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VIROLOGIA AMBIENTAL:
Desafios da Detecção de Vírus
Gastrentéricos em Águas e AlimentosDra. Adriana de Abreu Corrêa
Pesquisadora Visitante
Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental
Setembro/2011
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Conjunto de fatores físicos, químicos, bióticos e climáticos, que age sobre um determinado organismo ou uma comunidade ecológica, determinando a forma de convivência e de
sobrevivência de quem nele habita.
Meio Ambiente
MEIO AMBIENTE
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O QUE RECEBEMOS …
Meio Ambiente
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O QUE DEVOLVEMOS …
Meio Ambiente
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•Hidrocarbonetos;
•Metais Pesados;
•Pesticidas;
•Toxinas Marinhas;
•Potenciais Carcinógenos;
•Alergenos;
•Materiais Radioativos;
•Patógenos: Agentes Causadores de Alguma Enfermidade (em geral, EPISÓDIOS AGUDOS).
Meio Ambiente
FONTES DE CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL
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Diversas Doenças
Bactérias
Protozoários
Vírus
Biotoxinas
Meio Ambiente
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A água atua como carreador passivo do agente infeccioso
Agentes etiológicos : patógenos excretados nas fezes, capazes de iniciar uma infecção
Doenças de Veiculação Hídrica
Doenças transmitidas pelo consumo de águaou alimentos contaminados ou após
contato direto pela pele ou ingestão de águas de recreação poluídas
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Bact�rias:Coliformes fecais, Vibrio spp., Salmonella spp., Listeria sp., Clostridiumsp., Aeromonas spp., E.coli, Yersinia enterolytica, Campylobacter sp.,
etc.)
Parasitas:Cryptosporidium sp.; Giardia sp., etc.
V�rus : Vírus Entéricos
AGENTES MICROBIOL�GICOS ASSOCIADOS COM DOEN�AS
DE VEICULA��O H�DRICA
“WATERBORNE e FOODBORNE DISEASES”
Doenças de Veiculação Hídrica
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Vias de contaminação dos alimentos
-Cultivo de Moluscos Bivalvesem águas contaminadas
- Manipuladores contaminados(sinto ou assintomáticos)
- Fômites contaminados
- Irrigação e/ou lavagem dos alimentos com água contaminada
Vírus em Alimentos
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- 1914 – Primeiro surto viral de origem alimentar – Poliomielite relacionadoao consumo de leite.
- 1956 e 1962 - Primeiros surtos de HAV por moluscos bivalves, na Su�cia e EUA, respectivamente.
- No in�cio da d�cada de 1970, surtos n�o-bacterianos de gastroenterite foram registrados, mas nenhum agente p�de ser isolado in vitro. Estudos posterioresfocaram na transmiss�o viral por moluscos bivalves, e no potencial risco de transmiss�o viral pelo uso de �gua contaminada para irriga��o.
- 1990 - Disponibilidade de m�todos moleculares, os v�rus foram implicados como os principais agentes etiol�gicos de doen�as de origem alimentar no mundo.
Virus em Alimentos: Histórico
v�rus da hepatite A,norov�rus, astrov�rus e
rotav�rus
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DISTINTAS FAM�LIAS VIRAIS IGUAL VIA DE TRANSMISS�O: FECAL – ORAL
Vírus Entéricos
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- N�O ENTEROPATOG�NICOS OU QUE CAUSAM DOEN�AS N�O RELACIONADAS AO EPIT�LIO INTESTINAL –
POLIOVIRUS, COXSACKIE A E B, ECHOVIRUS, HAV, HEV
- V�RUS RESPONS�VEIS PELAS GASTRENTERITES AGUDAS EM HUMANOS –ROTAVIRUS, ADENOVIRUS ENT�RICOS,
ASTROVIRUS E CALICIVIRUS
- ENTEROPAT�GENOS SEM RELA��O CAUSAL COMPROVADA – CORONAVIRUS, ENTEROVIRUS, TOROVIRUS,
PARVOVIRUS E REOVIRUS.
Vírus Entéricos
MAIS DE 15 GRUPOS DIFERENTES DE V�RUS INCLUINDO 140 SUBTIPOS DIVIDIDOS DE ACORDO A EPIDEMIOLOGIA
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(Abdel-Moety et al, 2008)
Doenças Virais de Veiculação Hídrica
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GRANDE N�MERO DE PART�CULAS VIRAIS ELIMINADAS NAS FEZES DE INDIVIDUOS INFECTADOS (105 – 1011/G)
BAIXA DOSE INFECCIOSA (O CONTATO COM APENAS UMA �NICA PART�CULA VIRAL � CAPAZ DE DESENCADENAR UMA INFEC��O
ESTABILIDADE DOS V�RUS
• NO ESGOTO: RESISTEM AOS TRATAMENTOS
• NOS SEDIMENTOS: ADSORVEM-SE AOS SEDIMENTOS
• NOS MOLUSCOS: ADSORVEM-SE AOS TECIDOS (BR�NQUIAS E TRATO GASTROINTESTINAL)
Disseminação Viral no Ambiente
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2,4 bilhões de pessoas não dispõem de tratamento de água morbidade e mortalidade devido a doenças causadas por microorganismos presentes em água.
Segundo o Banco Mundial, mais de 2,2 milhões de pessoas morrem anualmente devido ao consumo de água contaminada (JFSP, 04/12/2004).
¼ dos leitos hospitalares são ocupados por pacientes com complicações decorrentes de infecções de veiculação hídrica.
Aumento do número de surtos de doenças virais entéricas de veiculação hídrica.
(Straub & Chandler, 2003)
Virologia Ambiental
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NÚMERO DE CASOS DE GASTRENTERITES EM CRIANÇAS < 5 ANOS
18 milhões de hospitalizações
111 milhões de casos domiciliares
2 bilhões de casos
25 milhões de consultas
1.7 milhão de óbitos
40-60% dos casos de etiologia viralAho, 2000 et al.; Mitchell, 2002; Kosek, 2003; Parashar et al., 2003 ; WHO 2005
Ministério da Saúde, 20023.070 óbitos de crianças < 5
anos por doenças diarréicas em todo o Brasil ( 1/3 viral)
Virologia Ambiental
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Virologia Ambiental
Qual a importância de conhecimentos sobre a Virologia Ambiental???
Estudos Epidemiólogicos
Vias de Transmissão
Controle de Contaminação
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VIROLOGIA AMBIENTALQUANDO COMEÇOU?
Virologia Ambiental
História, Metodologias, Aplicação e Desafios
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1965 - I Confer�ncia Internacional – “Transmission of
Viruses by the Water Route”, Cincinatti, Estados
Unidos da Am�rica
Objetivos deste Encontro :
- Desenvolver métodos quantitativos adequados para detectar a
transmissão viral através da água
- Verificar como os vírus podem sobreviver, sem serem detectados, em
condições nas quais se consegue eliminar coliformes fecais
- Determinar quais as doses infecciosas virais para humanos
- Estudar a persistência viral em águas de esgoto (reuso)
- Intensificar esforços para conhecer o agente infeccioso da hepatite
viral
Virologia Ambiental : Histórico
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- Papel dos moluscos na transmissão de doenças virais humanas; Evolução das técnicas de Concentração
Virologia Ambiental : Histórico
- 1979 – Organiza��o Mundial da Sa�de, Genebra
“Report of WHO Scientific group of Human Viruses in water, wastewater and soil”
• Reuni�o de experts, relat�rio para planejamento em sa�de
p�blica e economia – pa�ses desenvolvidos e em
desenvolvimento: import�ncia, riscos, m�todos de detec��o,
�reas de estudo.
D�cada de 1970 e in�cio de 1980:
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D�cada de 1980 – Nova Era para a Virologia Ambiental
1. Reconhecimento do vírus da Hepatite E como vírus entérico capaz de produzir surtos de veiculação hídrica
2. Adaptação do HAV para replicar em cultura de células e desenvolvimento de ensaios sensíveis para detecção de antígeno de HAV
3. Desenvolvimento de métodos de concentração de HAV4. Reconhecimento do envolvimento de HAV em surtos de veiculação
hídrica5. Surtos de gastrenterites não bacterianas causados por calicivirus6. Demonstração do envolvimento dos rotavirus com responsáveis pela
diarréia infantil7. Reconhecimento de adenovirus entéricos, calicivirus e astrovirus
como responsáveis por quadros de gastrenterite aguda8. Reconhecimento de que surtos de hepatites e gastrenterites podem
ser causado pela transmissão de vírus no ambiente
Virologia Ambiental : Histórico
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D�cada de 1990 - �gua e Microbiologia 1. In�meros artigos e livros publicados2. Recursos humanos formados3. Cursos e Congressos
D�cada de 2000 - S�culo XXI 1. Aumento significativo de publica��es cientificas (5X) quando
comparada com a d�cada de 90;
1. SYMPOSIUM COST 929 - “CURRENT DEVELOPMENTS IN FOOD AND ENVIRONMENTAL VIROLOGY” Pisa, 9-11 October 2008;
Food and Environmental VirologyEditor-in-Chief: Nigel Cook
ISSN: 1867-0334 (print version)Journal no. 12560
Springer US
Virologia Ambiental : Histórico
3. Peri�dico espec�fico para a �rea de Virologia Ambiental (2010)
Metodologias moleculares de detec��o e
caracteriza��o de virus fastidiosos.
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Virologia Ambiental : Histórico
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Virologia Ambiental no Brasil
em 2004
Virologia Ambiental : Histórico
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Virologia Ambiental : Histórico
Curso Teórico - Prático de Virologia Ambiental
Florianópolis, junho de 2006UFSC/FIOCRUZ
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BRASILVirologia Ambiental
no Brasilem 2011
Virologia Ambiental : Histórico
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1. Esclarecimento de surtos2. Desenvolvimento e validação de metodologias3. Controle microbiológico da água 4. Monitoramento ambiental5. Desinfecção 6. Avaliação de risco
- Matrizes ambientais:
Água de consumo humano (Mineral), Água de reuso (águas residuárias), Água de recreação (lagoas, rios, piscinas, praias)Água de lastro; Águas subterrâneas; Lodo e sedimentos; Superfícies e Alimentos
Virologia Ambiental
APLICAÇÕES
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coleta, clarificação, concentração, descontaminação/remoção de inibidores detecção específica dos vírus
- Padronização e validação intra e interlaboratorial
- Uso Controle interno
Virologia Ambiental : Questões Técnico-científicas
Análise de vírus em amostras ambientais
envolve diferentes etapas:
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Evitar a perda de viabilidade
Diminuir volume da amostra
Reduzir inibidores
Concentração e detecção
de vírus no ambiente
Detectar qualitativamente e quantitativamente
Virologia Ambiental: Questões Técnico-científicas
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CONTROLE INTERNO
Bacteriofágo PP7 Mengo virus
Norovirus murino
DESAFIOS
VIRUS INFECCIOSOS x
NÃO-INFECCIOSOS
Virologia Ambiental: Questões Técnico-científicas
INDICADORES VIRAIS Vírus RNA
Vírus DNA - JCPyV Adenovirus
MAIOR RECUPERAÇÃO VIRAL
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FBVE – Food Borne Viruses in EuropeGrupo de 13 paises europeus para reunir informa��es sobre epidemiologia,
monitoramento e rotas de infec��o de v�rus ent�ricos, principalmente norov�rus.
Vírus em Alimentos: Questões Técnico-científicas
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Butot et al., 2007. Appl Environ Microbiol. 2007; 73, 186-92.
Vírus em Alimentos: Questões Técnico-científicas
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Métodos de detecçãoVirologia Ambiental : Questões Técnico-científicas
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MÉTODOS DE DETECÇÃO DE VÍRUS EM AMOSTRAS CONCENTRADAS:
PCR ou RT-PCR (QUALITATIVO) PCR em tempo real - QPCR ou RT-QPCR (QUANTITATIVO)
1. MOLECULARES: Detecção da Presença do GENOMA viral
ISOLAMENTO DO MATERIAL GENÉTICO VIRAL (DNA/RNA)
Etapa SUPER Importante
Virologia Ambiental : Questões Técnico-científicas
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MÉTODOS DE DETECÇÃO DE VÍRUS EM AMOSTRAS CONCENTRADAS:
2. INFECCIOSIDADE: Detecção da Presença vírus VIÁVEIS
Cultivo Celular in vitro
Células Não
Infectadas
Células Infectadas
(efeito citopático)
Virologia Ambiental : Questões Técnico-científicas
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51
Ensaios de Infecciosidade Viral
ICC/PCR (PCR integrado ao cultivo celular)
PFU (Placas de Lise)
IFA (Imunofluorescencia
indireta)
Ensaio Enzimático
TCID50( Dose Infecciosa Mínima)
Virologia Ambiental : Questões Técnico-científicas
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Métodos de detecção: vantagens e desvantagensVirologia Ambiental : Questões Técnico-científicas
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Centro Colaborador OPAS/OMS em Saúde Pública e Ambiental
EXPERIÊNCIA DA FIOCRUZ
Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental
Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental:
- Referência Regional para Rotaviroses- Referência em Virologia Ambiental
Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental:
- Referência Regional para Rotaviroses- Referência em Virologia Ambiental
Laboratório de Desenvolvimento Tecnológico em Virologia
Laboratório de Desenvolvimento Tecnológico em Virologia
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OBJETIVOS
Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental
Metodologías para concentração de virus por diferentes métodos
Validar métodos moleculares para a detecção viral em diferentes matrizes ambientais
Detectar e caracterizar vírus em águas ambientais e alimentos, contribuindo para o esclarecimento de surtos
de gastrenterites aguda e hepatites de veiculação hídrica de modo a possibilitar ações epidemiológicas efetivas no
controle destas infecções.
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LINHAS DE PESQUISA
Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental
1. Avaliação da disseminação ambiental dos vírus da hepatite A e E responsáveis pelas hepatites de
transmissão entéricas2. Avaliação de risco pela contaminação viral em águas
ambientais3. Avaliar os Rotavírus, Astrovírus, Norovírus e
Adenovirus entéricos como indicadores de saneamento ambiental através da detecção e
caracterização molecular destes vírus.4. Detecção e quantificação de Norovírus em
ecossistemas aquáticos e animais5. Estabilidade de norovirus em matrizes ambientais
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Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental
PARTICIPANTES
Dr. Marize Pereira MiagostovichDr. José Paulo Gagliardi LeiteDr. Adriana de Abreu Corrêa
Dr. Ana Maria Coimbra GasparDr. Jaqueline Mendes de OliveiraDr. Débora Regina Lopes dos Santos
Túlio Machado FumianCarmen Baur VieiraTatiana PradoAna Caroline GanimeJulia Fioretti
PESQUISADORESPESQUISADORES
Alunos de Pós Graduação
Alunos de Pós Graduação
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Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental
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Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental
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Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental
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Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental
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Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental
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AGRADECIMENTOS