Vergleich von Luftkeimsammelgeräten unter kontrollierten Bedingungen – neues Bewertungsschema für Messergebnisse erforderlich?

Prof. Dr. Joseph Strauss Abteilung Mikrobielle Genetik und Pathogen Interaktionen BOKU Campus Tulln Kommission “Klima & Luft” der ÖAW

Molekulare Genetik und Stoffwechsel Schimmelpilzgifte Antibiotika bioaktive Stoffe

Pathogene Pilze Virulenz- und Resistenzmechanismen Pflanzenstärkung durch Symbiosen

Biodiversität und ökologische Funktion von Pilzen Bioaerosole, Krankenhauskeime Entwicklung von analytischen Werkzeugen

Österreichs größtes Zentrum und europäisches Kompetenzzentrum für Schimmelpilzforschung

Biologische Partikel in der Luft (Bioaerosole) – was können wir davon sehen?

Nature | News Feature Mathematician Lydia Bourouiba (MIT, Boston, USA) uses high-speed video to break down the anatomy of sneezes and coughs — and to understand infectious disease. 31 May 2016

1 Mikrobiologische Methoden: KBE/m3 (oder Biomasse, MPN….)

Wie gut können wir biologische Bestandteile in Aerosolen messen?

3

2 Molekular-biologische Methoden (kulturunabhängig): a) Quantifizierung: Genom-äquivalente =~ KBE/m3 b) Biodiversität (ohne Quantifizierung): Hochdurchsatz-

Sequenzierungen

Physikalische und (Bio)chemische Methoden: a) Quantifizierung der Partikelzahlen: ohne biologische

Zuordnung b) Biomarker-Bestimmung (semiquantitativ):

Stoffwechselprodukte (MVOCs, Ergosterol) oder Pilz-spezifische Enzyme (z.B. Myco-Meter)

c) Sammlung und mikroskopische Auswertung: sehr ungenau, zeitaufwändig

Medium

DG18MEAMEA-BRRCS-T

DG18MEAMEA-BRRCS-T

DG18MEAMEA-BRRCS-T

DG18MEAMEA-BRRCS-T

CO

RM

AS

SE

DV

AC

OFFICECELLAROUTDOOR

Unterschiedliche Anforderungen an Substrat Unterschiedliche Wachstums-Geschwindigkeiten Hoher Anteil an geschädigten/toten Keimen Trotzdem bleibt allergisches oder inflammatorisches Potential erhalten oder ist sogar

höher (Exposition intrazellulärer Bestandteile)

Yamamoto et al., ISMEJ 2012: Jahreszeiten

Genetischer Fingerabdruck belegt wesentlich höhere Biodiversität als gedacht (Kultivierung)

aber: noch sind gleichzeitige Quantifizierung und genaue Art-Bestimmung mit genetischen Methoden für Routineanalyse Umweltproben zu teuer

D.h.: noch basieren routinemäßige Innenraumkonzentrationsbestimmungen von Bioaerosolen und

deren Bewertungen auf KBE/m3

Qualitätskontrolle durch Ringversuche (Bsp. VDB, Verband Deutscher Baubiologen, annähernd jährliche Durchführung; Bild: Bericht 2007)

Source: Interlaboratory Test 2010 – Association of Construction Engineers and Biologists (VDB, Germany)

Unterschiedliche Sammelgeräte und –prinzipien ergeben Schwankungen von bis zu 500% am selben Ort zur selben Zeit.

Schlussfolgerung: in der Praxis eher „Schätzwert“ als „Messwert“

Bisher keine systematische biologische Validierung der

Messgeräte unter kontrollierten Bedingungen

Wieso? • Inhomogene Verteilung der

Bioaerosole? • Unterschiedliche Überlebensraten

während der Sammlung? • Unterschiedlicher Abscheidegrad

je nach Organismentyp (Pilzsporen, Hefen, Bakterien, etc…)

Faktum ist nicht oder nur „versteckt“ in den einschlägigen ISO-Normen abgebildet

Forschungsprojekt

Evaluierung von Bioaerosol-Sammelgeräten auf ihre biologische Sammeleffizienz unter standardisierten Bedingungen

Ziele: Entwicklung und Evaluierung einer Bioaerosol-Prüfkammer für die Herstellung und

Sammlung von unterschiedlichen Bioaerosolen mit definierter Lebensfähigkeit Standardisierte Herstellung und Quantifizierung von relevanten Bioaerosol-

Komponenten: Pilzsporen, Bakterienzellen und –sporen, Viren, Allergene, Entzündungsauslöser (Endotoxine)

Vergleich der biologischen Sammeleffizienz unterschiedlicher Sammelgeräte und -systeme für Bioaerosole

Particle Scan®CR (IQAir®) Aufzeichnung Partikelzahl und –Größe

CCB 3000 (PALAS® GmbH)

Liquid Sparging Aerosolizer LSA (CH Technologies)

Datalogger Aufzeichnung Temperatur und Luftfeuchte

MAS-100 NT Luftkeimsammler

Bilogische Partikel in Suspension Trichoderma longibrachiatum Sporen

Überprüfen der Druckdifferenz zwischen Labor-Innenraum und Kammer-Innenraum

Versuchsaufbau / Setup

DI Clara Pogner

Physikalische Validierung der Bioaerosol-Kalibrierkammer

Evaluierung einer Prüfkammer für Bioaerosolsammelsysteme A. Konlechner, S. Goller, M. Gorfer, L. Mölter, J. Strauss Erschienen in Gefahrstoffe-Reinhaltung der Luft 73 (2013) Nr. 11/12 – November/Dezember

Measurements at 27 different positions in the chamber: (9 positions/level; 3 different levels) Anorganic particle size distribution : almost equal on all positions Particle concentrations:

dependent on the relative position (37% overall variation)

very constant at the same position (deviations up to 11%)

not influenced by operating sampling machines (air flow below

200l/min)

published in:

Biologische Kontrollpunkte entlang des Luftstroms zur Bestimmung der Bio-Effizienz

Vol = 70 m3/h T= 22-25°C; RLF=40%-50% Aerosolerzeugung (LSA): 0,19ml/min e.g. CA= 105/ml - 107/ml -> Ct. 100 - 10.000 p/m3

Sammelgeräte im optimalen Konzentrationsbereich getestet

1

4

2

5

3

Mikroskop. Zählung Keimrate VOR

Keimrate NACH

Partikel Zählung

KBE/m3

= keimfähige Partikel pro m3

Unterschiedliche Positionen des Sammelgerätes (MAS) ergeben annähernd idente Ergebnisse

LSA (Mainelis et al., 2005): Single-pass bubbling bioaerosol generator

A,B,C: 3 diff. positions in the chamber

erlaubt die Parallel-Messung von bis zu drei Messgeräten

in einem Durchgang

Setting in testchamber: MAS, RCS, COR

Beispiel Kontrollpunkt 2: Vergleich Keimfähigkeit Pilzsporen

Mikroskopische Zählung durch unterschiedliche Personen

Hefe-Zählung durch Ausplattieren und photometrisch (OD600)

Ergebnis als KBE/ml (Bakterien, Pilze) oder PFUs (Viren)

Keimraten (CBv) in Mehrfach-Bestimmungen für jeden einzelnen Versuchstag -> ziemlich unterschiedliche Keimraten je nach Organismus und Versuch

Ergebnisse Kontrollpunkte für die biologische Validierung,

Bsp: Konidiosporen von Trichoderma longibrachiatum

(2) Keimrate lebensfähig

(1) Ausgangssuspension Zählung/OD-Messung 100%

(3) wie viele lebensfähige Partikel werden aerosolisiert (Zählung)

(4) Wieviel kommt über den Luftstrom in die Kammer? Partikelzählung in der Kammer

(5) Biologische Sammeleffizienz Gerät „A“ (MAS) für Organismus „a“ (T.longi)

(3) wie viele Partikel sind nach der Aeros. Lebensfähig (KBE)

Korrektur um Keimrate vor* Aerosolisierung

Gesamtzahl Sporen in Kammer 100%

50,79 %

43,73 %

30,20 %

Korrektur um Keimrate nach* Aerosolisierung

Auszählung KBE/m3

* Bestimmung Keimratenverlust durch Aerosolisierung

Impingement

Bisher getestete Sammelgeräte

Impaktion Filtration Wet Cyclon Technology

Biotest RCS High Flow (Biotest AG) 100 l/min

MAS-100 NT (MBV AG) 100 l/min

Holbach MBASS30 (UA Holbach GmbH) 100 l/min

BioSampler (SKC) 12,5 l/min

MD-8 airscan (Sartorius) 100l/min

PGP-GSP filter System (from) 3,5 l/min

Coriolis µ (Bertin) 100 l/min

Filamentöse Pilze

T. longi A. bras P. comm C. clado MAS-100 NT

MBASS30

RCS High Flow

PGP-GSP System

MD8 Airscan

Coriolis µ

SKC Biosampler

Gleich gut wie Referenz Besser als Referenz Schlechter als Referenz

Pilze – Saccharomyces cervisiae

S. cervisiae MAS-100 NT

MBASS30

RCS High Flow

PGP-GSP System

MD8 Airscan

Coriolis µ

SKC Biosampler

− Hefezellen mit dem LSA gleich effizient zu vernebeln wie filamentöse Pilze

− Ergebnisse zeigen, dass Hefe sensibler auf Sammelstress ist

− SKC zeigt sich viel effizienter als andere Sammelgeräte

− Interpretation der Hefezählungen mit anderen Sammelgeräten sind mit Vorsicht zu betrachten

Ergebnisse - Bakterien

S. cervisiae B. amylo E. coli MAS-100 NT 100% 100% MBASS30 NT RCS High Flow 100% PGP-GSP System NT MD8 Airscan NT Coriolis µ NT SKC Biosampler

Ergebnis - Zusammenfassung

Pilze Hefe Bakterien Phage MAS-100 NT NT MBASS30 NT RCS High Flow NT PGP-GSP System NT MD8 Airscan

Coriolis µ

SKC Biosampler ?

Verschiedene Sammelmethoden unterschiedlich

geeignet für unterschiedliche Organismen / Organismen Gruppen

Bei der Festlegung von Richtwerten ist die Betrachtung

von Sammelmethode und Organismus essentiell Außerdem sollte bei der Interpretation zumindest die

durchschnittliche Keimrate mit einbezogen werden Eine Anpassung von Normen und Richtlinien zur

Erfassung von Bioaerosol-Komponenten und der Interpretation von Messergebnissen sollte erfolgen

Zusammenfassung – Take home messages

P. commune

C. cladosporioides

U. botrytis/oudemansii

Fungal Genetics & Genomics Lab

Fungal Genetics and Genomics Unit – BOKU University and Austrian Institute of Technology GmbH

Projekt Team Sabine Strauss-Goller Clara Pogner Anja Konlechner Verena Unterwurzacher Claudia Puck (Admin) Markus Gorfer (Co-PL) Joseph Strauss (PL) unterstützt durch Dragana Bandian Harald Berger Claudia Haager Agnes Gerstbauer Prof. Helmuth Horvath (Uni Wien) Annette Kolk (DGUV) Manfred Hinker (AUVA Projektfinanzierung durch

http://www.dagz.boku.ac.at/mgpi/