Usar la estereología con garantías de que no morirás en el...

Sección de análisis de imagen-Servicio de apoyo a la investigación

Usar la estereologíacon garantías de que no morirás

en el intento (I)Introducción


Porque la estereología es una herramienta muy útil para relacionar morfología y función:

¿Por qué usar técnicas estereológicas? (I)

Número de nefronas en un riñón

• Volumen de un núcleo cerebral y número de neuronas contenidas en el mismo

Superficie de intercambio gaseoso en pulmón

Longitud de las raíces de una planta

y un largo etcétera....


¿Por qué usar técnicas estereológicas? (II)

Porque la estereología, por definición, evita hacer ciertas asunciones en los estudios morfológicos que nos podrían conducir a errores importantes.

Un caso real:

Al estimar el número de perfiles neuronales por unidad de área, se vio que este índice era mayor en los cerebros jóvenes que en los viejos. Conclusión: el número de neuronas disminuye con la edad.

Verdad verdadera:

En 1984, un estudio sobre la retracción del tejido cerebral demostró que los cerebros jóvenes se retraen más que los de individuos viejos.

Cuando esta diferencia se corrigió, se comprobó que la diferencia entre el número de neuronas entre individuos jóvenes y viejos es mínima.


Otro ejemplo:

Tratamos a ratas recién nacidas con un fármaco para ver como afecta al desarrollo renal en sus etapas tempranas. Para estimar el número de nefronas formadas se cuenta el número de glomérulos. ¿Qué ocurre si estimamos el número de glomérulos por área de corteza renal?


Es posible que nuestra estimación de número/área nos señale un mayor número de nefronas por área de corteza renal en tratados que en controles...pero, ¿y si a expensas de una reducción del volumen total de la corteza, hubiera mas glomérulos concentrados en un área pero el número final fuera el mismo e incluso menor?

En este caso, la premisa errónea de la que partimos es que el volumen de referencia es el mismo, al igual que en el caso anterior.

SIEMPRE DEBEMOS CONOCER EL VOLUMEN DE REFERENCIA DE LA ESTRUCTURA QUE VAMOS A ESTUDIAR


Densidad de volumenDensidad de superficieDensidad de longitudDensidad numérica

En estereología, los datos que obtenemos son de tipo ratio:



Algunos ejemplos de ratios y volúmenes:


Ratio Número absoluto Significación funcional

Volumen de islotes pancreáticos por

volumen de páncreas

Volumen total de islotes pancreáticos de una

persona

Capacidad de producir insulina

Densidad de superficie de intercambio gaseoso por

unidad de volumen de parénquima pulmonar

Superficie total de intercambio gaseoso

Capacidad de intercambio gaseoso del individuo

Número de nefronas por unidad de volumen de

corteza renal

Número de nefronas en el riñón de un individuo

Capacidad de filtración renal

Unbiased Stereology. Three Dimensional Measurement in MicroscopyC.V. Howard and M.G. Reed. 1998


¿Por qué usar técnicas estereológicas? (III)Porque nos ayuda a manejar el problema de que la fracción de muestreo aumente de forma no lineal con el aumento de la magnificación lineal

Magnificaciónlineal

Fracción aproximada de un objeto 2D en el

campo de observación

x1

1

x5 x25 x125 x625

1/47 1/1.200 1/30.000 1/730.000



Variabilidad inter-individual (biológica) 70%Variabilidad entre bloques 20%Variabilidad entre secciones 5%Variabilidad entre campos 3%Variabilidad entre medidas 2%

Variabilidad total observada 100%

Esto quiere decir que una forma de incrementar la precisión es tomar más individuos o más bloques por individuo. No sería aconsejable obtener muchas secciones por bloque o medir muchos campos del mismo porta.Los métodos en estereología son muy eficientes y de hecho, la norma es contar o medir sólo 200 puntos o intersecciones por animal.

¿Por qué usar técnicas estereológicas? (III)

Pese a que nuestro primer impulso al ver el esquema anterior sería pensar en medir muchísimos campos, hemos de tener en cuenta como contribuyen a la variabilidad los diferentes pasos del trabajo del morfólogo.



Pero...¡¿qué quieres decir con “sólo” 200 intersecciones por animal?!

La estereología implica el uso de plantillas, que dependiendo de su dimensión, nos ayudaran a estimar una magnitud u otra:

- Las plantillas de puntos estiman densidad de volumen- Las plantillas de líneas estiman densidad de superficie- Los planos estiman longitud- Los volúmenes estiman número

Las “intersecciones” son los puntos en los que nuestra estructura de interés “toca” nuestra plantilla. Un ejemplo...vamos a estimar la densidad de volumen de islotes pancreáticos respecto al total del páncreas de una rata.


Páncreas patatiforme

_ = El volumen desalojado es el volumen de nuestro páncreas patatiforme (1 ml. Si, me lo he inventado)

Un paso muy sencillo, tras la recogida de muestras….

…estimar el volumen por el principio de Arquímedes


70%

20%

5%

3%

Procesamos nuestro páncreas, recordando la variabilidad que aporta cada uno de los pasos.

Una vez tenemos los portas teñidos y montados, vamos al equipo de estereología de nuestra sección, el newCAST. Podemos ver nuestro porta de ejemplo en este enlace:

http://155.54.216.150/dih/webViewer.php?snapshotId=1316434882








En newCAST podemos hacer un preescaneo de nuestra sección


Y posteriormente, delimitar la región de interés donde vamos a llevar a cabo el muestreo


Nosotros mismos definimos nuestro muestro (en este caso, un 2% aprox.)

Como podemos observar, no usamos un muestreo muy exhaustivo, sino de pocos campos (4, como se ve en el navegador)


Podemos personalizar nuestras marcas

En cada uno de los campos, marcamos las veces que tocan los puntos el páncreas (P) y las veces que tocan las células de los islotes (I)

Con este botón avanzamos en las posiciones del muestreo


Para hacer el proceso más eficiente, usamos dos plantillas de puntos. La azul, con mayor área asociada al punto, sirve para estimar páncreas en general; la amarilla, con área asociada al punto menor, la usamos para marcar los islotes pancreáticos


Repetimos el proceso en todas las posiciones


La aplicación nos devuelve una hoja de datos con todos los detalles del muestreo

% de ROI muestreada

Área asociada al punto

Puntos de cada plantilla que han tocado la estructura de interés, su sumatorio y por posiciones de muestreo Este proceso lo repetiríamos con

más secciones de otros bloques, aunque vamos a hacer nuestros cálculos con este ejemplo


Área de páncreas: 123*9122=1122006 µm2

Área de islotes: 51*1282=65382 µm2

Densidad volumen islotes/páncreas=65382/1122006=0,06

SI EL VOLUMEN TOTAL DEL PÁNCREAS ES DE 1 ml, EL VOLUMEN TOTAL DE ISLOTES PANCREÁTICOS SERÁ DE 0,06 ml


Bibliografía

• Unbiased Stereology. Three Dimensional Measurement in MicroscopyC.V. Howard and M.G. Reed. 1998

• 'If you assume, you can make an ass out of u and me': a decade of the disector for stereological counting of particles in 3D space. T.M. Mayhew and H. J. Gundersen. J. Anat. 1996; 188:1-15.

• How much is there really? Why stereology is essential in lung morphometry. E.R. Weibel, C.C. W. Hsia and M. Ochs. J Appl Physiol. 2007; 102:459-67.

• The Art of Counting . K.M. Madsen. J Am Soc Nephrol. 1999; 10:1124-1125

• Design-based stereology in neuroscience. C. Schmitz and P.R. Hof. Neuroscience. 2005; 130:813-831


Y colorín colorado, esta presentación se ha terminado

Hasta la próxima…

(LA SECCIÓN DE ANÁLISIS DE IMAGEN PIDE PERDÓN AL PARTIDO ANTI-POWERPOINT)

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