VEGF no risco de adenocarcinoma colorretal esporádico e ......C936T foi avaliado por meio da...
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Polimorfismo C936T do gene VEGF no risco de adenocarcinoma colorretal esporádico e em seus aspectos clínicos e biológicos LAURA CREDIDIO Campinas UNICAMP 2012
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Polimorfismo C936T do gene VEGF no risco de adenocarcinoma colorretal esporádico e em seus aspectos clínicos e biológicos
LAURA CREDIDIO
Campinas
UNICAMP
2012
i
Polimorfismo C936T do gene VEGF no risco de adenocarcinoma colorretal esporádico e em seus aspectos clínicos e biológicos
LAURA CREDIDIO
Campinas
UNICAMP
2012
Dissertação de Mestrado apresentada à
Pós-Graduação da Faculdade de Ciências
Médicas da Universidade Estadual de
Campinas - UNICAMP para obtenção do
título de Mestre em Ciências, sob
orientação do Prof. Dr. Claudio Saddy
Rodrigues Coy e co-orientação Prof. Dra.
Carmem Silvia Passos Lima.
ii
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA POR ROSANA EVANGELISTA PODEROSO CRB8/6652
BIBLIOTECA DA FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS UNICAMP
Informações para Biblioteca Digital Título em inglês: VEGF C936T polymorphism and risk of sporadic colorectal cancer related to clinical and biological characteristics. Palavras-chave em inglês: Polymorphism, genetic Colorectal neoplasms Gene frequency Titulação: Mestre em Ciências Banca examinadora: Claudio Saddy Rodrigues Coy [Orientador] José Alfredo Reis Neto João José Fagundes Data da defesa: 15-02-2012 Programa de Pós-Graduação: Ciências da Cirurgia
Credidio, Laura, 1976 - C86p Polimorfismo C936T do gene VEGF no risco de
adenocarcinoma colorretal esporádico e em seus aspectos clínicos e biológicos / Laura Credidio. -- Campinas, SP : [s.n.], 2012.
Orientador : Claudio Saddy Rodrigues Coy. . Coorientador : Carmem Silvia Passos Lima. Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual de
Campinas, Faculdade de Ciências Médicas. 1. Polimorfismo genético. 2. Neoplasias colorretais.
3. Frequência do gene. I. Coy, Claudio Saddy Rodrigues. II. Lima, Carmem Silvia Passos. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. IV. Título.
iii
iv
Dedicatória
__________________________________________________________________ Ao meu filho e meu marido, os Joaquim’s, que tiveram paciência e
compreensão nas horas que mais precisei.
Aos meus pais que sempre me incentivaram a estudar.
A minha irmã querida, Ana Paula, sempre presente em minha vida.
v
Agradecimentos
__________________________________________________________________ Ao meu orientador Prof. Dr. Claudio Saddy Rodrigues Coy.
A Prof. Dra. Carmem Silvia Passos Lima.
As enfermeiras do gastrocentro, sob coordenação da enfermeira Lucia
Helena.
As enfermeiras do HC do ambulatório de coloproctologia,
especialmente a enfermeira Luciana que me acolheu com paciência, auxiliando
nos procedimentos necessários.
Aos funcionários do gastrocentro, sempre solícitos quando necessário.
A FAPESP por financiar este projeto.
vi
Resumo
__________________________________________________________________
O papel da angiogênese para o desenvolvimento do câncer colorretal
(CCR) ainda não é totalmente conhecido. Uma das principais glicoproteínas
responsáveis pela angiogênese é o fator de crescimento endotelial vascular
(VEGF), acredita-se que o polimorfismo C936T, localizado no gene VEGF, esteja
correlacionado com a suscetibilidade para o desenvolvimento do CCR.
Objetivos: Identificar as freqüências dos genótipos do polimorfismo
C936T do gene VEGF em pacientes portadores de adenocarcinoma colorretal
esporádico (ACE) e controles e correlacionar a ocorrência do mesmo com as
seguintes variáveis: sexo, idade, localização tumoral, acometimento de linfonodos
(N) e infiltração tumoral (T) em pacientes.
Material e método: No período compreendido entre outubro de 2008 a
dezembro de 2009 foram coletadas amostras de sangue periférico de pacientes
com ACE, no ambulatório de Coloproctologia do HC UNICAMP (G1). O grupo
controle (G2) foi constituído por doadores de sangue. Foram excluídos do estudo
portadores de polipose familiar, síndrome de Lynch, doenças inflamatórias
intestinais e com antecedente familiar de CCR. A extração do DNA genômico se
deu por cloreto de lítio e por kit de extração de DNA. Os genótipos do polimorfismo
C936T foi avaliado por meio da reação em cadeia da polimerase e digestão
enzimática.
Resultados : O G1 constou de 261 pacientes, sendo 52,1% do sexo
masculino com média de idade de 64,9 (32-97) anos. O G2 foi formado por 261
doadores de sangue, com idade media de 52,9 anos (25-62) sendo 52,1% do sexo
masculino. A ocorrência do genótipo selvagem (CC) foi de 80,5%, do heterozigoto
(CT) foi de 18,4% e do homozigoto (TT) de 1,1% em pacientes. No G2 a
ocorrência dos genótipos foram 78,5% (CC), 20,7% (CT) e 0,8% (TT), indivíduos
com genótipos distintos do gene estiveram sob riscos similares do ACE. Com
relação á localização do tumor, 51,5% encontravam-se no reto, 16,4% cólon
direito, 31,1% em cólon esquerdo. Em relação ao grau de invasão tumoral, 0,7%
foram classificados como Tis, 1,5% T0, 8,1% T1, 19,3% T2, 65,2% T3 e 7,4%
vii
como T4. Quanto ao acometimento de linfonodos, 53,9% foram classificados como
N0, 33,6% como N1 e 12,5% como N2. Não se observou diferenças em relação
ao grau de invasão tumoral, acometimento de linfonodos ou ocorrência de
metástases (p = 0,2996) em relação à ocorrência do polimorfismo C936T.
Conclusão: O polimorfismo C936T do gene VEGF não correlaciona-se
com o risco de ocorrência do tumor e com o sexo, idade, localização da lesão,
acometimento de linfonodos e infiltração tumoral.
viii
Abstract
__________________________________________________________________
Background: The role of angiogenesis for the development of Colorectal
Cancer (CC) is not yet fully known. One of the major glycoprotein responsible for
pro-angiogenesis is vascular endothelial growth factor (VEGF). It is believed that
the C936T polymorphism located in the VEGF gene is correlated with less
susceptibility to the development of CC.
Objectives: To identify the genotype frequencies of the C936T
polymorphism of the VEGF gene in patients with sporadic colorectal
adenocarcinoma (ACE) and controls and to correlate the occurrence of the same
with following variables: gender, age, tumor location, lymph node (N) and tumor
infiltration (T).
Methods: Between October 2008 and December 2009 samples were
collected from peripheral blood of patients with colorectal cancer in the clinic of
Coloproctology of HC UNICAMP (G1). The control group (G2) comprised blood
donors. We excluded patients with familial polyposis, Lynch syndrome,
inflammatory bowel diseases and family history of CC. The genomic DNA
extraction was done by lithium chloride and by DNA extraction kit. The genotypes
of the C936T polymorphism were assessed by polymerase chain reaction and
enzymatic digestion.
Results: G1 consisted of 261 patients, 52.1% male with a mean age of
64.9 (32-97) years. The G2 is composed of 261 blood donors, with a mean age of
52.9 years (25-62) 52.1% male. The occurrence of wild genotype (CC) was 80.5%,
the heterozygous (CT) was 18.4% and the homozygous (TT) of 1.1% in patients. In
G2 the occurrence of genotypes were 78.5% (CC), 20.7% (CT) and 0.8% (TT);
individuals with different genotypes of the gene were under similar risks of ACE.
Regarding the location of the tumor, 51.5% were in the rectum, right colon 16.4%,
31.1% in the left colon. Regarding the degree of tumor invasion, 0.7% was
classified as Tis, T0 1.5%, 8.1% T1, 19.3% T2, T3 65.2% and 7.4% as T4. As for
the involvement of lymph nodes, 53.9% were classified as N0, 33.6% N1 and
12.5% N2. There were no significant differences in the degree of tumor invasion,
ix
lymph nodes or occurrence of metastases (p = 0.2996) in relation to the
occurrence of the C936T polymorphism.
Conclusion: The C936T polymorphism of the VEGF gene did not
correlate with the risk of tumor occurrence and sex, age, lesion location, lymph
nodes and tumor infiltration.
x
Símbolos, Siglas e Abreviaturas
ACE Adenocarcinoma colorretal esporádico
APC Polipose adenomatose colônica, do inglês adenomatous polyposis coli
CCR Câncer colorretal
DCC Deletado no câncer do colón, do inglês deleted in colon cancer
DNA Ácido desoxirribonucléico
EGF Fator de crescimento epidérmico
FCM Faculdade de Ciências Médicas
FGF Fator de crescimento de fibroblastos
G1 Grupo paciente
G2 Grupo controle
HC Hospital das clínicas
HIF-α Fator induzido por hipóxia alfa
HNPCC Câncer colorretal hereditário não poliposo
K-ras Do inglês Kirsten retrovirus-associated DNA sequence
KCL Cloreto de potássio
MgCl2 Cloreto de magnésio
mM Milimol
mRNA Ácido ribonucléico mensageiro
ng Nanograma
NlaIII Enzima de restrição endonuclease
NRP-1 Neutrofilina 1
OR Risco relativo
pb Pares de base
PCR Reação em cadeia de polimerase
PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas
PIGF Fator de crescimento placentário
pmol Picomole
SMAD Proteínas relacionadas SMA e Mad
SNPs Polimorfismo de um nucleotídeo (single-nucleotide polimorphism)
Taq Enzima DNA polimerase
xi
TGF-β Fator de crescimento de transformação beta
TNM Classificação de tumores malignos
TRIS HCL Tampão de Acido clorídrico
UNICAMP Universidade de Campinas
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
VEGFR Receptor de fator de crescimento endotelial vascular
VPF Fator de permeabilidade vascular
xii
Lista de quadros
Quadro 1. Isoformas do VEGF .......................................................................... 22
Quadro 2. Classificação TNM ............................................................................ 30
Quadro 3. Estágio tumoral ................................................................................. 31
Quadro 4. Critérios de Amsterdam .................................................................... 32
xiii
Lista de tabelas
Tabela 1. Análise comparativa da idade média entre pacientes e controles ... 39
Tabela 2. Idades média e mediana e genótipos do polimorfismo C936T do
gene VEGF ....................................................................................... 40
Tabela 3. Idade média dos genótipos polimorfismo C936T do gene VEGF
em pacientes (G1) e controles (G2) ................................................. 40
Tabela 4. Distribuição de pacientes (G1) e controles (G2) por sexo ................ 41
Tabela 5. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T de
pacientes e controles por sexo ......................................................... 42
Tabela 6. Distribuição de pacientes e controles por classe ............................. 42
Tabela 7. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo
a localização tumoral ........................................................................ 44 Tabela 8. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo
os estágios da TNM .......................................................................... 45
Tabela 9. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo
a classificação TNM excluindo-se pacientes com terapia neo-
adjuvante .......................................................................................... 47
Tabela 10. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T
agrupando o estágio I e II versus III e IV, excluindo-se pacientes
com terapia neo-adjuvante ............................................................... 48
Tabela 11 Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo
a infiltração tumoral .......................................................................... 49
Tabela 12. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T
agrupando as categorias Tis, T0 e T1 versus T2, T3 e T4,
excluindo-se pacientes com terapia neo-adjuvante ......................... 50
Tabela 13. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo
o acometimento de linfonodos .......................................................... 52
Tabela 14. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T em
pacientes e controles ........................................................................ 54
xiv
Lista de Figuras
Figura 1. Clivagem do VEGF ......................................................................... 24
Figura 2. Banda auto-radiografada com genótipos do polimorfismo C936T
do gene VEGF ................................................................................ 53
xv
Lista de Gráficos
Gráfico 1. Distribuição de pacientes e controles por sexo ......................... 41
Gráfico 2. Distribuição de pacientes e controles por classe ...................... 43
Gráfico 3. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T
segundo a localização tumoral .................................................. 44
Gráfico 4. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T
segundo os estágios da TNM ................................................... 46
Gráfico 5. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T
segundo a classificação TNM excluindo-se pacientes com
terapia neo-adjuvante ............................................................... 47
Gráfico 6. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T
agrupando o estágio I e II versus III e IV, excluindo-se
pacientes com terapia neo-adjuvante ....................................... 48
Gráfico 7. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T
segundo a infiltração tumoral .................................................... 50
Gráfico 8. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T
agrupando as categorias Tis, T0 e T1 versus T2, T3 e T4,
excluindo-se pacientes com terapia neo-adjuvante .................. 51
Gráfico 9. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T
segundo o acometimento de linfonodos ................................... 52
Gráfico 10. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T em
pacientes e controles ................................................................ 54
xvi
Sumário
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 18
1.1 Epidemiologia ................................................................................. 19
1.2 Angiogênese e câncer .................................................................... 21
1.3 Fator de crescimento endotelial vascular ....................................... 22
1.4 Polimorfismo C936T do gene VEGF .............................................. 26
2 OBJETIVO ................................................................................................. 28
3 MATERIAL E MÉTODO ............................................................................. 29
3.1 Avaliação clínica ............................................................................. 29
3.2 Critério de exclusão ....................................................................... 32
3.3 Grupo controle ................................................................................ 33
3.4 Análise molecular do polimorfismo C936T do gene VEGF ............ 33
3.5 Aspectos éticos .............................................................................. 36
3.6 Análise estatística ........................................................................... 38
4 RESULTADOS ........................................................................................... 39
4.1 Idade ............................................................................................... 39
4.2 Sexo ............................................................................................... 40
4.3 Classe ............................................................................................. 42
4.4 Localização tumoral ........................................................................ 43
4.5 Classificação TNM .......................................................................... 44
4.5.1 Infiltração tumoral e acometimento de linfonodos ................. 49
4.6 Análise do VEGF em pacientes e controles ................................... 53
xvii
5 DISCUSSÃO .............................................................................................. 56
6 CONCLUSÕES .......................................................................................... 60
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................... 61
ANEXO 1: Termo de consentimento de pacientes ................................... 69
ANEXO 2: Termo de consentimento de controles .................................... 71
ANEXO 3: Tabela controles ...................................................................... 73
ANEXO 4: Tabela pacientes ..................................................................... 81
ANEXO 5: Parecer do CEP ...................................................................... 89
18
1 INTRODUÇÃO
1.1 Epidemiologia
Uma das neoplasias mais freqüentes e letais no Brasil e no mundo
ocidental, quando diagnosticada tardiamente, é o adenocarcinoma colorretal
esporádico (ACE). O tumor ocorre em indivíduos com 40 a 70 anos de idade. A
sobrevida média mundial é estimada em 44%, mas se detectado precocemente a
sobrevida pode ultrapassar 90% [1, 2].
O ACE é o terceiro tipo de câncer mais freqüente entre os homens e o
segundo entre as mulheres nas regiões sul e sudeste do Brasil. Nos países
desenvolvidos é o segundo tipo de câncer com maior incidência de óbito em
ambos os sexos [3, 4]. Segundo a Secretaria da Saúde de Campinas é o segundo
tipo de câncer causador de óbito entre as mulheres [5]. Seu desenvolvimento pode
estar relacionado a aspectos hereditários, ou em sua maioria, a fatores ambientais
relacionados à hábitos alimentares, tabagismo e sedentarismo.
Estima-se que em 95% dos casos, o ACE se desenvolve a partir de um
adenoma [3, 6], sendo que em 60% dos casos ocorra a partir da mutação do gene
supressor APC. O fenótipo metilador de ilhas CpG (CIMP) é responsável por 35%
dos carcinomas colorretais, os outros 5% são provenientes da mutação em via de
sinalização na Síndrome de Lynch [7, 8].
A transformação de uma célula normal em adenoma pode ocorrer entre
5 a 20 anos e de adenoma para o câncer entre 5 a 15 anos [9]. A evolução do
adenoma para o carcinoma decorre de uma seqüência de mutações, e em 50 a
80% dos casos, a primeira mutação ocorre no gene APC. Sua inativação impede a
diferenciação celular resultando na proliferação das criptas intestinais, a displasia
[6, 10, 11]. A seguir ocorre a ativação do proto-oncogenese K-ras em oncogene;
esta mutação está presente em 30 a 50 % dos casos de ACE. Posteriormente
pode ocorrer a mutação do gene DCC, responsável por manter a adesão celular e
dos genes que codificam as proteínas SMAD2/4.
19
Estas proteínas liberam sinais inibidores de crescimento para o núcleo
celular e sua mutação promove a proliferação celular. Por último a mutação ou
perda do gene supressor de tumor P53, presente em quase todas as células do
organismo e responsável pela regulação dos genes de reparo e apoptose celular.
Esta mutação encontra-se presente em 75% dos carcinomas, promovendo assim
o crescimento celular [12].
1.2 Angiogênese e câncer
O ACE, como citado previamente, decorre por meio de mutações
sucessivas, interferindo no controle do crescimento, diferenciação, transcrição,
metilação e apoptose celular, passando a se comportar de forma insólita [13-15].
Fearon & Volgestein [6] demonstraram que as mutações não ocorrem em uma
única célula, mas nas descendentes das mesmas, acumulando-se
progressivamente.
Acredita-se que a angiogênese seja essencial para o crescimento
tumoral e disseminação metastática [13, 15-20]. As primeiras etapas do
crescimento e progressão tumoral são limitadas, iniciando-se como uma massa
avascular e quando o tumor cresce além de 2 a 3 milímetros, requer sua própria
vascularização, induzindo a angiogênese [21].
Em 1787, o médico britânico João Hunter utilizou o termo angiogênese
pela primeira vez, mas somente por volta de 1860 a morfologia vascular do tumor
foi estudada com detalhes. Nas décadas de 30 e 40, pesquisadores estudaram a
formação de novos vasos sanguíneos em tumores a partir de estudos
experimentais [22].
A formação de novos vasos se dá através da vasculogênese ou da
angiogênese. Na primeira, a formação de novos vasos surge a partir de
hemangioblastos, células percursoras das células endoteliais, a segunda decorre
de vasos sanguíneos pré-existentes, ocorrendo por quatro mecanismos diferentes:
brotação, intussuscepção (divisão de estrutura vascular pré existente),
20
elongação/ampliação e por incorporação das células precursoras das células
endoteliais nas paredes dos vasos sanguíneos.
Sua regulação ocorre por meio de moléculas pró-angiogênicas e anti-
angiogênicas [18, 23]. Como exemplo destas moléculas temos a angiopoetina
(Angpt-1), através da interação com seu receptor (Tie-2), neutraliza a vaso
dilatação enquanto a angiopoetina 2 (Angpt-2) desestabiliza a matriz extracelular
através da degradação parcial, bem como a ativação proteolítica de fatores de
crescimento. [24]
A indução da angiogênese se deve a fatores como hipóxia, ph ácido,
estímulos hormonais, tamanho do tumor entre outros, resultando na síntese de
fatores de crescimento e citocinas que são liberados na matriz extracelular
migrando em direção às células endoteliais. Estas proteínas se ligam aos
receptores localizados na membrana plasmáticas das células endoteliais, ativando
fatores de crescimento responsáveis pela angiogênese como o fatores de
crescimento de fibroblastos (FGF), epidérmicos (EGF), de crescimento endotelial
derivados de plaquetas (PDGF) e de crescimento endotelial vascular (VEGF),
entre outros. Estes fatores iniciam a formação de brotos que proliferam e migram
em direção à célula emissora de sinais, transformando-se em capilares maduros
[12, 25].
Há aproximadamente 30 fatores endógenos pró-angiogênicos, alguns
são mais conhecidos, como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), o
Fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e Fator de crescimento de
transformação beta (TGF-β) e 30 fatores endógenos anti-angiogênicos, sendo os
mais estudados a angiostatina, endostatina e trombospondina [26, 27]. Quando a
regulação desse equilíbrio é afetada, como ocorre durante o crescimento de um
tumor, os vasos começam a formar-se em locais e momentos inadequados [28].
Uma das principais glicoproteínas responsáveis pela angiogênese, com
importante ação na proliferação, sobrevivência e migração celular, além de mediar
21
a permeabilidade vascular é o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e
seus receptores [29-31].
1.3 Fator de crescimento endotelial vascular
O VEGF foi uma dos primeiros fatores angiogênicos a serem
identificados e acredita-se ser o principal regulador da angiogênese, com ação
especifica para células endoteliais.
Em 1983, Harold Dvorak e colaboradores foram os primeiros a
identificar esta glicoproteína, por meio da purificação de células tumorais, ao
perceberem que esta melhorava a permeabilidade celular, sendo chamada de
fator de permeabilidade vascular (VPF). Posteriormente, em 1989, Ferrara e
Henzel identificaram a mesma proteína, da qual Ferrara já tinha purificado e
seqüenciado, em meio condicionado, em células pituitárias bovinas e verificaram
que promovia a proliferação de células endoteliais vasculares.
Em 1990, ficou claro que as duas proteínas eram a mesma, passando
a ser denominada fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) [22, 26, 32, 33]
sendo um potente regulador positivo da angiogênese [25, 27, 32, 34].
A região codificadora do gene VEGF se encontra no braço curto do
cromossomo 6 na região p 21.3. O gene contém 8 éxons separados por 7 íntrons
[18, 29, 35-37]. A remoção dos íntrons do pré-RNA transcrito a partir de um único
gene resultam em 5 diferentes isoformas: VEGF ou VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C,
VEGF-D e fator de crescimento placentário (PIGF) e 2 diferentes da família que
não provêm de humanos o VEGF-E e VEGF-F, como podemos visualizar no
quadro 1 [22, 26, 27, 33].
22
Quadro 1: Isoformas do VEGF
VEGF ISOFORMAS
VEGF-A VEGF-A121 VEGF-A145 VEGF-A165 VEGF-A183 VEGF-A189 VEGF-A206
VEGF-B VEGF-B167 VEGF-B186
VEGF-C
VEGF-D
VEGF-E
VEGF-F
PIGF PIGF-131 PIGF-152 PIGF-203 PIGF-224
Quadro 1: Os números correspondem a quantidade de aminoácidos
após a remoção dos íntrons.
São mediados por três receptores transmembrana tirosina quinase,
conhecidos como VEGFR (receptor do fator de crescimento endotelial vascular)
denominados: VEGFR-1 (fms-like tyrosine kinase 1 ou Flt1), VEGFR-2 (fetal liver
kinase, Flk1 ou KDR), VEGFR-3 (fms-like tyrosine kinase 4 ou Flt4). Os dois
primeiros são expressos predominantemente em células endoteliais vasculares e
suas progenitoras e o VEGFR-3 é expresso principalmente em células endoteliais
linfáticas. As neutrofilinas 1 e 2 (NRP- 1 e 2) também agem como receptores para
alguns membros da família do VEGF [25, 32, 38].
O VEGFR-1 foi o primeiro receptor de tirosina quinase identificado
como receptor do VEGF e é expresso por células endoteliais, monócitos,
macrófagos, células dentríticas, osteoclastos, pericitos e trofoblastos na placenta
[39, 40]. Considerado como um inibidor na embriogênese, mas um estimulador na
fase adulta, está relacionado com a migração celular [41].
O VEGFR-1 liga-se com VEGF, VEGF-B e PIGF e relaciona-se à
metástase pulmonar [42]. Fan et al. demonstrou que o VEGFR-1 está presente e
23
funcional em células do câncer colorretal, podendo ativar processos que levam a
progressão tumoral e metástase [43].
O VEGFR-2 é altamente expresso em células precursoras das células
endoteliais na embriogênese precoce [41]. É considerado o principal receptor do
VEGF, estimulando a mitose de células endoteliais e a indução da permeabilidade
vascular e proliferação da célula endotelial [23]. Sua expressão é encontrada
também em células-tronco hematopoéticas, células neuronais, osteoblastos,
células do ducto pancreático, células progenitora de retina e megacariócitos [41,
42].
O VEGFR-3 possui uma expressão mais limitada e está relacionado
com a linfangiogênese sendo expresso em células endoteliais linfáticas, capilares
fenestrados, veias de órgãos endócrinos, monócitos e macrófagos.[41]
O fator de crescimento mais estudado e também o mais conhecido é o
VEGF-A ou somente VEGF e possui várias isoformas, dependendo da clivagem
dos íntrons (figura 1) [38].
O VEGF ou VEGF-A é uma glicoproteína com ligação dimérica à
cisteína, apresenta um peso molecular de 40kDa, sendo uma seqüência homologa
ao fator de crescimento placentário, ao VEGF-B e VEGF-C. Alguns tecidos
expressão fortemente esta proteína como tecidos do sistema reprodutor feminino,
tecidos isquêmicos, tumores e linhagem de células transformadas [44, 45].
As 4 isoformas, polipeptídeos com diferentes quantidades de
aminoácidos [46] , são apresentadas na figura 1, sendo que a isoforma VEGF165
pode ser clivada gerando mais duas isoformas: VEGF110 e VEGF113, dois
fragmentos bioativos NH2-terminal [47].
24
Figura 1: Clivagem do VEGF
O VEGF-B é expresso no coração e musculatura esquelética, acredita-
se que seja importante no desenvolvimento cardíaco além de regular a
biodisponibilidade do VEGF-A competindo pelo receptor VEGFR-1 e NRP-1, ao
qual se liga [25, 26].
O VEGF-C se liga com o VEGFR-3 e com o VEGFR-2, promovendo
também a angiogênese em alguns tipos de tumores [25, 26, 32, 33].
O VEGF-D também se liga ao receptor linfático VEGFR-3, induzindo a
linfangiogênese. Além disto, promove a disseminação de células tumorais para os
linfonodos [48]. Sua expressão esta correlacionada a ocorrência de metástase
linfonodal em diversos tipos de tumores, incluindo o câncer colorretal [26].
25
O VEGF-E foi codificada pelo parapoxvirus Orf, portanto não é um fator
humano, conecta-se com o VEGFR-2, in vitro estimulando a quimiotaxia e mitose
celular, in vivo induz a angiogênese e aumenta a permeabilidade vascular [25, 26].
O fator de crescimento mais recentemente descoberto é o VEGF-F,
proveniente do veneno de cobra, este fator se liga somente com o VEGFR-2 e
aumenta em até cinco vezes a permeabilidade vascular [49].
A maior fonte do PIGF na gravidez é na placenta e é essencial na
angiogênese e vasculogênese durante a embriogênese.
Em células normais a tradução do VEGF, por meio do RNA
mensageiro, é controlada pelos estímulos da angiogênese [15, 16, 29]. Nas
células tumorais existe um descontrole na síntese do VEGF, causada pelo
aumento da expressão do mRNA, podendo ser detectado no plasma em tumores
avançados [50-52].
O VEGF, como citado previamente, poder ser induzido por vários
fatores, sendo a concentração celular de oxigênio um dos principais. Na vigência
de hipóxia, ocorre o aumento da quantidade de VEGF, promovendo assim a
angiogênese, aumentando assim o numero de glóbulos vermelhos e fornecimento
de oxigênio [26].
A hipóxia induz a síntese de VEGF através do fator de indutor de
hipóxia (HIF). HIFs são fatores de transcrição heterodimérico composto por duas
subunidade, α e β. A subunidade HIF-1α é regulada pelos níveis teciduais de
oxigênio, sendo mantido em baixa quantidade em condições normais [23].
A baixa concentração de oxigênio, resulta na falta da hidroxilação da
prolina hidrolise 4 e consequentemente há uma diminuição da ligação do HIF-1α
com o gene supressor de tumor Hippel Lindau, inativando-o. Assim, ocorreria um
acúmulo do HIF-1α, aumentando a expressão do VEGF e de outros fatores
angiogênicos. A formação de vasos normais requer uma ativação coordenada de
vários mediadores, no entanto a hiper expressão do VEGF-A resulta em vasos
26
anormais, tortuosos, frágeis, sem pericitos com propensão a sangramento,
exsudação e aumento da permeabilidade vascular [28, 34].
O aumento da expressão do VEGF tem sido associada a pior
prognóstico no câncer colorretal [26, 33, 38].
1.4 Polimorfismo C936T do gene VEGF
O DNA pode sofrer alterações em sua seqüência, de um único ou de
vários nucleotídeos como: substituição, inserção a deleção das bases; mudança
do número de repetições das bases e grandes alterações na estrutura do
cromossomo. Se a freqüência destas alterações ocorre entre 1 a 99% da
população é classificado como gene polimórfico, se for menor que 1% é
classificado com gene idiomorfo e acima de 99%, classificado como gene
monomorfo [53].
O polimorfismo deste estudo esta localizado no gene VEGF-A na região
936, onde ocorre a substituição de um único nucleotídeo (SNP) no éxon 8 na
região 3’ não-traduzida (3’UTR) [35], ocorrendo a substituição da base citosina (C)
pela timina (T) [54-57], resultando na perda da região que transcreve o fator AP-4
(activated protein 4). Analises do produto do DNA complementar (cDNA) sugere
que o AP-4 codifica a proteína HLH, esta proteína reconhece sítios específicos da
seqüência de DNA CAG2TG [58].
O AP-4 é um fator de transcrição hélice-alça-hélice que aumenta a
expressão de vários genes virais e celulares pela ligação a sítios potenciador
específicos, a perda do potencial de ligação deste sítio pode ser responsável pela
diminuição da expressão do VEGF em portadores do alelo T comparado aos
portadores do alelo C [37, 44, 59].
Na presença do genótipo selvagem, o nível da glicoproteína no plasma
aumenta, estimulando a formação de novos vasos [18, 51, 60-62]. Acredita-se que
o polimorfismo 936C→T do gene VEGF esteja correlacionado com suscetibilidade
variável de indivíduos para o desenvolvimento do ACE [44, 51]. Segundo
27
RENNER et al [44], os portadores do genótipo variante CT e TT possuem baixos
níveis séricos de VEGF, diminuindo a angiogênese e o risco de adquirir câncer.
Esta hipótese é corroborada por outros autores onde o alelo T teria efeito protetor
quanto ao risco de desenvolver neoplasia maligna [18, 56, 57, 63].
Contudo, Hofmann et al. [64] e Dassaoulas et al. [65] não identificaram
associação do ACE e do polimorfismo C936T do gene VEGF.
A metanálise realizada por Xu et al. [37] contendo 13.293 casos de
câncer e 12.308 controles, não evidenciou associação do ACE e polimorfismo
C936T do gene VEGF.
Entretanto, outros autores evidenciaram que o alelo T associou-se ao
maior risco de ACE e outras neoplasias malignas [61], de adenoma colorretal [66],
câncer gástrico [62] e câncer bucal [67] . Esses autores acreditam que o genótipo
variante heterozigoto C/T seja responsável pelo aumento da ocorrência de
neoplasias, mas citam também que os resultados possam variar entre grupos
étnicos diversos, com diferentes expressões em populações distintas.
Alguns autores compararam características histopatológicas do ACE
com o polimorfismo citado, porém os resultados foram controversos. Tanto
Hofman quanto Dassoulas não verificaram associação do polimorfismo VEGF
C936T em relação ao tamanho, diferenciação tumoral, estágio tumoral, presença
de metástase linfonodal e faixa etária. Chae et al. [68] obtiveram resultados
semelhantes, porém Lurje [21] demonstrou que o genótipo selvagem CC esteve
relacionado a recidiva no estágio III do ACE.
A adequada compreensão da biologia molecular e dos mecanismos
genéticos do ACE pode proporcionar novas perspectivas para a prevenção,
prognóstico e tratamento dos pacientes portadores desta enfermidade.
28
2 OBJETIVO
Verificar se o polimorfismo VEGF C936T influencia o risco de ACE
Verificar se o polimorfismo VEGF C936T altera o sexo e a idade de
ocorrência de tumor e a localização, invasão tumoral e acometimento linfonodal
pelo tumor.
29
3 MATERIAL E MÉTODO
Avaliação de pacientes portadores de ACE atendidos, por ocasião do
diagnóstico ou durante o seguimento clínico, no ambulatório de Coloproctologia do
HC da UNICAMP, entre 2008 a 2010.
3.1 Avaliação clínica
As características analisadas foram: idade, sexo, raça, localização do
tumor e estágio do tumor. Os dados referentes a idade, sexo, raça assim como a
autorização para participação no estudo, foram obtidos pela pesquisadora
responsável. Com relação a raça, os participantes foram classificados em
caucasóides e não caucasóides.
O diagnóstico histológico foi realizado em cortes de fragmentos de
tumor incluídos em parafina e corados com hematoxilina e eosina por patologistas
do Laboratório de Anatomia Patológica do Gastrocentro-UNICAMP. A
classificação da diferenciação tumoral foi realizada de acordo com os critérios
propostos por Broders [69]. O estágio do tumor foi obtido por meio de exame
anatomopatológico do espécime cirúrgico e classificado pelos critérios TNM
(quadro 2) [70].
30
Quadro 2:Classificação TNM
Categorias Descrição
Categoria T Tumor
Tx Tumor primário não pode ser avaliado
T0 Não há evidencia de tumor primário
Tis Carcinoma in situ: intra-epitelial ou invasão da lâmina própria
T1 Tumor invade a submucosa
T2 Tumor invade a muscular própria
T3 Tumor ultrapassa a muscular própria até a subserosa ou tecidos pericólicos não peritoniais ou perirretais
T4a Tumor penetra a superfície de peritônio visceral
T4b Tumor se estende diretamente ou está aderido em outros órgãos ou estruturas
Categoria N Linfonodos regionais
Nx Linfonodos regionais não podem ser avaliados
N0 Sem metástase em linfonodos regionais
N1 Metástase em 1 a 3 linfonodos regionais
N1a Metástase em um linfonodo regional
N1b Metástase em 2 a 3 linfonodo regional
N1c Tumor se encontra na subserosa, mesentério ou tecidos noa perotonizados pericólicos ou perirretais, sem metástase em linfonodo regional
N2 Metástase em 4 ou mais linfonodos regionais
N2a Metástase em 4 a 6 linfonodos regionais
N2b Metástase em 7 ou mais linfonodos regionais
31
Categoria M Metástase à distância
M0 Nenhuma metástase a distância foi identificada
M1 Metástase a distância presente
M1a Metástase confinado a um órgão ou local (por exemplo, fígado, pulmão, ovário, sem nódulo regional)
M1b Metástases em mais de um órgão / local ou no peritônio
Quadro 3: Estágio tumoral
Estágio Classificação TNM
0 Tis N0 M0
T1 N0 M0 I
T2 N0 M0
IIA T3 N0 M0
IIB T4a N0 M0
IIC T4b N0 M0
T1-T2 N1/N1c M0 IIIA
T1 N2a M0
T3-T4a N1/N1c M0
T2-T5 N2a M0 IIIB
T1-T2 N2b M0
T4a N2a M0
T3-T4a N2b Mo IIIC
T4b N2b Mo
IV Qualquer T Qualquer N M1a
32
A constatação com relação a presença de metástases foi realizada pelo
achado durante o ato operatório ou exames de imagem (radiograma de tórax,
ultrassom abdominal, tomografia de abdômen e de tórax).
Com relação a localização tumoral, considerou-se o achado do
espécime cirúrgico. Denominou-se cólon direito as lesões presentes no ceco,
cólon ascendente e transverso; cólon esquerdo as lesões do cólon descendente e
sigmóide; reto as lesões localizadas até 18 cm da margem anal.
3.2 Critérios de exclusão Considerou-se como critérios de exclusão, polipose adenomatosa
familiar, síndrome de Lynch (critérios de Amsterdam, quadro 4) [71, 72] doenças
inflamatórias intestinais, antecedente familiar de ACE e aqueles que não
aceitaram participar do estudo proposto.
Quadro 4: Critérios de Amsterdam
Amsterdam I Ao menos três familiares portadores de câncer colorretal verificado
histologicamente;
Um deve ser parente em primeiro grau dos outros dois;
Ao menos duas gerações sucessivas devem ser afetadas;
Ao menos um dos casos de câncer colorretal deve ter sido diagnosticado antes
dos 50 anos;
Polipose adenomatosa familiar deve ser excluída.
Amsterdam II Ao menos três familiares devem ter um câncer associado com câncer colorretal
hereditário não poliposo (HNPCC) (colorretal, endométrio, urotélio ou intestino
delgado);
Um deve ser parente em primeiro grau dos outros dois;
33
Ao menos duas gerações sucessivas devem ser afetadas;
Ao menos um dos casos de câncer associado ao HNPCC deve ter sido
diagnosticado antes dos 50 anos;
Polipose adenomatosa familiar deve ser excluída.
3.3 Grupo controle O grupo controle foi constituído por doadores de sangue oriundos do
Hemocentro da UNICAMP.
Os critérios de inclusão para doadores de sangue foram: idade entre 50
e 60 anos, que não referiram perda de peso, sintomas gastrointestinais ou
antecedente familiar de câncer colorretal, e que não apresentassem doenças
consideradas pré-neoplásicas, adenomas colorretais, polipose adenomatosa
familiar, síndrome de Lynch e doenças inflamatórias intestinais (critérios
estabelecidos pelo Hemocentro da UNICAMP).
Os pacientes portadores de ACE incluídos no estudo fazem parte do
Grupo denominado G1 e o Grupo controle foi denominado G2.
3.4 Análise molecular do polimorfismo C936T do gene VEGF As análises das amostras foram processadas no Laboratório de
Genética do Câncer da FCM da UNICAMP, coordenado pela Profa. Dra. Carmen
Silvia Passos Lima.
Para a extração do DNA genômico é necessário a coleta de 4 ml de
sangue periférico, tanto dos pacientes como grupo controle. A coleta é efetuada
por meio de tubo esterilizado, com capacidade de armazenamento de 4 ml,
contendo EDTA (anticoagulante ácido etilenodiaminotetracético). A amostra é
centrifugada a 1300 rpm por 10 minutos. O plasma é removido e descartado e os
eritrócitos armazenados para posterior extração do DNA genômico.
34
O DNA genômico foi obtido por meio da extração por cloreto de lítio
(WOODHEAD, 1986) e por kit de extração de DNA (Bionner), após o
procedimento descrito acima. O método utilizado por extração de cloreto de lítio,
após descarte do plasma sanguíneo, encontra-se descrito abaixo:
✓ “lavar” o sangue com tampão de lise e repetir o processo até a
remoção completa das hemácias;
✓ Colocar 400µl tampão de digestão e 20µl de proteinase K;
✓ Levar a amostra a 55° por 2 horas;
✓ Adicionar 200µl de cloreto de lítio;
✓ Levar ao freezer por 15 minutos, centrifugar;
✓ Retirar o sobrenadante e colocar em um novo tubo;
✓ Adicionar etanol absoluto e inverter aproximadamente 50 vezes até
que o DNA se precipite;
✓ Centrifugar, desprezar;
✓ Adicionar etanol 70%, agitar, centrifugar e desprezar o álcool;
✓ Secar o DNA, adicionar água e incubar a 55° por 10 minutos;
✓ Armazenar em freezer.
A extração por kit de DNA é reportada abaixo:
✓ Adicionar 20 ul de proteinase K em tubo limpo de 1,5 ml;
✓ Aplicar 200µl de sangue total no tubo contendo proteinase K;
35
✓ Adicionar 200µl de tampão de ligação (G2) e misture imediatamente
por vorticidade. Ressuspender a amostra para atingir lise com máxima eficiência.
✓ Incubar a 60o por 10 min.
✓ Adicionar 100µl de isopropanol e homogeneizar com pipeta.
✓ Centrifugação rápida para as gotas da tampa caírem.
✓ Transferir cuidadosamente o conteúdo para o reservatório superior
do tubo com coluna de vinculação;
✓ Fechar o tubo e centrifugar a 8.000 rpm por 1 min;
✓ Transfira o tubo da coluna de vinculação a um novo tubo de 2 ml de
filtração;
✓ Adicionar 500µl de tampão de lavagem 1 (W1), sem molhar a borda,
fechar o tubo e centrifugar a 8.000 rpm por 1 min;
✓ Abra o tubo e despeje a solução do tubo 2 ml em um frasco de
eliminação;
✓ Juntar cuidadosamente 500µl de tampão de lavagem 2 (W2), fechar
o tubo e centrifugar a 8.000 rpm por 1 min;
✓ Centrifugar mais uma vez para a 12.000 rpm por 1 min para remover
completamente o etanol;
✓ Transferir o tubo da coluna de vinculação a um novo tubo de 1,5 ml
para eluição, adicionar 100µl de tampão de eluição (EL, ou água livre de nuclease)
para ligação de tubos de coluna, e esperar por um minuto à temperatura ambiente
(15 o ~ 25o) até ser absorvido pela fibra de vidro do tubo de ligação da coluna.
✓ Centrifugar a 8.000 rpm por um minuto para eluição.
36
✓ Armazenar a 20o negativos.
O polimorfismo C936T foi avaliado de acordo com os métodos descritos
por Renner et al (2000) onde parte do éxon 8 foi amplificada, por meio da reação
em cadeia da polimerase (PCR), utilizando uma solução contendo de 20mM Tris
HCl (pH 8,4), 50nM de KCl, 4,5mM de MG2l2, 0,2mM de cada nucleotídeo
trifosfato, 20pmol de cada iniciador, 1U Taq DNA polimerase e 500ng de DNA.
A reação iniciou-se pela desnaturação a 94ºC (5 minutos) seguida por
35 ciclos de incubação a 94°C (40 segundos), a 64°C (1 minuto), a 72°C (40
segundos) e 72ºC (5 minutos) para a extensão final. Após a reação, um fragmento
de 208pb, do gene VEGF, foi obtido com a utilização dos iniciadores 5’- AAG GAA
GAG ACT CTG CG2 AGA G2-3’ e posteriormente do iniciador reverso 5’ – TAA
ATG TAT GTA TGT GGG TGG GTG TGT CTA CAG G - 3’.
Os produtos da amplificação dos grupos foram digeridos com 1U da
enzima de restrição endonuclease NlaIII a 37° por 2 horas em banho-maria e
posteriormente analisados por eletroforese em gel de agarose a 3,0% contendo
brometo etílico. Os produtos da amplificação dos pacientes foram digeridos com a
enzima de restrição endonuclease FastDigest®NlaIII (Hin1II) (Fermentas life
sciences) por 5 minutos a 37° em banho seco e posteriormente analisados por
eletroforese em gel de agarose a 2,0% contendo brometo etílico.
Um único fragmento de 208 pares de base (pb) correspondeu ao
genótipo homozigoto selvagem CC. Fragmentos de 208, 122 e 86pb
corresponderam ao genótipo heterozigoto CT e fragmentos de 122 e 86pb
corresponderam ao genótipo homozigoto variante TT. Controles positivo e
negativo para o polimorfismo foram avaliados em cada reação enzimática dos
produtos da PCR em questão.
3.5 Aspectos éticos
O estudo molecular realizou-se em amostras de sangue periférico
obtidos por ocasião da punção venosa realizada para a coleta de exames
37
necessários ao diagnóstico ou acompanhamento clínico dos pacientes e de uma
única punção venosa em controles.
O diagnóstico e o estadiamento foram realizados no ambulatório de
Coloproctologia HC da UNICAMP, podendo haver necessidade de exames
laboratoriais, radiografia de tórax, ultra-sonografia e a tomografia computadorizada
do abdome e pelve. Nenhum material adicional foi coletado dos pacientes ou
controles.
Todas as informações obtidas dos pacientes e controles foram
sigilosas, somente tendo acesso os profissionais envolvidos no estudo. Os dados
foram armazenados em arquivo eletrônico, cuja responsabilidade cabe ao
pesquisador responsável. O material biológico foi armazenado no Laboratório de
Genética do Câncer (FCM-UNICAMP), sob a responsabilidade da Profa. Dra
Carmen Silvia Passos Lima.
Os participantes foram informados e puderam optar por meio do "Termo
de Consentimento Livre e Esclarecido" em:
✓ Permitir ou não o armazenamento do material coletado para
pesquisas futuras nesta área;
✓ Receber ou não os resultados da pesquisa por correio ou telefone.
Os procedimentos realizados só foram efetuados após a obtenção dos
“Termos de Consentimento Livre e Esclarecido” de pacientes e controles (Anexos
1 e 2). O estudo foi aprovado no Comitê de Ética da Faculdade de Ciências
Médicas da UNICAMP (Parecer n° 759/2007, anexo 5).
O armazenamento do material biológico foi realizado para possibilitar a
disponibilização a outras investigações do grupo de trabalho, e que para a
utilização do mesmo, as pesquisas futuras deverão ser aprovadas pelo Comitê de
Ética da instituição, mesmo com a autorização previa do individuo.
38
3.6 Análise estatística O tamanho amostral do estudo teve como base as freqüências dos
polimorfismos gênicos obtidas em indivíduos normais de outras populações e, foi
calculado de acordo com as normas definidas por BEIGUELMAN [73] , sendo
estabelecido o total de 250 pacientes.
O teste de verificação do Equilíbrio de Hardy-Weinberg foi realizado
com o intuito de verificar se ocorre distribuição preferencial de algum dos
genótipos avaliados no grupo de pacientes e controles utilizados no estudo
(BEIGUELMAN, 1995).
O significado estatístico das diferenças entre grupos foi calculado por
meio dos testes exato de Fisher, qui-quadrado, Kruskal-Wallis e Wilcoxon. O teste
de regressão logística foi realizado para corrigir discrepâncias de idades em
comparação entre pacientes e controles.
39
4 RESULTADOS
Fazem parte do estudo 261 controles (G2) e 261 pacientes com ACE
(G1) atendidos, por ocasião do diagnóstico ou durante o seguimento clínico, no
ambulatório de Coloproctologia do Hospital das Clínicas da UNICAMP.
O cálculo do tamanho amostral de acordo com as freqüências dos
polimorfismos foi de 237,72.
O teste de Hardy-Weinberg foi aplicado a controles e pacientes. Ambos
estão em equilíbrio (X2=0,019, p=0,89 e X2=0,587, p=0,4436 respectivamente),
para o lócus do polimorfismo VEGF C936T.
4.1 Idade
A idade média dos pacientes foi de 65,2 (32-97) anos, sendo que a
comparação entre os grupos evidenciou faixa etária maior no Grupo G1 (tabela1).
Tabela 1: Análise comparativa da idade média entre pacientes e controles
IDADE
Grupo média desvio-padrão mediana
G1 65,2 12,3 66
G2 52,9 3,7 53
teste Wilcoxon pareado p < 0.0001
Com relação à faixa etária não foram identificadas diferenças nas
freqüências dos genótipos do polimorfismo (tabela 2), assim como na comparação
das mesmas entre os grupos (tabela 3).
40
Tabela 2: Idades média e mediana e genótipos do polimorfismo C936T do gene
VEGF
IDADE
Variante n Idade média desvio-padrão mediana
CC 415 59 11,1 56,0
CT 102 59 10,6 56,0
TT 5 58,4 11,8 53,0
teste de Kruskal-Wallis p = 0.9283
Tabela 3: Idade média das variantes do polimorfismo C936T por grupos
IDADE
G1 G2
Variante n Idade média n Idade média
CC 210 64,9 205 52,9
CT 48 65,8 54 52,8
TT 3 62,6 2 52
4.2 Sexo Com relação ao sexo de pacientes e controles, observou-se discreto
predomínio do sexo masculino (52,1%) sendo que não foram observadas
diferenças estatísticas em relação aos grupos (tabela 4).
41
Tabela 4: Distribuição de pacientes (G1) e controles (G2) por sexo
SEXO
G1 G2
n % n % Sexo
F 125 47,9 125 47,9 M 136 52,1 136 52,1
Test qui-uadrado p=1,00
Gráfico 1: Distribuição de pacientes (G1) e controles (G2) por sexo
45,0% 46,0% 47,0% 48,0% 49,0% 50,0% 51,0% 52,0% 53,0%
Masculino Feminino
Sexo
G1
G2
42
Tabela 5: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T de pacientes
e controles por sexo
SEXO
G1 G2
CC CT+TT CC CT+TT
n n
Feminino* 105 19 95 30
Masculino** 101 36 110 26
*Teste exato de Fisher p= 0,1105 **Teste exato de Fisher p= 0,1936
4.3 Classe Observou-se também um predomínio da classe caucasóide, tanto no
G1 (88,9%) como no G2 (87,4%), porém sem diferença estatística na comparação
entre os grupos (p>0,05).
Tabela 6: Distribuição de pacientes e controles por classe
CLASSE
G1 G2
n % n %
Caucasóide 219 83,9 232 88,9
Não-caucasóide 42 16,1 29 11,1
Teste exao de Fisher p=0,1976
43
Gráfico 2: Distribuição de pacientes e controles por classe
4.4 Localização do tumor A localização tumoral prevalente foi no reto com 119 pacientes, seguido
pelo cólon descendente (n=98), cólon ascendente (n=27) e com a menor
ocorrência o cólon transverso (n=10). Em quatro portadores de neoplasia de cólon
não foi possível a identificação do segmento acometido e em 19 não constava no
prontuário se o tumor primário era do reto ou cólon (tabela 6 e gráfico 3)
(p=0,1202).
0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0% 50,0% 60,0% 70,0% 80,0% 90,0%
Caucasóide Não caucasóide
Raça
G1
G2
44
Tabela 7: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo a
localização tumoral
LOCALIZAÇÃO TUMORAL
Cólon Direito Cólon esquerdo Reto n % n % n %
CC 34 87,2% 55 74,3% 99 79,2%
CT 5 12,8% 19 25,7% 24 19,2% TT 2 1,6%
Test qui-qadrado p= 0,2575
Gráfico 3: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo a
localização tumoral
4.5 Classificação TNM A análise da freqüência das variantes do polimorfismo foram
estudados em relação ao sistema TNM, não evidenciou diferença da freqüência da
variante CC nos diversos estágios, enquanto que a variante CT foi mais freqüente
no estágio I (p=0,0091). No estágio IV, a variante selvagem (CC) foi a única
identificada. A tabela 7 apresenta a freqüência dos genótipos do polimorfismo
0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0% 50,0% 60,0% 70,0% 80,0% 90,0%
CC CT
TT
Localização Tumoral
Cólon direito
Cólon esquerdo
Reto
45
VEGF C936T segundo a classificação TNM incluindo os pacientes com neoplasia
de reto com tratamento neo-adjuvante. Foram excluídos 49 pacientes por falta de
dados para a obtenção do estágio.
Tabela 8: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo os
estágios da TNM
ESTÁGIO TUMORAL
I II III IV
n % n % n % n %
CC 32 67,4% 64 89,7% 63 76,3% 11 100%
CT 15 30,4% 7 10,3% 19 23,8%
TT 1 2,2%
Teste exato de Fisher p = 0,0091
46
Gráfico 4: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo os
estágios da TNM
A análise com a exclusão de 83 pacientes portadores de neoplasia
de reto com tratamento neo-adjuvante, também não evidenciou diferença
significante em relação aos estágios do tumor pela classificação TNM (tabela 8).
Quando agrupados os estágios I e II e comparamos com os estágios III e IV
obtivemos p = 0,2947 (OR 1,325, 95% IC, 0,8109 a 2,166) como podemos
visualizar na tabela 9.
0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0% 50,0% 60,0% 70,0% 80,0% 90,0% 100,0%
CC CT
TT
Estágio
I
II
III
IV
47
Tabela 9: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo a
classificação TNM excluindo-se pacientes com terapia neo-adjuvante
ESTÁGIO
I II III IV
n % n % n % n %
CC 17 81% 46 86,8% 49 74,2% 9 100%
CT 4 19% 7 13,2% 17 25,8%
Teste t-student p = 0,1526
Gráfico 5: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo a
classificação TNM excluindo-se pacientes com terapia neo-adjuvante
I
II
III
I V
0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0% 50,0% 60,0% 70,0% 80,0% 90,0% 100,0%
CC CT
Estágio
I
II
III
I V
48
Tabela 10: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T agrupando o
estágio I e II versus III e IV, excluindo-se pacientes com terapia neo-adjuvante
ESTÁGIO
I + II III + IV
n % n %
CC 63 85,1% 58 77,3%
CT 11 14,9% 17 22,7%
Teste exato de Fisher p = 0,2947
Gráfico 6: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T agrupando o
estágio I e II versus III e IV, excluindo-se pacientes com terapia neo-adjuvante
I + II
III + IV
0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0% 50,0%
60,0%
70,0%
80,0%
90,0%
CC CT
I + II
III + IV
49
4.5.1 Infiltração tumoral e acometimento de linfonodos Para a análise da infiltração tumoral e de acometimento de
linfonodos foram excluídos 83 portadores de neoplasia de reto com tratamento
neo-adjuvante e 40 pacientes por falta de dados. Dois pacientes portadores de
pólipos com transformação carcinomatosa e removidos no pré-operatório por
colonoscopia foram classificados como T0. Não se observou diferença nas
freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T em relação à invasão
tumoral (tabela 10). Não foi identificada nesta população a variante TT.
Tabela 11: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo a
infiltração tumoral
INVASÃO TUMORAL
Tis T0 T1 T2 T3 T4
N % N % N % N % N % N %
CC 1 100% 1 50% 8 72,7% 23 88,5% 77 87,5% 7 70%
CT 1 50% 3 27,3% 3 11,5% 11 12,5% 3 30%
Qui-quadrado p = 0,6061
50
Gráfico 7: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo a
infiltração tumoral
A análise da infiltração tumoral quando agrupamos as categorias Tis,
T0 e T1 versus T2, T3 3 T4 também não obtivemos resultados estatísticos
significantes (p=0,2288), o mesmo ocorreu com o risco relativo (OR 0,4487, 95%
IC, 0,1550 a 1,2999) como demonstrado na tabela 11.
Tis
T0 T1
T2 T3 T4
0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0%
50,0%
60,0%
70,0%
80,0%
90,0%
CC CT
Tis
T0
T1
T2
T3
T4
51
Tabela 12: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T agrupando
as categorias Tis, T0 e T1 versus T2, T3 e T4, excluindo-se pacientes com terapia
neo-adjuvante
Infiltração tumoral
Tis + T0 + T1 T2 + T3 + T4
n % n %
CC 10 71,4% 107 86,3%
CT 4 28,6% 17 13,7%
Teste exato de Fisher p = 0,2288
Gráfico 8: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T agrupando as
categorias Tis, T0 e T1 versus T2, T3 e T4, excluindo-se pacientes com terapia
neo-adjuvante
Tis+T0+T1
T2+T3+T4
0,0% 10,0% 20,0%
30,0%
40,0%
50,0%
60,0%
70,0%
80,0%
90,0%
CC CT
Tis+T0+T1
T2+T3+T4
52
Com relação ao acometimento de linfonodos, também não foram
identificadas diferenças significantes em relação as variantes estudadas (tabela
10) (p=0,7637).
Tabela 13: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo o
acometimento de linfonodos
LINFONODO
N0 N1 N2
N % N % N %
CC 58 (84,1%) 35 (81,4%) 15 (93,8%)
CT 11 (15,9%) 08 (18,6%) 1 (6,3%)
teste exato de Fisher p = 0,4641
Gráfico 9: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo o
acometimento de linfonodos
0,0%
50,0%
100,0%
CC CT
Linfonodo
N0
N1
N2
53
4.6 Análise do genótipo em pacientes e controles Após a amplificação e digestão do DNA, os resultados foram analisados
conforme a figura 2. Quando a imagem mostra somente fragmentos de 208pb
significa que o paciente é portador do genótipo selvagem CC, quando a imagem
mostra fragmentos de 208, 122 e 86pb, o paciente é portador do genótipo variante
heterozigoto CT e quando na imagem aparecem os fragmentos de 122 e 86pb
significa que o paciente é portador do genótipo variante homozigoto TT.
Figura 2: Banda auto-radiografada com genótipos do polimorfismo C936T do gene
VEGF
Marcador CT CC TT
208 pares de base
122 pares de base 86 pares de base
Enzima de restrição NlaIII. M: marcador de DNA com tamanho de
100pb; CC= genótipo selvagem; CT= genótipo variante heterozigoto do C936T.
A análise dos genótipos do polimorfismo C936T não demonstrou
diferença estatística entre os grupos (Tabela 13, gráfico 10)
54
Tabela 14: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T em
pacientes e controles
VEGF 936
G1 G2
n % n %
CC 210 80,5 205 78,5
CT 48 18,4 54 20,7
TT 3 1,1 2 0,8
teste exato de Fisher p= 0,737 Gráfico 10: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T em
pacientes e controles
A análise da chance de risco (OR) da variante CC em relação a CT
foi de 1,47 com intervalo de confiança 95% (0,80 a 2,70), e da variante TT em
0,0%
20,0%
40,0%
60,0%
80,0%
100,0%
CC CT TT
VEGF
G1
G2
55
relação CT foi de 0,34 com intervalo de confiança de 95% (0,03 a 3,63), com
p=0,737 (regressão logística com fator de ajuste para a idade).
56
5 DISCUSSÃO
A angiogênese desempenha um papel essencial no crescimento
tumoral, invasão e metástase das células tumorais e pode ser estimulada pela
produção de fatores produzidos pela células neoplásicas [74, 75]. Entre os fatores
que regulam a angiogênese, o VEGF é o mais conhecido e considerando sua
capacidade de estimular a proliferação vascular, a sua expressão teria a
capacidade de modificar o comportamento biológico de tumores sólidos, incluindo
o ACE. O gene VEGF humano entretanto, é altamente polimórfico propiciando
uma ampla variação de sua expressão entre os indivíduos.
Acredita-se que o polimorfismo VEGF C936T interfira na produção da
proteína [44, 76], sendo o genótipo homozigoto variante TT associado aos
menores níveis plasmáticos da proteína VEGF [21]. Assim, o genótipo TT
diminuiria a angiogênese e, em tese, proporcionaria menor desenvolvimento
tumoral. Sabe-se que níveis séricos mais elevados de VEGF no período pré-
operatório em portadores de ACE associou-se a menor sobrevida [77].
Entretanto, estudos desse polimorfismo em diversos tumores sólidos
apresenta resultados distintos em relação ao risco de câncer ou fatores
prognósticos [35, 57, 78]. Oliveira et al. [79] demonstraram que o genótipo
selvagem CC é determinante para a maior agressividade do tumor esporádico de
mama.
No câncer gástrico, Tzanakis et al [62] encontraram uma forte
associação entre o gene C936T, o genótipo TT esta relacionado a um tamanho
maior do tumor. No entanto, os resultados do presente estudo, bem como os
resultados de Hofmann e Dassoulas não apóiam uma associação com o tamanho
do tumor, graduação histológica, estágio do tumor, metástases linfonodais e idade
ao diagnóstico em casos ACE, contudo Chae [68] mostrou que o alelo T esta
relacionado com o estagio avançado (metástase) do ACE.
Estes dados sugerem que a contribuição de cada genótipo às
57
características do tumor pode estar intimamente relacionada com o tipo de órgão
que carrega a malignidade.
O presente estudo sugere que os genótipos estudados não aumentam
o risco de ACE (CT x CC = OR 1,47 95% IC 0,80 a 2,70 e TT x CT = OR 0,34 95%
IC 0,03 a 3,63). Estes achados foram corroborados por Hofmann [64], Dassaoulas
[65], Xu [37] e colaboradores obtendo os mesmos resultados em relação ao
polimorfismo C936T. Achados diversos foram obtidos por Eroglu e Wu [61, 80] em
estudo que evidenciou que este polimorfismo aumenta a predisposição do
paciente a desenvolver um tumor maligno, apesar da freqüência das variantes
deste estudo ser semelhante a de outros estudos [56, 81].
Estes dados podem ser explicados pela ação de diversos fatores como
a variação no lócus, ação de vários outros genes, aspectos ambientais e etnia, o
que justificaria seu estudo em populações distintas. Hefler et al [82] reportaram
que a presença de três genótipo homozigotos (2578/CC; 1154/GG; 634/CC)
presentes simultaneamente aumentaram os níveis séricos de VEGF e
relacionaram-se com menor sobrevida em 563 pacientes com carcinoma de
ovário. Assim, além da variação seqüencial do gene VEGF que alteraria sua
produção ou atividade, outros fatores angiogênicos presentes na circulação,
interagindo com VEGF, poderiam influenciar seu papel na patogênese de
cânceres.
O estudo da freqüência do polimorfismo torna-se importante pois pode
correlacionar-se com informações genéticas populacionais e assim determinar sua
influência no desenvolvimento tumoral. Nesta casuística, o estudo da distribuição
genotípica pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg demonstrou que as variantes
estudadas encontram-se dentro da proporcionalidade genética esperada.
A análise do polimorfismo com relação à idade, sexo e localização
tumoral não evidenciou alterações significativas, achado distinto de BAE et al. [83],
que constataram que a ocorrência do alelo T aumentaria o risco em indivíduos
58
com idade inferior a 55 anos, mulheres, e estaria associado a maior ocorrência de
adenocarcinoma em cólon direito. Estes resultados podem ser explicados devido a
diferença étnica.
O estudo de aspectos relacionados ao comportamento biológico do
ACE também não evidenciou correlação quanto à presença do polimorfismo com
aspectos relacionados à invasão tumoral, acometimento de linfonodos ou
ocorrência de metástases, apesar de Vidaurreta et al. [76] reportar que o alelo T
se mostrou em menor freqüência no estágio de Dukes D (presença de metástase
a distância) e estágios inicias do CCR. Porém outros estudos mostram que o
aumento da expressão do VEGF está associado a ocorrência de metástase [59,
68, 84] e estágios mais avançados da doença [68], mas poucos estudos relata o
envolvimento do VEGF no estágio e localização tumoral [65]. Kim et al. [59] em
estudo com três polimorfismos do gene VEGF em 445 portadores de CCR
observaram que o genótipo 936TT associou-se a menor sobrevida.
No presente estudo o polimorfismo C936T não altera o risco de
desenvolvimento ACE. Nossos resultados estão de acordo com Hofmann et al.
[64], Dassoulas [65] e Wu [81] que sugeriram que os polimorfismos C2578A,
G634C e C936T não são fatores de risco geral para a ACE. A análise do
polimorfismo C936T do gene VEGF do presente estudo também foi realizada em
câncer de mama, pulmão, estômago, melanoma [35, 62, 85] e não influenciou a
suscetibilidade ao câncer de mama de forma significativa no estudo de Jin et al.
[85]. Por outro lado, os portadores do alelo T no VEGF 936 apresentam diminuição
do risco de câncer de mama e de pulmão de acordo com outros pesquisadores
[56, 86]. Esses resultados não são inesperados, pois o VEGF funciona como um
mediador fundamental da angiogênese, influenciando aspectos biológicos e
fenotípicos (tamanho do tumor, grau histológico, estágio da doença, e potencial
metastático) do que definir a susceptibilidade ao desenvolvimento de câncer.
Vários estudos têm recomendado que os genótipos do VEGF
influenciam a expressão VEGF [44, 56, 87, 88]. Como existem controvérsias em
59
relação ao papel do polimorfismo C936T para o desenvolvimento e evolução de
alguns tipos de tumores malignos, justifica-se a realização de outros estudos,
incluindo a analise sérica da proteína do VEGF no sangue periférico dos pacientes
e controles, além de correlacionar este polimorfismo com outros envolvidos na
síntese do VEGF e angiogênese.
A princípio o VEGF C936T não pode ser considerado um marcador
tumoral no câncer colorretal em nossa população, apesar da angiogênese ser um
alvo terapêutico promissor, visando a inibição da formação de novos vasos e
possibilitando assim a regressão tumoral. Estudos com casuísticas maiores e com
indivíduos das diversas regiões do pais são necessários para definir o papel do
polimorfismo no risco de ACE em nossa população. Descobertas sobre
polimorfismos gênicos têm influenciando estas terapias utilizando o VEGF como
alvo, possibilitando a adequação de tratamentos individuais e melhorar a resposta
terapêutica no pós-operatório e tratamentos como quimioterapia [89, 90].
Algumas limitações devem ser consideradas neste estudo: os
indivíduos do grupo controle podem desenvolver ACE nos anos subseqüentes e
não foi considerado fatores ambientais como tabagismo e etilismo.
A contínua investigação para o melhor conhecimento sobre a
funcionalidade dos diversos polimorfismos do gene VEGF e sua relação com o
desenvolvimento tumoral deve ser incentivada, pois levará a uma melhor
compreensão da biologia tumoral e comportamento, podendo influenciar aspectos
terapêuticos assim como esclarecer a inconsistência de dados encontrados em
estudos recentes.
60
6 CONCLUSÕES
✓ O polimorfismo C936T do gene VEGF não altera o sexo e a idade de
ocorrência do tumor, bem como a localização, o acometimento de linfonodo e o
grau de invasão tumoral.
✓ O polimorfismo C936T do gene VEGF não influencia o risco de
ocorrência de ACE em indivíduos de nossa população.
61
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71. Vasen, H.F.A., et al., The International Collaborative Group on
Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer (ICG-HNPCC). Diseases of the Colon
& Rectum, 1991. 34(5): p. 424-425.
72. Vasen, H.F.A., et al., New clinical criteria for hereditary nonpolyposis
colorectal cancer (HNPCC, Lynch syndrome) proposed by the International
Collaborative Group on HNPCC. Gastroenterology, 1999. 116(6): p. 1453-1456.
73. Beiguelman, B., Dinâmica dos Genes nas Famílias e Populações.
Sociedade Brasileira de Genética, 1995(2): p. 1-472.
74. Ferrara, N. and T. Davis-Smyth, The Biology of Vascular Endothelial
Growth Factor. Endocrine Reviews, 1997. 18(1): p. 4-25.
75. Carmeliet, P. and R.K. Jain, Angiogenesis in cancer and other
diseases. Nature, 2000. 407(6801).
76. Vidaurreta, M., et al., Vascular endothelial growth factor gene
polymorphisms in patients with colorectal cancer. Revista Espanhola de
Enfermedades Digestivas, 2010. 102(1): p. 20-25.
77. De Vita, F., et al., Elevated perioperative serum vascular endothelial
growth factor levels in patients with colon carcinoma. Cancer, 2004. 100(2): p. 270-
278.
78. Lin, C.-C., et al., Vascular endothelial growth factor gene‚àí460 C/T
polymorphism is a biomarker for prostate cancer. Urology, 2003. 62(2): p. 374-377.
79. Oliveira, C., et al., Polymorphisms in the 5'- and 3'-untranslated
region of the VEGF gene and sporadic breast cancer risk and clinicopathologic
characteristics. Tumor Biology, 2011. 32(2): p. 295-300.
80. Wu, X., et al., Vascular endothelial growth factor 1498C/T, 936C/T
polymorphisms associated with increased risk of colorectal adenoma: a Chinese
case–control study. Molecular Biology Reports, 2011. 38(3): p. 1949-1955.
81. Wu, G.-y., et al., Association Between EGF, TGF-β1, VEGF Gene
Polymorphism and Colorectal Cancer. World Journal of Surgery, 2009. 33(1): p.
124-129.
68
82. Hefler, L.A., et al., Vascular Endothelial Growth Factor Gene
Polymorphisms Are Associated with Prognosis in Ovarian Cancer. Clinical Cancer
Research, 2007. 13(3): p. 898-901.
83. Bae, S.J., et al., Gender-specific Association between Polymorphism
of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF 936C > T) Gene and Patients with
Stomach Cancer. Yonsei Med J, 2008. 49(5): p. 783-791.
84. Guba, M., et al., Vascular endothelial growth factor in colorectal
cancer. International Journal of Colorectal Disease, 2004. 19(6): p. 510-517.
85. Jin, Q., et al., Vascular Endothelial Growth Factor Polymorphisms in
Relation to Breast Cancer Development and Prognosis. Clinical Cancer Research,
2005. 11(10): p. 3647-3653.
86. LEE, J.E., et al., Effect of Estrogen, Tamoxifen and Epidermal
Growth Factor on the Transcriptional Regulation of Vascular Endothelial Growth
Factor in Breast Cancer Cells. Anticancer Research, 2004. 24(6): p. 3961-3964.
87. Koukourakis, M.I., et al., VEGF gene sequence variation defines
VEGF gene expression status and angiogenic activity in non-small cell lung
cancer. Lung Cancer, 2004. 46(3): p. 293-298.
88. Watson, C.J., et al., Identification of polymorphism within the
vascular endothelial growth factor (VEGF) gene: correlation with variation in VEGF
protein production. Cytokine, 2000. 12(8): p. 1232-1235.
89. Loupakis, F., et al., Retrospective exploratory analysis of VEGF
polymorphisms in the prediction of benefit from first-line FOLFIRI plus
bevacizumab in metastatic colorectal cancer. BMC Cancer, 2011. 11(1): p. 247.
90. Grothey, A. and E. Galanis, Targeting angiogenesis: progress with
anti-VEGF treatment with large molecules. Nat Rev Clin Oncol, 2009. 6(9).
69
ANEXO 1: Termo de Consentimento Paciente
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido - a ser obtida dos pacientes, para
participação no estudo intitulado “Identificação do polimorfismo C936T no gene
VEGF, em pacientes portadores de adenocarcinoma colorretal esporádico”.
Nome do paciente: ...................................................................................................
Idade:.............. anos RG: ......................................
HC:.............................................
Endereço: ..................................................................................................................
Nome do responsável legal (se paciente incapacitado): ........................................
RG:................................................ Grau de parentesco: ........................................
Endereço:..................................................................................................................
Aceito participar do estudo proposto, no qual fornecerei uma amostra de sangue
(volume: 12 ml) a ser colhida em veia de um dos braços. Estou ciente de que este
sangue será utilizado para a avaliação de uma predisposição familiar para o
desenvolvimento de câncer do intestino e reto. Sei que posso sentir dor de
pequena intensidade e pequena duração no local da punção da veia. Estou ciente
de que não terei outros prejuízos com a realização deste exame. Essa é uma área
que está em grande evolução, portanto, caso você permita, gostaríamos de
guardar seu material para novos estudos nessa área. Qualquer outro estudo que
utilize esse material, primeiro deverá ser aprovado no Comitê de Ética em
Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP e na Comissão
Nacional de Ética em Pesquisa. Sei que posso sair do estudo a qualquer momento
e que isto não vai prejudicar o meu tratamento na UNICAMP. Sei ainda, que meus
dados pessoais foram mantidos em sigilo pelo pesquisador. Se tiver qualquer
dúvida sobre o estudo poderei procurar o Prof. Dr. Cláudio Saddy Rodrigues Coy
no Gastrocentro - UNICAMP. Tel: (19) 3521-1383 e 3521-8563. Se tiver
70
reclamações sobre qualquer procedimento do estudo, poderei procurar a
secretaria do Comitê de Ética do Hospital das Clínicas UNICAMP. Tel: (19) 3521-
8936.
Eu li/ouvi o conteúdo deste termo e recebi esclarecimentos sobre as minhas
dúvidas oralmente.
Guardar Material: SIM ( ) NÃO ( )
Gostaria de ser avisado por carta ou telefone se for constatado a predisposição
genética ao câncer de intestino e reto: SIM ( ) NÃO ( )
....................................................................
Assinatura do paciente
..........................................................................
Assinatura do responsável legal
.............................................................................
Assinatura do pesquisador legal
Campinas,.......... / ............ / ..........
71
ANEXO 2: Termo de Consentimento Controle
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido - a ser obtida dos controles, para
participação no estudo intitulado “Identificação do polimorfismo C936T no gene
VEGF, em pacientes portadores de adenocarcinoma colorretal esporádico”.
Nome do controle: ...................................................................................................
Idade:...............anos RG: ......................................
HC:.............................................
Endereço: ..................................................................................................................
Nome do responsável legal (se paciente incapacitado):.........................................
RG:................................................ Grau de parentesco:.........................................
Endereço:...................................................................................................................
Aceito participar do estudo proposto, no qual fornecerei uma amostra de sangue
(volume: 10 ml) a ser colhida em veia de um dos braços. Estou ciente de que este
sangue será utilizado para a avaliação de uma predisposição familiar para o
desenvolvimento de câncer do intestino e reto. Sei que posso sentir dor de
pequena intensidade e pequena duração no local da punção da veia. Estou ciente
de que não terei outros prejuízos com a realização deste exame. Essa é uma área
que está em grande evolução, portanto, caso você permita, gostaríamos de
guardar seu material para novos estudos nessa área. Qualquer outro estudo que
utilize esse material, primeiro deverá ser aprovado no Comitê de Ética em
Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP e na Comissão
Nacional de Ética em Pesquisa. Sei que posso sair do estudo a qualquer momento
e que isto não vai prejudicar o meu tratamento na UNICAMP. Sei ainda, que meus
dados pessoais foram mantidos em sigilo pelo pesquisador. Se tiver qualquer
dúvida sobre o estudo poderei procurar o Prof. Dr. Cláudio Saddy Rodrigues Coy
no Gastrocentro - UNICAMP. Tel: (19) 3521-1383 e 3521-8563. Se tiver
72
reclamações sobre qualquer procedimento do estudo, poderei procurar a
secretaria do Comitê de Ética do Hospital das Clínicas UNICAMP. Tel: (19) 3521-
8936.
Eu li/ouvi o conteúdo deste termo e recebi esclarecimentos sobre as minhas
dúvidas oralmente.
Guardar Material: SIM ( ) NÃO ( )
Gostaria de ser avisado por carta ou telefone se for constatado a predisposição
genética ao câncer de intestino e reto: SIM ( ) NÃO ( )
....................................................................
Assinatura do paciente
..........................................................................
Assinatura do responsável legal
.............................................................................
Assinatura do pesquisador legal
Campinas,.......... / ............ / ..........
72
ANEXO 3: TABELA CONTROLE
Nome Sexo Raça Idade VEGF C936T
GJL M C 25 CC
JCM M C 50 CT
ACS M C 50 CC
JCS M C 50 CC
VO M C 50 CC
ECL M C 50 CC
HJM M C 50 CC
JCS M C 50 CC
JML M C 50 CT
JRC M C 50 CC
FLGF M C 50 CT
JSFP M C 50 CC
CAP M C 50 CC
OM M C 50 CC
UT M C 50 CC
VO M C 50 CC
JCM M C 50 CC
ACS M C 50 CC
MFN M C 51 CT
FS M C 51 CT
CAF M C 51 CC
SPB M C 51 CC
GPS M C 51 CC
ARO M C 51 CC
JBBM M C 51 CT
JMF M C 51 CC
JRC M C 51 CC
73
ABS M C 51 CC
AS M C 51 CC
ALG M C 51 CC
NC M C 51 CC
PBS M C 51 CT
ALF M C 51 CC
AS M C 51 CC
MFN M C 51 CC
FS M C 51 CC
SPB M C 51 CC
RM M C 51 CC
ACSR M C 52 CC
WMC M C 52 CC
ECC M C 52 CC
DB M C 52 CC
JC M C 52 CT
JGSS M C 52 CC
CJF M C 52 CT
JPML M C 52 CC
FD M C 52 CC
ACC M C 52 CC
WMC M C 52 CC
ACSR M C 52 CC
ECC M C 52 CC
DB M C 52 CC
AJ M C 52 CC
ART M C 53 CC
LSS M C 53 CC
JGS M C 53 CC
DAS M C 53 CC
74
JCL M C 53 CT
JGS M C 53 TT
MJS M C 53 CC
MN M C 53 CC
JVF M C 53 CC
LSS M C 53 CC
VAB M C 53 CC
MRS M C 53 CC
MS M C 54 CC
ST M C 54 CC
AC M C 54 CC
MGB M C 54 CC
LAL M C 54 CC
MGB M C 54 CC
VA M C 54 CC
MS M C 54 CC
AC M C 54 CC
LAL M C 54 CC
ET M C 55 CC
JMHM M C 55 CC
JRS M C 55 CT
MC M C 55 CC
M M C 55 CC
PAS M C 55 CC
JGAS M C 55 CC
JPS M C 55 CC
ABCM M C 55 CC
MC M C 55 CC
VA M C 55 CC
NPS M C 55 CC
75
PAS M C 55 CC
PJS M C 55 CT
VA M C 55 CT
JMHM M C 55 CC
JRS M C 55 CC
SN M C 55 CC
ANP M C 56 CC
APM M C 56 CC
ANP M C 56 CT
APM M C 56 CC
RBAN M C 56 CC
SFR M C 56 CC
ACB M C 56 CC
PNOS M C 56 CC
RBAN M C 56 CC
SR M C 56 CC
RBM M C 56 CC
LG M C 56 CT
JFS M C 57 CC
LGO M C 57 CC
JAS M C 57 CT
BB M C 57 CC
MVG M C 57 CT
JPA M C 57 CC
IF M C 57 CT
WMS M C 57 CC
OJ M C 58 CC
OJ M C 58 CC
AR M C 58 CC
JAF M C 59 CC
76
JFN M C 59 CC
LGT M C 59 CC
CM M C 59 CC
JAS M C 59 CT
AP M C 59 CC
MHP M C 60 CT
JDS M C 60 CC
EPC F C 47 CC
ASA F C 46 CC
IA F C 46 CT
RAFM F C 47 CT
LLB F C 47 CC
AMDA F C 47 CC
SSD F C 47 CC
MWAR F C 47 CC
LMSS F C 47 CT
GLZG F C 47 CC
EFN F C 48 CT
AMG F C 48 CC
MVAS F C 48 CC
MPB F C 48 CT
ES F C 48 CT
ECB F C 49 CT
IAGMS F C 49 CC
NFAL F C 49 CC
NS F C 49 CC
LG2 F C 49 CT
MATM F C 49 CC
MRA F C 49 CC
ASA2 F C 49 CT
77
RMFM F C 49 CT
MFLDP F C 49 CT
NGAB F C 50 CC
EPA F C 50 CC
MCP F C 50 CC
SPU F C 50 CC
MARSM F C 50 CC
CMC F C 50 CC
MAOM F C 50 CC
LFN F C 50 CC
IMV F C 50 CC
MHPS F C 51 CT
DISD F C 51 CC
LTG F C 51 CC
MABB F C 51 TT
CR F C 51 CC
MFRV F C 51 CC
LNS F C 51 CC
LENA F C 51 CC
EACL F C 51 CC
BRB F C 51 CC
CSF F C 52 CC
ALA F C 52 CC
AVG F C 52 CC
MAT F C 52 CC
IMLC F C 52 CC
MACG F C 52 CC
ONISM F C 52 CC
NRP F C 52 CT
CCT F C 52 CC
78
ACDG F C 52 CC
AAO F C 52 CC
NMJG F C 53 CC
JMS F C 53 CT
CPL F C 53 CC
CSF F C 53 CC
MSCO F C 53 CC
MJC F C 53 CC
TABM F C 53 CC
COB F C 53 CC
MAP2 F C 53 CC
EMF F C 53 CC
LAS F C 53 CT
TJPR F C 54 CT
CM F C 54 CC
AABP F C 54 CC
DMB F C 54 CC
MSOR F C 54 CC
BMSJ F C 54 CT
RBB F C 54 CT
LSO F C 54 CC
GAS F C 54 CC
APC F C 54 CC
MLAC F C 54 CC
ISD F C 54 CC
EAB F C 55 CC
BA F C 55 CC
SBSF F C 55 CC
VAS F C 55 CC
MLS F C 56 CT
79
IRP F C 56 CT
LAS F C 56 CT
VSPF F C 56 CC
HCL F C 56 CC
DLS F C 56 CC
SCM F C 56 CC
MCBF F C 56 CC
ZVS F C 56 CC
LL F C 56 CC
MLSL F C 56 CC
CBL F C 56 CC
MARC F C 57 CC
MLVS F C 57 CC
MPSL F C 57 CT
ASL F C 57 CC
AAZ F C 57 CC
OPS F C 57 CC
LTO F C 58 CT
MCT F C 58 CC
LOR F C 58 CT
EPI F C 58 CT
GMC F C 58 CT
MPM F C 59 CC
EF F C 60 CC
ASL F C 62 CC
JAS M NC 51 CC
BJZ M NC 52 CC
LO M NC 52 CC
JAN M NC 52 CT
JCAN M NC 53 CT
80
LM M NC 53 CT
SMS M NC 54 CC
JRF M NC 55 CC
NS M NC 56 CT
ARS M NC 58 CC
EPT M NC 59 CT
ESR M NC 60 CC
SAB F NC 46 CC
WSS F NC 46 CC
MASR F NC 46 CT
CAV F NC 46 CC
AISM F NC 48 CC
TAF F NC 50 CC
MPSG F NC 50 CT
MJGJ F NC 51 CT
ALFR F NC 51 CC
TAF F NC 51 CC
EETR F NC 51 CC
RMC F NC 52 CC
AMSC F NC 54 CC
MDS F NC 54 CC
MABR F NC 55 CC
VSC F NC 58 CC
AFDO F NC 59 CC
81
Anexo 4: TABELA PACIENTES
Num Idade Sexo cor vegf tp np mp estagio neoadj LOCAL
4 72 M C CT Cólon esquerdo
7 82 M NC CC II Cólon esquerdo
8 34 M NC CC
10 56 F C CC T2 N1 MX III Sim Reto
12 64 M C CT Cólon esquerdo
14 84 M C CC T1 N0 MX I Sim Reto
16 68 M C CC T3 N0 MX II Sim Reto
17 73 M C CC Cólon esquerdo
18 68 F C CC
19 72 F C CC T2 N0 MX I Cólon direito
20 50 M C CC
24 60 M C CC T3 N1 M1 IV Cólon direito
25 64 M C CC T3 N1 III Cólon direito
26 50 M NC CC T2 N1 MX III Reto
31 56 F NC CT III Cólon esquerdo
32 81 F NC CC T2 N0 MX I Reto
35 84 M C CC T3 N0 MX II Sim Reto
36 73 M C CC T3 III Cólon esquerdo
37 81 M C CC T3 N1 MX III Cólon direito
38 63 M C CC Sim reto
39 76 M C CC T3 N1 MX III Cólon direito
40 75 F NC CC T3 N1 MX III Cólon esquerdo
41 81 F C CC T3 IV Cólon direito
42 79 F NC CC T3 N0 MX II Sim Reto
43 78 M C CC T3 N0 M1 IV Reto
44 56 M C CC T3 N0 MX II Sim Reto
45 73 F C CC T3 III Cólon esquerdo
46 53 F C CC
47 59 F C CC T3 II Cólon direito
48 89 M NC CC T2 N0 I Cólon esquerdo
49 92 F C CC T3 N1 MX III Cólon direito
51 83 M C CC T1 N0 MX I Reto
52 60 F C CT III Cólon esquerdo
82
53 79 M NC CC T3 N1 M1 IV Cólon direito
54 49 M C CC T3 M1 IV Cólon esquerdo
55 82 M C CC T2 N0 MX I Sim Reto
56 69 F NC CC T3 N1 III Cólon direito
57 61 M C CT III
58 45 F NC CT T1 N0 MX I Sim Reto
59 83 F C CC T3 N0 MX II Sim Reto
60 70 F C CC T3 N2 MX III Cólon esquerdo
61 78 M C CT III Cólon direito
63 54 M C CC III Cólon esquerdo
64 70 F NC CT T2 N0 MX I Sim Reto
65 64 F NC CC T3 N1 M1 IV Cólon esquerdo
68 61 M NC CC T3 N2 MX III Sim Reto
70 61 F C CC T3 N2 MX III Reto
72 75 M C CC T2 N0 I Cólon esquerdo
76 60 M C CC T3 N1 MX III Sim Reto
77 70 M C CC T2 N0 MX I Reto
79 82 M C CC T3 N0 MX II Reto
80 77 M C CT III Cólon esquerdo
82 67 M NC CC T3 N1 III Cólon esquerdo
83 47 M C CC N1 III Cólon esquerdo
85 64 F C CC T2 N1 MX III Reto
89 83 M C CC Cólon esquerdo
90 68 M C CC T2 N0 MX I Sim Reto
91 83 F NC CC T3 N0 II Cólon esquerdo
92 85 M C CT III Cólon esquerdo
93 68 M C CT T2 N0 MX I Sim Reto
94 48 M NC TT T0 N0 MX Sim Reto
96 76 M C CC T3 N1 III Cólon esquerdo
97 58 F NC CC T0 N0 MX Sim Reto
98 81 F C CC IV Cólon esquerdo
99 79 M C CT T4 N0 MX II Cólon esquerdo
100 76 M NC CC T2 N1 M0 III Cólon esquerdo
101 50 F NC CC T3 N0 MX II Sim Reto
102 52 M C CC T1 N1 M0 III
103 53 F C CC T3 N0 MX II Sim Reto
83
104 72 M NC CT T4 N1 M0 III Reto
105 51 F C CC T2 N1 M0 III Cólon direito
106 68 F C CC T0 N0 MX Cólon esquerdo
107 74 M C CC T3 N0 MX II Sim Reto
108 64 F C CC T1 N0 MX I Cólon direito
109 73 F C CC T2 N0 MX I
110 70 F C CC T3 N1 MX III Cólon esquerdo
111 84 F C CC T2 N0 MX I Cólon esquerdo
112 47 F C CT T3 N2 MX III Sim Reto
113 57 M C CT T0 NX MX Reto
114 57 M NC CC T0 N2 MX III Sim Reto
115 54 F C CC T3 N0 MX II Cólon esquerdo
116 75 M C CC T3 N0 MX II Sim Reto
117 97 F C CC
118 64 M C CT T1 N0 MX I Reto
119 52 M C CC T3 N0 MX II Cólon esquerdo
120 82 M C CT T3 N0 MX II Cólon esquerdo
121 42 M C CT T2 N0 MX I Sim Reto
122 50 F C CT T2 N0 M0 I Sim Reto
123 79 M NC CC T0 N0 M0 Sim Reto
125 47 F NC CC TIS N0 MX Reto
126 63 F NC CC T3 N0 MX II Reto
127 65 F C CC T3 N0 MX II Reto
128 71 F C CT T3 N0 MX II Cólon esquerdo
129 66 F C CT T3 N0 MX II Reto
130 46 M C CC T3 N2 MX III Cólon esquerdo
131 50 F C CC T1 N0 MX I Sim Reto
132 59 M C CC T2 N0 MX I Cólon esquerdo
133 67 F C CC T3 N0 MX II Cólon direito
134 65 F C CC T2 N2 MX III Cólon esquerdo
135 59 F C CC T3 N0 MX II Cólon esquerdo
136 58 M C CT T2 N0 MX I Cólon direito
137 83 M C CC T3 N0 II Sim Reto
138 58 M C CC Cólon esquerdo
139 53 F NC CC T3 N0 MX II Reto
140 62 F C CC T3 N1 MX III Sim Reto
84
141 59 F C CC T4 N0 MX II Cólon
142 40 M C CC T3 N0 MX II Cólon direito
143 69 M NC CT
144 46 M C CC T2 N0 MX I Sim Reto
145 50 F C CC T2 N0 I Cólon direito
146 73 M C CC Sim Reto
147 78 M C CT T0 N0 MX Sim Reto
148 65 F NC CC T3 NX MX II Reto
149 54 M C CC T0 N0 MX Sim Reto
150 67 M NC CC Cólon
151 62 F C CT T3 N1 M0 III Cólon esquerdo
152 57 F C CC T3 N0 MX II Cólon esquerdo
153 57 F C CC T1 N1 MX III Reto
154 70 M C CC Sim Reto
155 43 F C CC T2 N0 MX I Sim Reto
156 91 M C CC T3 N1 MX III Cólon direito
157 44 F C CC T1 N0 MX I Cólon esquerdo
158 58 F C CC T1 N1 MX III Reto
159 73 M C CC T3 N2 MX III Cólon esquerdo
160 80 M C CC Cólon esquerdo
161 66 M C CC
162 65 M C CC IV Sim Reto
163 77 F C CC II Cólon direito
164 52 F C CC T3 NX MX III Sim Reto
165 72 F C CC T3 N1 M0 III Cólon esquerdo
166 81 M C CT Cólon direito
167 55 M C CC T3 N0 MX II
168 81 M C CC Sim Reto
169 61 M C CC T3 N0 MX II Sim Reto
170 56 F C CC
171 86 F C CC T3 N1 MX III
172 74 M C CC T3 N0 MX II Sim Reto
173 63 F C CC T2 N0 I Sim Reto
174 76 M C CT Cólon esquerdo
175 54 F C CC T3 N0 II Cólon direito
176 49 F NC CC T3 N0 MX II Cólon
85
177 86 M C CT T3 N0 MX II Reto
178 58 F C CC T3 N0 MX II Sim Reto
179 73 M C CT
180 67 M C CC T3 N0 II Cólon esquerdo
181 76 M NC CT T3 N1 MX III Cólon esquerdo
182 76 F C CC T3 N2 M0 III Cólon direito
183 65 F C CT T2 N1 M0 III Reto
184 67 M C CT T2 N0 MX I Sim Reto
185 65 M C CC T3 N0 MX II Reto
186 56 M C CC T1 N1 M0 III Sim Reto
187 71 M C CC T3 Cólon esquerdo
188 73 F C CC T3 N2 MX III Cólon direito
189 60 F C CT T1 N0 MX I Cólon esquerdo
191 77 F C CT T3 N0 MX II Cólon esquerdo
192 45 F C CC T3 N0 MX II Sim Reto
193 43 F C CC T3 N2 III Cólon direito
194 68 M C CC T3 N1 MX III Cólon direito
195 66 M C CC T3 N0 II Cólon esquerdo
196 51 F NC CC T4 N0 MX II Cólon esquerdo
197 79 M C CC T3 N0 MX II Cólon esquerdo
198 60 F C CC T3 N1 MX III Cólon direito
199 82 M NC CC T2 NX MX I Sim Reto
200 55 F NC CC T3 N1 M0 III Sim Reto
201 69 M C CC T3 N0 MX II Reto
202 59 F C CC T3 NX MX II Reto
203 80 F C CC T3 N0 M0 II Cólon esquerdo
204 75 M C CC T3 N0 MX II Reto
205 64 F C CC T3 N1 M1 IV Cólon direito
206 49 F C CC T3 N0 MX II Cólon esquerdo
207 85 F C CC T3 N0 MX II Sim Reto
208 78 F C CC T3 N1 MX III Sim Reto
209 54 F NC CC T3 N2 MX III Cólon direito
210 64 M C CC T2 N1 MX III Reto
211 71 F NC CC T1 N0 MX I Sim Reto
212 79 F C CC T3 N0 MX II Reto
213 63 M C CC T2 N1 MX III Cólon esquerdo
86
214 58 M C CC T3 N2 M0 III Cólon
215 61 F C CC T4 N0 MX II Cólon esquerdo
216 52 F C CC T4 N0 MX II Sim Reto
217 44 F C CC T3 N1 MX III Sim Reto
218 69 M C CC T3 N0 MX II Cólon direito
219 50 F C CC T3 N0 MX II Cólon direito
220 51 M C CT T3 N1 MX III Cólon esquerdo
221 56 M C CC T1 N0 I Reto
222 80 M C CT Cólon direito
223 67 M C CT T2 N0 MX I Sim Reto
224 43 F C CC T2 No MX I Sim Reto
225 75 F C CT T3 N0 II Cólon esquerdo
226 56 M C CC
227 45 F C CC
230 71 M C CC T4 N1 MX III Reto
231 49 M C CC T2 N0 I Cólon esquerdo
233 76 F C CC T2 N0 MX I Reto
234 81 M C CC Sim Reto
235 60 F C CC Reto
236 60 F C CC Sim Reto
237 61 F C CC T0 N0 MX Sim Reto
238 39 M C CC T4 NX MX II Cólon direito
239 71 F C CC T3 N2 MX III Reto
240 32 F C CC T4 NX MX II Sim Reto
241 68 F C CC Sim Reto
242 71 F NC CC T3 N1 III Cólon direito
243 70 F C CC T2 N1 III Sim Reto
244 49 F NC CT III Cólon esquerdo
245 57 M C CT III Reto
247 61 M C CC T1 N1 III Sim Reto
249 77 F C CC T4 N1 MX III Cólon direito
251 83 F C CC T3 N1 III Cólon esquerdo
253 54 M C CC T1 N1 III Cólon direito
254 49 F NC CC T0 N0 Sim Reto
255 74 F NC CC T3 N1 III Cólon esquerdo
256 51 M C CC T3 N0 M0 II Cólon esquerdo
87
257 77 M C CC T3 N0 MX II Reto
258 56 M C CC T3 N0 II Reto
259 58 M C CT
261 64 M C CC T3 N0 II Sim Reto
262 63 M C CT T1 N0 MX I Reto
263 69 F C CC II Cólon direito
266 69 M C CT T2 NX MX I Sim Reto
267 66 F C CC T2 N0 I Cólon esquerdo
268 71 M C CC T3 N2 M1 IV Cólon direito
269 71 F C CC T3 N0 II Cólon esquerdo
270 70 M C CT T3 N1 III Cólon esquerdo
271 84 M C CC T2 N0 I Sim Reto
272 48 M C CC T0 N2 III Sim Reto
273 58 M C CC T2 N0 II Cólon direito
274 76 M C CC T3 N1 MX III Cólon esquerdo
275 60 F C CC T2 N0 II Sim Reto
276 86 F C CT T4 N1 MX III
277 63 F C CC Cólon esquerdo
278 69 F C CC T2 N0 MX I Sim Reto
279 32 F NC CC T3 N2 MX III Sim Reto
280 69 M C CC T2 N0 II Cólon esquerdo
281 39 M C CT T2 N1 III Cólon direito
282 78 F C CC T0 N0 Sim Reto
283 37 M C CC T2 N0 II Cólon esquerdo
284 55 F C CT T1 N0 MX I Sim Reto
285 77 M C CC II
286 55 F C CT T3 N1 M0 III Sim Reto
288 66 M C CC T3 N0 MX II Reto
289 69 F C CC Reto
290 70 M C CT T2 N0 MX I Sim Reto
291 68 M C CC T3 N0 II Reto
292 56 M C CC T0 N0 Sim Reto
295 77 M NC TT T2 N0 M0 I Sim Reto
296 62 M C CC T4 N2 MX III Cólon esquerdo
298 58 M C CC T3 N2 M0 III Cólon esquerdo
299 61 M C CC T1 N0 MX I Sim Reto
88
301 71 F C CC T3 N2 MX III Cólon esquerdo
303 69 F C CC T2 N0 MX I Sim Reto
305 83 F C CC T2 N0 MX I Reto
306 59 M C CT Sim Reto
307 67 F C CT T3 N2 MX III Cólon esquerdo
308 63 M C CT Sim Reto
309 72 M C CC T3 N2 M1 IV Sim Reto
310 55 F C CC T3 N0 MX II Reto
311 66 F C CT T2 N0 M0 I Sim Reto
312 58 M C CC T2 N0 MX I Sim Reto
313 67 F C CC T3 N2 MX III Reto
315 68 M C CC Sim Reto
89
Anexo 5: Parecer do CEP
90
