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Efecto de la suplementación con antioxidantes y el sistema de empaque sobre las características espermáticas del semen equino criopreservado y su relación con la criotolerancia espermática. Valentina Vélez Henao Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias Medellín, Colombia 2016
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Efecto de la suplementación con antioxidantes y el sistema de
empaque sobre las características espermáticas del semen equino
criopreservado y su relación con la criotolerancia espermática.
Valentina Vélez Henao
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias
Medellín, Colombia
2016
Efecto de la suplementación con antioxidantes y el sistema de empaque sobre las características espermáticas del semen equino criopreservado y su
relación con la criotolerancia espermática.
Valentina Vélez Henao
Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título
de:
Magister en Biotecnología
Director:
M.Sc. Andrés Pareja López
Codirector:
Ph.D. Delmis Omar Camargo Rodríguez
Línea de Investigación:
Universidad Nacional - Biotecnología Animal
Universidad CES – Biología
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias
Medellín, Colombia
2016
Evolucionar constituye una infidelidad, a los demás, al pasado, a las antiguas opiniones
de uno mismo. Cada día debería de tener al menos una infidelidad esencial, una traición
necesaria, se trataría de un acto optimista, esperanzador, garantizaría la fe en el futuro,
una afirmación de que las cosas pueden ser no solo diferentes, sino mejores.
Jonás Trueba
Todas las canciones hablan de mí (2010).
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada bajo el marco de la “Convocatoria para Proyectos de
Carácter Innovador en Investigación y Transferencia de Tecnología” del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural, presentado y ejecutado por la Universidad CES y la
Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín. Agradecimientos especiales al personal
de los laboratorios de biotecnología en salud de la Universidad CES, sede Sabaneta, al
Laboratorio de Procesamiento de Semen San Pablo de la Universidad Nacional de
Colombia, sede Rionegro, y al Laboratorio de Citometría de Flujo de la Sede de
Investigación Universitaria (SIU), quienes se encargaron de mantener las condiciones
técnicas y logísticas necesarias para que las instalaciones del laboratorio, equipos y
suministros se encontrarán siempre a nuestra disposición.
Agradezco el apoyo incondicional y permanente en este proceso de formación a mis
amigos y asesores; los profesores Andrés Pareja López y Omar Camargo Rodríguez
quienes acompañaron la generación y ejecución del presente trabajo con su asesoría y
dirección.
Contenido
Lista de abreviaturas y unidades .................................................................................. IX
Lista de tablas ................................................................................................................. 1
OBJETIVOS ..................................................................................................................... 3 Objetivo General ........................................................................................................... 3 Objetivos Específicos .................................................................................................... 3
1. Capítulo I. .................................................................................................................. 4 1.1 Resumen .............................................................................................................. 4 1.2 Abstract ................................................................................................................ 5 1.3 Introducción .......................................................................................................... 7 1.4 Marco teórico ........................................................................................................ 7 1.5 Metodología ........................................................................................................ 10
1.5.1 Animales ....................................................................................................... 16 1.5.2 Recolección de la muestra seminal ............................................................... 16 1.5.3 Protocolo de criopreservacion ....................................................................... 16 1.5.4 Protocolo de descongelación ......................................................................... 18 1.5.5 Evaluación de movilidad ................................................................................ 18 1.5.6 Funcionalidad de la membrana plasmática (TEST HIPO-OSMOTICO HOS) . 18 1.5.7 Reacción acrosómica .................................................................................... 19 1.5.8 Integridad de Ácido Desoxirribonucleico (ADN) ............................................ 19 1.5.9 Potencial de membrana mitocondrial ............................................................. 19 1.5.10 Viabilidad espermática .................................................................................. 20 1.5.11 Análisis estadístico ........................................................................................ 20
1.6 Resultados ......................................................................................................... 21 1.6.1 Evaluación de movilidad ................................................................................ 22 1.6.2 Funcionalidad de membrana plasmática (Test Hipo-Osmótico) ..................... 22 1.6.3 Reacción acrosómica .................................................................................... 22 1.6.4 Integridad de ácido desoxirribonucleico (ADN) ............................................. 22 1.6.5 Potencial de membrana mitocondrial ............................................................. 23 1.6.6 Viabilidad espermática .................................................................................. 23
1.7 Discusión ............................................................................................................ 25 1.8 Conclusiones y recomendaciones ...................................................................... 30
1.8.1 Conclusiones ................................................................................................. 30 1.8.2 Recomendaciones ......................................................................................... 31
Bibliografía .................................................................................................................... 33
Lista de abreviaturas y unidades
Abreviatura Término
ADN Ácido desoxirribunocleico ALH Amplitud lateral de la cabeza ARN Ácido ribonucleico AOX Antioxidante ATP BCF
Adenosín trifosfato Frecuencia de batido de la cola
CASA Computer Assisted Sperm Analyzer Conc Concentración DE Desviación estándar ERO Especie reactiva de oxígeno HOS Test hiposmótico IP Yoduro de propidio LIN Índice de linealidad PBS Buffer fosfato Q Quercetina Rep Reproductor Spm Espermatozoide Tp Tamaño de pajilla VAP Velocidad media VCL Velocidad curvilínea VSL Velocidad rectilínea Ve Vitamina E % Mov % espermatozoides móviles % Pro % espermatozoides progresivos
Unidades Término
g Gravedades g Gramo gl Grados de libertad M Molar mg Miligramo ml Mililitro mM Milimolar % Porcentaje °C Grados Celsius °C/min Celsius por minuto
Unidades Término µL Microlitro µm/seg. Micrómetros por segundo µm Micrómetro µM Micromolar MOsmol Miliosmolar
Lista de tablas
Tabla 1. Tratamientos suplementados ........................................................................... 17 Tabla 2. Variables sensibles al efecto del antioxidante .................................................. 22 Tabla 3. Variables que fueron sensibles a la interacción del antioxidante y sus niveles de
concentración. ................................................................................................................ 23 Tabla 4. Variables que fueron sensibles a la interacción del tamaño de la pajilla y el
antioxidante .................................................................................................................... 23 Tabla 5. Variables que fueron sensibles a la interacción del tamaño de la pajilla y el
antioxidante. ................................................................................................................... 24 Tabla 6. Porcentaje de actividad mitocondrial según concentraciones de Quercetina .... 24 Tabla 7. Comparaciones múltiples entre tratamientos y su respectivo control. ............... 25
OBJETIVOS
Objetivo General
Evaluar el efecto de la suplementación con antioxidantes y el sistema de empaque sobre
las características espermáticas generales del semen equino criopreservado y la respuesta
individual a la criotolerancia.
Objetivos Específicos
- Estudiar el efecto de los antioxidantes quercetina y vitamina E sobre las
características del semen equino sometido a criopreservación.
- Evaluar el efecto del sistema de empaque sobre los parámetros seminales de
semen equino criopreservado.
- Determinar si existe relación entre la suplementación con antioxidantes y el sistema
de empaque con la criotolerancia espermática.
4
1. Capítulo I.
EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN CON ANTIOXIDANTES Y EL SISTEMA DE
EMPAQUE SOBRE LAS CARACTERÍSTICAS ESPERMÁTICAS DEL SEMEN EQUINO
CRIOPRESERVADO Y SU RELACIÓN CON LA CRIOTOLERANCIA ESPERMÁTICA.
1.1 Resumen
Objetivo: Evaluar el efecto de la suplementación con antioxidantes y el sistema de
empaque sobre las características espermáticas del semen equino criopreservado y la
respuesta a la variabilidad individual a la criotolerancia. Materiales y métodos: El semen
colectado de 10 caballos con fertilidad comprobada, se obtuvo de diferentes criaderos del
departamento de Antioquia, fue criopreservado empleando dos sistemas de empaque
(pajilla 0.5 ml y pajilla 0.25 ml) y dos antioxidantes (Vitamina E y Quercetina), con niveles
de concentración 20µM, 200 µM, 2000 µM para Vitamina E y 2.5 µM, 25 µM, 250 µM para
Vitamina E. Post-descongelación se realizó la evaluación de los parámetros de calidad
seminal: evaluación de movilidad por medio del software CASA (Computer Assisted Sperm
Analyzer), funcionalidad de membrana plasmática según test hipo-osmótico HOS, los
parámetros de reacción acrosomal, actividad de membrana mitocondrial, integridad de ADN
y porcentaje de vitalidad fueron evaluados por medio de citometría de flujo. Para el análisis
estadístico fueron realizados análisis de varianza (ANOVA) con estructura factorial y
utilizando la prueba de Dunnett, se realizaron comparaciones múltiples de medias.
Resultados: El efecto del antioxidante fue representativo (P<0.05) para los parámetros de
movilidad VAP (µm/s), VSL (µm/s), VCL (µm/s), ALH (µm/s) y Linearidad (%). Las variables
que fueron sensibles a la interacción del antioxidante y sus niveles de concentración fueron
% de actividad mitocondrial y % de vitalidad (P<0.05). Particularmente para % de actividad
5
mitocondrial se observó un efecto altamente significativo del antioxidante Quercetina (P=
0.000306) en la concentración 2.5 µM. Adicionalmente, se evidenció el efecto del
tratamiento: tamaño de pajilla: 0.5 ml, antioxidante: Quercetina, concentración: 2.5 µM,
cuando fue comparado con su respectivo control para las variables: Velocidad rectilínea
(VSL), % Spm Progresivos, Amplitud lateral de la cabeza (ALH) (P<0.05). Conclusiones:
Si bien la suplementación con antioxidantes y el sistema de empaque mejoran algunos
parámetros espermáticos post-descongelación, no optimizan de manera contundente el
protocolo de congelación del semen equino, y no es posible establecer su relación directa
con la criotolerancia. El fenómeno de criotolerancia espermática parece estar determinado
por la respuesta individual de los reproductores a los procesos de superenfriamiento y
congelación.
Palabras clave: Criopreservación, Equinos, Semen, Antioxidantes, Sistema de empaque.
1.2 Abstract
Objective: This study evaluated the effects of antioxidant supplementation and packaging
system on stallion cryopreserved sperm characteristics and cryotolerance individual
variability. Materials and Methods: Ten ejaculate samples from fertile horses in different
farms from the Antioquia department (Colombia), were collected and assessed for semen
traits. Each sample was cryopreserved using two packaging systems (straw 0.5 ml and
straw 0.25 ml) and two different antioxidants (vitamin E and Quercetin) with concentration
levels of 20 µM , 200 µM, 2000 µM for Vitamin E and 2.5 µM, 25 µM, 250 µM for Vitamin E.
Post-thaw evaluation of semen quality parameters was performed: mobility were assessed
through CASA software (Computer Assisted Sperm Analyzer), plasma membrane
functionality were assessed according hypo-osmotic test HOS; acrosome reaction
parameters, mitochondrial membrane activity, DNA integrity and vitality percentage were
assessed by flow cytometry. For statistical analyzes and multiple means comparison,
variance analysis (ANOVA) with factorial structure and Dunnett's test were performed.
Results: The antioxidant effect was representative (P <0.05) for mobility parameters VAP
(µm/s), VSL (µm/s), VCL (µm/s), ALH (µm/s) and Linearity (%). Percentage of mitochondrial
activity and vitality percentage were sensitive to the interaction of the antioxidant and its
concentration levels (P <0.05). Highly significant effect of antioxidant Quercetin (P =
0.000306) on mitochondrial activity percentage was observed, particularly at 2.5 µM
concentration. Additionally, for this specific treatment: 0.5 ml straw size and antioxidant
6
Quercetin at 2.5 µM concentration, effect was observed when compared with its respective
control for variables: Velocity average path (VAP), Speed Progressive Velocity straight line
(VSL),% Mobile sperm,% Progressives sperm, Velocity curvilinear (VCL), lateral amplitude
of head (ALH) (P <0.05). Conclusions: Even though antioxidant supplementation and
packaging system, improve some post-thawing sperm parameters, they do not optimize
conclusively stallion semen freezing protocol, and it is not possible to establish a direct
relationship between them and cryotolerance. Supplementation with antioxidants and
different packaging systems did not decisively improve the process of equine semen
freezing. Sperm cryotolerance phenomenon seems to be determined by the stallion
individual response to the supercooling and freezing processes.
Keywords: Cryopreservation, Equine, Stallion, Semen, Antioxidants, Packing System.
7
1.3 Introducción
En Colombia actualmente, los esquemas reproductivos de los criaderos de equinos se
basan en los procedimientos de monta natural e inseminación artificial (AI) con semen
fresco o refrigerado. Su aplicación intensiva se debe a la facilidad del manejo en campo
debido a la optimización de tiempo y esfuerzo de trabajo, la explotación permanente de
reproductores con características genéticas favorables, el control sobre la calidad de las
características espermáticas, así como la reducción de la probabilidad de introducir
enfermedades durante el manejo reproductivo (1,2).
Según la Encuesta Nacional Agropecuaria ENA-2014, en Colombia, la actividad pecuaria
de equinos presenta una variación -2.1% con relación a años anteriores. En los años 2012,
2013, y 2014 se contabilizaba un inventario equino de 899.813, 839.182, 821.852 cabezas,
respectivamente. Estos inventarios han disminuido en comparación con especies mulares
y asnales los cuales registran un aumento del 11,1 % y 87,1%, respectivamente, entre los
años 2013 y 2014. (3)
El subsector productivo equino juega un papel importante en el país, tanto para su
crecimiento económico como para su desarrollo cultural toda vez que la mayoría de su
distribución geográfica y dinámica poblacional se asocia con la economía primaria
(agricultura) establecida, principalmente, en la región andina, en donde los equinos son
usados como herramienta de trabajo, indispensable para las regiones más apartadas y
topográficamente difíciles. Lo anteriormente expuesto justifica emprender esfuerzos
encaminados al mejoramiento de los procesos productivos y concretamente en los
reproductivos orientados al desarrollo y mantenimiento de las líneas reproductivas criollas.
Actualmente, en general, el manejo reproductivo se basa principalmente en la monta
natural y en una población menor pero creciente, se viene usando biotecnologías
reproductivas como la inseminación artificial (IA) con semen fresco, refrigerado y/o
criopreservado y la transferencia de embriones, todo ello con el objetivo de incrementar el
número de crías de ejemplares con características genéticas de alto valor comercial. (5)
Actualmente, entre el 30 y 45% de las inseminaciones alrededor del mundo se llevan a
cabo con semen refrigerado (colectado, procesado y refrigerado para ser usado en un las
24h siguientes) alcanzando tasas de preñez de entre 50 y 60%. Estos resultados de
fertilidad son similares a los obtenidos en la inseminación artificial con semen fresco
(colecta e inseminación en máximo 1h), el cual es utilizado por un 50 a 60% de los criadores
que inseminan y alcanza una tasa de preñez de entre 65 y 70% por ciclo reproductivo. Las
8
inseminaciones artificiales realizadas con semen congelado (criopreservado en nitrógeno
líquido y descongelado para inseminar) comprenden entre el 5 y 10 % de las
inseminaciones y alcanza una tasa de preñez entre el 40 y 50 % o menos, lo cual es un
poco más bajo en comparación al semen fresco y refrigerado (6). La inseminación con
semen congelado/descongelado se traduce en los criaderos en menores índices de
concepción y dada la mortalidad celular inherente al proceso mismo de criopreservación,
se traduce también en un menor número de dosis (comercializables) por eyaculado, de
manera que esta metodología aún no es lo suficientemente atractiva ni ampliamente
acogida por los criadores de équidos. Por esta razón, las inseminaciones con semen
congelado se limitan principalmente al comercio internacional, a la introducción de nuevo
material genético para inseminar yeguas puras en los criaderos, muchas veces importado
o en los casos de bancos genéticos creados para reproductores que aun siendo fértiles
perdieron la habilidad para montar o que siendo tan valosos se estimó necesario
criopreservar su germoplasma.
Pese a su relativa ineficiencia reproductiva, el semen equino criopreservado presenta
ventajas sustanciales sobre el semen fresco o refrigerado entre las cuales se destacan: su
facilidad para el transporte a largas distancias (entre países), su conservación viable
durante un tiempo prolongado, casi ilimitado (años), el mayor control sanitario, genético y/o
productivo que se puede aplicvar sobre los donantes; el autoabastecimiento de genética en
los criaderos supliendo la necesidad de disponer de reproductores vivos para preñar la
yeguada, la creación de bancos genéticos para razas en peligro de extinción o de individuos
sobresalientes, la propagación de líneas que se encuentren en circunstancias
desfavorables (brotes epidémicos) y además permite optimizar los procesos de
comercialización (importación y exportación) aumentando el tiempo de anaquel del semen
equino, lo que ha permitido crear nuevas unidades de negocio dentro de las explotaciones
equinas.
En la mayoría de protocolos de criopreservación de semen equino, es necesario separar el
plasma seminal del paquete celular, para lo cual el semen es sometido a centrifugaciones
seriadas, lo cual induce una generación desmedida de especies reactivas de oxigeno
(ERO); que terminan afectando la microarquitectura y fisiología espermática de múltiples
formas: daño en membranas celulares, ADN, enzimas, receptores y otras proteínas de
importancia estructural máxima relacionadas con el citoesqueleto (7), el axonema
9
(relacionados con la pérdida de movilidad)(8), o la fusión esperma-oocito, entre otros(9,10).
Se ha reportado además, que los espermatozoides equinos son particularmente
susceptibles al choque térmico y al enfriamiento, lo cual está directamente relacionado con
la naturaleza de sus membranas y la formación de cristales a nivel intracelular y extracelular
durante los procesos de congelación/descongelación (11). Adicionalmente, la misma
composición de los diluyentes usados durante el proceso de criopreservación, pueden
inducir un estrés osmótico y oxidativo, los cuales afectan la mayoría de las organelas
celulares, causando una disfunción espermática (12,13).
En los últimos años, los protocolos de criopreservación han venido siendo modificados
sustancialmente en buscando reducir los daños ocasionados por la criopreservación. Para
tal efecto se han desarrollado nuevos y perfeccionado tradicionales sistemas de empaque
tales como el Flatpack® (14), el Mini-Flatpack (15), los sistemas abiertos (16), las pajillas
de 0.25 ml y 0.25ml (17); en esa misma medida, se han optimizado los protocolos de
congelación con base en las características conjugadas de las tasas de enfriamiento, los
crioprotectores y los diluyentes en ellos usados (11,17–19). Así mismo se ha demostrado
la bondad de suplementar los diluyentes de congelación con compuestos con propiedades
antioxidantes como es el caso de la Quercetina y Vitamina E (20,21) toda vez que reducen
la peroxidación lipídica, el daño en ADN y otras organelas, causados por la acción de los
radicales libres inestables. Todas las innovaciones y mejoras introducidas al proceso han
permitido mejorar los parámetros de calidad seminal medidos tras la descongelación, sin
embargo aún siguen siendo inferiores comparados con los índices obtenidos en semen
fresco y refrigerado lo cual significa que es necesario investigar más buscando introducir
mejoras adicionales en temas fundamentales y definitivos como la concentración del
antioxidante, el sistema de empaque, las tasas de enfriamiento y las tasas de recuperación
pos-descongelación con los cuales sea posible implementar un procedimiento de IA exitoso
con semen congelado.
No obstante los resultados aceptables obtenidos bajo diferentes protocolos de
criopreservación son prometedores, se sabe de la existencia de una subpoblación de
reproductores cuyos espermatozoides presentan baja criotolerancia y/o mala
congelabilidad (22,23), y que en consecuencia tendrían resringido su uso en un programa
de IA basado en semen congelado. El caso contrario también se presenta, una
subpoblación equina para la cual se reporta una mejor respuesta a la criopreservación y/o
10
mayor criotolerancia. Hasta ahora, el criterio de selección aplicado a los potenciales
reproductores donantes sde semen congelable en los criaderos se limita a su valor
comercial y no por la criotolerancia espermática, que de implementarse de manera paralela
potencializaría la creación de bancos genéticos.
Una diferencia esencial entre la refrigeración y la congelación es que mientras la gran
mayoría de los eyaculados soportan el proceso de refrigeración, la respuesta de los
espermatozoides a la congelación es muy variable. Aunque dicha variabilidad se ha
reportado hace tiempo en la especie equina (22) las mejoras introducidas en los protocolos
de criopreservación no han logrado superar este hecho. Últimamente se han venido
postulando diferentes teorías que tratan de explicar la razón a dicha variabilidad individual,
reportada también en otras especies. Aquellas relacionadas con las características de la
respuesta al estrés oxidativo (24,25) y la composición lipídica de la membrana plasmática
de los espermatozoides (26,27), son las que han venido acumulando mayores evidencias
para la explicación de dicho fenómeno.
Finalmente, es aceptado que para mejorar la eficiencia reproductiva del semen
criopreservado es necesario conocer con la mayor exactitud posible los posibles factores
extrínsecos e intrínsecos que afectan al individuo donante, identificar los aspectos o
factores que condicionan esta variabilidad pues aunque se han señalado muchos aspectos
asociados a la variabilidad en la criotolerancia espermática, son escasos los estudios que
han abordado dicha problemática en la especie equina. Por esta razón, y dada la
importancia económica, social y cultural de los caballos en Colombia, se hace necesario
adelantar investigaciones como esta que buscan contribuir a mejorar la congelabilidad de
los espermatozoides equinos mediante el estudio del efecto de dos variables de
importancia fundamental en el proceso: la presencia de antioxidantes y los sistemas de
empaque.
1.4 Marco teórico
Durante las últimas décadas, el sector equino ha realizado importantes esfuerzos para
potenciar el crecimiento de la industria equina en diferentes escenarios a nivel deportivo,
cultural y/o como herramienta de trabajo y transporte. Sin embargo, según el censo
pecuario nacional de 2016 realizado por el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA), para
11
la fecha del censo se evidencia una leve recuperación del inventario equino. Colombia
cuenta con reconocimiento internacional por sus especies caballar, mular y asnal usadas
en la recreación, el deporte y el trabajo. El Caballo Criollo Colombiano, caracterizado por
su sensibilidad, fuerza, brío, velocidad y suavidad es un ejemplar de un fenotipo único,
hermoso, elegante, noble, con movimientos bien definidos, permitiéndole a quien lo monta
gozar de gran quietud en su andar. También se cuenta con valiosos ejemplares mulares y
asnales de labor, los cuales suman una población de 1´451.085 cabezas, asentada
principalmente en los departamentos de Antioquia (10,61%), Tolima (8,15%),
Cundinamarca (7,52%), Córdoba (7,36%), Casanare (5,69%) y Cauca (5,63%), regiones
en que se concentra el 45,21% del censo equino nacional. Antioquia particularmente cuenta
a la fecha con 153.970 cabezas. (4). Sin embargo, el gran reto del país es buscar
alternativas que optimicen la competitividad con el propósito de fortalecer su participación
en el mercado internacional ya que actualmente Colombia no ha sido reconocido como un
país productor principal ni tampoco con actividad exportadora representativa. Los
principales avances en el mejoramiento de los parámetros productivos, con reconocimiento
mundial han sido direccionados a la producción y mejoramiento genético del caballo criollo
colombiano(28).
Una de las biotecnologías reproductivas que ha hecho avanzar tecnológicamente la
reproducción equina ha sido la inseminación artificial (IA) con semen refrigerado, que
aplicada rutinariamente en los criaderos, produce resultados de fertilidad y prolificidad
similares a los alcanzados con la monta natural (2,29). Su aplicación se ha extendido por
su contribución al mejoramiento genético acelerado mediante la utilización intensiva de
reproductores con caracteres genéticos de alto valor comercial, la reducción del número de
sementales por granja, la reducción del riesgo de introducción de enfermedades a las
explotaciones, la facilidad para el manejo reproductivo al reducir el tiempo y el trabajo
necesarios, así como un mejor control de la calidad del semen(30).
La IA con semen refrigerado se ha desarrollado gracias a la disponibilidad de diluyentes
comerciales que permiten la conservación del semen durante periodos variables entre 2 y
7 días, pero el uso de semen equino congelado se limita a la introducción de nuevo material
genético de alto valor para inseminar yeguas puras en las granjas de selección, o bien
asociados a labores de investigación (6,31,32).
12
La criopreservación de semen es una técnica accesoria a la inseminación artificial y la
fertilización in vitro y ha jugado un papel bastante importante en los últimos 50 años en el
mejoramiento genético en diferentes especies de animales de interés zootécnico. Mediante
esta biotecnología se ha logrado realizar mejoramiento genético en rebaños, prevenir y
controlar enfermedades, hacer control reproductivo, aprovechar mejor los sementales y
obtener un mejor rendimiento económico.
No obstante, la manipulación del semen en estos procesos altera el óptimo desempeño de
los espermatozoides (33), al punto que la fertilidad del semen criopreservado es
comparativamente menor que la del semen fresco causada posiblemente por la
susceptibilidad al choque térmico, al enfriamiento y a la composición misma del diluyente;
variables que están directamente relacionadas con el estrés osmótico y la formación de
cristales durante el proceso de congelación/descongelación, afectando la mayoría de las
estructuras y organelas (34,35). De otro lado, las centrifugaciones seriadas y la remoción
del plasma seminal, inducen una liberación significativa de especies reactivas de oxígeno
(EROs) por parte de los espermatozoides y leucocitos del semen resultando en disfunción
espermática (36,37).
Particularmente la membrana plasmática de los espermatozoides de los mamíferos es rica
en ácidos grasos poli-insaturados, los cuales son muy susceptibles al ataque de las ERO
(12,26,36), además, durante los últimos estados de la espermatogénesis, los
espermatozoides han descartado la mayoría de su citoplasma perdiendo gran parte del
conjunto de defensas enzimáticas que los protegen del daño peroxidativo. Igualmente, la
capacidad de reparación del ADN se pierde en los espermatozoides maduros, haciéndolos
más vulnerables al daño oxidativo que cualquier célula somática (38).
En resumen, las ERO dañan las macromoléculas afectando el componente estructural y
funcional de los espermatozoides sobrevivientes, lo cual se ve reflejado en la inestabilidad
de la membrana, daño de los receptores de membrana, alteraciones del citoesquelesto,
perturbaciones del axonema (el cual es asociado con la pérdida de movilidad), inhibición
de la fusión esperma-oocito, y daño nuclear entre otros (8,9,34,39). Por esta razón, la
adición de compuestos antioxidantes en los diluyentes para la criopreservación de semen
equino se ha utilizado ampliamente ya que puede reducir la peroxidación lipídica, el daño
en ADN y demás organelas espermáticas, procurando reducir el daño espermático
acumulado hasta el momento de la pos-descongelación (40–42)
Las sustancias antioxidantes son capaz de retardar o prevenir la oxidación de moléculas
tales como las especies reactivas de oxígenos- ERO. La oxidación es una reacción química
13
de transferencia de electrones de una molécula a un agente oxidante. Las reacciones de
oxidación pueden producir radicales libres que inician reacciones en cadena con resultados
deletéreos para las células(43,44). Los antioxidantes detienen estas reacciones eliminando
los intermediarios del radical libre e inhiben otras reacciones de oxidación. Los flavonoides
son pigmentos (o metabolitos secundarios) naturales presentes en los vegetales y que
protegen al organismo del daño producido por agentes oxidantes, se encuentran en frutas,
verduras, semillas y flores, así como en cerveza, vino, té verde, té negro y soja. Contienen
en su estructura química un número variable de grupos hidroxilo fenólicos y excelentes
propiedades de quelación del hierro y otros metales de transición, lo que les confiere una
gran capacidad antioxidante. Por ello, desempeñan un papel esencial en la protección
frente a los fenómenos de daño oxidativo. Sus propiedades anti-radicales libres se dirigen
fundamentalmente hacia el radical hidroxilo y superóxido, especies altamente reactivas
implicadas en el inicio de la cadena de peroxidación lipídica(45,46)
Dentro de los flavonoides, la quercetina ha sido ampliamente investigada debido a su
capacidad para eliminar radicales libres así como sus habilidades quelantes de metales; la
presencia de tres grupos hidroxilo hace del compuesto un potencial barredor de radicales
libres y / o antioxidante (47). Es el flavonoide más abundante en la dieta. En humanos,
particularmente, se ha reportado que la quercetina puede proteger el ADN del estrés
oxidativo in vitro, al interactuar con el ADN forma una especie de complejo que no tiene
actividad electroquímica y no puede ser reducido (48). La presencia de quercetina durante
la congelación mejora la movilidad y capacidad de la zona de unión de los espermatozoides,
ya que disminuye el proceso de peroxidación lipídica. El flavonoide quercetina, inhibe la
formación del ion superóxido, quelatos de hierro, así como la formación del radical peróxido
lipídico (21) . De la misma manera, el antioxidante vitamina E o α-tocoferol ha sido usado
y estudiado a gran profundidad, es una vitamina liposoluble que ofrece un efecto protector
en la membrana plasmática del semen congelado, ayudando así a mantener la actividad
metabólica y la viabilidad celular. La vitamina E es conocida por comportarse como inhibidor
de la peroxidación lipídica en la membranas biológicas, previniendo el daño oxidativo de
semen criopreservado o refrigerado (49,50).
A pesar de la suplementación de los diluyentes de criopreservación con compuestos
antioxidantes, el daño sufrido por el estrés oxidativo sigue siendo persistente, lo cual ha
generado la necesidad de explorar alternativas como el uso de ácidos grasos, para procurar
estabilizar la membrana plasmática. En las células espermáticas la composición lipídica de
la membrana plasmática juega un rol importante en la determinación de la fluidez de la
14
membrana así como la movilidad y viabilidad(12). Los espermatozoides equinos, en
particular, contienen un mayor porcentaje de ácidos grasos poliinsaturados n-6 en lugar de
n-3. El ácido graso que se presenta en mayor cantidad en la membrana plasmática de la
especie equina es el DPA (ácido docosapentaenoico) y sus niveles no cambian durante la
congelación y tampoco se relaciona con la disminución de la movilidad, a diferencia del
DHA (ácido docosahexaenoico), el cual disminuye luego de la congelación y está
positivamente relacionado con la movilidad espermática (51,52). Diferencias en la
composición lipídica de la membrana plasmática del espermatozoide ha sido sugerida
como el factor clave de la variabilidad presentada respecto a la congelabilidad. En muchas
especies de mamíferos, hasta el 60% del total de ácidos grasos son ácidos grasos
poliinsaturados (AGPI) de cadena larga de la serie n-3, lo que les confiere mayor fluidez
debido a la presencia de muchos enlaces dobles pero también mayor propoensión a la
peroxidación. La composición de ácidos grasos en espermatozoides de porcinos es
especialmente interesante, ya que contienen 25% ácido docosapentanoico (C22: 5 n-6;
DPA) y 30% de ácido docosahexaenoico (C22: 6 n-3; DHA) y presentan las mismas
dificultades que los espermatozoides equinos cuando son sometidos a los procesos de
criopreservación/descongelación (35), lo cual permite especular que equilibrar la
proporción de ácidos grasos poliinsaturados en la membrana plasmática del
espermatozoide podría mejorar la respuesta a la congelabilidad y disminuir así la
variabilidad en respuesta al proceso de congelación.
Si bien se han descrito varias técnicas para la criopreservación de semen equino, el más
utilizado es de congelación en pajillas. En esta técnica se procede inicialmente con una
etapa previa de enfriamiento y estabilización y otra posterior de congelación las cuales se
han diseñado para minimizar las consecuencias negativas derivadas del proceso de
congelación y aumentar la resistencia de los espermatozoides a este proceso(18,53,54).
En la actualidad se utilizan una gran variedad de empaques, buscando albergar una
cantidad suficiente de espermatozoides y que a su vez permita una distribución homogénea
de la temperatura, los diferentes tipos de empaque y las principales ventajas y desventajas
de los mismos son:
Píldoras: La relación volumen/superficie facilita una mejor distribución de la
temperatura, pero su limitado volumen y concentración supone la utilización de un
número considerable de ellas para reconstituir una dosis inseminante con suficientes
espermatozoides para poder ser utilizados en IA.
15
Maxi pajuela: Solo se necesitan una o dos de ellas para reconstituir una dosis
inseminante stándar, pero su diseño geométrico no facilita la transmisión de la
temperatura y ello supone que las zonas periféricas del envase se ven sometidas a un
tiempo más prolongado de exposición a temperaturas extremas de congelación y
descongelación.
Pajillas de 0.5 ml: De tipo francés o alemán. Permiten una transmisión de la temperatura
del exterior al interior aceptable, pero su pequeño volumen dificulta la consecución de
una dosis inseminante exitosa.
Mini pajillas de 0.25 ml: De tipo americano. Permiten una buena transmisión de la
temperatura del exterior al interior, pero su pequeño volumen dificulta aún más la
consecución de una dosis inseminante efectiva.
Bolsas planas: Contienen una dosis entera y su geometría facilita la congelación y
descongelación rápida y homogénea. Presenta dificultades para su almacenamiento en
tanques de nitrógeno líquido.
En el área de criopreservación de espermatozoides equinos hay poca literatura sobre
investigaciones que conduzcan a dilucidar las diferencias que existen entre eyaculados de
reproductores denominados de buenos congeladores y malos congeladores. La
congelabilidad de los eyaculados parece estar relacionada con características individuales
más que con el proceso de criopreservación como tal (55) y por esta razón la capacidad de
cada reproductor en producir espermatozoides resistentes al choque térmico tiene diversas
explicaciones en las características de su propio eyaculado.
Las características particulares de ciertos eyaculados de resistir a la criopreservación mejor
que otros permanecen sin dilucidar. Sin embargo, algunos trabajos han vinculado estos
aspectos con orígenes genéticos (6,56,57), lo cual explica también porque eyaculados
recolectados del mismo macho tienden a mostrar la misma congelabilidad (25,58). A pesar
de que se ha notado que puede haber ligeros cambios en la congelabilidad entre
eyaculados del mismo macho, se ha postulado que las condiciones de cría junto con la
genética, pueden afectar la resistencia al choque térmico.
Finalmente, para determinar el efecto de una variable sobre los procedimientos de
congelación o determinar el efecto de un reproductor por ejemplo sobre las características
del semen pos-descongelación, se deben hacer las evaluaciones seminales de rutina, que
16
generalmente incluyen la medición del volumen, el color, el olor, la apariencia, la
consistencia, la densidad, el pH, la presencia de impurezas, la concentración y la movilidad,
pero estas mediciones no proveen una información confiable sobre la capacidad fertilizante
de los espermatozoides, por lo cual, se deben introducir otras evaluaciones como la de la
integridad del ADN y del estado del acrosoma, y la funcionalidad de las membranas
plasmática y mitocondrial, como un complemento para la determinación indirecta de la
calidad espermática.
1.5 Metodología
1.5.1 Animales
El semen fue obtenido diferentes criaderos del departamento de Antioquia. Se colectaron
en total de 10 eyaculados de machos que cumplieran con los criterios de inclusión: entre 2-
6 años de edad, 350- 420 kg en peso, fertilidad comprobada y usados de manera rutinaria
para inseminación artificial. Las condiciones de manejo de los reproductores fueron las
propias de cada criadero, en general, bajo estabulación, alimentados con una dieta a base
de forraje picado y heno suplementado con alimento concentrado, sal mineralizada y agua
a libre disposición.
1.5.2 Recolección de la muestra seminal
Las muestras de semen fueron recolectadas usando una vagina artificial (53°C) en
presencia de una yegua en celo. La vagina artificial posee un filtro que permite la
recolección de semen libre de gel. Inmediatamente posterior a la recolección los
eyaculados fueron sometidos a las respectivas evaluaciones macroscópica de campo:
volumen, color, olor, apariencia, consistencia, densidad, pH, presencia de impurezas para
luego, las muestras aptas, ser diluidas en una proporción 2:1 (Semen: Diluyente comercial
Kenny). Una vez en el laboratorio de les medía concentración, viabilidad, morfología y
movilidad. Las muestras fueron procesadas y evaluadas en el Laboratorio de Biotecnología
en Salud de la Universidad CES, sede Sabaneta, el Laboratorio de Reproducción Animal
de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín, y en el Laboratorio de Citometría
de Flujo de la Sede de Investigación Universitaria (SIU) de la Universidad de Antioquia.
17
1.5.3 Protocolo de criopreservación
Inicialmente se realiza una centrifugación a 660 x g por 15 min a 20°C de las muestras
previamente diluidas. El sobrenadante es eliminado y el pellet re-suspendido con 2ml del
diluyente comercial, el cual contiene yema de huevo. Posterior a esta dilución los
parámetros de viabilidad, concentración espermática, número total de espermatozoides y
movilidad fueron re-evaluados, y solo las muestras de semen que presentaron un mínimo
de 70% en movilidad progresiva y un 80 % en morfología normal fueron procesadas.
Posteriormente, el diluyente comercial suplementado con yema de huevo y glicerol es
adicionado para obtener una concentración final 2 x 108 espermatozoides viables/ml. Las
muestras de semen diluidas se dividen en 14 alícuotas, 2 control para cada tamaño de
pajilla (Sin antioxidantes) y 12 suplementadas con los antioxidantes Vitamina E 2000 µM,
200 µM y 20 µM, Quercetina 250 µM, 25 µM y 2.5 µM. Luego cada tratamiento fue
empacado en pajillas de 0.25 ml y 0.5 ml respectivamente (Tabla 1). Después, las muestras
fueron sometidas a una curva de enfriamiento/congelación de 3 fases. En la primera fase
se dio el enfriamiento de 20°C a 5°C a una tasa de enfriamiento de 0.26°C/min. En la
segunda fase se disminuyó la temperatura de las muestras de 5°C a - 90°C a una tasa de
enfriamiento de 4.75°C/min por medio de la exposición a vapores de nitrógeno líquido. La
última fase consistió en llevar las muestras congeladas directamente al nitrógeno líquido
en donde fueron almacenadas.
Tabla 1. Tratamientos suplementados
ID Tratamiento
1 Ve- 0.25 ml – 2000 µM
2 Ve- 0.25 ml – 200 µM
3 Ve- 0.25 ml – 20 µM
4 Ve- 0.5 ml - 2000 µM
5 Ve- 0.5 ml – 200 µM
6 Ve- 0.5 ml – 20 µM
7 Q- 0.25 ml – 250 µM
8 Q- 0.25 ml – 25 µM
9 Q- 0.25 ml - 2.5 µM
10 Q- 0.5 ml – 250 µM
11 Q- 0.5 ml – 25 µM
12 Q- 0.5 ml - 2.5 µM
13 Control - 0.5 ml
14 Control - 0.25 ml
18
1.5.4 Protocolo de descongelación
La descongelación se realizó en un baño maría a 37°C por 20 segundos. Después de la
descongelación, las muestras fueron preparadas para las diferentes evaluaciones que se
describen a continuación.
1.5.5 Evaluación de movilidad
Las evaluaciones de movilidad individual post-congelación fueron realizadas por medio del
software CASA (Computer Assisted Sperm Analyzer), referencia IVOS de Hamilton Thorne.
Cada tratamiento se evaluó por triplicado en microcélulas leja de 4 pozos de 3 µl cada uno.
En cada medición se capturan diferentes campos hasta alcanzar 1500 espermatozoides.
Cada evaluación se realiza por un video de 25 cuadros consecutivos por segundo y se
determinan 11 para metros de movilidad:
Proporción de espermatozoides móviles (expresada en %)
Proporción de espermatozoides progresivos (expresada en %)
Velocidades (expresada en µm/s):
o Velocidad promedio (VAP)
o Velocidad rectilínea (VSL)
o Velocidad curvilínea (VCL)
Progresión (expresada en %),
o Linealidad (LIN)
o Rectitud del movimiento (STR)
o Balanceo (WOB)
Desplazamiento lateral de la cabeza espermática (ALH) (se expresa en µm)
Frecuencia de golpe cruzado (BCF) (se expresa en Hz).
1.5.6 Funcionalidad de la membrana plasmática (Test hiposmótico)
De cada tratamiento se toman 50µl de semen y se mezclan con 1ml de solución hipo-
osmótica (0.49g de citrato de sodio y 0.9g de fructosa en 100ml de 100mOsm/Kg), y luego
se llevó a incubación a 37°C por 60 min.
Para la evaluación una gota de 10µl es dispuesta en un portaobjetos y cubierto por un
cubreobjetos. Bajo un microscopio de contraste de fases se determinan los
espermatozoides positivos, que son aquellos que tienen la cola doblada o enrollada.(59,60)
19
1.5.7 Reacción acrosómica
Esta evaluación se realizó por medio de citometría de flujo. Esta técnica se basa en el uso
de una lectina conjugada con un fluorocromo, PNA (lectina de maní (Arachis hypogaea)),
esta se une específicamente a la membrana acrosomal interna de los espermatozoides y
es marcada por el fluorocromo FITC (Isotiocianato de fluoresceína) se usó a una
concentración de 100 µg/ml. Permite detectar aquellos espermatozoides que tienen su
membrana acrosomal dañada, lo cual permite la unión de la lectina a la membrana
acrosomal y de igual manera el fluorocromo, al interior del compartimiento acrosomal.
10.000 eventos por lectura. (Szabolcs et al,2002 con modificaciones) (61)
1.5.8 Integridad de Ácido Desoxirribonucleico (DNA)
La medición de integridad de ADN se realizó por medio de citometría de flujo. Mediante el
fluorocromo Naranja de Acridina se mide la suceptibilidad del ADN espermático a la
desnaturalización, esto se realiza por cuantificación del cambio cromático fluorescente del
verde al rojo. El fluorocromo Naranja de acridina se intercala entre las dobles cadenas de
ADN como un monómero y se liga a las cadenas simples del ADN como un agregado. El
monomérico emite fluorescencia verde (ADN intacto) mientras que el agregado emite
fluorescencia roja (ADN desnaturalizado). Se utilizó a una concentración de 10.000 eventos
por lectura. (Golan et al,1997 con modificaciones)(62)
1.5.9 Potencial de membrana mitocondrial
La medición del potencial de membrana mitocondrial se realizó por medio de citometría de
flujo. Fue utilizado el fluorocromo 3,3-diexyloxacarbocianina iodido (DiOC 6), un compuesto
catiónico y lipofílico, cuya acumulación en compartimentos intracelulares depende del
potencial transmembrana y es por tanto empleado para marcar mitocondrias, este se
incorpora en mitocondrias con elevado potencial de membrana mitocondrial, y percibe
cuando la mitocondria padece una pérdida de potencial de membrana, con lo cual se da
una pérdida del fluorocromo y consecuentemente una perdida en la fluorescencia, lo cual
es detectado por el citómetro. Se utilizó a una concentración 1nM. 10.000 eventos por
lectura. (Rottenberg et al,1998 con modificaciones) (63)
20
1.5.10 Viabilidad espermática
La viabilidad espermática se realizó por citometría de flujo utilizando el fluorocromo ioduro
de propidio (IP), esta técnica se basa en la exclusión del IP en células vivas. La membrana
plasmática de las células viables forma una barrera con permeabilidad selectiva entre el
contenido intracelular y el medio extracelular. Las células muertas pierden esta propiedad
y por lo tanto incorporan el fluorocromo, el cual se intercala entre las bases del ADN y del
ARN en una relación de 1 molécula de colorante cada 4 o 5 pares de bases. Una vez unido
a los ácidos nucleicos, la fluorescencia del IP se ve incrementada 20 a 30 veces. Se utilizó
a una concentración 500ug/ml.10.000 eventos por lectura. (Szabolcs et al, 2002 con
modificaciones) (61)
1.5.11 Análisis estadístico
Por medio del software libre The R Project for Statistical Computing versión 3.3.1 Fueron
realizados análisis de varianza con estructura factorial, tomando la concentración como
factor anidado, dado que los niveles de concentración para cada antioxidante no son
iguales. Se manejan tres niveles de cada antioxidante, pero diferentes dosis entre ellos
(aunque corresponden con bajo, medio y alto). Consecuentemente, se considera un modelo
con concentración anidada en antioxidante. En la evaluación de los tratamientos (14
tratamientos en total, configurados a partir de una estructura factorial 2x2x3 + 2 controles)
y se midieron 16 variables respuesta, estableciendo así, el reproductor en el modelo como
factor de bloqueo.
La estructura factorial de los tratamientos se organizó de la siguiente manera:
- Tamaño de pajilla (tp), con dos niveles: 1 y 2
- Antioxidante (aox), con dos niveles: Vitamina E y Quercetina.
- Concentración (conc), con tres niveles diferentes para cada antioxidante.
En R, el modelo anidado para la estructura factorial se denota así:
variable.respuesta~rep + tp + aox + tp:aox + aox/conc
Se realizaron anovas para cada una de las variables respuesta y dos modelos para cada
una de ellas:
Modelo 1, considerando la estructura factorial (no se incluyen los controles).
21
Fuentes de Variación gl
Reproductor 9
Tp 1
Aox 1
Tp*Aox 1
Aox / Concentración 4
Error 103
Total 119
Modelo 2, ignorando la estructura factorial (incluyendo los controles)
Fuentes de Variación gl
Reproductor 9
Tratamiento 13
Error 117
Total 139
Usando el paquete phia se evaluaron efectos simples de la interacción tamaño de pajilla:
antioxidante (tp*Aox), cuando fue del caso.
La significancia del efecto aox/concentración quiere decir que hay efecto de la
concentración, es decir, que la respuesta media difiere entre concentraciones. Puesto que
los niveles de concentración difieren entre antioxidantes, cuando dicha condición estuvo
presente, se realizaron análisis independientes para cada antioxidante. Para ello se
particionó la base de datos por tipo de antioxidante (Vitamina E y Quercetina). En tales
casos, para cada antioxidante, se corre el siguiente modelo:
variable.respuesta~rep + tp*conc
Usando la prueba de Dunnett, se realizan comparaciones de cada tratamiento contra el
control.
1.6 Resultados
El análisis de varianza se aplicó a cada una de las variables respuesta (11 variables
pertenecientes a los parámetros de movilidad y 5 variables que evalúan funcionalidad
espermática (Host, reacción acrosomal, reacción mitocondrial, integridad de ADN y
vitalidad) teniendo en cuenta antioxidante, tamaño de la pajilla, concentración, interacción
entre tamaño de pajilla y antioxidante, así como la interacción entre el antioxidante y la
concentración.
22
1.6.1 Evaluación de movilidad
Se observó de manera trasversal una alta variabilidad por parte de los reproductores para
cada una de las variables evaluadas. Aquellas variables que presentaron efectos
significativos del antioxidante (p≤ 0,05) se observan en la tabla 2. Los parámetros de
movilidad expuestos en la tabla presentaron una mejor respuesta con la suplementación
con el antioxidante Vitamina E. Para los demás parámetros de movilidad evaluados no se
determinó un efecto del antioxidante.
Tabla 2. Variables sensibles al efecto del antioxidante
Antioxidante (X ± DE)
Variable Valor P Vitamina E Quercetina
VAP (µm/s) 0.00000215 64.55 ± 1.80a 51.73 ± 1.80b
VSL (µm/s) 0.0000128 49.99 ± 1.41a 40.8 ± 1.41b
VCL (µm/s) 0.0000671 127.68 ± 4.02a 104.03 ± 4.02b
ALH (µm/s) 0.0333 5.33 ± 0.32 4.33 ± 0.32
Linearidad (%) 0.0106 37.44 ± 1.15 33.17 ± 1.15 Valores mostrados: media ± desviación estándar. Los exponentes a, b indican diferencia estadística
significativa
VAP: Velocidad media
VSL: Velocidad rectilínea.
VCL: Velocidad curvilínea.
ALH: Amplitud lateral de la cabeza.
1.6.2 Funcionalidad de membrana plasmática (Test hipoosmótico)
No se encontró ningún efecto del antioxidante y tamaño de la pajilla para ninguno de los
tratamientos suplementados, sin embargo si se observó un efecto bastante significativo del
reproductor (P < 0.05).
1.6.3 Reacción acrosómica
No se observó efecto del antioxidante y el tamaño de la pajilla, pero si un efecto importante
del reproductor (P < 0.05).
1.6.4 Integridad de ácido desoxirribonucleico (ADN)
No se encontró ningún efecto del antioxidante, ni tampoco del tamaño de la pajilla, pero de
igual manera un si un efecto significativo por parte del reproductor (P < 0.05).
23
1.6.5 Potencial de membrana mitocondrial
Se encontró efecto del antioxidante Quercetina dependiente de la concentración (P=
0.0142), y del reproductor (P < 0.05).no se observó efecto del tamaño de la pajilla. Tabla
3.
Tabla 3. Variables que fueron sensibles a la interacción del antioxidante y sus niveles de
concentración.
Antioxidante (X ± DE)
Variable Valor P Vitamina E Quercetina
Actividad mitocondrial (%) 0.0142 37.92 ± 2.37a 42.27 ± 2.37b
Vitalidad (%) 0.0454 45.89 ± 1.13a 43.83 ± 1.13b Valores mostrados: media ± desviación estándar. Los exponentes a, b indican diferencia estadística
significativa
1.6.6 Viabilidad espermática
El porcentaje de vitalidad se vio afectado por efecto del antioxidante dependiente de la
concentración (Tabla 3) y efecto del reproductor (P < 0.05) pero no se determinó ningún
efecto del tamaño de la pajilla.
No se presentó efecto directo del tamaño de la pajilla para ninguna de las variables
evaluadas, pero si se observó su efecto en la interacción con el antioxidante para el
porcentaje de espermatozoides móviles (tabla 4).
Tabla 4. Variables que fueron sensibles a la interacción del tamaño de la pajilla y el
antioxidante
Variable Valor P Interacción Media ± DE
Espermatozoides móviles (%) 0.0193
Tp 0.5 ml - Ve 11.71 ± 0.90
Tp 0.25 ml - Ve 14.76 ± 0.90a
Tp 0.5 ml - Q 12.15 ± 0.90
Tp 0.25 ml - Q 10.91 ± 0.90b Valores mostrados: media ± desviación estándar. Los exponentes a, b indican diferencia estadística
significativa
Tp: Tamaño de pajilla
Ve: Vitamina E
Q: Quercetina
24
Posteriormente se realizó un análisis de varianza para las concentraciones de antioxidante,
únicamente para aquellas variables que presentaron interacción entre la concentración y el
antioxidante (tabla 3), realizando análisis de varianza (ANOVA) para determinar los efectos
significativos de la concentración con el fin de determinar el efecto real del antioxidante.
Particularmente para el porcentaje de actividad mitocondrial se observó un efecto altamente
significativo del antioxidante Quercetina (0.000306) en comparación con el antioxidante
Vitamina E. (Tabla 5).
Tabla 5. Variables que fueron sensibles a la interacción del tamaño de la pajilla y el antioxidante.
Antioxidante
Variable Vitamina E Quercetina
Actividad mitocondrial (%) 0.788 ª 0.000306 b
Vitalidad (%) 0.0750 0.0767 Valores mostrados: media ± desviación estándar. Los exponentes a, b indican diferencia estadística
significativa
Con base en el resultado anterior del porcentaje de actividad mitocondrial, se realizó una
prueba de medias para determinar la concentración a la cual el antioxidante Quercetina
presento una diferencia significativa, encontrando que la concentración 2.5 µM tuvo una
incidencia mayor en el porcentaje de actividad mitocondrial. Tabla 6. La mayor diferencia
entre concentraciones de Quercetina se presentó para 2.5 µM y 250 µM, P = 0.0001826.
Tabla 6. Porcentaje de actividad mitocondrial según concentraciones de Quercetina
Concentración Quercetina Actividad mitocondrial (%)
2.5 µM 49.69 ± 3.33ª
25 µM 46.87 ± 3.33ª
250 µM 30.35 ± 3.33b Valores mostrados: media ± desviación estándar. Los exponentes a, b indican diferencia estadística
significativa
Finalmente se realizaron comparaciones múltiples de medias con la prueba de Dunnett, de
todos los tratamientos contra su respectivo control, determinando según el valor P si algún
tratamiento tuvo diferencias significativas para cada variable evaluada.
25
Se observó el efecto en particular del tratamiento: tamaño de pajilla: 0.5 ml, antioxidante:
Quercetina, concentración: 2.5 µM. Las variables para las cuales dicho tratamiento difiere
del control son: Velocidad rectilínea (VSL), % Spm Progresivos, Amplitud lateral de la
cabeza (ALH).Tabla 7.
Tabla 7. Comparaciones múltiples entre tratamientos y su respectivo control.
Tratamiento
Variable Tamaño pajilla (ml) Antioxidante Concentración (µM) Valor P
VSL (µm/s) 0.5 Quercetina 2.5 0.0566
ALH (µm/s) 0.5 Quercetina 2.5 0.0203
% Spm Pro 0.5 Quercetina 2.5 0.0418 Velocidad rectilínea (VSL) % Spm Progresivos (Pro) Amplitud lateral de la cabeza (ALH)
Para las demás variables evaluadas no se observó una diferencia significativa de ninguno
de los tratamientos cuando fueron comparados con su respectivo control.
1.7 Discusión
La criopreservación y la inseminación artificial son biotecnologías reproductivas que
pueden contribuir de manera significativa al crecimiento y desarrollo de la industria
equina(64), las ventajas que aporta la criopreservación de semen a los procesos
productivos supera en gran medida los procedimientos convencionales realizados con
semen fresco o refrigerado, por ser una metodología practica y eficiente para el transporte
y almacenamiento de semen equino criopreservado(33). No obstante, tal como lo describen
Loomis y Gram, uno de los retos para aquellos que pretenden criopreservar
espermatozoides equinos es enfrentarse a la variabilidad entre individuos en respuesta a
la criotolerancia de sus espermatozoides (22). En otras especies como la bovina, es común
que los programas de inseminación artificial con semen congelado cuenten con criterios de
selección de la calidad seminal de los individuos que sean incluidos, de manera que las
células espermáticas resistan los factores de estres desencadenados durante los
protocolos de criopreservación, lo que consecuentemente ha permitido obtener resultados
más homogéneos en la eficiencia reproductiva de aquellos individuos seleccionados dentro
de los programas de inseminación artificial para la especie bovina(22).
Este tipo de selección no ha sido establecido para los equinos, no se dispone con precisión
de parámetros bajo los cuales la calidad seminal de un reproductor puede ser considerado
26
como buen congelador o mal congelador(65), por lo tanto el uso indiscriminado de
reproductores dentro de los programas de inseminación artificial con semen congelado no
cumplen con las expectativas reproductivas de los criaderos, las tasas de preñez son
altamente variables (64) lo que conlleva a disminuir la implementación de semen
congelado. La alta variabilidad a la criotolerancia individual de los reproductores dificulta el
establecimiento de parámetros que definan la calidad seminal de los buenos congeladores
para la especie equina, puesto que se conoce que la características de congelabilidad de
un reproductor (bueno o malo) mantiene su efecto consecuente en los análisis de calidad
seminal tales como parámetros de movilidad, integridad y funcionalidad de membrana
plasmática y acrosomal, actividad mitocondrial, integridad de ADN y vitalidad (22,65).
En el presente estudio se confirmó que dicha variabilidad es un factor trasversal para cada
una de las pruebas realizadas donde se encontró un efecto del reproductor altamente
significativo (p<0.05) tal como ha sido reportado previamente. No se observó un efecto
significativo del antioxidante ni el sistema de empaque en las evaluaciones realizadas para
funcionalidad de membrana plasmática, integridad acrosomal, actividad mitocondrial,
integridad de DNA y vitalidad, sin embargo para cada una de ellas se observó un fuerte
efecto del reproductor. Los factores a los cuales se atribuye dicha variabilidad han sido
diferencias genéticas (raza), edad, ambiente(66), suplementación dietaria (40,67),
capacidad antioxidante del plasma seminal(19,25), presencia o ausencia de proteínas, la
composición del plasma seminal y los efectos sobre la longevidad espermática varían entre
fracciones del eyaculado y entre reproductores(68), por otro lado las proteínas asociadas
al contenido del plasma seminal pueden ser interpretadas como un factor de predicción a
la congelabilidad tal como se ha reportado en otras especies como la bovina y porcina
(69,70), y la composición lipídica de la membrana plasmática. Los perfiles fosfolipídicos de
la membrana plasmática de los equinos es similar a la del cerdo, contiene altos niveles de
ácido docosapentaenoico, y ácidos grasos poliinsaturados omega ˗ 6 (PUFA) y ácido
docosahexaenoico y omega ̠ 3 ̠ PUFA.(71) El contenido de ácido docosapentaenoico varía
entre reproductores causando posiblemente diferencias en cuanto a la criotolerancia
espermática. En un estudio realizado por García et al, 2010 se reportó que el porcentaje de
ácidos grasos poliinsaturados estaba correlacionado positivamente con la calidad
espermática y a menor susceptibilidad de sufrir peroxidación lipídica, probablemente
porque este ácido graso en particular proporciona una mayor fluidez en la membrana
plasmática, los equinos que mostraron los resultados más negativas para la integridad de
membrana espermática y además mayores niveles de peroxidación lipídica, tienen un
27
menor porcentaje de estos ácidos grasos en la membrana plasmática de sus
espermatozoides(72). Los daños mecánicos sufridos a causa de la formación de cristales
intracelulares en las células espermáticas sometidas a criopreservación no se presentan
de la misma manera en la especie equina, este daño se ha asociado más a un imbalance
osmótico presente en el proceso de descongelación(73). La membrana espermática se
somete a estrés osmótico en la fase de transición de líquido a solido durante la congelación
y la formación de cristales extracelulares también causa estrés osmótico, la fluidez de la
membrana afecta el grado de daño sufrido por la criopreservación (65).
En este orden de ideas las investigaciones han apuntado a suplementar los medios de
criopreservación con diferentes alternativas como crioprotectores, proteínas, lípidos y
antioxidantes buscando mejorar la calidad espermática y disminuir el daño fisiológico y
mecánico de la célula espermática ocasionado por las bajas temperaturas.
El uso de antioxidantes durante la congelación de semen equino criopreservado es debido
al incremento en la generación de especies reactivas de oxigeno (ERO) estrechamente
relacionadas con el estrés oxidativo ligado a fenómenos como la peroxidación lipídica que
se ha relacionado directamente con la disminución de la fertilidad en los reproductores
debido a la degradación de lípidos en la membrana plasmática de los espermatozoides(74)
y daño de proteínas y cromatina por estrés oxidativo (75). Los antioxidantes tienen la
capacidad de bloquear la generación de dichas moléculas y estabilizar las reacciones de
oxidación/reducción.
En esta investigación se observó que la suplementación con vitamina E presento un efecto
positivo para los parámetros de movilidad Velocidad media (VAP µm/s), Velocidad rectilínea
(VSL µm/s), Velocidad curvilínea VCL (µm/s), Amplitud lateral de la cabeza (ALH µm/s),
Linearidad (%) (Tabla 1). La suplementación con vitamina E protege la membrana
plasmática de la peroxidación lipídica post- descongelación aportando un efecto positivo en
la integridad y estabilidad de la membrana plasmática de los espermatozoides equinos(76),
el efecto protector de la vitamina E sobre la estructura de la membrana plasmática está
directamente relacionada con un aumento del porcentaje de vitalidad post-descongelación
tal como se reporta en la tabla 3, en donde el porcentaje de vitalidad fue 2% superior al
observado para Quercetina. También se observó que la interacción entre la pajilla de 0.25ml
y el antioxidante vitamina E tiende a mejorar el porcentaje de espermatozoides móviles
(tabla 3). Según Agüero et al, 1995 la adición de vitamina E en los diluyentes, previo al
súper-enfriamiento (5ºC) ejerce un efecto protector en la membrana plasmática y mantiene
28
la movilidad progresiva.(77) La vitamina E no mejora la integridad acrosomal ni tampoco el
potencial de membrana mitocondrial post-descongelación(76),otros estudios también
reportan que la adición de vitamina E no aumenta el potencial de membrana mitocondrial,
la viabilidad, integridad acrosomal o los parámetros de movilidad del semen equino
criopreservado (41), sin embargo, la vitamina E se ha propuesto como el componente
principal de la batería antioxidante del espermatozoide y es considerado el mayor protector
contra las especies reactivas de oxígeno (ERO) y la peroxidación lipídica de la membrana
plasmática(40,78), este antioxidante puede inhibir la peroxidación lipídica por la eliminación
de los radicales peroxi ( ROO•) y alcoxi (RO•) y otras formas lipídicas participan en
reacciones de peroxidación de lípidos(79). Muchos estudios con resultados variables e
inconsistentes entre ellos se reportan para diferentes mamíferos (equinos, bovinos,
porcinos, caninos) para los cuales se evaluó la suplementación con vitamina E en los
diluyentes de refrigeración y/o congelación con el fin de mejorar las características
espermáticas.(50,76, 80–82)
En esta investigación se determinó que el antioxidante Quercetina tuvo un efecto altamente
significativo para el potencial de membrana mitocondrial (P < 0.05). Este flavonoide suprime
la formación del ion superóxido, quelatos de hierro e inhibe la formación del radical lipídico
peroxi (21), se reporta que cuando la Quercetina es añadida a los medios usados para
almacenar o congelar semen, muchos de los daños asociados con el estrés oxidativo se
reducen. Los efectos positivos de las características espermáticas post-descongelación de
suplementar Quercetina han sido reportados para varias especies (83–86). En otros
análisis los espermatozoides almacenados en diferentes concentraciones de Quercetina
en los medios de almacenamiento tienen mayor movilidad, mayor porcentaje de integridad
de membrana plasmática y mayor contenido de ATP que aquellos espermatozoides
almacenados en diluyentes convencionales o suplementados con otros antioxidantes (87).
Considerando de igual manera que la peroxidación lipídica en el espermatozoide se genera
principalmente por estrés oxidativo, dicha peroxidación puede ser inhibida por Quercetina
en el medio, los diluyentes de almacenamiento o congelación para semen equino
suplementados con Quercetina, reducen la peroxidación lipídica del espermatozoide,
mantiene la concentración interna de ATP y previene la capacitación prematura de las
células espermáticas (88) de esta manera la presencia de Quercetina durante la
criopreservación mejora la movilidad y la habilidad de unión a la zona pelucida del semen
equino (21). En presencia de estrés oxidativo la Quercetina inhibe la peroxidación lipídica
29
y mejora la longevidad o esperanza de vida del espermatozoide equino (87)
Adicionalmente, la suplementación con Quercetina de semen fresco de cordero, inhibe
temporalmente la glicolisis, por lo tanto previene la acidificación y mejora el tiempo de vida
del espermatozoide (83).
Establecer la fuente principal de ATP para las funciones primordiales del espermatozoide
y en particular para la movilidad(89) ha sido muy rebatido y es debido principalmente a las
diferencias entre especies. El espermatozoide necesita abastecerse continuamente de ATP
para el movimiento flagelar y la transducción de señal a través de la fosforilación de
proteínas (90). Existen diferencias entre especies en cuanto a la generación de energía,
los espermatozoides de humano, ratón, cerdo y toro dependen de la glicólisis para la
producción de ATP, contrariamente se ha indicado que este no es el caso para los
espermatozoides equinos(91,92), donde la fosforilación oxidativa de la mitocondria es la
principal fuente de ATP. Por lo tanto la funcionalidad mitocondrial es especialmente
importante en los equinos en términos de la función espermática y la fertilidad debido a su
alta dependencia de la fosforilación oxidativa para la producción de ATP, por otra parte,
reproductores altamente fértiles expresan niveles mayores para la fosforilación
oxidativa(91).(93)
Las especies reactivas de oxígeno son subproductos de diversos procesos metabólicos y
ahora se reconocen como importantes reguladores de muchas funciones celulares. La
mitocondria se considera como la principal fuente de ERO en la mayoría de las células. El
ión Superóxido (O2 •) puede generarse en diferentes puntos dentro de la cadena
transportadora de electrones, por reducción de oxígeno, de forma espontánea o enzimática
reduciendo y oxidando al H2O2 (93).
Con base en los fundamentos anteriormente descritos, es posible validar los resultados
encontrados en esta investigación, afirmando la relación que existe entre la Quercetina y el
potencial de membrana mitocondrial, tal como se observa en la tabla 3, la concentración
de Quercetina 2.5 µM tuvo una incidencia mayor en el porcentaje de actividad mitocondrial
para este estudio. (Tabla 6). Muchos estudios demuestran que la integridad y actividad
mitocondrial regulan la mayoría de los procesos asociados a las características
espermáticas.
Si bien Quercetina no presento un mayor porcentaje de espermatozoides móviles, como
fue el caso de la vitamina E, se observó que en presencia del tratamiento (pajilla 0.5ml
Quercetina – 2.5 µM) tabla 7, si tiene un efecto interesante ya que los parámetros de
30
movilidad asociados a velocidad y progresividad (Velocidad rectilínea (VSL), % Spm
Progresivos (Pro), Amplitud lateral de la cabeza (ALH) ) fueron significativos para este
tratamiento, por lo tanto se podría pensar que si bien Quercetina no permitió recuperar un
porcentaje mayor de espermatozoides móviles, si permitió obtener espermatozoides más
veloces y progresivos post-descongelación.
En cuanto al tamaño de la pajilla por sí solo no tuvo un efecto significativo para ninguna de
las variables evaluadas, en asociación al antioxidante Quercetina (2.5 µM) se presentó un
efecto favorecedor de la pajilla 0.5 ml para las variables de movilidad Velocidad rectilínea
(VSL), % Spm Progresivos (Pro), Amplitud lateral de la cabeza (ALH) tabla 7, No se
reportan diferencias altamente significativas en las características espermáticas de semen
equino para los tamaños de pajillas 0.5 y 0.25 ml (18,94,95).
Sin embargo el empacado de semen equino en volúmenes pequeños (0.5 ml y 0.25 ml)
presenta mejores características seminales post-descongelación, debido a que permiten
una mayor proporción de la relación área de superficie / volumen, permitiendo que los
procesos de refrigeración, congelación, descongelación y calentamiento se lleven a cabo a
una velocidad más adecuada y uniforme que otros sistemas (18,96,97). Particularmente
para semen equino se utilizan con más regularidad las pajillas de 0.5 ml para los procesos
de congelación.
1.8 Conclusiones y recomendaciones
1.8.1 Conclusiones
En conclusión la suplementación con antioxidantes a los medios de criopreservación de
espermatozoides equinos mejora algunas características espermáticas post-
descongelación. El efecto protector de la vitamina E presenta un efecto positivo para los
parámetros de movilidad Velocidad media (VAP µm/s), Velocidad rectilínea (VSL µm/s),
Velocidad curvilínea VCL (µm/s), Amplitud lateral de la cabeza (ALH µm/s), Linearidad (%)
y aumenta el porcentaje de viatilidad post-descongelación en 2% superior al observado
para Quercetina; la interacción entre la pajilla de 0.25 ml y el antioxidante vitamina E tiende
a mejorar el porcentaje de espermatozoides móviles. La suplementación con Quercetina
favorece el potencial de membrana mitocondrial y presenta un efecto interesante en los
parámetros de movilidad asociados a velocidad y progresividad (Velocidad rectilínea
31
(VSL), % Spm Progresivos (Pro), Amplitud lateral de la cabeza (ALH)) específicamente en
el tratamiento pajilla 0.5ml - Quercetina – 2.5 µM. La suplementación con Quercetina
permite obtener espermatozoides más veloces y progresivos post-descongelación. Por otro
lado, el tamaño de la pajilla por sí solo, no presento un efecto contundente sobre las
características espermáticas del semen equino criopreservado, su asociación con el
antioxidante Quercetina presenta un efecto favorecedor para el tamaño de pajilla 0.5 ml en
algunos parámetros de movilidad.
Es importante tener en cuenta que aunque se observaron y pudieron determinar algunos
efectos significativos en cuanto a la suplementación con ambos antioxidantes y
tratamientos asociados, las variaciones (diferencias estadísticas significativas) entre ellos
son mínimas para las variables en donde se expresó la diferencia, por lo que la
interpretación de resultados puede considerarse de manera austera y no permite generar
conclusiones contundentes sobre un posible efecto biológico como la criotolerancia, ni
generalizar sobre interpretaciones biológicas. No fue posible establecer una relación entre
la suplementación de antioxidantes y el tipo de empaque sobre la criotolerancia
espermática, la alta variabilidad presentada por los reproductores juega un papel esencial.
1.8.2 Recomendaciones
Algunos aspectos de fisiología del espermatozoide y su respuesta a los procesos de
criopreservación permanecen sin ser elucidados y la profundización de estas
investigaciones puede aproximarnos más al conocimiento de los mecanismos que están
implicados en el criodaño durante el super-enfriamiento, congelación y descongelación.
Para próximos trabajos se recomienda establecer un protocolo de criopreservación
suplementando aquellos tratamientos que mostraron alguna diferencia particular haciendo
uso de un congelador programable controlando las variables de temperatura, tiempo y
curvas de enfriamiento.
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