bLH-B5) and isoforms.

I) The reference standard and CM-3ab fraction. II) Standard and basic isoforms (A, pH, 10.75-9.75, B, pH,

9.58-8.41); Standard and neutral isoform (C, pH 7.98-6.89); Standard and acidic isoforms (D, pH 6.88-5.41

and E, pH 5.36-3.46). III) Table summarizing the analysis parameters of the B/Bo vs dose

S ta n d a rd

0.01 0.1 1 10

0

20

40

60

80

100

120

U SD A-bL H -B5C M-3a b

I

P ro tei n (ng /tu be )

B/B

0(%

)

Ne u tra l

0 .0 1 0 .1 1 1 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

C

P ro te in (n g/ tu be )

B a sic

0.01 0.1 1 10

0

20

40

60

80

100

120II

U S D A-bL H -B5

B

A

P ro tei n (n g /tu be )

B/B

0(%

)

A cid ic

0 .0 1 0 .1 1 1 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

D

E

P rote i n (n g/t ub e)

Isofo rm s

IC 5 0

h

R 2

0 .4 5

-1 .0

0 .9 8

0 .6 3 *,a

-1 .3

0 .9 4

1 .9 5 *

-1 .5

0 .9 6

1 .4 3 *, a

-1. 2

0 .9 8

1 .5 1 *,a

-1.0

0 .9 6

0 .4 2

-1.4

0 .9 8

* In d ic a te s p < 0 .0 5 v s U SDA -bL H- B5

2 .5 4 *,b

-1.6

0 .9 5

a,b D iffe ren t lette r su p e rc r ip ts b etw e e n is ofo ms in th e s ame p H ra n ge in d ica tes ig ni ficant diffe ren c e s ( p < 0 .05 )

A B C D E

U SD A-bLH -B 5

CM

-3ab

B as ic Ne utra l A cid ic

S u m m ary of th e d o s e -d e p e n d e n t e ffe c t o n th e B /B O p e rc e n ta g eIII

42


activity (IC50) is similar between USDA-bLH-B5and CM-3ab (Figure 4(II)). However, the IC50for the reference was lower than those of theisoforms, indicating that the standard isimmunologically more active versus the antibodyused in the assay. The dose-response curveslopes of the standard and the isoforms did notdiffer, indicating the proteins' identity (Figure4(III)).

Production of cAMP by HEK-239 cells in responseto the immunoreactive LH standard and the LHisoforms was dose-dependent (Figure 5(I)).Calculation of EC50 as a proxy for biologicalactivity on the normalized dose-response curveshowed the standard and the isoforms to differ(Figure 5(II)). The neutral isoform had thelowest EC50 value, meaning it was the mostbiologically active, whereas the acidic isoformhad the highest EC50 value and therefore thelowest bioactivity (Figure 5(III)). For thestandard, the Hill slope (h) value differed fromthose of the basic and acidic isoforms, but notfrom that of the neutral isoform (Figure 5(III)).

DISCUSSION

Polymorphism in mammal LH is reflected in itsphysicochemical, immunological and biologicalproperties. In vivo(13,14,15) and in vitro(16,17)

bioassays have been done of biological activity indifferent LH isolates from ruminant hypophyses.The results indicate that basic isoforms are themost bioactive proteins in vitro, whereas acidicisoforms are more active in vivo. Recentdevelopments include bioassays using cell linesthat express gonadotropin receptors, which allowstudy of biologically functional proteins(20,30).

The present study is the first time an in vitrobioassay using HEK-293 cells transfected withrat LH receptor cDNA has been applied toevaluate biological activity in different chargeisoforms of bovine hypophysis(20). QuantitativecAMP production per immunoreactive LH unitdiffered between isoforms, with the neutralisoform having more activity than the basic andacidic isoforms.

de proteína, por lo que se excluyeron del estudioy no se analizaron electroforéticamente. Elpatrón electroforético de aquellas fracciones conmayor contenido de proteína y LH se ejemplificaen la Figura 1(II).

De acuerdo al patrón electroforético, en ausenciade β-mercaptoetanol (condiciones no reductoras,NR), la fracción CM-3ab y el patrón de referenciapresentaron un patrón similar que consistió dedos proteínas con un peso molecular de 36.5 y23.4 kDa, respectivamente (Figura 1(III)). Apesar de la presencia de estas dos proteínas enel extracto glicoprotéico y en las fracciones CM-1ab, CM-2ab, el patrón electroforético en estasúltimas fracciones resultó más heterogéneo, yse observó una proteína predominante de mayorpeso molecular (56.0 kDa). En presencia deβ-mercaptoetanol (condiciones reductoras, R),el patrón electroforético de la fracción CM-3abse caracterizó por la presencia de tres proteínascon un peso molecular de 23.4, 20.8 y 17.0kDa, respectivamente; las fracciones CM-1ab yCM-2ab presentaron un patrón similar, sinembargo en ellas se observó una proteína muyintensa de peso molecular de 72.0 kDa. Conbase en este patrón electroforético se decidióque ambas fracciones de proteína se excluyerandel estudio, por lo tanto el grupo de isoformasde carga de LH se aislaron únicamente de lafracción CM-3ab (pH 9.5).

El patrón de elución de la fracción CM-3ab enel intercambiador iónico, PBE118, se distribuyóen cinco picos de proteína a través del gradientede pH; cada pico correspondió a una isoforma(Figura 2(I)). Del total de LH inmunoreactivarecuperada, el 72.8 % se obtuvo a pH básico(≥7.5, fracciones A y B), mientras que a pH neutro(7.4 a 6.6, fracción C) se recuperó el 6.3 % y apH ácido (≤6.5, fracciones D y E) el 20.1 %. Lacantidad de proteína y de LH inmunoreactiva paracada isoforma se resume en la Figura 2(II).

En el patrón electroforético en condiciones noreductoras (Figura 3(I), panel superior) cadaisoforma de la LH mostró un patrón homogéneocon dos bandas de proteínas predominantes de

43


peso molecular de 36.5 y 23.4 kDa respectivamente,patrón similar al USDA-bLH-B5 y a la fracciónCM-3ab. A pesar que el extracto glicoprotéico(EGP) y la isoforma E (pH; 5.36-3.46) mostraronun patrón similar en ellos, se observó unaproteína de 55.0 kDa. Asimismo, en condicionesreductoras, cada isoforma mostró el mismopatrón electroforético que el extractoglicoprotéico, la fracción CM-3ab y el USDA-bLH-B5. Interesantemente, se presentó unabanda de proteína de 17 kDa particularmenteen la fracción CM-3ab y en las isoformas B, Cy D (Figura 3(I), panel inferior).

Del análisis por inmunotransferencia encondiciones no reductoras (Figura 3(II), panelsuperior) se desprende que las distintasisoformas conservan un patrón de proteínainmunoreactiva a LH similar al USDA-bLH-B5,siendo la proteína de 36.5 kDa una de lasbandas de proteína importantes, que encondiciones reductoras prácticamentedesaparece y se incrementan las proteínas demenor peso molecular (23.4 y 20.8 kDa).

Las curvas de desplazamiento que se obtuvieroncon el radioinmunoensayo para las diferentesisoformas de la LH y la fracción CM-3ab encomparación con el estándar de referencia sepresentan en la Figura 4. La actividadinmunológica referida como el parámetro IC50mostró un valor similar entre el USDA-bLH-B5y la fracción CM-3ab (Figura 4(II)). En contraste,el valor de IC50 del estándar fue significati-vamente menor al de las isoformas, que indicaque el estándar es inmunológicamente másactivo ante el anticuerpo utilizado. Laspendientes de las curvas dosis-respuesta delestándar y las de las isoformas no fueronestadísticamente diferentes, lo que denota laidentidad de las proteínas (Figura 4(III)).

La cantidad de AMPc producido por las célulasHEK-293 después de 24 h de tratamiento conlas diferentes dosis de LH inmunoreactiva delestándar o con cada isoforma de LH seejemplifica en la Figura 5(I). La producción deAMPc fue dependiente de la dosis y el cálculodel parámetro EC50 como indicativo de actividad

Under the studied bioassay conditions, theresponse patterns for the different bovine LHisolates were dose-dependent between 6.5 and100 ng immunoreactive LH. Production of cAMPwas unaltered at higher doses and evenexhibited a decline. This response pattern couldindicate desensitizing of the limited number ofreceptors in the HEK-293 cells through arelatively slow down-regulation process of the

Figura 5. Producción de AMPc por las células HEK-293

con el estímulo de bLH y sus isoformas. I) Dosis-respuesta

para la isoforma básica (B), neutra (C) y ácida (E). II)

Respuesta normalizada en la producción de AMPc por

dosis de LH inmunoreactiva. III) Análisis de las curvas

dosis-respuesta. Los resultados presentan el promedio

de tres ensayos independientes por isoforma.

Figure 5. AMPc production in HEK-293 cells after

stimulation with different isoforms of LH. I) Dose-response

pattern isoforms to basic (B), neutral (C) and acidic (E).

II) Normalized response pattern in cAMP production by

LH immunoreactive dose. III) Analysis parameters of the

dose-response curve. Each point represents the mean of

three independent assays for each isoform

0.01 0.1 1 10 100 1000

0

250

500

750

1000

1250

irLH (ng/ml)

cA

MP

(pm

ol/m

l)

USDA-bLH-b5

Basic

Neutral

Acidic

I

Hormone EC50 R2

USDA-bLH-b5BasicNeutralAcidic

9.67

14.01*a

6.63*b

18.96*c

0.9640.9800.9310.982

Summary ofthe LHdose-dependenteffectoncAMP production by HEK-293cells

a,b,c Different letter supercripts in the same columns indicate significant

differentces (p <0.05)

III

h

1.24

0.90*a

1.81

2.46*b

0.01 0.1 1 10 100 1000

0

50

100

irLH (ng/ml)

cA

MP

pro

du

ction

(%)

II

Basic

Neutral

USDA-bLH-b5

Acidic

* Indicatesp < 0.05 vs USDA-bLH-B5

44


biológica sobre la curva dosis-respuestanormalizada (Figura 5(II)) resultó diferente entrelas isoformas y el estándar, con la isoformaneutra más activa biológicamente con un EC50menor; en contraste, la isoforma ácida mostróla menor actividad biológica con un EC50 mayor(Figura 5(III)). El valor de la pendiente (h) delestándar con respecto a la isoforma básica y laácida denotó diferencias significativas, en tantoque al comparar la pendiente del estándar conla isoforma neutra no se observó diferencia(Figura 5(III)).

DISCUSIÓN

El polimorfismo de la LH de mamíferos se reflejaen sus propiedades fisicoquímicas, inmunológicasy biológicas. La actividad biológica de distintosaislados de la LH hipofisaria de rumiantes seha determinado con bioensayos in vivo(13,14,15)

e in vitro(16,17) con resultados que indican quelas isoformas básicas son las proteínas másbioactivas in vitro, en tanto que la mayor respuestain vivo lo generan las isoformas ácidas. En añosrecientes el desarrollo de bioensayos usandolíneas celulares que expresan receptores paragonadotropinas ha permitido evaluar proteínasbiológicamente funcionales(20,30).

El presente estudio evaluó la actividad biológicade distintas isoformas de carga de LH de lahipófisis bovina utilizando por primera vez elbioensayo in vitro de las células HEK-293transfectadas con el cDNA para el receptor dela LH de rata(20) con resultados que mostrarondiferencias significativas en la produccióncuantitativa de AMPc por unidad de LHinmunoreactiva, siendo la isoforma de tiponeutro la que resultó la más activa al compararsu efecto con su análoga básica y ácida.

En este estudio, y bajo las condiciones delbioensayo, el patrón de respuesta con losdiferentes aislados de LH bovina fue dependientede la dosis en el rango de 6.5 a 100 ng de LHinmunoreactiva, mientras que la producción deAMPc a dosis mayores no se modificó, más aúnse presentó una caída en la producción. Este

number of receptors in each cell(22). However,it could also be a product of the relatively rapidprocess of a decrease in the LH receptor'scapacity to interact with and activate its relatedG proteins(31). Time-dependent cAMP productionwas not analyzed in the present study, but 24 hof stimulus allowed an evaluation of differentialchanges in cAMP production between isoforms.

The greater response of the basic isoformcompared to that of the acidic isoform coincidedwith the biological effect reported after placingdifferent doses of diabetic and obese rathypophysis eluted at basic and acidic pHs inHEK-293 cells(20,21). It is a response patternalso seen in vitro in primary Leydig cell culturesafter stimulus with human(32), rat(33) andovine(17) LH hypophysis isoforms, as well aswith basic isoforms present in circulation(16).

Why biological activity differed between the testedisoforms is not completely clear. Partial or total removalof some isoform oligosaccharide components bychemical or enzymatic means modifies theiractivity(34,35), suggesting that one explanation maybe the type of oligosaccharides in each isoform(4).For example, removal of the sulphate group in bovineLH containing only oligosaccharides with sulphatedN-acetylgalactosamine terminals (thus exposing theN-acetylgalactosamine) produces greater LHdepuration from the blood(36). This occurs dueto easy recognition of the desulphated LH bythe specific receptor in the liver (Gal/GalNAc-specific receptor), which proportionally reducesthis protein's in vivo biological activity(36,37).

Total removal of the oligosaccharide from LHhas shown that deglycosilated hormones canno longer stimulate adenylate cyclase activity,although no apparent change occurs in receptoraffinity(38). Deglycosilated hormones exhibitantagonistic functions in second messengerformation and production(39), and therefore onproduction of steroidal hormones(40). Variationin receptor affinity for each isoform may alsohave had an effect. Studies of bonding in HEK-239 cells transfected with rat LH receptor cDNAhave shown that there is a constant association

45


patrón de respuesta en el bioensayo podría serun indicativo de la desensibilización del númerolimitado de receptores presentes en las célulasHEK-293(22) a través de un proceso relativamentelento de regulación a la baja del número dereceptores presentes en cada célula, o bienmediante el proceso relativamente rápido de ladisminución en la capacidad del receptor de laLH de interactuar y activar a sus proteínas Gafines(31). Aunque en este estudio no se analizóla producción de AMPc dependiente del tiempo,24 h de estímulo permitió evaluar el cambiodiferencial en la producción de AMPc entreisoformas.

El patrón de respuesta mayor entre la isoformabásica con respecto a su análoga ácida de laLH bovina coincidió con el efecto biológico quese generó después de colocar diferentes dosisde extractos de hipófisis de rata diabética yobesa eluídos a pH básico o ácidos en las célulasHEK-293(20,21). Estos resultados tambiéncoincidieron con el patrón de respuestagenerado in vitro en cultivos primarios de célulasde Leydig después del estímulo con isoformashipofisarias de la LH humana(32); de rata(33);ovina(17), así como con las isoformas básicaspresentes en la circulación(16).

La causa de la discrepancia en la actividadbiológica entre las isoformas ensayadas no es deltodo conocida, sin embargo, el o los mecanismosde esta diferencia biológica, se atribuye en parteal tipo de oligosacáridos que integran a cadaisoforma(4), dado que la remoción total o parcialde algunos de los componentes de losoligosacáridos por medios químicos o enzimáticosmodifican su actividad biológica(34,35). La LHbovina que contiene únicamente oligosacáridoscon terminaciones de N-acetilgalactosaminasulfatada(36), y la remoción del grupo sulfato queexpone a la N-acetilgalactosamina resulta en unamayor depuración de la hormona de la sangre,debido a su alto reconocimiento de la LHdesulfatada por el receptor específico presenteen el hígado (Gal/GalNAc-receptor específico),reduciendo proporcionalmente la actividadbiológica in vivo de la proteína(36,37).

at different orders of magnitude betweendifferent mammal LHs(22). Bovine LH exhibitsthe lowest affinity for the LH receptor, eventhough it has repeated leucine-rich regions (LRR;specifically leucine 3, 7, 8 and 9) in the receptor'sextracellular domain that are specifically forrecognizing this hormone(22).

It can therefore be inferred that cAMPproduction after treatment with the differentisoforms could also depend on differentiatedaffinity in the receptor. This makes it highlyprobable that the LH's glycosylation pattern iswhat regulates the differential pattern inbiological response measured as cAMPproduction by HEK-239 cells after stimulationwith different LH isoforms. Proteins with distinctreceptor affinities can be produced as a result,the interaction of which can be reflected inchanges in biological response quantified ascAMP production by cells.

The present data on isoform biological activitywill complement the limited data currentlyavailable. To date, the neutral isoform in LHfrom ruminants and other species has not beenimmunologically or biologically characterized,possibly because it is difficult to purify andcharacterize due to its low content in theadenohypophysis(13,40,41) and the blood(6). Thebioactivity recorded in the neutral isoform inthe present study is a valuable addition tobiological evaluation of the bovine LH isoformspectrum. For the basic isoform, the observedbiological activity complements previous reportson ovine(17), bovine(13) and rat LH(33) in whichthe basic isoform exhibits greater in vitrobioactivity than the acidic isoform. Under the invitro bioassay conditions used here, the isoformsexhibited differential bioactivity, but use of ahomologous bioassay is desirable because itwould provide superior analysis of LH isoformsin ruminants.

Quantitative immunoreactive LH concentrationin the LH isoforms isolated from the bovineadenohypophysis was measured using USDA-bLH-B5 as a reference. The RIA response

46


Por otro lado, la remoción total del oligosacáridode la LH, ha confirmado que las hormonasdeglicosiladas pierden su acción estimuladorasobre la actividad de la adenilato ciclasa, sinque se aprecie un cambio en su afinidad por elreceptor(38). Con ello, se ha observado que lashormonas deglicosiladas presentan funcionesantagónicas en la inducción de la formación yproducción de segundos mensajeros(39) y porende sobre la producción de hormonasesteroides(40). Finalmente, no se puededescartar la posible participación del receptorpor diferencias en la afinidad por cada isoforma.Estudios de unión en células HEK-293transfectadas con el cDNA para el receptor dela LH de rata(22), demostraron que existe unaconstante de asociación con diferente orden demagnitud entre distintas LH de mamíferos,siendo la LH bovina la que presentó la menorafinidad por el receptor de LH, a pesar decontar con las regiones repetidas ricas en leucina(LRR) 3, 7, 8 y 9 en el dominio extracelular delreceptor, específicas para el reconocimiento deesta hormona(22).

Con base en este estudio se puede inferir quela producción de AMPc después del tratamientocon los diferentes tipos de isoformas dependetambién de la afinidad diferenciada del receptor.Por lo tanto, basados en esta serie de resultadosse puede establecer que el patrón diferencialen la respuesta biológica sobre la producciónde AMPc por las células HEK-293 a través delestímulo con las distintas isoformas de la LHestá regulado por el patrón de glicosilación dela LH, que puede dar origen a proteínas condistinta afinidad por su receptor, y cuyainteracción se refleje en un cambio en larespuesta biológica medida como la producciónde AMPc por las células.

Adicionalmente, hasta donde se sabe, lacaracterización inmunológica y biológica para laisoforma de tipo neutro en rumiantes y otrasespecies no se ha reportado, debido posiblementea su bajo contenido en la adenohipófisis(13,40,41)

y en el suero(6), lo que genera dificultad parasu caracterización y purificación. Con el resultado

pattern depended in the amount of assayedprotein, exhibiting similar values between theslopes, indicating the proteins are analogous.Values for IC50 were also similar among elutionproteins in the same basic pH range (USDA-bLH-B5; CM-3ab; and basic isoform B, pH 9.58-8.41). However, they increased significantly inthe neutral and acidic isoforms, suggesting aprogressive decrease in LH immunologicalactivity.

Distinct immunological activity between isoformscan be attributed to use of a polyclonal antibodyin the RIA which is specifically focused againstnative oLH (NIDDK-oLH-26), a protein isolatedusing a procedure similar to that described here.A number of studies have shown that pureforms of LH contain different components. In astudy using Nal125-labelled USDA-bLH-B5analyzed using chromatofocusing(9), thisreference LH exhibited a basic type distributionpattern in which 80 % of the LH eluted in abasic pH range, while the rest of the labelledprotein eluted in neutral and acidic pH gradients.This may indicate that the antibody generatedfor oLH, used in the immunodiagnostic, is mostlyfocused on basic isoforms with little emphasison neutral and acidic proteins in LH. A clearadvantage therefore exists for isoformsrecovered at extremely basic pH (e.g. isoformA). Neutral and acid isoforms require moreprotein for this antibody to identify them.

The increasing amount of protein in eachisoform could interfere in their biologicalresponse due to possible contamination fromproteins structurally related to LH which remainpresent throughout purification and in the finalproducts. However, this is unlikely since theanti-oLH antibody had been shown to be highlyspecific in quantifying LH in serum and ruminanthypophysis extracts without generating crossreactions with structurally related proteins suchas FSH and TSH(9,11).

All the isoforms were recognized by the sameantibody, although specificity was greatest inthe basic isoform group. This was reflected in

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de la bioactividad de la isoforma neutra secomplementa la valoración biológica del espectrode isoformas de LH bovina. Por otra parte, elresultado de la actividad biológica reportado eneste estudio para la isoforma básicacomplementa a lo reportado en la LH ovina(17),bovina(13) y de rata(33) en donde la isoformabásica muestra una mayor actividad biológicain vitro con relación a la isoforma ácida. Apesar de que bajo las condiciones de desarrollodel bioensayo in vitro se observó un efectodiferencial en la actividad biológica entreisoformas, es deseable contar con un bioensayohomólogo de este tipo, que permita un mejoranálisis para las isoformas de la LH derumiantes.

La concentración cuantitativa de LHinmunoreactiva se determinó en las distintasisoformas de LH aisladas de la adenohipófisisbovina, tomando como referencia al USDA-bLH-B5; el patrón de respuesta en el RIA fuedependiente de la cantidad de proteínaensayada. El valor entre pendientes fue similar,lo que denotó identidad entre proteínas. Deforma interesante, el cálculo de la dosis al 50 %de inhibición (IC50) como un referente de laactividad inmunológica fue similar entreproteínas de elución en el rango básico (USDA-bLH-B5, fracción CM-3ab y la isoforma básicaB, pH 9.58-8.41), en tanto que en la isoformaneutra y las isoformas ácidas, el valor de IC50se incrementó significativamente, lo que seinterpretó como proteínas con menor actividadinmunológica de LH.

Esta discrepancia en la actividad inmunológicaentre isoformas se puede atribuir a que para eldesarrollo del RIA se utilizó un anticuerpopoliclonal dirigido específicamente contra la oLHnativa (NIDDK-oLH-26), proteína que se obtuvocon un procedimiento similar al descrito en esteestudio. Diversos estudios han demostrado queformas puras de la LH contienen diferentescomponentes. El patrón de referencia USDA-bLH-B5 radiomarcado con Na125I y analizadoen el cromatoenfoque mostró un patrón dedistribución de tipo básico, en donde el 80 %

the amount of protein required to attain theIC50 dose in the system, which was significantlylower in the other analyzed isoforms. Calculationof each isoform's immunological activity usingthe LH-specific heterologous assay may beadequate, but more accurate immunologicalevaluation will require developing a specifichomologue system for each isoform.

Glycoprotein extract (GPE) was generated inthe extraction process with the hypophysisanterior lobes. Purification of the GPE in theCM-Sepharose exchanger produced CM-3ab, aprotein fraction containing the greatest amountof immunoreactive LH. Its physicochemical,immunological and biological characteristics weresimilar to those of the reference, and itschromatofocusing distribution pattern was similarto that of adenohypophysis tissue inbovines(42,43,44), caprines(14) and humans(45).Use of the chromatofocusing technique resultedin higher LH yield (µg LH/mg protein) thanreported in other species and using othertechniques(15,17,44).

Of the isoforms isolated from CM-3ab usingchromatofocusing, LH immunoreactive proteinsin the basic pH range dominated. Similardistribution patterns have been reported in ovinespecies(42), and in the elution patterns ofovine(46) and bovine hypophysis extracts(11,47).It can therefore be assumed that the proceduredeveloped here to isolate isoform groups frombovine LH does not interfere in the isoformdistribution patterns of bovine LH.

In NR conditions, the isoform group isolatedfrom the hypophysis anterior lobe had the samemolecular weight as the reference standard,which corresponds to the 36.5 kDa heterodimer.Under R conditions, the dominant presence ofproteins with 20.8 and 23.0 kDa molecularweights corresponds to alpha- and beta-LH,respectively, and with values reported for nativeLH and its subunits(13,14,15). Pattern analysisof the acidic isoform under NR conditions showeda series of high molecular weight proteins thatdisappeared after treatment with the reducing

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de la LH eluyó en este rango de pH, y el restode la proteína radiomarcada eluyó en el rangode pH neutro y ácido del gradiente(9), resultadoque puede ser un indicativo que el anticuerpogenerado para oLH y que se utilizó para elinmunodiagnóstico está dirigido en su mayoríapara isoformas básicas, y escasamente paraproteínas neutras y ácidas de la LH, lo que legenera una ventaja de inmunodetección sobreaquellas isoformas recuperadas a pHextremadamente básico, como resulta con laisoforma A, por lo que neutras y ácidasrequirieron mayor cantidad de proteína requeridapara ser identificadas por el anticuerpo.

El incremento en la cantidad de proteína paracada isoforma podría interferir en la respuestabiológica debido a la presencia de posiblescontaminantes de proteínas estructuralmenterelacionadas con la LH, y que como se sabedurante la purificación, están presentes hastalos productos finales; sin embargo, estaposibilidad se puede descartar dado que sedemostró previamente la alta especificidad delanticuerpo anti-oLH para cuantificar LH del sueroy de extractos de hipófisis de rumiantes singenerar ninguna reacción cruzada con proteínascomo la FSH y TSH estructuralmenteemparentadas(9,11).

Todas las isoformas se reconocieron por elmismo anticuerpo, sin embargo, la mayorespecificidad se presentó con el grupo deisoformas básicas que se reflejó en la cantidadde proteína requerida para alcanzar la dosisIC50 en el sistema, y que fue significativamenteinferior con el resto de las isoformas analizadas.Aunque podemos inferir que el cálculo de laactividad inmunológica para cada isoforma conel ensayo heterólogo específico para LH esadecuado, se debe considerar que para unamejor valoración inmunológica se requiere deldesarrollo de un sistema homólogo y específicopara cada isoforma.

Durante el proceso de extracción de los lóbulosanteriores de la hipófisis se generó el extractoglicoprotéico, a partir del cual y después de su

agent β-mercaptoethanol. This suggests thepresence of molecular aggregates of LH.

Electrophoretic analysis under R conditions ofCM-3ab, and the C and D isoforms showed them allto be characterized by the presence of a 17 kDaprotein, which was absent in isoform A and barelypresent in isoform B. Because this protein was notidentified in the immunotransference analysis,it is probably a contaminating protein concentratedbetween pH 7.98 and 5.41. It may correspondto one of the isoforms of bovine FSH(11), whichelute in this pH range. Another possibility is that itis an immature form of one of the subunits. Aprotein with a molecular weight similar to thatdescribed here was identified in electrophoreticanalysis under R conditions of deglycosilated ovineLH(48). Some of the subunits may also haveexperienced proteolytic breakage, as describedfor fractionated proteins of human LH with asimilar molecular weight(49). Presence of thisprotein type in some isoform isolates does notcorrespond to LH, although it could interfere inthe interaction between LH and it receptor, thusmodifying the strength of its biological activity.


Isoforms of bovine luteinizing hormone havediffering biological activities. Differences in thestrength of in vitro biological activity betweenLH isoforms suggest that some may experiencechanges during the isoform synthesis process.This may represent a fine-tuned regulationmechanism of gonadal function in theadenohypophysis. Isoform biological activity wasquantified using an in vitro heterologousbioassay, which does not truly reflect eachisoform's physiological response in the organismas a whole. However, this technique did provethe presence of differential biological responseamong the tested isoforms. Confirming eachisoform's affinity and selective specificity willrequire use of HEK-239 cells transfected withbovine LH (homologue) receptor cDNA.


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purificación en el intercambiador CM-sepharosadio origen a la fracción CM-3ab, fracción deproteína que agrupó a la mayor cantidad de LHinmunoreactiva. Esta fracción de proteína mostrócaracterísticas fisicoquímicas, inmunológicas ybiológicas similares al patrón de referencia,además su patrón de distribución en elcromatoenfoque se asemejó al patrón observadodel tejido adenohipofisario de estaespecie(42,43,44), la especie caprina(14) yhumana(45). Adicionalmente, con el empleo delcromatoenfoque, el rendimiento de LH (µg deLH/mg de proteína) resultó superior a loreportado en otras especies que aislaron a estaproteína con diferentes procedimientos(15,17,44).

Las isoformas aisladas a partir de la fracciónCM-3ab mediante el cromatoenfoquerepresentaron diferentes proporciones, dondepredominaron las proteínas inmunoreactivas aLH que eluyeron en el rango de pH básico.Este patrón de distribución resultó similaraunque no idéntico al observado en la especieovina(42), así como al patrón de elución que seobservó durante el análisis de extractoshipofisarios ovinos(46) y bovinos(11,47), endonde las isoformas aisladas de tipo básicopredominaron. Por lo tanto, se puede asumirque el procedimiento desarrollado para laobtención del grupo de isoformas de la LHbovina no interfiere en el patrón particular dedistribución de isoformas que muestra la LH enesta especie.

El grupo de isoformas aisladas del lóbulo anteriorde la hipófisis tuvo el mismo peso molecularque el estándar de referencia en condicionesno reductoras, correspondiente al heterodímerode 36.5 kDa. La presencia de proteínaspredominantes con peso molecular de 20.8 kDay 23.0 kDa en el gel electroforético en condicionesreductoras, corresponde a las subunidades alfa ybeta de la LH, respectivamente, lo que coincidecon los valores reportados para la forma nativade esta hormona y sus subunidades(13,14,15).El análisis del patrón electroforético en condicionesno reductoras de la isoforma ácida, presentó unaserie de proteínas con alto peso molecular, que

después del tratamiento con el agente reductor,β-mercaptoetanol, desaparecieron, lo que hacepensar en agregados moleculares de la LH.

El análisis electroforético en condicionesreductoras de la fracción CM-3ab, isoforma C eisoforma D se caracterizó por la presencia deuna proteína de 17 kDa, ausente en la isoformaA y ligeramente presente en la isoforma B.Esta proteína durante el análisis porinmunotransferencia no se identificó, lo quesugiere que se trata de una proteína contaminanteque se concentró entre el pH 7.98 a 5.41 y quepuede corresponder a alguna de las isoformas dela FSH bovina(11), que eluyen en este rango depH. La otra posibilidad es que se trate de unaforma inmadura de alguna de la subunidades.Estudios electroforéticos en condicionesreductoras con LH ovina deglicosilada(48) hanidentificado una proteína con un peso molecularsimilar al descrito en este estudio. No sedescarta la posibilidad de un rompimientoproteolítico de alguna de las subunidades, comose ha descrito para proteínas fraccionadas deLH humana que presentan un peso molecularsimilar(49). Por lo tanto, aunque existe lapresencia de este tipo de proteína en aisladosde determinadas isoformas, su presencia nocorresponde a LH, aunque probablemente puedainterferir en la interacción de la hormona consu receptor, modificando la estimación de supotencia biológica.


Los resultados de este estudio indican que lasisoformas de la hormona luteinizante bovinatienen diferente potencia biológica. El hallazgode un cambio en la potencia biológica in vitroentre isoformas de la LH sugiere la posibilidadque durante el proceso de síntesis de lasisoformas en la especie bovina, ocurran cambiospara una mayor o menor proporción de algunasde ellas, y que éste pueda representar unmecanismo fino de regulación a nivel de laadenohipófisis sobre la función gonadal. Aunqueen este estudio la actividad biológica de lasisoformas de la LH bovina se determinó con un

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bioensayo heterólogo in vitro, que no es elverdadero reflejo de la respuesta fisiológica decada isoforma en un organismo entero, se pudoconstatar que la respuesta biológica a lasdistintas isoformas es diferencial; sin embargo,es necesario contar con células HEK-293transfectadas con el cDNA para el receptor dela LH bovina (homólogo) y confirmar la afinidady especificidad selectiva de cada isoforma.

LITERATURA CITADA

1. Zeleznik AJ. The physiology of follicle selection. Reprod BiolEndocrinol 2004;16(2):31-37.

2. Bao B, Garverick HA. Expression of steroidogenic enzymeand gonadotropin receptor genes in bovine follicles duringovarian fol l icular waves: a review. J Anim Sci1998;76(7):1903-1921.

3. Niswender GD, Juengel JL, Silva PJ, Rollyson MK, McIntushEW. Mechanisms controlling the function and life span ofthe corpus luteum. Physiol Rev 2000;80(1):1-29.

4. Baenziger JU, Green ED. Pituitary glycoprotein hormoneoligosaccharides: structure, synthesis and function of theasparagine-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin andthyrotropin. Biochim Biophys Acta 1988;947(2):287-306.

5. Baenziger JU, Kumar S, Brodbeck RM, Smith PL, BeranekMC. Circulatory half-life but not interaction with the lutropin/chorionic gonadotropin receptor is modulated by sulfationof bovine lutropin oligosaccharides. Proc Natl Acad Sci USA1992;89(1):334-338.

6. Arrieta E, Porras A, González-Padilla E, Murcia C, Rojas S,Perera-Marín G. Ovine serum and pituitary isoforms ofluteinising hormone during the luteal phase. Reprod FertilDev 2006;18(4):485-495.

7. Cooke DJ, Crowe MA, Roche JF. Circulating FSH isoformpatterns during recurrent increases in FSH throughout theoestrous cycle of heifers. J Reprod Fertil 1997;110(2):339-345.

8. Keel BA, Grotjan HE, Jr. Characterization of rat lutropincharge microheterogeneity using chromatofocusing. AnalBiochem 1984;142(2):267-270.

9. Perera-Marín G, Murcia C, Rojas S, Hernández-Cerón J,González-Padilla E. Pattern of circulating luteinizing hormoneisoforms during the estrous and luteal phases in Holsteinheifers. Anim Reprod Sci 2005;86(1-2):53-69.

10. Rojas-Maya S, González-Padilla E, Murcia-Mejía C, Olivares-Segura A, Hernández-Cerón J, Perera-Marín G. Caprineluteinizing hormone isoforms during the follicular phase andanestrus. Anim Reprod Sci 2007;100(3-4):280-290.

11. Perera-Marín G, Gutiérrez CG, Murcia C, León H, González-Padilla E. Progesterone and the distribution of pituitarygonadotropin isoforms in cattle. Anim Reprod Sci2008;104(2-4):164-176.

12. Sairam MR, Zaky AA, Hassan AA. Isolation andcharacterization of distinct bioactive forms of LH from male

buffalo pituitaries: differences localized to their alphasubunits. J Endocrinol 1994;143(2):313-323.

13. Perera MG, Falcón AA, Murcia MC, Hernández CJ, GonzálezPE. Purificación de cinco isoformas de la hormona luteinizantebovina (bLH). Caracterización fisicoquímica, biológica einmunológica. Vet Mex 2004;35(2):129-145.

14. Perera MG, Ortiz RF, Gamboa VJJ, Reynoso MW, Falcón AA,Salas VA. Obtención, purificación y caracterización de dosformas de hormona luteinizante de la adenohipófisis caprina(gLH). Vet Mex 1996;1(27):1-10.

15. Chaudhary R, Muralidhar K. Caprine (Capra hircus) luteinizinghormone: purification and chromatographic investigation ofi ts different isoforms. Prep Biochem Biotechnol2007;37(3):277-300.

16. Hejl KM, Wolfe MW, Kinder JE, Grotjan HE. Bioactive andimmunoreactive concentrations of circulating luteinizinghormone during sexual maturation in the bovine. Biol Reprod1992;46(6):1205-1210.

17. Nakamura Y, Nomura K, Watanabe M, Ujihara M, DemuraH. Comparison of biological aspects among ovine luteinizinghormone isoforms with charge heterogeneity. Endocr J1993;40(1):73-81.

18. McFarland KC, Sprengel R, Phillips HS, Köhler M, RosemblitN, Nikolics K, et al. Lutropin-choriogonadotropin receptor:an unusual member of the G protein-coupled receptor family.Science 1989;4;245(4917): 494-499.

19. Loosfelt H1, Misrahi M, Atger M, Salesse R, Vu Hai-Luu ThiMT, Jolivet A, et al. Cloning and sequencing of porcine LH-hCG receptor cDNA: variants lacking transmembrane domain.Science 1989;4;245(4917):525-528.

20. Olivares A, Mendez JP, Cardenas M, Oviedo N, PalominoMA, Santos I, et al. Pituitary-testicular axis function, biologicalto immunological ratio and charge isoform distribution ofpituitary LH in male rats with experimental diabetes. GenComp Endocrinol 2009;161(3):304-312.

21. Olivares A, Mendez JP, Zambrano E, Cardenas M, Tovar A,Perera-Marín G, et al. Reproductive axis function andgonadotropin microheterogeneity in a male rat model ofdiet-induced obesity. Gen Comp Endocrinol 2010;166(2):356-364.

22. Galet C, Ascoli M. The differential binding affinities of theluteinizing hormone (LH)/choriogonadotropin receptor forLH and choriogonadotropin are dictated by differentextracel lular domain residues. Mol Endocrinol2005;19(5):1263-1276.

23. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during theassembly of the head of bacteriophage T4. Nature1970;227(5259):680-685.

24. Bollag DM, Edelstein SJ. Protein Methods. 1st ed. NewYork, USA: Wiley-Liss Inc.; 1991.

25. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer ofproteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA1979;76(9):4350-4354.

26. Borromeo V, Amsterdam A, Berrini A, Gaggioli D, Dantes A,Secchi C. Characterization of biologically active bovinepituitary FSH purified by immunoaffinity chromatographyusing a monoclonal antibody. Gen Comp Endocrinol2004;139(2):179-189.

27. DeLean A, Munson PJ, Rodbard D. Simultaneous analysis offamilies of sigmoidal curves: application to bioassay,

51


radioligand assay, and physiological dose-response curves.Am J Physiol 1978;235(2):E97-E102.

28. Rosenfield RL, Helke J. Is an immunoassay available for themeasurement of bioactive LH in serum? J Androl1992;13(1):1-10.

29. Hunter WM, Greenwood FC. Preparation of iodine-131labelled human growth hormone of high specific activity.Nature 1962;5(194):495-496.

30. Minegishi Y, Dirks RP, de Wijze DL, Brittijn SA, BurgerhoutE, Spaink HP, et al. Quantitative bioassays for measuringbiologically functional gonadotropins based on eelgonadotropic receptors. Gen Comp Endocrinol2012;178(1):145-152.

31. Galet C, Min L, Narayanan R, Kishi M, Weigel NL, Ascoli M.Identification of a transferable two-amino-acid motif (GT)present in the C-terminal tail of the human lutropin receptorthat redirects internalized G protein-coupled receptors froma degradation to a recycling pathway. Mol Endocrinol2003;17(3):411-22.

32. Robertson DM, Diczfalusy E. Biological and immunologicalcharacterization of human luteinizing hormone: II. Acomparison of the immunological and biological activities ofpituitary extracts after electrofocusing using differentstandard preparations. Mol Cell Endocrinol 1977;9(1):57-67.

33. Hattori M, Sakamoto K, Wakabayashi K. The presence of LHcomponents having different ratios of bioactivity toimmunoreactivity in the rat pituitary glands. Endocrinol Jpn1983;30(3):289-296.

34. Hortin G, Natowicz M, Pierce J, Baenziger J, Parsons T,Boime I. Metabolic labeling of lutropin with [35S] sulfate.Proc Natl Acad Sci USA 1981;78:7468-7472.

35. Galway AB, Hsueh AJ, Keene JL, Fauser BC, Boime I. Invitro and in vivo bioactivity of recombinant human follicle-stimulating hormone and partially deglycosylated variantssecreted by transfected eukaryotic cell lines. Endocrinology1990;127:93-100.

36. Fiete DJ, Srivatava V, Hindsgaul O, Baenzinger JU. A hepaticreticuloendothelial cell receptor specific for SO4-4GalNAcbeta 1,4GlcNAc beta 1,2Man alpha that mediates rapidclearance of lutropin. Cell 1991;67:1103-1110.

37. Fiete DJ, Beranek MC, Baenzinger JU. A cysteine-rich domainof the "mannose" receptor mediates GalNAc-4-SO4 binding.Proc Natl Acad Sci USA 1998;3:2089-2093.

38. Perlman S, van den Hazel B, Christiansen J, Gram-NielsenS, Jeppesen B, Andersen CKM et al. Glycosylation of an N-terminal extension prolongs the half-life and increases the

in vivo activity of follicle stimulating hormone. J ClinEndocrinol Metab 2003;88,3227-3235.

39. Fares F. The role of O-linked and N-linked oligosaccharideson the structure-function of glycoprotein hormones:development of agonists and antagonists. Biochim BiophysActa 2006;1760 (4):560-567.

40. Ulloa-Aguirre A, Midgley AR, Jr., Beitins IZ, Padmanabhan V.Follicle-stimulating isohormones: characterization andphysiological relevance. Endocr Rev 1995;16(6):765-787.

41. Kojima FN, Cupp AS, Stumpf TT, Zalesky DD, Roberson MS,Werth LA, et al. Effects of 17 beta-estradiol on distributionof pituitary isoforms of luteinizing hormone and follicle-stimulating hormone during the follicular phase of the bovineestrous cycle. Biol Reprod 1995;52(2):297-304.

42. Zalesky DD, Grotjan HE. Comparison of intracellular andsecreted isoforms of bovine and ovine luteinizing hormone.Biol Reprod 1991;44(6):1016-1024.

43. Stumpf TT, Wolfe MW, Roberson MS, Caddy G, Kittok RJ,Schanbacher BD, et al. Bovine luteinizing hormone (LH)isoforms and amounts of messenger ribonucleic acid foralpha- and LH beta-subunits in pituitaries of cows immunizedagainst LH-releasing hormone. Biol Reprod 1992;47(5):776-781.

44. Carranza SME, Amezcua MEV, Neri BR, Salas VA. Extraccióny purificación de la hormona luteinizante bovina. Tec PecuMex 1994;32:5-17.

45. Stockell HA. Separation and partial purification of the proteinhormones from human pituitary glands. J Biol Chem1966;100:754-761.

46. Montero A, Olivares A, González-Padilla E, Murcia C, DiazD, Gómez-Chavarín M, Perera-Marín G. Effect of ovineluteinizing hormone (oLH) charge isoforms on VEGF andcAMP production. [enviado a publicación].

47. Kojima FN, Cupp AS, Stumpf TT, Zalesky DD, Roberson MS,Werth LA, et al.Effects of 17 beta-estradiol on distributionof pituitary isoforms of luteinizing hormone and follicle-stimulating hormone during the follicular phase of the bovineestrous cycle. Biol Reprod 1995;52:297-304.

48. Zalesky DD, Schanbacher BD, Grotjan HE. Effect ofimmunization against LHRH on isoforms of LH in the ovinepituitary. J Reprod Fertil 1993;99:231-235.

49. Manjunath P, Sairam MR, Schil ler PW. Chemicaldeglycosylation of ovine pituitary lutropin. A study of thereaction conditions and effects on biochemical, biophysicaland biological properties of the hormone. Biochem J1982;1;207(1):11-19.

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ESTUDIO MORFOMÉTRICO DE LOS EPIDÍDIMOS DURANTE EL DESARROLLO POSTNATAL DE CORDEROSRev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):53-68

Estudio morfométrico de los epidídimos duranteel desarrollo postnatal de corderos Barbados

Blackbelly

Morphometric study of the epididymes during thepostnatal development in Barbados Blackbelly ram lambs

Anahy Danae Vargas-Velázqueza, Héctor Jiménez-Severianob

RESUMEN

Para caracterizar el desarrollo de los epidídimos, se castraron corderos Blackbelly al nacimiento y cada tres semanashasta la 21 (n=4 a 6 por grupo). Se registró el peso de los epidídimos y de las tres regiones anatómicas y se tomaronmuestras para morfometría. Se calculó el porcentaje de tejido tubular, el diámetro tubular, el grosor y área de la capamuscular, la altura y área del epitelio, y el diámetro y área de la luz tubular. El mayor crecimiento del epidídimo seobservó entre las semanas 9 y 18; la cola comenzó a desarrollarse antes que las otras regiones; el peso de ésta fuemayor entre el nacimiento y la semana 12, pero de la semana 15 a la 21 no difirió de la cabeza. En general, eldiámetro tubular, el grosor y área de la capa muscular y el diámetro y área de la luz fueron mayores en la cola. Laaltura del epitelio fue mayor en la cola hasta la semana 9, pero la situación se invirtió a partir de la semana 12. Deacuerdo a lo que se conoce de esta raza, la cola comenzó a desarrollarse antes de aparecer la luz de los túbulosseminíferos y del aumento de las concentraciones de testosterona, mientras que el desarrollo de la cabeza y el cuerpocoincidió con el aumento de la capacidad esteroidogénica y la secreción del fluido tubular. Tales hallazgos sugierendiferentes requerimientos de estimulación endocrina y lumicrina para el desarrollo normal de las diferentes regionesdel epidídimo.

PALABRAS CLAVE: Epidídimo; Desarrollo sexual; Ovinos tropicales; Corderos Blackbelly.

ABSTRACT

To characterize the development of the epididymides, Barbados Blackbelly ram lambs were castrated at birth andevery three weeks until wk 21 (n=4 to 6 per group). The individual epididymal weight was recorded; the threeanatomical regions (caput, corpus and cauda) of the left epididymis were weighed, and samples taken for morphometricstudies. The percentage of tubular tissue was calculated, as well as the tubular diameter, the width and area of themuscular layer, the height and area of the epithelium, and the diameter and area of the tubular lumen. Data wereanalyzed to determine differences among the anatomical regions and ages. The greatest growth of the whole organwas observed between 9 and 18 wk; the cauda started developing earlier than the other anatomical regions; thecauda was heaviest between birth and wk 12, but from 15 to 21 wk the caput and cauda weights were similar toeach other. Overall, tubular diameter, width and area of the muscular layer, and luminal diameter and area weregreatest in the cauda epididymidis. The epithelium height was greatest in the cauda until wk 9, but the situationreversed from wk 12 onwards. According to previous information for this breed, cauda started developing before theincrease of circulating testosterone concentrations, and before the seminiferous tubule lumen appeared, whilst thecaput and corpus development coincided temporally with the increase of testicular steroidogenic capacity and tubularfluid secretion. Such findings suggest differential requirements of endocrine and lumicrine stimulation for the normaldevelopment of the various anatomical regions of the epididymis.

KEYWORDS: Epididymis; Sexual development; Tropical sheep; Blackbelly lambs.

Recibido el 19 de marzo de 2015. Aceptado el 23 de abril de 2015.a Licenciatura en Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma Metropolitana, Xochimilco, DF, México.b Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Fisiología y Mejoramiento Animal, INIFAP, Ajuchitlán, Querétaro, México. [email protected]

correspondencia al segundo autor.

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Anahy Danae Vargas-Velázquez, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):53-68

INTRODUCCIÓN

Barbados Blackbelly es una raza de ovinos depelo (Ovis aries) desarrollada en latitudestropicales y bien adaptada a esas condicionesclimáticas. Las hembras son precoces yprolíficas, con una larga estación reproductiva(1,2).Los estudios sobre el desarrollo sexual ycapacidad reproductiva de los machos Blackbellyson escasos, pese a que esta información esimportante para la evaluación, selección y usode sementales jóvenes. El desarrollo testiculares importante, ya que la capacidad reproductivay la fertilidad de los sementales dependenprincipalmente de una adecuada funcióntesticular; sin embargo, la producciónespermática debe completarse con lamaduración celular, la cual se realiza durante eltransporte de los espermatozoides por losepidídimos(3); cualquier falla del desarrollo delos epidídimos o en su función puede conducir aproblemas de fertilidad, como consecuencia detrastornos en la maduración, incluso con unaproducción espermática adecuada(4). Lamaduración espermática es adquirida progresivay simultáneamente, conforme los espermatozoidesrecorren la cabeza y el cuerpo del epidídimo(5),mientras que la cola sirve principalmente comolugar de almacenamiento de los espermatozoidesfuncionalmente maduros, ya que proporciona elambiente óptimo para mantener su viabilidaddurante varios días(4,5,6).

La importancia funcional de la regionalizaciónanatómica del epidídimo ha sido reconocida(7),ya que las diversas regiones anatómicas tienendiferentes patrones de expresión génica yproteica, acordes con las diferentes funciones enla maduración y almacenamiento de losespermatozoides(7). Es de esperarse que estasdiferencias funcionales en los adultos, tambiénestén presentes en las característicasmorfométricas de las regiones anatómicas enetapas inmaduras, lo que podría sugerir diferentesrequerimientos y mecanismos estimulatoriosdurante su desarrollo. Información previa sugiereque existen tales diferencias(8,9); sin embargo,en el primer estudio(8) la única variable evaluada

INTRODUCTION

Barbados Blackbelly is a hair breed of sheep(Ovis aries), developed in tropical latitudes andis well adapted to tropical conditions. Ewes areprecocious and highly prolific, having a longbreeding season(1,2). Studies of sexualdevelopment and reproductive capacity ofBlackbelly males are scarce, albeit theimportance of this information for the evaluation,selection and usage of young sires. Testisdevelopment is important, as the reproductivecapacity and fertility of sires depends primarilyon a satisfactory testicular function; however,adequate sperm production must be completedwith cell maturation, which is achieved duringsperm transit through the epididymis(3); anyfailure during the epididymal development orfunction might lead to fertility problems, asconsequence of maturation disorders, even withadequate sperm production(4). Spermmaturation is acquired progressively andsimultaneously as the sperm travel through thecaput and corpus epididymidis(5), whilst thecauda serves primarily as a storage site forfunctionally mature sperm, since it provides theoptimal environment to maintain sperm viabilityfor several days(4,5,6).

The functional importance of the anatomicalregionalization of the epididymis has beenfurther recognized(7), as the several anatomicalregions have different patterns of gene andprotein expression, in agreement with thedifferent functions relative to sperm maturationand storage. It is expected that the functionaldifferences among the anatomical regions inthe adult epididymis are also present in themorphometric characteristics during thedevelopment of the epididymal anatomicalregions, which could suggest differentialrequirements and stimulatory mechanismsduring their development. Previous informationsuggests that such differences exist(8,9);however, in the first study the only variablestudied was the epididymal epithelium, whilstin the last study, the authors used lambs at anage when important developmental changes

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ESTUDIO MORFOMÉTRICO DE LOS EPIDÍDIMOS DURANTE EL DESARROLLO POSTNATAL DE CORDEROS

fue el epitelio del epidídimo, mientras que enel segundo(9), los corderos utilizados eran deuna edad tal, que muchos de los cambiosimportantes en el desarrollo gonadal seguramenteya habían ocurrido. Una descripción anatómicadetallada sería útil para responder preguntasimportantes, no resueltas en los estudiosanteriores; por lo tanto, el presente es unestudio exploratorio, donde se utilizaron técnicasde morfometría cuantitativa para caracterizar eldesarrollo de las regiones anatómicas delepidídimo, entre el nacimiento y las 21 semanasde edad, en corderos Barbados Blackbelly.

MATERIAL Y METODOS

Animales y diseño experimental

Todos los procedimientos experimentales serealizaron de acuerdo con “International GuidingPrinciples for Biomedical Research InvolvingAnimals” (disponible en: http://www.cioms.ch/images/stories/CIOMS/IGP2012.pdf). El estudiose realizó en el estado de Querétaro, México(20° 43’ N, 100° 15’ O). Se utilizaron 43corderos de la raza Barbados Blackbelly nacidosen verano (julio a septiembre). Los corderos sealojaron en corrales al aire libre; antes deldestete, a los corderos se les ofreció una dietaque contenía 14 % de proteína cruda (78 % desorgo, 20 % de harina de canola y 2 % deminerales); después del destete a los 75 díasde edad, se alimentaron con heno de alfalfa yel concentrado ya descrito, el agua siempreestuvo ad libitum. Los corderos se asignaron aocho grupos experimentales; los corderos decada grupo se castraron quirúrgicamente bajoanestesia local, al nacer (antes de 3 días deedad), o bien cuando tenían 3, 6, 9, 12, 15, 18o 21 semanas de edad (n= 4 a 6 por grupo);dentro de cada grupo la diferencia de edadnunca fue mayor a 3 días. Todas las castracionesse realizaron durante septiembre a diciembre.

Recolección y procesamiento de los tejidos

A ambos epidídimos se les retiró todo el tejidoadyacente y se pesaron por separado. Elepidídimo izquierdo se dividió en sus tres

must have already occurred. A detailedanatomical description would be useful toanswer important questions do not solved inthe previous studies; therefore, the present isan exploratory study, where quantitativemorphometric techniques were used tocharacterize the development of the severalanatomical regions of the epididymides, betweenbirth and 21 wk of age, in Barbados Blackbellyram lambs.


Animals and experimental design

All the experimental procedures were performedaccording to the “International Guiding Principlesfor Biomedical Research Involving Animals”(available at: http://www.cioms.ch/images/stories/CIOMS/IGP2012.pdf). The study wasconducted in the state of Queretaro, Mexico(20º 43’ N, 100º 15’ W). Forty-three summer-born (July to September) Barbados Blackbellyram lambs were used. Lambs were alwayshoused in outdoor pens; before weaning, lambswere creep fed with a diet containing 14 %crude protein (78 % sorghum, 20 % canolameal and 2 % minerals); after weaning at 75 dof age, lambs were offered alfalfa hay and aconcentrate as described above, water wasalways available ad libitum. Lambs were allottedinto eight experimental groups, each group weresurgically castrated under local anesthesia either,at birth (before 3 d of age), or when they were3, 6, 9, 12, 15, 18 or 21 wk of age (n= 4 to6 per group), within each group the differencein age was never greater than 3 d. All castrationswere performed during September to December.

Tissue collection and processing

Both epididymides were tr immed offextraneous tissue and weighed separately. Theleft epididymis was divided in its threeanatomical regions, caput, corpus andcauda(5). Each region was weighed and thepercentage accounted for each region to thewhole organ weight was calculated, thesepercentages were then used to estimate the

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regiones anatómicas, cabeza, cuerpo y cola(5).Cada región se pesó y se calculó el porcentajeque representaba cada una respecto al pesototal del órgano; estos porcentajes se utilizaronpara estimar el peso conjunto de ambos ladospara cada región. Se obtuvieron muestras delepidídimo izquierdo, de las zonas 2 (cabeza), 5(cuerpo) y 8/9 (cola), de acuerdo con Gatti etal(5), y fueron fijadas y procesadas parahistología(10). Se tomaron tres a cuatro cortes(5 µm) de cada muestra, se montaron enportaobjetos recubiertos con gelatina y sedejaron secar durante toda la noche a 37 °C;los cortes se tiñeron con hematoxilina-eosina yse almacenaron a temperatura ambiente hastaque se llevó a cabo el análisis.

Evaluación morfométrica de los cortes deepidídimo

De cada cordero se eligieron al azar uno o doscortes de cada región del epidídimo para serobservados bajo un microscopio de campo claro(Axiostar Plus, Carl Zeiss, México DF); seobtuvieron imágenes digitales a 100x o 200x(dependiendo de la edad del cordero y lavariable evaluada) con una cámara digital (ColorView II, Soft Imaging System, Lakewood CO)acoplada al microscopio. Las imágenes fueronadquiridas y procesadas utilizando un softwarede análisis de imágenes (AnalySIS Opti Basic,Soft Imaging System). El porcentaje deparénquima epididimal compuesto por tejidotubular en cada región se determinó en lasimágenes tomadas a 100x. Cada corte se dividióen cuadrantes, un campo de cada cuadrante seeligió al azar y se le colocó un cuadrado dedimensiones conocidas (945.5 x 945.5 µm); acontinuación, todos los tubos dentro delcuadrado se delimitaron y el software calculó elárea tubular total en el interior del cuadrado, lacual se utilizó para obtener el porcentaje detejido tubular. Para obtener las variables delcomponente tubular del tejido epididimal, setrazó el contorno de 10 cortes tubularesredondos en cada región epididimal de cadacordero, incluyendo y sin incluir la capamuscular; además, se trazó el contorno de la

paired weight of each region. Samples wereobtained from the left epididymis, from thezones 2 (caput), 5 (corpus) and 8/9 (cauda)(5),and were fixed and processed for histology(10).Three to four sections (5 µm) were made fromeach sample, mounted onto gelatin-coated glassslides and dried overnight at 37 °C. Sectionswere stained with hematoxylin-eosin and storedat room temperature until quantitativemorphometric analysis was conducted.

Morphometric evaluation of epididymalsections

One or two sections from each epididymal regionand ram were randomly chosen and observedunder a bright field microscope (Axiostar Plus,Carl Zeiss, Mexico DF); digital images wereobtained at 100x or 200x magnifications(depending on the age of the lamb and thevariable to be recorded) with a digital camera(Color View II, Soft Imaging System, LakewoodCO) attached to the microscope. Imageacquiring and processing were performed usingimage analysis software (AnalySIS Opti Basic,Soft Imaging System). The percentage of theepididymal parenchyma composed of tubulartissue in each region was determined in imagestaken at a magnification of 100x. Each sectionwas divided in quadrants, a field from eachquadrant was randomly chosen and a square(945.5 x 945.5 µm) was applied; then, all tubesections inside the square were delimited andthe software calculated the total tubular areainside the square, which was used to calculatethe corresponding percentages. Tubular variablesof the epididymal tissue were obtained bytracing outlines of 10 rounded tube sections inevery region for each ram lamb, including andnot including the muscular layer, also by tracingthe tubular lumen. The analysis softwarecalculated several variables, such as tubulararea, perimeter and diameter. Such data wereused to calculate the tubular diameter, thethickness and area of the muscular layer, theheight and area of the epithelium, and thediameter and area of the tubular lumen in everyepididymal region in each lamb.

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luz tubular. El software de análisis calculódiferentes variables, tales como el diámetro,área y perímetro tubular. Además, estos datosse utilizaron para calcular el grosor y el área dela capa muscular, la altura y el área del epitelio,y el diámetro y el área de la luz tubular entodas las regiones del epidídimo en cadacordero.

Análisis estadístico

Los 10 valores de cada región del epidídimo decada cordero se promediaron, de esta manera,para cada cordero se obtuvo un valor únicopara cada región del epidídimo para el análisisestadístico. Los datos se analizaron como undiseño completamente al azar con arreglofactorial, utilizando el procedimiento GLM deSAS (SAS Institute Inc., Cary NC, USA). La edadde los animales, la región anatómica y lainteracción edad por región se incluyeron en elmodelo; la opción PDIFF de SAS se utilizó paracomparar las medias de mínimos cuadradosentre los grupos de edad y entre las regiones.Para cumplir con los supuestos del análisis devarianza, los datos porcentuales, expresadoscomo proporciones (p), se transformaron alarco-seno de la raíz cuadrada de p; todas lasdemás variables se transformaron a logn.Después del análisis, los datos seretransformaron a los valores reales para loscuadros y figuras.

RESULTADOS

Peso de los epidídimos

La siguiente descripción considera el peso deambos epidídimos. Las diferencias entre edadespara el peso de los epidídimos siempre fueronsignificativas (P<0.05), excepto 0 vs 3, y 18 vs21 semanas. Al nacimiento, el peso de losepidídimos fue de 0.93 ± 0.07 g (Figura 1),durante las primeras 9 semanas aumentó 5.4veces (5 ± 0.49 g); La mayor tasa decrecimiento se observó entre las semanas 9 y18 (4.7 veces), hasta llegar a 25.6 ± 2.5 g enla semana 21. La interacción región x edad fuesignificativa (P<0.001); el peso de cada región

Statistical Analyses

The 10 values for each epididymal region withina lamb were averaged; in this way a singlevalue for a particular epididymal region andlamb was obtained for the statistical analysis.Data were analyzed as a completely randomizeddesign with a factorial arrangement, using theGLM procedure of SAS (SAS Institute Inc., CaryNC, USA). The age of the animals, the anatomicalregion and the interaction age by region wereincluded in the model; the PDIFF option of SASwas used to compare least square means amongage groups and among regions. In order to meetthe assumptions of the analysis of variance,percentage data, expressed as proportions (p),were transformed to arc-sine squared root of p;all the other variables were logn transformed.After analysis, data were transformed back toactual values for tables and figures.

RESULTS

Epididymal weight

Differences between ages for paired epididymisweight were always significant (P<0.05), exceptfor 0 vs 3, and 18 vs 21 wk. At birth, theweight of paired epididymides was 0.93 ± 0.07 g(Figure 1), during the first 9 wk increased 5.4fold (5 ± 0.49 g); the greatest growth rate wasobserved between 9 and 18 wk (4.7 fold), untilreaching 25.6 ± 2.5 g on wk 21. The interactionage x region was significant (P<0.001); pairedweight of each epididymal region followed asimilar trend, yet with some differences amongregions. Corpus epididymidis was always lighterthan cauda (P<0.01), and lighter than caputfrom wk 6 onwards (P<0.01), from 0.14 ±0.01 g at birth to 4.6 ± 0.31 g at wk 21. Atbirth, the weight of caput (0.34 ± 0.03 g) andcauda (0.44 ± 0.03 g) were not different toeach other, as well as by 3 wk. Between 6 and12 wk, the cauda weight increased faster andwas greater than caput (P<0.01). After wk 12,the caput weight started increasing, in such away that by 15 to 21 wk no differences weredetected between the two regions (caput 10.7± 1.03 g; cauda 10.3 ± 0.89 g at wk 21).

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del epidídimo siguió una tendencia similar(Figura 1), pero con algunas diferencias entreregiones. El cuerpo del epidídimo siempre fuemás ligero que la cola (P<0.01), y más ligeroque la cabeza de la semana 6 en adelante(P<0.01), de 0.14 ± 0.01 g al nacer a 4.6 ±0.31 g en la semana 21. Al nacimiento, el pesode la cabeza (0.34 ± 0.03 g) y de la cola (0.44± 0.03 g) no fueron diferentes entre sí, al igualque en la semana 3. Entre las semana 6 y 12,el peso de la cola aumentó más rápido y fuemayor que la cabeza (P<0.01). Después de lasemana 12, el peso de la cabeza aumentó, detal manera que en las semana 15 a 21 no sedetectaron diferencias entre las dos regiones(cabeza 10.7 ± 1.03 g; cola 10.3 ± 0.89 g enla semana 21).

El diferente desarrollo de las regiones delepidídimo también fue evidente en el porcentajeque cada región aportó al peso total del órgano(interacción edad x región, P<0.001; Figura 2).La proporción aportada por la cabeza disminuyóentre el nacimiento (36.7 %) y la semana 9

The differential development of the epididymalregions was also evident on the percentagethat each region accounted to the total organweight (interaction age x region, P<0.001;Figure 2). The proportion accounted by thecaput decreased between birth (36.7 %) andwk 9 (28 %; P<0.001), then increased until wk15 (P<0.05), with no further changes thereafteruntil wk 21 (41.7 %). The cauda followed anopposite trend, increasing from birth (47.8 %)to wk 6 (58.5 %; P<0.001), decreasing fromwk 9 to 15 (P<0.001), with no further changesthereafter until wk 21 (40.3 %). Cauda wasgreater than the other regions from birth to wk12 (P<0.001), and not different from caput atwk 15, 18 and 21; corpus accounted alwaysthe smallest percentage (P<0.001).

Characteristics of the epididymal tissue

Tubular tissue percentage and tubular diameter.The interaction age by region was significant(P<0.05) for the percentage of tubular tissue;this variable had an increasing trend in thethree epididymal regions until wk 15 (Table 1);

Figura 1. Desarrollo del peso total y de cada región anatómica de ambos epidídimos, del nacimiento

a 21 semanas de edad de corderos Barbados Blackbelly

Figure 1. Development of paired epididymal weight and paired weight of each anatomical region,

from birth to 21 wk of age in Barbados Blackbelly ram lambs

Each time point represent the mean ± SE for 4 to 6 rams. *Corpus weight was smaller than caput from 6

wk onwards (P<0.01), and smaller than cauda at every age evaluated (P<0.01). **Cauda weight was larger

than caput at 6, 9 and 12 wk of age (P<0.01). The arrow indicates the age when sperm first appeared in

the tubular lumen of the three epididymal regions.

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(28 %, P<0.001), después aumentó hasta lasemana 15 (P<0.05), sin más cambios a partirde entonces hasta la semana 21 (41.7 %). Lacola siguió una tendencia opuesta, aumentóentre el nacimiento (47.8 %) y la semana 6(58.5 %; P<0.001), con una disminución entrelas semanas 9 y 15 (P<0.001), sin más cambiosa partir de entonces hasta la semana 21 (40.3 %).La cola fue mayor que las otras regiones desdeel nacimiento hasta la semana 12 (P<0.001), yno fue diferente de la cabeza en las semanas15, 18 y 21; el cuerpo siempre aportó el menorporcentaje (P<0.001).

Características del tejido epididimal

Porcentaje de tejido tubular y diámetro tubular.La interacción edad por región fue significativa(P<0.05) para el porcentaje de tejido tubular;esta variable tuvo una tendencia creciente enlas tres regiones del epidídimo hasta la semana15 (Cuadro 1); después, no cambió (cabeza ycuerpo) o disminuyó (cola) hacia la semana 21.En general, el porcentaje de tejido tubular fue

then, it did not change (caput and corpus) ordecreased (cauda) by wk 21. Overall, thepercentage of tubular tissue was greatest inthe cauda and lowest in the caput (P<0.05),except for wk 3, 18 and 21, when no differencesamong regions were detected; corpus wasintermediate, but not always different from theother regions. The increasing rate (percentageof each age, related to wk 21) was differentamong regions (Figure 3a); by wk 6, corpusand cauda had reached, respectively, 93 and88 % of the final value, whilst caput had reachedonly 68 %, such trend was maintained until wk15. For tubular diameter, the interaction age byregion was not significant (P=0.13; Table 1).This variable increased (P<0.05) until wk 15(caput and corpus) or 12 (cauda), with nochanges thereafter. The greatest diameter wasalways observed in the cauda, and the smallestin the caput (P<005); corpus was not differentfrom caput, except for wk 3 and 6, when allregions were different to each other. Regardingthe increasing rate (Figure 3b), by wk 6, caput,

Figura 2. Desarrollo del porcentaje aportado por cada región anatómica del epidídimo al peso

total del órgano, del nacimiento a 21 semanas de edad de corderos Barbados

Blackbelly

Figure 2. Development of the percentage accounted by each epididymal region to the total

epididymal weight, from birth to 21 wk of age in Barbados Blackbelly ram lambs

Each time point represents the mean ± SE for 4 to 6 rams. *Cauda was greater than caput from 0

to 12 wk of age (P<0.001); corpus always accounted for the smaller percentage to the total epididymal

weight (P<0.001). The arrow indicates the age when sperm first appeared in the tubular lumen of the

three epididymal regions.

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mayor en la cola y menor en la cabeza (P<0.05),a excepción de las semanas 3, 18 y 21, cuandono se detectaron diferencias entre las regiones;el cuerpo fue intermedio, pero no siempre fuediferente de las otras regiones. La tasa deincremento (porcentaje de cada edad, con

corpus and cauda had reached 38, 47 and 55 %of their final values, respectively; similardifferences were maintained until wk 12, atthat age cauda had reached 92 %, whilst similarpercentages (90 %) were not reached in caputand corpus until 18 wk of age.

Cuadro 1. Medias (± EE) del porcentaje de tejido tubular y del diámetro tubular promedio en las diferentes regiones

anatómicas del epidídimo de corderos Barbados Blackbelly, del nacimiento a 21 semanas de edad

Table 1. Mean (± SE) of the percentage of tubular tissue and the average tubular diameter in the several epididymal

anatomical regions in Barbados Blackbelly ram lambs, from birth to 21 wk of age

Age Tubular tissue (%) Tubular diameter (µm)

(wk) Caput Corpus Cauda Caput Corpus Cauda

0 a38.6 ± 3.4y a34.6 ± 3.4y a50.2 ± 3.4z a90 ± 15y a101 ± 15y a149 ± 15z

3 ab42.5 ± 3.49z b51.7 ± 3.4z a50 ± 3.4z ab92 ± 15x b120 ± 15y a162 ± 15z

6 abc52.3 ± 3.82y c64.7 ± 3.82z b68.4 ± 3.82z b107 ± 16x bc136 ± 16y b227 ± 16z

9 bc52.7 ± 4.27y c64.8 ± 4.27yz b66.1 ± 4.27z c134 ± 18y c157 ± 18y c299 ± 18z

12 cd56.9 ± 3.49y c64.4 ± 3.49y b76.9 ± 3.49z d192 ± 15y d223 ± 15y d380 ± 15z

15 e74.6 ± 3.49y d77.8 ± 3.49y c86.8 ± 3.49z e248 ± 15y de249 ± 15y d396 ± 15z

18 de66.8 ± 3.49z bc60.2 ± 3.49z b70.1 ± 3.49z e248 ± 15y e275 ± 15y d421 ± 15z

21 e76.6 ± 4.27z cd69.7 ± 4.27z b77.6 ± 4.27z e283 ± 18y e291 ± 18y d405 ± 18z

a-e Means within a column without a common superscript are different (P<0.05).

x,y,z Means within a row and variable without a common superscript are different (P<0.05).

Figura 3. Tasa de incremento relativo del porcentaje de tejido tubular (panel a), diámetro tubular (panel b),

altura del epitelio (panel c) y área del epitelio (panel d) en corderos Barbados Blackbelly

Figure 3. Relative increase of the epididymal tubular tissue percentage (panel a), tubular diameter (panel

b), epithelium height (panel c) and epithelium area (panel d) in Barbados Blackbelly ram lambs

Data are the percentage of the values at each age as compared with the value at 21 wk of age for each variable

(panels a, b, d). * For epithelium height (panel c), the percentage value at each age is relative to the maximum

value reached in each region (21 wk for caput and corpus, and 9 wk for cauda).

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relación a la semana 21) fue diferente entre lasregiones (Figura 3a); en la semana 6, el cuerpoy la cola habían alcanzado, respectivamente, el93 y el 88 % del valor final, mientras que lacabeza alcanzó sólo el 68 %, tal tendencia semantuvo hasta la semana 15. Para el diámetrotubular, la interacción edad por región no fuesignificativa (P=0.13; Cuadro 1). Esta variableaumentó (P<0.05) hasta la semana 15 (cabezay cuerpo) o 12 (cola), sin cambios a partir deentonces. El mayor diámetro siempre se observóen la cola, y el menor en la cabeza (P<0.05);el cuerpo no fue diferente de la cabeza, aexcepción de las semanas 3 y 6, cuando todaslas regiones fueron diferentes entre sí. En cuantoa la tasa de incremento (Figura 3b), en lasemana 6, la cabeza, el cuerpo y la cola habíanalcanzado, respectivamente, 38, 47 y 55 % desus valores finales; diferencias similares semantuvieron hasta la semana 12; a esa edadla cola había alcanzado el 92 %, mientras queporcentajes similares (90 %) no se alcanzaronen la cabeza y el cuerpo hasta las 18 semanasde edad.

Capa muscular del epidídimo. La interacciónedad por región fue significativa (P<0.01) paraambas variables de la capa muscular. El grosor

Epididymal muscular layer. The interaction ageby region was significant (P<0.01) for bothvariables of the muscular layer. The thicknessof the muscular layer in caput did not changebetween birth and wk 6 (Table 2), increased35 % by wk 9 (P<0.05) and then, did notchange or had a descendent trend until wk 21.In the cauda, the muscular thickness did notchange between birth and wk 6, increased119 % by wk 9 (P<0.05), with no change bywk 15 and a descendent trend thereafter(P<0.05). In the corpus epididymidis there wereno changes between 3 and 21 wk. Whencomparing the muscular layer thickness in wk 0vs wk 21, no differences were observed in thecaput and corpus, but in the cauda, it was 48 %greater on wk 21 (P<0.05). The muscular layerarea (Table 2) increased until wk 12 (caput andcorpus) and 9 (cauda), with no significantchanges thereafter. The maximum area observedin each region, as compared to value at birth,was 3.8-, 3.8-, and 5.5-fold, for caput (wk 18),corpus (wk 18) and cauda (wk 15), respectively.Comparisons among regions were similar for bothvariables, the greatest values were observed inthe cauda (P<0.05), followed by the corpus andcaput; however, differences between the last twowere significant (P<0.05) only at 3 and 6 wk.

Cuadro 2. Medias (± EE) del grosor y área de la capa muscular del tubo en las diferentes regiones anatómicas del

epidídimo de corderos Barbados Blackbelly, del nacimiento a 21 semanas de edad

Table 2. Mean (± SE) of the thickness and area of the tubular muscular layer in the several epididymal anatomical

regions in Barbados Blackbelly ram lambs, from birth to 21 wk of age

Age Thickness of muscular layer (µm) Area of muscular layer (µm2)


0 a17.3 ± 2.4y a19.2 ± 2.4y a27.4 ± 2.4z a4,847 ± 3,392y a5,870 ± 3,392y a12,096 ± 3,392z

3 a17.3 ± 2.2x ab22.9 ± 2.4y a29.1 ± 2.4z a4,798 ± 3,392x b8,028 ± 3,392y a14,210 ± 3,392z

6 ab17.3 ± 2.6x ab22.8 ± 2.7y ab34.7 ± 2.6z a4,798 ± 3,716x b8,003 ± 3,716y b21,775 ± 3,716z

9 c23.4 ± 2.9y ab21.6 ± 3.0y d59.2 ± 2.9z b9,261 ± 4,155y b10,676 ± 4,155y c50,836 ± 4,155z

12 bc21.4 ± 2.4y b23.5 ± 2.4y cd51.8 ± 2.4z c13,276 ± 3,392y c16,698 ± 3,392y c66,328 ± 3,392z

15 c22.1 ± 2.4y ab23.1 ± 2.4y cd50.7 ± 2.4z c16,998 ±3,392y c18,365 ± 3,392y c64,453 ± 3,392z

18 abc21.2 ± 2.4y b24.5 ± 2.4y b37.9 ± 2.4z c17,510 ± 3,392y c21,037 ± 3,392y c51,495 ± 3,392z

21 a16.9 ± 2.9y ab20.9 ± 3.0y bc41 ± 2.9z c16,085 ± 4,155y c20,638 ± 4,155y c56,418 ± 4,155z

a-e Means within a column without a common superscript are different (P<0.05).x,y,z Means within a row and variable without

a common superscript are different (P<0.05).

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Epididymal epithelium. The interaction age byregion was significant (P<0.001) for bothvariables of the epithelial layer. In the caputand corpus, the epithelium height did not changebetween birth and wk 6, then increased untilwk 12 (caput) or 15 (corpus), with no furtherchanges (Table 3); in the cauda, an increasingtrend was observed from birth to wk 9, then,decreased on wk 12, with no more changesuntil wk 21. Comparison between regions hadtwo different phases, from birth to wk 9, theepithelium was highest in the cauda and lowestin the caput (P<0.05), but from 12 to 21 wkthe situation reversed, as the lowest valueswere observed in the cauda (P<0.05) and thegreatest in the caput and corpus with nodifferences between the last two. Regardingthe increasing rate (Figure 3c), at birth, caudahad over 45 % of their maximum value, whichwas reached at wk 9; caput and corpus, atbirth had reached, respectively, 20 and 25 %of the value at wk 21, and did not reach over90 % until wk 15. The epithelial area (Table 3)did not change between birth and wk 6 (caputand corpus) or 3 (cauda), then, it increaseduntil wk 15 in the three regions (P<0.05), withno further changes (Table 3). Between birthand wk 12, the greatest values were observedin the cauda, with the smallest values in thecaput (P<0.05); from wk 15 onwards nodifferences among regions were detected. Theincreasing rate was always greater for cauda(Figure 3d), by wk 6 it had reached 31 %, ascompared with 5 and 8 % for caput and corpus,respectively; such differences were maintaineduntil wk 18.

Epididymal tubular lumen. The interaction ageby region was not significant (P≥0.25) for bothvariables of the tubular lumen, but the effectof region was (P<0.001). The lumen diameterand area did not increase or increased verylittle in all three regions until wk 6; then,increased steadily until wk 15 (caput and corpus)or 12 (cauda), with no further changesthereafter (Table 4). The greatest relativeaugment was observed between 9 and 12 wk(0.5- to 1.2-fold in the lumen diameter, and

de la capa muscular en la cabeza no cambióentre el nacimiento y la semana 6 (Cuadro 2),aumentó 35 % en la semana 9 (P<0.05),posteriormente no cambió o tuvo una tendenciadescendente hasta la semana 21. En la cola, elgrosor de la capa muscular no cambió entre elnacimiento y la semana 6, aumentó 119 % enla semana 9 (P<0.05), sin cambios hacia lasemana 15 y una tendencia descendente a partirde entonces (P<0.05). En el cuerpo delepidídimo no hubo cambios entre la semana 3y 21. Al comparar el grosor de la capa muscularen la semana 0 vs 21, no se observarondiferencias en la cabeza y cuerpo, pero en lacola fue 48 % mayor en la semana 21 (P<0.05).El área de la capa muscular (Cuadro 2) aumentóhasta la semana 12 (cabeza y cuerpo) y 9(cola), sin cambios significativos a partir deentonces; El área máxima observada en cadaregión, en comparación con el valor alnacimiento, fue 3.8, 3.8 y 5.5 veces, para cabeza(semana 18), cuerpo (semana 18) y cola(semana 15), respectivamente. Lascomparaciones entre regiones fueron similaresen ambas variables, los mayores valores seobservaron en la cola (P<0.05), seguido por elcuerpo y la cabeza; sin embargo, las diferenciasentre los dos últimos fueron significativas(P<0.05) solamente en las semanas 3 y 6.

Epitelio del epidídimo. La interacción edad porregión fue significativa (P<0.001) para ambasvariables de la capa epitelial. En la cabeza ycuerpo, la altura del epitelio no cambió entre elnacimiento y la semana 6, luego aumentó hastala semana 12 (cabeza) o 15 (cuerpo), sin máscambios (Cuadro 3); en la cola, se observó unatendencia creciente desde el nacimiento hastala semana 9, seguido de una disminución en lasemana 12, sin más cambios hasta la semana21. La comparación entre regiones tuvo dosfases diferentes, del nacimiento a la semana 9,el epitelio fue más alto en la cola y más bajoen la cabeza (P<0.05), pero de la semana 12a la 21 la situación se invirtió, ya que los valoresmás bajos se observaron en la cola (P<0.05) ylos mayores en la cabeza y cuerpo, sindiferencias entre estos dos. En cuanto a la tasa

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de incremento (Figura 3c), al nacer la cola teníamás del 45 % de su valor máximo, que sealcanzó en la semana 9; la cabeza y el cuerpoal nacer habían alcanzado, respectivamente, el20 y 25 % del valor de la semana 21, y norebasaron el 90 % hasta la semana 15. El áreaepitelial (Cuadro 3) no cambió entre elnacimiento y la semana 6 (cabeza y cuerpo) o

1.3- to 5.2-fold in the lumen area), with thegreatest increase in the cauda; both variableswere greatest in the cauda at all ages (P<0.05),with no differences between caput and corpus.The maximum lumen diameter observed in eachregion (caput, corpus and cauda, respectively)corresponded to 3.7-, 3.5- and 5.2-fold increase,as compared to wk 0. Similarly, the increase in

Cuadro 3. Medias (± EE) de la altura y el área del epitelio tubular en las diferentes regiones anatómicas del epidídimo

de corderos Barbados Blackbelly, del nacimiento a 21 semanas de edad

Table 3. Mean (± SE) of the tubular epithelium height and area in the several epididymal anatomical regions in

Barbados Blackbelly ram lambs, from birth to 21 wk of age

Age Epithelium height (µm) Epithelium area (µm2)


0 a9.8 ± 2.4x a14.2 ± 2.4y a19.9 ± 2.4z a1,616 ± 2,218x a2,330 ± 2,218y a5,182 ± 2,218z

3 a10.3 ± 2.4x a14.9 ± 2.4y ab24.6 ± 2.4z a1,719 ± 2,218x a3,180 ± 2,218y a7,337 ± 2,218z

6 a10.4 ± 2.6x a15.2 ± 2.6y cd32.1 ± 2.6z a1,720 ± 2,430x a3,221 ± 2,430y b11,986 ± 2,430z

9 b16.2 ± 2.9y b32.1 ± 2.9z d43.1 ± 2.9z b3,800 ± 2,717x b9,987 ± 2,717y c21,483 ± 2,717z

12 c37 ± 2.3yz bc42.4 ± 2.3z c31 ± 2.3y c16,910 ± 2,218y c22,105 ± 2,218yz cd29,720 ± 2,218z

15 c44.8 ± 2.3z c50.4 ± 2.3z c31.2 ± 2.3y d26,545 ± 2,218z d32,374 ± 2,218z d33,531 ± 2,218z

18 c42.6 ± 2.3z c47.1 ± 2.3z bc28 ± 2.3y d26,288 ± 2,218z d31,905 ± 2,218z d33,766 ± 2,218z

21 c47.5 ± 2.8z c54.6 ± 2.8z c31.8 ± 2.8y d36,119 ± 2,717z d40,755 ± 2,717z d37,240 ± 2,717z

a-d Means within a column without a common superscript are different (P<0.05).

x,y,z Means within a row and variable without a common superscript are different (P<0.05).

Cuadro 4. Medias (± EE) del diámetro y área de la luz tubular en las diferentes regiones anatómicas del epidídimo

de corderos Barbados Blackbelly, del nacimiento a 21 semanas de edad

Table 4. Mean (± SE) of the tubular lumen diameter and area in the several epididymal anatomical regions in Barbados

Blackbelly ram lambs, from birth to 21 wk of age

Age Lumen diameter (µm) Lumen area (µm2)


0 a36 ± 14.5y a35 ± 14.5y a58 ± 14.5z a1,524 ± 6,372y a1,385 ± 6,372y a4,152 ± 6,372z

3 ab37 ± 14.5y ab44 ± 14.5yz a54 ± 14.5z ab1,455 ± 6,372y b2,346 ± 6,372yz a3,309 ± 6,372z

6 ab36 ± 15.9y b53 ± 15.9yz ab73 ± 15.9z ab1,755 ± 6,980y b2,994 ± 6,980yz ab5,629 ± 6,980z

9 bc50 ± 17.7y b50 ± 17.7y b94 ± 17.7z b2,544 ± 7,804y b2,411 ± 7,804y b8,929 ± 7,804z

12 c75 ± 14.5y c91 ± 14.5y c216 ± 14.5z c6,432 ± 6,372y c8,489 ± 6,372y c57,784 ± 6,372z

15 d114 ± 14.5y cd102 ± 14.5y c232 ± 14.5z d13,803 ±6,372y cd12,507 ± 6,372y c64,620 ± 6,372z

18 d121 ± 14.5y cd132 ± 14.5y c289 ± 14.5z d16,138 ± 6,372y cd19,469 ± 6,372y c89,408 ± 6,372z

21 d154 ± 17.7y d140 ± 17.7y c260 ± 17.7z d26,890 ± 7,804y d20,791 ± 7,804y c82,177 ± 7,804z

a-d Means within a column without a common superscript are different (P<0.05).

y,z Means within a row and variable without a common superscript are different (P<0.05).

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3 (cola), seguido de un incremento hasta lasemana 15 en las tres regiones (P<0.05), sinmás cambios posteriores (Cuadro 3). Entre elnacimiento y la semana 12, los mayores valoresse observaron en la cola, con los menoresvalores en la cabeza (P<0.05); desde la semana15 en adelante no se detectaron diferenciasentre las regiones. La tasa de incremento fuesiempre mayor en la cola (Figura 3d), hacia lasemana 6 ya había alcanzado el 31 %, encomparación con el 5 y 8 % de la cabeza y elcuerpo, respectivamente; estas diferencias semantuvieron hasta la semana 18.

Luz tubular del epidídimo. La interacción edadpor región no fue significativa (P≥0.25) paraambas variables de la luz tubular, pero sí elefecto de la región (P<0.001). El diámetro y elárea de la luz no aumentaron o aumentaronmuy poco en las tres regiones hasta la semana6; a partir de entonces, aumentaronconstantemente hasta la semana 15 (cabeza ycuerpo) o 12 (cola), sin más cambios (Cuadro4). El mayor aumento relativo se observó entrelas semanas 9 y 12 (0.5 a 1.2 veces en eldiámetro de la luz, y 1.3 a 5.2 veces en el áreade la luz), con el mayor aumento en la cola;ambas variables fueron mayores en la cola entodas las edades (P<0.05), sin diferencias entrecabeza y cuerpo. El máximo diámetro de la luzobservado en cada región (cabeza, cuerpo ycola, respectivamente) correspondió a unaumento de 3.7, 3.5 y 5.2 veces, encomparación con la semana 0. Del mismo modo,el aumento en el área de la luz representó21.8, 21.2 y 24.9 veces, en comparación con lasemana 0, para la cabeza, cuerpo y cola,respectivamente. Los espermatozoidesaparecieron por primera vez en la luz tubularde las tres regiones del epidídimo en la semana18 (flechas en las Figuras 1 y 2), lo cual indicaque a esa edad los corderos ya habían alcanzadoo estaban muy cerca de alcanzar la pubertad.

DISCUSIÓN

El crecimiento de los epidídimos siguió unatendencia paralela al desarrollo de los testículos,

the lumen area represented 21.8-, 21.2- and24.9-fold, as compared to wk 0, for caput,corpus and cauda, respectively. Sperm firstappeared in the tubular lumen of the threeepididymal regions by wk 18 (arrows in Figures1 and 2), which indicate that by that age thelambs had already reached or were very closeto reach puberty.

DISCUSSION

Epididymal growth followed a parallel trend totestis development, as reported previously forBlackbelly ram lambs(10); the greatest relativeepididymal growth was observed between 9 and18 wk, which agrees temporally with the greatestrate of testicular growth in this breed(10,11).During that stage of development, the absoluteincrease of the interstitial tissue in the testis isassociated with increased number of Leydig cellsand with the development of their steroidogeniccapacity(12). This, in turn, leads to increasedplasma concentrations of testosterone(10,13)

and, therefore, to greater stimulation to theepididymides, as the development and functionof these organs depend on adequate androgencontribution(14,15).

The functional component of the epididymis isthe tubular tissue, as all the changes related tosperm maturation and storage during theirtransit through the epididymis take place in theluminal compartment, under a highly specializedmicroenvironment consequence of the epithelialactivity(4,5). To accomplish this task, the epitheliummust be structured in a way such that preventand regulate the entry of substances into thelumen, it has the ability of synthesize, secreteand absorb components, and it is arranged sothat the sperm come into contact with theappropriate environment at the appropriatetime(16). It is, therefore, reasonable to considerthe variables related to tubular tissue andepithelial layer as the most appropriate toevaluate the epididymal development at themicroscopic level; such variables have been usedto evaluate epididymal function in severalexperimental models(15,17,18).

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de acuerdo a lo publicado para corderosBlackbelly(10); el mayor crecimiento relativo delos epidídimos se observó entre las 9 y 18semanas de edad, lo que coincide con la mayortasa de crecimiento testicular en esta raza(10,11).Durante esa fase de desarrollo, el aumentoabsoluto del tejido intersticial en los testículosse asocia con aumento en el número de célulasde Leydig y con el desarrollo de su capacidadesteroidogénica(12); esto, a su vez, conduce aun aumento en las concentraciones plasmáticasde testosterona(10,13) y por lo tanto a unamayor estimulación de lo epidídimos, ya que eldesarrollo y la función de estos órganos dependedel aporte adecuado de andrógenos(14,15).

El componente funcional del epidídimo es eltejido tubular, ya que todos los cambiosrelacionados con la maduración yalmacenamiento de los espermatozoides durantesu tránsito por el epidídimo se llevan a cabo enel compartimiento luminal, dentro de unmicroambiente altamente especializado,consecuencia de la actividad epitelial(4,5). Paralograr esta tarea, el epitelio debe estarestructurado de tal manera que pueda preveniry regular la entrada de sustancias a la luz,además de tener la capacidad de sintetizar,secretar y absorber componentes, permitiendoque los espermatozoides entren en contactocon el entorno adecuado y en el momentoexacto(16). Por lo tanto, es razonable considerarlas variables relacionadas con el tejido tubulary la capa epitelial como las más convenientespara evaluar el desarrollo epididimal a nivelmicroscópico; tales variables se han utilizadopara evaluar la función del epidídimo en variosmodelos experimentales(15,17,18).

A nivel macroscópico (peso y contribuciónrelativa al peso total del órgano), el desarrollode las diversas regiones anatómicas de losepidídimos siguieron una tendencia diferenteentre ellos; la cola del epidídimo comenzó adesarrollarse a una edad muy temprana (semana6), mientras que el mayor desarrollo de lacabeza y el cuerpo inició en la semana 12. Loshallazgos en el presente estudio, tanto en el

At the macroscopic level (weight and relativecontribution to the whole organ weight), thedevelopment of the several anatomical regionsof the epididymides followed a different trendto each other; the cauda epididymidis began todevelop at a very early age (wk 6), whereasthe greatest development of the caput andcorpus started by wk 12. The findings in thepresent study, at both, the macroscopic andmicroscopic levels, suggest that the postnataldevelopment of the epididymides goes from thecauda towards the caput, which agrees withdata reported for other species, such ascattle(19), goats(17) and rats(16). In sheep thereis some discrepancy in this matter; whereassome authors reported a trend similar to thatobserved in the present study(8), others(9) founda maturation process advancing from caput tocauda. It is highly probable that the age of theexperimental animals used in the differentstudies in lambs had accounted for the variationof the results observed among studies. In thestudy of Bielli(9), ram lambs were older (90 to180 d-old, that is, 12.9 to 25.7 wk), as comparedwith lambs in the study of Nilnophakoon(8)

(1 to 18 wk) and ours (birth to 21 wk). Thisfact determines important differences in thestage of physiological maturity of the lambs atthe beginning of those studies, as importantanatomical and physiological changes occur inthe testes and epididymides before 12 wk ofage(10,13).

Epididymal function does not depend only onthe endocrine stimulation received fromtestosterone in blood; even more importantmight be the lumicrine system(7,15), given bytestosterone and other factors(15,16). Testosterone,bound to the androgen binding protein (ABP),reaches the epididymides via the efferent ducts,where it is converted into dihydrotestosterone(20).In addition, several growth factors contained inthe tubular fluid have important effects onepididymal function(15,16,21); these factors areproduced by the Sertoli cells in the seminiferoustubules(22), and carried towards the epididymidesvia the excurrent duct system. Then, fluidcomposition undergoes modifications as travels

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nivel macroscópico como en el microscópico,sugieren que el desarrollo posnatal de losepidídimos va en dirección de la cola hacia lacabeza, lo cual coincide con lo publicado paraotras especies, tales como bovinos(19), cabras(17)

y ratas(16). En los ovinos existe cierta discrepanciaen este asunto; mientras que algunos autoresobservaron una tendencia similar a la encontradaen el presente estudio(8), otros(9) reportaron queel proceso de maduración avanzó en direcciónde la cabeza a la cola. Es muy probable que laedad de los animales experimentales utilizadosen los diferentes estudios explique la variaciónde los resultados observados. En el estudio deBielli(9), los corderos eran mayores (90 a 180días de edad, es decir, 12.9 a 25.7 semanas),en comparación con los corderos del estudiode Nilnophakoon(8) (1 a 18 semanas) y elpresente (nacimiento a 21 semanas). Este hechodetermina diferencias importantes en el estadode madurez fisiológica de los corderos al iniciode los estudios, ya que entre el nacimiento y12 semanas de edad se producen cambiosanatómicos y fisiológicos muy importantes enlos testículos y epidídimos(10,13).

La función del epidídimo no depende únicamentede la estimulación endocrina recibida por latestosterona sanguínea; aún más importantepodría ser el llamado sistema lumicrino(7,15),dado por la testosterona y otros factores(15,16).La testosterona, unida a la proteína ligadora deandrógenos (ABP), llega a los epidídimos víalos conductos eferentes, donde se convierte endihidrotestosterona(20). Adicionalmente, variosfactores de crecimiento contenidos en el fluidotubular tienen efectos importantes sobre lafunción del epidídimo(15,16,21); estos factoresse producen en las células de Sertoli, dentro delos túbulos seminíferos(22) y son transportadosa los epidídimos a través del sistema deconductos. Posteriormente, la composición delfluido sufre modificaciones conforme viaja porel epidídimo(5,16). Tal regulación lumicrina esposible sólo después de que aparece la luz delos túbulos seminíferos, como resultado delaumento de la secreción de líquido por lascélulas de Sertoli, cuando inician el proceso de

through the epididymal duct(5,16). Suchlumicrine regulation is feasible only after theseminiferous tubule lumen appears, as result ofincreased fluid secretion by Sertoli cells, whenthey initiate the maturation process to acquiretheir functional capacity as adult cells(22). InBlackbelly ram lambs the lumen of theseminiferous tubules appears after 9 wk of age,and by wk 12 lumen is present in 80 % of thetubules(10). This finding also coincidestemporarily with the greatest increase inepididymal weight, and with the greatestincrease of the epithelium height in the caputand corpus epididymidis observed in the presentstudy, which is in agreement with previousreports in sheep(8) and goats(23).

Cauda epididymidis began to develop beforethe accelerated growth of the testes(10). Atthat time, there is still no contribution of tubularfluid via the testicular excurrent duct system,because the lumen of the seminiferous tubuleshas not formed yet(10). Such findings suggestthat the initial development of the caudaepididymidis could not depend on the presenceof testosterone or other luminal factors comingfrom the testicular tubular system. Additionalevidences supporting this possibility have beenpresented in studies with mature goats, whoseefferent ducts had been ligated(23); in these goats,it was evident the lack of morphologic andfunctional dependence of the cauda epididymidistowards the secretions coming from the testis,via the extra testicular excurrent duct system(23).When cauda epididymidis began to develop,plasma concentration of testosterone must havebeen still very small(10,13); therefore, initialcaudal development might not depend on hightestosterone concentrations, or depend on otherpredominant steroids different fromtestosterone, such as androstenedione, whosecirculating concentrations are larger at thatage(24,25,26). Another possibility is that thethreshold of the caudal response to testosteroneand other circulating androgens might be lowerat that age.

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maduración para adquirir la capacidad funcionalcomo células adultas(22). En corderos Blackbellyla luz de los túbulos seminíferos aparece despuésde las 9 semanas de edad, y hacia la semana 12ya está presente en el 80 % de los túbulosevaluados(10). Este hallazgo coincide con la etapade mayor aumento en el peso de los epidídimos,y con el mayor aumento de la altura del epitelioen la cabeza y el cuerpo, observado en el presenteestudio, lo cual concuerda con hallazgos anterioresen ovinos(8) y caprinos(23).

La cola del epidídimo comenzó a desarrollarseantes del acelerado crecimiento de lostestículos(10). En ese momento todavía no existeuna contribución del fluido tubular a través delsistema de conductos, debido a que la luz delos túbulos seminíferos no se ha formadotodavía(10). Tales hallazgos sugieren que eldesarrollo inicial de la cola del epidídimo podríano depender de la presencia de testosterona uotros factores procedentes del sistema tubulartesticular. Evidencias adicionales que apoyanesta posibilidad se han presentado en estudioscon machos cabríos adultos, cuyos conductoseferentes fueron ligados(23); en estos animalesfue evidente la falta de dependencia morfológicay funcional de la cola del epidídimo hacia lassecreciones procedentes de los testículos, através del sistema de conductos extratesticulares(23). Cuando la cola del epidídimocomenzó a desarrollarse, la concentraciónplasmática de testosterona debió haber sidomuy baja(10,13); por lo tanto, el desarrollo inicialde la cola puede no depender de concentracionesaltas de testosterona, o bien, depender de otrosesteroides predominantes diferentes a latestosterona, como la androstenediona, cuyasconcentraciones circulantes son mayores a esaedad(24,25,26). También existe la posibilidad deque el umbral de respuesta de la cola delepidídimo a la testosterona y a otros andrógenoscirculantes sea menor a esa edad.


En conclusión, los datos del presente estudioindican que el desarrollo del epidídimo en ovinos


In conclusion, data of the present study indicatethat the pattern of development of theepididymis in sheep is regionalized, going fromcauda to caput, that is, the cauda starteddeveloping earlier than the other anatomicalregions. The development of cauda epididymidisshould have started before the increase oftestosterone concentration in blood plasma, andbefore the seminiferous tubule lumen appeared;in contrast, the caput and corpus developmentshould have coincided temporally with theincrease of the testicular steroidogenic capacityand tubular fluid secretion. Such findings suggestthat the various anatomical regions of theepididymis have differential requirements ofendocrine and lumicrine stimulation for theirnormal development.

ACKNOWLEDGEMENTS

To the “Consejo Nacional de Ciencia yTecnología”, México, for financing the project(39290-B); Víctor Robledo and Adolfo Paulín,from the “Universidad Autónoma de Querétaro”(UAQ), for providing with, and caring for thelambs; Jesús Herrera for helping in tissuecollection; Miguel Silva and Mary Guerrero (UAQ)for tissue processing. AD Vargas-Velázquez is aformer student, under the supervision of thelast author (HJS).


es regionalizado, en dirección de la cola a lacabeza, es decir, la cola comenzó a desarrollarseantes que las otras regiones anatómicas. Esprobable que el desarrollo de la cola delepidídimo debió haber comenzado antes delaumento de las concentraciones de testosteronaen el plasma sanguíneo, y antes de la apariciónde la luz de los túbulos seminíferos; encontraste, el desarrollo de la cabeza y el cuerpo

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debió coincidir en tiempo, con el aumento dela capacidad esteroidogénica de los testículos ycon la secreción de los fluidos tubulares. Estoshallazgos sugieren que las diversas regionesanatómicas del epidídimo tienen diferentesrequisitos de estimulación endocrina y lumicrinapara su desarrollo normal.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece al Consejo Nacional de Ciencia yTecnología, México, por el financiamientorecibido (proyecto 39290-B); a Víctor Robledoy Adolfo Paulín, de la Universidad Autónoma deQuerétaro (UAQ), por proporcionar y cuidar alos corderos; a Jesús Herrera por su ayuda enla obtención de los tejidos; a Miguel Silva yMaría Guerrero (UAQ) por el procesamiento delos tejidos.

LITERATURA CITADA

1. Segura JC, Sarmiento L, Rojas O. Productivity of Pelibueyand Blackbelly ewes in Mexico under extensive management.Small Rum Res 1996;21:57-62.

2. Wildeus S. Hair sheep genetic resources and theircontribution to diversified small ruminant production in theUnited States. J Anim Sci 1997;75:630-640.

3. Turner TT. On the epididymis and its role in the developmentof the fertile ejaculate. J Androl 1995;16:292-298.

4. Cornwall GA. New insights into epididymal biology andfunction. Hum Reprod Update 2009;15:213-227.

5. Gatti JL, Castella S, Dacheux F, Ecroyd H, Metayer S, ThimonV, et al. Post-testicular sperm environment and fertility. AnimReprod Sci 2004;82:321-339.

6. Amann RP. Function of the epididymis in bulls and rams. JReprod Fertil Suppl 1987;(Suppl 34):115-131.

7. Turner TT, Bomgardner D, Jacobs JP, Nguyen QA. Associationof segmentation of the epididymal interstitium withsegmented tubule function in rats and mice. J Reprod Fertil2003;125:871-878.

8. Nilnophakoon N. Histological studies on the regional postnataldifferentiation of the epididymis in the ram. Anat HistolEmbryol 1978;7:253-272.

9. Bielli A, Genovese P, Ungerfeld R, Katz H. Histology of lambepididymal development. Anat Histol Embryol 2007;36:437-141.

10. Herrera-Alarcón J, Villagómez-Amezcua E, González-PadillaE, Jiménez-Severiano H. Stereological study of postnatal

testicular development in Blackbelly sheep. Theriogenology2007;68:582-591.

11. Jiménez-Severiano H, Reynoso ML, Roman-Ponce SI, RobledoVM. Evaluation of mathematical models to describe testiculargrowth in Blackbelly ram lambs. Theriogenology2010;74:1107-1114.

12. Monet KC, Hochereau-de Reviers MT, Terqui M. Variationsin testicular androgen receptors and histology of the lambtestis from birth to puberty. J Reprod Fertil 1984;70:203-210.

13. Montiel-Olguín LJ. Desarrollo endocrino del eje reproductivoen ovinos de pelo [tesis maestría]. Cuautitlán Izcalli, Estadode México: Universidad Nacional Autónoma de México; 2010.

14. Zhu LJ, Hardy MP, Inigo IV, Huhtaniemi I, Bardin CW, Moo-Young AJ. Effects of androgen on androgen receptorexpression in rat testicular and epididymal cells: aquantitative immunohistochemical study. Biol Reprod2000;63:368-376.

15. Robaire B, Hamzeh M. Androgen action in the epididymis.J Androl 2011;32:592-599.

16. Robaire B, Hinton BT, Orgebin-Crist MC. The epididymis. In:Neill JD editor. Physiology of reproduction. 3rd ed. San Diego,CA USA: Elsevier Academic Press; 2006:1071-1148.

17. Goyal HO, Williams CS, Khalil MK, Vig MM, Maloney MA.Postnatal differentiation of the ductus deferens, tail of theepididymis, and distal body of the epididymis in goats occursindependently of rete testis fluid. Anat Rec 1999;254:508-520.

18. Hamzeh M, Robaire B. Effect of testosterone on epithelialcell proliferation in the regressed rat epididymis. J Androl2009;30:200-212.

19. Wildeus S, Entwistle KW. A quantitative histological study oftesticular and epididymal development in Bos indicus crossbulls. Anim Reprod Sci 1983;6:1-10.

20. Robaire B, Seenundun S, Hamzeh M, Lamour SA. Androgenicregulation of novel genes in the epididymis. Asian J Androl2007;9:545-553.

21. Tomsig JL, Turner TT. Growth factors and the epididymis. JAndrol 2006;27:348-357.

22. Russell LD, Bartke A, Goh JC. Postnatal development of theSertoli cell barrier, tubular lumen, and cytoskeleton of Sertoliand myoid cells in the rat, and their relationship to tubularfluid secretion and flow. Am J Anat 1989;184:179-189.

23. Goyal HO, Hutto V, Maloney MA. Effects of androgendeprivation in the goat epididymis. Cells Tissues Organs1994;150:127-135.

24. Amann RP. Endocrine changes associated with onset ofspermatogenesis in Holstein bulls. J Dairy Sci 1983;66:2606-2622.

25. O’Shaughnessy PJ, Baker PJ, Heikkilä M, Vainio S, McMahonAP. Localization of 17ß-hydroxysteroid dehydrogenase/17-ketosteroid reductase isoform expression in the developingmouse testis-androstenedione is the major androgensecreted by fetal/neonatal Leydig cells. Endocrinology2000;141:2631-2637.

26. Teerds KJ, Rijntjes E. Dynamics of Leydig cell regenerationafter EDS. A model for postnatal Leydig cell development.In: Payne AH, Hardy MP editors. The Leydig cell in healthand disease. 1st ed. Totowa, NJ, USA: Humana Press;2007:91-116.

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TIPOLOGÍA DE LAS EXPLOTACIONES GANADERAS DE BOVINOS DOBLE PROPÓSITORev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):69-83

Tipología de las explotaciones ganaderas debovinos doble propósito en Sinaloa, México

Typology of dual-purpose cattle production farms inSinaloa, Mexico

Venancio Cuevas Reyesa, Alfredo Loaiza Mezab, José Antonio Espinosa Garcíac,Alejandra Vélez Izquierdoc, María Denisse Montoya Floresc

RESUMEN

El objetivo del presente estudio consistió en realizar una tipología de las explotaciones ganaderas de bovinos de doblepropósito en el estado de Sinaloa, usando variables sociales, económicas y tecnológicas. Se analizó información de1,165 productores del sistema de producción de doble propósito que participaron en el programa Soporte de SAGARPA2010-2011. A través del uso de componentes principales, análisis cluster y análisis de varianza fueron identificadosy caracterizados cuatros tipos de explotaciones ganaderas; pequeñas explotaciones ganaderas (67 %), explotacionesganaderas medianas (24 %), explotaciones ganaderas grandes (7 %), y explotaciones ganaderas grandes con potencialempresarial (2 %). La tipología obtenida puede ser útil para generar políticas públicas diferenciadas que incrementenel uso de innovaciones tecnológicas que incidan en una mayor eficiencia y productividad del sistema bovinos de doblepropósito en Sinaloa.

PALABRAS CLAVE: Políticas diferenciadas, Variables, Componentes principales, Análisis cluster, Innovaciones.

ABSTRACT

The aim of this study was to conduct a typology of dual purpose cattle farms in the state of Sinaloa, using social,economic and technological variables. Information of 1,165 system producing dual purpose of Sinaloa who participatedin the support program SAGARPA 2010 to 2011 were analyzed. Through the use of principal component analysis,cluster analysis and variance analysis were identified and characterized four types of farms; small farms (67 %),medium farms (24 %), large livestock farms (7 %), and large farms with business potential (2 %). The typologyobtained can be useful for generating differentiated public policies that increase the use of technological innovationsto obtain greater efficiency and productivity of dual cattle purpose in Sinaloa.

KEY WORDS: Differentiated policies, Principal components, Cluster analysis, Innovations.

Recibido el 10 de marzo de 2015. Aceptado el 17 de abril de 2015.a Programa de Socioeconomía. Campo Experimental Valle de México-INIFAP. México. [email protected]. Correspondencia al primer autor.b Campo Experimental Valle de Culiacán. INIFAP. México.c CENID Fisiología. INIFAP. México.

INTRODUCCIÓN

La producción de leche en México se lleva acabo en todos los Estados y bajo diferentessistemas de producción, identificándose cuatrosistemas predominantes: especializado, semi-especializado, doble propósito y familiar,aportando el 50.6, 21.3, 18.3 y 9.8 %respectivamente(1). Estos sistemas están

INTRODUCTION

Milk production in Mexico is carried out in allStates and under different production systems.Four predominant systems have been identified:skilled, semi-skilled, dual-purpose and family runfarms, contributing 50.6, 21.3, 18.3 and 9.8 %respectively(1). These systems are associatedwith agro-ecological regions; intensive system,

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Venancio Cuevas Reyes, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):69-83

asociados a regiones agroecológicas; el sistemaintensivo, predominante de la zona árida ysemiárida, los sistemas familiar y semi-especializado con predominio en la zonatemplada y el de doble propósito en la regióntropical(2), el cual se caracteriza por tenerunidades de producción cuya finalidad esproducir y vender leche o queso artesanal yanimales para rastro, becerros destetados yhembras de desecho(3).

Uno de los estados representativos del sistemade bovinos doble propósito es Sinaloa, quedurante el periodo 1980-2013 aportó enpromedio 1.2 % de la producción nacional deleche de bovino; sin embargo, en 2013 esteaporte sólo fue de 0.85 %(4), situación querefleja que el ritmo de crecimiento en el estadoes menor que el promedio nacional, a pesardel potencial que representa la producción enregiones tropicales, por los bajos niveles deproductividad y rentabilidad, así como bajosniveles de uso de tecnología(5,6,7). Por loanterior, cobra importancia identificar losdiferentes estratos y características de losproductores de estos sistemas productivos, conel fin de generar un mayor impacto del uso deinnovaciones a través de estrategiasdiferenciadas al tipo y nivel de recursos de lasexplotaciones pecuarias de bovinos de doblepropósito.

Una clasificación o tipología sirve para constituircategorías de actores, de tal forma que sepuedan analizar las particularidades de cadauna e identificar soluciones específicas paraproblemas que también son específicos(8). Deesta forma, la tipología de productores se refierea la identificación y elaboración de diferentesgrupos o estratos, que se obtienen a través dela selección de variables representativas de larealidad observada. Es decir, la tipificación tieneuna connotación con la que se alude a algunanoción que resume una diversidad decaracterísticas, situaciones, fenómenos oindividuos que comparten algún carácter másevidente o notorio y que puede identificarsecomo modelo diferenciado(9).

prevalent in the arid and semi-arid zone, arefamily-based and semi-specialized systems thatare predominantly found in temperate zonesand are dual-purpose in the tropical regions(2),they are characterized by production units aimedat producing and selling milk or animals forartisanal cheese or animals for slaughter, asweaned calves and as worn-out cows(3).

One of the representative states with dual-purposecattle systems is Sinaloa. The state contributed1.2 % on average to the national production ofbovine milk during the period 1980-2013; however,in 2013 this contribution was only 0.85 %(4). Asituation that reflects that the pace of growth inthe state is lower than the national average,despite the potential of production in tropicalregions, because of the low levels of productivityand profitability, as well as low levels of technologyuse(5,6,7). Therefore, it becomes important toidentify the different strata and characteristicsof the producers of these production systems,in order to generate greater impact in the useof innovations through differentiated strategiestailored to the type and level of resourcesavailable in the dual-purpose cattle farms.

A classification or typology serves to establishcategories of actors, so that they can analyzethe characteristics of each one and identifyspecific solutions to problems that are alsospecific(8). Thus, the typology of producersrelates to the identification and development ofvarious groups or strata, which are obtainedthrough the selection of variables representingthe observed reality. Hence, the classificationprovides some notion that summarizes a varietyof characteristics, conditions, events orindividuals that or who share some obvious orevident and identifiable characteristic that willallow for a differentiated model(9).

The use of multivariate methods for classificationand identification of production units in theagricultural field has been recurring; severalauthors(10-14) have used multivariate analysistechniques to identify homogeneous groups infarms.

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TIPOLOGÍA DE LAS EXPLOTACIONES GANADERAS DE BOVINOS DOBLE PROPÓSITO

El uso de métodos multivariados para laclasificación y caracterización de unidades deproducción en el ámbito agropecuario ha sidomuy recurrente, diversos autores(10-14) hanutilizado técnicas de análisis multivariante paraidentificar grupos homogéneos en explotacionesagropecuarias.

En México existen trabajos que han clasificadoy tipificado la agricultura nacional, realizados anivel desagregado con base a informacióncensal(15,16). Diversos autores han utilizado elanálisis multivariado para identificar los factoresque limitan el desarrollo del sistema familiar deproducción de leche(17), caracterizar lasexplotaciones ovinas(18), analizar y caracterizarla producción ovina asociada a la agricultura detemporal(19), y tipificar sistemas de producciónlecheros(20), entre otros.

En Sinaloa no existe un estudio de estanaturaleza, por lo tanto el objetivo del presenteestudio consistió en realizar una tipología delas explotaciones ganaderas de bovinos doblepropósito en el estado de Sinaloa, usandovariables sociales, económicas y tecnológicas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Área de estudio

El estudio se realizó en el estado de Sinaloa,ubicado en la región Noroeste de México a 27°07' y 22° 20' N y 105° 22' y 109° 30' O. El 48 %del estado presenta clima cálido subhúmedo,40 % clima seco y semiseco, 10 % es muy seco,y el restante 2 % es clima templado subhúmedo.La temperatura media anual es 25 °C, con mínimasde 10.5 °C en enero y las máximas pueden sermayores a 36 °C durante mayo a julio(21).

Datos y variables

Se analizó información de 1,165 explotacionesganaderas del sistema bovinos de doblepropósito (SBDP) que participaron en elprograma Soporte de SAGARPA 2010-2011(22).El programa en Sinaloa inició en julio de 2010y culminó en marzo de 2011. Durante este

In Mexico, there are studies that have classifiedand typified domestic agriculture. These havebeen conducted at a disaggregated level basedon census data(15,16). Several authors have usedmultivariate analysis to identify factors that limitthe development of the family system of milkproduction(17), to characterize sheep productionfarms(18), to analyze and characterize sheepproduction associated with rainfed agriculture(19)

and to classify dairy production systems(20),among others.

In Sinaloa there is no information of this nature;therefore the objective of this study was toconduct a typology of dual-purpose cattleproduction farms in the state of Sinaloa, usingsocial, economic and technological variables.


Study area

The study was conducted in the state of Sinaloa,in a region located in the northwestern of Mexicoat 27° 07' and 22° 20' N, and 105° 22' and109° 30' W. About 48 % of the state has awarm humid climate, while 40 % is dry andsemidry, 10 % is very dry, and the remaining2 % is temperate sub-humid. The averageannual temperature is 25 °C, with minimum of10.5 °C in January and maximum may be higherat 36 °C for May to July(21).

Data and variables

Information of 1,165 dual-purpose cattleproduction systems (DCPS) that participated inthe 2010-2011 SAGARPA funded program wasanalyzed(22). The Sinaloa program began in July2010 and ended in March 2011. During thisperiod an online baseline survey of theproduction units (PU) participating in theprogram was carried out. The survey wasstructured into eight sections: generalinformation of the producer group, generalinformation about the PU, social and economicproducer aspects, characteristics of the PU,inventories (livestock, land, plant, machinery andequipment), management practices and

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periodo se realizó una encuesta de línea basea las unidades de producción (UP) participantesen el programa. La encuesta estaba estructuradaen ocho apartados: información general delgrupo de productores, información general dela unidad de UP, aspectos sociales y económicosdel productor, características de la UP,inventarios (semovientes, tierras, instalaciones,maquinaria y equipo), prácticas de manejo ycomponentes tecnológicos, comercialización einversiones. Con esta información se diseñó unabase de datos en Excel.

Para clasificar productores se pueden utilizaruna gran cantidad de variables y métodos(8,9).La selección de variables para el presenteestudio se realizó con base a la identificaciónde aquellos factores que han sido relevantesen la caracterización y tipologías deexplotaciones ganaderas(12,23), y con base alanálisis de indicadores tecnológicos sobre eluso y adopción de innovaciones y prácticas enlas UP(24,25). El procedimiento de obtención delos índices tecnológicos utilizados que se siguió,fue el descrito por autores que han trabajadoeste tema en SBDP en México(26), de estaforma, los siguientes índices se consideraroncomo variables de análisis: manejo general,mejoramiento genético, manejo reproductivo,alimentación con forrajes, alimentación conconcentrado, sanidad, manejo de la ordeña,instalaciones y, finalmente índice de uso demaquinaria y equipo. Los índices obtenidosreflejan la proporción de adopción y aplicaciónde innovaciones tecnológicas en cada una delas unidades de producción, esto con base a lafrecuencia de uso para el año en que fuecapturada la información.

Posteriormente se seleccionaron aquellas variablesque han sido consideradas en otros estudios deestratificación de productores: variablessociales(10,19) (como la edad, númerodependientes menores y dependientes mayoresde edad; variables económicas tales como tamañodel hato(17), número de hectáreas dedicadas a laganadería(14) y número de vacas adultas(12,23).

technological components, marketing andinvestment. With this information, a databasewas constructed in Excel.

To classify producers a great number of variablesand methods can be used(8,9). The selection ofvariables for this study was carried out basedon the identification of those factors that havebeen important in the characterization andtypology of livestock production(12,23), andbased on the analysis of technological indicatorson the use and adoption of innovations andpractices in PU(24,25). The technological indiceswere obtained following the procedure ofauthors who have worked on this issue of DCPSin Mexico(26), in this manner the followingindices were considered as analysis variables:general management, genetic improvement,reproductive management, feeding forages,concentrate feeding, health, milkingmanagement, facilities and finally use rate ofmachinery and equipment. The indices obtainedreflect the proportion of adoption andimplementation of technology innovations ineach of the production units; this was basedon the frequency of use for the year theinformation was captured.

Subsequently, variables that have beenconsidered in other studies of stratification ofproducers were selected, these were socialvariables(10,19) such as: age, number dependentchildren and dependent adults, economicvariables such as size of the herd(17), numberof hectares devoted to livestock(14) and numberof adult cows(12,23).

Statistical analysis

The selection of variables was performed usingdescriptive statistics and correlation analysis(13).The social and economic variables along withvariables related to technological aspects wereapplied to a correlation analysis to select thosewith greater representation in the DCPS.Variables that were significantly correlated(P<0.05) were identified, thus reducing from15 variables to just 5, which grouped

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Análisis estadístico

La selección de las variables se realizó con usode estadística descriptiva y análisis decorrelación(13). A las variables sociales yeconómicas en conjunto con las variablesrelacionadas con aspectos tecnológicos se lesaplicó un análisis de correlación, para seleccionaraquéllas con mayor representación en el SBDP.Así, se identificaron variables que estuvierancorrelacionadas de forma significativa (P<0.05),reduciéndose de 15 a sólo 5 variables, las cualesagrupan características representativas de lapoblación a estudiar: edad del productor,número de unidades animal, índice demaquinaria y equipo, índice de manejo generale índice de alimentación con forrajes.

El análisis multivariado incluye un conjunto demétodos y técnicas que permiten estudiar enbloque un conjunto de variables medidas uobservadas en una población de individuos(8,9,27).Las variables seleccionadas se analizaron con lossiguientes métodos de análisis multivariado:análisis de componentes principales (ACO) yanálisis cluster para la clasificación y posteriorcaracterización de las UP(11,13,14). El análisis decomponentes principales permitió reducir lasvariables que identifican a los grupos deproductores, además de generar nuevas variables(factores o componentes). El análisis cluster, entanto, se utilizó para realizar una agrupación entrelas unidades de producción con característicashomogéneas. Para la obtención de losconglomerados se aplicó el método de Ward y ladistancia euclidiana al cuadrado(17,20).

Finalmente, el análisis y descripción de losgrupos se realizó mediante un análisis devarianza para comparación de medias. Laspruebas estadísticas se realizaron con el paqueteestadístico SPSS(27) y Matlab V16.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Factores relevantes e identificación de tipos deproductores

El análisis de componentes principales(28)

permitió extraer factores explicativos de las

representative characteristics of the studypopulation such as age of the producer, numberof animal units, machinery and equipment index,general management index and a forage feedindex.

Multivariate analysis includes a set of methodsand techniques that enables studying a blockof a set of variables that are measured orobserved in a population of individuals(8,9,27).The selected variables were analyzed with thefollowing methods of multivariate analysis:principal component analysis (PCA) and clusteranalysis for classifying and furthercharacterization of the PU(11,13,14). Principalcomponent analysis allowed to reduce thevariables that identify producer groups andgenerate new variables (factors or components).Cluster analysis, meanwhile, was used toperform a grouping between production unitswith similar characteristics. To obtainconglomerates Ward’s method and Euclideandistance squared was applied(17,20).

Finally, the analysis and description of thegroups was performed using analysis of varianceto compare means. Statistical tests wereperformed using SPSS(27) and V16 Matlabstatistical package.

RESULTS AND DISCUSSION

Identify relevant factors and types of producers

The principal component analysis(28) allowedexplanatory factors in order to extractquantitative variables. The factors obtained werenamed as: social dimension (component 4),availability of resources (component 2),infrastructure and management (component 1)and livestock feed (component 3), which accountfor 86.8 % of the original variation (Table 1).

The Kaiser-Meyer-Olkin (KMO) statisticobtained presented a value of 0.568, indicatesa good fit in sampling adequacy for factoranalysis. For the Barlett test of sphericity(29)

a value of 0.000 was obtained, thus the nullhypothesis can be rejected and the variables

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variables cuantitativas. Los factores obtenidosse denominaron como: dimensión social(componente 4), disponibilidad de recursos(componente 2), infraestructura y manejo(componente 1) y alimentación del ganado(componente 3), los cuales explican el 86.8 %del total de la variación original (Cuadro 1).

El estadístico Kaiser-Meyer-Olkin (KMO) obtenidopresentó un valor de 0.568, lo que indica unabuena adecuación muestral. Con la prueba deesfericidad de Barlet(29) se obtuvo un valor de0.000, por lo que se puede rechazar la hipótesisnula considerando el ajuste de las variables,mediante el análisis factorial idóneo. El análisisde conglomerados de los factores obtenidosidentificó claramente cuatro cluster o gruposde explotaciones ganaderas (Figura 1).

El Cluster 1 se compone de 778 UP, y se definiócomo pequeñas explotaciones ganaderas (PEG).Representan el 67 % de las explotaciones, esel grupo más representativo y entre suscaracterísticas relevantes, es que cuentan conun promedio de edad de 51.5 ± 14.4 años.Cuentan con 21.4 ± 10.1 unidades animal y26.9 ± 16.0 ha dedicadas a la producciónganadera. Es el grupo mayoritario en el estadoy presenta bajos índices de innovaciones,infraestructura y manejo.

can be considered by a suitable factor analysis.Cluster analysis of the factors obtained clearlyidentified four clusters or groups of farms(Figure 1).

Cluster 1 consists of 778 PU, and was definedas small cattle farms (SCF). They represent 67 %of the production farms, it is the mostrepresentative and among its relevant group

Cuadro 1. Matriz de componentes rotados de explotaciones ganaderas*

Table 1. Rotated components matrix of cattle production farms*

Variable* Component 1 Component 2 Component 3 Component 4

Age -.012 -.031 .021 .998InventaryAU .028 .957 -.017 -.038IndMaqyEq .602 .392 .312 .037IndMGral .921 -.075 -.023 -.032IndAliForr .075 -.003 .974 .020Actual value 1.5 1.0 0.9 0.8Variance, % 29.9 21.1 18.5 17.1Accumulated, % 29.9 51.0 69.6 86.8

* Extraction method: Principal component analysis. Rotation method: Varimax with Kaiser Normalization.

The rotation converged in 5 iterations.

InventaryAU= herd; IndMaqyEq= machinery and equipment; IndMGral= general management; IndAliForr=

feeding forages.

Figura 1. Dendograma de clasificación de lasexplotaciones ganaderas en Sinaloa

Figure 1. Dendogram classification of production cattlefarms in Sinaloa

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El Cluster 2 agrupa 83 UP, y fue definido comoexplotaciones ganaderas grandes (EGG).Representan el 7 %, es un grupo relativamentepequeño pero destaca por contar con más de115 unidades animal (115.4 ± 19.8); por suescala, utilizan una gran cantidad de superficieagrícola, más de 100 ha, la edad de losproductores es de 50.4 ± 12.8 años.

El Cluster 3 se integra por 285 UP, y se definiócomo explotaciones ganaderas medianas (EGM).Representan 24 % de las explotaciones, cuentancon un promedio de edad de 57.2 ± 11.8, con55.0 ± 13.9 unidades animal y 38.5 ± 24.2 hadedicadas a la producción ganadera. En conjuntocon el grupo PEG representan 91 % del totalde UP.

Las pequeñas y medianas explotacionesganaderas identificadas en el presente estudiocoincide con los resultados del estudio sobretipología de productores para el sur deSinaloa(5); dichos autores señalan que el tamañode la UP típica en la región es de 20 ha y el80 % de los productores cuentan con un hatode bovinos de entre 21 y 42 cabezas.

Finalmente, el cluster 4 está constituido por 19explotaciones y representa el 2 %. Se definiócomo explotaciones ganaderas grandes conpotencial empresarial (EGGPE) por el nivel derecursos con los que cuenta (242.5 ± 76.5unidades animal y 174.3 ± 246.6 ha dedicadas ala ganadería). Son productores que destacan porla escala de las unidades de producción y portener una edad menor a 50 años (47.3 ± 14.2).

Una vez identificados los tipos de productor, seprocedió a caracterizarlos de acuerdo a loscomponentes identificados, ya que como señalanalgunos autores, la identificación de lascaracterísticas que determinan la heterogeneidadal interior de los sistemas de producción es elpunto de partida para buscar su desarrollo(14).

Dimensión social

El número de dependientes mayores de 18 años(cercano a dos dependientes) presenta

characteristics is that they have an averageage of 51.5 ± 14.4 yr. They have 21.4 ± 10.1units of animals and 26.9 ± 16.0 ha arededicated to livestock production. It is thelargest group in the state and has low levels ofinnovation, infrastructure and management.

Cluster 2 groups consisted of 83 PU, and thesewere defined as large cattle farms (LCF). Therepresented just 7 %, which is a relatively smallbut stands out for having more than 115 animalsunits (115.4 ± 19.8); in scale, they use a lot ofagricultural land, more than 100 ha, the age ofthe producers is 50.4 ± 12.8 yr.

Cluster 3 was comprised of 285 PU, and wasdefined as medium-sized cattle farms (MCF).They represent 24 % of farms with an averageage of 57.2 ± 11.8, with 55.0 ± 13.9 animalunits and have 38.5 ± 24.2 ha dedicated tolivestock production. In conjunction with theSCF group they represent 91 % of PU.

The small and medium farms identified in thisstudy is consistent with the results of the studyon typology of producers for southern Sinaloa(5);these authors point out that the size of the PUtypically in the region is 20 ha and 80 % ofproducers have a herd of cattle of between 21and 42 heads.

Finally, the cluster 4 consisted of 19 farms andrepresented 2 %. They were defined as largecattle farms with business potential (LCFBP)due to the level of resources that they have(242.5 ± 76.5 animal units with 117.5 ± 91.1ha dedicated to cattle ranching). They areproducers that stand out for the scale of theproduction units and younger age of less than50 yr (47.3 ± 14.2).

Once the types of producer identified, they werecharacterized according to the identifiedcomponents, because as reported by someauthors, identifying the characteristics thatdetermine the heterogeneity within productionsystems is the development starting point(14).

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similitudes. La edad promedio de los productoresfluctúa entre 47.3 y 57.2 años. Es relevanteseñalar que se identificaron diferenciassignificativas (P<0.05) entre PEG y EGGPE parala variable edad (51.5 ± 14.4 vs 47.3 ± 14.2años) y para la variable número de dependientesmenores (un miembro menor de edad encomparación con aproximadamente dos miembrosmenores de edad en las EGGPE) (Cuadro 2).

Los resultados encontrados contrastan con loinformado por otros autores(30) quienes noencontraron diferencias significativas en la edaddel productor en fincas de doble propósito enVenezuela, mientras otro estudio(7) en Sinaloaencontró que la variable edad tampoco presentódiferencias significativas.

En contraste, otros estudios encontraron que laedad del productor tiene significancia (P<0.05)para la adopción de innovaciones tecnológicas(25).En este sentido, el hecho de que los productoresde las EGGPE sean menores de 50 años pudierainfluir en su receptividad hacia propuestas decambio tecnológico, capacitación y uso deinnovaciones.

Disponibilidad de recursos

Las variables número de unidades animal ysuperficie dedicada a la ganadería de lasexplotaciones ganaderas resultó significativa(P<0.05), lo cual indica que estas variablespueden ser importantes para la clasificación detipos de productores en sistemas de producción

Social dimension

The number of dependents over 18 yr (close totwo dependents) has similarities. The averageage of producers fluctuated between 47.3 and57.2 yr. It is worth noting that significantdifferences (P<0.05) between SCF and LCFBPfor the variable age (51.5 ± 14.4 vs 47.3 ±14.2 yr) and the variable number of dependentchildren (one minor in comparison to twomembers being minors for LCFBP) (Table 2).

The results contrast with those reported by otherauthors(30) who found no significant differencesin the age of the producer in dual-purpose farmsin Venezuela, while another study(7) in Sinaloafound that the age variable also showedsignificant differences.

In contrast, other studies found that the age ofthe producer has significance (P<0.05) in termsof adopting technological innovations(25). In thissense, the fact that the producers of the LPFBPare under 50 might influence their receptivityto proposals of technological change, trainingand use of innovations.

Availability of resources

The variables of number of animal units andarea devoted to raising livestock farms wassignificant (P<0.05), indicating that thesevariables may be important for the classificationof types of producers in dual-purpose productioncattle systems; in other words the level offinancial resources (herd size and agricultural

Cuadro 2. Características sociales de los tipos de productores en Sinaloa

Table 2. Social characteristics of the types of producers in Sinaloa

Variable SCF MCF LCF LCFBP F value

Age 51.5±14.4ac 57.2±11.8ab 50.4±12.8ab 47.3±14.2b 14.344Dependent children 1.3±1.3ac 1.0±1.3ab 1.4±1.4ab 1.8±1.3b 3.786Dependent adults 1.6±1.3a 1.7±1.2a 1.8±1.5a 1.8±1.4a 0.833

SCF= Small catlle farms; MCF= Medium catlle farms; LCF= Large cattle farms; LCFBP= Large cattle farms with business

potential.

abc Dissimilar letter in the same row indicate difference (P<0.05).

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de bovinos doble propósito, es decir, el nivel derecursos económicos (tamaño del hato ysuperficie agrícola) resulta determinante en ladiferenciación de los productores de este sistemade producción (Cuadro 3).

La selección del tamaño total del hato comovariable que diferencia grupos de productoresconcuerda con un estudio realizado en el sistemafamiliar de producción de leche en Michoacán(17),ya que el total de animales en el hato y las vacasen producción fueron las variables másimportantes para la formación de conglomeradosde los sistemas estudiados por estos autores.

Las EGGPE se definieron como explotacionesgrandes con potencial empresarial, por la grancantidad de recursos con los que cuenta parala producción; un hato promedio de 242.5 ±76.5 y una superficie agrícola destinada a laproducción ganadera de 174.3 ± 246.6. Es decir,tienen un alto potencial para lograr una mayorvinculación al mercado y mejorar su competitividada través de potenciales incrementos en laproducción de becerros y leche, dado su nivel derecursos; el mejoramiento de la competitividadde los sistemas de producción de leche en eltrópico latinoamericano independientemente dela ubicación de las fincas, tiene una relacióndirecta con el tamaño del hato(31).

Infraestructura y manejo

Los índices relacionados con la infraestructurade las explotaciones ganaderas muestrandiferencias (P<0.05) entre las EGGPE en

area) is decisive in differentiating producers ofthis production system (Table 3).

The selection of the total herd size as a variabledifferentiate producer groups is consistent witha study on the family system of milk productionin Michoacan(17), since the total number ofanimals in the herd and cows in productionwere the most important variables leading tothe formation of clusters of these systemsstudied by these authors.

LCFBP were defined as large farms with businesspotential due to the large amount of resourcesthat they have for production; a herd averageof 242.5 ± 76.5 with an agricultural areadevoted to livestock production of 174.3 ±246.6. That is, they have a high potential tohave closer links with the market and improvetheir competitiveness through potential increasesin production of calves and milk, given its levelof resources; improving the competitiveness ofmilk production systems in tropical Latin Americaregardless of the location of the farms is directlyrelated to the size of the herd(31).

Infrastructure and management

The indices related to infrastructure of livestockfarms show differences (P<0.05) between theLCFBP compared with SCF. Small farms have arate of 0.09 ± 0.09 facilities compared to farmswith business potential (0.18 ± 0.22). This samebehavior occurs in the index of machinery andequipment, general management and health.

Cuadro 3. Disponibilidad de recursos por tipo de explotaciones ganaderas

Table 3. Availability of resources by type of livestock farms


Average herd, AU 21.4±10.1a 55.0±13.9b 115.4±19.8c 242.5±76.5d 2239.663Adult cows, n 18.0±19.0a 29.0±21.0a 46.0±34.0b 88.0±61.0c 103.657Surface area, ha 32.2±83.9a 44.3±82.6b 104.6±167.7b 174.3±246.6c 26.207

SCF= Small catlle farms; MCF= Medium catlle farms; LCF= Large cattle farms; LCFBP= Large cattle farms with business

potential.

abc Dissimilar letter in the same row indicate significant difference (P<0.05).

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The indices related to genetic management,reproductive management and handling of milkingdid not show significant difference (Table 4).

There are many studies examining the use oftechnological components or factors that limitthe application of innovations in livestockproduction systems(32-34). In the present study,we identified that the use of technologicalinnovations is low and very similar betweenproducers (innovations related to food and usefodder less than 16 %, using concentrate wasless than 11 %, milk management practiceswas between 22 and 11 %, innovations relatedto reproductive management was less than 6 %;Tables 4, 5). The differences in terms ofinfrastructure correspond to the size of the farmsthan to differentiation by level of innovationadopted. In this regard, the Agricultural CensusVIII, Livestock and Forestry(35) indicates thatthere are 27,022 production units farming inSinaloa, of which 22,535 use some form oftechnology. The technology component that isapplied to a greater extent is vaccination(1.8 %), followed by ticks baths (1.7 %),deworming (46.2 %), use of mineral salts (0.8 %)and purchase of balanced diets (0.5 %). Thisshows enormous potential for the promotionand implementation of technological innovationsrelated to aspects of nutrition, reproductivehandling, health and milking in these farms

comparación con las PEG. Las pequeñasexplotaciones ganaderas tienen un índice deinstalaciones de 0.09 ± 0.09 en comparacióncon las explotaciones ganaderas con potencialempresarial (0.18 ± 0.22). Este mismocomportamiento se presenta en el índice demaquinaria y equipo, el de manejo general y elde sanidad. Los índices relacionados con elmanejo genético, manejo reproductivo y manejode ordeña no presentaron diferencia significativa(Cuadro 4).

Existe una gran cantidad de estudios queanalizan el uso de componentes tecnológicos olos factores que limitan la aplicación deinnovaciones en sistemas de producciónpecuarios(32-34). En el presente estudio seidentificó que el uso de innovacionestecnológicas es bajo y muy parecido entre losproductores (innovaciones relacionadas conalimentación y uso de forrajes menor a 16 %,uso de concentrado menor a 11 %, prácticasde manejo de ordeña entre 22 y 11 %;innovaciones relacionadas con manejoreproductivo menor a 6 %, (Cuadros 4, 5). Lasdiferencias encontradas en cuanto a lainfraestructura corresponden más bien al tamañode las explotaciones que a una diferenciaciónpor nivel de adopción de innovaciones. Alrespecto, el análisis de uso de tecnología conbase al VIII Censo Agrícola, Ganadero y

Cuadro 4. Uso de infraestructura y manejo del ganado por tipo de explotación

Table 4. Use of infrastructure and management of livestock by type of farm


Facilities 0.09±0.09a 0.12±0.11a 0.15±0.15ab 0.18±0.22bc 11.202Machinery and equipment 0.14±0.11a 0.16±0.11ab 0.21±0.15ab 0.27±0.16c 15.439General management 0.25±0.17ab 0.25±0.15ac 0.26±0.15ab 0.34±0.23b 1.728Genetic management 0.24±0.27a 0.26±0.28a 0.29±0.33a 0.22±0.29a 1.050Reproductive management 0.05±0.11a 0.05±0.11a 0.06±0.14a 0.06±0.15a 0.581Health 0.62±0.16ab 0.63±0.16ab 0.66±0.13b 0.57±0.25ac 2.168Milking management 0.15±0.26a 0.11±0.21a 0.12±0.22a 0.22±0.37a 2.673

SCF= Small catlle farms; MCF= Medium catlle farms; LCF= Large cattle farms; LCFBP= Large cattle farms with

business potential.

abc Dissimilar letter in the same row indicate difference (P<0.05).

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Forestal(35) indica que en Sinaloa existen 27,022UP con actividad agropecuaria, de las cuales22,535 utilizan algún tipo de tecnología. Elcomponente tecnológico que se aplica en mayormedida es la vacunación (1.8 %), seguido delbaño garrapaticida (1.7 %), la desparasitación(46.2 %), uso de sales minerales (0.8 %), ycompra de alimento balanceado (0.5 %). Estomuestra un enorme potencial para la promocióne implementación de innovaciones tecnológicasrelacionadas con aspectos de alimentación,manejo reproductivo, sanidad y ordeña en lasexplotaciones de este sistema de producciónde carne y leche en Sinaloa.

Alimentación del ganado

Las variables analizadas referentes al manejoalimenticio mostraron diferencias significativas(P<0.05) para EGG en comparación con EGGPE,en el uso de forrajes, las explotaciones grandestienen un índice de 0.16 ± 0.09 en comparacióncon 0.11 ± 0.09 de las EGGPE; una posibleexplicación sea el que estas últimas cuentencon grandes áreas de agostadero en dondeenvíen su ganado a pastar. Es relevante señalarque en el aspecto de uso de concentrado no seencontraron diferencias significativas (Cuadro 5).

Los principales problemas que enfrentan losproductores de doble propósito en Sinaloa son:la falta de forraje durante la época seca delaño, la desnutrición del ganado, la degradación(erosión y compactación) de las tierras de usoagrícola y de agostadero, y la baja eficienciaen el uso del agua de lluvia(5). En este sentido,

with these systems of production of meat andmilk in Sinaloa.

Livestock feed

The variables analyzed regarding the nutritionalmanagement showed significant differences(P<0.05) with LCP compared to LCPBP in termsof use of feed, large farms have a rate of 0.16± 0.09 compared to 0.11 ± 0.09 of LCFBP; onepossible explanation is that the later have largeareas of rangeland where to send their cattleto graze. It is worth noting that in this aspectit was found that the use of concentrate showedno significant differences (Table 5).

The main problems facing dual-purpose cattleproducers in Sinaloa are lack of fodder duringthe dry season, livestock malnutrition,degradation (erosion and compaction) ofagricultural land and rangeland, and lowefficiency of rainwater(5). In this sense, theresults show that the use of technologicalinnovations to solve this problem is limited forall the farms, hence it is necessary to generatemechanisms and strategies for disseminationand technology transfer for producers to knowrelated innovations in the use and conservationof fodder.

The results obtained allow authorities, researchers,professional service providers and decision makersto know the different types and characteristicsthat differentiate livestock producers in the dual-purpose cattle production systems of Sinaloa.This can positively impact the definition and

Cuadro 5. Índices de manejo de la alimentación por tipo de explotación

Table 5. Indices of feeding management by type of farm


Fodder 0.13±0.09ab 0.14±0.08ab 0.16±0.09b 0.11±0.09ac 4.427Concentrate 0.09±0.07a 0.10±0.06a 0.11±0.06a 0.09±0.07a 1.604

SCF= Small catlle farms; MCF= Medium catlle farms; LCF= Large cattle farms; LCFBP= Large cattle farms with

business potential.

abc Dissimilar letter in the same row indicate significant difference (P<0.05).

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los resultados obtenidos muestran que el usode innovaciones tecnológicas para solucionaresta problemática son limitadas para el total delas explotaciones ganaderas, por lo que serequiere generar mecanismos y estrategias dedifusión y transferencia de tecnología para quelos productores conozcan innovacionesrelacionadas con el uso y conservación deforrajes.

Los resultados obtenidos permiten tanto aautoridades, investigadores, prestadores deservicios profesionales y tomadores de decisiónconocer los diferentes tipos, así como lascaracterísticas que diferencian a los productorespecuarios en el sistema bovinos doble propósitoen Sinaloa. Lo anterior puede impactarpositivamente en la definición y elaboración depolíticas públicas focalizadas por tipo deproductor a través de: la planificación eimplementación de programas de transferenciatecnológica, reorientación de inversiones yapoyos estatales y federales, definición deacciones y l íneas de investigación,implementación de actividades de extensión ycapacitación con “trajes a la medida”, es decir,con políticas diferenciadas para cada grupo deproductores (individuales u organizados).

Se recomienda que las instituciones de fomentoy apoyo estatal establezcan estrategias dedesarrollo de la ganadería en función de losdiferentes tipos y características de losproductores. En este sentido, la generación depaquetes tecnológicos por tipo de productorpuede permitir una mayor eficiencia de losrecursos involucrados; es claro que existe unaproblemática común en este sistema deproducción, la alimentación en época seca. Sinembargo, para alcanzar un mayor impacto esrecomendable que las estrategias deintervención sean diferenciadas por tipo deproductor, lo que puede potencializar eldesarrollo y adopción de innovacionestecnológicas, puede permitir la focalización ydiseño de estrategias de transferenciatecnológica específicas al nivel de recursos conlos que cuenta el ganadero, su problemática y

development of public policies targeted by typeof producer through: planning and implementationof programs for technology transfer, investmentand reorientation of state and federal support,defining actions and lines of research,implementation of outreach and training that is“tailored to fit”, i.e., with differentiated policies foreach group of producers (individual or organized).

It is recommended that state institutions ofdevelopment and support establish developmentstrategies for livestock depending on thedifferent types and characteristics of producers.In this sense, the generation of technologicalpackages by type of producer can enable greaterefficiency of the involved resources; it is clearthat there is a common problem in thisproduction system, feeding during the dryseason. However, to achieve a greater impactit is advisable that intervention strategies bedifferentiated by type of producer, which havethe potential to develop and adopt technologicalinnovations. This can allow for targeting anddesign strategies that are specific to the typeof technology transfer based on the level ofresources the livestock rancher has, as well ashis problems and requirements, and canenhance regional development. For example,the inclusion of strata with business potentialwith strategies of territorial development throughintegration with other links in the beefproduction chain can be used for generatingpoles of regional development through thecreation of a cluster for production of feedercalves, a product in which Mexico has a deficit.In summary, the results obtained can be usedto improve dual-purpose cattle productionsystems in Sinaloa, as well as in other statesand developing countries with similar conditions.The use of typology for producers in theagricultural sector is a necessary tool for definingpublic policies that consider the various actorsin the rural territory.


Using multivariate analysis techniques clearlyidentified four types of producers in the cattle

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sus requerimientos, y puede potenciardesarrollos regionales. Por ejemplo, la inclusióndel estrato con potencial empresarial enestrategias de desarrollo territorial mediante laintegración con otros eslabones de la cadenaproductiva de carne de bovino puede servirpara la generación de polos de desarrolloregional a través de la generación de un clusterpara la producción de becerros en pie, productoen el que México tiene déficit. En síntesis, losresultados obtenidos pueden ser utilizados parael mejoramiento de la ganadería de doblepropósito en Sinaloa, en otros estados y paísesen desarrollo con condiciones similares. El usode una tipificación de productores en el sectoragropecuario es una herramienta necesaria parala definición de políticas públicas que considerenlos diversos actores del territorio rural.


El uso de técnicas de análisis multivariadopermitió identificar claramente cuatro tipos deproductores en el sistema de producción bovinosdoble propósito: pequeñas explotacionesganaderas (67 %), explotaciones ganaderasmedianas (24 %), explotaciones ganaderasgrandes (7 %), y explotaciones ganaderasgrandes con potencial empresarial (2 %). Lasvariables que resultaron relevantes para suestratificación fueron, el tamaño del hato(medido en número de unidades de animal), lasuperficie dedicada a la ganadería, el índice demanejo general y el índice de uso de forrajesen la alimentación animal. La tipología de lasexplotaciones ganaderas puede ser útil para latoma de decisiones y estrategias diferenciadasde apoyo, así como contribuir a la definición depolíticas públicas. Se observó que existe unbajo nivel de uso y adopción de tecnología, porlo que existe un gran potencial de trabajo enla promoción de modelos de extensión queconsideren los recursos y características de cadatipo de productor para incrementar el uso yadopción de innovaciones tecnológicas queincidan en un mayor bienestar de las familiasque integran el sistema bovinos de doblepropósito en Sinaloa.

production system dual-purpose: small farms(67 %), medium-sized farms (24 %), largelivestock farms (7 %), and livestock farms withgreat business potential (2 %). The variablesthat were relevant to its stratification were, herdsize (measured in number of animal units), thearea devoted to livestock, the rate of generalmanagement and rate of use of forages inanimal feed. The typology of the farms can beuseful for decision-making and differentiatedsupport strategies and contribute to thedefinition of public policies. It was observedthat there is a low level of use and adoption oftechnology, so there is great potential work inpromoting extension models that consider theresources and characteristics of each type ofproducer to increase the use and adoption oftechnological innovations that affect and improvewelfare of the families that make up the dual-purpose cattle farms in Sinaloa.

ACKNOWLEDGMENTS

Thanks to the Specialized Technical Unit forLivestock at INIFAP in Sinaloa for the informationprovided during the 2010-2011 evaluation cycleof the Funding Program, it served as the basisfor this study. As well as the project: Adoptionand impact assessment of the technologyimplemented in dual-purpose cattle systems inMexico. INIFAP fiscal funds, project number21541832011.


AGRADECIMIENTOS

Se agradece a la Unidad Técnica EspecializadaPecuaria del INIFAP en Sinaloa por lainformación proporcionada durante el ciclo deevaluación 2010-2011 del Programa Soporte quesirvió de base para este estudio. Así como alproyecto: La adopción y evaluación del impactode la tecnología implementada en sistemas

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bovinos de doble propósito en México. FondosFiscales de INIFAP, número de proyecto21541832011.

LITERATURA CITADA

1. Villamar AL, Olivera CE. Situación actual y perspectiva de laproducción de leche de bovino en México 2005. CoordinaciónGeneral de Ganadería SAGARPA. México, DF. 2005.

2. Núñez HG, Díaz AE, Espinosa GJA, Ortega RL, HernándezAL, Vera AH, et al. Producción de leche de bovino en elsistema intensivo. Libro Técnico Núm. 23. Veracruz, México:INIFAP. CIRGOC. 2009:373.

3. Urdaneta F, Dios-Palomares R, Cañas JA. Estudio comparativode la eficiencia técnica de sistemas ganaderos de doblepropósito en las zonas agroeconómicas de los municipioszulianos de la Cuenca del Lago de Maracaibo, Venezuela.Rev Cientif FCV-LUZ 2013;23(3):211-219.

4. SIAP. Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera.Cierre de la producción pecuaria por Estado 2014. Secretariade Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca yAlimentación 2014. http://www.siap.gob.mx/ganaderia-produccion-anual. Consultado 3 Mar, 2015.

5. Perales RMA, Fregoso TLE, Martínez ACO, Cuevas RV, LoaizaMA, Reyes JJE, et al. Evaluación del sistema agrosilvopastorildel sur de Sinaloa. Sustentabilidad y sistemas campesinos:cinco experiencias de evaluación en el México rural. MaseraO, López RL editores. México: Edit. Mundiprensa; 2000.

6. FAO. Food and Agriculture Organization of the UnitedNations. Ayudando a desarrollar una ganadería sustentableen Latinoamérica y el caribe: lecciones a partir de casosexitosos. Oficina Regional para América Latina y el CaribeSantiago de Chile. 2008:91.

7. Cuevas RV, Baca MJ, Cervantes EF, Espinosa GJA, AguilarAJ, Loaiza MA. Factores que determinan el uso deinnovaciones tecnológicas en la ganadería de doble propósitoen Sinaloa. Rev Mex Cienc Pecu 2013;4(1):31-46.

8. Herrera D. Metodología para la elaboración de tipología deactores. IICA. 1998. http://orton.catie.ac.cr/repdoc/A7950E/A7950E.PDF. Consultado 15 Nov, 2013.

9. López RP. La construcción de tipologías: metodología deanálisis. Universidad Autónoma de Barcelona. España 1996.h t t p : / / d d d . u a b . c a t / p u b / p a p e r s / 0 2 1 0 2 8 6 2 n 4 8 /02102862n48p9.pdf. Consultado 8 Dic, 2013.

10. Siegmund-Schultze M, Rischkowsky B. Relating householdcharacteristics to urban sheep keeping in West Africa. AgricSyst 2001;67(3):139-152.

11. Castel JM, Mena Y, Delgado-Pertínez M, Camúñez J, BasultoJ, Caravaca F, et al. Characterization of semi-extensive goatproduction systems in southern Spain. Small Ruminant Res2003;47(2):133-143.

12. Da Silva A, Escobar MD, Colmenares O, Martínez C.Aplicación de métodos multivariados en la clasificación deunidades de producción con vacunos de doble propósito enel Norte del estado de Carabobo, Venezuela. Rev CientFCV-LUZ 2003;13(6):471-479.

13. Köbrich C, Rehman T, Khan M. Typification of farmingsystems for constructing representative farm models: twoillustrations of the application of multivariate analyses inChile and Pakistan. Agric Syst 2003;(76):141-157.

14. Castaldo A, Acero R, Perea J, Martos J, Valerio D, Pamio J,García A. Tipología de los sistemas de producción de engordebovino en la Pampa Argentina. Arch Zootec2006;55(210):183-193.

15. CEPAL. Comisión Económica para América Latina y el Caribe.Economía campesina y agricultura empresarial: tipología deproductores del agro mexicano. México. Edit. Siglo XXI; 1982.

16. Ovando RE. Tipificación de la agricultura en México: comoparte de la referencia territorial de una política sectorialdiferenciada. [Tesis maestría]. Tijuana, BC: Colegio de laFrontera Norte; 1998.

17. Sánchez GLG, Solorio RJL, Santos FJ. Factores limitativos aldesarrollo del sistema familiar de producción de leche, enMichoacán, México. Cuad Des Rur 2006;5(60):133-146.

18. Vázquez MI, Zaragoza RJL, Bustamante GA, Calderón SF,Rojas AJ, Casiano VMA. Tipología de explotaciones ovinasen la sierra norte del estado de Puebla. Téc Pecu Méx2009;47(4):357-369.

19. Galaviz RJR, Vargas LS, Zaragoza RJL, Bustamante GA,Ramírez BE, Guerrero RJD, Hernández ZS. Evaluación territorialde los sistemas de producción ovina en la región nor-ponientede Tlaxcala. Rev Mex Cien Pecu 2011;2(1):53-68.

20. Hernández MP, Estrada FJG, Avilés VF, Yong AG, López GF,Donají SMA, Castelán OOA. Tipificación de sistemascampesinos del Sur del Estado de México. Univ y Cienc2013;29(1):19-31.

21. INEGI. Instituto Nacional de Estadística y Geografía.Perspectiva Estadística Sinaloa. México 2011. http://www.inegi.org.mx/est/contenidos/espanol/sistemas/perspectivas/perspectiva-sin.pdf. Consultado 12 Ene, 2015.

22. UTEP-INIFAP. Unidad Técnica Especializada Pecuaria-Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolasy Pecuarias. México 2011. www.utep.inifap.gob.mx.Consultado 17 jul, 2011.

23. Togo JPR, Usandivaras P, Castel JM, Mena Y. Análisis de ladiversidad en los sistemas lecheros caprinos y evaluaciónde los parámetros productivos en la principal cuenca lecherade Argentina. Livest Res Rural Develop 2005;17(1):1-14.

24. Urdaneta F, Materan M, Peña ME, Casanova A. Tipificacióntecnológica del sistema de producción con ganadería bovinade doble propósito (Bos Taurus x Bos indicus). Rev CientifFCV-LUZ 2004;14(3):254-262.

25. Bernués A, Herrero M. Farm intensification and drivers oftechnology adoption in mixed dairy-crop systems in SantaCruz, Bolivia. Span J Agric Res 2008;(2):279-293.

26. Montoya FMD, Espejel GA, Vélez IA, Granados ZL, EspinosaJJA. Caracterización de productores del sistema bovino dedoble propósito por el uso de tecnologías en el estado deChiapas, México. Congreso mundial de ganadería tropical.Tamaulipas, México. 2014.

27. Pérez LC. Técnicas estadísticas con SPSS. España: EdPrentice Hall; 2001.

28. Aluja BT. El análisis de componentes principales, unaaproximación al Data Mining. Barcelona, España: EdicionesUniversidad de Barcelona; 1999.

29. Snedecor GW, Cochran WG. Statistical methods. Iowa: IowaState University Press; 1989.

83


30. Velasco FJ, Ortega SL, Sánchez CE, Urdaneta F. Factoresque influyen sobre el nivel tecnológico presente en las fincasganaderas de doble propósito localizadas en el estado Zulia,Venezuela. Rev Cient FCV-LUZ 2009;19(2):187-195.

31. Holmann F, Rivas L, Carrulla J, Rivera B, Giraldo L, Guzmán S,Martínez M, Medina A, Farrow A. Evolución de los sistemas deproducción de leche en el trópico Latinoamericano y su interrelacióncon los mercados: un análisis del caso Colombiano 2015. http://www.avpa.ula.ve/congresos/seminario_ pasto_X/Conferencias/A13-Federico%20Holmann.pdf. Consultado 20 Feb, 2015.

32. Galindo GG. Uso de innovaciones en el grupo de ganaderospara la validación y transferencia de tecnología “Joachin”,Veracruz, México. Terra 2001;(19):385-392.

33. Rehman T, McKemey K, Yates CM, Cooke RJ, Garforth CJ,Tranter RB, et al. Identifying and understanding factorsinfluencing the uptake of new technologies on dairy farmsin SW England using the theory of reasoned action. AgricSyst 2007;94(2):281-293.

34. Ward EC, Vestal KM, Doye GD, Lalman LD. Factors affectingadoption of cow-calf production practices in Oklahoma. JAgric Apl Econ 2008;40(3):851-863.

35. INEGI. Instituto Nacional de Estadística y Geografía. VIIICenso Agrícola, Ganadero y Forestal. Aguascalientes 2009.http://www.inegi.org.mx/est/contenidos/proyectos/Agro/ca2007/Resultados_Agricola/default.aspx. Consultado 18Ago, 2011.

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PROPIEDADES DE CRECIMIENTO DE LAS LÍNEAS CELULARES DH82 Y RF/6ARev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):85-104

Propiedades de crecimiento de las líneas celularesDH82 y RF/6A bajo condiciones normales de

laboratorio

Growth properties of DH82 and RF/6A cell lines understandard laboratory conditions

Samara Machuca Figueroaa, Gabriela Granjeno Colínb, Sergio Darío RodríguezCamarillob, Carlos Agustín Vega y Murguíab

RESUMEN

La línea celular RF/6A ha sido utilizada en estudios de corto plazo evaluando fármacos o infecciones experimentalescon Anaplasma marginale; en contraste, DH82 es utilizada para la multiplicación de Ehrlichia canis. No obstante, sedesconocen condiciones específicas de su crecimiento, por lo que se diseñaron varios experimentos para resolverinterrogantes de su propagación. Ambas líneas, se adquirieron de la American Type Culture Collection, mantenidasen Medio Mínimo Esencial suplementado con suero fetal bovino, piruvato de Na y NaHCO3 e incubadas en atmósferade 5% de CO2 en aire, a 37 °C. Los primeros ensayos, en placas de 24 pozos, esclarecieron los valores de dosismínima inicial, que fueron 62,500 y 8,836 células/pozo para DH82 y RF/6A; así como los de densidad de siembra;cultivos con concentraciones de 5, 10, 20 y 40 células por mm2, cosechados con solución Tripsina-EDTA al alcanzar>95% de confluencia. Los índices estimados fueron: 3,319.32, 1,956.70, 870.73 y 422.14 para DH82 y 62.38, 63.51,25.31 y 12.16 veces con RF/6A. La cinética del crecimiento, en cajas de Petri de 35 mm Ø, incluyó la siembra de 20células/mm2, cambio del medio cada 63 h y cosecha cada 21 h para DH82; para RF/6A; la siembra fue 10 células/mm2, cambio de medio cada 45 h y cosecha cada 15 h. El máximo crecimiento se observó hasta las 336 y 315 h contiempos de duplicación de 42.9 y 36.9 h respectivamente para DH82 y RF/6A. Los datos permitieron proponer unmodelo patrón de cultivo, para estudios futuros.

PALABRAS CLAVE: Cultivo celular, DH82, RF/6A, Intervalo de duplicación.

ABSTRACT

DH82 Cell line has been utilized to grow Ehrlichia canis and RF/6A for drug evaluation in short-term cultures, as wellas for replicating Anaplasma marginale. However, specific in vitro culture development conditions are unknown.Several experiments were designed to solve inquiries of such procedure. Both cell lines were acquired from ATCC andput into culture. Na Pyruvate, NaHCO3 and fetal calf serum were used to enrich MEM culture media and incubatedat 37 °C on 5% CO2 - air humid mixture atmosphere. First assays used 24 well plates and were focused on determinationof a minimum initial cell concentration and cell density. In the former, averages of 62,500 cell/well for DH82 & 8,836for RF/6A; were found. Later, experiments to identify a minimum cell density started with 5, 10, 20 & 40 cells/mm2,harvesting with a EDTA-Trypsin solution when confluence be reached. Growth indexes of 3,319.32, 1,956.70, 870.73 &422.14 times and of 62.38, 63.51, 25.31 & 12.16 times, were respectively found for DH82 & RF/6A cell lines. Forkinetics studies, 35 mm Ø sterile Petri dishes were used. Cultures were set with 20 cell/mm2 seed density for DH82and 10 cell/mm2 for RF/6A. Dishes were randomly separated into two groups, with and without culture mediaperiodical replacement. Maximum growth was observed at 336 and 315 h with 42.9 and 36.9 h doubling time inculture, respectively for DH82 & RF/6A cell lines. Generated data provided a model to define an in vitro growthpattern for future studies.

KEY WORDS: Cell culture, DH82, RF/6A, Doubling time.

Recibido el 19 de diciembre del 2014. Aceptado el 6 de mayo de 2015.a Universidad Politécnica del Estado de Morelos. México.b Unidad de Anaplasmosis, CENID Parasitología Veterinaria / INIFAP. Carretera Federal Cuernavaca-Cuautla No. 8534, Col. Progreso, C.P. 62550; Jiutepec, Morelos.

México. [email protected]. Correspondencia al último autor.

Resultados parciales para titulación como Ingeniero en Biotecnología del primer autor.

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Samara Machuca Figueroa, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):85-104

INTRODUCCIÓN

El cultivo celular se precisa como la forma depropagar y mantener fuera del organismo, encondiciones in vitro, células de origen animal ovegetal; que pueden formar monocapa omantenerse en suspensión manteniendo susfunciones(1). Las líneas celulares son aquellascélulas que lograron diferenciarse genética ymorfológicamente de las estirpes de las que sederivaron, se han mantenido en cultivoscontinuos y pueden crecer de maneraindefinida(2). La línea celular RF/6A(3) cuyoorigen es el mono Macaca mulatta ha sidoampliamente utilizada tanto en estudiostoxicológicos para evaluar la efectividad dealgunos fármacos(4), así como en infeccionescon la rickettsia Anaplasma marginale debido asus propiedades de células endoteliales(5). Noobstante, los datos publicados son insuficientesdebido a que no se indican condiciones ycaracterísticas específicas de las células encultivo, los ensayos son de corto plazo y susdatos no son homogéneos o sólo muestran elnúmero de pases(6). La línea DH82 se derivade un perro (Canis lupus familiaris) de razaLabrador dorado (Golden retriever) de 10 añosde edad que padecía histiocitosis maligna(6,7,8)

y ha sido utilizada para la multiplicación delmicroorganismo Ehrlichia canis(9,10) y en suinteracción con eritrocitos infectados conAnaplasma marginale(11); recientemente sedescribió una caracterización inmunológicaparcial de la línea celular DH82, en la que seacentuaba la necesidad de generar másinformación relativa a las propiedades de laslíneas celulares(12).

El interés que tiene el Instituto Nacional deInvestigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuariasde conocer las características de propagaciónde estas líneas celulares en cultivo, radica enestablecer un modelo de estudio para el cultivoin vitro de la rickettsia Anaplasma marginale,agente causal de la anaplasmosis bovina,enfermedad que representa un impacto negativopara la economía ganadera de zonas tropicalesde México y el mundo(13,14). Ocupados en dicha

INTRODUCTION

Cell culture is the process by which animal orplant origin cells are propagated and maintainedunder in vitro conditions. Once they have beenremoved from an organism they may form amonolayer or remain in suspension keeping theirfunctions(1). Cell lines are those that becomegenetically and morphologically differentiatedfrom lineages they were derived and aremaintained in continuous culture where theycan grow indefinitely(2). Monkey (Macacamulatta) RF/6A cell line(3) has been widely usedin toxicological studies for the evaluation of theeffectiveness of several drugs(4), as well as ininfections caused by rickettsia Anaplasmamarginale, due to its endothelial cel lproperties(5). However, the published data areinsufficient because they do not indicate specificconditions and characteristics of the cell lines,assays are short-term and their data are nothomogeneous or they only show the numberof passages(6). The DH82 cell line, which derivesfrom a 10-year-old male Golden Retriever (Canislupus familiaris) with malignant histiocytosis(6-8),has been used for the multiplication of Ehrlichiacanis(9,10) and for its interaction witherythrocytes infected with Anaplasmamarginale(11). Recently, a partial immunologicalcharacterization of cell line DH82 was described,which accentuated the need to generate furtherinformation concerning the properties of celllines(12).

The interest of the Instituto Nacional deInvestigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuariasto know about the propagation characteristicsof these cell lines lies in establishing a studymodel for in vitro culture of rickettsia Anaplasmamarginale, causative agent of bovineanaplasmosis, disease that has a negative effecton livestock economy in tropical zones of Mexicoand worldwide(13,14). In that matter, its purposeis to carry out experiments that allow studyingthe behaviour of DH82 and RF/6A cell linesbefore being infected with the microorganism.The objective of the study was to know howboth cell lines grow and develop under standard

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PROPIEDADES DE CRECIMIENTO DE LAS LÍNEAS CELULARES DH82 Y RF/6A

problemática se plantea la realización deexperimentos que nos permitirán estudiar elcomportamiento de las células de las líneasDH82 y RF/6A en cultivo antes de la infeccióncon el microorganismo. El objetivo de lainvestigación fue conocer el crecimiento ydesarrollo de ambas líneas celulares encondiciones normales de laboratorio, para definirun patrón de su comportamiento.

MATERIALES Y MÉTODOS

Líneas celulares: Ambas líneas, DH82 (Canislupus familiaris) y RF/6A (Macaca mulatta),utilizadas en esta investigación se obtuvieroncomercialmente en forma congelada de“American Type Culture Collection” (ATCC), CRL-10389™ y CRL-1780™, respectivamente. Cadauna fue rápidamente descongelada en bañomaría a 37 °C y suspendida en medio mínimoesencial (MEM) según formulación de “Eagle”,con 2.0 mM L-glutamina (Sigma-ALDRICH QUÍMICA,SA. de CV Edo. de México; México. No. de Cat.MO643-10x1L) suplementado con 1.0 mMpiruvato de Na, 1.5 g/l de NaHCO3 y 15 % (v/v) suero fetal bovino inactivado a 56 °C parala línea DH82 (MEM 15i); para RF/6A se utilizó10% (v/v) de suero fetal bovino sin inactivar(MEM 10). Ambas líneas celulares se adicionaronen una columna de 2 mm de altura, equivalentea un volumen de 2 µl/mm2 y mantenidas porpases sucesivos en botellas de 25 cm2

(CORNING Inc. Corning, NY; EE.UU.; No. deCat. 430372), con tapón flojo, hasta el momentode su uso experimental. Tanto en el proceso desu mantenimiento como en los ensayosexperimentales, los cultivos se incubaron a 37°C en una atmósfera de 5.0 % (v/v) de CO2 enaire, saturado de humedad(15).

Experimento de la dosis mínima inicial deDH82

Para dilucidar la cantidad mínima de célulasrequeridas para iniciar los cultivos, se partió deuna concentración de 5.0 x 105 células en su3er pase, suspendidas en 350 µl de medio decultivo completo MEM15i; realizando diluciones

laboratory conditions, in order to define theirbehaviour pattern.


Cell lines: Both lines, DH82 (Canis lupusfamiliaris) and RF/6A (Macaca mulatta), usedin this study were commercially obtained in afrozen form from “American Type CultureCollection” (ATCC), CRL-10389 and CRL-1780™,respectively. Each was quickly thawed in waterbath at 37 °C and suspended in Eagle’sminimum essential medium (MEM), with 2.0mM L-glutamine (Sigma-Aldrich Química, SA deCV Edo. de México; México. No. de Cat. MO643-10x1L) supplemented with 1.0 mM sodiumpyruvate, 1.5 g/L of NaHCO3 and 15 % (v/v)inactivated fetal bovine calf serum at 56 °C forthe DH82 cell line (MEM 15i), and for RF/6A,10 % (v/v) normal fetal calf serum (MEM 10)was used. Both cell lines were added onto acolumn of 2 mm height, equivalent to a volumeof 2 µl/mm2 and maintained by successivepassages in 25 cm2 flasks (CORNING Inc,Corning, NY; EE.UU.; No. of Cat. 430372) withloosen caps, until experimentally used. In theprocess of maintenance and in the experimentalassays, both cultures were incubated at 37 °Cin 5.0 CO2 in air(v/v) atmosphere undersaturated humidity(15).

Minimum seed initial dose for DH82 cell lineassay

For determining the minimum number of cellsrequired to start cultures, a concentration of5.0 × 105 cells (third passage), suspended in350 µl of MEM15i complete cell culture media,was used; performing two-fold dilutions forreducing the inoculum to 2.5 × 105, 1.25 ×105 and 6.25 × 104 cells suspended in 350 µlof MEM15i. Cells were seeded in quadruplicate,inoculating 350 µxl/well, using two 24-well plates(CORNING Inc. Corning, NY; EE.UU. No of Cat.35249). Cell culture media exchange wasperformed every 72 h until harvest. whichoccurred when any of the wells of any treatmentreached ≥ 95% confluence, collecting the

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dobles, para reducir el inóculo a 2.5 x 105,1.25 x 105 y 6.25 x104 células suspendidas en350 µl de MEM15i. Las células se sembraronpor cuadruplicado inoculando 350 µl/pozo,utilizando dos placas de 24 pozos (CORNINGInc. Corning, NY; EE.UU. No. de Cat. 35249).El cambio del medio se realizó cada 72 h, hastael momento de la cosecha. Ésta tendría lugarcuando cualquiera de los pozos de cualquiertratamiento llegara a ≥ 95 % de confluencia,cosechándose la totalidad de los pozos mediantedisgregación enzimática con 180 µl/pozo desolución 1X de Tripsina-EDTA (SIGMA-ALDRICH

QUÍMICA, S.A. DE C.V. Toluca, Edo. de México.No. de Cat. 3924) parando la reacción con unvolumen igual de medio completo con suero,transfiriendo las células a un microtuboeppendorf de 1.5 ml estéril. Se realizó un lavadopor centrifugación a 250 xg durante 15 min atemperatura ambiente (microcentrífuga HERMLEMod. Z230MA), decantando el sobrenadante yresuspendiendo el paquete celular en un volumende 180 µl de medio completo, empleando unagitador de vórtice. La concentración y viabilidadcelular se midió utilizando una muestra de 20µl adicionada con 20 µl de una solución 0.15 %(p/v) de azul de tripano estéril en solución 0.11 Mde NaCl; empleando la cámara de Neubauer®.Para el conteo celular se utilizó un microscopioLeica® de campo claro bajo el objetivo 40X,determinándose los valores promedio, errorestándar e intervalo de confianza al 95 %,aplicando el programa Microsoft Office Excel2007(16).

Experimento de la dosis mínima inicial de RF/6A

Para identificar la cantidad mínima de célulasrequeridas para iniciar un cultivo de RF/6A, secontaron 5.0 x105 células en su pase 543,suspendidas en 350 µl de medio de cultivocompleto MEM10; realizando diluciones doblesseriadas, para tener una suspensión celular de2.5 x 105, 1.25 x 105 y 6.25 x 104, en unaprimera fase. Para la segunda fase, elexperimento se inició con una concentracióncelular de 7.07 x 104 células en su pase 551,

contents of all wells by enzymatic dissagregationusing 180 µl/well of Trypsin/EDTA 1X (Sigma-Aldrich Química, S.A. de C.V. Toluca, Edo. deMéxico. No of Cat. 3924), stopping the reactionwith an equal volume of complete medium withserum and transferring the cells into a sterile1.5 ml Eppendorf tube. Subsequently, they werewashed by centrifugation at 250 xg for 15 minat room temperature (microcentrifuge HERMLEModel Z230MA), decanting the supernatant andresuspending the cell pellet in a volume of 180µl of complete medium, using a Vortex Agitator.Cell viability and concentration was measuredusing a sample of 20 µl mixed with 20 µl of0.15 % (p/v) sterile trypan blue solution in a0.11 M NaCl solution; using the Neubauer®chamber, in a 40X bright-field Leica®microscope. Mean values, standard error and95 % confidence interval, were determined usingMicrosoft Office Excel 2007(16) program.

Minimum seed initial dose for RF/6A assay

For the determination of the minimal numberof cells required to start RF/6A culture, 5.0 ×105 cells in passage 543, suspended in 350 µlof complete culture medium MEM, werecounted; performing two-fold serial dilutions toobtain a cell suspensions of 2.5 × 105, 1.25 ×105 and 6.25 × 104, in a first trial. For a secondtrial, the experiment began with a cellularconcentration of 7.07 × 104 cells in passage551, also performing two-fold serial dilutions toobtain cellular suspensions of 3.53 × 104, 1.77 ×104 and 8.84 × 103 in 350 µl of MEM10, alreadydescribed. For both trials, cells in two 24-wellplates were inoculated in duplicate with 350 µl/well of cell suspension. Cell culture mediaexchange was performed each 48 h, untilharvest, which occurred when cells reached ≥95 % confluence in any well and then thetotality of wells of each phase was collected.For cell count, the monolayer of confluent cellswas disaggregated by enzyme action, using 200µl/well of 1X Tripsyn-EDTA solution. Afterwashed by centrifugation, cell viability andconcentration were determined by trypan blue

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realizando igualmente diluciones dobles seriadaspara obtener una suspensión celular de 3.53 x104, 1.77 x 104 y 8.84 x 103 en 350 µl delmedio MEM10, previamente descrito. En ambasfases, las células se inocularon por duplicadoen dos placas de 24 pozos de 350 µl/pozo dela suspensión celular. El cambio del medio serealizó cada 48 h, hasta el momento de lacosecha, misma que se realizó al observarse ≥95% de confluencia en algún pozo,cosechándose la totalidad de los pozos de cadafase. Para realizar el conteo de células, lamonocapa de células confluente se disgregópor acción enzimática utilizando 200 µl/pozo dela solución 1X de Tripsina-EDTA. Después deun lavado por centrifugación, se determinó laconcentración y viabilidad celular por la exclusiónde azul de tripano, registrándose la descripcióny los valores obtenidos, según lo descrito parael primer ensayo.

Experimento de la densidad de siembra deDH82

El objetivo fue conocer el intervalo de tiempopara alcanzar el máximo crecimiento, iniciandolos cultivos con diferentes concentracionescelulares. Las células en el 4° pase se crecieronpor duplicado en dos placas de 24 pozosadicionando 350 µl/pozo de la suspensióncelular, con una densidad de 5, 10, 20 y 40células/mm2. Como en el primer experimento,el cambio del medio se realizó cada 72 h, hastael momento de la cosecha (≥95 % deconfluencia) en cada tratamiento. Laconcentración y viabilidad celular sedeterminaron por exclusión del azul tripano, deacuerdo a lo ya descrito y se registraron losvalores promedio, error estándar e intervalo deconfianza al 95 %.

Experimento de la densidad de siembra de RF/6A

Las células del pase 547 se crecieron en dosplacas de 24 pozos empleando el mismovolumen, con densidades de 5, 10, 20 y 40células/mm2 por duplicado. El cambio del mediose realizó cada 48 h hasta el momento de la

exclusion, recording obtained values asdescribed in the first assay.

Seed density for DH82 assay

The aim was to know the time interval forreaching maximal growth, initiating the cultureswith different cell concentrations. Fourth-passagecells were grown in two 24-well plates induplicate, adding 350 µl/well of cell suspension,with density of 5, 10, 20 and 40 cells/mm2. Asin the first assay, cell culture media exchangewas performed every 72 h, until all treatmentswere harvested (≥ 95 % confluence). Cellviability and concentration were determined bytrypan blue exclusion, as already described andmean values, standard error and 95 %confidence interval were recorded.

Seed density for RF/6A assay

After 547 passages, cells were grown in two24-well plates using the same volume, withdensities of 5, 10, 20 and 40 cells/mm2 induplicate. Cell culture media exchange wasperformed each 48 h, until harvested, usingthe same criterion for reaching ≥95%confluence. The enzyme disaggregation wasperformed using 200 µl/well of 1X Tripsyn-EDTAsolution, washing the cells by centrifugation.Similarly, viability and number of cells weremeasured by trypan blue exclusion.

Kinetics of DH82 cell line development

Cells were expanded up to passage 6. For thispurpose, a cell suspension was prepared forseeding 64 Costar® Petri dishes - 35 mm Ø ×10 mm height (Corning Inc. Bellerica, NY, EE.UU.No of Cat. 14831), in volumes of 2,000 µl/dish,with a seed density previously determined inthe second assay or third trial(15); in terms of 20cells/mm2 each, and two groups were formed.No cell culture media exchange was done to halfof the dishes (32 units), whereas cell culture mediaexchange was performed in the remaining 32dishes, at regular intervals of 63 h. Each 21 hand until 336 h of initiation of cultures, twodishes of each group were taken at random,

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cosecha, con el mismo criterio de alcanzar≥95 % de confluencia. La disgregaciónenzimática se realizó con 200 µl/pozo de lamisma solución 1X de Tripsina-EDTA, lavandolas células por centrifugación. En forma similar,se midió la viabilidad y número de células,mediante el método de exclusión de azul tripano.

Ensayo de cinética de desarrollo de DH82

Este experimento se inició con una expansióncelular que alcanzó al pase 6. Para ello, sepreparó una suspensión celular suficiente parasembrar con el mismo lote 64 cajas Petri de 35mm Ø x 10 mm alto, marca Costar® (CorningInc. Bellerica, NY, EE.UU. No. de Cat. 14831),en volúmenes de 2,000 µl/caja, con unadensidad de siembra previamente determinadaen los ensayos del tercer experimento(15), entérminos de 20 células/mm2 c/u y se formarondos grupos. A la mitad de las cajas, 32 unidades,no se les hizo cambio de medio alguno, mientrasque a las 32 unidades restantes el cambio demedio se realizó a intervalos regulares de 63 h.Cada 21 h y hasta las 336 h de iniciados loscultivos, se tomaron aleatoriamente dos cajasde cada grupo, cosechando su contenido de lamisma manera ya descrita. Al finalizar, seresuspendió el paquete celular en 300 µl demedio completo y determinando suconcentración y viabilidad, según lo indicadopreviamente, tabulando los resultados comovalores promedio.

Ensayo de cinética de crecimiento de RF/6A

Este experimento se inició con una expansióncelular hasta el pase 551. De la misma maneraque en el experimento previo, se preparó unasuspensión celular suficiente para sembrar 92cajas Petri de 35 mm Ø con el mismo pase, envolúmenes de 2,000 µl/caja, con una densidadde siembra determinada en el cuartoexperimento, igualmente en células/mm2 ydivididos en dos grupos de 46 cajas c/u. A ungrupo no se le hizo cambio de medio. A la otramitad de las cajas, se realizó el cambio demedio a intervalos regulares de 45 h.

harvesting its content as it has already beendescribed. Finally, cell pellets were resuspendedin 300 µl of complete medium and concentrationand viability were determined, as previouslystated; tabulating results as mean values.

Kinetics of RF/6A cell line growth

Cells were expanded up to passage 551. In thesame way as the previous trial, enough cellularsuspension was prepared for seeding 94 Petridishes – dimension 35 mm Ø with the samepassage, in volumes of 2000 µl/dish, with seeddensity determined in the fourth trial, as wellas in cells/mm2 and divided into two groups of46 dishes each. No cell culture media exchangewas done to one group. Cell culture mediaexchange at regular intervals of 45 h wereperformed in the other half of the dishes. Apair of dishes from each group was randomlyharvested each 15 h and until 345 h of initiatingthe culture, culture was processed according tothe aforementioned for harvesting RF/6A cellline, resuspending cell pellet in 300 µl ofcomplete medium, determining its concentrationand viability and tabulating results as meanvalues according to the stated.

Doubling time determination

Using data from earlier trials, doubling timeformula was applied (DT), suggested byATCC(17), which considers the log phase:

DT = T In2 / In(Xe/Xb)

Where T= incubation period= interval [final T –initial T] in hours; Xb= initial value of cellnumber; Xe= final value of cell number.

RESULTS

There were no contamination problems due tostrict management of asepsis, antisepsis andsterilization of components used in the cultureof both cell lines. The morphology observedunder the phase contrast microscope wasapparently normal. Cell number was determinedby total count of live and dead cells.

91


Aleatoriamente se cosecharon un par de cajasde cada grupo, cada 15 h y hasta las 345 h deiniciados los cultivos, procesando su contenidosegún lo señalado anteriormente para cosecharla línea RF/6A, resuspendiendo el paquetecelular en 300 µl de medio completo ydeterminando su concentración y viabilidad,tabulando los resultados como valores promediosegún lo mencionado.

Determinación del intervalo de duplicación

Con los datos de los dos experimentosanteriores, se aplicó la fórmula de intervalo deduplicación (DT) sugerida por el ATCC(17) quetoma en consideración la fase de crecimientologarítmico:

DT = T ln2 / ln(Xe/Xb),

Donde T= tiempo de incubación= intervalo [Tfinal - T inicial] en horas; Xb= valor inicial delnúmero de células; Xe= valor final del númerode células.

Minimum seed initial dose for DH82 cell line

This trial lasted 7 d from day zero, same timeperiod that took the first treatment to reach ≥95 % confluence, which corresponded to theone started with 5.0 × 105 cells, whosemaximum average concentration reached 1.07 ×107 cells, a growth 20.4 times the initialconcentration. The maximum averageconcentrations for the remaining treatmentswere: 4.5 × 106, 2.49 × 106 and 7.38 × 105

cells, which is equivalent to a growth of 18,19.9 and 11.8 times, respectively, for culturesstarted with 2.5 × 105, 1.25 × 105 and 6.25 ×104 cells/well. None of them demonstrated tobe statistically significant. Table 1 shows valuesobtained for growth, standard deviations andupper and lower limits at 95% confidenceinterval (CI95%).

Minimum seed initial dose for RF/6A

The assay had a duration of 10 d in any of the twotrials, in which the first phase of treatment 1

Cuadro 1. Valores obtenidos del ensayo para la determinación de dosis mínima inicial de la línea

celular DH82

Table 1. Minimum seed initial dose values determined for the DH82 cell line

Treatments* 1 2 3 4

n 4 4 4 4

Initial count§ 5.00 x105 2.50 x105 1.25 x105 6.25 x104

Final count† 1.07 x107 4.75 x106 2.61 x106 8.00 x105

SD (±) 9.82 x106 3.82 x106 2.69 x106 8.46 x105

α** 0.05 0.05 0.05 0.05

SE (±) 4.91 x106 1.91 x106 1.35 x106 4.23 x105

Lower limit 1.08 x106 1.01 x106 -2.73 x104 -2.87 x104

Upper limit 2.03 x107 8.49 x106 5.25 x106 1.63 x106

Increment 1.02 x107 4.50 x106 2.49 x106 7.38 x105

Growth rate 20.40 18.00 19.90 11.80

Harvest§§ 7 NA NA NA

* Started with 5.00x105, 2.50x105, 1.25x105 y 6.25x105 cells/well, respectively.

§ Total cells/well.

† Average total cells/well.

SD= Standard deviation; SE= Standard error.

** Alpha value for 95 % confidence interval.

§§ Day to reach > 95 % confluence; NA= Not applicable.

92


RESULTADOS

No se presentaron problemas por contaminacióndebido al estricto manejo de la asepsia,antisepsia y esterilidad de los componentesutilizados en el cultivo de ambas líneas celulares.La morfología observada al microscopio decontraste de fases fue aparentemente normal.El número de células se determinó por el conteototal de células vivas y muertas.

Dosis mínima inicial de DH82

Este experimento tuvo una duración de sietedías a partir del día 0, mismo periodo que tuvoel primer tratamiento en llegar a ≥95 % deconfluencia, que correspondió al iniciado con5.0 x 105 células; cuya concentración máximapromedio alcanzada fue 1.07 x 107 células, estoes un crecimiento de 20.4 veces la concentracióninicial. Las concentraciones máxima promediopara los tratamientos restantes fueron: 4.5 x106, 2.49 x 106 y 7.38 x 105 células, lo queequivale a un crecimiento de 18, 19.9 y 11.8

and the second phase of treatment 5 reached≥95% confluence. It was evident that therewas a decrease in all first phase treatments.The biggest fall, represented by a reduction incell number, occurred in treatment 1, reachinga value of -4.21 × 105 cells, followed bytreatments 2, 3 and 4, with reductions of 1.7 ×105, 5.8 × 104 and 4.5 × 103 total cells. Thesedata, together with statistical variables areshown in Table 2.1. Cell harvesting in the firstassay reached a total of 7.9, 8.0, 6.7 and 5.8 ×104 average cells for treatments 1, 2, 3 and 4,respectively. The second experimental phaseimplemented with lower cell concentration, gavepositive results. The maximum cell concentrationwas obtained in treatment 8, reaching onaverage 1.12 × 105 total cells. Treatments 7, 5and 6 followed the performance of the cellconcentration, obtaining on average 1.03 × 105,8.48 × 104 and 8.35 × 104 total cells. The95 % CI together with the statistical evaluation,which did not result significant, are shown inTable 2.2.

Cuadro 2.1. Valores obtenidos del primer ensayo para la determinación de dosis mínima inicial

de la línea celular RF/6A

Table 2.1. Minimum seed initial dose values determined for the RF/6A cell line in first assay

Treatments* 1 2 3 4

n 4 4 4 4


Final count† 7.90 x104 8.00 x104 6.70 x104 5.80 x104

SD (±) 6.29 x104 8.23 x104 5.29 x104 4.59 x104

α** 0.05 0.05 0.05 0.05

SE (±) 3.14 x104 4.12 x104 2.65 x104 2.29 x104

Lower limit 1.74 x104 -6.54 x102 1.52 x104 1.30 x104

Upper limit 1.41 x105 1.61 x105 1.19 x105 1.03 x105

Increment -4.21 x105 -1.70 x105 -5.80 x104 -4.50 x103

Growth rate -0.84 -0.68 -0.46 -0.07



§Total cells/well.





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veces, respectivamente para los cultivos iniciadoscon 2.5 x 105, 1.25 x 105 y 6.25 x 104 células/pozo. Ninguno de ellos demostró serestadísticamente significativo. En el Cuadro 1se muestran los valores de crecimientoobtenidos, las desviaciones estándar y los límitessuperior e inferior del intervalo de confianza al95 % (IC95 %).

Dosis mínima inicial de RF/6A

El ensayo tuvo una duración de 10 días encualquiera de sus dos fases, en que eltratamiento 1 de la primera fase y el tratamiento5 de la segunda fase, alcanzaron ≥95 % deconfluencia. Fue notorio que en todos lostratamientos de la primera fase, hubo undecremento. La mayor caída representada conuna reducción del número de células se dio enel tratamiento 1 alcanzando un valor de -4.21 x105 células seguido de los tratamientos 2, 3 y4 con reducciones de 1.7 x 105, 5.8 x 104 y4.5 x 103 células totales. Estos datos, junto

Seed density for DH82 cell line

Fourteen days after culture started, the first wellthat reached ≥95 % confluence corresponded tothe inoculum of 40 cells/mm2, followed by theinoculum of 20 cells/mm2 on d 15; d 16corresponded to the inoculum of 10 cells/mm2

and the inoculum of 5 cells/mm2 on d 17. Thehighest average cell concentration at the momentof cell harvesting was obtained with the inoculumof 10 cells/mm2, reaching a value of 3.46 × 106

on d 17, followed by the inoculum started with 20cells/mm2 with 3.08 × 106 on d 15, whereas forinocula of 40 and 5 cells/mm2, counts of 2.9 × 106

were obtained in both on d 14 and 17, respectively.The resulting values of this assay are shown inTable 3, where the standard error and 95 % CIare sown, since the average values of eachtreatment resulted to be statistically non-significant.

Seed density for RF/6A

Cultures began to reach progressive confluencein direct relation to the inoculum density on

Cuadro 2.2. Valores obtenidos del segundo ensayo para la determinación de dosis mínima inicial

de la línea celular RF/6A

Table 2.2. Minimum seed initial dose values determined for the RF/6A cell line in a second assay

Treatments* 5 6 7 8

n 4 4 4 4


Final count† 8.48 x104 8.35 x104 1.03 x105 1.12 x105

SE (±) 5.20 x104 5.11 x104 4.55 x104 4.93 x104

α** 0.05 0.05 0.05 0.05

SE (±) 2.60 x104 2.55 x104 2.27 x104 2.46 x104

Lower limit 3.39 x104 3.34 x104 5.81 x104 6.34 x104

Upper limit 1.36 x105 1.34 x105 1.47 x105 1.60 x105

Increment 1.41 x104 4.81 x104 8.50 x104 1.03 x105

Growth ratio 0.20 1.36 4.81 11.64








94


d 8, 9, 10 and 11, after culture of inocula of40, 20, 10 and 5 cells/mm2 were initiated. Thevalue of the maximum average cell concentrationwas 1.04 × 105 and it was obtained in theinoculum of 10 cells/mm2; the minimum averagevalue of 5.6 × 104 was obtained with 5 cells/mm2, whereas the remaining inocula of 20 and40 cells/mm2 both reached, on average, theintermediate concentration of 9.3 × 104. As inthe previous assay, the resulting values of thisexperiment, were statistically non-significant, asshown in Table 4.

Kinetics of DH82 cell line growth

This assay had a duration of 336 h or 14 d.The lag or adaptation phase lasted 126 h inboth groups. In the first, without cell culturemedia exchange, it reached an average cellconcentration of 47,025; whereas in the secondgroup, with a periodic cell culture mediaexchange, 59,875 total cells, equivalent to a

con las variables estadísticas pueden observarseen el Cuadro 2.1. La cosecha en el primerensayo, alcanzó un total de 7.9, 8.0, 6.7 y 5.8x 104 células totales promedio, respectivamentepara los tratamientos 1, 2, 3 y 4. La segundafase experimental implementada con unaconcentración menor de células, arrojó resultadospositivos. La máxima concentración celularobtenida fue con el tratamiento 8, alcanzandoun total de 1.12 x 105 células promedio.Siguieron en rendimiento, los tratamientos 7, 5y 6, obteniendo respectivamente en promedio1.03 x 105, 8.48 x 104 y 8.35 x 104 célulastotales. El IC95 % junto con la evaluaciónestadística, que no resultó significativa, aparecenen el Cuadro 2.2.

Densidad de siembra de DH82

A los 14 días de iniciado el cultivo se obtuvo elprimer pozo que llegara a confluencia ≥95 %,que correspondió al inóculo de 40 células/mm2,

Cuadro 3. Valores obtenidos del ensayo para la determinación de densidad de siembra de la

línea celular DH82

Table 3. Seed density values determined for the DH82 cell line

Treatments* 1 2 3 4

N 4 4 4 4

Initial count§ 5 10 20 40

Final count† 16,602 19,577 17,435 16,926

SD (±) 1,124.52 3,341.18 5,650.17 1,422.65

α** 0.05 0.05 0.05 0.05

SE (±) 562.26 1,670.59 2,825.09 711.33

Lower limit 15,499.56 16,302.64 11,897.47 15,531.36

Upper limit 17,703.62 22,851.36 22,971.81 18,319.76

Increment§§ 16,596.59 19,567.00 17,414.64 16,885.56

Growth ratio 3,319.32 1,956.70 870.73 422.14

Harvest†† 17 16 15 14






§§ In number of cells/mm2.

†† Day to reach > 95 % confluence.

95


seguido del inóculo de 20 células/mm2 en eldía 15; el día 16 lo fue para el inóculo de 10células/mm2 y el de 5 células/mm2, el día 17.La mayor concentración celular promedio, almomento de la cosecha se obtuvo con el inóculode 10 células/mm2 alcanzando un valor de 3.46x 106 al día 17, seguido del inóculo iniciadocon 20 células/mm2 con 3.08 x 106 al día 15,mientras que para los inóculos de 40 y 5 células/mm2 se obtuvieron cuentas de 2.9 x 106 enambos, a los 14 y 17 días respectivamente. Losvalores resultantes de este experimento seresumen en el Cuadro 3, en el que aparecen elerror estándar y el IC al 95%, ya que los valorespromedio de cada tratamiento resultaron serno significativos estadísticamente.

Densidad de siembra de RF/6A

Los cultivos fueron alcanzando confluenciaprogresivamente en relación directa a ladensidad del inóculo, en los días 8, 9, 10 y 11

density of 49 and 62 cells/mm2, respectively.Log phase lasted until 315 h with a value ofmaximum average cell concentration of 538 250cells per well in the group without cell culturemedia exchange; but in the second one, thelog phase lasted up to 336 h, when a maximumaverage cell concentration reached 1.77 × 106

(1’774,750 cells) and the assay was finished.Maximum densities reached were 559 and 1,845cells/mm2 for treatments with and without cellculture media exchange. Figure 1 shows growthdifferences between both groups, as well asthe log phase and time in culture medium.

Kinetics of RF/6A cell line growth

This assay lasted 345 h, a little bit more than14 d. For both treatments, with or without cellculture media exchange, the adaptation periodhad a duration of 90 h, from which log phasewas observed. This was mild in the first case,reaching its maximum average value of 8.4 ×

Cuadro 4. Valores obtenidos del ensayo para la determinación de la densidad de siembra de

la línea celular RF/6A

Table 4. Seed density values determined for the RF/6A cell line

Treatments* 1 2 3 4

N 4 4 4 4

Initial count§ 5 10 20 40

Final count† 317 645 526 526

SD (±) 118.34 223.70 187.00 431.21

α** 0.05 0.05 0.05 0.05

SE (±) 59.17 111.85 93.50 215.61

Lower limit 200.92 425.88 343.01 103.68

Upper limit 432.87 864.33 709.53 948.86

Increment§§ 311.89 635.11 506.27 486.27

Growth ratio 62.38 63.51 25.31 12.16

Harvest†† 11 10 9 8






§§ In number of cells/mm2.

††Day to reach > 95 % confluence.

96


después del inicio del cultivo a los inóculos de40, 20, 10 y 5 células/mm2. El valor deconcentración celular máxima promedio fue de1.04 x 105 y se obtuvo en el inóculo 10 células/mm2; el valor mínimo promedio de 5.6 x 104

se obtuvo con 5 células/mm2, mientras que losinóculos restantes de 20 y 40 células/mm2,alcanzaron ambos la concentración intermediade 9.3 x 104 en promedio. Como en elexperimento anterior, los valores resultantes deeste experimento, mismos que resultaron serestadísticamente no significativos se resumenen el Cuadro 4.

Cinética de crecimiento DH82

Este experimento tuvo una duración de 336 ho 14 días. La fase de latencia o adaptacióntuvo una duración de 126 h en ambos grupos.En el primero sin cambio de medio, alcanzóuna concentración celular promedio de 47,025;mientras que en el segundo grupo, con cambiode medio periódico, 59,875 células totales,

104 (83,950 cells) after 300 h culture started,equivalent to an average density of 87 cells/mm2. In a similar way, the second treatmentreached its maximum value after 315 h witha maximum average concentration of 6.52 ×105 (651,600 cells), equivalent to an averagedensity of 677 cells/mm2. Further measuresrevealed gradual decrease in cell number.Figure 2 shows growth differences between bothgroups, as well as log phase and time in culturemedium.

Doubling time

Based on data obtained from our experiments,results were tabulated, and shown in Table 5,as follows:

DT DH82 = 42.95 h, equivalent to 42 h 56’real-time.

DT RF/6A = 37.00 h, equivalent to 36 h 59’real-time.

Figura 1. Crecimiento celular comparativo de la línea celular DH82 de origen canino, con y sin cambio de medio de

cultivo, habiendo iniciado el día 0*

Figure 1. Comparative cell growth of DH82 cell line of canine origin, with or without cell culture media exchange,

having started on day 0*

*Cultures started with a density of 20 cells /mm2. Maintained in minimum essential medium (Eagle formulation), with 2.0 mM

L-glutamine supplemented with 1.0 mM sodium pyruvate, 1.5 g/l of NaHCO3 and 15 % (v/v) inactivated fetal bovine serum

at 56 °C. Cell culture media was exchanged every 63 h. The exponential growth time period occurred between 126 and 336 h

after culture.

0

500

1,000

1,500

2,000

0 21 42 63 84 105 126 147 168 189 210 231 252 273 294 315 336

Av

era

ge

ce

ll c

on

ce

ntra

tio

n

(Ce

lls/m

m2)

Hours of culture

DH82 Line

With Without

97


equivalentes a una densidad de 49 y 62 células/mm2, respectivamente. El crecimientologarítmico duró hasta las 315 h con un valorde concentración celular promedio máxima de538,250 células por pozo en el grupo sin cambiode medio; pero en el segundo, la fase logarítmicacontinuó hasta las 336 h, cuando se alcanzó unaconcentración celular máxima promedio de 1.77x 106 (1’774,750 células) y se dio por terminadoel experimento. Las densidades máximasalcanzadas fueron de 559 y 1,845 células/mm2

para los tratamientos sin y con cambio de medio.La Figura 1 ilustra las diferencias de crecimientoentre los dos grupos, así como la faselogarítmica y el tiempo en cultivo.

Cinética de crecimiento RF/6A

Este experimento tuvo una duración de 345 h,un poco más de 14 días. Para ambostratamientos, sin y con cambio de medio, elintervalo de adaptación tuvo una duración de90 h, a partir del cual se observó el crecimiento

DISCUSSION

Characteristics and properties of DH82 cell lineof canine origin and RF/6A line, derived fromRhesus monkey, were defined. Additionally, bothlines behaved very different from each other,which increases the value of this study byhighlighting their inequality. This is to beexpected, since DH82 is myeloid origin,monocyte-macrophage type(6,7), in contrast toRF/6A which is endothelial type(2,5).

For the first DH82 cell line assay, a first dose of5.0 × 105 cells was established, which is twotimes less than 1.0 × 106, with which culturesare traditionally started in 25 cm2 flasks at thelaboratory. For the determination of a dose of6.25 × 104, it was established that cell culturescan be started even at doses 16 times lower.Moreover, cultures started in flasks with the highestdose of 1.0 × 106 have a density of 400 cells perunit area (mm2); in contrast, the ones that arestarted with a lower dose of 6.24 × 104, the

Figura 2. Crecimiento celular comparativo de la línea celular RF/6A de origen mono Rhesus con y sin cambio de

medio de cultivo habiendo iniciado el día 0*

Figure 2. Comparative cell growth of RF/6ª cell line derived from Rhesus monkey, with or without cell culture media

exchange, having started on day 0*

* Cell cultures started with a density of 10 cells /mm2. Maintained in minimum essential medium (Eagle formulation), with 2.0

mM L-glutamine supplemented with 1.0 mM sodium pyruvate, 1.5 g/l of NaHCO3 and 10 % (v/v) fetal bovine serum. Cell

culture media was exchanged every 45 h. The exponential growth time period occurred between 90 and 315 hours after

culture.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195 210 225 240 255 270 285 300 315 330 345

Av

era

ge

ce

ll c

on

ce

ntra

tio

n

(Ce

lls/m

m2)

Hours of culture

RF/6A Line

Without With

98


logarítmico. Éste fue muy leve en el primercaso, alcanzando su valor máximo promedio de8.4 x 104 (83,950 células) a las 300 h de iniciadoel cultivo; equivalentes a una densidad promediode 87 células/mm2. En forma similar, el segundotratamiento alcanzó su valor máximo a las 315 hcon una concentración máxima promedio de6.52 x 105 (651,600 células) equivalentes auna densidad promedio de 677 células/mm2.Mediciones posteriores, revelaron unadisminución paulatina en el número de células.En la Figura 2 se ilustran las diferencias decrecimiento entre los dos grupos, así como lafase logarítmica y el tiempo en cultivo.

Intervalo de duplicación

Con base en los datos obtenidos de los dosexperimentos anteriores, se tabularon losresultados, como se muestra en el Cuadro 5,quedando como sigue:

DT DH82 = 42.95 h equivalentes en tiemporeal a 42 h 56’.

DT RF/6A= 37.00 h equivalentes en tiemporeal a 36 h 59’.

DISCUSIÓN

Se cubrió la expectativa de definir característicasy propiedades de cultivo de las líneas celulares

density is 354 cells per unit area, which is not agreat difference; but that is not indicative of theadvantage for initiating cultures with comparativelyhigh doses. This led to the conclusion that celllines, once adapted to laboratory conditions, shouldbe started based on a density determination, whichwill indicate the dose to be used independently ofthe container size.

Although in the case of RF/6A cell line, whoseinitial assay had the same expectation as theearlier trial, the results were very different. Firstof all, the concentrations previously defined andconsidered high, resulted in limited assayconditions and that is why none of theestablished treatments managed to increasetheir values; on the contrary, they decreased.According to these results, the second phasewas defined, reducing even more the total initialcell concentration to just over 141 times. Thisresult proves that for this cell lineage, the initialdose of seeding inoculum can start from smallerquantities than the traditionally recommended.Likewise, in this assay it is shown that possiblylarge amounts of inoculum failed to adapt underculture conditions, which can be associated withlack of nutrients, enough to satisfy requirementsfor the total population. Although this shouldrather be referred to some key nutrient at themoment of adhesion to the container walls . Itshould be remembered that the selection

Cuadro 5. Valores del desarrollo celular de ambas líneas, empleadas en la fórmula para la determinación del

intervalo de duplicación (DT)§ [16]

Table 5. Cell development values of both cell lines, used in the doubling time (DT) determination formulae [16]

Time (h) Cell densityϕ Doubling time

Cell line Initial* Final§§ Total (Xb) Initial (Xe) Final (DT) Real time

DH82Ψ 126 336 210 62 1,845 42.95 42h56'

RF/6A** 90 315 225 10* 677 37.00 36h59'

§DT= T ln2/ln(Xe/Xb).

ϕ= Cells/mm2.

* Time; hours of culture when log phase initiated.

§§ Time; hours of culture when log phase ended.

Ψ Isolated canine cell line (Canis lupus familiaris).

** Derived from Rhesus monkey fetus (Macaca mulatta).

99


DH82 de origen canino y la línea RF/6A, derivadade un mono Rhesus. Aunado a ello, ambaslíneas se comportaron de manera muy diferenteentre sí, lo que incrementa el valor de estetrabajo, al destacar sus desigualdades. Esto esconforme a lo esperado, ya que DH82 es deorigen mieloide, tipo monocito-macrófago(6,7),en contraste con RF/6A que es de tipoendotelial(2,5).

Para el primer experimento con la línea DH82,se estableció una primera dosis de 5.0 x 105

células, que es dos veces menor a la de 1.0 x106 con la que tradicionalmente se iniciancultivos en botellas de 25 cm2 en nuestrolaboratorio. Con la determinación de la dosisde 6.25 x 104, se resolvió que se pueden iniciarcultivos aún a dosis que son 16 veces menores.Es más, los cultivos que se inician en botellasde cultivo con la dosis mayor 1.0 x 106, tieneuna densidad de 400 células por unidad desuperficie (mm2); en contraste las que se iniciancon la dosis menor 6.24 x 104 la densidad esde 354 células por unidad de superficie, lo queno es en sí, una gran diferencia. Ello tampocoes indicativo de la ventaja de iniciar cultivoscon dosis tan altas, comparativamente. Ellocondujo a definir que las líneas celulares, unavez adaptadas a las condiciones del laboratorio,los cultivos deberán iniciarse con base en unadeterminación de su densidad, la cual indicarála dosis a utilizar independientemente deltamaño del contenedor.

Aunque en el caso de la línea celular RF/6A,cuyo experimento inicial tenía las mismasexpectativas del ensayo anterior, los resultadosresultaron ser muy diferentes. Para empezarlas concentraciones antes definidas yconsideradas altas, resultaron ser limitativas,para las condiciones ensayadas, y es por elloque ninguno de los tratamientos establecidosconsiguió incrementar sus valores, al contrario,disminuyeron. Con esos resultados, entoncesse definió la segunda fase, reduciendo aún másla concentración celular inicial total, hasta pocomás de 141 veces. Con ese resultado secomprueba que para esta estirpe celular, la dosis

criterion to define the end of the experiment isalmost complete confluence. This is a subjectivevisual measurement and it will not always givethe same results, specifically based on its degreeof subjectivity. Areas near the border of thewells seemed not to have same cell density, incomparison to the central areas, where cellsappeared to have more contact between themand more uniform in appearance. As a disparityreflex, the reported by Kasai et al(18) and Shenet al was performed, using 4.8 × 103 and 1.0 ×105 cells per well, in 96-well plates to startRF/6A cell culture, respectively. This representsa difference, with respect to each other, of 20times the concentration. As a result of this, thereliability of the results is in doubt, because atthe moment of starting the cultures with highcell concentrations, these conglomerations willbe sub-optimal for a cell-based assay, becauseinstead of growing and multiplying, theirconcentration decreases.

Based on the experience of the previous assays,seed density trials were designed, initially aimingat determining whether the closeness of the cellsto each other could be a conditioning factor fortheir growth. The initial concentration of 1.0 ×106 cells in culture flasks surface area 25 cm2,is equivalent to a density of 400 cells/mm2. Sothe following pair of trials would be startedwith quantities varying from 80 times less, whichmeans 5 cells/mm2, recorded as treatment 1,up to 10 times less, which is equivalent to 40cells/mm2, described as treatment 4. For thecase of DH82 line, it was found that themaximum growth values reached, in each ofthe treatments, were not statistically differentbetween them, which is interpreted as uniformbut not equal. Partly because the subjectivecriterion of confluence for their harvestingcoincided in all cases with the discrepancy ofinterval that corresponds to the incubationperiod that was indeed different.

With respect to seed density of RF/6A cell lineresults were discordant with the canine originline. Values were much lower, both in cell

100


inicial de inóculo de siembra puede partir decantidades menores a las recomendadastradicionalmente. Igualmente en esteexperimento se refleja que posiblementecantidades de inóculo tan grandes, fallen en suadaptación a las condiciones de cultivo, quepudiesen estar asociadas a una insuficiencia denutrientes para satisfacer a la totalidad de lapoblación. Aunque esto más bien deberíareferirse a algún nutriente clave para elmomento del adosamiento o anclaje a la pareddel contenedor. Cabe recordar que el criteriode elección para definir el término delexperimento es la confluencia casi total. Ello esuna medida subjetiva visual y no siemprearrojará los mismos resultados, basadosprecisamente en su grado de subjetividad. Áreascercanas a los bordes de los pozos, parecíanno tener la misma densidad celular, encomparación con las áreas centrales, en lasque las células aparecen con mayor contactoentre sí, y más uniformes en apariencia. Comoreflejo de la disparidad, tomamos lo indicadopor Kasai et al(18) y Shen et al(19), quienesutilizaron 4.8 x 103 y 1.0 x 105 células por pozo,en placas de 96 pozos, para iniciar cultivo con lalínea celular RF/6A, respectivamente. Ellorepresenta una diferencia entre sí de 20 vecesla concentración. Derivado de lo anterior, quedala duda de la confiabilidad de esos resultados,ya que al iniciar cultivos con altas concentracionescelulares, estas conglomeraciones no seránóptimas para un ensayo celular, pues en lugarde estar creciendo y multiplicándose, suconcentración está disminuyendo.

Con base en la experiencia de los ensayos previos,se diseñaron los experimentos de densidad desiembra, en principio orientados a dilucidar si lacercanía entre sí de las células, pudiera ser unacondicionante para su desarrollo. La concentracióninicial de 1.0 x 106 células en botellas de cultivode 25 cm2, equivale a una densidad de 400células/mm2. Así que para el siguiente par deexperimentos se iniciarían con cantidades quevariaban desde 80 veces menos, esto es 5células/mm2, anotado como tratamiento 1;hasta 10 veces menos, lo que es igual a 40

performance and the required interval to reachconfluence. A simple explanation is that thesize of the cells tended to be greater, indicatedby the density obtained, that in no case it wason average higher than 645 cells/mm2. Likewise,they reached confluence in shorter incubationintervals, because the maximum value reachedwas 11 d. The average growth differs with theinoculum of 5 cells/mm2, although the obtainedwith the other three treatments is notstatistically significant. Considering, as a simpleexplanation, the necessity of cell proximity, beinga cell line of epithelial origin, it would be easierto understand that it is a tissue that requiresa certain degree of organization and structureto operate efficiently(17,18), speculating that thecommunication between cells is favored by beingphysical ly closer together. Monocytes/macrophages expressed in DH82 cell line tendto function individually and cell-cell interactionsare rather with other cell lineages, as antigen-presenting cells would be in the immuneresponse. However, this study does notpretend to compare cell lines used, but ratherdiscover differences with the aim to find theirproperties.

Kinetic assay of DH82 cell line was based onthe use of specific cell density of 20 cells/mm2,which was associated with certain expectations,foreseen beforehand, in terms of reaching theexpected confluence after 15 d in culture. Thiswould confirm our speculation of obtaining apre-established growth, independently of thecontainer’s size. The intermediate samplinginterval of 21 h was based on an arithmeticestimation of generation time, according to thedata calculated (not shown) in the first assay;and based on that estimation, cell culture mediaexchange was proposed every 63 h, which isthree times that period of time. In compliancewith the premise of reaching confluence after15 d, representing 360 h in culture and havingfallen short for one day, since biological materialprepared for it ran out. The individualobservation of the graphs allows to distinguish

101


células/mm2, descrito como tratamiento 4. Parael caso de la línea DH82 se encontró que losvalores máximos de crecimiento alcanzados encada uno de los tratamientos no son diferentesestadísticamente entre sí, lo que se interpretacomo que fueron uniformes aunque no iguales.En parte, porque el criterio subjetivo deconfluencia para su cosecha, fue coincidenteen todos los casos, con la discrepancia delintervalo que corresponde al tiempo deincubación, que sí fue diferente.

En lo que respecta a la densidad de siembra dela línea RF/6A los resultados fueron discordantescon los de la línea celular de origen canino. Losvalores fueron mucho menores, tanto enrendimiento celular, como en el intervalo requeridopara alcanzar la confluencia. Una explicación simplees que el tamaño de las células tiende a sermayor, indicado por la densidad obtenida, que enningún caso fue en promedio mayor a las 645células/mm2. De la misma manera, alcanzaronconfluencia en intervalos de incubación más cortos,pues el máximo valor alcanzado fue de 11 días.El crecimiento promedio alcanzado con el inóculode 5 células/mm2 difiere, aunque no esestadísticamente significativo del obtenido conlos otros tres tratamientos. Considerando, comoexplicación igualmente sencilla, la necesidadde proximidad en las células, ya que esta líneaes de origen endotelial, lo que contribuiría apensar que es un tejido que requiere ciertogrado de organización y estructura, para operareficientemente(17,18), especulando que lacomunicación entre las células se favorece porestar más cercanas entre sí, físicamente. Losmonocitos-macrófagos, que se expresan en lalínea celular DH82, tienden a operar en formaindividual, y sus interacciones célula-célula sonmás bien con otras estirpes celulares, como loserían células presentadoras de antígeno en larespuesta inmune. Sin embargo, este trabajono pretende comparar las líneas celularesutilizadas, sino descubrir sus diferencias paraencontrar sus propiedades.

Los experimentos de cinética de la línea DH82se basaron en el uso de una densidad celular

that the adaptation time period coincided betweenboth treatments, only highlighting the log phase,while it decreased in the group without culturemedia exchange, the same did not occurred inthe group with cell cultured media exchange,which would appear to be growing althoughnot in the same reproductive rate.

Following the same reasoning for the kineticassay for the development of RF/6A line derivedfrom Rhesus macaque, initial seed density of10 cells/mm2 was established to reach theexpected confluence after 10 d or 240 h,independently of the size of the container. Asin the previous assay, the interval of 30 h wascalculated (data not shown), which correspondsto a generation time period, based on dataobtained in the second phase of the initialseeding dose assay. Samplings wereprogrammed every 15 h, considering it as halfof the time between generations. For cell culturemedia exchange, the interval of 45 h wasconsidered, 1.5 times the calculated for thegeneration time period, but very similar to the48 h used in continuous cultures and previousassays. Now, the experience was different, sincecell growth exceeded the expected time periodof 10 d by extending the log phase up to 315 h,equivalent to 13.125 d. Cell density reached atthat date was 677 cells/mm2, similar or closerto 645 cells/mm2 obtained in the seed densityassay after 10 d. This phenomenon is biologicallycompatible with the functionality of the cell line,considering that it is not likely that only onelayer is formed but several layers will pile up,characteristic of the tissue from where this cellline derived(8).

It is globally accepted that in every cell culturethere are adaptation and log phase timeperiods(1). One point this paper emphasizes isthat in both cell lines these assays havedemonstrated a similar behavior on what theadaptation time period refers to, regardless ofwhether or not they received fresh mediaculture, the intervals coincide, since the upsand downs shown (data not shown) at the

102


específica de 20 células/mm2, que estabaasociada a una expectativa determinada, entérminos de alcanzar la confluencia esperadaen un plazo de 15 días, previsto de antemano.Ello confirmaría lo especulado de obtener uncrecimiento preestablecido, sin importar eltamaño del contenedor. El intervalo demuestreos intermedio cada 21 h se basó enuna estimación aritmética de periodogeneracional, según los datos calculados (nomostrados) del primer ensayo; y, con base enesa estimación se propuso el recambio de mediocada 63 h, que es tres veces ese periodo. Elcumplimiento de la premisa de alcanzarconfluencia a los 15 días, representaba 360 hen cultivo, habiendo quedado cortos por undía, cuando se agotó el material biológicodispuesto para ello. La observación individualde los gráficos permite distinguir que el periodode adaptación fue coincidente entre ambostratamientos, sólo destacando la fase decrecimiento logarítmico, que mientras en elgrupo sin recambio de medio, fue declinando,no sucedió lo mismo, para el grupo con cambiode medio, que pareciera seguir creciendoaunque ya no a la misma tasa reproductiva.

Siguiendo el mismo raciocinio para el ensayode la cinética de desarrollo de la línea RF/6Aderivada del mono Rhesus, se estableció comodensidad inicial de siembra 10 células/mm2, paraalcanzar la confluencia esperada a los 10 díaso 240 h, igualmente independientemente deltamaño del contenedor. Como en el ensayoprevio, se calculó (datos no mostrados) elintervalo de 30 h, que corresponde al periodode una generación, con base en los datosobtenidos en la segunda fase del experimentode dosis inicial de siembra. Los muestreos seprogramaron cada 15 h, considerando como lamitad del tiempo entre generaciones. Para elrecambio de medio, se consideró el intervalode 45 h, 1.5 veces el calculado para el periodogeneracional, pero muy similar al de 48 hempleado en cultivos continuos y experimentosprevios. Ahora, la experiencia resultó diferente,puesto que el crecimiento celular rebasó elperiodo esperado de 10 días, al extenderse la

beginning of the previous cultures, on thedefinition of intervals confirm this.

The results of the DT determination weresurprising, because they give the appearanceof being too high. The DT for DH82 of almost43 h, as well as 37 h for RF/6A seem to coincidegiven the culture conditions used. Likewise, theydiffer from the initially calculated doubling timeperiods of 21 and 30 h, respectively. This verifiedinformation could give rise to studies fordecreasing or even increasing its efficiency, usingnew culture medium formulations. MEM is oneof the most commonly used of all cell culturemedia; it has a very simple formulation,compared to the components of other mediachemically defined, such as Medium 199 or RPMI1640, commercially available, for which it wouldbe interesting to perform assays to identify somegrowth-restricting components.

Indirect inference obtained by preparation andstaining of imprints (data not shown) allows toassert that cells from RF/6A lineage arepolymorphic, in contrast to the description ofcells reported by Luna Castro et al(14), whomentioned that RF/6A cells present a mosaicshape. Additionally, it was observed that cellsfrom this cell lineage show different sizes.Nonetheless, cells in general are very big, incomparison with other cell lines, such as BUVECE6E7(15,20) and DH82(7,8), cell lines that areuniform in shape and have an inferior size, incontrast to RF/6A cell line.


Data obtained allowed to generate a cell culturepattern model for further studies. In this wayit will be more practical and simple to predicttimes and dates, for eventually obtaining cellcultures with high degree of confluence on aparticular day. Equally relevant is the finding ofcell cultures that have little growth when theyare started with large number of cells, incontrast to the widespread view that cell culturesshould be started with the largest number ofcells as possible.

103


fase de crecimiento logarítmico hasta las 315 h,equivalente a 13.125 días. La densidad celularalcanzada en esa fecha fue de 677 células/mm2, cantidad similar o cercana a los 645células/mm2 obtenidas en el ensayo de densidadde siembra a los 10 días. Este fenómeno esbiológicamente compatible con la funcionalidadde la l ínea celular, considerando queposiblemente no se forme una sola capa, sinoun poliestrato; característica ésta, del tejido dedonde se derivó esta línea celular(8).

Es universalmente aceptado que en todo cultivocelular existen los periodos de adaptación y decrecimiento logarítmico(1). Este estudio destacaque ambas líneas celulares hayan mostrado uncomportamiento similar en lo que al periodo deadaptación se refiere, pues independientementede que hayan recibido o no, medio de cultivofresco, los intervalos coinciden, ya que losaltibajos mostrados (datos no presentados) alprincipio de los cultivos previos, a la definicióndel intervalo, así lo confirman.

Los resultados de determinación del DTresultaron sorprendentes, pues dan la aparienciade ser muy altos. El DT para DH82 de casi 43 h,así como el de 37 h para RF/6A, parecen sercoincidentes dadas las condiciones de cultivoempleadas. Igualmente difieren de los periodosde duplicación de 21 y 30 h respectivamente,calculados inicialmente. Con esta informaciónverificada se daría pie a estudios paradisminuirlos e inclusive incrementar su eficiencia,mediante el ensayo con nuevas fórmulas demedios de cultivo. El medio utilizado, MEM, esde los que tiene la formulación más sencilla,comparados con los componentes de otrosmedios químicamente definidos, como el Medio199 o el RPMI 1640, accesibles comercialmente;por lo que sería hasta deseable realizar losensayos para identificar algunos componentesque pudieran ser limitantes para su crecimiento.

Inferencias indirectas obtenidas mediante laobtención y tinción de improntas (datos nopresentados), permiten aseverar que las célulasde la estirpe RF/6A son polimórficas; en

contraste a la descripción de las célulasreportada por Luna Castro et al.(14), quienesmencionan que las células RF/6A presentanformas de “mosaico”. Adicionalmente seobservó, que las células de esta línea celularmuestran diversos tamaños. No obstante, lascélulas en general son muy grandes, encomparación con otras líneas celulares, comolo son BUVEC E6E7(15,20) y DH82(7,8), mismasque tienen una forma uniforme y un tamañoinferior al de las células de la línea RF/6A.


Los datos obtenidos permitieron generar unmodelo patrón de cultivo, para estudios futuros.De esta manera será más práctico y sencillo, elpredecir tiempos y fechas, eventualmente paraobtener cultivos con alto grado de confluenciaen un día determinado. Igualmente relevantees el hallazgo de cultivos celulares que tienenpoco crecimiento cuando se inician concantidades grandes de células, en contraste conla opinión generalizada de iniciar con el mayornúmero posible de células.

AGRADECIMIENTOS

Financiado por: INIFAP – Recursos Fiscales,Proyecto No. 14531319812

LITERATURA CITADA

1. Cossío BR, Rojas MC, Miranda ME, Álvarez MJA, FigueroaMJV, Vega YMCA. Cultivo in vitro de células animales y sus

ACKNOWLEDGEMENT

Special thanks to INIFAP-Recursos fiscales forthe financing of Project No. 14531319812.


104


aplicaciones. 1ª ed. Morelos, México: CENID-PAVET / INIFAP;2011.

2. Lou D, Hu F. Specific antigen and organelle expression ofa long-term rhesus endothelial cell line. In Vitro Cell DevBiol 1987;23:75-85.

3. Grigsby JG, Parvathaneni K, Almanza MA, Botello AM,Mondragon AA, Donald MA, Tsin TCA. Effects of tamoxifenversus raloxifene on retinal capillary endothelial cellproliferation. J Ocular Pharma Therap 2011;27(3):225-233.

4. Munderloh U, Lynch MJ, Herron MJ, Palmer AT, Kurtti TJ,Nelson RD, Goodman LJ. Infection of endotelial cells withAnaplasma marginale and A. phagocytophilum. Vet Micro2004;101:53-64.

5. Machuca FS. Implementación de un cultivo de célulasendoteliales de origen primate [tesina licenciatura]. Jiutepec,Morelos: Universidad Politécnica del Estado de Morelos;2014.

6. Dawson JE, Rikihisa Y. Growing Ehrlichia species in acontinuous cell line. US patent 5,192,679; Mar 9, 1993.

7. Wellman ML, Krakowka S, Jacobs RM, Kociba GJ. Amacrophage-monocyte cell line from a dog with malignanthistiocytosis. In vitro Cell Dev Biol 1988;24(3):223-229.

8. Granjeno CG, Machuca FS, Rodríguez CSD, Vega YMCA.Mantenimiento de las líneas celulares RF/6A del monoRhesus y DH82 del perro doméstico. 1ª ed. Morelos, México.CENID-PaVet / INIFAP; [EN PRENSA] 2015.

9. Hegarty BC, Levy MG, Gager RF, Breitschwrdt RF.Immunoblot analysis of the immunoglobulin G response toEhrlichia canis in dogs: An international survey. J Vet DiagInvest 1997;9:32-38.

10. Keysary A, Trevor W, Strenger C, Harrus S. Cultivation ofErlichia canis in a continuous BALB/C mouse macrophagecell culture line. J Vet Diag Invest 2001;13:521-523.

11. Granjeno CG, Machuca FS, Rojas REE, Amaro EI, PreciadoDLTJF, Rodríguez CSD, Vega YMCA. Interacción entre

eritrocitos infectados con Anaplasma marginale y las estirpescelulares permisivas DH82 y RF/6A [resumen]. ReuniónNacional de Investigación Pecuaria. Mérida, Yucatán. 2014:4.

12. Heinrich F, Bono-Contioso V, Stein VM, Carlson R, Tipold A,Ulrich R, et al. Passage-dependent morphological andphenotypical changes of a canine histiocytic sarcoma cellline (DH82). Vet Immunol Immunopathol 2015;163:86-92.

13. Fragoso SH. La anaplasmosis bovina en México. En: VegaYMCA et al. editores. 2º Seminario Internacional deParasitología Animal. Oaxtepec, Morelos. 1993:153-160.

14. Vega YMCA. Actualidad e importancia de las enfermedadescausadas por los hemoparásitos En: Vega YMCA et al.editores. 2º Seminario Internacional de Parasitología Animal.Oaxtepec, Morelos. 1993:144-152.

15. Luna CGS, Rodríguez CSD, Ramírez NP, Preciado DLTJF,Rojas REE, Mosqueda GJJ, Vega YMCA. Cultivo in vitro deAnaplasma marginale en líneas celulares endoteliales. RevMex Cienc Pecu 2010;1(4):373-390.

16. Microsoft® Office Excel 2007: Funciones estadísticas.

17. ATCC. ATCC® Animal Cell Culture Guide, tips and techniquesfor continuous cell lines. https://www.atcc.org/~/media/PDFs/CultureGuides/AnimCellCulture_Guide.pdf Accessed: 29Jan, 2014.

18. Kasai A, Shintani N, Oda M, Kakuda M, Hashimoto H,Matsuda T, Baba A. Apelin is a novel angiogenic factor inretinal endotelial cells. Biochem Biophysical Res Com2004;325(2):395-400.

19. Shen S, Yu H, Chen P, Yin J, Xiong YK. Fatty acids in teashoots (Camellia sinensis (L) O. Kuntze) and their effectson the growth of retinal RF/6A endotelial cell lines. MolNutrition Food Res 2007;51:221-228.

20. Cajero-Juárez M, Avila B, Ochoa A, Garrido-Guerrero E,Varela-Echavarria A, Martínez DLEE, Clapp C. Immortalizationof bovine umbilical vein endothelial cells: a model for thestudy of vascular endothelium. Eur J Cel Biol 2002;81:1-8.

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REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS DE OVINOS DE PELO EN REGIONES TROPICALES DE LATINOAMÉRICARev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):105-125

Requerimientos energéticos de ovinos de pelo enlas regiones tropicales de Latinoamérica. Revisión

Energy requirements of hair sheep in the tropical regionsof Latin America. Review

Alfonso Juventino Chay-Canula, Juan Gabriel Magaña-Monforteb, Mario Luiz Chizzottic,Angel Trinidad Piñeiro-Vázquezb, Jorge Rodolfo Canul-Solísd, Armin Javier

Ayala-Burgosb, Juan Carlos Ku-Verab, Luis Orlindo Tedeschie

RESUMEN

Los ovinos de pelo juegan un papel importante en la producción animal en las regiones tropicales; sin embargo, susrequerimientos nutricionales no se han determinado en la misma medida que los de las razas de lana. Debido a lascondiciones ambientales de las regiones tropicales (clima, calidad y disponibilidad de alimentos), es razonable lahipótesis de que los requerimientos de energía metabolizable (EM) y la eficiencia de utilización de la EM pueden serdiferentes entre los ovinos de razas de pelo y de lana. La información disponible en ovinos de pelo muestra una grandiscrepancia en cuanto a las necesidades de energía. Con base en datos de la literatura disponible para hembrasovinas, el requerimiento de EM para mantenimiento (EMm) fue de 419±129 kJ/kg PC0.75 (media ± desviaciónestándar) y para machos fue 388±123 kJ/kg BW0.75. El requerimiento de energía neta para la ganancia de peso (ENg)varió de 8.75 a 14.06 kJ/g (11.63±1.86 kJ/g). Las eficiencias de utilización de la EM para el mantenimiento (km) yla ganancia de peso (kg) fueron de 0.66±0.023 y 0.42±0.044, respectivamente. Esta revisión también indicó que lainformación es escasa para ovejas adultas en diferentes etapas fisiológicas (mantenimiento, lactancia y gestación).Se requiere más trabajo de investigación con relación a la estimación de las necesidades de energía de los ovinos depelo, con el fin de hacer ajustes a los modelos existentes de alimentación, con el objetivo de predecir la respuestade los animales con la condición que prevalece en los trópicos (tipo de animal, medio ambiente y alimentos disponibles).

PALABRAS CLAVE: Ovinos de pelo, Requerimientos de energía, Trópicos, Mantenimiento, Ganancia, Eficiencia.

ABSTRACT

Breeds of hair sheep play an important role in animal production in tropical regions; however, their nutrientrequirements have not been determined to the same extent as those of wool breeds. Due to the environmentalconditions of the tropical regions (climate, quality and availability of feedstuffs), it is reasonable to hypothesize thatenergy requirements and efficiency of utilization of metabolizable energy (ME) may be different between hair andwool breeds of sheep. Information available on hair sheep shows a large discrepancy regarding energy requirements.Based on available literature data for female sheep, ME requirement for maintenance (MEm) was 419±129 kJ/kgBW0.75 (mean ± standard deviation) and for the male 388±123 kJ/kg BW0.75. The requirement of net energy forgain (NEg) ranged from 8.75 to 14.06 kJ/g (11.63±1.86 kJ/g). The efficiency of ME utilization for maintenance (km)and gain (kg) were 0.66±0.02 and 0.42±0.04, respectively. This review indicated also that information is scarce foradult ewes at different physiological stages (maintenance, lactation, or pregnancy). More work is required regardingestimates of nutrient requirements of hair sheep in order to develop adjustments to existing nutrition models topredict animal’s response under the conditions prevailing in the tropics (animal type, environment and feedstuffsavailable).

KEY WORDS: Hair sheep, Energy requirements, Tropics, Maintenance, Gain, Efficiency.

Recibido el 23 de enero de 2015. Aceptado el 17 de abril de 2015.a División Académica de Ciencias Agropecuarias, Universidad Juárez Autónoma de Tabasco. Carretera Villahermosa-Teapa, km 25, CP 86280. Villahermosa, Tabasco,

México. [email protected]; [email protected]. Correspondencia al primer autor.b Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Yucatán. Mérida, Yucatán, México.c Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG 36571. Brazil.d Instituto Tecnológico de Tizimín. Departamento de Investigación y Posgrado. Tizimín, Yucatán, México.e Department of Animal Science, Texas A&M University, College Station. USA.

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Alfonso Juventino Chay-Canul, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):105-125

INTRODUCCIÓN

La producción ovina en las regiones tropicalesde América Latina y el Caribe ha aumentado enlos últimos años. Los sistemas de producciónen estas regiones se caracterizan por bajaproductividad y las razas empleadas son en sumayoría ovinos de pelo. Desde un punto devista comparativo con razas de lana, las razasde pelo son pequeñas, con una tasa decrecimiento lenta y mala conformación muscular,por lo tanto, éstas se han cruzado para mejorarla tasa de crecimiento(1). Razas de pelo comoDorper y Katahdin muestran altas tasas decrecimiento y se han introducido en sistemasde cría con las razas Pelibuey y Blackbellyutilizadas en México(2).

A pesar de la importancia de las razas de peloen la producción ovina tropical y del mundo,sólo pocos experimentos se han realizado paradeterminar sus requerimientos de energía(3,4,5).Conocer las necesidades de nutrientes y laeficiencia de utilización de los recursosalimenticios es importante para optimizar laproductividad y lograr el comportamientoproductivo esperado(5,6,7). Sin embargo, confrecuencia se publican valores y modelos depredicción de requerimientos, basados en razasde clima templado(5,7,8,9) con resultados en laproducción animal diferentes de lo esperado,así como la incapacidad para predecir elcomportamiento productivo del animal. En estesentido(10) recientemente en ovejas Santa Inêsse ha demostrado la importancia de la utilizaciónde ecuaciones específicas a las condicioneslocales para asegurar que se realicenpredicciones precisas y confiables de consumode materia seca. Además, algunos estudios hanindicado que las razas ovinas de pelo tienendiferentes requerimientos de energía encomparación con las razas de lana, pero estaafirmación se ha basado en datosexperimentales limitados(11).

Por otro lado, el consumo de energía por losovinos se considera como el primer nutrientelimitante para el crecimiento(12). Además, el

INTRODUCTION

Sheep production in the tropical regions of LatinAmerica and the Caribbean has increased duringrecent years. Production systems in thoseregions are characterized by low-inputs, andbreeds employed are mostly hair sheep. Froma comparative standpoint with wool breeds,breeds of hair sheep are small, with a slowgrowth rate and poor muscular conformation,therefore, these have been crossed to improverate of growth(1). Hair breeds such as Dorperand Katahdin show high rates of growth andhave been introduced in breeding schemes withthe Pelibuey and Blackbelly breeds commonlyused in Mexico(2).

In spite of the importance of hair breeds intropical and world sheep production, only fewexperiments have been carried out to assesstheir energy requirements(3,4,5). Knowledge ofnutrient requirements and efficiency of utilizationof feed resources is important to optimizeproductivity and achieve expectedperformance(5,6,7). However, frequentlypublished values and prediction models ofrequirements, are based on breeds fromtemperate environments(5,7,8,9) with results inanimal performance different from what isexpected and the inability to predict animalperformance. In this sense(10) recentlydemonstrated the importance of using specificequations to local conditions to ensure thataccurate and reliable predictions of dry matterintake by Santa Inês sheep are made. Also,some studies have stated that hair sheep breedshave different energy requirements comparedto wool breeds, but this assertion has beenbased on limited experimental data(11).

On the other hand, energy intake by sheep isconsidered to be the first limiting nutrient forgrowth(12). Moreover, insufficient energy supplyto the animal results in slow growth, older ageat puberty, reduced fertility, decreased milkproduction and greater susceptibility tonematodes. In adult animals, when energyintake is lower than that required for

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REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS DE OVINOS DE PELO EN REGIONES TROPICALES DE LATINOAMÉRICA

suministro de energía insuficiente se refleja enlento crecimiento, mayor edad a la pubertad,reducción en fertilidad, menor producción deleche y una mayor susceptibilidad a losnematodos. En animales adultos, cuando laingesta energética es menor que la necesariapara el mantenimiento, el animal utiliza susreservas corporales de energía(13),especialmente de grasa, y cuando esto ocurreen exceso, enfermedades metabólicas comocetosis pueden surgir. Al final de la gestación yprincipio de la lactancia, también se puedepresentar un desequilibrio energético, queinduce al animal a utilizar sus reservasenergéticas corporales para producción deleche(14).

En la actualidad, debido a que los principalesrecursos para la producción animal (tierra, agua)están más limitados en algunas regiones delmundo, la determinación precisa de nutrientesrequeridos por los animales es de sumaimportancia para evitar la pérdida de estosrecursos(12). El NRC(15) incluye ovinos de peloen la base de datos para predecir la gananciadiaria de peso (GDP). El sistema Cornell decarbohidratos y proteína netos para ganadoovino (CNCPS-S, por sus siglas en inglés) o elsistema de nutrición de pequeños rumiantes(SRNS, por sus siglas en inglés)(12,16) han sidoevaluados para la predicción de GDP en ovinosPelibuey(6,17) y GDP y consumo de materiaseca en ovinos Santa Inês(18,19,20) y ajustes adichos modelos han sido propuestos para quesean comparables a los de Pelibuey(6,17). Costaet al(21) informaron que es necesario tener unabase de datos que pueda ser actualizada confrecuencia, por medio de meta-análisis, de talmanera que los modelos desarrollados tenganincorporados datos recientes. Tedeschi et al(12)

concluyen que se requieren más datos quepermitan una mejora en la precisión de losmodelos de predicción basados en el SNRS bajocondiciones de producción diferentes. Sinembargo, la información disponible para ovinosde pelo es escasa y sin actualizar. En México seconoce poco con respecto a sus requerimientospara mantenimiento y ganancia de peso y la

maintenance, the animal uses its own bodyenergy reserves(13), particularly fat and whenthis occurs in excess, metabolic diseases suchas ketosis may arise. At the end of pregnancyand beginning of lactation, there may also occuran energy unbalance which induces the animalto use its own body energy reserves for milkproduction(14).

At present, due to the fact that the mainresources for animal production (land, feed,water) are more limited in some regions of theworld, precise determination of nutrient requiredby the animals is of paramount importance toavoid waste of these resources(12). The NRC(15)

includes hair sheep in the database used topredict daily weight gain (DWG). The CornellNet Carbohydrate and Protein System for sheep(CNCPS-S) or Small Ruminant Nutrition Systems(SRNS)(12,16) have been evaluated for theprediction of DWG in Pelibuey sheep(6,17) andDWG and dry matter intake in Santa Inêssheep(18,19,20), and adjustments to such modelshave been proposed to make them comparableto those of Pelibuey sheep(6,17). Costa et al(21)

reported that it is necessary to have a databasewhich can be updated frequently, by means ofa meta-analysis in such a way that modelsdeveloped have recent data incorporated.Tedeschi et al(12) concluded that it is necessarymore data which allow an improvement to berealized in the precision of prediction modelsbased on the SRNS under different productionconditions. However, the available informationfor hair sheep is scattered and outdated. Verylittlle is known in Mexico regarding metabolizableenergy (ME) requirements of hair sheep formaintenance and weight gain and the efficiencywith which ME is utilized for both physiologicalfunctions. The knowledge of such informationmay help to improve the efficiency of sheepproduction under practical conditions in sheepfarms thus improving farm profitability.

The aim of the present review was to analyzeavailable information on ME requirements andefficiency of its utilization for maintenance andweight gain in hair sheep kept under tropical

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eficiencia con la que la energía metabolizable(EM) se utiliza para ambas funciones fisiológicas.El conocimiento de tal información puede ayudara mejorar la eficiencia de la producción ovinabajo condiciones prácticas en las explotacionesovinas, mejorando la rentabilidad de laexplotación.

El objetivo de la presente revisión fue analizarla información disponible sobre losrequerimientos de EM y la eficiencia deutilización para mantenimiento y ganancia depeso en ovinos de pelo mantenidos bajocondiciones tropicales en América Latina, conel fin de visualizar las áreas potenciales deinvestigación que puedan llevar hacia un mejorconocimiento de los requerimientos nutricionalesde estos ovinos.

Situación de la producción de ovinos de pelo

En los principales países productores de ovinosde América Latina y el Caribe, las razas deovinos y fenotipos son diversos, y se describengeneralmente como “Criollos”, recibiendodiferentes nombres dependiendo de donde esténubicados, y en algunos casos la misma raza senombra de diferentes maneras; por ejemplo elPelibuey o Tabasco se cría en México, en las

conditions in Latin America, in order to visualizepotential areas of research which may leadtowards a better understanding of nutrientrequirement by hair sheep.

Situation of hair sheep production

In the main sheep producing countries in LatinAmerica and the Caribbean, the phenotypes andbreeds of sheep are diverse and they aregenerally described as “Creole”, and receivedifferent names depending on where they arelocated and in some cases the same breed isnamed in different ways, for example thePelibuey or Tabasco breed in Mexico, in theVirgin Islands the Pelo Blanco or Saint Croixbreed, in Tobago West African or Roja Africanabreed are the same. In Brazil there are threebreeds of hair sheep: Morada Nova, SomaliBrasileño and Santa Inês. Table 1 shows thebreeds of hair sheep and their distribution inLatin America. Mature weight by sex of eachbreed was taken from the “Breeds of Livestock”website (www.ansi.okstate.edu/breeds/) of theAnimal Science Department at Oklahoma StateUniversity(15). According to NRC(15), in orderto obtain a more precise prediction of energyrequirements, it is necessary to consider matureweight of the animals, as this is associated

Cuadro 1. Razas de ovinos de pelo y su distribución en América Latina

Table 1. Breeds of hair sheep and their distribution in Latin America

Breed Other names MW (kg) Distribution

Male Female

Africana Pelona, Camura, Red African, Rojo Africana,

Colombian Wooless, West African - - Colombia and Venezuela

Blackbelly Barriga negra 60 32-44 Mexico, Caribbean

Dorper - 60 Mexico and Brazil

Katadhin - 70-90 55-70 Mexico, Dominican Republic, Haiti

Morada Nova - 40 30 Brazil

Pelibuey Carnero de pelo de buey, Cuban hairy, Cubano rojo,

Peligüey, Tabasco 54 34 Cuba, Mexico and Caribbean

Rabo largo - - - Brazil

Santa Inês - 80-100 60-70 Brazil

Somali Brasileño Somali Brasileiro, Rabo gordo - - Brazil

St. Croix Virgin Island White, White Virgin Islander, White Virgin Island 100 35-45 British Islands, Virgin Islands, in the Caribbean

MW= Mature weight, taken from the web site: www.ansi.okstate.edu/breeds/.

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Islas Vírgenes las razas Pelo Blanco o SaintCroix, en Tobago la raza Roja Africana y WestAfrican son las mismas. En Brasil hay tres razasde ovinos de pelo: Somalí Brasileño, MoradaNova y Santa Inês. El Cuadro 1 muestra lasrazas de ovinos de pelo y su distribución enAmérica Latina. El peso adulto por sexo decada raza se tomó de la página Web de “Razasde ganadería” (del www.ansi.okstate.edu/breeds/) del Departamento de Ciencia Animalde la Universidad del estado de Oklahoma(15).Según la NRC(15), para obtener una predicciónmás precisa de las necesidades energéticas, esnecesario considerar el peso adulto de losanimales, ya que éste está asociado con lacomposición del tejido retenido según elporcentaje de peso adulto del animal, que varíaentre razas y genotipos. En ovinos, se hareportado que los requerimientos de EM paramantenimiento disminuyen conforme el animalva creciendo, que está relacionado con laproporción obtenida del peso adulto(15).

Requerimientos de energía paramantenimiento y crecimiento

Para la creación de la base de datos, se realizóuna revisión de literatura con Science Direct

with composition of the retained tissuedepending on the percentage of mature weightof the animal, which varies among breeds andgenotypes. In sheep, it has been reported thatME requirements for maintenance decrease asthe animal gets older, which is related with theproportion achieved of mature weight(15).

Data on energy requirements for maintenanceand growth of hair sheep

A literature review using the Science Direct(http://www.sciencedirect.com/), and GoogleScholar (http://scholar.google.com/) searchengines was conducted to create a database,and papers published in the scientific literaturewere obtained from journals such as: TecnicaPecuaria en Mexico, Brazilian Journal of AnimalScience, Ciência Agrotecnica, Small RuminantResearch, Semina: Ciências Agrárias and ItalianJournal of Animal Science. The method bymeans the ME requirement for maintenanceand growth was estimated is also presented inTable 2. It can be appreciated that the workcarried out with hair sheep was performed withregression and comparative slaughtertechniques; different to what has been done

Cuadro 2. Descripción de la base de datos utilizada en esta revisión

Table 2. Description of the database used in this review

Author N Breed Method Country Sex and physiological stage Range LW (kg)

(3) 24 Pb CS Mexico Male, growing 29.6 ± 1.58

(40) 40 Ra x Pb REG2 Mexico Castrated male and growing ewes, grazing 13.5 ± 0.80

(4) 17 SI CS Brazil Castrated male, growing lambs 20 to 35

(38) 13 SI CS Brazil Male, growing 15 to 45

(8) 30 MN CS Brazil Male, growing 15 to 25

(32) 1112 Pb REG1 Mexico Male, growing 21.6 to 34.9

(32) 192 Pb REG1 Mexico Female, growing and beginning of pregnancy. 27.7 to 34.0

(7) 32 SI CS Brazil Castrated male, growing, grazing 15.8 to 30

(31) 22 Pb CS Mexico Adult females 35 to 37

(18,22) 24 SI CS Brazil Male, growing 12.35 to 30.30

(34) 48 MN CS Brazil Male, growing 12.5 to 25.9

(20) 35 SI CS Brazil Male, growing 14.77 to 28

(30) 84 1/2 Do × 1/2 SI CS Brazil Male growing lambs 18.0 to 45

(26) 48 BS CS Brazil Male growing lambs 13.47 to 28.71

Pb= Pelibuey; Ra= Rambouillet; SI= Santa Inês; MN= Morada Nova; Do= Dorper; BS= Brazilian Somali.

CS= Comparative slaughter; REG1= Regression of ME intake on changes in live weight, in experiments published in the literature; REG2= Regression of ME intake on changes in live

weight (with original data from the experiments).

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(en http://www.sciencedirect.com/) y motoresde búsqueda de Google Scholar (del http://scholar.google.com/) así como artículospublicados en la literatura científica de revistastales como: Técnica Pecuaria en México, RevistaBrasileña de Zootecnia, Ciência Agrotecnica,Small Ruminant Research, Semina: CiênciasAgrarias y Revista Italiana de Ciencia Animal.El método por el cual se estimó la EM requeridapara mantenimiento y crecimiento también sepresenta en el Cuadro 2. Se aprecia que eltrabajo realizado con ovinos de pelo se harealizado con regresión y técnicas de sacrificiocomparativo; lo que difiere a lo realizado conovinos de lana, en los cuales sus necesidadesde energía se han obtenido básicamente contécnicas calorimétricas(23-26). Hay que iniciartrabajos calorimétricos con ovejas de pelo enlas regiones tropicales para validar los datosobtenidos por regresión y técnicas de sacrificiocomparativas.

Requerimientos de energía y eficiencia en lautilización de EM para mantenimiento

Los costos de energía para el mantenimientorepresentan entre el 60 y el 80 % del total deenergía consumida por rumiantes(25). Losrequerimientos de energía y en particular losde mantenimiento (Em), así como la eficienciade utilización del alimento y la energía contenidaen los tejidos (adiposo, muscular) en el ganado,ha sido un tema de investigación durante variasdécadas(25,27). El requerimiento de EM paramantenimiento (EMm), puede ser comparadoal llamado “metabolismo basal” (en su mayoríautilizado en la alimentación humana), y se definecomo la cantidad de energía que el animalnecesita para mantener los procesos vitales(funciones [corazón, pulmón, renal, nervioso,“trabajo”] y las funciones celulares [grasa yproteína; intercambio de iones de Na/K]) delcuerpo en condiciones normales. En la práctica,el EMm podría definirse como el estado en elque el animal no sufre cambios en sucomposición corporal(9,23). También se hadefinido como el estado en que el consumo deEM (CEM) no resultará en pérdidas o ganancias

with wool sheep, since the energy requirementsof these sheep has been obtained basically withcalorimetric techniques(23-26). There is a needto initiate calorimetric work with hair sheep intropical regions to validate the data obtainedby regression and comparative slaughtertechniques.

Energy requirements and efficiency of MEutilization for maintenance (km)

Energy costs for maintenance represent between60 and 80 % of total energy consumed byruminants(25). Energy requirements and inparticular those for maintenance (Em), as wellas the efficiency of feed utilization and theenergy contained in tissues (adipose, muscular)in cattle has been a research subject duringseveral decades(25,27). The requirement ofmetabolizable energy (ME) for maintenance(MEm), can be equated to the so-called “basalmetabolism” (mostly used in human nutrition)and is defined as the amount of energy thatthe animal needs in order to maintain vitalprocesses (basic functions [heart, lung, kidney,nervous, “work”] and cellular functions [fat andprotein turnover; Na/K ion pump]) of the bodyunder normal conditions. In a practical way,the MEm could be defined as the state in whichthe animal does not suffer changes in its bodycomposition(9,23). It has also been defined asthe state in which ME intake (MEI) will notresult in loses or gains of energy (RE) in theanimal body tissues; Ferrell and Oltjen(28) definethis unit as, MEm= MEI at which RE= 0; or HP(heat production)= MEI.

Among the factors which influence Em: bodyweight (BW), breed, sex, physiological condition,nutritional level, environmental conditions,stress, exercise, or physical activity andparasitism can be listed(9,15). The efficiency ofutilization of MEm (km) represents that fractionof ME which can be converted to net energy(NE), to support maintenance requirements ofthe ruminant. The fraction which is no convertedto NE is lost as heat increment including

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de energía (ER) en los tejidos del cuerpo animal;Ferrell y Oltjen(28) definen esta unidad como,EMm= CEM en el que ER= 0; o PC (producciónde calor) = CEM.

Entre los factores que influyen en el Em sepueden mencionar: peso corporal (PC), raza,sexo, estado fisiológico, nivel nutricional,condiciones ambientales, estrés, ejercicio oactividad física y parasitismo(9,15). La eficienciade la utilización de EMm (Km) representa lafracción de EM que se puede convertir en energíaneta (EN), para soportar los requerimientos demantenimiento de los rumiantes. La fracciónque no se puede convertir a EN se pierde comoel incremento de calor incluyendo fermentaciónen el tracto gastrointestinal y reacciones

fermentation in the gastrointestinal tract andbiochemical reactions at the cellular level(29).The efficiency of energy utilization of feedstuffshas an economic impact, and the best way todetermine it is by means of feed conversionefficiency(27,30).

Table 3 shows estimations of ME and NErequirements for maintenance (MEm and NEmrespectively) and Table 4 shows efficiencies ofME utilization for maintenance (km) estimatedin hair sheep of different breeds under tropicalconditions of Latin America.

It is important to point out that for the case ofewes, in the present review only twoexperiments were found which were related to

Cuadro 3. Requerimientos energéticos para mantenimiento estimados en ovinos de pelo en condiciones tropicales de

América Latina

Table 3. Energy requirements for maintenance estimated in hair sheep in tropical conditions of Latin America

Sex, breed and Relationship Requirement

physiological stage BW/EBW MEm (kJ/kg EBW0.75) MEm (kJ/ kg BW0.75) NEm (kJ/ kg EBW0.75) NEm (kJ/ kg BW0.75) Reference

Females:

Pb growing ewes and

at early pregnancy - - 327 - - (32)

Pb adults ewes 1.19 606 510 - - (31)

Mean 1.19 606 419 - -

Minimum value - - 327 - -

Maximum value - - 510 - -

Standard deviation - - 129 - -

CV, % - - 30.9 - -

Males:

Growing Pb - - 490 - - (3)

Growing SI castrated 1.18 - 465 - 308 (4)

Growing MN 1.27 328 258 220 (8)

Growing Pb - - 598 - - (32)

Growing SI 1.24 365 294 257 - (18)

Growing SI castrated - - 470 310 (7)

MN - - 270 219 - (34)

SI growing males - 329 267 - - (20)

1/2 Do × 1/2 SI - - 471 - 300 (30)

BS lambs 1.23 363 295 240 - (26)

Mean 1.23 343 388 234 306

Minimum value 1.18 328 258 219 300

Maximum value 1.27 365 598 257 310

Standard deviation 0.04 19.0 123 18.34 5.3

CV, % 3.04 5.53 31.78 7.84 1.73

Pb= Pelibuey; Ra= Rambouillet; SI= Santa Inês; MN= Morada Nova; Do= Dorper; BS= Brazilian Somali.

CV= Coeficient of variation.

112


bioquímicas a nivel celular(29). La eficiencia deutilización de la energía de los alimentos tieneun impacto económico, y la mejor manera dedeterminarla es por medio de la eficiencia de laconversión alimenticia(27,30).

El Cuadro 3 muestra las estimaciones derequerimientos de EM y EN (EMm y ENmrespectivamente) y el Cuadro 4 muestra laseficiencias de util ización de EM paramantenimiento (Km) en ovejas de pelo dediferentes razas en condiciones tropicales deAmérica Latina. Es importante señalar que parael caso de las ovejas, en la presente revisiónsólo se encontraron dos experimentos queestaban relacionados con esta información(31,32)

y la media (± desviación estándar) de EMm fue419 ± 129 kJ/kg PC0.75; esta información debetomarse con reserva, ya que proviene de unnúmero reducido de observaciones. En estesentido, Chávez et al(33), encontraron quesuministrando 506 PC0.75 kJ/kg para ovejasPelibuey durante los primeros 100 días degestación y 700 kJ/kg PC0.75 durante los últimos50 días de gestación era suficiente para que lasovejas aumentaran de peso (36 g/díaaproximadamente). Junto con esto, informaronque para la lactancia, el suministro de 1,000kJ/kg PC0.75 fue suficiente para que las ovejasobtuvieran 4 a 20 g/día, producción de 700a 800 ml de leche y ser capaces de sostenerun aumento de peso en sus corderos de 200g/día.

Para machos en crecimiento, se utilizaron datosde nueve experimentos que involucraban lasrazas Pelibuey(3,32), Santa Inês(4,18,20), MoradaNova(8,34), 1/2 Dorper × 1/2 Santa Inês(30) ySomalí Brasileño(26). El valor medio encontradoen el presente experimento para EMm fue 388± 123 kJ/kg PC0.75; sin embargo, estos datosmostraron un relativamente alto coeficiente devariación de 31.8 %, el cual puede atribuirse adiferencias entre experimentos, genotipos ycruces, entre otros factores.

En varios experimentos(8,20,22,26,34) los valoresde EMm (kJ/kg PC0.75) se derivan de la relación

this information(31,32) and the mean value (±standard deviation) for MEm was 419 ± 129kJ/kg BW0.75. This information must be takenwith reserve since it comes from a reducednumber of observations. In this sense, Chávezet al(33), found that supplying 506 kJ/kg BW0.75

to Pelibuey ewes during the first 100 d ofpregnancy and 700 kJ/kg BW0.75 during thelast 50 d of pregnancy was enough for theewes to gain weight (36 g/d approximately).Along with this, they reported that for lactation,the supply of 1,000 kJ/kg BW0.75 was enoughfor the ewes to gain 4 to 20 g/d, producing700 to 800 ml of milk and be able to sustaina weight gain by their lambs of 200 g/d.

For growing male sheep, data from nineexperiments were used which involvedPelibuey(3,32), Santa Inês(4,18,20), MoradaNova(8,34), 1/2 Dorper × 1/2 Santa Inês(30)

and Brazilian Somali lambs(26). The mean valuefound in the present experiment for MEm was388 ± 123 kJ/kg BW0.75; however, this datashowed a relatively high coefficient of variationof 31.8 %, this variation can be attributed todifferences between experiments, genotypes,and crosses, among several other factors.

In several experiments(8,20,22,26,34) the valuesfor MEm (kJ/kg BW0.75) were derived from therelation of BW/EBW and using the km reportedby these authors. In relation to MEm, in growingSanta Inês sheep, some authors(4,20) report amean value for MEm of 342 (±107) kJ /kgBW0.75. For Morada Nova sheep(8,34) an averageMEm of 264 (±8.23) kJ/kg; for Pelibuey(3,32),a mean value of 544 (±76.4) kJ/kg. Whileothers(26,30) reported only values available for1/2 Dorper × 1/2 Santa Inês and BrazilianSomali lambs (Table 3).

In relation to km, it was found an averagevalue of 0.70(18). An average value of 0.67 wasreported(8) when estimating km in diets withforage proportions of 40, 55 and 70(4,7,20); inSanta Inês growing males reported a km valueof 0.66. Recently(30) it was found a km of 0.63in 1/2 Dorper × 1/2 Santa Inês lambs. The

113


entre PC/PCV y usando el Km reportado porestos autores. En relación con el EMm, en ovejasSanta Inês en crecimiento, a lgunosautores(4,20) informan un valor medio de EMmde 342 (±107) kJ/kg, y para Morada Nova264 (±8.23) kJ/kg(8,34). En el caso dePelibuey(3,32), un valor medio de 544 (±76.4)kJ/kg. Mientras que otros autores(26,30)

informan sólo valores disponibles para corderos1/2 Dorper × 1/2 Santa Inês y Somalí Brasileño(Cuadro 3).

En relación con Km, se encontró un valorpromedio de 0.70(18). Un valor promedio de0.67 fue reportado(8) cuando Km se estimó endietas con proporciones de forraje de 40, 55 y70 %(4,7,20); en machos en crecimiento SantaInês se registró un valor de 0.66. Recientemente(30)

se encontró un Km de 0.63 en corderos 1/2Dorper x 1/2 Santa Inês. El valor medio de Kmen la presente revisión fue de 0.66. En esterespecto, cuando la EM de las dietas de calidadmedia (como los utilizados en los trópicos) seutil iza con una baja eficiencia paramantenimiento y ganancia, Km es relativamentemayor en comparación con Kg(29). Además, esteautor reportó que Km podría considerarse enpromedio como 0.60 independientemente de ladieta; esto se aproxima al valor promedio deeste trabajo, que fue de 0.66 (Cuadro 4).

La falta de información es más evidente para elcaso de las ovejas, ya que existen muy pocosinformes sobre la determinación de lasnecesidades energéticas en sus diferentes etapasfisiológicas (mantenimiento, gestación,lactancia), siendo estos componentesfundamentales de los sistemas de producción.Además, se sabe que la alimentación de lasovejas antes y después de parto tiene un efectosobre la supervivencia y crecimiento de las crías.Por lo tanto, es necesario continuar con lostrabajos que se centren en la determinación delas necesidades de nutrientes de ovinos de peloy desarrollar un sistema de alimentación basadoen las características de la ración, raza ycondiciones ambientales que prevalecen en los

mean value for km in the present review was0.66. In this respect, even when ME of dietsof medium quality (such as those commonlyused in the tropics) is utilized with a lowefficiency for maintenance and gain, km isre lat ively higher compared to kg(29).Furthermore, this author reported that km couldbe considered on average as 0.60 independentlyof the diet. This approximates to that foundin this work, where an average km value of0.66 was obtained (Table 4).

Lack of information is more evident for thecase of ewes, for which there are very fewreports regarding determination of energyrequirements in their different physiologicalstages (maintenance, pregnancy, lactation),being these fundamental components of theproduction systems. Furthermore, it is knownthat feeding of ewes before and after parturitionhas an effect on survival and growth of theoffspring. It is thus necessary to continue withwork focused on the determination of thenutrient requirements of hair sheep and developa feeding system based on characteristics ofthe ration, breed and environmental conditionsprevailing in Latin American tropics. Rationformulation with precise knowledge of theenergy requirements of hair sheep and theconcentration of ME (and its efficiency ofutilization), of the feedstuffs available in the

Cuadro 4. Eficiencia de utilización de la EM para

mantenimiento (km) en ovinos de pelo

Table 4. Efficiency of utilization of ME for maintenance

(km) in hair sheep

Breed or genotype km Reference

Morada Nova growing males 0.67 (8)

Santa Inês growing males 0.70 (18)


Santa Inês castrated males, growing, grazing 0.66 (7)


1/2 Dorper × 1/2 Santa Inês 0.63 (30)

Mean 0.66

SD 0.023

CV (%) 3.39

SD= Standard deviation; CV= Coefficient of variation.

114


tropics, will have an influence on improvementin sheep production, by giving sheep the preciseamount of feed that require without over orunder estimating its requirements nor the energyvalue of feedstuffs. Ration formulation for sheepbased on the precise knowledge of theirrequirement for maintenance and production,will contribute to reduce production costs, sincethere would probably be a lower waste (asheat increment) arising from ME absorbed fromthe GIT. Knowledge of energy requirements ofhair sheep for the different physiological stages(maintenance, growth, pregnancy and lactation),is of paramount importance since these couldbe readily incorporated in different programsfor ration formulation (CNSPS-S/SRNS) and withthese, formulates rations that will satisfy theenergy requirements of hair sheep kept undertropical conditions.

Energy requirements for weight gain andestimated kg

The energy requirement for growth or weightgain (MEg or NEg), corresponds to the caloricvalue or gross energy of the protein and fatstored in the bodyl(23). The ARC(23) mentionedthat rate of growth affects protein depositionwhich in turn affects NE requirements.Composition of weight gain, expressed as emptybody weight (EBW), is the main determinant ofenergy requirements for weight gain, which isestimated from energy retained in the body(15).Moreover, the main factor determining thecomposition of gain in the mature stage, inwhich as the animal is closer to its adult weight,more fat (and energy) is stored in the gain.

Ferrell and Oltjen(28) reported that ME in theration is used with different efficienciesdepending on the type of ration (ingredients),level of intake and the physiological functionfor which it is being utilized by the animal.Tolkamp(29) reported that kg for rations of lowto medium quality (such as those of tropicalforages), is expected to be low. Tedeschi et al(35)

mentioned that there are factors which mayaffect kg, pointing out that ration (energy density

trópicos de América Latina. La formulación dedietas con conocimiento preciso de lasnecesidades de energía de ovinos de pelo y laconcentración de EM y la eficiencia de utilización,de los alimentos disponibles en los trópicos, tendráuna influencia en la mejora en la producción,dándole a los ovinos la cantidad exacta de alimentoque requieren sin sobreestimar o subestimar susnecesidades ni el valor energético de los alimentos.La formulación basada en el conocimiento precisode sus necesidades de mantenimiento yproducción, contribuirá a reducir los costos deproducción, ya que probablemente habría menorresiduos (como el incremento de calor) derivadosde la EM absorbida desde el tracto gastrointestinal.El conocimiento de las necesidades energéticasde las oveja de pelo para las diferentes etapasfisiológicas (mantenimiento, crecimiento,embarazo y lactancia), es de suma importancia,ya que estos podrían incorporarse fácilmenteen los diferentes programas de formulación dedietas (CNSPS-S/SRNS), para satisfacer losrequerimientos de energía de los ovinos de pelo,en condiciones tropicales.

Requerimientos de energía para ganancia depeso y Km estimado

El requerimiento de energía para crecimiento oganancia de peso (EMg o ENg), corresponde alvalor calórico o energía bruta de la proteína ygrasa almacenadas en el cuerpo del animal(23).El ARC(23) menciona que la tasa de deposiciónde proteína afecta el crecimiento, que a su vezafecta los requerimientos de EN. La composiciónde la ganancia de peso, expresado comoaumento de PCV (ganancia de PCV), es elprincipal factor determinante de las necesidadesenergéticas de ganancia de peso, que se estimade la energía retenida en el cuerpo(15). Porotra parte, el principal factor para ladeterminación de la composición de la gananciaen la etapa de madurez, en la que el animalestá más cercano de su peso adulto, más grasa(y energía), es almacenamiento en la ganancia.

Ferrell y Oltjen(28) informaron que la dieta seutiliza con diferente eficiencia dependiendo deltipo de ración (ingredientes), nivel de consumo

115


y la función fisiológica en que está siendoutilizada por el animal. Tolkamp(29) informó quepara raciones de baja a mediana calidad (comolos de forrajes tropicales), se espera una Kgbaja. Tedeschi et al(35) mencionan que hayfactores que pueden afectar Kg, señalando quela ración (densidad de energía y proporciónmolar de los ácidos grasos volátiles) y lacomposición de la ganancia de peso, son lascuestiones más importantes; estos autoresconcluyeron que el uso de una combinación dela composición química del cuerpo y laconcentración de energía de la ración, puedeser un mejor enfoque para la evaluación de laeficiencia de la utilización de EM para elmantenimiento y crecimiento. Al respecto,algunos investigadores, demostraron que elfactor principal que afecta Kg es la composiciónde la ganancia en la PCV(36,37); incluso cuandoel nivel de EM interfiere con Kg, una ración conuna alta concentración de EM inducirá uncontenido alto de grasa en la ganancia.

En otros trabajos(36,37) estos autores noencontraron evidencia genética de requerimientosde EN para ganancia de peso, concluyendo queel efecto de la raza o genotipo en EN paraganancia puede ser atribuido a los diferentespesos a la madurez, y a la precocidad en ladeposición de grasa en las distintas razas deganado. Diferentes pesos a la madurez de lasrazas, pueden determinar diferentes grados demadurez en los animales con el mismo pesoabsoluto y la misma tasa de ganancia; en laganancia de peso de los animales de razas conbajo peso a la madurez en comparación conlas razas de madurez tardía se esperan altasconcentraciones de energía. En la presenterevisión, trabajos con corderos MoradaNova(8,21) estiman valores de ganancia de 13.8a 17.9 kJ EN/g y 7.0 a 9.2 kJ EN/g, en animalesde peso comprendido entre 15 y 30 kg,respectivamente. Regadas-Filho et al(22) encorderos machos Santa Inês en crecimiento,reportaron de 10.0 a 14.5 kJ EN/g en animalesentre 15 y 30 kg. Sin embargo, con este mismotipo de animales, se encontraron valores de 6.0a 9.0 kJ EN/g(7,20). Galvani et al(,30) y Pereira

and volatile fatty acids molar proportions) andthe composition of the weight gain are themost important issues; these authors concludedthat the use of a combination of chemicalcomposition of the body and energyconcentration of the ration may be a betterapproach for the assessment of efficiency ofutilization of ME for maintenance and growth.Indeed, some authors(36,37) demonstrated thatthe main factor affecting kg is the compositionof gain in the EBW; even when the level of MEinterferes with kg, a ration with a high MEconcentration, will induce a high fat content inthe gain, therefore, the effect of the energycontent of the ration is considered in thecomposition of the gain.

On the other hand(36,37) these same authorsdid not find evidence of genetic background onNE requirements for weight gain, concludingthat the effect of breed or genotype on NE forgain can be attributed to the different matureweights and to the precocity of fat depositionin the different breeds of cattle. Different matureweights of breeds, may determine differentdegrees of maturity in animals with the sameabsolute weight and the same rate of gain,high energy concentrations are expected in thegain of animals of breeds with low weight atmaturity compared to that of late maturitybreeds. In the present review, works withMorada Nova lambs(8,21) estimated values of13.8 to 17.9 kJ NE/g gain and 7.0 to 9.2 kJNE/g gain respectively, in animals weighing from15 to 30 kg. Regadas-Filho et al(22) in SantaInês growing male lambs reported values of10.0 to 14.5 kJ NE/g gain in animals between15 and 30 kg. Nonetheless, in Santa Inêsgrowing male lambs found values of 6.0 to 9.0kJ NE/g gain(7,20). Galvani et al(30) and Pereiraet al(26) reported values of 9.3 to 14.7 and 9.2to 11 kJ NE/g gain in 1/2 Dorper × 1/2 SantaInês and Brazilian Somali lambs, respectively.Using the values described above, it was founda mean value of 8.75 to 14.06 kJ NE/g gain inhair sheep of different breeds under tropicalconditions of Latin America. Table 5 shows NErequirements for daily weight gain (MJ/animal/d)

116


et al(26) informaron de 9.3 a 14,7 y 9.2 a 11kJ EN/g para ganancia en corderos 1/2 Dorper x1/2 Santa Inês y Somalí Brasi leño,respectivamente. Utilizando los valores descritosanteriormente, se encontró un valor promediode 8.75 a 14.06 kJ EN/g para ganancia enovinos de pelo de diferentes razas encondiciones tropicales de América Latina. ElCuadro 5 muestra los requisitos de EN para

of hair sheep according to live weight andexpected weight gain.

As regard to the efficiency of ME utilization forgrowth, it has been reported that in growingPelibuey sheep, this value varies according toage and weight, being higher during the firststages of growth and decreasing as the animalapproaches mature weight, due to a greater

Cuadro 5. Requerimientos de EN para ganancia de peso (MJ/animal/d) en ovinos Santa Inés, Morada Nova, 1/2

Dorper × 1/2 Santa Inês y Somalí Brasileño con pesos entre 15 y 45 kg

Table 5. NE requirements for weight gain (MJ/sheep/d) of Santa Inés, Morada Nova, 1/2 Dorper × 1/2 Santa Inês and

Brazilian Somali hair heep weighing between 15 and 45 kg

BW ADG Reference

(kg) (g/d) (8) (7) (18) (34) (20) (30) (26) Mean SD CV

15 100 1.38 0.65 1.00 0.71 0.69 0.94 0.93 0.90 0.25 28.2

150 2.08 0.97 1.49 1.05 1.04 1.41 1.39 1.35 0.42 31.1

200 2.76 1.30 1.99 1.42 1.04 1.88 1.85 1.75 0.62 35.4

250 - 2.49 1.76 1.73 2.35 2.31 2.13 0.40 18.6

300 - 2.09 2.82 2.78 2.56 0.51 20.1

20 100 1.60 0.86 1.16 0.79 0.77 1.05 1.00 1.03 0.32 30.6

150 2.40 1.29 1.74 1.17 1.15 1.57 1.51 1.55 0.48 30.8

200 3.21 1.72 2.33 1.59 1.53 2.09 2.01 2.07 0.63 30.6

250 - 2.91 1.97 1.91 2.62 2.51 2.38 0.49 20.6

300 - 2.34 3.14 3.01 2.83 0.56 19.9

25 100 1.79 1.05 1.31 0.84 0.82 1.13 1.07 1.15 0.36 31.6

150 2.69 1.58 1.97 1.30 1.23 1.70 1.60 1.72 0.53 31.0

200 3.58 2.11 2.62 1.72 1.64 2.27 2.13 2.30 0.71 31.1

250 - 3.28 2.13 1.64 2.84 2.67 2.51 0.73 28.9

300 - 2.55 3.41 3.00 2.99 0.60 20.2

30 100 - 2.11 1.45 0.92 0.87 1.21 1.10 1.28 0.50 39.4

150 - 1.85 2.17 1.38 1.30 1.82 1.65 1.70 0.36 21.3

200 - 2.47 2.90 1.80 1.74 2.43 2.20 2.26 0.49 21.8

250 - 3.62 2.26 2.17 3.03 2.75 2.77 0.69 24.8

300 - - 2.72 3.64 3.30 3.22 0.65 20.2

35 100 - - 1.28 1.28

150 - - 1.92 1.92

200 - - 2.57 2.57 -

250 - - 3.21 3.21 -

300 - - 3.85 3.85 -

40 100 - - 1.35 1.35 -

150 - 2.02 2.02 -

200 - 2.69 2.69 -

250 - - 3.37 3.37 -

300 - 4.05 4.05 -

45 100 - - 1.41 1.41 -

150 - - 2.11 2.11 -

200 - - 2.81 2.81

250 - - 3.52 3.52

300 - - 4.22 4.22 -

BW= Body weight; ADG= Average daily gain; SD= Standard deviation; CV= Coefficient of variation.

117


ganancia de peso (MJ/animal/día) de ovinos depelo según su peso vivo y ganancia de pesoesperada.

Con respecto a la eficiencia de la utilización deEM para el crecimiento (Kg), se ha informadoque en ovinos Pelibuey, este valor varía segúnla edad y peso, siendo mayor durante lasprimeras etapas de crecimiento y disminuyendoa medida que el animal se acerca a su pesomaduro, debido a una mayor deposición degrasa en los tejidos del cuerpo(32). Sin embargo,estos autores también sugirieron que la mayordemanda puede ser debida al mayorrequerimiento de energía por unidad de peso.El Cuadro 6 muestra las estimaciones de Kg enovinos de pelo. La Kg reportada para ovinos depelo osciló entre 0.38(8) y 0.48(38), y elpromedio obtenido con el propósito de estarevisión fue 0.42 ± 0.04.

Con base en los datos obtenidos en estarevisión, respecto a las necesidades de energíapara ganancia de peso (MJ EN/animal/día) y Kg(0.42), se encontró que los requerimientos deenergía para la ganancia de peso (kJ EM/g)oscilaron entre 20.8 y 33.5 (media: 27.7);Asimismo, se informó que los valores mediospara las necesidades de energía para ganancia(MJ EM/animal/d) derivados, fueron superioresen un 26 % a los reportados previamente paraovinos Pelibuey en crecimiento(39), sin embargo,es importante destacar que los datos delpresente trabajo, y de otros(39), fueroncercanos, con ganancias de 100 g (5 % másen promedio), en comparación con mayorestasas de ganancia.

Requerimientos de energía para ovinos enpastoreo

En las regiones tropicales, los sistemas deproducción ovina generalmente son mixtos,donde en la mayoría de los casos, los animales(ovejas principalmente) se mantienen enpastoreo con o sin alimentación suplementaria.La alimentación se basa en el uso de gramíneasnativas e introducidas y arbustos; las

fat deposition in body tissues(32). However,those authors also suggested that the greaterdemand may be due to the higher requirementof energy per unit weight gain. Table 6 showsestimations of kg in hair sheep. The kg reportedfor hair sheep ranged from 0.38(8) to 0.48(38).The average kg value obtained for the purposeof this review was 0.42 ± 0.04.

Based on the data obtained in this reviewregarding the energy requirement of weight gain(MJ NE/animal/d) and kg (0.42), it was foundthat the energy requirements for weight gain(kJ ME/g gain) ranged from 20.8 to 33.5 (mean:27.7). Similarly, it was reported that the meanvalues for the energy requirements for gain(MJ ME/animal/d) derived, were higher by 26 %than those previously reported for growingPelibuey sheep(39), nonetheless, it is importantto emphasize that the data of the present reviewand from others(39), average daily gain werecloser of 100 g (5 % higher on average),compared to higher rates of gain.

Energy requirements of grazing sheep

In tropical regions, sheep production systemsare usually mixed, where in most cases, animals(ewes mainly) are maintained grazing with orwithout supplementary feed. Feeding is basedon the use of native and introduced grassesand shrubs; sheep farms have low production

Cuadro 6. Eficiencia de utilización de la EM para ganancia

de peso (kg) en ovinos de pelo

Table 6. Efficiency of utilization of ME for weight gain (kg)

in hair sheep

Breed or genotype kg Reference

Santa Inês males 0.43 (18)

Morada Nova, sheep 0.38 (8)

Santa Inés growing males 0.48 (20)

1/2 Dorper × 1/2 Santa Inês 0.39 (30)

Mean 0.42

SD 0.044

CV (%) 10.82

SD= Standard deviation; CV= Coefficient of variation.

118


and profitability parameters and low rate ofadoption of new technologies. For that reasonestimation of nutrient requirement of grazingsheep must be of paramount importance.However, there are few reports of experimentswhere nutrient requirements of grazing sheephave been determined. In this context(40), withRambouillet × Pelibuey sheep recently weanedof 13.5 kg grazing Buffel (Cenchrus ciliaris)grass, found an energy requirement formaintenance of 359 kJ ME/kg BW0.75/d. Onthe other hand(7) considering a km of 0.66,reported a MEm of 470 kJ ME/kg, thereforeNEm was 310 kJ/kg BW0.75. Similarly, reportedthat in lambs of 3 to 4 mo old (castrated males)of the Santa Inês breed of 15 to 30 kg liveweight grazing buffel grass had a requirementof 18.2 kJ ME/g weight gain in lambs of 15 kg.In lambs of 20 kg, the requirement was 24 kJ,in lambs of 25 kg the requirement was 30 kJand in animals of 30 kg it was 35 kJ. Theestimated kg value was 0.42 for all weightsevaluated.

Empty body weight (EBW)

Marcondes et al(36) suggested that the firststep in the determination of energy requirementsof ruminants is the conversion of shrunk BW(SBW) to EBW. Also, some authors mention(30),that the energy concentration in the body hasusually been expressed as a function of EBWrather than SBW because interference by thegastrointestinal content is completely eliminated.The EBW is equivalent to SBW minus the weightof the gastrointestinal contents. SBW is alsodefined as 96 % of full BW (kg) and definesEBW as: EBW = 0.85 × SBW (kg)(12,16,30).

Nonetheless, to determine the EBW, sheep haveto be slaughtered; for this reason, regressionequations have been developed to estimate EBWfrom BW or SBW and include this informationand thus contribute to updating with the datafor estimation of some parameters required bynutritional models such as SRNS in order topredict the performance of hair sheepbreeds(11,32).

explotaciones ovinas tienen bajos parámetrosde producción y rentabilidad y baja tasa deadopción de nuevas tecnologías. Por esa razónes primordial la estimación de los requerimientosnutricionales de ovinos en pastoreo; sinembargo, hay pocos reportes de experimentosdonde se hayan determinado. En este contexto,se menciona(40), con corderos destetadosRambouillet x Pelibuey de 13.5 kg en pastoreode Buffel (Cenchrus ciliaris), un requerimientode energía para mantenimiento de 359 kJ EM/kgPC0.75/día. En otro trabajo(7) considerando unKm de 0.66, informaron una EMm de 470 kJEM, por lo tanto ENm fue 310 kJ/kg PC0.75.Asimismo, encontraron que en corderos de 3 a4 meses de edad (machos castrados) de laraza Santa Inês de 15 a 30 kg de peso enpastoreo de buffel tenían un requerimiento de18.2 kJ EM/g para ganancia de peso en corderosde 15 kg. En corderos de 20 kg, el requerimientofue 24 kJ, en corderos de 25 kg el requerimientofue 30 kJ y en los animales de 30 kg de 35 kJ.El valor estimado para Kg fue 0.42 al evaluartodos los pesos.

Peso corporal vacío (PCV)

Marcondes et al(36) sugirieron que el primerpaso en la determinación de las necesidadesenergéticas de los rumiantes es la conversiónde PC encogido (PCE, con ayuno de 16 a 24 h)a PCV. También se ha informado(30), que laconcentración de energía en el cuerpogeneralmente ha sido expresada como unafunción de PCV en lugar de PCE, debido a quela interferencia del contenido gastrointestinales eliminada completamente. El PCV esequivalente a PCE menos el peso del contenidogastrointestinal. Según algunos autores(12,16,30),el PCE se define como el 96 % de PC lleno (kg)y definen PCV como: PCV= 0.85 × PCE (kg).

Sin embargo, para determinar el PCV, losanimales tienen que ser sacrificados; por estarazón, han desarrollado ecuaciones de regresiónpara estimar PCV a partir del PC o PCE, eincluir esta información, y así contribuir a laactualización con los datos para la estimación

119


de algunos parámetros requeridos por losmodelos nutricionales como SRNS para predecirel desempeño de razas de ovejas de pelo(11,32).

Basados en datos reportados en laliteratura(8,22,26,30,34,38), se ajustó una ecuaciónde regresión lineal.

(Ecuación 1): PCV= -1.80 (±0.59***) + 0.89(±0. 02***) × PCE (R2= 0.98; MSE= 1.669;RSD= 1.292; P<0.0001; n= 51).

Se encontró que el contenido gastrointestinalfue 10 % y la PCV 90 % del PC en animalesmachos. Los valores encontrados en el presentetrabajo en cuanto a PC correspondiente a PCVfueron superiores a los reportados en laliteratura(16,32). También se encontró que larelación PC/PCV fue en promedio de 1.23 paralos machos.

Con respecto a las hembras, en ovejas Pelibueyadultas en diferentes estados fisiológicos, el pesodel contenido gastrointestinal fue aproxima-damente un 19 % de PCE(11). Recientemente,(Chay-Canul, datos inéditos) utilizando datosde 28 ovejas Pelibuey adultas con diferentespesos y condicion corporal, se conformó lasiguiente ecuación:

(Ecuación 2): PCV= -3.82 (±0.93***) + 0.92(±0.02***) × PCE (R2= 0.96, MSE= 2.183,RSD= 1.477, P<0.0001; n= 71).

La PCV correspondió al 92 % de PC. Por otraparte, la relación PC/PCV fue en promedio 1.22para ovejas.

Composición corporal y su relación con losrequerimientos de energía

Para estimar las necesidades de nutrientes esimportante saber el aumento de peso y lacomposición corporal, porque estos estándirectamente relacionados. Fernandes et al(41)

afirman que el conocimiento de la composicióncorporal de los animales es de gran relevanciaen estudios de nutrición animal para determinarnecesidades de nutrientes. Costa et al(21) y

Based on data reported(8,22,26,30,34,38), a linearregression equation was fitted.

(Equation 1): EBW= -1.80(±0.59***) + 0.89(±0.02***) × SBW (R2= 0.98; MSE= 1.669;RSD= 1.292; P<0.0001; n= 51).

It was found that gastrointestinal fill was 10 %and the EBW was 90 % of BW in male animals.The values found in the present work as regardto BW corresponding to EBW were higher tothose reported in the literature(16,32). Also itwas found that the relation BW/EBW was onaverage 1.23 for males.

Regarding females, in adult Pelibuey ewes atdifferent physiological stages the weight of thegastrointestinal content was approximately 19 %of SBW(11). Recently, (Chay-Canul, unpublisheddata) used a data set of 28 adult Pelibueyewes with different BW and body condition scoreand when analyzed, the data conformed anequation:

(Equation 2): EBW= -3.82 (±0.93***) + 0.92(±0.02***) × SBW (R2= 0.96, MSE= 2.183,RSD= 1.477, P<0.0001; n= 71).

The EBW corresponded to 92 % of BW.Moreover, the relation BW/EBW was on average1.22 for ewes.

Body composition and its relationship withenergy requirements

In order to estimate nutrient requirements it isimportant to know body composition and weightgain of sheep because these are directly related.Fernandes et al(41) suggested that knowledgeof body composition of the animals is of greatrelevance in studies of animal nutrition todetermine nutrient requirements. Costa et al(21)

and Maia et al(19) reported that the first stepfor determining nutritional requirements is tomeasure the body composition of the sheep,which may be obtained by direct or indirectmethods. Although the direct determination ofbody composition by grinding and analyzing allbody tissues is the most reliable method, it isexpensive, time consuming, and laborious.

120


Maia et al(19) informan que el primer paso parala determinación de los requerimientosnutricionales es medir la composición corporalde los ovinos, que puede obtenerse por métodosdirectos o indirectos. Aunque la determinacióndirecta de la composición corporal por molienday análisis de todos los tejidos del cuerpo es elmétodo más confiable, es caro, lento y laborioso.

La composición corporal de los ovinos es unfactor importante para determinar losrequerimientos nutricionales, ya que el cuerpose compone básicamente de agua, proteína,grasa y minerales, en proporciones que varíansegún la raza, edad, tasa de crecimiento, elgénero y nutrición, entre otros(34).

En corderos Morada Nova de 15.23 a 25.43 kgse reportó que la composición corporal (% PCV)varió de 70.14 a 64.61 % agua, 18.14 a 18.17 %de proteína cruda, de 6.7 a 12.1 % grasa y7.28 a 9.50 MJ/kg PCV(8). Los autoresinformaron también que la concentración deproteína bruta se redujo de 181.76 a 178.74g/kg PCV cuando el PC de los animales aumentóde 15 a 25 kg. Asimismo, otros autores(34),informaron que el contenido de energía y grasaen el PCV aumentó de 79.38 g/kg PCV, a 8.83MJ/kg, 6.86 MJ/kg y 123,73 g/kg,respectivamente, conforme el PV de los animalesaumentó de 15 a 30 kg; también se observóun efecto cuadrático para las concentracionesde agua y grasa con el aumento de PCV, y elporcentaje de proteínas mostró una tendenciaa disminuir linealmente, presentando unadisminución de 0.10 puntos porcentuales porcada kilo de incremento de PCV.

En corderos Santa Inês(22), se encontró que elcontenido de energía y grasa del PCV aumentóde 7.99 MJ/kg y 85.16 g/kg de PCV,respectivamente, a 11.63 MJ/kg y 221.23 g/kg,conforme el PV aumentó de 15 a 30 kg; tambiénse observó un efecto cuadrático para lasconcentraciones de agua, grasa y energía conel aumento de PCV; mencionan que elporcentaje de proteína cruda mostró unatendencia a disminuir linealmente, de 0.12

Sheep body composition is an important factorwhen determining nutritional requirements, sincethe body is basically composed of water, protein,fat and minerals, in proportions that varyaccording to breed, age, rate of growth, sexand nutrition, among others(34).

In Morada Nova lambs weighing 15.23 to 25.43kg, reported that the body composition (%EBW) varied from 70.14 to 64.61 % water,18.14 to 18.17 % crude protein, 6.7 to 12.1 %fat and 7.28 to 9.50 MJ/kg EBW(8). Thoseauthors also reported that the concentration ofcrude protein was reduced from 181.76 to178.74 g/kg EBW when the BW of animalsincreased from 15 to 25 kg. Others(34), informedthat the energy and fat contents of the EBWincreased from 6.86 MJ/kg and 79.38 g/kg EBW,to 8.83 MJ/kg and 123.73 g/kg of EBW,respectively, as the BW of the animals increasedfrom 15 to 30 kg; a quadratic effect was alsoobserved for the concentrations of water andfat with increasing EBW and the percentage ofprotein showed a tendency to decrease linearly,representing a decrease of 0.10 percentagepoints for each kilogram increase in EBW.

In Santa Inês lambs(22), reported that theenergy and fat contents of the EBW of thesheep increased from 7.99 MJ/kg and 85.16 g/kgof EBW, respectively, to 11.63 MJ/kg and 221.23g/kg, as the BW increased from 15 to 30 kg;they also observed a quadratic effect for theconcentrations of water, fat, and energy withincreasing EBW and informed that thepercentage of crude protein showed a tendencyto decrease linearly, representing a decrease of0.12 percentage points for each kilogramincrease in EBW, from 15 to 30 kg. Thoseauthors, concluded that the net energyrequirement for EBW gain increased withincreasing body weight, due to a parallelincrease in the quantity of fat deposited perkilogram gained. Correspondingly, someauthors(38), found that the crude protein contentof the body decreased but fat and energy bodycontent increased as the EBW increased from15 to 45 kg. Similar results(7) mention that the

121


puntos porcentuales por cada kilogramo deincremento de PCV, de 15 a 30 kg. Los autoresconcluyeron que los requerimientos de energíaneta para PCV aumentaron con el aumento depeso corporal, debido a un aumento paraleloen la cantidad de grasa depositada porkilogramo de ganancia. En consecuencia,algunos autores(38), mencionan que el contenidode proteína cruda del cuerpo disminuyó, peroel contenido de grasa y energía del cuerpoaumentaron conforme el PCV aumentó de 15 a45 kg. Resultados similares mencionan que losniveles de suplementación y valores PCVafectaron positivamente contenidos de MS enla PCV de 31.15, 35.18 y 36.19 %(7). Sinembargo, el contenido de proteína cruda en laPCV disminuyó con la suplementación. Estopuede explicarse por la mayor ganancia de PCy los depósitos de grasa con el aumento ennivel de suplementación. El contenido de energíaen el PCV varió de 6.23 a 8.66 MJ/kg PCV. Laconcentración de proteína cruda disminuyó de212 a 180 g/kg PCV cuando el PC aumentó de15 a 30 kg. El contenido de grasa en corderosde 15 a 30 kg osciló entre 17.3 y 103.2 g/kgPCV. Estos autores concluyeron que el requisitode proteína disminuyó y el requerimiento deenergía aumenta con el aumento de pesocorporal.

Galvani et al(30) encontraron que laconcentración de grasa en la ganancia (g/kg deganancia del PCV), aumentó con el aumentoen el PV de los corderos, y que la cantidad deproteína cruda en la ganancia no fue afectadapor el peso al sacrificio. Pereira et al(26) concorderos Somalí Brasileño, informaron que laenergía del animal y el contenido de grasa delPCV aumentaron de 11.20 MJ/kg y 208.54 g/kga 13.54 MJ/kg y 274.95 g/kg de PCV,respectivamente, conforme el PV aumentó de13.0 a 28.70 kg.

Con los datos obtenidos en la presente revisión,la composición corporal de ovinos de pelo serelacionó con el PCV y se ajustaron tresecuaciones para predecir la composición corporal(Figura 1). Las ecuaciones ajustadas fueron:

supplementation levels and EBW values affectedpositively DM content in the EBW from 31.15to 35.18 and to 36.19 %. However, the crudeprotein content in the EBW decreased withsupplementation (P<0.05). This can beexplained by the higher BW gain and fatdeposition with the increase in supplementationlevel. The energy content in the EBW rangedfrom 6.23 to 8.66 MJ/kg EBW. The crude proteinconcentration decreased from 212 to 180 g/kgEBW when the body weight increased from 15to 30 kg. The fat contents in 15 to 30 kg BWlambs ranged from 17.3 to 103.2 g/kg EBW.These authors concluded that the proteinrequirement decreased and the energyrequirement increased with the increase in bodyweight.

Galvani et al(30) found that fat concentration inthe gain (g/kg EBW gain), increased with anincrease in the BW of the lambs and that theamount of crude protein in the gain was notaffected by slaughter weight. Pereira et al(26)

with Brazilian Somali lambs, reported that theanimal’s energy and EBW fat contents increased

EBW (kg)

5 10 15 20 25 30 35 40 45

Co

nc

en

tra

tio

n i

n E

BW

(%

)

0

20

40

60

80

Water (%)

Fat (%)

Protein (%)

Ash (%)

Energy (MJ)

Figure 1. Composición corporal de ovinos de pelo machos

como función del peso corporal vacío (EBW)

Figure 1. Body composition of male hair sheep as a

function of empty body weight (EBW)

(Data from references: 7, 8, 22, 30, 34 and 38)

122


Ecuación (3): % agua= 72.881 (±1.022***)-0.385 (±0.044***) × PCV (R2= 0.67; CME=5,558; DER= 2.357; P<0.0001; n= 39).

Ecuación (4): % grasa= 3.62 (±1.22***) +0.460 (±0.05***) × PCV (R2= 0.67; CME =7.929; DER= 2.815; P<0.0001; n= 39).

Ecuación (5): Energía (MJ/kg PCV)= 3.322(±1.108***) + 0.449 (±0.098***) × PCV-0.006(±0.002***) × PCV2 (R2= 0,71; CME= 0.976;DER= 0.988; P<0.0001; n= 39). Sin embargo,no se ajustaron ecuaciones para proteína cruday cenizas del cuerpo.

CONCLUSIONES E IMPLICACIONESGENERALES

Existen pocos estudios disponibles sobre laevaluación de los requerimientos nutricionalesde los ovinos de pelo. Los estudios encontradosmuestran gran variación con respecto a losrequerimientos de energía para los ovinos,siendo el promedio de EMm para hembras de419 ± 129 kJ/kg PC0.75 y para machos 388 ±123 kJ/kg PC0.75. La eficacia de la utilizaciónde EM para mantenimiento (Km) y ganancia(Kg) fueron 0.66 ± 0.02 y 0.42 ± 0.04,respectivamente.

Algunos autores han informado que estosrequerimientos son en algunos casos superioresen comparación con los reportados previamenteen sistemas energéticos de América del Nortey Europa para razas de lana(15,23,24,42). Sinembargo, otros autores han reportado que estosrequerimientos son más bajos en comparacióncon esos sistemas. Información con respecto arequerimientos de EM para mantenimiento yproducción, y la variación existente en esasestimaciones es escasa para las razas de ovinosde pelo. Se ha informado que es probable queexistan diferencias en los requisitos de EM paramantenimiento en ovinos de diferentes razas ytipos (de pelo vs lana); si esto es así, entonceshabria una oportunidad para seleccionar lasovejas con el más bajo requerimiento de EMpara mantenimiento y con ello, aumentar la

from 11.20 MJ/kg and 208.54 g/kg to 13.54MJ/kg and 274.95 g/kg of EBW, respectively, asthe BW increased from 13.0 to 28.70 kg.

Using the data obtained in the present review,the body composition of hair sheep was plottedagainst the EBW, and three equations were fittedto predict body composition (Figure 1). Theequations fitted were:

Equation (3): % Water= 72.881 (±1.022***) -0.385 (±0.044***) × EBW (R2= 0.67; MSE=5.558; RSD= 2.357; P<0.0001; n= 39).

Equation (4): % Fat= 3.62 (±1.22***) + 0.460(±0.05***) × EBW (R2= 0.67; MSE= 7.929;RSD= 2.815; P<0.0001; n= 39).

Equation (5): Energy (MJ/kg EBW)= 3.322(±1.108***) + 0.449 (±0.098***) ×EBW -0.006(±0.002***) ×EBW2 (R2= 0.71; MSE= 0.976;RSD= 0.988; P<0.0001; n= 39). Nonetheless,for body crude protein and ash, no equationswere adjusted.

GENERAL CONCLUSIONS ANDIMPLICATIONS

There are few studies available concerning theassessment of the nutrient requirements of hairsheep. Those studies show great variationregarding the energy requirements for ewes,being the average MEm 419 ± 129 kJ/kg BW0.75

and for the male 388 ± 123 kJ/kg BW0.75. Theefficiency of ME utilization for maintenance (km)and gain (kg) were 0.66 ± 0.02 and 0.42 ±0.04, respectively.

Some authors have reported that suchrequirements are in some cases higher comparedto those previously reported in North Americanand European energy systems(15,23,24,42) forwool breeds. However, other authors havereported that these requirements are lowercompared to those systems. Informationregarding ME requirements for maintenance andproduction and the variation existing in suchestimates is scarce for the breeds of hair sheep.

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eficiencia de la producción de corderos. Por lotanto, es importante determinar las necesidadesde energía de diferentes razas de ovinos depelo y la eficiencia con la que utilizan la EMabsorbida desde el tracto gastrointestinal. Paradesentrañar algunas de los cuestionamientosanteriores, será necesario construir una unidadcalorimétrica en México con la infraestructuraadecuada y equipos para medir indirectamenteel calor resultante de las diferentes fuentes enel animal. Esta instalación no necesariamenteha de ser extremadamente costosa, las cajasde cabeza para mediciones calorimétricas encabras del Instituto de investigación en laUniversidad de Langston “Kika de la Garza”,Estados Unidos, son un buen ejemplo de unaunidad calorimétrica de bajo costo, eficiente,para pequeños rumiantes.

Esta revisión intentó identificar las áreaspotenciales de investigación donde se requierenlos conocimientos fundamentales para aumentarla eficiencia energética de producción de ovinosde pelo en las regiones tropicales de AméricaLatina. Parece evidente que debe hacersehincapié en enfoques experimentales quepermitan la identificación de animales con elmás bajo consumo residual y requerimientosde energía para mantenimiento, así como lamayor eficiencia de utilización de EM paramantenimiento, aumento de peso, gestación ylactancia. El conocimiento de estos valorespuede ayudar a los nutricionistas a formularraciones prácticas con una mejor base científicaque en la actualidad. La identificación eincorporación de las ovejas más eficientes enlos sistemas de producción puedeeventualmente, causar un aumento en laproductividad y rentabilidad para los agricultoresde los países en desarrollo de las regionestropicales del mundo.

LITERATURA CITADA

1. López-Carlos MA, Ramírez RG, Aguilera-Soto JI, AréchigaCF, Rodríguez H. Size and shape analyses in hair sheep ram

It has been reported that it is likely thatdifferences exist in the ME requirements formaintenance in ewes of different breeds andtype (hair vs wool); if this is so, then therewould be an opportunity to select those eweswith the lowest ME requirement for maintenanceand with this, increase the efficiency of muttonproduction. Thus, it is important to determinethe energy requirement of different breeds ofhair sheep and the efficiency with which theyutilize ME absorbed from the gastrointestinaltract. To unravel some of the questions above,it will be required to build a calorimetric unit inMexico with the appropriate infraestructure andequipment to measure indirectly heat arisingfrom the different sources within the animal.This facility has not necessarily be extremelyexpensive, the head-boxes for calorimetricmeasurements in goats at the “Kika de la Garza”Research Institute in Langston University, UnitedStates, are a good example of a low-cost,efficient, calorimetric unit for small ruminants.

This review attempted to identify potential areasof research where fundamental knowledge isrequired in order to increase energetic efficiencyof hair sheep production in the tropical regionsof Latin America. It seems apparent thatemphasis must be given to experimentalapproaches which allow identification of animalswith the lowest residual feed intake and energyrequirement for maintenance as well as thehighest efficiency of ME util ization formaintenance, weight gain, pregnancy andlactation. The knowledge of those values mayhelp nutritionists to formulate practical rationswith a better scientific base than at present.The identification and incorporation of the mostefficient sheep in production systems mayeventually lead to an increase in productivityand profitability for farmers in developingcountries of the tropical regions of the world.


lambs and its relationships with growth performance. LivestSci 2010;(131):203-211.

124


2. Cantón GCJ, Bores QR, Baeza RJ, Quintal FJ, Santos RR,Sandoval CC. Energy retention of F1 Pelibuey lambs crossedwith breeds for meat production. J Anim Vet Adv2009;8(12):2655-2661.

3. Cantón J, Moguel Y, Castellanos A. Estimación delrequerimiento energético de mantenimiento del borregoPelibuey en clima tropical. Téc Pecu Méx 1995;(33):66-73.

4. Silva A, da Silva Sobrinho A, Trindade I, Resende K, BakkeO. Net requirements of protein and energy for maintenanceof wool and hair lambs in tropical region. Small Rum Res2003;(49):165-171.

5. Cabral LDS, Neves EMDO, Zervoudakis JT, Abreu JGD,Rodrigues RC, Souza AL, et al. Estimativas dos requisitosnutricionais de ovinos em condições brasileiras. Rev BrasSaúde Prod Anim 2008;9(3):529-542.

6. Duarte VF, Sandoval CA, Sarmiento LA. Empleo del modeloSRNS para predecir la ganancia de peso en ovinos machosPelibuey en crecimiento. Arch Zootec 2009;58(224):671-681.

7. Silva AMA, Santos EM, Filho JMP, Bakke OA, Gonzaga NS,Costa RG. Body composition and nutritional requirementsof protein and energy for body weight gain of lambsbrowsing in a tropical semiarid region. Rev Bras Zootec2010;(39):210-216.

8. Gonzaga-Neto SA, da Silva-Sobrinho AG, de Resende KT,Zeola NMBL, de Azevedo-Silva AM, Marques CAT, et al.Composição corporal e exigências nutricionais de proteínae energia para cordeiros Morada Nova. Rev Bras Zootec2005;(34):2446-2456.

9. Resende KT, Silva HGO, de-Lima LD, Teixeira IAMA. Avaliaçãodas exigências nutricionais de pequenos ruminantes pelossistemas de alimentação recentemente publicados. Rev BrasZootec 2008;37(Supl esp):161-177.

10. Vieira PAS, Pereira LGR, Azevêdo JAG, Neves ALA, ChizzottiML, dos Santos et al. Development of mathematical modelsto predict dry matter intake in feedlot Santa Ines rams.Small Rumin Res 2013;112(1):78-84.

11. Chay-Canul AJ, Espinoza-Hernández JC, Ayala-Burgos AJ,Magaña-Monforte JG, Aguilar-Pérez CF, Chizzotti ML, et al.Relationship of empty body weight with shrunken bodyweight and carcass weights in adult Pelibuey ewes atdifferent physiological states. Small Ruminant Res2014;(117):10-14.

12. Tedeschi LO, Cannas A, Fox DG. A nutrition mathematicalmodel to account for dietary supply and requirements ofenergy and nutrients for domesticated small ruminants:The development and evaluation of the Small RuminantNutrition System. Small Ruminant Res 2010;(89):174-184.

13. Chay-Canul AJ, Ayala-Burgos AJ, Kú-Vera JC, Magaña-Monforte JG, Tedeschi L. O. The effects of metabolizableenergy intake on body fat depots of adult Pelibuey ewesfed roughage diets under tropical conditions. Trop AnimHealth Prod 2011;(43):929-936.

14. Chilliard Y, Bocquier F, Doreau M. Digestive and metabolicadaptations of ruminants to undernutrit ion, andconsequences on reproduction. A review. Reprod Nutr Dev1998;(38):129-150.

15. NRC. Nutrient requirements of small ruminants: Sheep,goats, cervids, and New World camelids, 6th ed. Washington,DC: National Academy Press; 2007.

16. Cannas A, Tedeschi LO, Fox DG, Pell AN, Van Soest PJ. Amechanistic model for predicting the nutrient requirementsand feed biological values for sheep. J Anim Sci2004;(82):149-169.

17. Duarte VF, Sandoval CA, Sarmiento LA. Evaluación del modeloCNSPS-S para predecir el crecimiento del borrego Pelibuey.Rev Cient-Fac Cien V FCV-LUZ 2008;(18):296-304.

18. Regadas-Filho JGL, Pereira ES, Villarroel ABS, Pimentel PG,Fontenele RM, Costa MRGF, et al. Efficiency of metabolizableenergy utilization for maintenance and gain and evaluationof Small Ruminant Nutrition System model in Santa Inessheep. Rev Bras Zootec 2011;(40):2558-2564.

19. Maia ISG, Pereira ES, Pinto AP, Mizubuti IY, de Azambuja-Ribeiro EL, et al. Consumo, avaliação do modelo SmallRuminant Nutrition System e predição da composiçãocorporal de cordeiros Santa Inês alimentados com raçõescontendo diferentes níveis de energia. Semina: Sci Agric2014;35(4):2579-2596.

20. Oliveira AP, Pereira ES, Pinto AP, de Azevêdo-Silva AM, deSouza-Carneiro M S, Mizubuti IY. et al. Estimativas dosrequisitos nutricionais e utilização do modelo Small RuminantNutrition System para ovinos deslanados em condiçõessemiáridas. Semina: Sci Agric 2014;35(4):1985-1998.

21. Costa MRGF, Pereira ES, Pinto AP, de Azevêdo Silva AM, deMedeiros AN, et al. Prediction of body chemical compositionof Morada Nova lambs using the composition of ribs sectionbetween 9th and 11th. Semina: Sci Agric 2014;35(4):2019-2032.

22. Regadas-Filho JGL, Pereira ES, Pimentel PG, Villarroel ABS,Medeiros AN, Fontenele RM. Body composition and netenergy requirements for Santa Ines lambs. Small RuminantRes 2013;(109):107-112.

23. ARC. The nutrient requirements of ruminant livestock. AgrRes Council. London: Gresham Press; 1980.

24. AFRC. Technical Committee on Responses to Nutrients.Energy and protein requirements of ruminants. CABInternational, Wallingford, UK; 1993.

25. Cannas A, Atzori AS, Teixeira IAMA, Sainz RD, Oltjen JW.The energetic cost of maintenance in ruminants: fromclassical to new concepts and prediction systems. In:Crovetto M editor. Energy and protein metabolism andnutrition. Netherlands: Wageningen Academic Publishers;2010;531-542.

26. Pereira ES, Fontenele RM, Silva AM, Oliveira RL, FerreiraMR, Mizubuti IY, et al. Body composition and net energyrequirements of Brazilian Somali lambs. Ital J Anim Sci2014;13(4):880-886.

27. Reynolds CK, Crompton LA, Mills JAN. Improving theefficiency of energy utilization in cattle. Anim Prod Sci2011;(51):6-12.

28. Ferrell CL. And Oltjen JW. ASAS CENTENNIAL PAPER: Netenergy systems for beef cattle- Concepts, application, andfuture models. J Anim Sci 2008;(86):2779-2794.

29. Tolkamp BJ. Efficiency of energy utilization and voluntaryfeed intake in ruminants. Animal 2010;(4):1084-1092.

30. Galvani DB, Pires AV, Susin I, Gouvêa VN, Berndt A, ChagasLJ, et al. Energy efficiency of growing ram lambs fedconcentrate-based diets with different roughage sources. JAnim Sci 2014;92(1):250-263.

125


31. Chay-Canul AJ, Ayala-Burgos AJ, Kú-Vera JC, Magaña-Monforte JG, Ferrell CL. Metabolizable energy intake andchanges in body weight and body condition of Pelibueyewes fed three levels of roughage diets under tropicalconditions. Trop Subtrop Agroecosyt 2011;(14):777-786.

32. Duarte F, Sandoval-Castro CA, Sarmiento-Franco LA, TedeschiLO, Santos-Ricalde RH. Energy and protein requirements ofgrowing Pelibuey sheep under tropical conditions estimatedfrom a literature database analyses. Trop Subtrop Agroecosyt2012;15(1):97-103.

33. Chávez RG, Castellanos RA, Velásquez MP. Producción delas ovejas Pelibuey pre y posparto alimentadas con diversosaportes nutricionales. Tec Pecu Mex 1995;(33):183-191.

34. Costa MRGF, Pereira ES, Silva AMA, Paulino PVR, MizubutiIY, Pimentel PG, et al. Body composition and net energyand protein requirements of Morada Nova lambs. SmallRuminant Res 2013;114(2):206-213.

35. Tedeschi LO, Fox DG, Carstens GE, Ferrell CL. The partialefficiency of use of metabolisable energy for growth inruminants. In: Crovetto M, editor. Energy and proteinmetabolism and nutrition. Netherlands: WageningenAcademic Publishers; 2010:519-529.

36. Marcondes MI, Chizzotti ML, Valadares-Filho SC, GionbelliMP, Paulino PVR, Paulino MF. Energy requirements of Zebubeef cattle. In: Valadares FS. et al editors. Nutrient

requirements of Zebu beef cattle, BR. Corte. 2nd ed. FederalUniversity of Vicosa, MG; UFV, DZO, Brasil. 2010;81-106.

37. Chizzotti ML, Tedeschi LO, Valadares-Filho SC. A meta-analysis of energy and protein requirements for maintenanceand growth of Nellore cattle. J Anim Sci 2008;86(7):1588-1597.

38. Oliveira NA, Pérez JRO, Carvalho PA, Paula OJ, Baião EAM.Composição corporal e exigências líquidas em energia eproteína para ganho de cordeiros de quatro gruposgenéticos. Ciênc Agrotéc 2004;(28):1169-1176.

39. Solís RG, Castellanos RA, Velázquez MA, Rodríguez GF.Determination of nutritional requirements of growing hairsheep. Small Ruminant Res 1991;(4):115-125.

40. Ramírez RG, Huerta J, Kawas JR, Alonso DS, Mireles E,Gómez MV. Performance of lambs grazing in a buffelgrass(Cenchrus ciliaris) pasture and estimation of theirmaintenance and energy requirements for growth. SmallRuminant Res 1995;(17):117-121.

41. Fernandes MHMR, Resende KT, Tedeschi LO, Fernandes-JrJS, Teixeira IAMA, Carstens GE, et al. Predicting the chemicalcomposition of the body and the carcass of 3/4 Boer x 1/4Saanen kids using body components. Small Ruminant Res2008;(75):90-98.

42. NRC. Nutrient requirements of sheep. 6th ed. Washington,DC: National Academy Press; 1985.

126


127

ADAPTACIÓN DE M. SMEGMATIS Y SU EFECTO EN LA EXPRESIÓN DE ESAT-6Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):127-139

Adaptación de Mycobacterium smegmatis ante elagotamiento de nutrientes y su efecto en la

expresión de esat-6

Adaptation of Mycobacterium smegmatis to nutrientdepletion and its effect on esat-6 expression

Héctor M. López-Péreza,d, Sixto Velarde-Félixb, Idalia Enriquez-Verdugoa,Rosa Xicotencatl-Palaciosc,d, Soila M. Gaxiola-Camachoa

RESUMEN

Cuando los recursos son escasos, las micobacterias detienen su crecimiento para dar paso a los genes de la adaptación.Contrariamente, cuando el crecimiento continúa bajo condiciones de estrés, se activan genes específicos de redesmetabólicas para su protección. En este sentido, la proteína codificada por esat-6 (por sus siglas en inglés: earlysecretory antigenic target, 6 kDa) en Mycobacterium tuberculosis, actúa en la lisis del epitelio alveolar y membranasde los macrófagos para escapar e invadir otras células. Pero puede tener otras funciones, tales como interferir en elcontacto célula-célula y transferir su ADN. En M. smegmatis, el sistema ESX-1 (por sus siglas en inglés: SecretionEjectosoma BOX) facilita la secreción de la proteína ESAT-6, probablemente es sensible a uno o más nutrientes delmedio de cultivo. Por lo que en el presente estudio se evalúan las condiciones de cultivo limitantes en nutrientes parael crecimiento de M. smegmatis y su relación con la expresión del gen esat-6. Los medios de cultivos probados fueronHartmans de Bond medio mínimo (HdB), limitado en carbono (HdB<C), nitrógeno (HdB<N) y fosfato inorgánico(HdB<Pi). M. smegmatis se adapta a HdB medio mínimo, HdB<C y HdB<N y reanuda su actividad metabólica enmedio fresco, pero no se expresa esat-6. En HdB<Pi M. smegmatis pierde su capacidad metabólica respecto a laresistencia alcohol-ácido y expresa esat-6. Por lo tanto, se proponen los medios de cultivo probados como modelopara la expresión génica bajo limitación por nutrientes.

PALABRAS CLAVE: Metabolismo, Aletargamiento, Adaptación, Estrés, Agotamiento de nutrientes, Mycobacteriumsmegmatis, esat-6.

ABSTRACT

When resources are scarce, mycobacteria stop growing to make way for genes adaptation allow. Conversely, whengrowth continues under stress conditions, specific genes metabolic networks for protection are activating. In thissense, the protein encoded by esat-6 (early secretory antigenic target, 6 kDa) gene in Mycobacterium tuberculosis,acting in the lysis of alveolar epithelial and macrophage membranes to escape and invade other cells. But it can haveother functions, such as interfering with cell-cell contact and transfer their DNA. In M. smegmatis, the ESX-1 (SecretionEjectosoma BOX) system that facilitates secretion of ESAT-6 protein, probably it is sensitive to one or more nutrientsof the culture medium. So it in the present study culture conditions limiting nutrient for growth of M. smegmatis areevaluated and relate the expression of esat-6. Culture media tested were minimal medium Hartmans Bond (HdB),carbon-limited (HdB<C), nitrogen (HdB<N) and inorganic phosphate (HdB<Pi). M. smegmatis HdB adapted to minimalmedium, HdB<C and HdB<N and resume its metabolic activity in fresh medium, but not expressed esat-6. In HdB<Pi M. smegmatis loses its metabolic capacity for resistance acid-alcohol and expressed esat-6. Therefore, the culturemedia tested as a model for gene expression under nutrient limitation is proposed.

KEY WORDS: Metabolism, Dormancy, Adaptation, Stress, Nutrient depletion, Mycobacterium smegmatis, esat-6.

Recibido el 14 de mayo de 2014. Aceptado el 9 de septiembre de 2014.a Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Autónoma de Sinaloa, Boulevard San Ángel S/N, Fraccionamiento San Benito, Predio las Coloradas, Culiacán,

Sinaloa, México.b Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias. México. [email protected]. Correspondencia al segundo autor.c Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. México.d Centro de Innovación y Desarrollo Educativo. México.

Esta investigación fue financiada con recursos del Programa de Fomento y Apoyo a Proyectos de Investigación de la Universidad Autónoma de Sinaloa.

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Héctor M. López-Pérez, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(1):127-139

El agente causal de la tuberculosis estáconformado por el complejo M. tuberculosis,capaz de sobrevivir y crecer dentro de losmacrófagos, un ambiente hostil por la limitaciónde nutrientes y acidificación(1-3). Su adaptaciónse efectúa a través de mecanismos que lepermiten detectar su entorno, regulando losgenes que se expresan o reprimen durante sucrecimiento y reproducción(4), que favorecensu persistencia en el hospedero(5).

Las células pueden responder a estímulosexternos al iniciar un proceso que se da a partirde la unión de un efector a un receptor unidoa la membrana. Este es un mecanismo detransducción, en el que los factores estresantesdesencadenan una respuesta a través de laexpresión de los genes, que preparan a lasbacterias durante el agotamiento de losrecursos(6,7). Hecho que se puede observar invitro en la fase exponencial y son decisivospara la adaptación a las condiciones que sepresenten en la fase estacionaria y sobrevivir(8).Lo anterior, implica que la célula acumuleprotones del medio para mantener lahomeostasis del pH en el citoplasma(9),polifosfatos para la conversión en fuentes deenergía(10). En M. tuberculosis y M. smegmatis,además se acumula el glutamato(11) y laasparagina(12) que se relaciona con la induccióndel aletargamiento de M. tuberculosis(13).

Los bacilos tuberculosos responden a situacionesde estrés por agotamiento de nutrientes, pH ácido,especies reactivas de oxígeno y nitrógeno causadopor su crecimiento en los macrófagos(7,8,14). Pararesponder a estos estímulos, las micobacteriassecretan enzimas como ESAT-6 y CFP-10(2,15),que en las células del hospedero, actúan en losprocesos de necrosis, tales como la lisis delepitelio alveolar y membranas de losmacrófagos, induce la fragmentación del ADN yla permeabilidad de la membrana de lasmitocondrias(15). Entre las funciones metabólicasde las micobacterias, se propone que regulanla transferencia de ADN(16).

M. smegmatis mc2155, mutante de la cepasilvestre M. smegmatis, es 10 a 100 mil veces

Mycobacterium tuberculosis complex is agenetically related group of Mycobacteriumspecies that can cause tuberculosis. Itcharacterizes for its ability to survive and growwithin macrophages, in a stress environmentprovided with nutrient limitation andacidification(1-3). Its adaptation takes placethrough mechanisms that allow to detect itsenvironment, regulating gene expression orrepression during growth and reproduction(4),favoring its persistence in the host(5).

The cells can respond to external stimuli byinitiating a process derived from the binding ofan effector to a receptor joined with themembrane. This is a transduction mechanismin which stress factors can trigger a responsethrough gene expression, preparing the bacteriaduring nutrient depletion(6,7). A fact that canbe observed in vitro during the exponentialphase and is decisive for adaptation toconditions present in the stationary phase andsurvival(8). This involved that the cell accumulateprotons from the environment to maintain pHhomeostasis in the cytosol(9) and polyphosphateto sustain energy(10). In addition, glutamatealso accumulates in M. tuberculosis and M.smegmatis(11) and asparagine(12), which isassociated with induction dormancy of M.tuberculosis(13).

The bacilli respond to stress conditions due tonutrient depletion, acid pH, and reactive oxygenand nitrogen species, caused by their growth inmacrophages(7,8,14). In order to respond tothese stimuli, mycobacteria secrete enzymes, suchas ESAT-6 and CFP-10(2,15), which in the cells ofthe host, act in necrosis processes, such as lysisof alveolar epithelium and membranes ofmacrophages, induction of DNA fragmentation andpermeability of mitochondrial membranes(15).Among the metabolic functions of mycobacteria,they regulate the transfer of DNA(16).

M. smegmatis mc2155, mutant of M. smegmatiswild-type strain, is 10 to 100 times moreefficiently transformed with plasmid vectors, foruse in the analysis of mycobacteria function(17).

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ADAPTACIÓN DE M. SMEGMATIS Y SU EFECTO EN LA EXPRESIÓN DE ESAT-6

más eficiente transformada con plásmidos,utilizada en el análisis de la función de lasmicobacterias(17). Por su rápido crecimiento seha propuesto como modelo para entender loscambios que promueven la adaptación(18) y lapersistencia de las micobacterias patógenas(19).Comparte 12 de 19 genes de virulencia con M.tuberculosis(20), entre los que se encuentranlos genes esat-6 y cfp-10, que codifican paralas proteínas correspondientes secretadas porel sistema ESX-1 (por sus siglas en inglés:Secretion Ejectosoma BOX)(21). Converse yCox(22) observaron el efecto de los medios decultivo en el sistema de secreción ESX-1, por loque proponen que este sistema puede sersensible a uno o más nutrientes del medio decultivo.

Durante el proceso de adaptación, los genesrelacionados con redes metabólicas específicasse expresan como una respuesta al estrésocasionado por la privación de nutrientes(23).La adaptación de las micobacterias cultivada sepuede observar después de la fase estacionaria,al cambiarse a un medio de cultivo frescoreinician su actividad. Por lo que en el presenteestudio se evalúan las condiciones de cultivolimitantes de nutrientes para el crecimiento deM. smegmatis y su relación con la expresióndel gen esat-6.

M. smegmatis mc2155, se creció rutinariamentea 37 ºC en Middlebrook 7H11. Las alícuotasiniciales de los medios de cultivo testigos yprobados, se obtuvieron por inóculo de una coloniade M. smegmatis en 10 ml de medio líquidoMiddlebrook 7H9 y se creció por 24 h hastamedia fase logarítmica (0.8-1.0 DO a 600 nm).

Los medios de cultivo utilizados como controlpara comparar el comportamiento metabólicode los bacilos y expresión del gen esat-6 fueron7H9 y Sauton sin zinc, suplementados amboscon 0.5 y 6 % de glicerol respectivamente y0.05 % de Tween 80, por ser medios en losque expresa el gen esat-6(22). La inoculacióninicial se efectuó con 100 µl del cultivo inicialen frascos de 225 ml con 150 ml de medio

Because of its fast growing, it has beenproposed as model for understanding thechanges that promote adaptation(18) andpersistence of pathogenic mycobacteria(19). Itshares 12 out of 19 virulence genes with M.tuberculosis(20), among them are esat-6 andcfp-10 genes, which encode correspondingproteins secreted by the Secretion EjectosomaBOX(21). Converse and Cox(22) observed theeffect of culture media in the ESX-1 secretionsystem, for which they suggest that this systemcan be sensitive to one or more culture medianutrients.

During the adaptation process, genes relatedto specific metabolic functions are expressedas a response to stress caused by nutrientdepletion(23). The adaptation of culturedmycobacteria can be observed after thestationary phase, changing to fresh culturemedium where they resume their activity;therefore, in the present study, the limitingnutrient conditions for the growth of M.smegmatis and its relationship with esat-6 geneexpression was evaluated.

M. smegmatis mc2155, was grown at 37 °C inMiddlebrook 7H11 agar. The initial aliquots oftest culture and untreated control cultures wereobtained by inoculum of a M. smegmatis colonyin 10 ml of liquid Middlebrook 7H9 mediumand was grown for 24 h until mid-log phase(0.8-1.0 DO at 600 nm).

The culture media used as control for comparingthe metabolic behavior of bacilli and expressionof esat-6 gene and Sauton’s medium withoutzinc, both supplemented with 0.5 and 6% ofglycerol, respectively, and 0.05 % of Tween 80,for being media in which esat-6 geneexpresses(22). The initial inoculation was carriedout using 100 µl of the initial culture in 225 mlflasks with 150 ml of liquid medium and wereincubated at 37 °C and agitated at 250 rpm.

All assay culture media for nutrient limitationderived from HdB minimal medium; pH 7 wasadjusted and 0.2 % of glycerol and 0.05 % of

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líquido, se incubaron a 37 ºC, en agitación a250 rpm.

Todos los medios de cultivo probados para lalimitación de nutrientes se derivan del mediomínimo HdB, se ajustó el pH 7, se adicionó,0.2 % de glicerol, 0.05 % de Tween 80(24),excepto para provocar el agotamiento de C(HdB<C) al que se limitó el glicerol a 0.08 %(v/v). Para los experimentos en los que serequirió el agotamiento de nitrógeno (HdB<N),se usó (NH4)2SO4 a una concentración 100veces menor (0.15 mM) que el usado para elmedio mínimo HdB. Para los experimentoslimitados 100 veces menos en Pi (HdB<Pi), seadicionó K2HPO4 a una concentración final de0.089 mM (0.0155 g L-1) y NaH2PO4 a unaconcentración de 0.0708 mM (0.085 g L-1), parareemplazar la pérdida de capacidad amortiguadorase agregó ácido propanosulfónico 3-(N-morfolino) (MOPS) 50 mM(24). La fase decrecimiento y estacionaria de todos los cultivosse monitoreó a 600 nm DO, hasta las 144 h yse registró el pH final.

El fragmento predicho del gen esat-6 se obtuvopor amplificación del ADN de M. smegmatis apartir de los iniciadores: F-5’ACAGGTATGGAATTTCGCCG-3’, R-5’-CAGGCAAACATTCCCGTGA-3’,los cuales se diseñaron con el programa OligoTM Software DNA Star Program. Para llevar acabo la identificación mediante secuenciaciónenzimática, el producto amplificado se purificómediante un protocolo a base de columnas desilica (QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN®),para ello, el fragmento amplificado se visualizóen el gel de agarosa al 1.2 % a través de untransiluminador de luz UV y se cortó medianteun bisturí estéril, llevando a cabo el protocolomencionado. La calidad y la cantidad de ADNpurificado se observó mediante un gel deagarosa y se procedió a enviar esta muestraamplificada para su secuenciación. El procesode secuenciación se realizó en el LaboratorioNacional de Genómica para la Biodiversidad(LANGEBIO) del Centro de Investigación yEstudios Avanzados (CINVESTAV), UnidadIrapuato, Guanajuato, México, del Instituto

Tween 80 were added, except for depletion of C(HdB<C) to which glycerol was limited to0.08 % (v/v). For the experiments in whichnitrogen depletion was required (HdB<N),(NH4)2SO4 was used at a concentration 100times lower (0.15 mM) than the utilized forHdB minimal medium. For the experimentslimited 100 times lower in Pi (HdB<Pi), K2HPO4was added at a final concentration of 0.089mM (0.0155 g L-1) and NaH2PO4, at aconcentration of 0.0708 mM (0.085 g L-1), forreplacing the loss of buffer capacity, 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) 50mM was added(24). The growth and stationaryphases of all cultures were monitored at 600nm (OD600), until 144 h and final pH wasrecorded.

The predicted fragment incorporating esat-6 genewas obtained by amplification of M. smegmatisgenomic DNA, using primers: F-5’ACAGGTATGGAATTTCGCCG-3’, R-5’-CAGGCAAACATTCCCGTGA-3’,which were designed using the Oligo TMSoftware DNA Star Program. For conductingthe identification by enzymatic sequencing, theamplified product was purified by a protocolbased on silica columns (QIAquick Gel ExtractionKit, QIAGEN®); the amplified fragment wasobserved in agarose gel at 1.2 % through aUV- light transilluminator and it was cut with asterile scalpel, carrying out the aforementionedprotocol. The quality and quantity of purifiedDNA was observed by agarose gel and thisamplified sample was sent for sequencing. Thisprocess was carried out at the LaboratorioNacional de Genómica para la Biodiversidad(LANGEBIO) of the Centro de Investigación yEstudios Avanzados (CINVESTAV), UnidadIrapuato, Guanajuato, México, of the InstitutoPolitécnico Nacional (IPN), based on the ddNTPsmethod(25), using the 3730 XL DNA sequencer(Applied Biosystems, Foster City, CA) and thekit Big Dye Terminator 3.1 (Applied Biosystems,Foster City, CA).

For RNA extraction, M. smegmatis culture wasadapted to the corresponding culture media untilthe beginning of the stationary phase (96 h).

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Politécnico Nacional (IPN), basado por el métododdNTPs(25), utilizando un secuenciador 3730XL DNA, (Applied Biosystems, Foster City, CA)y el kit Big Dye Terminator 3.1 (AppliedBiosystems, Foster City, CA).

Para la extracción de ARN el cultivo de M.smegmatis se adaptó en los medios de cultivocorrespondientes hasta el inicio de la faseestacionaria (96 h). En esta fase se cosechó el30 % de las células, se lavaron con PBS y secolocaron en 150 ml de medio de cultivo frescocon las mismas condiciones nutritivas, seincubaron por 14 h. El ARN se extrajo medianteel uso de TRIzol (Invitrogen®). Se observó porelectroforesis en geles de agarosa (1.2 %) conMOPS X (200 mM de MOPS, 50 mM de acetatode sodio, y 10 mM de EDTA, pH 7) y 3.15 %de formaldehído. La electroforesis se corrió enuna solución amortiguadora TAE (40/1 mM pH8.0).

La hibridación Northern se efectuó a partir de8 a 12 ng del ARN extraído, transferido porcapilaridad descendente en membranas denailon, en citrato de sodio y cloruro de sodio20X. El ARN se fijó con luz ultravioleta durante5 min. La sonda se elaboró a partir delfragmento del gen esat-6 amplificado por PCRy marcada con biotina acoplada a fosfatasaalcalina (Gene Images Alkphos Direct Labellingand Detection System-GE Health Care®). Lahibridación se efectuó durante toda la noche yse reveló por autoradiografía (Hyperfilm-MPautoradiography, Amersham PharmaciaBioscience®)(26).

Los datos obtenidos del crecimiento y pH, seobtuvieron de seis repeticiones y se aplicó laprueba t de student, para expresar losresultados de la media, el error estándar de lamedia y las correspondientes comparacionesentre ellas de todos los cultivos de M.smegmatis(27).

En los medios de cultivo probados, se observóa M. smegmatis con crecimiento más bajo enlos medios HdB<N, HdB<C (0.659 y 1.697)

In this phase, 30 % of cells were cultured,washed with PBS and placed in 150 mL offresh culture medium under the same nutritionalconditions and they were incubated for 14 h.RNA was extracted using TRlzol (Invitrogen®);it was observed by electrophoresis in agarosegels (1.2 %) using MOPS X (200 mM of MOPS,50 mM of sodium acetate and 10 mM of EDTA,pH 7), and 3.15 % of formaldehyde.Electrophoresis was ran in TAE buffer solution(40/1 mM pH 8.0).

Northern blot hybridization was performedstarting from 8 to 12 ng of extracted RNA,capillary transferred onto nylon membranes,sodium citrate and sodium chloride 20X. DNAwas fixed using ultraviolet light for 5 min. Theprobe was derived from fragments of esat-6gene, amplified by PCR and labelled asbiotinylated alkaline phosphatase (Gene ImagesAlkphos Direct Labelling and Detection System-GE Health Care®). Hybridization was performedall night and was revealed by autoradiography(Hyperfilm-MP autoradiography, AmershamPharmacia Bioscience®)(26).

The growth and pH data were obtained fromsix repetitions and Student’s t- test was used toexpress the results of the mean, standard errorof the mean and corresponding comparisonsbetween all M. smegmatis cultures(27).

In the testing culture media, M. smegmatis wasobserved with lower growth in HdB<N, HdB<C(0.659 and 1.697) media, in comparison to HdBminimal culture and HdB<Pi (2.170 and 1.982)(P<0.05). In addition, M. smegmatis in HdB<Pihas similar growth in HdB minimal culture(P>0.05) (Figure 1). This is indicative of acontinuous growth in spite of stress conditionsdue to a decrease 100 times Pi. With theexception of HdB<Pi culture, in the rest of thetesting and control media used, M. smegmatisresume its growth while changing it to a freshculture medium, after 144 h of culture.

In HdB<Pi culture medium, a relationshipbetween growth, loss of acid-alcohol resistance

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respecto al medio de cultivo HdB mínimo yHdB<Pi (2.170 y 1.982) (P<0.05). Además, M.smegmatis en HdB<Pi tiene un crecimientosimilar al cultivo en HdB mínimo (P>0.05)(Figura 1). Lo que es indicativo de uncrecimiento continuo a pesar de las condicionesde estrés por la disminución de 100 veces Pi.Con excepción del cultivo en HdB<Pi, en losdemás medios de cultivo probados y los usadoscomo controles, M. smegmatis reanuda sucrecimiento al cambiarlo al medio de cultivofresco correspondiente, después de 144 h decultivo.

En el medio de cultivo HdB<Pi se observó unarelación entre el crecimiento de M. smegmatis,el pH y la pérdida de resistencia alcohol-ácido.Es decir, a mayor número de horas de cultivo(144 h), se disminuyó el pH (5.4 ± 0.16),aunado a la incapacidad de recuperar suactividad metabólica cuando se cambia el cultivoa medio fresco. Esto se observó por los cúmulosde células teñidas con el color característico dela técnica Ziehl-Neelsen desaparecen partir de

of M. smegmatis, and pH was observed. Thatis, by higher number of culture hours (144),pH was decreased (5.4 ± 0.16), and themycobacteria showed incapacity to recuperateits metabolic activity when the culture waschanged to a fresh medium. This was observedin cumulus cells stained with the characteristiccolor of Ziehl-Neelsen technique, whichdisappeared from 100 h, until all cells werestained blue-colored (Figures 2a and 2b).

With the exception of HdB<Pi culture medium,mycobacteria in limited nutrient culture mediahave a slow growth until they reach thestationary phase. Additionally, bacteria grownin HdB<P gradually lose their resistance to acid-alcohol from 96 h, not recovering it until 144 hof culture, when bacteria were changed to freshmedium. For which the 96 h were taken intoconsideration for changing M. smegmatis tofresh culture media, extract total RNA after12 ± 1 h (Figure 3A) and perform Northernhybridization. This assay reveals that M.smegmatis cultured in HdB<C, HdB<N and HdB

Figura 1. M. smegmatis crecido a 144 h en los medios de cultivo usados para el experimento

HdB<N (0.659±0.12), Sauton (1.559±0.03), HdB<C (1.697±0.07), HdB<Pi

(1.982±0.11) HdB mínimo (2.170±0.12) y 7H9 (2.638±0.12)

Figure 1. M. smegmatis grown until 144 h in culture media used for experiments: HdB<N

(0.659±0.12), Sauton (1.559±0.03), HdB<C (1.697±0.07), HdB<Pi (1.982±0.11) HdB

minimal (2.170±0.12) and 7H9 (2.638±0.12)

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las 100 h hasta teñirse todas las células decolor azul (Figuras 2a y 2b).

Con excepción del medio HdB<Pi, lasmicobacterias en los medios de cultivorestringidos en nutrientes tienen un menorcrecimiento hasta la fase estacionaria. Además,las bacterias crecidas en HdB<Pi pierdenpaulatinamente su capacidad de resistencia alalcohol-ácido a partir de las 96 h, para no volvera recuperarla después de 144 h de cultivo,cuando las bacterias se cambiaron a mediofresco. Por lo que las 96 h se tomaron encuenta para hacer los cambios de M. smegmatisa medios de cultivo fresco de todas las pruebas,extraer el ARN total 12 ± 1 h después (Figura3A) y llevar a cabo la hibridación Northern.Esta prueba revela que M. smegmatis cultivadoen HdB<C, HdB<N, y HdB medio mínimo, noexpresa el gen esat-6. Sin embargo, el cultivolimitado 100 veces en Pi (Figura 3B carril 7) si

minimal medium, does not express esat-6 gene.However, the culture limited 100 times in Pi(Figure 3B, lane 7) did showed the expression, ina similar way as the culture media used as control(7H9 and Sauton, lanes 1 and 3, Figure 3B).

The probe elaborated from esat-6 fragment wassequenced and was referred to GeneBanknumber SeqID KR363260. The homologycomparison consulted on the databasecorresponds to esat-6 gene and is located insite 87 387 to 87 604 pb of the completegenome sequencing of M. smegmatis strainMC2155 (ID: gb|CP000480.1).

The mycobacterial capacity to accumulateenergy sources, allows them to in vivo persistthe infection phase(28). In this sense, in vitromycobacteria achieve to adapt to nutrientdepletion and survive for more than 650 d(24),due to energy accumulation of the stored

Figura 2. M. smegmatis a) Pérdida de resistencia alcohol-ácido en cultivo HdB<Pi a 96 horas.

b) mismo cultivo cambiado a medio fresco 1 hora después, en el que se observa

la recuperación de la capacidad de respuesta al alcohol-ácido

Figure 2. M. smegmatis a) Loss of acid-alcohol resistance in HdB<Pi culture medium through

96 h. b) Same culture changed to fresh medium 1 h after, where recovery of capacity

of response to acid-alcohol is observed

a b

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se observó la expresión, de manera similar alos medios de cultivo usados como control (7H9y Sauton carriles 1 y 3 de la Figura 3B).

La sonda elaborada a partir del fragmento deesat-6, se secuenció y se remitió al GeneBankcon el número SeqID KR363260. La comparaciónhomológica consultada en la base de datoscorresponde al gen esat-6, y se localiza en elsitio del 87,387 a 87,604 pb de la secuencia delgenoma completo de M. smegmatis cepaMC2155 (ID: gb|CP000480.1).

La capacidad que poseen las micobacterias paraacumular las fuentes de energía, les permitenpersistir in vivo durante la fase de infección(28).En este mismo sentido, las micobacterias invitro logran adaptarse al agotamiento de losnutrientes y sobrevivir por más de 650 días(24),debido a la acumulación de energía de loscompuestos almacenados y de la degradaciónde proteínas innecesarias y ARNm bacteriano(6).Esto puede provocar una situación emergente,en la cual las micobacterias responden al

compounds and degradation of unnecessaryproteins and bacterial RNA(6). This can causean emergency situation, where mycobacteriarespond to the environment through geneswhich regulate adequate changes to theconditions imposed. Thus, the model of thepresent study allows to observe esat-6 geneexpression of M. smegmatis in HdB<Pi.

The adaptation of M. smegmatis for up to 144 his evident in all culture media, with the exceptionof the mycobacteria grown in HdB<Pi (Figure 1).For which it poses instability of the bacteria tothe culture, because of its continuous growthwith respect to the HdB minimal medium(P>0.05) and its inactive metabolism after 144 hwhen changing the mycobacteria to a freshculture, where the loss of acid-alcohol capacityis observed (Figure 2: a and b); similar resultsin M. tuberculosis were obtained by Rifat et al(29),when limiting Pi in 7H9 medium.

This suggests, under the proposed conditions,the existence of a state of emergency, in which

Figura 3. M. smegmatis A) ARN total de la bacteria en los medios de cultivo: 1) 7H9, 2) HdB medio

mínimo, 3) Sauton sin Zinc, 4) variable no controlada 5) HdB<N, 6) HdB<C, 7) HdB<Pi.

B) Mismos carriles con los resultados de la hibridación Northern para el gen esat-6

Figure 3. M. smegmatis A) Total RNA of the bacteria in culture media: 1) 7H9, 2) HdB minimal

culture, 3) Sauton without zinc, 4) not controlled variable 5) HdB<N, 6) HdB<C, 7) HdB<Pi.

B) Same lanes with the results of Northern hybridization for esat-6 gene

1 2 3 4 5 6 7

A)

B)

135


ambiente a través de los genes que regulan loscambios adecuados a las condiciones impuestas.De esta manera, el modelo del presente estudiopermite observar la expresión del gen esat-6de M. smegmatis en HdB<Pi.

La adaptación de M. smegmatis hasta por 144 hes evidente en todos los medios de cultivo,excepto para las micobacterias crecidas por enHdB<Pi (Figura 1). Por lo cual se plantea lainestabilidad de la bacteria al cultivo, por sucrecimiento continuo con respecto al cultivo enHdB mínimo (P>0.05) y su metabolismo inactivodespués de 144 h al cambiar las micobacteriasa un medio de cultivo fresco, en donde seobserva la pérdida de la capacidad alcohol-ácido(Figura 2: a y b), resultados similares a los deRifat et al(29) al restringir Pi en medio 7H9 enel crecimiento de M. tuberculosis.

Esto hace suponer bajo las condicionespropuestas, la existencia del estado deemergencia, en el cual M. smegmatis puedetener diferentes formas de adaptación, dondese comprometen diversas rutas de transducciónmediante los cuales las micobacterias detectany dan una respuesta al medio. Estas rutas,pueden estar relacionados con la alarmonappGpp que desencadena la respuesta estricta.Un mecanismo indispensable para la adaptaciónde las bacterias durante la transición de la faseexponencial a la fase estacionaria(30-32). Alrespecto, en E. coli, la carencia de aminoácidos,carbono, o Pi, se acompaña por el incrementode los niveles de ppGpp y se observanacumulaciones de polifosfatos(33,34).

Bajo las condiciones limitantes de Pi y uncrecimiento sostenido muy cercano al HdB mediomínimo (Figura 1), M. smegmatis aparentementetermina los recursos externos y las reservas deenergía interna. Para evitar este desgaste delas reservas de energía se ha propuesto larespuesta estricta, que se caracteriza por laregulación de ppGpp, que incrementa laciclopropanación(35), la inhibición y síntesis delos ácidos grasos y los fosfolípidos(36). Aunquela propuesta de la respuesta estricta está

M. smegmatis can have different forms ofadaptation, where several signal transductionpathways are involved by which mycobacteriadetect and give response to the environment.These pathways can be associated withalarmone, which triggers the stringent response.An indispensable mechanism for bacterialadaptation during the transition of theexponential phase to the stationary phase(30-32).In this regard, in E. coli, lack of amino acids,carbon or Pi, is followed by an increase in ppGpplevels and polyphosphate accumulation(33,34).

Under limiting conditions of Pi and a sustainedgrowth very near to HdB minimal medium(Figure 1), M. smegmatis apparently finishesthe external sources and the internal energyreserves. In order to avoid this wear down ofenergy reserves, the stringent response hasbeen proposed, which is characterized by ppGppregulation that increases cyclopropanation(35),inhibition and synthesis of fat acids andphospholipids(36). Although the proposal of thestringent response is associated with thepossibility of stabilization of the metabolism foradaptation of mycobacteria to stress conditions,that is, under conditions of abundance,polyphosphates can be used as donors of ADP,GDP and other reactions in which the Relenzyme is involved, acting in the synthesis andhydrolysis of ppGpp(5,37). However, when thereare not enough Pi reserves and energy reservesare minimal, it is probable that the stringentresponse fails so that M. smegmatis adapts andits metabolic state does not let it respondimmediately to favorable changes to renew itsgrowth, as it happened in the present study.

An increase in ppGpp levels and polyphosphatesinduces the transcription of 150 genes involvedin the slowdown of growth and metabolism(38).Rather, what has been found in this study withrespect to Pi limitation in HdB, is that growthis maintained similar to HdB minimal medium(P<0.05), where Pi is not limited. Conversely,the esat-6 gene expression in HdB<Pi thatoccurred at mRNA level (Figure 3B), which iscomparable to 7H9 and Sauton, although the

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protein encoded by this gene is only secretedin Sauton medium(22), it is necessary todetermine whether under HdB<Pi cultureconditions, esat-6 protein is secreted. Thisprotein has also been proposed as anATPase(39), which modifies the properties ofthe phagosome compartment, where M.tuberculosis reside, as evidenced by aberrantretention or imperfect acquisition of a range ofproteins of the host, including RabGTPases(40,41) and vacuolar (H+)-ATPase(42).

In M. smegmatis and M. tuberculosis,polyphosphates regulate ppGpp synthesisthrough transcriptional control of relA via mprA-sigE-relA pathway(37,43). There are othersystems of the two components that cancontribute to the regulation of relA.Consequently, it is proposed as prospect to studythe relationships between regulators of Pi-dependent gene expression, including SenX3-RegX3 and its relationship with genes thatregulate the ESX-1 system and secretion of theproteins in M. smegmatis(44). Pang et al(45)

confirm that in M. tuberculosis, esat-6 is notregulated by MprAB under growth in standard7H9. Therefore, it is important to understandwhether esat-6 of M. smegmatis is regulatedby this system under Pi-limiting conditions. Thestudies of Rifat et al(29), focused on Pi limitation,show that esat-6 does not express in M.tuberculosis, when they limited Pi in 7H9medium with L-glutamate as source of organicnitrogen; however, in this model, Pi is limitedand the nitrogen source is inorganic. Pang etal(45) also report that at least there is an indirectregulation of ESX-1 by PhoPR. Thereon, it issuggested to research the relationships betweenPi limitation and PhoPR, under the proposedmodel in this research.

In conclusion, M. smegmatis adapts to HdBminimal medium, HdB<C and HdB<N, andresumes its metabolic activity in fresh medium,but it does not express esat-6 gene. However,in HdB<Pi medium, M. smegmatis shows acontinuous exponential growth phase,statistically similar to HdB medium (P<0.05),

relacionada con la posibilidad de la estabilizacióndel metabolismo para la adaptación de lamicobacteria a las condiciones de estrés, esdecir, bajo condiciones de abundancia, lospolifosfatos pueden servir como donadores deADP, GDP, y otras reacciones en las que seinvolucra la enzima Rel que actúa en la síntesise hidrólisis de ppGppp(5,37). Pero cuando nohay suficientes reservas de Pi y las reservas deenergía son mínimas, es probable que larespuesta estricta falle para que M. smegmatisse adapte, y su estado metabólico no le permitaresponder de inmediato a los cambios favorablespara reanudar su crecimiento, como lo sucedidoen el presente estudio.

Un incremento en los niveles de ppGpp ypolifosfatos induce la transcripción de 150 genesinvolucrados en la disminución del crecimientoy el metabolismo(38). Por el contrario, loencontrado en la presente investigación respectoa la limitación de Pi en HdB, es que se mantieneel crecimiento, similar al del medio HdB mínimoen el que no se restringe el Pi (P<0.05). Porotra parte, la expresión de gen esat-6 en HdB<Pique se dio a nivel de los ARNm (Figura 3B),que es comparable a 7H9 y Sauton, aunque laproteína codificada por este gen, se secretasólo en el medio Sauton(22), lo que falta pordeterminar es si bajo las condiciones de cultivoHdB<Pi se secreta la proteína ESAT-6. Estaproteína, también se ha propuesto como unaATPasa(39), que modifica las propiedades delcompartimiento del fagosoma donde reside M.tuberculosis, como lo evidenciado por laretención aberrante o adquisición defectuosade un rango de proteínas del hospedero, entrelas que se incluyen las Rab GTPasas(40,41) y laprotón-ATPasa de la vacuola(42).

En M. smegmatis y M. tuberculosis, lospolifosfatos regulan la síntesis de ppGpp a travésdel control de la transcripción de relA vía laruta mprA-sigE-relA(37,43). Existen otrossistemas de los dos componentes que puedencontribuir a la regulación de relA. Por lo que seplantea como perspectivas, estudiar lasrelaciones entre los reguladores de la expresión

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de los genes que dependen de Pi. Entre ellos,está SenX3-RegX3 y su relación con los genesque regulan el sistema ESX-1 y las proteínas desecreción en M. smegmatis(44). Pang et al(45),confirman que en M. tuberculosis, esat-6 no esregulado por MprAB bajo crecimiento en 7H9normal. Por lo que se debe entender si esat-6de M. smegmatis es regulado por este sistemaen condiciones limitantes de Pi. Al respecto, losestudios de Rifat et al(29), enfocados a larestricción de Pi, demuestran que no se expresaesat-6 en M. tuberculosis, cuando restringieronel Pi en medio 7H9 con L-glutamato como fuentede nitrógeno orgánico; sin embargo, en estemodelo se limita el Pi y la fuente de nitrógenoes inorgánico. Pang et al(45) también indicanque al menos indirectamente hay una regulacióndel ESX-1 por PhoPR. Por lo que se proponeinvestigar las relaciones entre la limitación dePi y PhoPR, bajo el modelo propuesto en estainvestigación.

En conclusión, M. smegmatis se adapta a HdBmedio mínimo, HdB<C y HdB<N y reanuda suactividad metabólica en medio fresco, pero noexpresa el gen esat-6. En cambio el medio decultivo HdB<Pi, M. smegmatis presenta una fasede crecimiento exponencial continuo,estadísticamente similar al de HdB medio mínimo(P<0.05), manifiesta un estado metabólico enel cual pierde su capacidad ácido-resistente enla fase estacionaria y expresa el gen esat-6después del cambio del medio de cultivo a 96 hal medio de cultivo fresco correspondiente. Porlo anterior se propone al modelo de investigaciónpara la expresión génica en condiciones deestrés por nutrientes.

AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Clara Espitia Pinzón del InstitutoNacional de Investigaciones Biomédicas de laUNAM por la aportación de la cepa M.smegmatis mc2155. A la comunidad del Centrode Innovación y Desarrollo Educativo y el Centrode Estudios Justo Sierra.

manifesting a metabolic state in which it losesresistant-acid capacity in the stationary phaseand expresses the esat-6 gene after changingthe culture medium to 96 h into thecorresponding fresh culture medium.Consequently, the model of research for geneticexpression under nutrient stress conditions isproposed.

ACKNOWLEDGEMENTS

Special thanks to Dr. Clara Espitia Pinzon at theInstituto Nacional de Investigaciones Biomédicasof the UNAM for the contribution of M.smegmatis strain mc2155 and to the communityof the Centro de Innovación y DesarrolloEducativo and Centro de Estudios Justo Sierra,Sinaloa State.


LITERATURA CITADA

1. Parish T, Smith DA, Kendall S, Casali N, Bancroft GJ, StokerNG. Deletion of two-component regulatory systems increasesthe virulence of Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun2003;71(3):1134-40.

2. de Jonge MI, Pehau-Arnaudet G, Fretz MM, Romain F, BottaiD, Brodin P, et al. ESAT-6 from Mycobacterium tuberculosisdissociates from its putative chaperone CFP-10 under acidicconditions and exhibits membrane-lysing activity. J Bacteriol2007;189(16):6028-34.

3. Rohde KH, Abramovitch RB, Russell DG. Mycobacteriumtuberculosis invasion of macrophages: linking bacterial geneexpression to environmental cues. Cell Host Microbe2007;2(5):352-64.

4. Abramovitch RB, Rohde KH, Hsu FF, Russell DG. aprABC: aMycobacterium tuberculosis complex-specific locus thatmodulates pH-driven adaptation to the macrophagephagosome. Mol Microbiol 2011;80(3):678-94.

5. Dahl JL, Kraus CN, Boshoff HI, Doan B, Foley K, AvarbockD, et al. The role of RelMtb-mediated adaptation to stationaryphase in long-term persistence of Mycobacterium tuberculosisin mice. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100(17):10026-31.

6. Siegele DA, Kolter R. Life after log. J Bacteriol1992;174(2):345-8.

7. Gebhard S, Humpel A, McLellan AD, Cook GM. The alternativesigma factor SigF of Mycobacterium smegmatis is requiredfor survival of heat shock, acidic pH and oxidative stress.Microbiology 2008;154(Pt 9):2786-95.

138


8. Humpel A, Gebhard S, Cook GM, Berney M. The SigF regulonin Mycobacterium smegmatis reveals roles in adaptation tostationary phase, heat, and oxidative stress. J Bacteriol2010;192(10):2491-2502.

9. Slonczewski JL, Rosen BP, Alger JR, Macnab RM. pHhomeostasis in Escherichia coli: measurement by 31P nuclearmagnetic resonance of methylphosphonate and phosphate.Proc Natl Acad Sci USA 1981;78(10):6271-6275.

10. Pepin CA, Wood HG. Polyphosphate glucokinase fromPropionibacterium shermanii. Kinetics and demonstration thatthe mechanism involves both processive and nonprocessivetype reactions. J Biol Chem 1986;261(10):4476-4480.

11. Lyon RH, Rogers P, Hall WH, Lichtein HC. Inducible glutamatetransport in Mycobacteria and its relation to glutamateoxidation. J Bacteriol 1967;94(1):92-100.

12. Sritharan V, Ratledge C, Wheeler PR. Effect of homoserineon growth of Mycobacterium smegmatis: inhibition ofglutamate transport by homoserine. J Gen Microbiol1987;133(10):2781-2785.

13. Malhotra V, Tyagi JS, Clark-Curtiss JE. DevR-mediatedadaptive response in Mycobacterium tuberculosis H37Ra:links to asparagine metabolism. Tuberculosis (Edinb)2009;89(2):169-174.

14. Ganguly N, Giang PH, Gupta C, Basu SK, Siddiqui I, SalunkeDM, et al. Mycobacterium tuberculosis secretory proteinsCFP-10, ESAT-6 and the CFP10:ESAT6 complex inhibitlipopolysaccharide-induced NF-kappaB transactivation bydown regulation of reactive oxidative species (ROS)production. Immunol Cell Biol 2008;86(1):98-106.

15. Welin A, Eklund D, Stendahl O, Lerm M. Human macrophagesinfected with a high burden of ESAT-6-expressing M.tuberculosis undergo caspase-1- and cathepsin B-independent necrosis. PLoS One 2011;6(5):e20302.

16. Flint JL, Kowalski JC, Karnati PK, Derbyshire KM. The RD1virulence locus of Mycobacterium tuberculosis regulates DNAtransfer in Mycobacterium smegmatis. Proc Natl Acad SciUSA 2004;101(34):12598-12603.

17. GenBank of National Center for Biotechnology Information.<http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr_118168627>.

18. Cox RA, Garcia MJ. Adaptation of mycobacteria to growthconditions: a theoretical analysis of changes in geneexpression revealed by microarrays. PLoS One2013;8(4):e59883.

19. Ojha AK, Mukherjee TK, Chatterji D. High intracellular levelof guanosine tetraphosphate in Mycobacterium smegmatischanges the morphology of the bacterium. Infect Immun2000;68(7):4084-4091.

20. Berthet FX, Rasmussen PB, Rosenkrands I, Andersen P,Gicquel B. A Mycobacterium tuberculosis operon encodingESAT-6 and a novel low-molecular-mass culture filtrateprotein (CFP-10). Microbiology 1998;144(Pt 11):3195-3203.

21. Brodin P, Majlessi L, Marsollier L, de Jonge MI, Bottai D,Demangel C, et al. Dissection of ESAT-6 system 1 ofMycobacterium tuberculosis and impact on immunogenicityand virulence. Infect Immun 2006;74(1):88-98.

22. Converse SE, Cox JS. A protein secretion pathway criticalfor Mycobacterium tuberculosis virulence is conserved andfunctional in Mycobacterium smegmatis. J Bacteriol2005;187(4):1238-1245.

23. Lamarche MG, Wanner BL, Crepin S, Harel J. The phosphateregulon and bacterial virulence: a regulatory networkconnecting phosphate homeostasis and pathogenesis. FEMSMicrobiol Rev 2008;32(3):461-473.

24. Smeulders MJ, Keer J, Speight RA, Williams HD. Adaptationof Mycobacterium smegmatis to stationary phase. J Bacteriol1999;181(1):270-283.

25. Sanger F, Nicklen S, Chase AR. DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci 1977;74(12):5463-5468.

26. Sambrook J, Russell DW. The condensed protocols fromMolecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor,NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2006:420-478.

27. Dowdy S. Weardon S. Chilko D. Statistics for research.Chapter 8: Student’s t distribution. Third ed. New Jersey:John Wiley & Sons, Inc.; 2004:178-210.

28. Gomez JE, McKinney JD. M. tuberculosis persistence, latency,and drug tolerance. Tuberculosis (Edinb) 2004;84(1-2):29-44.

29. Rifat D, Bishai WR, Karakousis PC. Phosphate depletion: anovel trigger for Mycobacterium tuberculosis persistence. JInfect Dis 2009;200(7):1126-1135.

30. Artsimovitch I, Patlan V, Sekine S, Vassylyeva MN, HosakaT, Ochi K, et al. Structural basis for transcription regulationby alarmone ppGpp. Cell 2004;117(3):299-310.

31. Gralla JD. Escherichia coli ribosomal RNA transcription:regulatory roles for ppGpp, NTPs, architectural proteins anda polymerase-binding protein. Mol Microbiol 2005;55(4):973-977.

32. Costanzo A, Ades SE. Growth phase-dependent regulationof the extracytoplasmic stress factor, sigmaE, by guanosine3',5'-bispyrophosphate (ppGpp). J Bacteriol 2006;188(13):4627-4634.

33. Ahn K, Kornberg A. Polyphosphate kinase from Escherichiacoli. Purification and demonstration of a phosphoenzymeintermediate. J Biol Chem 1990;265(20):11734-11739.

34. Spira B, Yagil E. The relation between ppGpp and the PHOregulon in Escherichia coli. Mol Gen Genet 1998;257(4):469-477.

35. Eichel J, Chang YY, Riesenberg D, Cronan JE, Jr. Effect ofppGpp on Escherichia coli cyclopropane fatty acid synthesisis mediated through the RpoS sigma factor (sigmaS). JBacteriol 1999;181(2):572-576.

36. Heath RJ, Jackowski S, Rock CO. Guanosine tetraphosphateinhibition of fatty acid and phospholipid synthesis inEscherichia coli is relieved by overexpression of glycerol-3-phosphate acyltransferase (plsB). J Biol Chem1994;269(42):26584-26590.

37. Sureka K, Dey S, Datta P, Singh AK, Dasgupta A, RodrigueS, et al. Polyphosphate kinase is involved in stress-inducedmprAB-sigE-rel signalling in mycobacteria. Mol Microbiol2007;65(2):261-276.

38. Hengge-Aronis R. Signal transduction and regulatorymechanisms involved in control of the sigma(S) (RpoS)subunit of RNA polymerase. Microbiol Mol Biol Rev2002;66(3):373-395.

39. Pallen MJ. The ESAT-6/WXG100 superfamily — and a newGram-positive secretion system? Trends Microbiol2002;10(5):209-212.

139


40. Via LE, Deretic D, Ulmer RJ, Hibler NS, Huber LA, DereticV. Arrest of mycobacterial phagosome maturation is causedby a block in vesicle fusion between stages controlled byrab5 and rab7. J Biol Chem 1997;272(20):13326-13331.

41. Clemens DL, Lee BY, Horwitz MA. Deviant expression ofRab5 on phagosomes containing the intracellular pathogensMycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila isassociated with altered phagosomal fate. Infect Immun2000;68(5):2671-2684.

42. Sturgill-Koszycki S, Schlesinger PH, Chakraborty P, HaddixPL, Collins HL, Fok AK, et al. Lack of acidification inMycobacterium phagosomes produced by exclusion of thevesicular proton-ATPase. Science 1994;263(5147):678-681.

43. Manganelli R, Voskuil MI, Schoolnik GK, Smith I. TheMycobacterium tuberculosis ECF sigma factor sigmaE: rolein global gene expression and survival in macrophages. MolMicrobiol 2001;41(2):423-437.

44. Glover RT, Kriakov J, Garforth SJ, Baughn AD, Jacobs WR,Jr. The two-component regulatory system senX3-regX3regulates phosphate-dependent gene expression inMycobacterium smegmatis. J Bacteriol 2007;189(15):5495-5503.

45. Pang X, Samten B, Cao G, Wang X, Tvinnereim AR, Chen XL,et al. MprAB Regulates the espA Operon in Mycobacteriumtuberculosis and Modulates ESX-1 Function and HostCytokine Response. J Bacteriol 2013;195(1):66-75.

140


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