Validering en aanpassing vragenlijsten Cliënten over Kwaliteit.
VALIDERING AF DYRKNINGSMETODER I KLINISK … · validering af dyrkningsmetoder i klinisk...
Transcript of VALIDERING AF DYRKNINGSMETODER I KLINISK … · validering af dyrkningsmetoder i klinisk...
VALIDERING AF DYRKNINGSMETODER I KLINISK MIKROBIOLOGI
David Fuglsang-Damgaard
Specialeansvarlig overlæge (og teknisk assessor DANAK)
Klinisk Mikrobiologisk Afdeling
Aalborg Universitetshospital
VALIDERING AF DYRKNINGSMETODER I KL INISK MIKROBIOLOGI
HVAD ER STATUS I DK FOR VALIDERING AF DYRKNINGSBASEREDE METODER
KOMPLEKSITETEN I METODERNE
MANGEL PÅ GULDSTANDARD
BIOLOGISKE FÆNOMENER OG BIOLOGISK DRIFT
PRAKTISKE EKSEMPLER PÅ VALIDERING OG UDFORDRINGER
VALIDERING – ANVENDT SYNTAKS I FOREDRAGET
Validering af analyser/test udføres ved;
a) Metoder der ikke er standardmetoder
b) b) Metoder, der er udviklet/udformet af laboratoriet
c) Standardmetoder der anvendes uden for deres tilsigtede anvendelseområde
d) Validerede metoder der efterfølgende er ændret
Bør omfatte;
Målekorrekthed, målenøjagtighed, præcision, måleusikkerhed, detektionsgrænse (kvantitative mål)
Repertérbarhed, intermediær præcision, sensitivitet, specificitet (kvalitative mål)
Interfererende substanser, prøvematerialet(standardiseret vs. non standardiseret)
Dokumentere den anvendte metode og resultaterne
FORSKELLEN MELLEM DE VIDENSKABELIGE DISCIPLINER
Efter Auguste Comte (1798-1857)
”Hierarchy of the Sciences”
Billede omfattet af copyright
Link: https://xkcd.com/435/
ISO AKKREDITERING I KL INISK MIKROBIOLOGI I DANMARK
STATENS SERUM INSTITUT
(ISO17125)
KMA OUH
(ISO15189)
KMA SLAGELSE
(ISO15189)
KMA
AALBORG
(ISO15189)
19
97
19
98
19
99
20
00
20
01
20
02
20
03
20
04
20
05
20
06
20
07
20
08
20
09
20
10
20
11
20
12
20
13
20
14
20
15
20
16
20
17
20
18
http://portal.danak.dk/
3 DYRKNINGSBASEREDE METODER AKKREDITERET EFTER ISO15189LUFTVEJSPATOGENE DYRKNING (KMA OUH)
URINPATOGENE DYRKNING (KMA SLAGELSE)
TARMPATOGENE BAKTERIER (DYRKNING) (KMA AALBORG)
MET ODER I KL INISK MIKROBIOLOGI - STATUS
ESTIMERET ANDEL I DK KVALITETSKONTROL DÆKNING
IN-HOUSE
KOMMERCIEL
/STANDARD
METODE
EKSTERN
KONTROL
INTERN
KONTROL
MIKROSKOPI 20-40% 60-80% MIDDEL/DÅRLIG DÅRLIG/INGEN
DYRKNING >90% <10% DÅRLIG DÅRLIG/INGEN
KOMPLEKSITETEN I MET ODERNE - BLODDYRKNING
Tra
nsp
ort
Op
bevari
ng Inkubering Mikroskopi Aflæsning Identifikation Resistens
Bactec®
PlademedierVarmeskabe
Gram-farvningApi®
MALDI-TOF-MSHurtig ID
DensiCheck
E-test®Tablet diffusion
IT/S
var
KOMPLEKSITETEN I MET ODERNE - URINDYRKNING
Anvendt apparatur:
WASP udsåningsrobot
CO2 inkubator (primær dyrkning)
Almindelig inkubator (resistensbestemmelse)
Densicheck (resistensbestemmelse)
MALDI-TOF-MS apparatur (identifikation)
Anvendte reagenser/forbrugsvarer:
3 plademedier
14 resistenstabletter
”Anvendte” bioanalytikere og evt. læger:
Op til 4 afhængigt af kompleksitet og tilfældighed
I alt mindst 5 apparaturer, mindst 17 komponenter og op til 4 personer for ét fund i en urindyrkning!
KOMPLEKSITETEN I MET ODERNE - KENDTE VS. UKENDTE UDFALD
Tarmpatogene bakterier (Dyrkning) Blod (Dyrkning)
Defineret liste over mikroorganismer: Ikke endelig liste over mikroorganismer
Campylobacter coli/jejuni ?
Salmonella species
Vibrio cholerae
Shigella species
Yersinia enterocolitica
Historisk <20 kombinationer af svar Historisk >>200 kombinationer af svar
KOMPLEKSITETEN I MET ODERNE – VALG AF MET ODE
Præanalyse
Prøveremedier (diverse fabrikater)
Analyse
Plademedier (5% blod, 10% blod, chokoladeplade, kromogene, selektive plader, m.fl.)
Inkubation (atmosfærisk luft, CO2, mikroaerofilt, anaerobt)
Temperatur (stuetemperatur, 35°C, 37°C, 42°C)
Tid (1, 2, 4, 6, 10, 14, 21 dage)
Identifikation (MALDI-TOF-MS, API®, diverse hurtig test,
Resistensbestemmelse (discdiffusion, gradient MIC, mikrotiter MIC, automatiseret MIC)
Postanalyse
Postanalytisk strukturering af svar (hvad betragtes som (potentielt) patogent og rapporteres)
MANGEL PÅ GULDSTANDARD FOR EN SYGDOMSENTITET
Hvordan defineres en patient som havende pneumokok pneumoni?
a) Klinisk pneumoni diagnose (klinisk)
b) Röngten thorax med lobær pneumoni (paraklinisk)
c) Luftvejsprøve med vækst af S. pneumoniae (paraklinisk)
d) Bakteriæmi med vækst af S. pneumoniae (paraklinisk)
e) Positiv pneumokok urin antigen test (PUT) (paraklinisk)
f) Luftvejsprøve med PCR positiv for S. pneumoniae (paraklinisk)
e) Alle øvrige årsager til pneumoni udelukket (paraklinisk)
En eller flere af ovenstående kan formentlig anvendes som sammensat Guldstandard, men det
er næppe praktisk gennemførbart for alle kombinationer af målorganismer.
MANGEL PÅ GULDSTANDARD – FORTOLKNING AF BETYDNING
5 danske KMA´er
10 simulerede urindyrkningsfund
(ikke dyrket)
21 påviste bakterier
= Konsensus rapportering 10af21
Azuz S et al. Infect Dis. 2017
VIGTIGHEDEN AF DEN KLINISKE KONTEKST
Staphylococcus epidermidis, vækst af
Podning, sår tolkning = hudflora, helt uden betydning!
Vævsprøve 1. tå (Diabetes Mellitus) tolkning = hudflora/potentielt patogen?
Kammeprøve (hofteprotese) 5af5 prøver tolkning = signifikant fund!
E. coli 10e5 CFU/ml
Urin, midtstråle (65 årig ♀ uden symptomer) tolkning =asymptomatisk bakteuri
Urin, midtstråle (65 årig ♀ med symptomer) tolkning =signifikant dyrkningsfund
ANVENDELSE AF KOMMENTARER/FORTOLKNING HYPPIG
Den samlede konklusion kan afhænge af flere (og forskellige) serielle prøver !
MANGEL PÅ GULDSTANDARD –HVILKEN MET ODE ER T ÆTTEST PÅ SANDHEDEN ?
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
16s Dyrkning
Ob
se
rvere
t fo
rde
lin
g %
(D
NA
ell
er d
yrk
et m
æn
gd
e)
Pasteurella canis
Bacillus cereus
Rhizobium radiobacter
Acinetobacter species
Prevotella species
Streptococcus agalactiae
Staphulococcus aureus
FP 16s PCR
FN dyrkning
FN 16s PCR
BIOLOGISK DRIFT - ”HOW T O HIT A MOVING TARGET”
Fysik og Kemi Biologi
Billede omfattet af copyright
Link: https://blog.forecast.it/the-
difference-between-accuracy-
and-precision
BIOLOGISK DRIFT - RESISTENSBESTEMMELSE
E. coli (meropenem resistent)
Fænotypisk carbapenemase test: KPC positiv
Immunkromatografisk test: Negativ
PCR (GenXpert): Negativ
Whole-genome-sequencing (WGS): IMI positiv
Brandt C et al. Sci Rep. 2017
Conclusion
“The bacterial domain of life is not uniform. Instead we see clumps of similar strains that share many characteristics,
and with an innate human urge to classify, we have defined these as species.” Hanage WP et al. BMC Biology. 2005
≈ En art er ikke en SI enhed
BIOLOGISK DRIFT – ART SBEGREBET OG IDENTIFIKATION
PRAKTISKE EKSEMPLER PÅ UDFORDRINGERPRÆANALYTISK USIKKERHED
Ofte større end den analytiske usikkerhed;
Mikroorganismen
Mikroorganismens fordeling
Hæmmende faktorer
Podepinden
Podningsproceduren
Transport
Temperatur
m.fl.
Gør det svært at argumentere for at analytiske usikkerheder bestemmes minutiøst i validering
PRAKTISKE EKSEMPLER PÅ UDFORDRINGERPRÆANALYTISK USIKKERHED
Ikke standardiseret prøvemateriale Opformering (P. aeruginosa) &
hæmning (N. gonorrhoeae) under transport
S.
au
reu
s
Podning
1
Podning
2
S.
pyo
ge
ne
s
Podning
1
Podning
2
+ + ++ ++
++ + + ++
+ + ++ ++
+++ ++ + +++
+ +++ ++ +
+ ++ 0v ++
0 v + ++ ++
+ + + +
+++ +++ +++ +
++ ++ +++ +++
Egne data
P. aeruginosa ørepodning (antal fund / antal prøver)
2011 (før E-swab) 3.kvartal 47/251 = 0,18 (95%CI: 0,14-0,24)2013 (efter E-swab) 3.kvartal 67/274 = 0,24 (95%CI: 0,19-0,29)
10af20 med overensstemmedekvantitering
8af 20 med varierende kvantitering (minor error)2af20 med varierende konklusion (major error)
+ = få kolonier++ = en del kolonier
+++ = mange kolonier
PRAKTISKE EKSEMPLER PÅ UDFORDRINGERKVALITATIV OBJEKTIV BEDØMMELSE
Antal fund rapporteret (urindyrkning) Kvantitering (urindyrkning)
1,4
1,5
1,7
1,6
1,4
1,5
1,4
0 mdr 6 mdr 12 mdr 18 mdr
AFLÆSNING
(MEAN)
KONSENSUS
AFLÆSNING
0
1
2
3
4
5
6
1 2 3 4 5
Lo
g(C
FU
/ml)
Log(CFU/ml)
Reference CFU/ml
Målt (aflæst) CFU/ml
Lineær (Målt (aflæst)
CFU/ml)
Egne data
Systematiske usikkerhed tiltaget over tid Systematiske usikkerhed i valideringsperioden
PRAKTISKE EKSEMPLER PÅ UDFORDRINGERUFORUDSETE BIOLOGISKE FÆNOMENER - HÆMNING
E. coli (isolat 1) E. coli (isolat 2)
PRAKTISKE EKSEMPLER PÅ UDFORDRINGER
Hvor mange forskellige bakterier er der i prøven?
Eschericia coli
Tolkning 1:
Mikrokolonier i CTX zone er
udspaltninger af samme klon der
udtrykker kromosomal ampC beta-
lactamase
Tolkning 2:
Mikrokolonierne i CTX zonen er en
unik bakterie der skal betragtes som
selvstændigt fund.
Ovenstående vil evt. kunne afklares
ved whole-genome-sequencing, men
dette er ikke realistisk i en klinisk
sammenhæng
PERSPEKTIV
Der er behov for validering af dyrkningsbaserede metoder
og…..
der er behov for mere standardisering af dyrkningsbaserede metoder i Danmark
men…..
der eksisterer ikke en manual for hvordan
og……
Klinisk Mikrobiologi ≠ Klinisk Biokemi ≠ øvrige laboratorie specialer