Variazioni epigenetiche Imprinting; Inattivazione cromosoma X (lyonizzazione); Effetto posizione....
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Variazioni epigenetiche
•Imprinting;
•Inattivazione cromosoma X (lyonizzazione);
•Effetto posizione.
•Inattivazione centromerica (eterocromatina);
Modifiche ereditabili, che può riguardare un cromosoma o l’attività di un gene, che non varia la sequenza nucleotidica.
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• L’imprinting genomico consiste nella espressione allelica differenziale e parentale-specifica.
Cromosoma materno
gene ”X” trascrizionalmente attivo
Cromosoma paterno
gene”X” trascrizionalmente inattivo
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Caratteristiche principali della seq. di DNA dei geni “imprinted”:
• % elevata di CpG islands (bersaglio della metilazione);
• Sequenze ripetute vicino alle CpG islands;
• Legame parentale-specifico di particolari complessi proteici responsabili delle modifiche epigenetiche;
• ImprintingControlRegions in alcuni clusters di geni “imprinted”.
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Altre caratteristiche epigenetiche delle regioni “imprinted”:
• Differenze nella frequenza della ricombinazione meiotica vicino o internamente ai clusters “imprinted”;
• Asincronia nella fase S del ciclo cellulare;
Non si conosce ancora la relazione tra queste caratteristiche ed il grado di metilazione o la
struttura della cromatina.
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Metilazione differenziale degli alleli parentali (DMRs)
• La metilazione influisce sul grado di espressione genica in modo variabile: la metilazione può riguardare la copia inattiva o attiva del gene (es. gene Igf2).
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CpG
CpG
Metilazione
Allele 1 (espresso)
Allele 2
(a) Promoter methylation
MDBs?
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CpG Igf2r
CpG Igf2r
CpG Air
CpG Air
Allele materno (espresso)
Allele paterno
(b) Antisense transcripts
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(c): Silencing factors
CpG of Igf2
CpG of Igf2
Allele paterno (espresso)
Allele materno
Repressore
Metilazione
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Fattori coinvolti
•DNA cytosine methyltransferases (Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b);
•Methyl-CpG-binding proteins (MECP2);
•Histone-modification enzymes (H3-K4 methyltransferases, H3-K9 methyltransferases),
•Histone acetyltransferase enzymes (GCN5/PCAF);
•ATP-dependent remodelling complexes (ISWI);
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Alcuni geni sottoposti ad imprinting•Chr1 (p73);
•Chr5 (U2AFBPL);
•Chr6 (MAS1; M6P/IGF2R..);
•Chr7 (GAMMA2-COP..);
•Chr11 (H19;IGF2;INS..);
•Chr13 (HTR2A);
•Chr14 (MEG3/GTL2);
•Chr15 (GABRA5;GABRB3;NDN;PAR1;PAR5;SNRPN;UBE3A)
•Chr18 (IMPACT);
•Chr19 (PEG3);
•Chr20 (GNAS1;NEURONATIN)
•ChrX (XIST).
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Imprinting genomico
•Cos’è l’imprinting?
•Meccanismi molecolari responsabili dell’imprinting;
•Regione 15q11-13 e sindromi di PraderWilli-Angelman;
•Modifiche epigenetiche nella regione critica 15q11-q13.
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•Geni espressi paternamente: SNRPN locus
(snoRNA cluster), necdina, PAR1, PAR5, PAR7;
•Geni espressi maternamente: UBE3A;
Imprinting nella regione 15q11-q13
(K.O. e studio di mutazioni)
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SNRPN UBE3A
•Maturazione mRNA;•10 esoni;•SNRPN locus > 460kb;•Espressione monoallelica nel cuore (feto) e nel cervello (feto e adulto).
•Ubiquitina transferasi;•10 esoni;•Locus > 60kb;•Espressione monoallelica (cervello).
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Prader-Willi (PWS)/Angelman syndrome (AS)
Cromosoma 15q11-q13 (mouse 7C-D1);
PWS (MIM 176270) AS (MIM 105830)
• Ritardo mentale;• Obesità;• Ipotonia muscolare;• Ridotta attività fetale;• Bassa statura;• Ipogonadismo
• Ritardo mentale;• Ritardo motorio;• Atassia;• Epilessia;• “Absence of speech”;• Facies tipica
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UBE3A SNRPN
Modifiche epigenetiche
tel cen
UBE3A SNRPNtel cen
Angelman syndrome
Prader-Willi syndrome
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ICR (Impriniting Control Region) nella PWS/AS
•AS-SRO (0,88Kb), 35Kb upstream SNRPN promoter
Fig.1a pubblicazione di Perk
•PWS-SRO (4,3Kb), SNRPN promoter/exon1
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AS-SRO e PWS-SRO costituiscono un “imprinting box” che regola l’intero dominio 15q11-q13 su entrambi i
cromosomi
Modifiche epigenetiche allele-specifiche
AS-SRO sul chr paterno
PWS-SRO sul chr materno
UBE3A non espresso SNRPN non espresso
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Caratteristiche epigenetiche della AS-SRO.Livelli di metilazione allelica
A differenza di quanto atteso, i livelli di metilazione della AS-SRO è simile in entrambi gli alleli
ER+ Southern blot
ASAS
Met
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Osservazioni:
•Forse il livello di metilazione della AS-SRO non costituisce un meccanismo chiave nell’imprinting;
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Accessibilità maggiore nel locus materno.
Caratteristiche della cromatina AS-SRO:accessibilità alla Dnasi I.
Dnasi I
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Metilazione H3(K4) e
acetilazione H3 e H4 maggiori a livello materno
Caratteristiche epigenetiche differenziali.
ChIP assay
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•Struttura cromatinica più accessibile sul cromosoma materno;
Caratteristiche epigenetiche della AS-SRO
•Metilazione materna H3 (K4)
•Acetilazione materna H3 e H4
Espressione genica allele-specifica
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SNURF-SNRPN gene locus
PWS-SRO (4,3Kb), SNRPN promoter/exon1
•ChIP assay
(Ab anti-acetylated H3 e H4 histone)
•PCR
Acetilazione istonica (espressione genica)
Prodotto di PCR
Cromosoma paterno
Deacetilazione istonica
Prodotto di PCR
Cromosoma materno
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ChIP assay
L’acetilazione istonica H3/H4 è limitata alla regione 5’ del locus SNURF-SNRPN
CpG island
SNRPN
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Copia attiva del gene
Relazione tra acetilazione istonica e metilazione della CpG island del locus SNURF-SNRPN
•Acetilazione istonica
•Metilazione
•Acetilazione istonica
•Metilazione
Copia inattiva del gene (“imprinted”)
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•ChIP assay Ab anti-acetylated H3 e H4 histone
•M-PCR: amplificazione del DNA non metilato
Relazione tra acetilazione istonica e metilazione della CpG island del locus SNURF-SNURP
Prodotto di M-PCR
Cromosoma paterno
Deacetilazione istonica
No prodotto di M-PCR
Cromosoma materno
Acetilazione istonica
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Relazione tra acetilazione istonica e metilazione della CpG island del locus SNURF-SNURP
La copia attiva del gene (paterna) è caratterizzata da
acetilazione istonica e metilazione
ChIP assay e M-PCR
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Conclusioni
AS-SRO (copia materna,
trascrizionalmente attiva)
•Suscettibilità alla DNAsi I;•Acetilazione istonica H3-H4;•Metilazione istonica H3(K4);
PWS-SRO (copia paterna,
trascrizionalmente attiva)
•Suscettibilità alla DNAsi I;•Acetilazione istonica H3-H4;•Metilazione istonica H3(K4);•Metilazione CpG island.
Modifiche epigenetiche che garantiscono l’espressione allelica
differenziale
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Esiste un’influenza della AS-SRO PWS-SRO?
La delezione della AS-SRO, esclusivamente a livello materno, è in grado di influenzare lo stato di
metilazione della PWS-SRO;
ER+Southern blotMet
PWSAS
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Caratteristiche strutturali della cromatina nella PWS-SRO:
La delezione materna della AS-SRO rende la
PWS-SRO materna accessibile alla Dnasi I
Dnase I assay + Southern blot
AS
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Modifiche epigenetiche differenziali della PWS-SRO:
La delezione materna della AS-SRO influisce considerevolmente sullla metilazione istonica del locus PWS-SRO, mentre è ininfluente sull’acetilazione istonica.
ChIP assay
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La presenza della AS-SRO sul cromosoma materno interviene nei meccanismi di imprinting che agiscono sulla PWS-SRO.
Influenza della AS-SRO sulla PWS-SRO
Influenza della PWS-SRO sulla AS-SRO
L’assenza della PWS-SRO, sia materna che paterna, non influisce:
•Sul tasso di metilazione della AS-SRO;•Sulla suscettibilità della AS-SRO alla DNasiI;•Sul tasso di acetilazione istonica a livello della AS-SRO.
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Dnasi I assay
Influenza della PWS-SRO sulla AS-SRO
ER+Southern blot
ChIP assay
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Conclusioni
•La AS-SRO materna ha un ruolo importante nel determinare una struttura cromatinica “chiusa” della PWS-SRO materna (DNasiI/ChIP).•L’attività della AS-SRO sulla PWS-SRO non è l’unico meccanismo in grado di sostenere l’imprinting della PWS-SRO (acetilazione istonica).
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La AS-SRO probabilmente acquisisce un’espressione differenziale prima della PWS-SRO
Conclusioni
Gli oociti subiscono metilazione differenziale
durante la loro maturazione
Entrambi i tipi di gameti non presentano
metilazione della PWS-SRO