Varijacije u broju kopija u genomu -...
Transcript of Varijacije u broju kopija u genomu -...
Koje su razlike između individua ?
Koje su razlike između vrsta ?
Projekat “Genom čoveka” –
Genomika – Komparativna
genomika
Komparativna genomika
• 3. mart 2016. godine
• Kompletno sekvencirano 8.017 genoma
• U toku sekvenciranje preko 35.000 genoma
• http://www.genomesonline.org/
The Encyclopedia of DNA
Elements (ENCODE)
• Cilj projekta – registrovati sve funkcionalne elemente
genoma čoveka:
• Segmenti genoma koji kodiraju za definisani produkt (RNK
i/ili protein)
• Elementi genoma koji pokazuju “reproducible biochemical
signature" (sekvence za vezivanje proteina ili sekvence
odgovorne za specifične strukture hromatina)
The Encyclopedia of DNA
Elements (ENCODE)
• 399,124 regiona koji po svojim karakteristikama
odgovaraju pojačivačima i 70,292 regiona koji po svojim
karakterisitkama odgovaraju promotorima
• Procena da se dve trećine genoma čoveka prepisuje
Genom čoveka
• 3.164,7 miliona nukleotida
• 3 miliona SNP-ova - 2001
• 38 miliona SPN-ova - 2012
• 1-2 % kodira proteine
• 100.000 - 30.000 gena 1991-2001
• Oko 20.000 protein kodirajućih
gena – 2012.
• 1000 gena za RNK – 2001
• 8,801 malih RNK i
9,640 lncRNK – 2012
• 1.947 pseudogena – 2001
• 11,224 pseudogena – 2012
Razlike u genomima ljudi
• Prvi eksperimentalni dokazi o postojanju značajnih
razlika u genomima zdravih individua dobijeni su
zahvaljujući razvoju novih tehnika
• Komparativna genomska hibridizacija
bazirana na genskom čipu (aCGH)
• Iafrate et al, 2004
• Sebat et al., 2004
Komparativna genomska
hibridizacija
• Metoda se bazira na kvantitativnom dvobojnom FISH-u
• Simultana hibridizacija dve različito obeležene genomske probe sa normalnim metafaznim hromozomima.
• Genomske probe – kontrolna DNK i DNK tumorskog tkiva
Genski čip
• Na osnovu količine probe koja hibridizuje za svaku tačku
(“spot”) na array-u dobija se informacija o specifičnom
sastavu nk u ispitivanom uzorku.
Representational Oligonucleotide
Microarray Analysis
• Konstruisana 2003. godine
• Michael H. Wigler i Rob Lucito
• Cold Spring Harbor Laboratory
aCGH
• Metodološke kritike
- Šta je referentni genom
- Kako je “istačkan” genski čip
- Analiza dobijenih rezultata
- Tehnika se definiše kao “prljava”
Provera rezultata
• FISH
• qPCR
• MLPA
Metoda multipleks
amplifikacije
ligiranih proba
• Sekvenciranje
Multipleks amplifikacija ligiranih
proba - MLPA • Jedan oligonukleotid svake
MLPA probe na 3’ kraju sadrži
sekvencu komplementarnu
specifičnoj ciljnoj sekvenci,
dok na 5’ kraju sadrži
sekvencu koja je zajednička
za sve MLPA probe i identična
je fluorescentno obeleženom
PCR prajmeru.
Multipleks amplifikacija ligiranih
proba - MLPA • Drugi oligonukleotid svake MLPA
probe na 5’ kraju poseduje sekvencu
komplementarnu specifičnoj ciljnoj
sekvenci, na 3’ kraju sadrži sekvencu
zajedničku za sve MLPA probe dužine
koja je komplementarna
neobeleženom prajmeru.
• Između ova dva kraja nalazi se insert
ili “stuffer” sekvenca različite dužine.
Multipleks amplifikacija ligiranih
proba - MLPA • Ligacijom oligonukleotida MLPA probe formiraju se
uspešno ligirane probe koje imaju identične sekvence na
5’ i 3’ krajevima.
• Zahvaljujući ovoj njihovoj osobini omogućena je
istovremena amplifikacija i do 50 različitih MLPA proba
korišćenjem samo jednog para prajmera.
Multipleks amplifikacija ligiranih
proba - MLPA • Kao rezultat procesa amplifikacije ligiranih MLPA proba,
nastaju PCR produkti jedinstvene dužine, odnosno
kombinacija jedinstvenih, PCR-om umnoženih
fragmenata čiji je opseg dužina od nekoliko desetina do
nekoliko stotina nt.
Multipleks amplifikacija ligiranih
proba - MLPA • Umnoženi fragmenti se analiziraju fragment analizom,
metodom za razdvajanje fragmenata molekula DNK na
osnovu njihovih dužina sa senzitivnošću od 1bp.
Metodologija istraživanja CNV
• aCGH
• Nove tehnike sekvenciranja
• Danas najmanje 12 platformi za
detekciju CNV
Godina Naučnici Otkrića
2003. Wigler i Lucito Otkriće tehnike ROMA (genski čip reprezentativnih oligonukleotida)
2004. Iafrate i saradnici 255 duplikacija i delecija između genoma 55 nesrodnih individua
2004. Sebat i saradnici 221 razlika između genoma 20 nesrodnih individua
2005. Tuzin i saradnici 241 razlika i 56 inverzija između genoma datog od strane internacionalnog
konzorcijuma „Genom čoveka“ (HGP) i genoma anonimnog muškarca
2005. Conrad i saradnici Upoređivanjem dva genoma identifikovali 586 delecionih varijanti veličine od 300bp do
1,2Mb, pri čemu su 92 gena bilo kompletno deletirana dok su 109 gena bila delimično
deletirana
2006. Hinds i saradnici Identifikovali 215 potencijalnih delecionih varijanti veličine od 70bp do 10kb kod 24
nesrodnih individua
2006. Redon i saradnici Identifikovali 1,447 CNVs koje zauzimaju veličinu od 360Mb (12% genoma) i sadrže
hiljade gena (3000), lokuse povezane sa bolestima čoveka, funkcionalne elemente i
segmetne duplikacije tokom analize genoma 270 individua iz 4 evropske populacije
2007. Lipson i saradnici Optimizacija metode aCGH i unapređenje matematičkog algoritma za analizu dobijenih
rezultata
Varijacije u broju kopija
• Redon R i sard., 2006.
• Identifikovali 1,447 CNVs koje zauzimaju veličinu od 360 Mb
(12% genoma) i sadrže hiljade gena (3000), lokuse povezane
sa bolestima čoveka, funkcionalne elemente i segmetne
duplikacije tokom analize genoma 270 individua iz 4 evropske
populacije
Varijacije u broju kopija (eng. Copy number variations, CNVs)
• Termin CNV objedinjuje i pojmove:
• LSV – large–scale CNV (Iafrate et al.,2004)
• CNP – copy number polymorphism (Sebat et
al, 2004)
• ISV – intermediate – sized variants (Tuzun et
al., 2005)
Polimorfizmi DNK lokusa
• Razlike u sekvenci DNK koje postoje u određenom DNK
lokusu između individua jedne vrste označene su kao
polimorfizmi DNK
• Postoje dva tipa DNK polimorfizama:
1. Polimorfizmi nukleotidne sekvence, koji su vezani za
- varijabilnost tipa bazne zamene (tačkasti polimorfizmi)
- za inserciju ili deleciju određenog niza nukleotida
(inserciono-delecioni prolimorfizmi)
2. Polimorfizmi dužina sekvence, koji su vezani za različiti
broj ponovaka u mini- i mikrosatelitskim lokusima
Varijacije u broju kopija - CNVs
• Termin polimorfizam zamenjen
terminom varijanta jer se
polimorfizam definiše kao genetička
varijanta koja se u populaciji javlja
frekvencom ≥ 1%.
Varijacije u broju kopija - CNVs
• Varijacije u broju kopija su segmenti molekula DNK veličine od 50bp do 1Mb ili veći koji se u jednom genomu pojavljuje u različitom broju kopija u odnosu na referentni genom.
• Po svojoj prirodi, CNV mogu biti
• duplikacije,
• delecije,
• insercije,ili
• kompleksniji genetički rearanžmani koji obuhvataju veći broj hromozoma (kompleksne CNV).
• CNV su kvantitativne strukturne varijante genoma.
• Pored kvantitativnih, razlikuju se i pozicione strukturne varijante (translokacije) i orijentacione strukturne varijante (inverzije).
• CNV treba razlikovati od mikro-delecija, mikro-duplikacija i inverzija hromozoma koje su vidljive tehnikom bojenja traka i koje se, kao takve, ubrajaju u hromozomske aberacije.
• CNV po tipu duplikacija treba razlikovati od mikrosatelita i minisatelita kao i triplikate od trinukleotidnih ponovaka.
Duplikacije
• Tandemske duplikacije podrazumevaju duplikacije
određenog segmenta molekula DNK koji se u svim
analiziranim genomima dupliciraju na isti način.
• Multialelske duplikacije podrazumevaju duplikacije čiji
se broj dupliciranih segmenata molekula DNK razlikuje
između analiziranih genoma.
Delecije i kompleksne CNV
• Delecije
• Kompleksna CNV podrazumeva segment molekula
DNK koji u jednom genomu može biti dupliciran a u
drugom deletiran
Triplikati
• Po svojoj strukturi razlikuju se dva tipa triplikata.
• Triplikati tipa I su segmenti molekula DNK koji predstavljaju tandemski ponovljene triplikate.
• Triplikati tipa II su triplikati koji su međusobno invertni i razdvojeni segmentima molekula DNK koji su duplicirani.
• 179,450 CNVs u genomu čoveka (avg 2012)
• Do sada identifikovano najmanje 100 gena meta
komoletnih delecija
Varijacije u broju kopija češće
pogađaju tri kategorije gena:
1) Signalni putevi imunskog sistema i međućelijske komunikacije
2) Interakcija sa spoljašnom sredinom (imunski odgovor i čulo
mirisa)
3) Retrovirusi i protein kodirajući geni povezani sa mehanizmima
transpozicije.
CNV u drugim vrstama
• Primati, psi, miševi, konji, krave,
kokoške, kukuruz, Arabidopsis
thaliana, Vinska mušica, Pivski
kvasac, C. Elegans....
• Perry i sar., 2006. godine
• 331 CNVs kod 20 šimpanza od
toga 74 CNVs detektovane u istim
regionima kao i kod čoveka
Distribucija CNV kod
šimpnze i čoveka u prilog
hipotezi o dupliciranju
gena kao mehanizmu
povećanja genoma tokom
evolucije
Molekularni mehanizmi nastanka CNV
• Nealelska homologna rekombinacije
• Prostim spajanjem krajeva kao mehanizam reparacije
dvolančanih prekida
• Reparacija prekida u molekulu DNK mehanizmom FoSTeS
• Tokom transpozicije L1 elemenata
Nealelska homologna
rekombinacija
• Duplikacije i delecije mogu biti posledica kako
interhromozomskog, tako i intrahromozomskog
krosingovera.
Nealelska homologna
rekombinacija
• Rezultat nealelske
homologne rekombinacije
koja se odvija u okviru
iste hromatide može biti
delecija određenog
segmenta molekula DNK.
Nealelska homologna
rekombinacija
• Kao posledica odvijanja
nealelske homologne
rekombinacije između
sestrinskih hromatida
formira se izohromozom
koji sadrži segment
molekula DNK koji je
invertovan.
Prosto spajanje
krajeva kao
mehanizam
reparacije
dvolančanih prekida
• Dvolančani prekidi u
molekulu DNK čoveka
najčešće se repariraju
nehomologim
spajanjem krajeva.
• Ovaj mehanizam može
biti uzrok delecije
određenog segmenta
molekula DNK.
Mehanizam FoSTeS
• Kompleksne CNV verovatno
nastaju kao posledica
reparacije jednolančanih
prekida u molekulu DNK
tokom procesa replikacije
mehanizmom koji je poznat po
svojoj skraćenici FoSTeS
(eng. fork stalling and template
switching).
• Mehanizam FoSTeS aktivira se zaustavljanjem replikacione viljuške na mestu jednolančanog prekida u molekulu DNK koji se replikuje.
• Razdvajanje zaostajućeg lanca od lanca koji je služio za njegovu sintezu.
• Zaostajući lanac, na osnovu mikrohomologije nastavlja replikaciju korišćenjem druge replikacione viljuške koja se nalazi u blizini.
• U zavisnosti da li se nova replikaciona viljuška nalazi uzvodno ili nizvodno od mesta jednolančanog prekida, nastavak replikacije dovodi do delecije ili duplikacije određenog segmenta molekula DNK.
• Duplicirani segmenti mogu biti direktno ponovljeni ili invertovani.
Tokom transpozicije L1 elemenata
• Tokom transpozicije
moguće je “nastanak”
CNV po tipu duplikacije
• Ove CNV nazivaju se i
retro CNV.
CNV i bolesti ljudi
• Dosadašnja istraživanja pokazala su snažnu asocijaciju
pojedinih CNV koje obuhvataju protein kodirajuće gene
sa razvojem psihijatrijskih bolesti (uključujući i autizam),
gojaznosti, psorijaze (autoimunska bolest kože), šećerne
bolesti, zapaljenskih bolesti creva, itd.
CNV i bolesti ljudi
• Poslednjih godina istražuje se moguća uloga CNV u
procesima neoplastične transformacije koji su
odogovorni za razvoj karicinoma debelog creva, pluća i
prostate.
Oboljenja broja kopija
(eng. copy-number disorder) • Za neke bolesti čoveka molekularno-biološkim
analizama pokazano je da su jedini do sada utvrđeni
genetički uzročnici razvoja bolesti CNV.
• Određene kongentalne bolesti srca ili bubrega su neke
od njih.
CNV i bolesti ljudi
• Protektivna uloga tokom infekcije HIV-om ili malarije
• Milanese M. i sarad., 2009
• Ispitivanje infekcije HIV
• Upoređivanje CNVs u 13 gena kod HIV+ i HIV- dece u
populaciji Brazila
• Gen DEFB104
• Pozitivna korelacija između
broja kopija ovog gena i
rezistentnosti na infekciju HIV
CNV i bolesti ljudi
• Personalna medicina
• Farmakogenomika
• Uloga CNV u individualnim odgovorima
na primenjenu terapiju u lečenju brojnih
bolesti čoveka