Untersuchungen zu Übertragungswegen der Koi-Herpesvirose (KHV… · 2019. 1. 10. · 1. Gutachter:...

Tierärzliche Hochschule Hannover

Institut für Parasitologie, Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung

Untersuchungen zu Übertragungswegen der Koi-Herpesvirose (KHV) in

Wildfischen

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

-Doctor rerum naturalium-

(Dr. rer. nat.)

vorgelegt von

Marc Fabian

aus Hannover

Hannover 2015

Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. Dieter Steinhagen

Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung

Zentrum für Infektionsmedizin

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Dieter Steinhagen

2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. Georg Herrler

Tag der mündlichen Prüfung: 17.02.2016

Die Bearbeitung des Forschungsvorhabens erfolgte im Auftrag des Sächsischen Landesamts

für Umwelt, Landwirtschaft und Geologie. Das Vorhaben wurde aus Mitteln des

Europäischen Fischereifonds gemäß Verordnung (EG) 1198/2006 gefördert.

Für meine Familie

-In Liebe und Dankbarkeit-

Auf den Daten dieser Dissertation basierend wurden folgende Artikel in internationalen Fachzeitschriften publiziert: Fabian M, Baumer A, Steinhagen D. (2013) Do wild fish species contribute to the transmission of koi herpesvirus (KHV) to carp in hatchery ponds? Journal of Fish Diseases 36: 505-514 (DOI: 10.1111/jfd.12016) und

Fabian M, Baumer A, Adamek M, Steinhagen D. (2015) Short communication: Transmission of Cyprinid herpesvirus 3 by wild fish species - results from infection experiments. Journal of Fish Diseases (on-line, doi: 10.1111/jfd.12399)

Des Weiteren wurden Teile dieser Arbeit bereits in folgender Schriftenreihe veröffentlicht:

Füllner G, Steinhagen D, Baumer A, Fabian M, Runge M, Bräuer G, Böttcher K, Mohr K, Göbel S, Neumann E, Thiem A, Gahsche J, Striese M, Teufert S (2011) Untersuchung zu Infektionswegen der Koi-Herpesvirus-Erkrankung von Karpfen und Untersuchungen zur Auswirkung von KHV-Bekämpfungsmaßnahmen auf Ökonomie und Ökologie. Schriftenreihe: LfULG, Heft 34/2011, ISSN: 1867-2868

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG ................................................................................................... 19

2 LITERATURÜBERSICHT.............................................................................. 23

2.1 Charakterisierung des KHV ............................................................................ 23

2.1.1 Systematische Stellung........................................................................................ 23

2.1.2 Morphologie ........................................................................................................ 23

2.1.3 Molekulare Struktur ............................................................................................ 24

2.1.3.1 Genom.......................................................................................................................................... 24

2.1.3.2 Proteom........................................................................................................................................ 25

2.1.3.3 In vitro Replikation ...................................................................................................................... 25

2.2 Krankheitsmuster und Wirtsfaktoren ............................................................ 26

2.2.1 Pathogenese......................................................................................................... 26

2.2.2 Klinische Symptomatik ....................................................................................... 28

2.2.3 Empfänglichkeit .................................................................................................. 29

2.2.3.1 Übertragung und Vektoren........................................................................................................... 30

2.2.4 Wirtsspektrum ..................................................................................................... 31

2.2.5 Einfluss der Temperatur und Inkubationszeit .....................................................34

2.2.6 Latenz .................................................................................................................. 35

2.3 Geschichte, Verbreitung und Epidemiologie des KHV ................................. 36

2.3.1 Geschichte ........................................................................................................... 36

2.3.2 Globale Verbreitung............................................................................................ 37

2.3.3 Nationale Verbreitung......................................................................................... 38

2.3.4 Epidemiologie ..................................................................................................... 38

2.3.5 Molekulare Epidemiologie.................................................................................. 39

2.4 Therapie, Kontrolle und Prophylaxe............................................................... 40

2.5 Tenazität und Desinfektion .............................................................................. 41

2.6 Diagnostik von KHV......................................................................................... 42

2.6.1 PCR ..................................................................................................................... 43

2.6.2 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ............................................... 43

2.6.3 Zellkultur............................................................................................................. 44

2.6.4 Elektronenmikroskopie ....................................................................................... 45

2.7 Differentialdiagnose .......................................................................................... 45

2.8 Rechtslage .......................................................................................................... 45

3 MATERIAL UND METHODEN .................................................................... 47

3.1 Virus ................................................................................................................... 47

3.1.1 Herkunft .............................................................................................................. 47

3.1.2 Zellkultur............................................................................................................. 47

3.1.3 Virusvermehrung................................................................................................. 48

3.1.4 Virustitration ....................................................................................................... 48

3.2 Versuchstiere ..................................................................................................... 49

3.2.1 SPF-Fische .......................................................................................................... 49

3.2.2 Aufzucht und Haltung ......................................................................................... 50

3.2.3 Handling .............................................................................................................. 50

3.2.4 Narkose und Tötung............................................................................................ 50

3.2.5 Entnahme von Gewebeproben bei Karpfen ........................................................ 51

3.2.5.1 Gewebeproben für DNA-Extraktion ............................................................................................ 51

3.2.5.2 Gewebeproben für RNA-Extraktion ............................................................................................ 51

3.2.6 Laborinfektion zur Prüfung der Empfänglichkeit von Karpfen für das KHV .... 52

3.3 Wildfische........................................................................................................... 52

3.3.1 Fang und Transport von Wildfischen.................................................................. 52

3.3.2 Auswahl und Haltung von Wildfischen für die Laborinfektionsversuche.......... 53

3.3.3 Entnahme von Gewebeproben bei Wildfischen .................................................. 53

3.3.3.1 Gewebeproben für DNA-Extraktion ............................................................................................ 53

3.3.3.2 Gewebeproben für RNA-Extraktion ............................................................................................ 53

3.4 Felduntersuchungen.......................................................................................... 54

3.4.1 Arbeitsplan in der Feldstudie .............................................................................. 54

3.4.1.1 Wildfische aus der Biozönose der Teiche .................................................................................... 56

3.4.1.2 Wildfische aus Teichen mit akutem KHV-Geschehen................................................................. 57

3.4.1.3 Wildfische aus Ablaufgräben von Teichen mit akutem KHV-Geschehen................................... 57

3.4.1.4 Wildfische aus Teichen mit latentem KHV-Geschehen............................................................... 58 3.4.1.4.1 Kohabitation von Wildfischen aus latent infizierten Teichen mit SPF-Karpfen ........................................... 59 3.4.1.5 Wildfische aus Teich und Ablauf mit saniertem Bestand ............................................................ 60

3.5 Laborinfektion von Wildfischen ...................................................................... 61

3.5.1 Infektionsversuch 1 (Badinfektion)..................................................................... 61

3.5.2 Infektionsversuch 2 (Kohabitation)..................................................................... 63

3.6 Molekularbiologische Methoden...................................................................... 65

3.6.1 Zellkulturen ......................................................................................................... 65

3.6.2 Gewebeproben..................................................................................................... 65

3.6.3 DNA-Extraktion mittels QIAamp® DNA Mini-Kit (Qiagen, Hilden) ................ 65

3.6.4 RNA-Extraktion mittels peqGOLD TriFast Reagenz ......................................... 66

3.6.5 Reverse Transkription mittels Maxima™ Reverse Transcriptase....................... 68

3.6.6 Real-time PCR..................................................................................................... 69

3.6.6.1 SYBR Green real-time PCR zur relativen Quantifizierung für das Thymidinkinase-Gen

(ADAMEK et al. 2012) mittels Housekeeping Gene (FORLENZA et al. 2008)........................ 70

3.6.6.2 SYBR Green real-time RT-PCR zur Quantifizierung der KHV-Replikation unter Verwendung

des Thymidinkinase-Gens (ADAMEK et al. 2012) mit externem Standard ............................... 72

3.6.6.3 SYBR Green real-time RT-PCR zur Quantifizierung des Gens kodierend für das Major Capsid

Protein-Gen (ORF92) des KHV (ADAMEK et al. 2012) mit externem Standard zum Nachweis

einer KHV-Replikation ................................................................................................................ 73

3.6.6.4 SYBR Green real-time PCR zur Qualitätskontrolle der TaqMan real-time PCR nach GILAD et

al. (2004) mittels Capsid Triplex Protein-Gen (ORF72)............................................................. 73

3.6.7 Quantitative real-time PCR nach GILAD et al. (2004) zum Nachweis von KHV .

............................................................................................................................. 74

3.6.7.1 Berechnung der Kopienzahl des Plasmids, Erstellen der Standardkurve und Datenanalyse....... 76

3.6.8 Klonierung des PCR-Produktes für einen externen Standard ............................. 77

3.6.8.1 Endpunkt-PCR ............................................................................................................................. 77

3.6.8.2 Agarosegelelektrophorese und Aufreinigung der PCR-Produkte ................................................ 78

3.6.8.3 Vektor .......................................................................................................................................... 79

3.6.8.4 Ligation........................................................................................................................................ 80

3.6.8.5 Transformation............................................................................................................................. 80

3.6.8.6 Plasmidpräparation....................................................................................................................... 81

3.6.8.7 Plasmidverdau mit FastDigest® EcoRI (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) ................................. 82

3.6.8.8 Sequenzierung.............................................................................................................................. 82

3.7 Statistische Auswertung.................................................................................... 83

4 ERGEBNISSE ................................................................................................... 84

4.1 Methodik ............................................................................................................ 84

4.1.1 Quantitative real-time PCR nach GILAD et al. (2004) zum Nachweis von KHV .

............................................................................................................................. 84

4.1.1.1 Klonierung der KHV-Zielsequenz ............................................................................................... 84

4.1.1.2 Standardkurve für das KHV-Plasmid........................................................................................... 84

4.1.1.3 Sequenzierung.............................................................................................................................. 86

4.1.2 SYBR Green real-time PCR zur relativen Quantifizierung für das

Thymidinkinase-Gen (ADAMEK et al. 2012) mittels Housekeeping Gene

(FORLENZA et al. 2008).................................................................................... 86

4.1.3 SYBR Green real-time PCR zur Qualitätskontrolle der TaqMan real-time PCR

nach GILAD et al. (2004) mittels Capsid Triplex Protein-Gen (ORF72)........... 86

4.1.4 SYBR Green real-time RT-PCR zur Quantifizierung der KHV-Replikation unter

Verwendung des Thymidinkinase-Gens (ADAMEK et al. 2012) mit externen

Standard............................................................................................................... 87

4.1.4.1 Klonierung der Thymidinkinase-Zielsequenz .............................................................................. 87

4.1.4.2 Standardkurve für das Thymidinkinase-Plasmids........................................................................ 87

4.1.5 SYBR Green real-time RT-PCR zur Quantifizierung des Gens kodierend für das

Major Capsid Protein-Gen (ORF92) des KHV (ADAMEK et al. 2012) mit

externem Standard zum Nachweis einer KHV-Replikation ............................... 90

4.1.5.1 Klonierung der Major Capsid Protein-Zielsequenz...................................................................... 90

4.1.5.2 Standardkurve für das Major Capsid Protein-Plasmid ................................................................. 90

4.1.6 Laborinfektion zur Prüfung der Empfänglichkeit von Karpfen für das KHV .... 93

4.2 Ergebnisse der Felduntersuchungen ............................................................... 94

4.2.1 Proben aus Teichen mit akutem KHV-Geschehen............................................ 100

4.2.1.1 Pathologisch-anatomische Untersuchungen der den Teichen entnommenen Wildfische ......... 100

4.2.1.2 Molekularbiologische Untersuchungen...................................................................................... 100

4.2.2 Proben aus Ablaufgräben von Teichen mit akutem KHV-Geschehen.............. 102



4.2.3 Proben aus Teichen mit latentem KHV-Geschehen.......................................... 103



4.2.4 Kohabitation von Wildfischen aus Teichen mit latentem KHV-Geschehen..... 111

4.2.4.1 Pathologisch-anatomische Untersuchungen............................................................................... 111


4.2.5 Untersuchungen eines sanierten Teiches nach Besatz mit KHV-freier

Karpfenbrut ....................................................................................................... 112

4.2.5.1 Pathologisch-anatomische Untersuchung der Teichkarpfen und der Expositionskarpfen ........ 113


4.3 Ergebnisse der Laborinfektion ...................................................................... 114

4.3.1 Infektionsversuch 1 (Badinfektion)................................................................... 114

4.3.1.1 Pathologisch-anatomische und molekularbiologische Voruntersuchungen an kommerziell

erworbenen Wildfischen und an Expositionskarpfen................................................................. 114


4.3.2 Infektionsversuch 2 (Kohabitation)................................................................... 116

4.3.2.1 Pathologisch-anatomische und molekularbiologische Voruntersuchungen an kommerziell

erworbenen Wildfischen und Expositionskarpfen ..................................................................... 117


5 DISKUSSION .................................................................................................. 120

6 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................ 139

7 SUMMARY...................................................................................................... 141

8 LITERATURVERZEICHNIS ....................................................................... 143

9 DANKSAGUNG.............................................................................................. 158

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Aufbau der Badinfektion von Wildfischen in Laborversuch 1 .......................... 62

Abbildung 2: Probennahme an Tag 7 der Laborinfektion........................................................ 62

Abbildung 3: Infektion von SPF-Karpfen in Laborstudie 2..................................................... 64

Abbildung 4: Für die Klonierung des KHV-Amplifikates verwendeter Vektor pGEM®-T Easy

(Promega, Mannheim).............................................................................................................. 79

Abbildung 5: Amplifikationsplots aus der real-time PCR nach GILAD et al (2004) für eine

logarithmische (log10) Verdünnungsreihe des KHV-Plasmids (pGEM®-T Easy) wie unter

3.6.7.1 beschrieben................................................................................................................... 85

Abbildung 6: Quantifizierung von KHV-Genomkopien mittels Standardkurve. Dargestellt ist

die Korrelation der KHV-Plasmidkonzentration (pGEM®-T Easy) und den Schwellenwerten

(Ct) für die Anzahl an Amplifikationszyklen in der unter 3.6.7.1 beschriebenen real-time

PCR. Die Gleichung der Steigungsgeraden ist: Y = -3.296 x LOG(X) + 39,76...................... 85

Abbildung 7: Amplifikationsplots der RT-PCR für das Thymidinkinase-Gen nach ADAMEK

et al. (2012) für eine logarithmische (log10) Verdünnungsreihe des Thymidinkinase-Plasmids

(pGEM®-T Easy) wie unter 3.6.6.2 beschrieben..................................................................... 88

Abbildung 8: Quantifizierung von Thymidinkinase-Genomkopien mittels Standardkurve.

Dargestellt ist die Korrelation der Thymidinkinase-Plasmidkonzentration (pGEM®-T Easy)

und den Schwellenwerten (Ct) für die Anzahl an Amplifikationszyklen in der unter 3.6.6.2

beschriebenen real-time RT-PCR. Die Gleichung der Steigungsgeraden ist: Y = -3.401 x

LOG(X) + 36.94....................................................................................................................... 88

Abbildung 9: Dissoziationskurve zur Qualitätskontrolle der quantitativen real-time PCR mit

SYBR Green nach ADAMEK et al. (2012) zum Nachweis einer KHV-Replikation.............. 89

Abbildung 10: Amplifikationsplots der RT-PCR für das Major Capsid Protein-Gen (ORF92)

nach ADAMEK et al. (2012) für eine logarithmische (log10) Verdünnungsreihe des Major

Capsid Protein-Plasmids (pGEM®-T Easy) wie unter 3.6.6.3 beschrieben. ........................... 91

Abbildung 11: Quantifizierung von Major Capsid Protein-Genomkopien mittels

Standardkurve. Dargestellt ist die Korrelation der Major Capsid Protein-Plasmidkonzentration

(pGEM®-T Easy) und den Schwellenwerten (Ct) für die Anzahl an Amplifikationszyklen in

der unter 3.6.6.3 beschriebenen real-time RT-PCR. Die Gleichung der Steigungsgeraden ist:

Y = -3.283 x LOG(X) + 34.77 ................................................................................................. 91

Abbildung 12: Dissoziationskurve zur Qualitätskontrolle der quantitativen real-time PCR mit

SYBR Green nach ADAMEK et al. (2012) zum Nachweis einer KHV-Replikation.............. 92

Abbildung 13: KHV infizierte Karpfen mit akuter Symptomatik. Konfluierende

Schleimhautläsionen mit „Sandpapier“-artiger Textur und Hämorrhagien (dargestellt durch

Pfeile) ....................................................................................................................................... 93

Abbildung 14: Prozentuales Vorkommen von Wildfischen aus Teichen mit einem Besatz von

akut an der KHV-Infektion erkrankten Karpfen ...................................................................... 97

Abbildung 15: Prozentuales Vorkommen von Wildfischen aus Teichen mit einem Besatz von

latent mit KHV infizierten Karpfen ......................................................................................... 98

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Taxonomie des KHV............................................................................................... 23

Tabelle 2: Bestandteile Kulturmedium CCB-Zellen................................................................ 47

Tabelle 3: Übersicht der Probennahmen bei Karpfenteichen mit akutem KHV-Geschehen... 55

Tabelle 4: Übersicht der Probennahmen bei Karpfenteichen mit latentem KHV-Geschehen. 55

Tabelle 5: Übersicht der Probennahmen bei einem sanierten Karpfenteich ............................ 55

Tabelle 6: Gesamtzahl beprobter Wildfische unterschiedlicher Arten aus sächsischen

Karpfenteichwirtschaften, die auf KHV spezifische DNA-Sequenzen untersucht wurden..... 56

Tabelle 7: Probenumfang aus Ablaufgräben von Teichen mit akutem KHV-Geschehen ....... 58

Tabelle 8: Probenumfang aus Teichen mit latent infiziertem Karpfenbesatz und

Kohabitationskarpfen ............................................................................................................... 59

Tabelle 9: Probenumfang sanierter Teich und Ablaufgraben mit Kohabitationskarpfen ........ 60

Tabelle 10: Verwendete Fischarten in Laborinfektion 1.......................................................... 63

Tabelle 11: Verwendete Fischarten in Laborinfektion 2.......................................................... 64

Tabelle 12: Reaktionsmix für die Reverse Transkription DNase I Verdau ............................. 68

Tabelle 13: Reaktionsmix für die Reverse Transkriptase ........................................................ 69

Tabelle 14: Temperaturprofil für die reverse Transkriptase .................................................... 69

Tabelle 15: Primersequenzen des von FORLENZA et al. (2008) beschriebenen 40S

Ribosomal Protein S11 Housekeeping Gene ........................................................................... 71

Tabelle 16: Primersequenzen für den Nachweis einer KHV-Replikation mittels

Thymidinkinase-Gen (ADAMEK et al. 2012) ......................................................................... 71

Tabelle 17: Pipettierschema für die SYBR Green real-time PCR mit Primersequenzen für das

Thymidinkinase-Gen zur relativen Quantifizierung (ADAMEK et al. 2012) ......................... 71

Tabelle 18: Temperaturprofil für die SYBR Green real-time für das Thymidinkinase-Gen

(ADAMEK et al. 2012)............................................................................................................ 71

Tabelle 19: Pipettierschema für die SYBR Green real-time RT-PCR zur Amplifikation des

Thymidinkinase-Gens zur Quantifizierung der KHV-Replikation (ADAMEK et al 2012) .... 72

Tabelle 20: Primersequenzen für den Nachweis einer KHV-Replikation mittels Major Capsid

Protein-Gen (ORF92) (ADAMEK et al. 2012) ........................................................................ 73

Tabelle 21: Primersequenzen für den Nachweis einer KHV-Replikation mittels Capsid

Triplex Protein-Gen (ORF72) (ADAMEK et al. 2012) ........................................................... 74

Tabelle 22: Primer- und Sondensequenzen die in der TaqMan real-time PCR nach GILAD et

al. (2004) zur Detektion des KHV und zur Qualitätskontrolle der Reaktion verwendet wurden

.................................................................................................................................................. 75

Tabelle 23: Zusammensetzung des Reaktionsansatzes für die real-time PCR nach GILAD et

al. (2004) zum Nachweis von KHV......................................................................................... 75

Tabelle 24: PCR-Programm für die real-time PCR nach GILAD et al. (2004) zum Nachweis

von KHV .................................................................................................................................. 75

Tabelle 25: Primer für den Nachweis des KHV-Genoms nach GILAD (2004) ...................... 77

Tabelle 26: Zusammensetzung des Reaktionsansatzes für die PCR zum KHV-Nachweis ..... 78

Tabelle 27: Touchdown-PCR-Programm für die Endpunkt-PCR nach GILAD et al. (2004) . 78

Tabelle 28: Zusammensetzung der Reaktionskomponenten für Ligationsansatz .................... 80

Tabelle 29: Reaktionsansatz für die Restriktionsverdau des Plasmids .................................... 82

Tabelle 30: Probenumfang der gefangenen Wildfischarten aus sächsischen

Karpfenteichwirtschaften, die auf KHV spezifische DNA-Sequenzen untersucht wurden und

der Bereich der nachgewiesenen Kopienzahl an KHV-Genomsequenzen (sanierter Teich hier

nicht berücksichtigt). ................................................................................................................ 95

Tabelle 31: Quantitativer Nachweis von KHV-Genomsequenzen in Organen von Wildfischen

und Karpfen aus Teichen und deren Ablauf mit Besatz von akut an einer KHV-Infektion

erkrankten Karpfen................................................................................................................. 100

Tabelle 32: Nachweis von KHV-Genomsequenzen in Organen von Wildfischen aus

Ablaufgräben von Teichen aus sächsischen Teichwirtschaften mit Besatz von akut mit KHV

infizierten Karpfen ................................................................................................................. 102

Tabelle 33: Nachweis von KHV-Genomsequenzen in Organen von Wildfischen und Karpfen

aus Teichen und Ablaufgräben aus sächsischen Teichwirtschaften mit Besatz mit latent mit

KHV infizierten Karpfen........................................................................................................ 104

Tabelle 34: Anzahl der KHV-Genomäquivalente in Proben von Wildfischen aus Teichen mit

latentem KHV-Geschehen in Abhängigkeit von der Wassertemperatur zum Zeitpunkt der

Probennahme.......................................................................................................................... 106


latentem KHV-Geschehen in Abhängigkeit vom Besatz der Teiche mit Karpfen

unterschiedlichen Alters......................................................................................................... 108


latentem KHV-Geschehen in Abhängigkeit des Jahres in dem sich der akute Ausbruch der

KHVD ereignete..................................................................................................................... 109

Tabelle 37: Nachweis von KHV-Genomsequenzen in den Organen von SPF-Karpfen nach

Kohabitation mit Wildfischen aus Teichen mit Besatz von latent mit KHV infizierten

Karpfen................................................................................................................................... 111

Tabelle 38: Anzahl der KHV-Genomäquivalente in Proben von Wildfischen und mit diesen

kohabitierten SPF-Karpfen aus dem sanierten Teich und dessen Ablaufgraben ................... 113

Tabelle 39: Anzahl der mittels TaqMan real-time PCR nach GILAD et al. (2004) ermittelten

KHV-Genomäquivalente in Proben von im Labor über das Bad infizierten Wildfischarten, mit

diesen kohabitierten SPF-Karpfen und Karpfen der Infektionskontrolle............................... 116

Tabelle 40: Anzahl der mittels TaqMan real-time PCR nach GILAD et al. (2004) ermittelten

KHV-Genomäquivalente in Proben von Wildfischen, die mit akut an einer KHV-Infektion

erkrankten Karpfen kohabitiert wurden, sowie deren Infektionskontrolle und im

Infektionswasser inkubierten SPF-Karpfen ........................................................................... 119

Abkürzungsverzeichnis

% Prozent

°C Grad Celsius

+ KHV-PCR positiv

- KHV-PCR negativ

Abb. Abbildung

AlCl ₂ Aluminiumchlorid

A. dest. Aqua destillatum Destilliertes Wasser

Au Goldfischflossen Zelllinie

AW Ablaufwasser

bp Basenpaare

bzw. beziehungsweise

ca. circa

CCB Common Carp Brain Zelllinie

CCG Common Carp Gill Zelllinie

CCO Channel Catfish Ovary Zelllinie

CCV Channel Catfish Virus

cDNA komplementäre DNA

CHSE Königslachs Embryo Zelllinie

cm Zentimeter

Ct-Wert Cycle Treshold (Schwellenwert)

CPE cytopathogener Effekt

CyHV-1 Cyprinides Herpesvirus-1, Herpesvirus cyprini,

Virus der Karpfenpocken

CyHV-2 Cyprinides Herpesvirus-2, Virus der

hämatopoetischen Nekrose der Goldfische

CyHV-3 Cyprinides Herpesvirus-3, Koi-Herpesvirus

DEPC Diethylpyrocarbonat

DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)

dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat

EBV Eppstein-Barr-Virus, Virus des Pfeifferschen

Drüsenfiebers

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EHNV Epizootische Hämatopoetische Nekrosevirus

EK Expositionskarpfen (SPF-Karpfen, in 20l

Ablaufwasser gehalten, welches aus dem

Ablaufgraben entnommen wurde)

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

et al. et alii (und andere)

Fa. Firma

FHM Fathead minnow-Zelllinie

FRET Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer

g Gramm

g Erdbeschleunigung

HPLC-Wasser High Performance Liquid Chromatography,

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-

Wasser

HSV-1 Herpes simplex Virus -1

IBR Bovine Rhinotracheitis

IFAT Immunofluorescent antibody test

IHN Infektiöse Hämatopoetische Nekrose

ISH In situ hybridization

i.p. intraperitoneal

kbp Kilobasenpaare

K0 Karpfenbrut

K v vorgestreckte Karpfenbrut

K1 einsömmrige Karpfen

K2 zweisömmrige Karpfen

K3 dreisömmrige Karpfen

KF-1 Koi-Fin-1-Zelllinie

KHV Koi-Herpesvirus

KHVD Koi-Herpesvirus Erkrankung

KID ₂₄ Zellkultur-infektiöse Dosis

K.I.S.S. Koi Immune System Suppressing Disease

l Liter

lat. Lateinisch

LAMP Loop Mediated Isothermal Amplification

LC-MS/MS Liquid Chromatography Tandem Mass

Spectrometry

LB-Agar-Platten lysogeny broth-Agar-Platten

max. Maximum

MEM Minimal Essential Medium

MgCl ₂ Magnesiumchlorid

min. Minimum

min Minute(n)

mg Milligramm

ml Milliliter

mM millimolar

mRNA messenger-ribonucleic-acid

(Boten-Ribonukleinsäure)

MS 222 Tricaine Methanesulfonate 222

NaCl Natriumchlorid

ng Nanogramm

nm Nanometer

n.u. nicht untersucht

µl Mikroliter

µg Mikrogramm

OD optische Dichte

OIE Organisation for Animal Health

ORF Open Reading Frame

p. appl. post applicationem

PBS phosphate buffered saline (Phosphatpuffer)

PCR Polymerase-Chain-Reaction

p.i. post infectionem

pmol pikomol

rel. relativ(e)

RSIVD Red Sea Bream Iridovirus

RTG-2 Regenbogenforellen Gonaden-Zellinie

s Standardabweichung

s. siehe

s.o. siehe oben

SDS sodium dodecyl sulfate

SNT Neutralisationstest

sec Sekunden

sp. Spezies

SPF spezifisch-pathogen-frei

ssp. Subspezies

SVC Frühlingsvirämie der Karpfen

t Tonne, Einheitenname, 1t=103 kg

Tab. Tabelle

TBE TRIS-Borat-EDTA

TCID Tissue Culture Infectious Dosis

TK Teichkarpfen

Tol/FL Silberkarpfenflossen Zelllinie

TW Teichwasser

u. und

U Unit(s) (Einheit(en))

UV Ultraviolett

V Volt

VHS Virale Hämorrhagische Septikämie

WP Wasserprobe

Einleitung 19

1 Einleitung

Das Koi-Herpesvirus (KHV) auch bekannt als Cyprinides Herpresvirus-3 (CyHV-3) infiziert

Karpfen und Koi-Zuchtformen (Cyprinus carpio). Die durch das Virus verursachte Koi-

Herpesvirose stellt eine virulente und hochkontagiöse Krankheit dar, doch beschränkt sich das

Krankheitsgeschehen mit Morbidität und Mortalität auf die Spezies Cyprinus carpio und

wurde bislang nur in Koi- und Speisekarpfenpopulationen in der Karpfenteichwirtschaft und

in Wildbeständen beobachtet (ARIAV et al. 1999; BRETZINGER et al. 1999; WALSTER

1999; GARVER et al. 2010). Erste mit dieser Erkrankung in Zusammenhang gebrachte

Verluste wurden in Israel und den USA beobachtet (HEDRICK et al. 2000). Seitdem hat sich

das KHV durch den unkontrollierten, internationalen Handel mit Zierkarpfen weltweit

verbreitet und beeinträchtigt mittlerweile ernsthaft den Handel mit Koi und die Produktion

von Speisekarpfen für den menschlichen Konsum (PIKARSKY et al. 2004). Durch intensive

und unkontrollierte Fischtransporte breitete sich die Infektion mit KHV im Folgenden rasant

schnell in Karpfenpopulationen aus. Verluste wurden daraufhin in vielen Ländern

dokumentiert und beschrieben. Gegen Ende des Jahres 2000 waren zum Bespiel in Israel

90 % der Karpfenbestände mit KHV infiziert. Diesem Umstand geschuldet machte die

israelische Aquakulturindustrie Verluste in Höhe von 300 Millionen Dollar jährlich

(PERELBERG et al. 2003). Eine großflächige Ausbreitung der Infektion und hohe

ökonomische Verluste, die mit der Infektion assoziiert waren, konnten auch in verschiedenen

Regionen im Osten Deutschlands beobachtet werden. Im Jahre 2004 berichtete beispielsweise

ein karpfenteichwirtschaftliches Unternehmen aus Thüringen über einen durch KHV

verursachten Verlust von 80 t Karpfen mit einem direkten Schaden von 310.000 Euro und

weiteren Folgeschäden in Höhe von 106.000 Euro (BOCKLISCH et al. 2006).

Um geeignete Schutzmaßnahmen für wertvolle Karpfenpopulationen gegen die Infektion mit

KHV zu entwickeln, müssen alle potentiellen Übertragungswege, durch die naive

Populationen in Kontakt mit dem Virus kommen können, analysiert und bewertet werden.

Neben infizierten Karpfen gibt es mehrere potentielle Vektoren, die an einer Übertragung der

Infektion beteiligt sein könnten.

Einleitung 20

Solche Vektoren sind unter anderem das Teichwirtschaftspersonal, die teichwirtschaftlich

genutzte Ausrüstung, verschiedene Wasserpflanzen und Tiere, einschließlich Amphibien und

Vögel. Insbesondere fischfressende Vögel, wie Reiher und Kormorane, werden in Betracht

gezogen an der Verbreitung von KHV maßgeblich beteiligt zu sein (MATSUI et al. 2008).

Ein anderer wichtiger Vektor ist sicherlich das Wasser, insbesondere das Ablaufwasser,

welches aus Teichen mit KHV-infizierten Karpfenpopulationen stammt. Das Absenken des

Wasserspiegels der Teiche und das Sammeln der Fische in der Fischgrube, während des

Befischungsprozesses im Frühjahr und im Herbst, wurde als geeigneter Stressor für Karpfen

betrachtet eine latente KHV-Infektion zu reaktivieren und außerdem eine erneute, intensive

Ausschüttung von Viruspartikeln zu induzieren (MEYER 2007b; BAUMER 2011). Im Zuge

von Studien zur Umweltüberwachung, die in japanischen Flüssen zum Vorkommen von KHV

durchgeführt wurden, konnten Viruspartikel über das ganze Jahr hinweg im Wasser detektiert

werden (MINAMOTO et al. 2009a; MINAMOTO et al. 2009b). Weiterhin wurde aufgezeigt,

dass auch Ablaufwasser von verschiedenen infizierten Standorten KHV-Partikel enthielt.

Als weitere potentielle Vektoren der Infektion könnten Individuen verschiedener

Wildfischarten in Frage kommen, die in Zuchtanlagen oder Ablaufkanäle von

Teichwirtschaftsbetrieben migrieren.

Erste Untersuchungen indizierten, dass das Wirtsspektrum von KHV auf Karpfen begrenzt zu

sein scheint, weil Vertreter der Wildfischarten, welche im Labor infiziert wurden oder mit

Virus ausschüttenden Karpfen kohabitiert wurden, bei permissiven Temperaturen keine

klinischen Symptome einer KHVD oder Mortalität zeigten (ARIAV et al. 1999; WALSTER

1999; RONEN et al. 2003; PIKARSKY et al. 2004). Des Weiteren konnten auch unter

Feldbedingungen, während Phasen akuter Ausbrüche der KHVD, keine deutlichen Anzeichen

einer klinischen Erkrankung oder Mortalität bei Individuen anderer Arten als Karpfen

beobachtet werden (HOFFMANN et al. 2000). Anschließende Studien zeigten jedoch, dass

KHV-spezifische Genomabschnitte mittels PCR in Geweben von Goldfischen (Carassius

auratus auratus) gefunden werden konnten, die mit infizierten Koi zusammen gehältert

wurden (EL-MATBOULI et al. 2007; SADLER et al. 2008). Überdies wurden auch Störe in

Aquakulturanlagen, die in Karpfenteichwirtschaften mit einer KHVD-Historie kultiviert

wurden, positiv mittels PCR auf KHV-Genomsequenzen getestet (KEMPTER et al. 2009).

Einleitung 21

Diesen Beobachtungen zufolge wurde das Konzept der vorliegenden Studie erarbeitet, welche

sich schwerpunktmäßig mit der Rolle der in der Karpfenteichwirtschaft vorkommenden

Wildfischarten bei der Verbreitung der KHV-Infektion unter Feldbedingungen

auseinandersetzt. In der vorliegenden Arbeit soll abgeklärt werden, inwiefern Wildfische aus

Karpfenteichen an der Verbreitung der KHV-Infektion beteiligt sind und inwiefern sie ein

epidemiologisches Risiko darstellen.

Karpfenteichgebiete in Bayern und der Lausitz im Freistaat Sachsen sind dadurch

charakterisiert, dass die Einzelteiche meist miteinander verknüpft sind und sich in enger

Nachbarschaft zueinander befinden, sodass ein breites Spektrum an Wildfischen dazu befähigt

ist sich zwischen einer Vielzahl an Teichen eines Systems frei zu bewegen. Die sächsische

Oberlausitzer Heide- und Teichlandschaft mit über 335 Teichen stellt das größte für die

Karpfenzucht wirtschaftlich genutzte Teichgebiet Europas dar. Erste mit der Koi-

Herpesvirose in Zusammenhang gebrachte Verluste wurden im Jahre 2002 diagnostiziert. Seit

diesem Jahr hat sich die Anzahl der betroffenen Betriebe von drei auf 26 erhöht (BÖTTCHER

et al. 2009). Die Erkrankung nimmt zumeist einen seuchenhaften Verlauf und erfasst ganze

Teichgruppen einzelner Betriebe und verursachte seit Beginn der KHV-Problematik einen

wirtschaftlichen Gesamtschaden von mehreren Millionen Euro und gefährdet laut

Sächsischem Landesamt für Umwelt, Landwirtschaft und Geologie die Wirtschaftlichkeit der

sächsischen Teichwirtschaft.

Um das Risiko einer KHV-Verbreitung durch Wildfische abschätzen zu können, wurden in

der vorliegenden Arbeit zuerst Methoden etabliert, um quantitativ die Viruslast in Geweben

von Wildfischen bestimmen sowie eine potentielle Virusvermehrung erfassen zu können.

Daraufhin wurden diverse Vertreter der Cypriniden sowie auch andere häufig vorkommende

Wildfischarten zu verschiedenen Zeitpunkten aus der Teichbiozönose entnommen. Zum einen

fanden diese Probennahmen im Sommer an Teichen statt, die mit akut an einer KHV-

Infektion erkrankten Karpfen besetzt waren. Zum anderen wurden diese während der

Befischung im Frühjahr oder Herbst an Teichen mit latent infizierten Karpfenbeständen sowie

an einem zuvor mit Branntkalk sanierten Teich durchgeführt. Die entnommenen Fische

wurden in Hälterungsbecken mit naiven Karpfen kohabitiert und anschließend auf das

Vorhandensein von KHV-Genomsequenzen untersucht. Darauf basierend wurden im Labor

Einleitung 22

häufig in der Teichbiozönose vorkommende Arten mit KHV infiziert und hinsichtlich ihrer

Empfänglichkeit und einer potentiellen Virusvermehrung in ihren Geweben untersucht.

Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war eine abschließende Aussage über die

epidemiologische Relevanz von Wildfischen für die Verbreitung des Koi-Herpresvirus

(KHV) in der sächsischen Karpfenteichwirtschaft zu generieren. Dies beinhaltete die

Beantwortung folgender Fragen:

• Welche Fischarten kommen in den Teichwirtschaften überhaupt vor?

• In welchen Fischarten können KHV-Genomsequenzen nachgewiesen werden?

• Welchen Einfluss haben die Faktoren Jahreszeit, Wassertemperatur, Altersklasse und Infektionsstatus des Karpfenbestandes auf die Infektion mit KHV bei Wildfischen?

• Können Wildfische aus der Teichbiozönose naive Karpfen mit KHV infizieren?

• Wie groß ist die Rolle der Wildfische bei der Verbreitung der KHV-Infektion?

• Findet eine Virusvermehrung in den Geweben von Wildfischen statt?

• Hat diese eine Relevanz für die Verbreitung der Infektion bei Karpfen?

• Können sie eine klinische Erkrankung bei Karpfen induzieren?

• Ist eine Sanierung von KHV- kontaminierten Teichen im Rahmen eines Koi-Herpesvirus-Tilgungsprogramms möglich?

Literaturverzeichnis 23

2 Literaturübersicht

2.1 Charakterisierung des KHV

2.1.1 Systematische Stellung

Das Koi-Herpesvirus (KHV, CyHV-3) ist ein Mitglied der Ordnung Herpesvirales und wird

nach neuesten Erkenntnissen systematisch der Familie der Alloherpesviridae zugeordnet

(DAVISON et al. 2009; WALTZEK et al. 2009), welche mit Vertretern der Familie

Herpesviridae eng verwandt sind, taxonomisch aber mittlerweile isoliert betrachtet werden.

Vertreter der Alloherpesviridae infizieren Fische und Amphibien, wohingegen Reptilien,

Vögel und Säugetiere das Wirtsspektrum der Vertreter der Herpesviridae darstellen

(MCGEOCH et al. 2006; WALTZEK et al. 2009). Phylogentischen Analysen spezifischer

Gene zufolge unterteilt sich die Familie der Alloherpesviridae in zwei Gruppen. Die erste

Gruppe umfasst die Gattung Cyprinivirus, welche aus den cypriniden Herpesviren 1,2 und 3

(CyHV1, 2, 3) sowie dem anguilliden Herpesvirus (AngHV1) besteht, die mit Genomen von

245–295 kb innerhalb der Ordnung Herpesvirales die größten Vertreter darstellen. In der

zweiten Gruppe befinden sich ictaluride, salmonide, acipenseride und ranide Herpesviren

(WALTZEK et al. 2009; MICHEL et al. 2010a) mit kleineren Genomen (134–235 kb).

Tabelle 1: Taxonomie des KHV

Systematik Doppelsträngige DNA-Viren

(dsDNA: double stranded DNA) Größe Morphologie Ordnung Herpesvirales Familie Alloherpesviridae Gattung Cyprinivirus

Art Cyprinides Herpesvirus-3 279 kb Ikosaedrisches Kapsid

2.1.2 Morphologie

Das KHV ist strukturell ein typischer Vertreter der Ordnung Herpesvirales. Das Genom

befindet sich in einem ikosaedrischen Nucleokapsid, welches einen Durchmesser von


100-110 nm aufweist und besteht aus einem einzelnen, linearen, doppelsträngigen DNA-

Molekül (HEDRICK et al. 2000; HOFFMANN 2001; PERELBERG et al. 2003; RONEN et

al. 2003). Der Durchmesser des gesamten Viruspartikels beträgt 170–200 nm (HEDRICK et

al. 2000; NEUKIRCH u. KUNZ 2001; HEDRICK et al. 2005) und mit einem Genom von 295

kb stellt es den größten Vertreter der Ordnung Herpesvirales dar (AOKI et al. 2007). Das

Kapsid ist mit einer wässrigen Proteinmatrix bedeckt, die als Tegument bezeichnet wird und

welche ihrerseits von einer aus der Trans-Golgi-Membran der Wirtszelle hergestellten

Lipidhülle umgeben wird (METTENLEITER et al. 2009).

2.1.3 Molekulare Struktur

2.1.3.1 Genom

Das Genom des KHV ist ein 295 kb großes, lineares, doppelsträngiges DNA-Molekül

bestehend aus einem umfangreichen Mittelabschnitt flankiert von zwei 22 kb

Wiederholungsregionen (AOKI et al. 2007; MICHEL et al. 2010a). Die Größe des Genoms ist

vergleichbar mit dem des CyHV-1. Die Cypriniden Herpesviren stellen die größten Vertreter

der Ordnung Herpesvirales dar, während andere Angehörige dieser Ordnung Genomgrößen

zwischen 125–240 kb aufweisen. Das Genom des CyHV-3 kodiert 156 potentielle, für

Proteine kodierende offene Leserahmen (ORFs), welche auch acht ORFs beinhalten, die von

den Wiederholungsregionen kodiert werden. Diese sind permanent in Form von zwei Kopien

im Genom zugegen (AOKI et al. 2007). Es wurden bisher fünf weitere Familien mit

verwandten Genen beschrieben. Hierzu gehören der ORF2, der Tumor Necrosis Factor

Receptor, ORF22 und 25 sowie die RING-Familien (MICHEL et al. 2010a).

In der Familie Alloherpesviridae ist das anguillide Herpesvirus 1 der engste Verwandte des

Koi-Herpesvirus, der bislang sequenziert wurde (VAN BEURDEN et al. 2010). Beide Viren

besitzen 40 ORFs, die erhebliche Ähnlichkeiten aufweisen.


Bislang wurden drei unterschiedliche und nicht verwandte Virusstämme sequenziert (AOKI et

al. 2007). Hierzu gehören die Isolate aus Isreal (CyHV-3 I), Japan (CyHV-3 J) und aus den

USA (CyHV-3 U). Trotz der großen Distanz ihres geographischen Ursprungs herrscht unter

ihnen eine hohe Sequenzgleichheit. Eine nur geringe Diversität unter den jeweiligen

Virusstämmen scheint für das KHV charakteristisch zu sein (KURITA et al. 2009).

2.1.3.2 Proteom

Eine strukturelle Analyse des KHV-Proteoms erfolgte mittels LC-MS/MS (MICHEL et al.

2010b). Beschrieben wurden insgesamt 40 Strukturproteine, die sich in drei Kapsid-, 13 Hüll-,

zwei Tegument- und 22 unklassifizierte Proteine aufgliedern. Das Genom des CyHV-3 besitzt

30 potentielle Transmembran kodierte ORFs (AOKI et al. 2007). Allerdings wurde bislang

einzig das ORF81, welches für ein auf der Virushülle exprimiertes Typ 3 Membranprotein

kodiert (ROSENKRANZ et al. 2008; MICHEL et al. 2010b), untersucht. Es wird

angenommen, dass ORF81 eines der wichtigsten immunogenetischen Membranproteine ist.

2.1.3.3 In vitro Replikation

Die Kultivierung des KHV erfolgt zumeist auf den Zelllinien KF-1, CCB und CCG. Andere

Zelllinien wurden getestet, erwiesen sich aber als nicht permissiv für eine Infektion

(HEDRICK et al. 2000; NEUKIRCH u. KUNZ 2001; OH et al. 2001; PERELBERG et al.

2003; DAVIDOVICH et al. 2007). Mittels Elektronenmikroskopie konnte der

Replikationszyklus des KHV anschaulich untersucht werden (METTENLEITER et al. 2009).

Bei Betrachtung der morphologischen Veränderungen im Verlauf der Replikation kann ein

für die Familie Herpesviridae ähnliches Muster wiedererkannt werden.

Eine optimale Virusvermehrung in Zellkulturen ist auf Temperaturen zwischen 15 °C und

25 °C beschränkt. Eine Vermehrung und Transkription viraler Gene ist in vitro bei

Temperaturen über 30 °C nicht mehr zu beobachten. Obwohl unter diesen Umständen keine

Virusreplikation mehr detektierbar ist, kann in infizierten Zellkulturen die über 30 Tage bei


30 °C inkubiert wurden jedoch nach einer Erniedrigung der Temperatur wieder replizierendes

Virus beobachtet werden (DAVIDOVICH et al. 2007).

2.2 Krankheitsmuster und Wirtsfaktoren

2.2.1 Pathogenese

Bezüglich der Eintrittspforte des Virus in den Organismus und des Mechanismus der

Virusausbreitung werden in der Literatur verschiedene Modelle vorgeschlagen und es herrscht

unter einer Vielzahl an Wissenschaftlern stetige Uneinigkeit. Das KHV konnte während der

Infektion in Schleim, Haut, Kieme, Niere und Milz detektiert werden. Außerdem erfolgte ein

Virusnachweis in Darm, Leber, Gehirn sowie in Blut (GILAD et al. 2004; PIKARSKY et al.

2004). Auf Grund der Verteilung der Viruslast im Fisch und der beobachteten

Krankheitssymptome wurde ein Tropismus zur Haut, den respiratorischen Organen und dem

Nervensystem angenommen (GILAD et al. 2004). Die Frage wie sich das Virus Zugang zum

Wirtsorganismus verschafft ist weiterhin nicht eindeutig geklärt. Anfangs wurde das

Kiemenepithel als primäre Eintrittspforte angenommen, da hier hohe Viruskonzentrationen

und nekrotische Veränderungen im Verlauf der Pathogenese beobachtet wurden. Eine weitere

Verbreitung erfolgte dann in den Leukozyten des Blutes zur Niere (DISHON et al. 2005).

Repliziertes Virus wird den Autoren zufolge ebenfalls durch die Kiemen an das

Umgebungswasser abgegeben (PIKARSKY et al. 2004). In anderen Studien wurden ebenfalls

das Darmgewebe und die Haut als primäre Eintrittspforten thematisiert. Die Becherzellen

könnten hier der Virusvermehrung dienen und die anfänglich zu beobachtete Hypersekretion

des epidermalen Mukus erklären (BRETZINGER et al. 1999; HEDRICK et al. 2000;

PERELBERG et al. 2003). BERGMANN (2007) geht bei einer akuten Infektion davon aus,

dass das Virus in erster Linie über den Verdauungstrakt aus dem Umgebungswasser

aufgenommen wird und nur sekundär über die Haut und die Kiemen. Es erfolge anfänglich

eine Verbreitung über den Blutstrom im Organismus, welches mit einer stetig abnehmenden

Viruslast in den Leukozyten begründet wurde. Diese Hypothesen wurden allerdings

widerlegt. Mittels Bioluminescent Imaging nach Klonierung einer Luciferase in ein

rekombinantes Plasmid und eines originellen Versuchsaufbaus, welcher nur eine Infektion


über die Haut des posterioren Teil des Fisches erlaubte, konnte veranschaulicht werden, dass

die Haut als das primäre Eingangsportal für KHV angesehen werden muss (COSTES et al.

2009). Auch frühere Arbeiten an Rhabdoviren der Salmoniden lassen vermuten, dass die Haut

eine effiziente Eingangspforte für verschiedene aquatische Viren zu sein scheint

(HARMACHE et al. 2006). Es kommt zur Virusreplikation in der Haut von wo aus es sich

rasch im ganzen Körper ausbreitet (COSTES et al. 2009). Bereits 24 Stunden p.i. erfolgt ein

positiver Virusnachweis in allen inneren Organen inklusive des Gehirns, wo eine weitere

Vermehrung zu verzeichnen ist und später Läsionen auftreten (GILAD et al. 2004). Acht bis

12 Tage p.i. wird die höchste Mortalität bei natürlich infizierten Fischen beobachtet, die bei

permissiven Temperaturen zwischen 18 und 28 °C gehalten werden (PERELBERG et al.

2003). Der Tod der Fische ist durch einen Verlust der osmoregulatorischen Funktionen der

Kieme, Niere und des Darm zu erklären (GILAD et al. 2004; NEGENBORN et al. 2015).

Alle Vertreter der Herpesviridae sind durch eine lytische Replikationsphase und eine Phase

der Latenz in ihrem Lebenszyklus gekennzeichnet (FRASER et al. 1981; MODROW et al.

2010). Diese Latenz ist gekennzeichnet durch das Verweilen des viralen Genoms in

infizierten Zellen als nicht integriertes Episom und durch die Expression einer geringen

Anzahl viraler Gene und microRNAs. Bei einer Reaktivierung wird die latente Phase durch

die lytische Replikation ersetzt (MICHEL et al. 2010a). Diese Latenz konnte für Vertreter der

Familie Alloherpesviridae noch nicht eindeutig bewiesen werden, jedoch gibt es Anzeichnen,

dass KHV eine Latenz im Wirt etablieren kann (GRAY et al. 2002). Mittels real-time PCR

konnten 65 Tage p.i. in klinisch gesunden Fischen KHV spezifische Genomabschnitte in

niedriger Konzentration nachgewiesen werden (GILAD et al. 2004). Auch zwei Jahre nach

einem Ausbruch der Virose in einer Wildkarpfenpopulation konnten den Gewässern noch

latente Virusträger entnommen werden (MINAMOTO et al. 2009b). KHV-Genomäquivalente

wurden auch in Leukozyten von symptomlosen Karpfen gefunden, die lediglich in Anlagen

mit KHV-Historie gehältert wurden. In diesem Zusammenhang konnten jedoch weder

infektiöse Viruspartikel noch mRNAs festgestellt werden, die einer lytischen Infektion

zugeordnet werden konnten (EIDE et al. 2011). Letztendlich demonstrierten ST-HILAIRE et

al. (2005), dass es nach Infektionen mit KHV zu temperaturabhängigen Virusreaktivierungen

auch Monate nach der Erstinfektion kommen kann und im Folgenden bei Temperaturen über

20 °C auch eine Übertragung auf naive Karpfen stattfindet. Weitere Untersuchungen zeigten,


dass in Karpfen mit einer latenten Infektion nach Stresssituationen, ausgelöst durch Transport,

Temperaturwechsel oder eine simulierte Befischung, eine Virusreaktivierung mit Mortalität

induziert werden kann (MEYER 2007b; BERGMANN u. KEMPTER 2011).

2.2.2 Klinische Symptomatik

KHV-Ausbrüche, die mit einem perakuten bis akuten Verlauf der Erkrankung einhergehen,

äußern sich in einer Morbidität von 80–100 % und einer Mortalität von 70–80 % im

betroffenen Bestand (BRETZINGER et al. 1999; WALSTER 1999). Erkrankte Fische können

auffällige Verhaltensstörungen zeigen, wie Apathie, Anorexie, Lethargie, Dyspnoe,

eingeklemmte Dorsalflosse und unkontrollierte Schwimmbewegungen. Oft zeigen Fische

auch im Laufe der Pathogenese unregelmäßige Schwimmaktivität mit sporadischer

Hyperaktivität. Sie können aber auch regungslos auf dem Teichboden verharren oder in

Bereichen mit wenig Strömung, wie an Teichzuläufen in der Wassersäule stehen (BLOOM

1998; ARIAV et al. 1999; WALSTER 1999).

Die äußerlichen Symptome der Erkrankung können sich teilweise sehr verschieden darstellen

oder sogar völlig symptomlos bis zum Eintritt der Mortalität verlaufen. Die Ausprägung des

Krankheitsbildes wird von Faktoren, wie dem Alter und der Kondition der Karpfen, der

Wassertemperatur und der Wasserqualität, der Populationsgröße und verschiedenen anderen

Stressoren bestimmt (WALSTER 1999). Oft wird zu Beginn der Erkrankung eine erhöhte

Schleimproduktion auf den Kiemen und der Haut beobachtet sowie das Auftreten von

Farbveränderungen über den ganzen Fisch (GRAY et al. 2002). Des Weiteren sind erkrankte

Tiere oft an einem bilateralen Enophtalmus, teilweise aber auch an einem Exophthalmus

zuerkennen. Die anfängliche Hypersekretion an Schleim wird im weiteren Verlauf der

Infektion von einer deutlichen Verringerung der Schleimmenge auf der Haut abgelöst. Die

massivsten pathologischen Veränderungen betreffen meist die Kiemen. Anfänglich wird oft

eine Kiemenschwellung beobachtet, worauf fokale und ausgedehnte Nekrosen und

Entzündungen des Kiemengewebes folgen. Diese Veränderungen äußern sich in weißen,

scharf abgegrenzten Zellarealen zwischen weiterhin gesunden, weinroten Kiemenlamellen.

Die Haut wirkt rau und zeigt schleimfreie Areale mit „Sandpapier“-artiger Textur und


gelegentlich auftretenden Hämorrhagien. Später sind auch Blutungen am Flossenansatz, in

den Flossen und in der Haut zu beobachten sowie das Auftreten von kreisrunden bis

konfluierenden Schleimhautläsionen, verbunden mit Schleimhautablösungen und

großflächigen Entzündungen. Pathologisch-anatomische Veränderungen in den Organen

erkrankter Tiere sind in der Sektion nicht zu erkennen (BLOOM 1998; ARIAV et al. 1999;

BRETZINGER et al. 1999; WALSTER 1999; HEDRICK et al. 2000; PERELBERG et al.

2003). Es besteht aber eine gesteigerte Sensibilität gegenüber Sekundärinfektionen mit

Parasiten, Bakterien und Pilzen (BLOOM 1998; ARIAV et al. 1999). Histopathologische

Untersuchungen zeigen allerdings, dass es zu ausgeprägten Veränderungen in fast allen

Organen kommt, welche sich in Form von unspezifischen Entzündungsreaktionen bis hin zu

Degeneration von ganzen Zellverbänden und Nekrosen des Gewebes darstellen (PIKARSKY

et al. 2004). Die deutlichsten Veränderungen verzeichneten sich im Kiemen- und

Nierengewebe (HEDRICK et al. 2000).

Im Kiemengewebe bildeten sich Hyperplasien, Hypertrophien und Nekrosen des Epithels aus,

die teilweise mit Verschmelzungen der Kiemensekundärlamellen einhergehen (HEDRICK et

al. 2000). Einen Verlust der Kiemensekundärlamellen nur kurze Zeit nach der Infektion und

einen totalen Zusammenbruch der Kiemenlamellenstruktur im weiteren Verlauf beobachteten

PIKARSKI et al. (2004). Im Nierengewebe kann eine interstitielle Nephritis auftreten und in

infizierten Geweben von Niere, Milz, Herz, Gehirn und Leber können eosinophile

intranukleäre Einschlusskörperchen in einzelnen Zellen festgestellt werden (MIYAZAKI et

al. 2008). Histopathologisch konnten auch starke Schädigungen in der Haut festgestellt

werden. Eine Degeneration von spezialisierten Zellen und eine Ablösung des Epithels von der

Basalmembran wurden von BRETZINGER et al. (1999) beschrieben. Einige Fische wiesen

im Endstadium der Erkrankung neurologische Symptome, wie fokale menigeale und

paramenigeale Entzündungen des Zentralnervensystems, auf (PIKARSKY et al. 2004).

2.2.3 Empfänglichkeit

Karpfen aller Altersgruppen sind für das KHV empfänglich (BRETZINGER et al. 1999;

SANO et al. 2004). Wobei Jungfische (1–3 Monate mit 2,5–6 g) unter experimentellen


Bedingungen anfälliger für die KHV-Erkrankung zu sein scheinen als vollentwickelte Fische

nach einem Jahr mit einem Gewicht von ca. 230 g (OH et al. 2001; PERELBERG et al.

2003). In Japan wurde eine Studie durchgeführt, um die Empfänglichkeit von jungen Karpfen

für das KHV zu bestimmen. Nach experimenteller Infektion von Karpfenlarven, drei bis vier

Tage nach dem Schlupf, konnten keine Anzeichen einer Erkrankung beobachtet werden,

stattdessen schienen sie in diesem Stadium über eine gewisse Resistenz zu verfügen.

Wohingegen die gleichen Fische zwei Monate später nach einer erneuten Virusexposition

einer Mortalität von 100 % unterlagen (ITO et al. 2007).

2.2.3.1 Übertragung und Vektoren

Die gegenwärtigen Erkenntnisse der Wissenschaft können die genauen Umstände der

Übertragung des KHV noch nicht eindeutig beschreiben. Bekannt ist aber, dass eine

horizontale Übertragung unter Karpfen jeder Altersstufe möglich ist. Der abiotische Faktor

Wasser als natürlicher Lebensraum spielt in diesem Zusammenhang die wohl wichtigste Rolle

als Medium der Übertragung (PERELBERG et al. 2003). Die Autoren demonstrieren, dass

Fische virale Partikel ins Umgebungswasser sekretierten, welche für mindestens vier Stunden

infektiös blieben und eine Mortalität in naiven Karpfen induzierten.

Als Reservoir der KHV-Erkrankung werden klinisch infizierte Karpfen, latente „Carrier“ aus

kultivierten und wilden Karpfenbeständen und verschiedene Wildfischarten beschrieben.

Neben anderen Fischarten werden aber auch diverse weitere Vektoren aufgeführt, die an der

Übertragung und Verbreitung des KHV beteiligt seien können.

WALSTER (1999) schreibt dem Faktor Mensch bei der Verschleppung des Erregers eine

übergeordnete Rolle zu und sieht einen Zusammenhang zwischen mangelnder

Betriebshygiene und Krankheitsausbrüchen in gezüchteten Karpfenbeständen. Kritisch

einzustufen sei vor allem ein zu hoher Personenverkehr an den Teichen und die Verwendung

von unzureichend desinfizierten Arbeitsgeräten. Des Weiteren wird die Karpfenlaus (Argulus

sp.) als potentieller Überträger der Infektion diskutiert. MATSUI et al. (2008) bezeichnen

ebenfalls einen hohen Personenverkehr und die Verwendung von kontaminierten


Gerätschaften als Risikofaktoren. Außerdem sind ihrer Ansicht nach weitere potentielle

Vektoren wie fischfressende Vögel (Fischreiher und Kormorane), Pflanzen und Amphibien an

der Verbreitung des KHV beteiligt.

Akut an KHV erkrankte Karpfen tragen hohe Viruslasten, die auch im Kot und im Urin

(DISHON et al. 2005; YUASA et al. 2008; NEGENBORN et al. 2015) oder in der Haut und

im Schleim gefunden wurden (GILAD et al. 2004).

DISHON et al. (2005) wiesen mittels PCR und ELISA virale Proteine und DNA in

Exkrementen von mit KHV infizierten Karpfen nach. I.p. infizierte Fische schieden an Tag

vier und über das Bad infizierte Fische an Tag fünf p.i. KHV-DNA mit dem Kot aus. Die

Autoren beobachteten einen CPE in mit Kot infizierten Zellkulturen und induzierten KHV-

spezifische Krankheitssymptome bei naiven Karpfen.

Andere Autoren sehen die Haut als Haupteingangspforte des CyHV-3 in den Organismus an

und beschreiben diese auch als Ort der ersten Virusreplikation (COSTES et al. 2009). Diese

Virusvermehrung in der Haut ist somit nicht nur als Ausgangspunkt für die Virusvermehrung

im Fisch anzusehen sondern auch als Ausgangspunkt für die Verbreitung der Infektion in

einer ganzen Population. Zwei bis drei Tage p.i. begannen die Karpfen sich aneinander oder

an Gegenständen zu reiben. Diese Verhaltenweise könnte den Verbreitungsmechanismus über

die Haut entscheidend verstärken. Auch die Tatsache, dass gesunde Fische makroskopisch

kleine Hautbestandteile oral von erkrankten Fischen aufnehmen kann als zusätzlicher Faktor

für die Erregerübertragung angesehen werden.

Nach derzeitigem Wissensstand sind noch keine Beweise erbracht worden, die als

Anhaltspunkte für eine vertikale Übertragung des KHV verstanden werden könnten.

2.2.4 Wirtsspektrum

Das Wirtsspektrum der Herpesviren ist mit wenigen Ausnahmen sehr eng, sodass

Übertragungen auf andere Spezies die Ausnahme sind. Zoonosen durch Herpesviren sind

daher unbekannt (DAVISON 2002; ROLLE u. MAYR 2007; MODROW et al. 2010). Die


Koi-Herpesvirose stellt eine virulente und hochkontagiöse Krankheit dar, doch beschränkt

sich das Krankheitsgeschehen mit Morbidität und Mortalität auf die Spezies Cyprinus carpio

und wurde bislang nur in Koi- und Speisekarpfenpopulationen beobachtet (ARIAV et al.

1999; WALSTER 1999). In Kohabitationsversuchen mit Virus ausschüttenden, erkrankten

Karpfen und nach Laborinfektionen mit Zellkulturvirus bei permissiven Temperaturen

konnten bei anderen Fischarten keine klinischen Anzeichen einer durch KHV induzierten

Erkrankung festgestellt werden (BODY et al. 2000; RONEN et al. 2003; PIKARSKY et al.

2004).

In Teichwirtschaften werden Karpfen oft zusammen mit verschiedenen Beifischarten

kultiviert. Während akuter KHV-Ausbrüche in diesen Polykulturen konnten bei anderen

Spezies keine Verluste wahrgenommen werden (HOFFMANN et al. 2000) und auch in

weiteren Studien, in denen mit KHV infizierte Karpfen mit anderen Cypriniden und Nicht-

Cypriniden zusammen gehältert wurden, wird beschreiben, dass sich das Wirtsspektrum auf

die Art C. carpio zu beschränken scheint. In verschiedenen Beobachtungen konnten bei

Goldfischen (Carassius aurata), Stören (Acipenseridae), Schleien (Tinca tinca), Goldorfen

(Leuciscus idus), Graskarpfen (Ctenopharyngodon idella), Hechten (Esox lucius) und

Zandern (Sander lucioperca) nie Anzeichen einer Erkrankung durch KHV festgestellt werden

(BLOOM 1998; BRETZINGER et al. 1999). GILAD et al. (2002) und PERELBERG et al.

(2003) zeigten ebenfalls, dass Goldfische und Karauschen (Carassius carassius), als nahe

Verwandte des Karpfens, weder nach Kohabitationsversuchen noch nach experimenteller

Infektion klinische Symptome entwickelten. PERELBERG et al. (2003) kohabitierten

außerdem infizierte Karpfen mit Tilapien (Oreochromis niloticus), Silberbarschen (Bidyanus

bidyanus), Silberkarpfen (Hypophthalmichthys molitrix), Goldfischen, Graskarpfen und

naiven Karpfen als Infektionskontrolle. Diese wurden wiederum im Anschluss mit naiven

Karpfen zusammengesetzt, um zu überprüfen, ob es zu einer Übertragung des Virus kommen

kann. Die aufgeführten Arten äußerten keinerlei Anzeichen einer Erkrankung, sowie die mit

ihnen kohabitierten naiven Karpfen, während sowohl die infizierten als auch die mit ihnen

kohabitierten naiven Karpfen eine Mortalität von ca. 70 % zeigten. HUTORAN et al. (2005)

konnten auch nach Vergesellschaftung von Goldfischen mit erkrankten Karpfen über mehrere

Monate keine krankhaften Veränderungen feststellen. In den ersten PCR-Untersuchungen

nach GILAD et al. (2002) an mit Zellkulturvirus infizierten Goldfischen wurden keine KHV-


spezifischen Genomsequenzen nachgewiesen (HEDRICK et al. 2006). Mittels LAMP

detektierten EL-MATBOULI et al. (2007) jedoch das KHV in Gewebepools aus Kieme, Milz,

Niere und Gehirn in natürlich infizierten Goldfischen. Untersuchungen derselben Proben mit

dem von BERCOVIER et al. (2005) entwickelten PCR-System bestätigten diese Ergebnisse.

MEYER et al. (2007a; MEYER 2007b) kohabitierten zuvor dem KHV ausgesetzte

Graskarpfen, Schleien und Silberkarpfen mit SPF-Karpfen und zeigten, dass es sich bei diesen

um symptomlose „Carrier“ handelt, da Genomfragmente des Virus anschließend auch bei den

zuvor naiven Karpfen gefunden wurden. SADLER et al. (2008) beschrieben, dass nach

Ausbruch einer durch KHV bedingten Tierseuche mit massenhaften Verlusten an Koi in einer

kommerziellen Zuchtanlage auch Goldfische des gleichen Zirkulationssystems als „Carrier“

ausgemacht werden konnten. Die Goldfische waren somit dem KHV natürlich ausgesetzt. Der

Nachweis erfolgte mittels quantitativer real-time PCR nach GILAD et al. (2004) lange Zeit

nach Auftreten der Mortalität, was die Autoren weiter vermuten lässt, dass infizierte

Goldfische auch infektiöses Virus ausschütten und sich somit als potentielle Vektoren für das

KHV darstellen könnten. Auch BERGMANN et al. (2009) bestätigten, dass der Goldfisch

Träger des KHV sein kann ohne selbst zu erkranken. Außerdem wurde beschrieben, dass

Goldfische nicht nur als Vektoren für das Virus anzusehen sind. Es konnte zudem eine

Virusreplikation in infizierten Fischen beobachtet werden, die unter Stress auslösenden

Umständen auch Virus ausschütten und auf naive Karpfen übertragen (EL-MATBOULI u.

SOLIMAN 2010). BERGMANN et al. (2010a) zeigten, dass sich Goldfische mit

Zellkulturvirus in einer Konzentration von 103 TCID 50 reproduzierbar mit KHV-I infizieren

lassen und dass das Virus anschließend mit verschiedenen Nachweismethoden wie PCR,

IFAT und ISH nachgewiesen und ebenfalls infektiöses Virus auf naive Karpfen übertragen

werden kann. In weiteren Studien zeigten BERGMANN et al. (2010d), dass auch Hybriden

(Koi x Goldfisch, Koi x Karausche) für das Virus empfänglich waren und nach einer

Infektion sogar Anzeichen einer symptomatischen Erkrankung mit Mortalität aufwiesen.

Das Spektrum der Arten, die für das Virus empfänglich sind, wurde stetig erweitert.

Russische und atlantische Störe (A. gueldenstaedtii and. A. oxyrinchus), die häufig in

Aquakulturanlagen zusammen mit Karpfen gehalten werden, wurden positiv getestet. In

diesem Zusammenhang wurde allerdings nicht überprüft, ob diese Fische das Potential haben


gesunde Karpfen zu infizieren und wie hoch dieses ist (KEMPTER et al. 2009). Des Weiteren

wurde die Rolle von Mollusken und Crustaceen, die mittels nested-PCR positiv auf KHV-

spezifische Genomsequenzen getestet wurden, diskutiert. Diese Detritus verarbeitenden und

filtrierenden Organismen stehen im Verdacht, befähigt zu sein, das KHV oder Virusfragmente

in ihren Organen zu akkumulieren, ohne dass eine Virusreplikation stattfindet (KIELPINSKI

et al. 2010).

2.2.5 Einfluss der Temperatur und Inkubationszeit

Die Inkubationszeit bis zum Auftreten der ersten klinischen Symptome und die Schwere des

Verlaufes der Erkrankung werden bei wechselwarmen Tieren wie Fischen vor allem durch die

Wassertemperatur bestimmt. Das humorale und zelluläre Immunsystem, sowie die

Virusvermehrung im infizierten Organismus werden vorrangig von der Temperatur

beeinflusst (BLY u. CLEM 1992). GILAD et al. (2003) stellte fest, dass der

Krankheitsverlauf stärker durch die Wassertemperatur beeinflusst wurde als durch die

Konzentration der verabreichten Viruslösung und Karpfen auch schon für geringe

Viruskonzentrationen in einem bestimmten Temperaturbereich hoch empfänglich sein

können. WALSTER et al. (1999) beschrieben KHV-Ausbrüche bei Temperaturen zwischen

15 und 28 °C. Infizierte Fische, die bei Temperaturen unter 13 °C und über 30 °C gehalten

wurden, zeigten keine Symptome der Erkrankung (POKOROVA et al. 2005). GILAD et al.

(2003) infizierten Karpfen mit 1,2 KID50/ml und 12 KID50/ml KHV-haltiger Lösung mittels

Immersionsbad und hälterten diese bei 13, 18, 23 und 28°C. Unterschiede in der Mortalität

bezüglich der verschiedenen Infektionsbäder waren nicht signifikant. Allerdings zeichnete

sich bezüglich der Hälterungstemperatur ein deutlicher Unterschied in der Mortalität ab. Bei

18, 23 und 28 °C betrug die Mortalität mehr als 90 %. Die bei 13 °C gehälterten Fische

zeigten hingegen weder Krankheitssymptome noch Mortalität. 30 Tage nach der Infektion

wurde die Wassertemperatur bei der Hälfte beider Gruppen, die bei 13 °C gehalten wurden

auf 23 °C erhöht und es konnte ebenfalls eine Mortalität von 90 % mit nicht signifikantem

Unterschied in der Inkubationszeit zu den anderen Infektionsgruppen beobachtet werden. Die

verbliebenen Fische wurden nach zwei Monaten einer Temperaturerhöhung von 13 auf 23° C

unterzogen und zeigten keine Anzeichen einer Erkrankung. Die Autoren deuteten daraus, dass


ein seuchenhafter Ausbruch der KHV-Infektion eine durch den Anstieg der Wassertemperatur

im Frühjahr oder Sommer hervorgerufene Aktivierung einer Infektion darstellen kann, die bei

geringen Temperaturen übertragen wurde, bei denen keine Virusvermehrung möglich war.

Die Erkrankung manifestierte sich innerhalb von drei Tagen nach dem Zusetzen naiver

Karpfen in einen Teich, der mit an KHV erkrankten Fischen besetzt war (WALSTER 1999).

Während andere Autoren die Erkrankung erst acht bis 21 Tage nach der Kohabitation in zuvor

naiven Fischen diagnostizierten (BRETZINGER et al. 1999; HEDRICK et al. 2000).

2.2.6 Latenz

Das charakteristische Merkmal aller Herpesviren ist die Fähigkeit, nach der Erstinfektion

lebenslang latent im Wirtsorganismus zu verbleiben. Die Zellen überleben in dieser Phase und

(ROIZMAN u. PELLET 2001) die Produktion von Viruspartikeln ist unterbunden. Eine

Reaktivierung aus diesem Zustand zurück zum lytischen Infektionszyklus ist jedoch

wiederholt möglich. Diese äußert sich meist in einem Krankheitsbild, das dem der

Primärinfektion entspricht (MODROW et al. 2010). Ein latent mit KHV infizierter Fisch trägt

somit das Virus, welches sich in einem inaktiven Zustand befindet, ohne Anzeichen der

Erkrankung zu zeigen. Solche Fische werden als „Carrier“ bezeichnet und sie können nach

einer stressinduzierten Virusreaktivierung vermehrungsfähige Virionen ausscheiden und auf

naive Karpfen übertragen (GILAD et al. 2004; ST-HILAIRE et al. 2005). Sowohl nach

experimenteller Infektion, als auch nach Kontakt mit KHV unter natürlichen Umständen

können Karpfen, die eine Infektion überlebt haben, als potentielle „Carrier“ betrachtet werden

(GILAD et al. 2004; HEDRICK et al. 2005). In diesem Zusammenhang scheint die

physiologische Verfassung des Wirtes von großer Bedeutung zu sein (ROIZMAN u. PELLET

2001). MEYER (2007b) setzte in ihren Experimenten Karpfen mit einer latenten Infektion

diversen Stresssituationen, wie zum Beispiel einem simulierten Transport oder einer

Befischung aus und induzierte so eine Virusreaktivierung verbunden mit einer erneuten

Virusausscheidung und einem subklinischen Verlauf. Die Dauer der Persistenz wird vor allem

durch die Wassertemperatur beeinflusst, ist aber auch von der Virulenz des Virus, dem Alter,

der Kondition und der Populationsdichte der Karpfen sowie anderen Stressfaktoren


(Transport, Laichzeit, Wasserqualität) abhängig. Typischerweise tritt die Erkrankung bei

Temperaturen zwischen 16 und 25 °C vermehrt auf (HEDRICK et al. 2000; DENHAM 2003;

GILAD et al. 2003; ADKISON et al. 2005).

Eine ähnliche Situation konnte bei Infektionen mit CyHV-1 beobachtet werden. Das dem

KHV nah verwandte Virus verursacht die „Karpfenpocken“ als Krankheitsbild. Typisch für

das CyHV-1 ist ebenfalls die Etablierung einer Latenzphase nach der Primärinfektion in der

das äußere Erscheinungsbild der Fische nicht durch „Pocken“ geprägt ist. Jedoch kann

beobachtet werden, dass abhängig von verschiedenen Umweltparametern diese Hautläsionen

erneut auftreten können, was vorzugsweise bei niedrigen Wassertemperaturen der Fall ist,

wenn Fische hauptsächlich auf die angeborene Immunantwort angewiesen sind (SANO et al.

1991; SANO et al. 1993; ADKISON et al. 2005).

2.3 Geschichte, Verbreitung und Epidemiologie des KHV

2.3.1 Geschichte

Die erste Infektion von Koi mit dem Koi-Herpesvirus wurde im Jahr 1998 beschrieben

(BLOOM 1998). Das Krankheitsbild kennzeichnete sich durch eine Vielgestaltigkeit der

Symptome und einen hohen Befall mit anderen Pathogenen. Deshalb wurde angenommen,

dass die Primärinfektion eine Immunsuppression zur Folge hatte, weshalb die Erkrankung als

K.I.S.S. (Koi Immune System Suppressing Disease) bezeichnet wurde. Im Jahre 1998 wurde

ebenfalls von massenhaften Verlusten in Koi- und Konsumkarpfenbeständen in Israel und den

Vereinigten Staaten berichtet (ARIAV et al. 1999; HEDRICK et al. 2000). Spätere Analysen

von archivierten Proben bestätigten, dass das Virus bereits im Jahre 1996 zu Verlusten in

Wildkarpfenbeständen in Großbritannien geführt hatte (WALSTER 1999). Kurz nach dem

ersten Bericht traten bereits Ausbrüche mit Massenverlusten in verschiedenen Ländern

Europas, Asiens und Afrikas auf. Heutzutage ist das Virus weltweit verbreitet und verursacht

massive finanzielle und ökonomische Verluste in der Koi- und Speisekarpfenindustrie

(POKOROVA et al. 2005). BRETZINGER et al. (1999) beschrieben vor allem dominante

Hautveränderungen und Nekrosen im Bereich des Kiemenepithels. Im Jahre 2000 wurde das


Virus erstmals isoliert und einzelne Partikel mittels Elektronenmikroskopie nachgewiesen

(HEDRICK et al. 2000). Anhand von vergleichenden Studien stellten WALTZEK et al.

(2005) eine hohe morphologische und antigenetische Ähnlichkeit zu den bereits bekannten

Cypriniden Herpesviren (CyHV) wie CyHV-1, dem Verursacher der Karpfenpocken und zu

CyHV-2, welches die hämatopoetischen Nekrose bei Goldfischen auslöst, fest. Auf Grund

dieser Tatsachen bezeichneten sie es als CyHV-3 oder alternativ als KHV, da es zuerst in Koi

beschrieben wurde.

2.3.2 Globale Verbreitung

Infektionen mit dem Koi-Herpesvirus stellen seit Ende 90er Jahre eine zunehmende

Bedrohung für die Karpfenteichwirtschaft und die Koizucht dar. Krankheitsausbrüche, die in

Zusammenhang mit KHV gebracht werden konnten, wurden vor allem in Israel und den USA

in Koi- und Speisekarpfenbeständen beschrieben (ARIAV et al. 1999). Durch intensiven

Fischhandel wurde eine rasche Verbreitung des Virus vorangetrieben. So waren

beispielsweise Ende der 2000er Jahre über 90 % der israelischen Fischfarmen von KHV-

Infektionen betroffen. Der Aquakultursektor beklagte wirtschaftliche Verluste in Höhe von

bis zu 300 Millionen US Dollar jährlich (PERELBERG et al. 2003). Durch unkontrollierten

Handel vorwiegend mit Zierkarpfen kam es schnell zu einer weltweiten Verbreitung der

viralen Erkrankung. In Europa wurden KHV-Ausbrüche zum Beispiel in Belgien, Dänemark,

Deutschland, Frankreich, Großbritannien, Italien, Österreich, Luxemburg, den Niederlanden,

Polen und der Schweiz (DENHAM 2003; HAENEN et al. 2004; SCHLOTFELDT 2004;

BERGMANN et al. 2006) beschrieben. In Asien wurde über Ausbrüche in China (HAENEN

et al. 2004), der Provinz Taiwan (TU et al. 2004), Indonesien (SUNARTO et al. 2005), Japan

(SANO et al. 2004), Korea (CHOI et al. 2004), Malaysia (HAENEN et al. 2004), Singapur

und Thailand (HAENEN et al. 2004), Taiwan und Thailand berichtet (HAENEN et al. 2004).

Auch Südafrika und die USA beschrieben durch das KHV verursachte Verluste in

Karpfenbeständen (HEDRICK et al. 2000; GRAY et al. 2002; TERHUNE et al. 2004).

Derzeit wird lediglich Australien als KHV-frei angesehen (BAUR 2010).


2.3.3 Nationale Verbreitung

In Deutschland wurden Infektionen mit KHV bei Koi und seit 2003 auch bei Speisekarpfen in

Teichwirtschaften der meisten Bundesländer beobachtet. Außerdem erfolgte bereits ein

Nachweis der Infektion bei Fischen in öffentlichen Gewässern Deutschlands, wie

beispielsweise im Jahre 2008 als der Landesbetrieb Hessisches Landeslabor in Gießen eine

Infektion mit KHV amtlich in zwei verendeten Karpfen aus der Lahn festgestellte. Vor allem

sind aber die teichwirtschaftlich intensiv genutzten Regionen in Bayern und Sachsen von

Verlusten betroffen. Die sächsische Oberlausitzer Heide- und Teichlandschaft mit über 335

Teichen stellt das größte für die Karpfenzucht wirtschaftlich genutzte Teichgebiet Europas

dar. Erste mit der Koi-Herpesvirose in Zusammenhang gebrachte Verluste wurden im Jahre

2002 diagnostiziert. Seit diesem Jahr hat sich die Anzahl der betroffenen Betriebe von drei

auf 26 erhöht (BÖTTCHER et al. 2009). Die Erkrankung nimmt zumeist einen seuchenhaften

Verlauf und erfasst ganze Teichgruppen einzelner Betriebe und verursachte seit Beginn der

KHV-Problematik einen wirtschaftlichen Gesamtschaden von mehreren Millionen Euro. In

bayrischen Teichwirtschaften sind die wirtschaftlichen Verluste durch Infektionen mit dem

KHV weniger drastisch. Ein KHV-Monitoring mittels ELISA im Jahre 2008 ergab allerdings,

dass 63 % der untersuchten Betriebe positiv auf Antikörper gegen KHV getestet werden

konnten, 21 % der Betriebe als verdächtig eingestuft wurden und nur in 16 % der Betriebe

keine Antikörper nachgewiesen werden konnten (FENEIS et al. 2009). Aber auch andere

Bundesländer wie beispielsweise Thüringen hatten teilweise empfindliche Verluste zu

beklagen. Im Jahre 2004 kam es in einer thüringer Karpfenteichwirtschaft zu einem KHV-

Ausbruch, der einen Ausfall von 80 t Karpfen mit einem Marktwert von 310.000 Euro

verursachte. Zusätzlich mussten 106.000 Euro für die Desinfektion und Sanierung

aufgebracht werden (BOCKLISCH et al. 2006).

2.3.4 Epidemiologie

Infektionen mit KHV stellen ein erhebliches Problem für die Speisekarpfen produzierende

Industrie und den Koihandel dar (HAENEN et al. 2004). Intensive Fischereiwirtschaft mit

unzureichenden Hygienemaßnahmen, internationaler Handel ohne Gesundheitskontrollen und


Zierfischausstellungen sind ursächlich für die rasante weltweite Verbreitung des KHV.

Krankheitsausbrüche in den betroffenen Betrieben sind oft mit erheblichen finanziellen

Verlusten verbunden (GILAD et al. 2002; GILAD et al. 2003; WAY et al. 2004). KHV-

Ausbrüche in zuvor unauffälligen Zier- und Nutzbeständen sind häufig nach Zukauf und

Einbringen neuer Fische zu beobachten. Eine besondere Rolle bei der Verbreitung spielen in

diesem Zusammenhang gesund erscheinende Carrierfische. Diese symptomlosen Virusträger

sind trotz Einhalten der Quarantänevorschriften als größtes Risiko bei der Virusverbreitung

anzusehen. Neben diesen Lebendfischbewegungen stehen auch Kontakte durch Personen,

Geräte und Wasser zu anderen Betrieben, das Aussetzen von KHV-infizierten Zier- und

Speisekarpfen und weitere Fischspezies als symptomlose Überträger im epidemiologischen

Zusammenhang (BLOOM 1998; BRETZINGER et al. 1999; WALSTER 1999; NEUKIRCH

u. KUNZ 2001).

2.3.5 Molekulare Epidemiologie

Drei nicht verwandte Virusstämme des KHV, isoliert in Israel (KHV-I), Japan (KHV-J) und

den USA (KHV-U) wurden bislang komplett sequenziert (AOKI et al. 2007). Trotz der hohen

geographischen Distanz ihrer Herkünfte besitzen sie eine sehr hohe

Sequenzübereinstimmung. Eine geringe Diversität der Sequenzen unter verschiedenen

Stämmen scheint charakteristisch für das CyHV-3 zu sein. KURITA et al. (2009)

untersuchten die Nukleotidsequenzen von drei verschiedenen Regionen des KHV-Genoms

und verglichen diese. Verwendet wurde die Sph I-5 Region von GRAY et al. (2002), die 9/5

Region von GILAD et al. (2002) und eine erweiterte Region, die des Thymidinkinase-Gens

von BERCOVIER et al. (2005). Untersucht wurden 34 Virusisolate aus Japan, sechs aus

Indonesien, zwei aus Taiwan, 13 Isolate aus den Niederlanden und jeweils eins von den

Philippinen, aus Großbritannien, den USA und Israel. Die Virusisolate aus den asiatischen

Ländern waren untereinander äußerst homogen, sowie die Europäischen untereinander auch

durch eine hohe Homogenität gekennzeichnet waren. Die Ergebnisse suggerieren, dass

zwischen asiatischen und europäischen KHV-Isolaten ein klarer genetischer Unterschied

besteht, inklusive der einzelnen Isolate aus den USA und Israel.


2.4 Therapie, Kontrolle und Prophylaxe

Therapeutische Maßnahmen wie Chemotherapie oder Behandlung mit Immunstimulantien

sind derzeit nicht bekannt und sind des Weiteren auch als wenig sinnvoll zu betrachten, da es

lediglich zur Verschleierung des Krankheitsverlaufes kommen würde. Auf Grund des meist

akuten Verlaufs würde sich die Frage auch nur in wenigen Fällen stellen. Als wirkungsvolle

Bekämpfungsmaßnahme nach Ausbruch der Fischseuche hat sich in der Praxis eine

längerfristige Trockenlegung des betroffenen Gewässers mit begleitenden

Desinfektionsmaßnahmen erwiesen (BAUR 2010).

Für die Kontrolle des KHV wurden drei verschiedene Ansätze beschrieben:

1) Ein verbessertes Management und diverse wirtschaftliche Maßnahmen um einen

internationalen Handel mit zertifizierten KHV-freien Karpfen zu begünstigen.

2) Die Zucht mit KHV-resistenten Karpfen

Eine Resistenz von Karpfen gegen das KHV scheint durch verschiedene genetische

Wirtsfaktoren bedingt zu sein. Anhand von Kreuzungsversuchen zwischen verschieden

domestizierten Karpfenstämmen und einem resistenten Wildkarpfenstamm demonstrierten

SHAPIRA et al. (2005) sowie DIXON et al. (2009) Unterschiede in der Überlebensrate der

jeweiligen Karpfenkreuzung. Weitere Studien über die Rolle der genetischen Wirtsfaktoren

bezüglich der Resistenz gegen das KHV zeigen, dass Gene der MHC-Klasse-II diese

Resistenz beeinflussen (RAKUS et al. 2009).

3) Die Prophylaxe mit Vakzinen

RONEN et al. (2003) entwickelten nach der Charakterisierung des KHV einen Ansatz zur

Induktion einer Immunantwort in Karpfen, welcher auf der Tatsache basierte, dass


krankheitsspezifische Symptome nur zwischen 18 und 28 °C zu beobachten sind. Uninfizierte

Karpfen wurden drei bis vier Tage dem KHV bei permissiven Temperaturen (22–23 °C)

ausgesetzt und anschließend für 30 Tage bei nicht permissiven Temperaturen über 30 °C

gehältert. Nach einer erneuten Infektion waren 60 % der Fische resistent gegen das Virus.

Allerdings überwiegen bei dieser Methode die Nachteile. Die hohen Wassertemperaturen

begünstigen Sekundärinfektionen und auch der Energieverbrauch ist hoch, nur 60 % der

Fische sind resistent, die Fische stellen eine potentielle Gefahr für naive Populationen dar, da

sie mit virulenten Virus vom Wildtyp infiziert wurden. Nur attenuierte Lebendvakzine

scheinen für die Massenimpfung geeignet. Derzeit wird nur ein attenuierter Impfstoff

produziert. Der Vertrieb durch die Firma KoVax Ltd. (Jerusalem, Israel) ist allerdings auf

Israel beschränkt und das Produkt hat den Nachteil, dass die molekulare Basis der

Virulenzreduktion nicht bestimmt ist und außerdem nicht ausgeschlossen werden kann, dass

eine Reversion zum pathogenen Phänotyp stattfindet (PERELBERG et al. 2008). Des

Weiteren wurde ein Vakzin durch YASUMOTO et al. (2006) beschrieben, welches oral über

das Futter verabreicht wird. Es gewährleistet eine Schutzeffizienz von 70 %. Hierbei handelt

es sich um ein formalininaktiviertes Virus, welches von liposomalen Kompartimenten

umschlossen ist. BOUTIER et al. (2015) entwickelten den ersten Ansatz zur Massenimpfung

von Karpfen mittels eines rekombinanten, attenuierten Vakzins gegen KHV.

2.5 Tenazität und Desinfektion

In israelischen Studien wurde gezeigt, dass KHV-Partikel außerhalb des Wirtsorganismus in

Wasser nach vier Stunden bei Temperaturen zwischen 23–25 °C noch aktiv sind, aber nicht

mehr nach 21 Stunden (PERELBERG et al. 2003). SHIMIZU et al. (2006) demonstrierten in

ihren Studien, dass eine signifikante Reduktion des Virustiter nach drei Tagen in natürlichen

Gewässern oder in Sedimentproben bei 15 °C zu beobachten war. In vergleichbarem Wasser,

welches zuvor autoklaviert oder filtriert wurde, blieb das Virus über einen Zeitraum von mehr

als sieben Tagen infektiös. Bei pH-Werten zwischen 5–8 können Herpesviren über mehrere

Wochen stabil bleiben und erst Temperaturen über 25 °C führen zu einer leichten

Schwächung der Infektiosität (ROLLE u. MAYR 2007). Aufgrund ihrer Lipidhülle zeigen


sich die Virionen allerdings gegenüber gängigen Desinfektionsmitteln nur als geringfügig

widerstandsfähig (NEUKIRCH 2003). Viruslösungen verlieren bei pH-Werten unter drei und

über 11 innerhalb von zwei Stunden ihre Infektiosität gegenüber Zellkulturen.

Eine Inaktivierung des KHV ist außerdem bei einer UV-Strahlendosis von 4,0 x 10³ µWs/cm²

und bei Temperaturen über 50 °C für eine Minute gegeben. Eine effektive Inaktivierung wird

ebenfalls durch Auftragen einer Iodophor-Lösung in einer Konzentration von 200 mg/l, einer

Benzalkoniumchlorid-Lösung in einer Konzentration von 60 mg/l oder durch 30 %iges

Ethanol jeweils mit einer Einwirkzeit von 20 min erreicht. Ebenfalls kann eine

Natriumhypochloritlösung in einer Konzentration von 200 mg/l und einer Einwirkzeit von

30 sec verwendet werden (KASAI et al. 2005).

Laut World Organisation for Animal Health (OIE 2010) sollten alle Methoden zur Kontrolle

und Prävention einer Erkrankung mit KHV darauf beruhen, eine Exposition mit infektiösen

Viruspartikeln zu vermeiden, unter gleichzeitigem Aufrechterhalten des erforderlichen

Hygienestatus.

2.6 Diagnostik von KHV

Die Diagnose einer KHV-Infektion am lebendigen Fisch ist bis heute mit den zur Verfügung

stehenden Nachweismethoden nicht eindeutig möglich. Nicht letale Probennahmen in Form

von Kiemen- und Flossenbioptaten unter Narkose sind als zweifelhaft bezüglich eines

Nachweises des KHV-Genoms anzusehen, da bei klinisch unauffälligen und gesunden

„Carriern“ spezifische DNA-Sequenzen nicht sicher nachgewiesen werden können

(PIKARSKY et al. 2004). Auch die Untersuchung von Kot, Blut, Haut und Schleim mit

direkten Nachweismethoden ist möglich, aber auch hier gelingt ein Virusnachweis nicht

zuverlässig und birgt die Gefahr ungenauer Ergebnisse (DISHON et al. 2005; POKOROVA

et al. 2005). Indirekte antikörperbasierte Nachweisverfahren wie der ELISA oder der Serum

Neutralisationstest (SNT) können ebenfalls mit in nicht letalen Untersuchungen gewonnen

Blutproben durchgeführt werden, doch besteht auch hier die Gefahr infizierte Fische im


Frühstadium der Infektion oder gesund erscheinende „Carrier“ nicht zu detektieren

(POKOROVA et al. 2005).

2.6.1 PCR

PCR-basierte Detektionssysteme stellen zurzeit die aussagekräftigsten Mittel zur KHV-

Nachweisführung dar und eine Vielzahl an genomischen Methoden, wie Standard-PCRs,

nested PCRs, TaqMan PCRs und die Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) mit

jeweils unterschiedlicher Sensitivität und Spezifität wurden bereits publiziert (GILAD et al.

2002; GRAY et al. 2002; GILAD et al. 2004; BERCOVIER et al. 2005; HUTORAN et al.

2005; BERGMANN et al. 2006; BERGMANN et al. 2010c; SOLIMAN u. EL-MATBOULI

2010) und werden auch von der (OIE 2010) empfohlen. Die real-time PCR nach GILAD et al.

(2004) zusammen mit einem internen Qualitätskontrollsystem (HOFFMANN et al. 2006),

wird zurzeit als goldener Standard in der Routinediagnostik angesehen und erlaubt die

Detektion von fünf bis 10 Viruspartikeln im Ausgangsmaterial. Diese wird neben der etwas

weniger sensitiven PCR nach Gilad (GILAD et al. 2002) und der nested PCR (BERGMANN

et al. 2006) mit den Primerpaaren KHV-1Fn-1Rn auch vom Nationalen Referenzlabor für die

Koi-Herpesvirusinfektion, Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesinstitut für Tiergesundheit, Insel

Riems empfohlen. Wohingegen von der weiterhin von der OIE empfohlen PCR nach

BERCOVIER et al. (2005) für diagnostische Zwecke abgeraten wird, da mit dieser PCR

DNA-Sequenzen von in Europa neu vorkommenden KHV-Stämmen nicht detektieren werden

können (BERGMANN et al. 2010c).

2.6.2 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Der ELISA stellt eine indirekte Nachweismethode dar, die verwendet wird, um durch

Messung des Antikörperspiegels die Immunantwort infizierter Fische zu quantifizieren

(HEDRICK et al. 2000). Detektiert werden dabei KHV-spezifische Antikörper im

Karpfenserum (ADKISON et al. 2005). ELISA-Testverfahren verfügen über eine hohe

Sensitivität, jedoch sind sie wenig spezifisch. Beschrieben wurden bereits Kreuzreaktionen


mit dem CyHV-1 (ADKISON et al. 2005). Das KHV-Monitoring in England und Wales

basiert primär auf Daten, die mittels ELISA-Untersuchungen erstellt wurden. TAYLOR et al.

(2010) konnten Kreuzreaktionen mit dem CyHV-1 in Serumverdünnungen bis 1:400

beobachten. In höheren Verdünnungsstufen, von 1:800 bis 1:1600, hingegen traten diese nicht

mehr auf, allerdings verringert sich dadurch die Konzentration der spezifischen Antikörper im

Serum. Eine weitere Schwachstelle dieser indirekten, antikörperbasierten Methode ist, dass

Antikörper produzierende Immunzellen einen gewissen Zeitraum der Aktivierung benötigen,

sodass zu Beginn der Infektion noch keine Antikörper in Serum vorliegen. Außerdem

produziert ein Fisch nach überstandener Erkrankung nur noch wenig bis keine KHV-

spezifischen Antikörper, weshalb auch die nachweisbare Konzentration im Serum abnimmt.

Also können Fische im Frühstadium einer Infektion, sowie latente Virusträger Jahre nach der

Erstinfektion nicht erfasst werden (HARTMANN et al. 2004). Des Weiteren sind die

serologischen Zusammenhänge der Antikörperkinetik nach einer KHV-Infektion noch nicht

eindeutig beschrieben (ADKISON et al. 2005; PERELBERG et al. 2008) und auf Grund

dieser Tatsache empfiehlt die OIE, ELISA-Verfahren nicht in der Routinediagnostik zu

verwenden.

2.6.3 Zellkultur

Die Isolation des Virus in Zellkulturen war die erste Methode, mit der KHV in Geweben von

erkrankten Fischen nachgewiesen werden konnte (HEDRICK et al. 2000). Die Virusanzucht

kann auf der KF-1 Zelllinie nach HEDRICK et al. (2000) und der CCB Zelllinie nach

NEUKIRCH et al. (1999) durchgeführt werden. Der Virusnachweis gelingt in Zellkulturen

allerdings nur zuverlässig bei Fischen mit einer klinischen Erkrankung und ist außerdem sehr

zeitaufwendig. Da die Sensitivität der Virusisolation geringer ist als die der zurzeit

verwendeten PCR-Methoden, können Proben die keinen CPE in der Zellkultur verursachen,

nicht als zwingend negativ angesehen werden und müssten somit im Anschluss an die

Kultivierung noch mit einem der zuvor beschriebenen molekularen Ansätze weiter untersucht

werden (HAENEN et al. 2004). Auf Grund dieser Tatsachen eignet sich die Zellkultur nicht

zur Routinediagnostik.


2.6.4 Elektronenmikroskopie

Der elektronenmikroskopische Nachweis erfolgt durch Visualisierung von

Einschlusskörperchen und Viruspartikeln in den Organen (MIYAZAKI et al. 2008).

Herpesviruspartikel wurden bereits in Zellkernen und Zytoplasma von Kiemenepithelzellen,

im Darmgewebe und Leukozyten von Fischen mit einer akuten Infektion nachgewiesen

(BRETZINGER et al. 1999; HEDRICK et al. 2000; HOFFMANN et al. 2000; PIKARSKY et

al. 2004; HUTORAN et al. 2005). Allerdings ist die Identifizierung KHV-spezifischer

Partikel sehr schwierig. Es sind außerdem sehr hohe Viruskonzentrationen für den Nachweis

erforderlich, weshalb Fische aus latent infizierten Beständen nicht als Virusträger zu erfassen

sind. Auf Grund dieser Unzulänglichkeiten sollte der elektronenmikroskopische Nachweis in

der Routinediagnostik nicht angewandt werden.

2.7 Differentialdiagnose

Eine differentialdiagnostische Aussage gestaltet sich zu meist kompliziert. Eine hohe

Morbiditäts- und Mortalitätsrate kann ebenfalls auf eine für die Fischhaltung unzureichende

Wasserqualität zurückzuführen sein und beispielsweise auch durch hohe Ammonium- und

Nitritkonzentrationen ausgelöst werden (ARIAV et al. 1999). Symptome wie Haut- und

Kiemenschäden, Dyspnoe, Apathie und zentralnervöse Ausfallerscheinungen, die typisch für eine

KHV-Infenktion sind, können ebenfalls durch Probleme in der Wasserchemie ausgelöst werden

(BAUR u. RAPP 2003). Bakterielle, mykotische und parasitologische Primärinfektionen sollten

ebenfalls berücksichtigt werden, da diese ebenfalls zu Dermatitiden und Kiemennekrosen führen

können. Gleichermaßen sollten andere bei Karpfen auftretende virale Krankheiten ausgeschlossen

werden (HARTMANN et al. 2004). Die Diagnosefindung sollte möglichst durch

differentialdiagnostische Untersuchungen erfolgen.

2.8 Rechtslage

Seit Dezember 2005 ist die Koi-Herpesvirose in Deutschland in die nationale Verordnung für

anzeigepflichtige Tierseuchen aufgenommen worden. Außerdem wurde die Infektion mit dem


Erreger in die Liste der bedeutsamen, nicht exotischen Krankheiten in der Neufassung der

Aquakulturrichtlinie (EU-Richtlinie 2006/88/EG) eingefügt. KHV-Ausbrüche sowie der

Verdacht auf einen Ausbruch unterliegen der Anzeigepflicht und sind unverzüglich der

zuständigen Behörde, an das Veterinäramt des Landkreises oder der kreisfreien Stadt anzuzeigen.

Bei Bestätigung der Verdachtsdiagnose muss mit der Tilgung des Krankheitsherdes unverzüglich

begonnen werden. In Deutschland dürfen allerdings mit Genehmigung der zuständigen Behörde

offensichtlich gesund erscheinende, ansteckungsverdächtige, bereits vermarktungsfähige Fische

geschlachtet oder an einen Betreiber verkauft werden, dessen Fische ebenfalls an KHV erkrankt

sind (BAUR 2010), um somit die wirtschaftlichen Schäden zu begrenzen.

3

Material und Methoden 47

4 Material und Methoden

4.1 Virus

4.1.1 Herkunft

Das für die Klonierung und in den Infektionsversuchen verwendete Virusisolat KHV-I- mit

der Listennummer 182 wurde aus dem deutschen Nationalen Referenzlabor für die Koi-

Herpesvirusinfektion, Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesinstitut für Tiergesundheit, Insel

Riems, bezogen. Anwendung fand die 6. Passage des während eines Ausbruches in Israel

isolierten Virusisolates (HEDRICK et al. 2000), welches auf Zellen der Cyprinus Carpio

Brain Zelllinie (CCB) vermehrt wurde. Der Virustiter betrug 5000 KID50/ml.

Die in den Infektionsversuchen mit Wildfischen eingesetzte Viruslösung hatte eine

Infektiosität von 102,75 (275) KID50/ml bzw. 105,62 (562) KID50/ml.

4.1.2 Zellkultur

Zur Virusvermehrung und Virustitration wurde die Karpfenzelllinie CCB verwendet

(NEUKIRCH et al. 1999). Kultiviert wurden die Zellen in supplementiertem Minimum

Essential Medium wie in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2: Bestandteile Kulturmedium CCB-Zellen

Komponenten Volumen Minimum Essential Medium (MEM) mit Earle´s Salz und L-Glutamin (PAA, Pasching) 500 ml D(+)-Glukose wasserfrei für die Zellkultur (Applichem, Darmstadt) 1,75 g Foetal Bovine Serum Standard Quality (PAA, Pasching) 50 ml Amino Acids Non Essential (PAA, Pasching) 5 ml Penicillin/Streptomycin (PAA, Pasching) 10 ml


Die Zellen wurden bei 20 °C bebrütet und in einem Abstand von vier bis fünf Tagen

subkultivert. Zur Subkultivierung wurde dem konfluenten Monolayer in einer 75 cm²

Zellkulturflasche (Nunc, Wiesbaden) 5 ml einer Lösung aus „Dulbecco`s“ PBS (PAA,

Pasching), 0,05 % Trypsin (PAA, Pasching) und 0,0 2% EDTA (PAA, Pasching)

hinzugegeben, um die Zellen vom Boden der Zellkulturflaschen zu lösen. Um eine

schädigende Wirkung des Trypsins zu vermeiden, wurden zur Neutralisation 5 ml

Zellkulturmedium hinzupipettiert. Durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mit einer 15 ml

Einmalpipette wurden die Zellen suspendiert und die Lösung anschließend im Verhältnis 1:2

auf zwei neue mit jeweils 10 ml Zellkulturmedium befüllten 75 cm² Zellkulturflaschen verteilt

werden.

4.1.3 Virusvermehrung

Zur Virusvermehrung wurden 5 ml von mit Virus versetztem Zellkulturmedium auf

24 Stunden alte CCB-Monolayer in 75 cm2 Zellkulturflaschen gegeben und eine Stunde unter

Schwenken bei 25 °C inkubiert. Anschließend wurden 10 ml Zellkulturmedium hinzugegeben

und die Flaschen weiter bei 25 °C gelagert. Täglich erfolgte eine mikroskopische

Untersuchung des Zellrasens und morphologische Veränderungen wurden dokumentiert. Am

sechsten Tag der Inkubation wurden die Kulturflaschen nach Auftreten eines cytopathischen

Effekts bei -80 °C eingefroren. Bis zum Erhalt der benötigten Menge an Viruslösung wurde

dieser Prozess wiederholt. Im Anschluss wurden definierte Aliquote hergestellt und bei

-80 °C gelagert. Zur Bestimmung der Infektiosität des Virus und zur Anwendung in den

Infektionsversuchen wurde die zellhaltige Viruslösung bei Raumtemperatur aufgetaut und

unmittelbar weiterverarbeitet.

4.1.4 Virustitration

Die Bestimmung der Infektiosität des Virus wurde durch Titration mit der logarithmischen

Endpunktverdünnungsmethode auf einer Mikrotiterplatte nach Kärber (KÄRBER 1931)

durchgeführt. Zur Titration wurden Mikrotiterplatten (Nunc, Wiesbaden) mit 96 Vertiefungen


mit Flachboden und Nunclon-Beschichtung mit CCB-Zellen beimpft. 24 Stunden später

wurden in jede Vertiefung mit einem konfluenten Monolayer jeweils 0,2 ml einer

dekadischen, logarithmischen Verdünnungsreihe (10-1–10-9) der Viruslösung pipettiert. Je

Verdünnungsstufe wurden vier Vertiefungen beimpft. Zusätzlich wurde auf jeder

Mikrotiterplatte eine Kontrolle mitgeführt. Hierfür wurden vier Vertiefungen mit 0,2 ml

Zellkulturmedium inokuliert. Die beimpften Mikrotiterplatten wurden 14 Tage bei 25 °C in

einer Atmosphäre mit 2 % CO2 inkubiert. Täglich wurde der Zellrasen mikroskopisch

untersucht und Veränderungen dokumentiert. Es wurde speziell auf Verfärbungen des

Zellkulturüberstandes, abgelöste Zellen, Bildung von Riesenzellen und Plaques im Zellrasen

geachtet. Anhand der nach Bonin (1973) zitierten, modifizierten Methode nach Kärber (1931)

wurde die Infektiosität anschließend berechnet (KÄRBER 1931; BONIN 1973). Die

verwendete Viruslösung hatte einen Titer von 1.000 KID50/0,2 ml Medium. Sie diente als

Ausgangsmaterial für die Infektion von Karpfen, Wildfischen, für die Klonierungsversuche

sowie zur Herstellung positiver PCR-Kontrollen.

4.2 Versuchstiere

Alle Tierversuche wurden vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und

Lebensmittelsicherheit unter dem Aktenzeichen 09/1626 genehmigt.

4.2.1 SPF-Fische

In den Kohabitations- und Infektionsversuchen wurden Karpfen (Cyprinus carpio) aus

Laborzucht verwendet. Diese wurden parasiten- und virusfrei aufgezogen und entstammten

als Geschwistertiere einer Kreuzung von Karpfen der Karpfenstämme R8 und R3:

R8F10 x R3F10 (Agricultural University Wageningen, Niederlande). Zum Zeitpunkt der

Versuchsreihen betrug das Gewicht der sechs Monate alten SPF-Karpfen durchschnittlich

15 g. Um auszuschließen, dass es zu einem vorherigen Zeitpunkt zu einer KHV-Infektion

kommen konnte, wurden vor Versuchsbeginn Gewebeproben von sechs Fischen auf die


Abwesenheit des KHV-Genoms überprüft. Die gleiche Anzahl an Fischen wurde gleichzeitig

mit KHV infiziert, um die Empfänglichkeit der Tiere für das Virus zu testen.

4.2.2 Aufzucht und Haltung

Die Karpfen wurden als befruchtete Eier von der Agricultural University Wageningen

(Niederlande) bezogen. Die Fische wurden in der Abteilung Fischkrankheiten und

Fischhaltung des Zentrums für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover

unter spezifisch parasiten- und virusfreien (SPF) Bedingungen aufgezogen und in einer mit

rezirkulierendem Leitungswasser befüllten Kreislaufanlage bei 18–23 °C gehalten. Zur

Fütterung der Karpfen wurde handelsübliches Karpfenfutter (Skretting, Niederlande)

verwendet, welches einmal täglich in einer Menge von 1 % des Körpergewichts den Tieren

angeboten wurde.

Versuchsfische wurden in mit Leitungswasser befüllten 20–80 l desinfizierten Glasaquarien

gehalten. Teilwasserwechsel wurden regelmäßig durchgeführt. Des Weiteren wurden das

Allgemeinbefinden der Tiere und die Wassertemperatur täglich dokumentiert.

4.2.3 Handling

Während der Manipulation der Fische wurden Einmalhandschuhe getragen. Für jedes Becken

wurden separate Kescher (Rebie, Bielefeld), Schläuche (Eheim, Deizisau), Stabheizungen

(Eheim, Deizisau), Thermometer (Rebie, Bielefeld) und Narkosebecken (Rebie, Bielefeld)

verwendet. Vor dem Umsetzen von Versuchsfischen in andere Becken wurden diese mit

heißem Wasser gespült und anschließend mit 0,5 M Natronlauge (Applichem, Darmstadt)

desinfiziert.

4.2.4 Narkose und Tötung

Für die Narkose wurden die Fische in mit Leitungswasser befüllte 1,5 l Plastikaquarien

(Rebie, Bielefeld) umgesetzt. Das Narkosemittel MS 222 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen)


wurde mit 150 mg/l Wasser dosiert. Die Fische verblieben bis zum Erlöschen des

Augendrehreflex in der Lösung. Für die Euthanasie wurde eine Dosierung von 500 mg/l

verwendet. Die Fische wurden dem Wasser entnommen, wenn keine Atembewegung mehr

festgestellt werden konnte.

4.2.5 Entnahme von Gewebeproben bei Karpfen

4.2.5.1 Gewebeproben für DNA-Extraktion

Von allen zu beprobenden Versuchskarpfen wurden Organproben bestehend aus Leber, Niere,

Milz, Gehirn und Kieme entnommen. Von Karpfen, die in Laborinfektion 2 zum Einsatz

kamen, wurden außerdem separat Proben von Haut und Flossen angefertigt. Die Organe

wurden in sterilisierte 2 ml Reaktionsgefäße (Eppendorf, Hamburg) überführt und pro Fisch

gepoolt. Für jeden Fisch wurde eine eigene sterilisierte Schere und Pinzette verwende. Die

entnommenen Gewebepools wurden für eine spätere Untersuchung mittels PCR auf KHV-

spezifische DNA-Sequenzen bei -80 °C gelagert.

4.2.5.2 Gewebeproben für RNA-Extraktion

Von allen zu beprobenden Kontroll- und Infektionskarpfen aus den Versuchen zur

Laborinfektion von verschiedenen Wildfischarten mit Zellkulturvirus wurden Organproben

bestehend aus Leber, Niere, Milz, Gehirn und Kieme entnommen. Von Karpfen, die in

Laborinfektion 2 zum Einsatz kamen, wurden außerdem separat Proben von Haut und Flossen

angefertigt. Die Organe wurden in zuvor mit 1 ml RNALater (QIAGEN, Hilden) sterilisierten

2 ml Reaktionsgefäße (Eppendorf, Hamburg) überführt und gepoolt. Für jeden Fisch wurde

eine eigene sterilisierte Schere und Pinzette verwende. Die entnommenen Gewebepools

wurden über Nacht bei 4 °C aufbewahrt und danach für eine spätere cDNA-Analyse bei

-20 °C gelagert.


4.2.6 Laborinfektion zur Prüfung der Empfänglichkeit von Karpfen für das KHV

Vor Versuchbeginn wurden sechs SPF-Karpfen mit in der Zellkultur vermehrtem KHV

infiziert, um die Empfänglichkeit der Tiere für das Virus zu testen. Zuvor narkotisierte

Versuchstiere wurden mit 0,1 ml KHV-Lösung (1000 KID50/0,2 ml) per Injektion i.p.

infiziert. Gleichzeitig wurde eine negativ-Kontrollgruppe bestehend aus sechs weiteren

Versuchskarpfen mit 0,1 ml PBS-Lösung (PAA, Pasching), wie bereits beschrieben, behandelt.

Die zwei Versuchsgruppen wurden jeweils in 20 l Plastikaquarien umgesetzt und für 14 Tage

bei 23 °C unter Durchführung regelmäßiger Teilwasserwechsel gehältert. In diesem Zeitraum

wurden die Karpfen im Hinblick auf das Auftreten von klinischen Symptomen unter

besonderer Berücksichtigung der für eine KHV-Infektion typischen Veränderungen

beobachtet. Nach 14 Tagen erfolgte die Euthanasie beider Gruppen. Anschließend wurden

Gewebeproben wie unter 3.2.5 beschrieben entnommen und bei -80 °C bis zur weiteren

Verwendung gelagert.

4.3 Wildfische

Die Haltung, das Handling, die Narkose und das Töten der Wildfische erfolgte wie unter 3.2

für Versuchskarpfen beschrieben.

4.3.1 Fang und Transport von Wildfischen

Für den Fang von Wildfischen aus Teichen mit akut mit KHV infizierten Karpfenbeständen

kamen vorrangig Reusen und Wurfnetze zum Einsatz. So konnte ein Ablassen des

Teichwassers vermieden werden, welches zusätzlichen Stress für die Tiere bedeutet hätte und

vermutlich zu weiteren Verlusten in den Karpfenbeständen geführt hätte. Fische aus

Ablaufgräben wurden mit Gleichstrom-Elektrobefischungsgeräten oder Bockreusen gefangen.

Fische aus Teichen mit latent mit KHV infizierten Karpfenbeständen wurden während der

Frühjahrs- oder Herbstbefischung aus der Fischsammelgrube nahe dem Mönch nach

Herablassen des Wasservolumens abgesammelt. Die Tiere wurden vor Ort zusammen mit


Teichwasser in lebensmittelechte Tüten (Lacers, Berlin) überführt, mit Sauerstoff versetzt,

verschlossen nach Hannover transportiert und wie unter 3.2 beschrieben in Hälterungsbecken

überführt.

4.3.2 Auswahl und Haltung von Wildfischen für die Laborinfektionsversuche

Die in diesem Versuchsteil verwendeten Fische wurden von einem Fischgroßhändler

bezogen, in dessen Beständen zuvor bei Kontrolluntersuchungen keine KHV-

Genomsequenzen nachgewiesen werden konnten und auch keine KHV-bedingten Verluste in

den Fischbeständen beobachtet wurden. Die Auswahl der verwendeten Fischarten orientierte

sich an dem zuvor in der Biozönose der Teichwirtschaften beobachteten Artenspektrum,

sowie nach der Verfügbarkeit beim Großhändler. Des Weiteren sollten auch Fischarten im

Versuch vertreten sein, die nicht der Familie der Karpfenfische angehören. Fünf Fische der

jeweiligen Art wurden vor Versuchsbeginn wie unter 3.2. beschrieben auf die Abwesenheit

von KHV-Genomsequenzen überprüft.

4.3.3 Entnahme von Gewebeproben bei Wildfischen

4.3.3.1 Gewebeproben für DNA-Extraktion

Gewebeproben wurden von Wildfischen für die DNA-Extraktion wie unter 3.2.5.1

beschrieben entnommen. Das Kiemengewebe von Wildfischarten aus der Feldstudie wurde

nicht für die Untersuchung auf KHV-Genomsequenzen herangezogen um falsch-positive

Ergebnisse durch von außen anhaftendes Virus auszuschließen.

4.3.3.2 Gewebeproben für RNA-Extraktion

Gewebeproben für die RNA-Extraktion von Wildfischen wurden wie unter 3.2.5.2

beschrieben entnommen. Das Kiemengewebe von Wildfischarten aus der Feldstudie wurde


nicht für die cDNA-Analyse herangezogen, um falsch-positive Ergebnisse durch von außen

anhaftendes Virus auszuschließen.

4.4 Felduntersuchungen

Die Auswahl der zu beprobenden Unternehmen und Teiche erfolgte in enger Zusammenarbeit

und in Absprache mit der Sächsischen Tierseuchenkasse (Fischgesundheitsdienst, Dresden)

und der Sächsischen Landesanstalt für Landwirtschaft und Geologie (LfULG, Königswartha).

Des Weiteren wurden die Termine für die Beprobung von akut infizierten Teichen mit den

Teichwirten an den betroffenen Teichen direkt abgesprochen, um zu Beginn des

Krankheitsausbruches eine Probennahme zu gewährleisten. Der Fang der Fische erfolgte in

Abstimmung und mit Unterstützung durch den betroffenen Betrieb und der LfULG.

Untersucht wurden Wildfische der Teichbiozönose, die mit latent infizierten Karpfen (K1–K3)

und mit akut infizierten Karpfen (K1, K3) besetzt waren sowie Ablaufgräben unterhalb dieser

Teiche. Außerdem wurden ein sanierter Teich und dessen Ablaufgraben in den

Untersuchungsumfang mit einbezogen. Dieser Teich wurde mit Branntkalk desinfiziert,

trocken gelegt und ein Jahr nach dem durch KHV bedingten Verlustgeschehen erneut mit

Karpfenbrut (KV) einer anderen zuvor negativ auf KHV getesteten Population besetzt.

Probenentnahmen wurden während des gesamten Untersuchungszeitraumes erst nach der

amtlichen Feststellung eines KHV-Ausbruches durch den sächsischen Fischgesundheitsdienst

und parallel zu zusätzlichen Kontrolluntersuchungen an zehn aus diesen Teichen entnommen

Karpfen inklusive Teichwasser. Diese Untersuchungen wurden in der Abteilung für

Fischkrankheiten und Fischhaltung der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt.

4.4.1 Arbeitsplan in der Feldstudie

Innerhalb des Untersuchungszeitraumes wurden Teiche und Ablaufgräben während eines

akuten Ausbruches der KHV-Erkrankung insgesamt achtmal beprobt. Teiche, die mit einem

latent mit KHV infizierten Karpfenbestand besetzt waren, wurden im gleichen Zeitraum

ebenfalls achtmal beprobt. Fische aus dem sanierten und neu besetzten Teich wurden einmal


während der Herbstbefischung entnommen. Die Ablaufgräben des sanierten Teiches wurden

insgesamt an vier verschiedenen Terminen beprobt (siehe Tabellen 3, 4, und 5)

Tabelle 3: Übersicht der Probennahmen bei Karpfenteichen mit akutem KHV-Geschehen

Teich Besatz Anzahl der

Probennahmen Jahr der KHV-Infektion A K3 1 (07.2009) 2009 B K3 2 (09.2009) 2009 C K1 2 (09.2009/10.2009) 2009 D K1 2 (10.2009) 2009 E K3 1 (09.2009) 2009

Tabelle 4: Übersicht der Probennahmen bei Karpfenteichen mit latentem KHV-Geschehen

Teich Besatz Anzahl der

Probennahmen Jahr der KHV-Infektion 1 K2 1 (06.2009) 2007 2 K1 2 (07.2009/04.2010) + SPF 2008 3 K1 1 (11.2009) + SPF 2009 4 K2 1 (09.2009) 2008 5 Kv 1 (10.2009) 2009 6 Kv 1 (10.2009) + SPF 2009 7 K1 1 (09.2009) 2009

Erkärung: SPF: Kohabitation mit SPF-Karpfen

Tabelle 5: Übersicht der Probennahmen bei einem sanierten Karpfenteich

Ablauf/Teich Besatz Probennahme Jahr der KHV-Infektion Ablauf K1 05.2009 2008 Ablauf K1 06.2009 2008 Ablauf K1 07.2009 2008 Ablauf K1 09.2009 2008 Teich K2 04.2010 2008


4.4.1.1 Wildfische aus der Biozönose der Teiche

Bei den jeweiligen Probennahmen wurden Wildfische aus der Teichbiozönose entnommen.

Entsprechend des Vorkommens an Wildfischen sollten pro Teich jeweils mindestens 20

Fische pro relevanter Art einzeln beprobt werden. Das Artenspektrum, sowie die Anzahl an

Fischen variierten in den jeweiligen beprobten Teichen sehr stark, weshalb nicht immer die

gleichen Arten und Mengen in den Probenumfang einbezogen werden konnten. Eine

Übersicht über die beprobten Fischarten und die Anzahl untersuchter Individuen ist in Tabelle

6 zu finden. Die Wassertemperatur wurde ebenfalls vor Ort aufgenommen.

Tabelle 6: Gesamtzahl beprobter Wildfische unterschiedlicher Arten aus sächsischen

Karpfenteichwirtschaften, die auf KHV spezifische DNA-Sequenzen untersucht wurden

Beprobte Fischarten Akute Teiche Latente Teiche Gesamt Cyprinidae Brachse (Abramis brama) 2 0 2 Giebel (Carassius carassius gibelio) 0 10 10 Gründling (Gobio gobio) 0 10 10 Moderlieschen (Leucaspius delineatus) 2 0 2 Döbel (Leuciscus cephalus) 0 1 1 Hasel (Leuciscus leuciscus) 0 10 10 Plötze (Rutilus rutilus) 13 33 46 Rotfeder (Scardinius erythrophthalmus) 32 26 58 Schleie (Tinca tinca) 33 58 91 Ictaluridae Zwergwels (Ictalurus nebulosus) 21 18 39 Gasterosteidae Stichling (Gasterosteus aculeatus) 13 21 34 Percidae Kaulbarsch (Gymnocephalus cernua) 8 39 47 Flußbarsch (Perca fluviatilis) 43 40 83 Zander (Sander lucioperca) 5 0 5 Esocidae Europäischer Hecht (Esox lucius) 7 8 15 Gesamt 179 274 453 Sanierter Teich nicht berücksichtigt


4.4.1.2 Wildfische aus Teichen mit akutem KHV-Geschehen

In fünf Teichen mit akutem KHV-Geschehen wurden im Jahr 2009 insgesamt 179 Wildfische

während des Ausbruches der KHV-Erkrankung sowie 14 Tage nach der ersten Probenahme

gefangen. In diesem Probenumfang vertreten waren Arten der Familien Cyprinidae,

Ictaluridae, Gasterosteidae, Percidae und Esocidae (siehe Tabelle 6). Die Fische aus diesen

Teichen wurden nach Arten getrennt, auf separate, desinfizierte 80 l Aquarien, welche mit gut

durchlüftetem Leitungswasser befüllt waren, verteilt und zeitnah drei bis vier Tage nach dem

Fang beprobt.

4.4.1.3 Wildfische aus Ablaufgräben von Teichen mit akutem KHV-Geschehen

In drei Ablaufgräben von zwei Teichen mit akutem KHV-Geschehen wurden in 2009

insgesamt 112 Wildfische während des Ausbruches der KHV-Erkrankung und 14 Tage nach

der ersten Probenahme gefangen. In diesem Probenumfang vertreten waren Arten der

Familien Cyprinidae, Ictaluridae, Gasterosteidae, Percidae und Esocidae (siehe Tabelle 7).

Bei Teich B wurden Wildfische aus zwei verschiedenen Ablaufgräben des gleichen Teiches

entnommen (siehe Tabelle 7). Die Fische der jeweiligen Arten dieses Probenumfanges

wurden auf separate, desinfizierte 80 l Aquarien, welche mit gut durchlüftetem

Leitungswasser befüllt waren, verteilt und zeitnah drei bis vier Tagen nach dem Fang beprobt.


Tabelle 7: Probenumfang aus Ablaufgräben von Teichen mit akutem KHV-Geschehen

Ablaufgraben Teich A Teich B Gesamt Graben 1 Graben 1 Graben 2 Cyprinidae Brachse (Abramis brama) 2 2 Giebel (Carassius carassius gibelio) 0 Gründling (Gobio gobio) 0 Moderlieschen (Leucaspius delineatus) 2 2 Döbel (Leuciscus cephalus) 0 Hasel (Leuciscus leuciscus) 0 Plötze (Rutilus rutilus) 2 2 Rotfeder (Scardinius erythrophthalmus) 10 20 30 Schleie (Tinca tinca) 1 9 9 19 Ictaluridae Zwergwels (Ictalurus nebulosus) 9 9 Gasterosteidae Stichling (Gasterosteus aculeatus) 6 6 Percidae Kaulbarsch (Gymnocephalus cernua) 3 1 4 Flußbarsch (Perca fluviatilis) 4 8 14 26 Zander (Sander lucioperca) 1 4 5 Esocidae Europäischer Hecht (Esox lucius) 2 3 2 7 Gesamtzahl 18 31 63 112

4.4.1.4 Wildfische aus Teichen mit latentem KHV-Geschehen

In sieben Teichen mit latentem KHV-Geschehen wurden bei acht Probennahmen insgesamt

274 Wildfische zwischen 2008 und 2010 gefangen. Die Fische aus diesen Teichen wurden

während der Frühjahrs- oder Herbstbefischung beim Absenken des Teichwasserspiegels in

der Sammelgrube nahe dem Mönch gefangen. Es wurden 12 verschiedene Wildfischarten der

Teichbiozönose gefangen. Im Probenumfang enthalten waren Arten der Familien Cyprinidae,

Ictaluridae, Gasterosteidae, Percidae und Esocidae (siehe Tabelle 6 und 8).


Tabelle 8: Probenumfang aus Teichen mit latent infiziertem Karpfenbesatz und Kohabitationskarpfen

Beprobte Fischarten Latente Teiche SPF Cyprinidae Giebel (Carassius carassius gibelio) 10 6 Gründling (Gobio gobio) 10 6 Hasel (Leuciscus leuciscus) 10 6 Plötze (Rutilus rutilus) 33 6 Rotfeder (Scardinius erythrophthalmus) 26 6 Schleie (Tinca tinca) 58 18 Ictaluridae Zwergwels (Ictalurus nebulosus) 18 6 Gasterosteidae Stichling (Gasterosteus aculeatus) 21 6 Percidae Kaulbarsch (Gymnocephalus cernua) 39 12 Flußbarsch (Perca fluviatilis) 40 10 Esocidae Europäischer Hecht (Esox lucius) 8 5 Gesamt 273 87

4.4.1.4.1 Kohabitation von Wildfischen aus latent infizierten Teichen mit SPF-Karpfen

Aus latent infizierten Teichen entnommene Wildfische wurden teilweise in einen

Kohabitationsversuch eingesetzt. Dazu wurden die jeweiligen Arten dieses Probenumfanges

auf separate, desinfizierte 80 l Aquarien verteilt, welche mit gut durchlüftetem

Leitungswasser befüllt waren. Das Hälterungswasser wurde schrittweise auf 25 °C aufgeheizt

und die Fische durch eine simulierte Befischung mittels Handkescher gestresst wie unter 3.5.1

beschrieben. Eine Hälfte der Fische wurde zwei Tage später getötet und wie unter 3.2.5

beprobt. Die andere Hälfte der nach Arten aufgeteilten Fische wurde über einen Zeitraum von

14 Tagen mit jeweils sechs SPF-Karpfen kohabitiert. Täglich erfolgten ein Wasserwechsel

von 90 % sowie die Beobachtung der Fische auf das Auftreten von klinischen Symptomen

einer Erkrankung mit dem KHV. Die Wildfische sowie die Karpfen wurden anschließend wie

unter 3.2 beschrieben euthanasiert und beprobt.


4.4.1.5 Wildfische aus Teich und Ablauf mit saniertem Bestand

Dem Ablauf des sanierten Teiches wurden im Jahr 2009 insgesamt 71 Wildfische

entnommen. Der Fang der Fische erfolgte mit einfachen Bockreusen, die am Abend vor der

Probennahme im Gewässer platziert wurden. Nach dem Transport wurde das

Hälterungswasser schrittweise auf 25 °C aufgeheizt und die Fische anschließend wie unter

3.5.1 beschrieben beprobt. Während der Herbstbefischung im Jahr 2010 wurden 74

Wildfische im Teich gefangen. Diese wurden dann mit SPF-Karpfen wie unter 3.4.1.4.1

beschrieben kohabitiert und beprobt (siehe Tabelle 9).

Tabelle 9: Probenumfang sanierter Teich und Ablaufgraben mit Kohabitationskarpfen

Beprobte Fischarten Teich SPF Ablauf Cyprinidae Gründling (Gobio gobio) 20 6 1 Plötze (Rutilus rutilus) 19 6 16 Rotfeder (Scardinius erythrophthalmus) 3 - - Schleie (Tinca tinca) 1 - 5 Ictaluridae Zwergwels (Ictalurus nebulosus) - - 18 Percidae Kaulbarsch (Gymnocephalus cernua) 11 1 20 Flußbarsch (Perca flviatilis) 20 6 11 Gesamtzahl 74 19 71


4.5 Laborinfektion von Wildfischen

In den Laborinfektionen sollte das Spektrum an für das KHV empfänglichen Fischen

experimentell untersucht werden. Die in den Versuchen verwendeten Wildfische wurden von

einem Großhändler bezogen, der bisher nachweislich nur KHV-freie Fischbestände führte

(siehe Tabelle 10). Pro Fischart wurden vor Versuchsbeginn jeweils fünf Individuen einer

allgemeinen Kontrolluntersuchung und einer speziellen parasitologischen Untersuchung von

Kiemen und Haut unterzogen. Diese wurden danach mit einem Handkescher wie unter 3.5.1

beschrieben gestresst und drei Tage später euthanasiert. Die angefertigten Gewebepools der

jeweiligen Fische wurden anschließend auf KHV-Genomsequenzen mittels real-time PCR

nach GILAD et al. (2004) untersucht. Die Ergebnisse der KHV-Kontrolluntersuchungen

waren alle negativ.

4.5.1 Infektionsversuch 1 (Badinfektion)

Für die Infektion von Wildfischen über das Bad wurde eine in Zellkultur hergestellte

Viruslösung verwendet (siehe 3.1.1). Hierzu wurden die 151 Wildfische sowie die Karpfen

der Infektionskontrolle auf zwei 20 l Plastikaquarien aufgeteilt, welche mit jeweils 5 l

Leitungswasser befüllt waren. In jedes Plastikaquarium wurden daraufhin 250 ml einer

Viruslösung mit einer Infektiosität von 275 KID50/ml gegeben und die Fische bei 25 °C für

60min inkubiert (siehe Abbildung 1). Anschließend wurden die Fische nach Spezies getrennt

und in separate, desinfizierte 80 l Aquarien umgesetzt, welche mit gut durchlüftetem

Leitungswasser befüllt waren. Die Haltung erfolgte bei 25 °C unter Durchführung

regelmäßiger Teilwasserwechsel. In diesem Zeitraum wurden die Fische im Hinblick auf das

Auftreten von klinischen Symptomen unter besonderer Berücksichtigung der für eine KHV-

Infektion typischen Symptome beobachtet. Verendete Karpfen wurden dokumentiert und

abgesammelt. An Tag 7 p.i. wurden 50 % der Fische der jeweiligen Arten euthanasiert und

beprobt. Im Anschluss daran wurden die verbliebenen Individuen mittels simulierter

Befischung gestresst, daraufhin in desinfizierte 100 l Aquarien umgesetzt und mit jeweils


sechs SPF Karpfen kohabitiert. Für die simulierte Befischung wurden die Fische fünfmal

aufeinander folgend für 30 sec im Kescher über dem Hälterungsbecken der Luft exponiert.

Zwischen den Intervallen fand eine Erholungsphase von jeweils 1 min statt. An Tag 17 p.i.

erfolgte die Euthanasie der restlichen Wildfische, Kontrollkarpfen sowie der kohabitierten

SPF-Karpfen. Anschließend wurden Gewebeproben wie unter 3.2.5 beschrieben entnommen

und entweder bei -80 °C eingefroren oder in 1 ml RNALater (QIAGEN, Hilden) bei 4 °C bis

zur weiteren Verwendung gelagert (siehe Abbildung 2).

Abbildung 1: Aufbau der Badinfektion von Wildfischen in Laborversuch 1

Abbildung 2: Probennahme an Tag 7 der Laborinfektion


Tabelle 10: Verwendete Fischarten in Laborinfektion 1

Fischart Tag 7 Tag 17 SPF 20 Gründling (Gobio gobio) 8 10 6 15 Nase (Chondrostoma nasus) 7 8 6 20 Orfe (Leuciscus idus) 10 10 6 20 Rotfeder (Scardinius erythrophthalmus) 10 10 6 20 Schleie (Tinca tinca) 10 10 6 30 Stichling (Gasterosteus aculeatus) 0 8 6 20 Flussbarsch (Perca fluviatilis) 7 8 6 12 Infektionskontrolle Karpfen (Cyprinus carpio) 6 6 6 Während der Inkubation in der Infektionslösung verstarben 2 Gründlinge, 22 Stichlinge und 5 Flussbarsche, welche nicht in den Untersuchungsumfang mit eingezogen wurden

4.5.2 Infektionsversuch 2 (Kohabitation)

In diesem Versuchsteil erfolgte die Infektion von Wildfischen durch Kohabitation mit zuvor

über das Bad mit KHV infizierten SPF-Karpfen. Dazu wurden sechs SPF-Karpfen in ein 2 l

Plastikaquarium gesetzt, welches mit Leitungswasser befüllt war. Daraufhin wurden 50 ml

einer Viruslösung mit 562 KID50/ml in dieses Plastikaquarium gegeben und die Fische bei

25 °C für 90 min inkubiert (siehe Abbildung 3). Anschließend wurden die Karpfen in ein

desinfiziertes, mit Leitungswasser befülltes 400 l Aquarium umgesetzt. Das Wasser hatte eine

Temperatur von 25 °C und wurde stetig durchlüftet. Bei Bedarf wurden Teilwasserwechsel

durchgeführt. Daraufhin erfolgte die Kohabitation mit den in Tabelle 11 dargestellten

Wildfischen. Um die Infektiosität des von den infizierten Karpfen ausgeschiedenen Virus zu

überprüfen, wurden weitere sechs Kontrollkarpfen mit markierten Flossen hinzugesetzt. An

Tag 7 p.i. wurden die Fische mittels Kescher gestresst und die jeweiligen Arten in separate,

desinfizierte 80 l Aquarien verteilt, welche mit gut durchlüftetem, 25 °C warmem

Leitungswasser befüllt waren. Im Anschluss erfolgte die Kohabitation jeder Gruppe mit sechs

SPF-Karpfen. Innerhalb dieses Zeitraumes wurden die Fische im Hinblick auf das Auftreten

von klinischen Symptomen unter besonderer Berücksichtigung der für eine KHV-Infektion

typischen Symptome beobachtet. Verendete Karpfen wurden dokumentiert und abgesammelt.

72 h nach Entnahme der Fische aus dem 400 l Aquarium, wurden sechs SPF-Karpfen in das

Hälterungswasser gesetzt um die Tenazität des Virus in der Infektionslösung zu prüfen. An

Tag 17 p.i. erfolgte die Euthanasie der Wildfische, der Kontrollkarpfen, der kohabitierten


SPF-Karpfen und der Karpfen aus dem 400 l Aquarium. Anschließend wurden Gewebeproben

wie unter 3.2.5 beschrieben entnommen und entweder bei -80 °C eingefroren oder in 1 ml

RNALater (QIAGEN, Hilden) bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert.

Abbildung 3: Infektion von SPF-Karpfen in Laborstudie 2

Tabelle 11: Verwendete Fischarten in Laborinfektion 2

Fischart SPF 10 Gründling (Gobio gobio) 6 10 Goldfische (Carassius auratus) 6 10 Orfe (Leuciscus idus) 6 10 Schleie (Tinca tinca) 6 6 Kontroll-SPF (Cyprinus carpio) 6 6 Kontroll-SPF-Infektionwasser (Cyprinus carpio) Während der Inkubation mit den infizierten SPF-Karpfen verstarben 6 Gründlinge, welche nicht in den Untersuchungsumfang mit eingezogen wurden


4.6 Molekularbiologische Methoden

4.6.1 Zellkulturen

Stabilate virushaltiger Zellkulturen wurden aufgetaut und das Zellmaterial vor der

Weiterverarbeitung 20 min bei 3.000 x g abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 200 µl

Zellkulturüberstand aufgenommen und danach 100 µl der Virussuspension in 2 ml

Reaktionsgefäße (Eppendorf, Hamburg) überführt und wie unter 3.6.3 beschrieben

weiterverarbeitet.

4.6.2 Gewebeproben

Gewebeproben wurden aufgetaut und 25 mg des zuvor angefertigten Organpools in ein 2 ml

Reaktionsgefäß (Eppendorf, Hamburg) überführt, mit einer Stahlkugel (Isometall,

Pleidelsheim) bestückt und in einer Schwingmühle (Qiagen, Hilden) bei 20 Hz 2 Minuten

homogenisiert. Anschließend wurde wie unter 3.6.3 beschrieben weiterverfahren.

4.6.3 DNA-Extraktion mittels QIAamp® DNA Mini-Kit (Qiagen, Hilden)

Bei den molekularbiologischen Arbeiten wurde darauf geachtet, dass es zwischen den

Schritten der DNA-Extraktion, der Präparation des Mastermixes und der Durchführung der

PCR zu einer räumlichen Trennung kam. Bei jeder Extraktion wurden stets eine positive und

eine negative Kontrolle mitgeführt. PCR-positives Probenmaterial wurde von Karpfen nach

einer Laborinfektion mit KHV entnommen, die KHV-spezifische Krankheitssymptome

zeigten. PCR-negativ Kontrollen wurden aus dem Gewebe von Flundern (Platichthys flesus)

hergestellt. Alle Positivkontrollen wurden in einer separaten Eppendorf MiniSpin®

(Eppendorf, Hamburg) Zentrifuge behandelt. Bei allen molekularbiologischen Arbeiten

wurden zwischen den verschiedenen Arbeitsschritten die Einmalhandschuhe gewechselt. Alle

verwendeten Pipetten, Zentrifugen und Arbeitsflächen wurden in regelmäßigen Abständen


gereinigt, danach abschließend mit Kohrsolin 1,5 % (Bode Chemie, Hamburg) desinfiziert

und 30 min mit UV-Licht bestrahlt.

Genomische DNA aus Zellkulturen und Gewebeproben wurde ausschließlich mit dem

QIAamp® DNA Mini-Kit (Qiagen, Hilden) extrahiert. Dazu wurden in 2 ml Reaktiongefäße

mit den jeweiligen Proben 180 µl ATL-Puffer (Qiagen, Hilden) und 20 µl Proteinase K

(Qiagen, Hilden) gegeben und für 60 min bei 56 °C in einem Heizblock (Thermomixer

Comfort, Eppendorf, Hamburg) mit 900 Hz Schüttelfrequenz bis zur vollständigen Lyse des

Gewebes inkubiert. Anschließend wurden 200 µl AL-Puffer zugegeben und bei 70 °C weitere

10 min im Heizblock inkubiert. Durch Zugabe von 200 µl 99 %-igem Ethanol wurde im

Anschluss die DNA ausgefällt. Die gesamte im 2 ml Reaktionsgefäß befindliche Probe wurde

daraufhin in eine Silicagel-Säule (Qiagen, Hilden), welche sich in einem deckellosen 2 ml

Reaktionsgefäß (Qiagen, Hilden) befand, überführt und für 60 s bei 6.800 x g zentrifugiert.

Das durchgelaufene Filtrat wurde verworfen und die Säule in ein neues Reaktionsgefäß

gesteckt. Darauf folgten zwei Waschschritte der in der Säule befindlichen DNA. Der erste mit

500 µl AW1-Puffer (Qiagen, Hilden) und einer Zentrifugation von 60 s bei 6.800 x g und ein

zweiter mit 500 AW2-Puffer (Qiagen, Hilden). Um die Reste der Waschlösung zu entfernen,

wurde daraufhin 60 s bei und 20.800 x g zentrifugiert. Um die DNA zu eluieren, wurden 150

µl AE-Puffer (Qiagen, Hilden) auf die Silicagel-Säule (Qiagen, Hilden) aufgetragen und 5

min bei Raumtemperatur inkubiert. Dadurch erfolgte die Resuspension in der Säule und nach

Zentrifugation für 60 s bei 6.800 x g wurde die DNA ausgewaschen und das Eluat bei -80 °C

in 0,2 ml Reaktionsgefäßen (Eppendorf, Hamburg) gelagert.

4.6.4 RNA-Extraktion mittels peqGOLD TriFast Reagenz

RNA aus Gewebeproben wurde ausschließlich mittels peqGOLD TriFast Reagenz (Peqlab

Biotechnologie GmbH, Erlangen) extrahiert. Bei jeder Extraktion wurden stets eine positive

und eine negative Kontrolle mitgeführt. KHV-positives Kontrollprobenmaterial für die RNA-

Extraktion wurde infizierten Karpfen aus der Laborinfektion zur Prüfung der Empfänglichkeit

entnommen, die KHV-spezifische Krankheitssymptome zeigten. Negative RNA-

Extraktionskontrollen stammten von SPF-Karpfen aus eigener Aufzucht.


Um eine Kontamination mit RNasen zu verhindern, wurden Wasser, SDS-Lösungen (Sigma-

Aldrich, Taufkirchen), sowie Metallkugeln (Isometall, Pleidelsheim), die zum Lösen der RNA

eingesetzt wurden, vorher mit Diethylpyrocarbonat (AppliChem GmbH, Darmstadt)

behandelt. Während aller Arbeitsschritte erfolgte eine Kühlung der Proben auf Eis.

Es wurden 20 bis 100 mg des in RNALater (QIAGEN, Hilden) gelagerten Gewebes in ein

zuvor mit 1 ml peqGOLD TriFast (Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen) befülltes 2 ml

Reaktiongefäß (Eppendorf, Hamburg) überführt, mit einer Metallkugel bestückt und in einer

Schwingmühle (Qiagen, Hilden) bei 20 Hertz 2 Minuten homogenisiert. Danach wurden die

Proben 5 min bei Raumtemperatur bis zur Dissoziation der Nukleotidkomplexe stehen

gelassen. Anschließend wurden sie in ein neues Reaktionsgefäß überführt, 0,2 ml Chloroform

(Sigma-Aldrich, Taufkirchen) hinzugegeben und danach für 15 s kräftig geschüttelt. Die

Proben wurden daraufhin 5 min bei Raumtemperatur stehen gelassen und im Anschluss

10 min bei 11.500 x g und 4 °C bis zur Phasenauftrennung zentrifugiert. Die mittlere,

wässrige RNA-Phase wurde in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß überführt, mit 0,5 ml

Isopropanol (Sigma-Aldrich, Taufkirchen) gemischt und für 5 min bei Raumtemperatur

inkubiert. Daraufhin folgte ein Zentrifugationsschritt von 20 min bei 4 °C und 11.500 x g. Der

Isopropanolüberstand wurde vorsichtig entfernt und das entstandene RNA-Pellet zweimal mit

0,9 ml 75 % Ethanol (AppliChem GmbH, Darmstadt) durch Aufrütteln (Vortexen) und

anschließendes Zentrifugation für 8 min bei 9.100 x g und 4 °C gewaschen und der Überstand

verworfen. Zum Lösen der RNA wurde das Pellet 10 bis 15 min an der Luft getrocknet und

durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren in 50 µl RNase-freiem Wasser gelöst und

anschließend für 10 min bei 56 °C in einem Heizblock (Thermomixer Comfort, Eppendorf,

Hamburg) inkubiert. Bis zur weiteren Verwendung wurde die RNA bei -80 °C gelagert.


4.6.5 Reverse Transkription mittels Maxima™ Reverse Transcriptase

Die reverse Transkription wurde mit dem Maxima™ Reverse Transcriptase Kit (Fermentas

GmbH, St. Leon-Rot) durchgeführt und während aller Zwischenschritte erfolgte die

Aufbewahrung der Proben auf Eis.

Tabelle 12: Reaktionsmix für die Reverse Transkription DNase I Verdau

Reaktionskomponenten Volumen RNA (200 ng/µl) 6,5 µl 5X RT-Buffer 1 µl RiboLock™ RNase Inhibitor 0,5 µl DNase I, RNase-free 2 µl Endvolumen 9,5 µl

Die verwendete, zuvor extrahierte Template-RNA wurde auf 200 ng/µl verdünnt und

anschließend im Verhältnis wie in Tabelle 12 angegeben in ein 0,2 ml Reaktionsgefäß

(Eppendorf, Hamburg) überführt, vorsichtig gemischt und 30 min bei 37 °C in einem

Mastercycler Gradient (Eppendorf, Sarstedt) inkubiert. DNase I (Fermentas GmbH, St. Leon-

Rot) wurde zusätzlich hinzugegeben, um verbliebene genomische DNA zu entfernen. Im

Anschluss wurde 1 µl EDTA (Applichem, Darmstadt) hinzugefügt und bei 65 °C für 10 min

inkubiert. Darauf folgten die Zugabe der in Tabelle 13 angegebenen Reaktionskomponenten

und eine fünfminütige Inkubation bei 65 °C. Anschließend wurden 5 µl RT-Buffer, 0,5 µl

RiboLock und 0,5 µl Maxima® Reverse Transkriptase in die Reaktionsgefäße pipettiert, die

reverse Transkription nach dem Protokoll wie in Tabelle 14 beschrieben durchführt und

anschließend die Reaktion durch eine fünfminütige Inkubation bei 85 °C gestoppt. Die

resultierende cDNA wurde bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert.


Tabelle 13: Reaktionsmix für die Reverse Transkriptase

Reaktionskomponenten Volumen Oligo(dT)18Primer (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) 0,5 µl Random Hexamer Primer (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) 0,25 µl dNTPs (10 mM) (Roth, München) 0,25 µl A. dest 8,5 µl RNA 5 µl Endvolumen 14,5 µl

Tabelle 14: Temperaturprofil für die reverse Transkriptase

Zeit Temperatur (°C) Zyklen (n)

15 min 95 1

60 sec 95 1 30 sec 60 1

4.6.6 Real-time PCR

Real-time PCR-Systeme bieten die Möglichkeit des direkten Nachweises mit gleichzeitiger

Quantifizierung von PCR-Produkten (STERNER-KOCK et al. 2002). Mit diesen Systemen

können Fluoreszenzsignale detektiert werden. Die Fluoreszenz ist in der Regel proportional

zur Menge der entstandenen PCR-Produkte. So ist es möglich, die Ausgangsmenge an DNA-

Template zu quantifizieren (LEE et al. 1993; LIVAK et al. 1995). Grundsätzlich kann hier

zwischen zwei verschiedenen Detektionssystemen unterschieden werden. Unspezifische

Detektionssysteme basieren auf der Verwendung von mit Doppelstrang-DNA

interkalierenden Farbstoffen, wie beispielsweise SYBR Green I oder Ethidiumbromid.

Dagegen werden in spezifischen Detektionssystemen sequenzspezifische fluorogene

Sondensysteme unter Ausnutzung des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)

verwendet (CARDULLO et al. 1988; WITTWER et al. 1997). Dies ist beispielsweise bei

TaqMan-Sonden (Hydrolyse-Sonden), Hybridisierungssonden (FRET-Sonden) oder

„Molecular Beacons“ der Fall.


4.6.6.1 SYBR Green real-time PCR zur relativen Quantifizierung für das


(FORLENZA et al. 2008)

Um zu Überprüfen, ob in den Geweben der mit Zellkulturvirus infizierten Fische eine

Virusreplikation stattgefunden hatte, wurde im Anschluss an die reverse Transkription der

RNA eine SYBR Green-basierte real-time PCR durchgeführt. Die Überprüfung der Spezifität

erfolgte über die Schmelzkurvenanalyse. Dafür wurden die von ADAMEK et al. (2012)

publizierten Primer verwendet (siehe Tabelle 16), welche ein bestimmtes DNA-Fragment des

Thymidinkinase-Gen amplifizieren. Die Expression des Zielgens wurde mit der Expression

eines Referenzgens verglichen. Somit konnte eine relative Quantifizierung der Menge an Ziel-

DNA durchgeführt werden. Hierfür wurde das von FORLENZA et al. (2008) beschriebene

Housekeeping Gene 40S Ribosomal Protein S11 kloniert (siehe Tabelle 15). Von diesem

Plasmid wurde eine serielle Verdünnungsreihe hergestellt, welche als interner Standard zur

Normalisierung diente. Für den Mastermix wurde das Maxima™ SYBR Green qPCR Master

Mix (2X), ROX Solution provided (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) Kit eingesetzt. Dieser

wurde in einer eigens dafür vorgesehenen DNA-Workstation in einem PCR-Kühlrack (beide:

IsoFreeze PCR-Rack, Kisker Biotech GmbH & Co. KG, Steinfurt) wie in Tabelle 17 angeben

zusammengestellt und Aliquots von 20 µl in 8-er Soft Strips (Biozym, Hess. Oldendorf) auf

die jeweiligen Vertiefungen verteilt. In einer wiederum eigens dafür vorgesehen DNA-

Workstation wurde anschließend die Template-DNA den Reaktionsgefäßen zugegeben. In

jedem PCR-Lauf wurden eine serielle Verdünnungsreihe des 40 S Plasmids, sowie eine

Negative Template Control (NTC) bestehend aus 5 µl A. dest. und eine Positivkontrolle,

welche aus unter Laborbedingungen mit Zellkulturvirus infizierten Fischen hergestellt wurde,

im Doppelansatz mitgeführt. Verwendet wurde dazu das in Tabelle 18 dargestellte

Temperaturprofil.


Tabelle 15: Primersequenzen des von FORLENZA et al. (2008) beschriebenen 40S Ribosomal Protein S11 Housekeeping Gene

Gen Primer Sequenz (5´ � 3´) Produkt 40 S q40S.FW1 CCG TGG GTG ACA TCG TTA CA 69 bp q40S.RV1 TCA GGA CAT TGA ACC TCA CTG TCT

Tabelle 16: Primersequenzen für den Nachweis einer KHV-Replikation mittels Thymidinkinase-Gen (ADAMEK et al. 2012)

Gen Primer Sequenz (5´ � 3´) GenBank ID KHV CyHV3_TK_qF1 TGG CTA TGC TGG AAC TGG TG DQ177346 CyHV3_TK_qR3 GCT GGT CTA TGG CGT GCT TG

Tabelle 17: Pipettierschema für die SYBR Green real-time PCR mit Primersequenzen für das Thymidinkinase-Gen zur relativen Quantifizierung (ADAMEK et al. 2012)

Reaktionskomponenten Volumen Maxima™ SYBR Green qPCR Master Mix (2X), ROX Solution provided (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) 12,5 µl

CyHV3_TK_qF1 0,5 µl

CyHV3_TK_qR3 0,5 µl

q40S.FW1 0,5 µl

q40S.RV1 0,5 µl

A. dest 5,5 µl

Template-DNA 5 µl

Endvolumen 25 µl

Tabelle 18: Temperaturprofil für die SYBR Green real-time für das Thymidinkinase-Gen (ADAMEK et al. 2012)


Initiale Denaturierung 10 min 95 1

Denaturierung 30 sec 95

Annealing 30 sec 60

Elongation 30 sec 72

40

Schmelzkurve 60 sec 95

30 sec 55

30 sec 95 90 x 0,5 °C


4.6.6.2 SYBR Green real-time RT-PCR zur Quantifizierung der KHV-Replikation

unter Verwendung des Thymidinkinase-Gens (ADAMEK et al. 2012) mit

externem Standard

Die Durchführung der SYBR Green reverse transcriptase (RT) real-time PCR für das

Thymidinkinase-Gen mit externen Standard (ADAMEK et al. 2012) erfolgte wie bereits unter

3.6.6.1 beschrieben mit dem Unterschied, dass zur absoluten Quantifizierung der

Virusvermehrung in den Geweben in jedem PCR-Lauf eine serielle Verdünnungsreihe des

Plasmids mitgeführt wurde.

Dieses Plasmid mit der klonierten Zielsequenz wurde wie unter 3.6.7 beschrieben hergestellt.

Die Berechnung der Kopienzahl des Plasmids, die Erstellung der Standardkurve und die

Datenanalyse erfolgten wie unter 3.6.7.1 beschrieben.

Es wurden die in Tabelle 16 dargestellten Primersequenzen verwendet. Das Pipettierschema

folgte Tabelle 17 und das Temperaturprofil wurde wie in Tabelle 18 dargestellt verwendet.

Tabelle 19: Pipettierschema für die SYBR Green real-time RT-PCR zur Amplifikation des Thymidinkinase-Gens zur Quantifizierung der KHV-Replikation (ADAMEK et al 2012)

Reaktionskomponenten Volumen Maxima™ SYBR Green qPCR Master Mix (2X), ROX Solution provided (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) 12,5 µl

CyHV3_TK_qF1 0,5 µl

CyHV3_TK_qR3 0,5 µl

A. dest 6,5 µl

Template-DNA 5 µl

Endvolumen 25 µl


4.6.6.3 SYBR Green real-time RT-PCR zur Quantifizierung des Gens kodierend

für das Major Capsid Protein-Gen (ORF92) des KHV (ADAMEK et al.

2012) mit externem Standard zum Nachweis einer KHV-Replikation

Die Durchführung der SYBR Green real-time RT PCR für das Major Capsid Protein-Gen mit

externen Standard (ADAMEK et al. 2012) erfolgte wie bereits unter 3.6.6.2 beschrieben.

Dieses Plasmid mit der klonierten Zielsequenz wurde wie unter 3.6.7 beschrieben hergestellt.

Die Berechnung der Kopienzahl des Plasmids, die Erstellung der Standardkurve und die

Datenanalyse erfolgten wie unter 3.6.7.1 beschrieben.



Tabelle 20: Primersequenzen für den Nachweis einer KHV-Replikation mittels Major Capsid Protein-Gen (ORF92) (ADAMEK et al. 2012)

Gen Primer Sequenz (5´ � 3´) Produkt KHV CyHV3_O92_qF1 AGC CAC CTC TTG GTC GTG 128 bp CyHV3_O92_qR1 ACT CCC TGT CCC AGC ACT C

4.6.6.4 SYBR Green real-time PCR zur Qualitätskontrolle der TaqMan real-time

PCR nach GILAD et al. (2004) mittels Capsid Triplex Protein-Gen

(ORF72)

Die Durchführung der SYBR Green real-time PCR für das Capsid Triplex Protein-Gen mit

externen Standard (ADAMEK et al 2012) erfolgte wie bereits unter 3.6.6.2 beschrieben.

Überprüft wurden die Gewebepools der Fische aus der Feldstudie, die mittels TaqMan real-

time PCR nach GILAD et al. (2004) positiv auf KHV-Genomsequenzen getestet wurden.




Tabelle 21: Primersequenzen für den Nachweis einer KHV-Replikation mittels Capsid Triplex Protein-Gen (ORF72) (ADAMEK et al. 2012)

Gen Primer Sequenz (5´ � 3´) Produkt KHV CyHV3_O72_qF1 CGA GAA GCA GGG TAT GGT C 132 bp CyHV3_O72_qR1 GGC GTG TAG GGC ACA AAG

4.6.7 Quantitative real-time PCR nach GILAD et al. (2004) zum Nachweis von KHV

Für den PCR-basierten KHV-Nachweis wurden in der vorliegenden Arbeit die von GILAD et

al. (2004) publizierten Primer- und Sondensequenzen verwendet (siehe Tabelle 22). Als

interne Positivkontrolle der Reaktion dienten in jedem Ansatz die Primer- und

Sondensequenzen nach HOFFMANN et al. (2006), welche zusätzlich zu einer exogenen

Kontroll-DNA (INTYPE IC-DNA, Labor Diagnostik GmbH Leipzig, Leipzig) in jeden

Reaktionsansatz hinzugesetzt wurden (siehe Tabelle 22). Diese Oligonukleotide basieren auf

dem EGFP-Gen (enhanced green fluorescent protein) und wurden als Qualitätskontrolle der

PCR verwendet. Das Temperaturprofil folgte den von GILAD et al. (2004) publizierten

Angaben.

Für den Mastermix wurde das QuantiTect®Multiplex PCR Kit (Qiagen, Hilden) eingesetzt.

Dieser wurde in einer eigens dafür vorgesehenen DNA-Workstation in einem PCR-Kühlrack

(beide: IsoFreeze PCR-Rack, Kisker Biotech GmbH & Co. KG, Steinfurt) wie in Tabelle 23

angeben zusammengestellt und Aliquots von 20 µl in 8-er Soft Strips (Biozym, Hess.

Oldendorf) auf die jeweiligen Vertiefungen verteilt. In einer wiederum eigens dafür

vorgesehen DNA-Workstation wurde anschließend die Template-DNA den Reaktionsgefäßen

zugegeben. In jedem PCR-Lauf wurden eine serielle Verdünnungsreihe des Plasmids (siehe

Tabelle 23), sowie eine Negative Template Control (NTC) bestehend aus 5 µl A. dest. und

eine Positivkontrolle, welche aus unter Laborbedingungen mit Zellkulturvirus infizierten


Fischen hergestellt wurde, im Doppelansatz mitgeführt. Das PCR-Programm wurde wie in

Tabelle 24 dargestellt verwendet.

Tabelle 22: Primer- und Sondensequenzen die in der TaqMan real-time PCR nach GILAD et

al. (2004) zur Detektion des KHV und zur Qualitätskontrolle der Reaktion verwendet wurden

Gen Primer Sequenz (5´ � 3´) Produkt KHV KHV_86 for GAC GCC GGA GAC CTT GTG 78 bp KHV_163 rev CGG GTT CTT ATT TTT GTC CTT GTT

Sonde KHV_109P FAM-CTT CTT CTG CTC GGC GAG CAC G-BHQ1

EGFP EGFP-1-F GAC CAC TAC CAG CAG AAC AC 176 bp

EGFP-10-R CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC

Sonde EGFP1-HEX HEX-AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC A-BHQ1

Tabelle 23: Zusammensetzung des Reaktionsansatzes für die real-time PCR nach GILAD et al. (2004) zum Nachweis von KHV

Reaktionskomponenten Volumen Probe Master Mix (2-fach) QuantiTect®Multiplex PCR Kit (Qiagen, Hilden) 12,5 µl

KHV-Primer Mix (KHV_86 for, KHV_163 rev, KHV_109P_FAM) 2 µl

IC2-Primer Mix (EGFP-1-for, EGFP-10-rev, EGFP-HEX) 2 µl

A. dest 3,25 µl

IC2 0,25 µl

Template-DNA 5 µl

Endvolumen 25 µl

Tabelle 24: PCR-Programm für die real-time PCR nach GILAD et al. (2004) zum Nachweis von KHV




Annealing 30 sec 60

40


4.6.7.1 Berechnung der Kopienzahl des Plasmids, Erstellen der Standardkurve und

Datenanalyse

Der DNA-Gehalt der Lösung mit dem unter 3.6.8 hergestellten Plasmid mit der klonierten

Zielsequenz wurde spektralphotometrisch bestimmt und es erfolgte die Berechnung der

Plasmidkonzentration in g/µl des Eluates nach der Formel:

Größe des Plasmids = 3015 bp, Größe des Inserts = 69 bp

Gewicht eines Plasmids:

5,535 x 10-22 g/ Base x (Länge des Vektors + Insert) x 2 = 3,38 x 10-18 g/ Plasmid

Anzahl der Plasmide pro ml:

DNA-Konzentration (g/ ml) / Gewicht pro Plasmid (g) = 7,2 x 1010 Plasmide/µl

Die ermittelte Konzentration an Plasmiden in der Lösung entspricht somit auch gleichzeitig

der Konzentration der spezifischen KHV-Genomäquivalente (Kopienzahl), also der

Zielsequenz. Aus der Plasmidlösung wurde eine logarithmische Verdünnungsreihe

angefertigt, die zwischen 1 und 108 Plasmide/µl für das Plasmid nach GILAD et al. (2004)

enthielt und zwischen 101 und 107 Plasmide/µl für die SYBR Green real-time PCR-Ansätze

nach ADAMEK et al. (2012). Hierbei war eine präzise Arbeitsweise unerlässlich. Von den

jeweiligen Verdünnungsstufen wurden Aliquotes hergestellt und bei -20 °C gelagert um sie

jeweils nur einmal direkt vor Gebrauch aufzutauen. Der hergestellte Standard wurde in jedem

real-time PCR-Lauf im Doppelansatz mitgeführt und so die zu untersuchenden Proben einer

absoluten Quantifizierung unterzogen. Eine optimale Effizienz der PCR-Reaktion liegt bei

100 %, welches sich in einer Steigung der Standardkurve von -3,322 widerspiegelt (HEID et

al. 1996). Die Proben wurden im Stratagene Mx3005PTM (Agilent Technologies, CB

Amsterdam Zuidoost, Niederlande) untersucht und mit der mitgelieferten Software analysiert.


4.6.8 Klonierung des PCR-Produktes für einen externen Standard

Ziel der Klonierung war die Herstellung eines Standards, der die absolute Quantifizierung

eines Teilstückes des Zielgens, welches auch für die Zielsequenz der real-time PCR kodiert,

in einen Vektor zu ligieren. Kompetente E. coli-Zellen wurden mit dem Vektor transformiert

und auf Agarplatten vermehrt. Die Zielsequenz enthaltende Plasmide wurden isoliert und für

die Quantifizierung der KHV-Genomfragmente in den Fischen verwendet.

4.6.8.1 Endpunkt-PCR

Für die Klonierung wurde in Zellkultur vermehrtes Virus hergestellt. Das

Amplifikationsprodukt aus der Endpunkt-PCR diente hierbei als Insert für die Ligation. Die

PCR-Reaktion wurde in einem Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg) durchgeführt

und das Platinum® Taq DNA Polymerase Kit (Invitrogen, Darmstadt) benutzt.

Die Reaktionsbedingungen, die verwendeten Primer und die Zusammensetzung der

Reaktionsansätze für die PCR sind in den Tabellen 25, 26 und 27 einzusehen.

Tabelle 25: Primer für den Nachweis des KHV-Genoms nach GILAD (2004)

Primer Sequenz (5´ � 3´) Produktgröße KHV 86 for 5´- GAC GCC GGA GAC CTT GTG -3´ 78 bp KHV163 rev 5´- CGG GTT CTT ATT TTT GTC CTT GTT -3´


Tabelle 26: Zusammensetzung des Reaktionsansatzes für die PCR zum KHV-Nachweis

Reaktionskomponenten Volumen Platinum® Taq DNA Polymerase 0,2 µl Primer KHV_86 for (10 pmol/µl) 2,5 µl Primer KHV_163 rev (10 pmol/µl) 2,5 µl dNTPs (10 mM) (Roth, München) 1 µl 10X PCR Buffer, Minus Mg 2,5 µl

MgCl2 (50 mM) 1,5 µl A. dest 12,8 µl Template-DNA 2,0 µl Endvolumen 25 µl

Tabelle 27: Touchdown-PCR-Programm für die Endpunkt-PCR nach GILAD et al. (2004)




Annealing 60 sec 55,9-61,9

Elongation 30 sec 72

35

Finale Elongation 10 min 72 1

∞ 4

4.6.8.2 Agarosegelelektrophorese und Aufreinigung der PCR-Produkte

Ein Aliquot der PCR-Reaktion wurde vor der Ligation auf einem Agarosegel analysiert und

gleichzeitig aufgereinigt, um zu überprüfen, ob in der PCR das gewünschte Produkt

amplifiziert wurde.

Dazu wurden die Amplifikationsprodukte nach Zugabe von Roti®-Load DNA-Puffer (Roth,

München) mit der Flachbett-Apparatur Compact XS/S (Biometra, Göttingen) in einem

3 %igen Agarosegel (Invitrogen, Karlsruhe) bei einer Spannung von 90 V Power (Supply

EV243, Roth, Karlsruhe) größenfraktioniert. Als Größenstandard diente eine 100 bp DNA-

Leiter, äquimolar (Roth, Karlsruhe). Als Lauf- und Gelpuffer wurde TBE-Puffer verwendet.


Die Analyse der DNA-Banden erfolgte mittels UV-Transilluminator (Biometra, Tl 1,

Göttingen).

Für die Ligation wurden artifizielle Amplifikate, Reste des PCR-Reaktionsansatzes und des

Agarosegels durch Aufreinigung des PCR-Produktes mit dem Wizard SV Gel and PCR

Clean-up System (Promega Corporation, Madison) nach Herstellerangaben entfernt. Dafür

wurden zuvor die 78 bp großen Banden mit einem Skalpell aus den Gelen ausgeschnittenen.

4.6.8.3 Vektor

Im Anschluss an die Aufreinigung der PCR-Produkte erfolgte die Ligation in den Vektor

pGEM®-T Easy (Promega, Mannheim). Dieser verfügt über einen Einzel-3’terminalen

Thymidin-Überhang an beiden freien Enden und liegt linearisiert vor. Diese T-Überhänge der

„multiple cloning site“ (siehe Abbildung 4) verhindern eine Rezirkulation und gestatten

gleichzeitig eine effiziente Ligation der synthetisierten PCR-Produkte, an deren 3’Enden

thermostabile Polymerasen kompatible Einzel-3’Deoxyadenosin-Überhänge erstellen.

Abbildung 4: Für die Klonierung des KHV-Amplifikates verwendeter Vektor pGEM®-T Easy (Promega, Mannheim)


4.6.8.4 Ligation

Die Ligation des KHV-Amplifikates wurde nach Herstellerangaben wie in dem Protocol for

Ligations Using the pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vectors and the 2X Rapid Ligation

Buffer (Promega, Mannheim) beschrieben durchgeführt. Die Reaktionskomponenten (siehe

Tabelle 28) wurden durch vorsichtiges Pipettieren vermischt und über Nacht bei 16 °C

inkubiert, um die Anzahl an Transformanten zu erhöhen.

Tabelle 28: Zusammensetzung der Reaktionskomponenten für Ligationsansatz

Reaktionskomponenten Volumen 2X Rapid Ligationspuffer 5 µl T4 DNA Ligase 1 µl pGEM®-T Easy Vector (50 ng) 1 µl PCR-Produkt 3 µl Nucleasenfreies Wasser 1 µl Endvolumen 10 µl

4.6.8.5 Transformation

Für die Transformation wurden kompetente Escherichia (E.) coli Zellen (JM109 High

Efficiency Competent Cells, Promega, Mannheim) verwendet. 25 µl der aufgetauten

Bakteriensuspension wurden mit 2 µl des Ligationsansatzes durch vorsichtiges Auf- und

Abpipettieren vermischt und für 20 min auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte ein Hitzeschock

für 50 s in einem Heizblock (Thermomixer Comfort, Eppendorf, Hamburg) bei 42 °C ohne

Schütteln. Die Zellen wurden daraufhin 2 min auf Eis gekühlt und danach 90 min unter

leichtem Schütteln in 950 µl LB-Flüssigmedium ohne Antibiotikazusatz inkubiert. Daraufhin

wurden 100 µl des Transformationsansatzes auf Selektivnährböden (LB-Agar-Platten mit 25

µl/ml Ampicillin), die mit 60 µl IPTG-Lösung (100 mM Isopropyl-β-D-Galaktopyranosid)

und 40 µl X-Gal (50 mg/ml 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-Galaktopyranosid) behandelt

worden waren, gleichmäßig mit einer sterilen Glaspipette ausplattiert und über Nacht bei

37 °C inkubiert. Das pGEM®-T-Easy Vector System verfügt über ein Ampicillin-

Resistenzgen, weshalb nur mit dem Vektor transformierte Zellen auf den mit Ampicillin


präparierten LB-Platten wachsen können. In der Klonierungsstelle ist zudem ein Gen

vorhanden, welches inaktiviert wird, wenn der Vektor ein DNA-Insert aufgenommen hat.

Dieses erleichtert anschließend die Selektion der gewünschten Klone. Bei einer erfolgreichen

Klonierung in den pGEM®-T-Easy Vector wird das LacZ`-Gen unterbrochen, welches für das

N-terminale α-Fragment der β-Galactosidase kodiert. Durch die Insertion des DNA-

Fragmentes wurde das LacZ`-Gen inaktiviert, wodurch sich nach einer Inkubation mit IPTG

und X-Gal die E. coli-Kolonien weiß färbten. Rekombinante Klone können nun durch ein

Farbscreening identifiziert werden. Weiße Kolonien tragen ein Insert, blaue Kolonien

hingegen in der Regel nicht. Es wurden fünf einzelne weiße Kolonien mit einer Pipettenspitze

von der Agarplatte aufgenommen, in 4 ml LB-Medium mit Ampicillin überführt und über

Nacht unter leichtem Schütteln bei 37 °C inkubiert.

4.6.8.6 Plasmidpräparation

Für die Präparation der Plasmid-DNA aus den Bakterienzellen wurden 1,5 ml des Gemisches

aus LB-Medium und weißen Kolonien für 1 min bei 15.000 x g zentrifugiert und der

Überstand verworfen. Das verbliebene Pellet wurde anschließend in 100 µl GTE-Lösung (50

mM Glukose (0,9 g), 25 mM Tris/HCL (3,5 ml 1 M Tris/HCL), 10 mM EDTA (2 ml 0,5 M

EDTA) ad 100 ml ddH2O) resuspendiert, für 30 sec geschüttelt und dann für 10 min bei

Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss wurden 200 µl Lösung 2 (100 µl 10% SDS, 100 µl

2 M NaOH, 700 µl ddH2O, pH 8) hinzugegeben und leicht geschüttelt. Nach einer

fünfminütigen Inkubation auf Eis wurden 150 µl eiskalter Lösung 3 (10 ml 5 M KAc, 1,91 ml

kalte Essigsäure, 4,75 ml ddH2O, pH 4,8) hinzugegeben, leicht geschüttelt und erneut 5 min

auf Eis inkubiert. Danach folgte ein Zentrifugationsschritt von 15 min bei 13.000 x g und

4 °C. 400 µl des Überstandes wurden in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß (Eppendorf,

Hamburg) überführt und zweimal 900 µl 96 % Ethanol (AppliChem GmbH, Darmstadt)

hinzugefügt. Daraufhin wurde das Gemisch bei Raumtemperatur 5 min inkubiert,

anschließend 5 min bei 13.000 x g zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Das

resultierende Pellet wurde mit 500 µl 70 % Ethanol (AppliChem GmbH, Darmstadt)

gewaschen, ein weiteres Mal 5 min bei 13.000 x g zentrifugiert und der Überstand verworfen.


Anschließend wurde das Pellet getrocknet und in 50 µl zuvor mit RNaseA (10mg/ml)

behandeltem TE-Puffer aufgenommen. Bis zur weiteren Verwendung wurde die Plamid-DNA

bei 4 °C gelagert.

4.6.8.7 Plasmidverdau mit FastDigest® EcoRI (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot)

Um zu prüfen, ob die Klonierung des PCR-Produktes in den Vektor erfolgreich war, wurde

das Insert aus dem Vektor mittels Plasmidverdau mit EcoRI (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot)

geschnitten. Dafür wurden 7,5 µl des Verdauungsansatzes mit 2,5 µl Plasmid-DNA (siehe

Tabelle 29) gemischt und 120 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend erfolgte die Beurteilung

auf einem Agarosegel. Es konnten zwei Banden visualisiert werden. Die erste bei 3015 bp,

welches der Größe des Vektorsystems entspricht und eine zweite bei 78 bp, welches der

Größe des KHV-Inserts entspricht.

Tabelle 29: Reaktionsansatz für die Restriktionsverdau des Plasmids

Reaktionskomponenten Volumen EcoRI 0,5 µl

SH Buffer 1,5 µl

A. dest 5,5 µl

Plasmid-DNA 2,5 µl

Endvolumen 10 µl

4.6.8.8 Sequenzierung

Um die mittels Gelelektrophorese aufgetrennten DNA-Fragmente als die von den jeweiligen

Primern amplifizierte, KHV-spezifische Sequenz verifizieren zu können, wurden die

entsprechenden DNA-Proben zum Sequenzieren an die Firma Eurofins MWG Operon

Sequencing Department gesendet. Die benötigte DNA-Menge von 100–300 ng/µl wurde in

10 µl ddH2O aufgenommen. Die Konzentration der Sequenzierungsprimer betrug 2 pmol/µl in


einem Gesamtvolumen von 15 µl. DNA, die nicht direkt als PCR-Produkt versandt werden

konnte, wurde mit dem Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega Corporation,

Madison) aus den vorher aus den Gelen ausgeschnittenen Banden isoliert und aufgereinigt

4.7 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Programm Sigmastat® 3.5 (Systat Software,

Inc., Kalifornien).

Zur Bestimmung signifikanter Unterschiede zwischen Teichen, die mit akut an KHV

erkrankten Karpfen besetzt waren und Teichen, die mit latent infizierten Karpfen besetzt

waren sowie bei den gemessenen Genomäquivalenten in Abhängigkeit von der

Wassertemperatur und vom Besatz der Teiche mit Karpfen unterschiedlichen Alters wurden

die Messwerte dem Rank Sum Test und dem ANOVA on ranks für normalverteilte

Messergebnisse unterzogen. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden bei einem p-Wert

unter 0,05 als signifikant bewertet.

Ergebnisse 84

5 Ergebnisse

5.1 Methodik

5.1.1 Quantitative real-time PCR nach GILAD et al. (2004) zum Nachweis von KHV

5.1.1.1 Klonierung der KHV-Zielsequenz

Zur Untersuchung der Gewebeproben von Wildfischen aus Teichwirtschaften,

Laborinfektionen und Karpfen aus Kohabitationsversuchen wurde ein DNA-

Nachweisverfahren etabliert, welches auf den Primer- und Sondensequenzen der real-time

PCR nach GILAD et al. (2004) basierte. Die Quantifizierung der Viruslast in den jeweiligen

Organen erfolgte mittels einer Verdünnungsreihe des Plasmids. Hierzu wurde das in der PCR

amplifizierte KHV-DNA-Fragment in den Vektor pGEM®-T Easy ligiert und anschließend in

E. coli Bakterien transformiert. Die Konzentration der Plasmide nach Aufreinigung betrug

244,096 ng/µl und entsprach 1,38 x 1011 pro µl.

5.1.1.2 Standardkurve für das KHV-Plasmid

Für die Quantifizierung der Viruslast wurde eine Verdünnungsreihe des KHV-Plasmids

angefertigt. In jeder PCR wurden Plasmide in den Konzentrationen von 1–108 Kopien im

Doppelansatz mitgeführt. Die Steigung der Standardkurve betrug -3,3 und die Effizienz der

Reaktion lag bei 101,1 % (siehe Abbildung 5 und 6). Diese Standardkurve diente der

Ermittlung der Kopienzahl der KHV-DNA in den Geweben der im Rahmen dieser Studie

untersuchten Fische.

Ergebnisse 85

F

luor

esze

nz (

dR)

Amplifikations Plots

Anzahl Zyklen

1 x 108

1 x 107

1 x 106

1 x 105

1 x 104

neg. PCR-Kontrolle

1 x 103

1 x 102

1 x 1001 x 101

Flu

ores

zenz

(dR

)


Anzahl Zyklen

1 x 108

1 x 107

1 x 106

1 x 105

1 x 104

neg. PCR-Kontrolle

1 x 103

1 x 102

1 x 1001 x 101

1 x 108

1 x 107

1 x 106

1 x 105

1 x 104

neg. PCR-Kontrolle

1 x 103

1 x 102

1 x 1001 x 101

Abbildung 5: Amplifikationsplots aus der real-time PCR nach GILAD et al (2004) für eine logarithmische (log10) Verdünnungsreihe des KHV-Plasmids (pGEM®-T Easy) wie unter 3.6.7.1 beschrieben.

Standardkurve

Initiale Quantität (Kopien)

Ct(

dR)

Standardkurve


Ct(

dR)

Abbildung 6: Quantifizierung von KHV-Genomkopien mittels Standardkurve. Dargestellt ist die Korrelation der KHV-Plasmidkonzentration (pGEM®-T Easy) und den Schwellenwerten (Ct) für die Anzahl an Amplifikationszyklen in der unter 3.6.7.1 beschriebenen real-time PCR. Die Gleichung der Steigungsgeraden ist: Y = -3.296 x LOG(X) + 39,76

Ergebnisse 86

5.1.1.3 Sequenzierung

Das Amplifikationsprodukt der PCR nach GILAD et al. (2004) wurde sequenziert, und mit

der in der Genbank hinterlegten Sequenz für KHV verglichen. Die Sequenzanalyse der PCR-

Produkte ergab eine 100 %ige Übereinstimmung zu den KHV-I und KHV-U Sequenzen

(Accession DQ177346 and DQ657948) (AOKI et al. 2007) die in der Datenbank (NCBI)

hinterlegt sind was bestätigte, dass es sich bei dem in der PCR amplifizierten DNA-Fragment

um KHV-spezifische DNA handelte.

5.1.2 SYBR Green real-time PCR zur relativen Quantifizierung für das


(FORLENZA et al. 2008)

Diese PCR diente der Qualitätskontrolle der RNA-Extraktion und der reversen Transkription.

Für alle untersuchten Karpfen, die mit KHV infiziert wurden, konnte aufgrund positiver PCR-

Ergebnisse festgestellt werden, dass nach der Infektion eine Virusreplikation in den Geweben

stattgefunden hatte. Des Weiteren konnte eine genügende Qualität der extrahierten RNA

sowie der reversen Transkription bestätigt werden.

5.1.3 SYBR Green real-time PCR zur Qualitätskontrolle der TaqMan real-time PCR

nach GILAD et al. (2004) mittels Capsid Triplex Protein-Gen (ORF72)

Um die Ergebnisse real-time PCR nach GILAD et al. (2004) zu bestätigen, wurden die zuvor

positiv auf KHV-Genomäquivalente getesteten Proben mit einer weiteren PCR, basierend auf

einem anderen Genomabschnitt, wiederholt. Für diese Analyse wurde das Capsid Triplex

Protein-Gen (ORF 72) nach ADAMEK et al. (2012) verwendet.

Die Quantifizierung der Viruslast in den jeweiligen Organen erfolgte mittels einer

Verdünnungsreihe des Plasmids. Hierzu wurde das in der PCR amplifizierte Capsid Triplex

Protein-Fragment in den Vektor pGEM®-T Easy ligiert und anschließend in E. coli Bakterien

transformiert. Die Konzentration der Plasmide nach Aufreinigung betrug 33,37 ng/µl und

entsprach 7,63 x 1010 pro µl.

Ergebnisse 87

5.1.4 SYBR Green real-time RT-PCR zur Quantifizierung der KHV-Replikation

unter Verwendung des Thymidinkinase-Gens (ADAMEK et al. 2012) mit

externen Standard

5.1.4.1 Klonierung der Thymidinkinase-Zielsequenz

Zur Untersuchung der Gewebeproben von Wildfischen und Karpfen aus den Laborinfektionen

und aus den Kohabitationsversuchen hinsichtlich einer Virusmehrung wurde ein SYBR Green

basiertes RT-PCR System zur Analyse der Transkription von Virusproteinen nach ADAMEK

et al. (2012) für das Thymidinkinase-Gen etabliert. Die Quantifizierung der Virusvermehrung

in den jeweiligen Organen erfolgte mittels einer Verdünnungsreihe des Plasmids. Hierzu

wurde das in der PCR amplifizierte Fragment des Thymidinkinase-Gens in den Vektor

pGEM®-T Easy ligiert und anschließend in E. coli Bakterien transformiert. Die Konzentration

der Plasmide nach Aufreinigung entsprach 3,46 x 1010 pro µl.

5.1.4.2 Standardkurve für das Thymidinkinase-Plasmids

Für die Quantifizierung der Virusvermehrung wurde eine Verdünnungsreihe des Plasmids


Doppelansatz mitgeführt. Die Steigung der Standardkurve betrug in etwa -3,4 und die

Effizienz der Reaktion lag bei 96,8 (siehe Abbildung 7 und 8). Diese Standardkurve diente

der Ermittlung der Virusvermehrung in den Geweben der untersuchten Fische.

Die Qualitätskontrolle der quantitativen real-time PCR mit SYBR Green nach ADAMEK et

al. (2012) zur Quantifizierung der KHV-Replikation wurde mittels Dissoziationskurve

durchgeführt, wodurch Artefakte der Reaktion ausgeschlossen werden konnten (siehe

Abbildung 9).

Ergebnisse 88

Anzahl Zyklen

Flu

ores

zenz

(dR

)


1 x 1071 x 1061 x 1051 x 1041 x 1031 x 1021 x 101neg. PCR-Kontrolle

Anzahl Zyklen

Flu

ores

zenz

(dR

)



1 x 1071 x 1061 x 1051 x 1041 x 1031 x 1021 x 101


Abbildung 7: Amplifikationsplots der RT-PCR für das Thymidinkinase-Gen nach ADAMEK et al. (2012) für eine logarithmische (log10) Verdünnungsreihe des Thymidinkinase-Plasmids (pGEM®-T Easy) wie unter 3.6.6.2 beschrieben.

Standardkurve


Ct(

dR)

Standardkurve


Ct(

dR)

Abbildung 8: Quantifizierung von Thymidinkinase-Genomkopien mittels Standardkurve. Dargestellt ist die Korrelation der Thymidinkinase-Plasmidkonzentration (pGEM®-T Easy) und den Schwellenwerten (Ct) für die Anzahl an Amplifikationszyklen in der unter 3.6.6.2 beschriebenen real-time RT-PCR. Die Gleichung der Steigungsgeraden ist: Y = -3.401 x LOG(X) + 36.94

Ergebnisse 89

Dissoziationskurve

Flu

ores

zenz

(-R

‘(T

))

Temperatur (°C)

Dissoziationskurve

Flu

ores

zenz

(-R

‘(T

))

Temperatur (°C)

Abbildung 9: Dissoziationskurve zur Qualitätskontrolle der quantitativen real-time PCR mit SYBR Green nach ADAMEK et al. (2012) zum Nachweis einer KHV-Replikation

Ergebnisse 90

5.1.5 SYBR Green real-time RT-PCR zur Quantifizierung des Gens kodierend für

das Major Capsid Protein-Gen (ORF92) des KHV (ADAMEK et al. 2012) mit

externem Standard zum Nachweis einer KHV-Replikation

5.1.5.1 Klonierung der Major Capsid Protein-Zielsequenz

Zur Untersuchung der Gewebeproben von Wildfischen und Karpfen aus den Laborinfektionen

und aus den Kohabitationsversuchen auf eine Virusmehrung wurde ein SYBR Green basiertes

RT-PCR System zur Analyse der Transkription von Virusproteinen nach ADAMEK et al.

(2012) für das Major Capsid Protein-Gen (ORF92) etabliert. Die Quantifizierung der

Virusvermehrung in den jeweiligen Organen erfolgte mittels einer Verdünnungsreihe des

Plasmids. Hierzu wurde das in der PCR amplifizierte Fragment des Major Capsid Protein-

Gens in den Vektor pGEM®-T Easy ligiert und anschließend in E. coli Bakterien

transformiert. Die Konzentration der Plasmide nach Aufreinigung betrug 42,72 ng/µl und

entsprach 8,78 x 1010 pro µl.

5.1.5.2 Standardkurve für das Major Capsid Protein-Plasmid

Für die Quantifizierung der Virusvermehrung wurde eine Verdünnungsreihe des Plasmids


Doppelansatz mitgeführt. Die Steigung der Standardkurve betrug in etwa -3,3 und die

Effizienz der Reaktion lag bei ca. 101,7 % (siehe Abbildung 10 und 11). Diese Standardkurve

diente der Ermittlung der Virusvermehrung in den Geweben der untersuchten Fische.

Die Qualitätskontrolle der quantitativen real-time PCR mit SYBR Green nach ADAMEK et

al. (2012) zum Nachweis einer KHV-Replikation wurde mittels Dissoziationskurve

durchgeführt, wodurch Artefakte der Reaktion ausgeschlossen werden konnten (siehe

Abbildung 12).

Ergebnisse 91

Anzahl Zyklen

Flu

ores

zenz

(dR

)



Anzahl Zyklen

Flu

ores

zenz

(dR

)


1 x 1071 x 1061 x 1051 x 1041 x 1031 x 1021 x 101



Abbildung 10: Amplifikationsplots der RT-PCR für das Major Capsid Protein-Gen (ORF92) nach ADAMEK et al. (2012) für eine logarithmische (log10) Verdünnungsreihe des Major Capsid Protein-Plasmids (pGEM®-T Easy) wie unter 3.6.6.3 beschrieben.


Standardkurve

Ct(

dR)


Standardkurve

Ct(

dR)

Abbildung 11: Quantifizierung von Major Capsid Protein-Genomkopien mittels Standardkurve. Dargestellt ist die Korrelation der Major Capsid Protein-Plasmidkonzentration (pGEM®-T Easy) und den Schwellenwerten (Ct) für die Anzahl an Amplifikationszyklen in der unter 3.6.6.3 beschriebenen real-time RT-PCR. Die Gleichung der Steigungsgeraden ist: Y = -3.283 x LOG(X) + 34.77

Ergebnisse 92

Dissoziationskurve

Flu

ores

zenz

(-R

‘(T

))

Temperatur (°C)

Dissoziationskurve

Flu

ores

zenz

(-R

‘(T

))

Temperatur (°C)

Abbildung 12: Dissoziationskurve zur Qualitätskontrolle der quantitativen real-time PCR mit SYBR Green nach ADAMEK et al. (2012) zum Nachweis einer KHV-Replikation

Ergebnisse 93

5.1.6 Laborinfektion zur Prüfung der Empfänglichkeit von Karpfen für das KHV

KHV-spezifische DNA-Sequenzen wurden in allen Geweben von Karpfen nachgewiesen,

denen eine Lösung mit KHV i.p. injiziert wurde. Individuen der Infektionsgruppe zeigten

zudem starke Symptome einer klinischen Erkrankung durch das KHV, begleitet von

auffälligen Verhaltensänderungen und Mortalitäten (siehe Abbildung 13). In den untersuchten

Geweben lag die Konzentration der virusspezifischen DNA zwischen 1 x 105–3 x 107 Kopien

pro 25 mg Gewebeprobenmaterial. In Geweben der nicht infizierten Kontrollgruppe waren

KHV-spezifische DNA-Sequenzen nicht nachweisbar. Des Weiteren wurden bei dieser

Gruppe keine KHV-spezifischen Krankheitssymptome oder pathologische Veränderungen

beobachtet.

Abbildung 13: KHV infizierte Karpfen mit akuter Symptomatik. Konfluierende Schleimhautläsionen mit „Sandpapier“-artiger Textur und Hämorrhagien (dargestellt durch Pfeile)

Ergebnisse 94

5.2 Ergebnisse der Felduntersuchungen

Probenumfang

Während eines akuten Ausbruches der KHV-Erkrankung und 14 Tage nach Feststellen der

Erkrankung wurden aus fünf Teichen und drei Ablaufgräben, die diese Teiche entwässerten,

insgesamt 291 Individuen aus 11 verschiedenen Fischarten gefangen. Aus insgesamt sieben

Teichen, die mit latent infizierten Karpfen besetzt waren wurden insgesamt 274 Individuen

aus 12 verschiedenen Fischarten gefangen. Alle Fische wurden auf für KHV-spezifische

Genomsequenzen untersucht (siehe Tabelle 30). Des Weiteren wurden 145 Individuen aus

sieben verschiedenen Fischarten untersucht, die einem zuvor sanierten Teich und dessen

Ablauf nach Neubesatz mit KHV-freier Karpfenbrut entnommen wurden.

Arteninventar

Das im Probenumfang enthaltene Artenspektrum spiegelt den Fischbestand in den

untersuchten Teichen wider. In Teichen mit akut an KHV infizierten Karpfen und Teichen mit

latent infizierten Beständen waren als Arten der Familie Cyprinidae vor allem Schleien als

wirtschaftlich genutzte Fische mit 20 bzw. 18 %, Rotfedern mit 9 bzw. 18 % und Plötzen mit

12 bzw. 8 % Vorkommen vorhanden. Eine hohe Präsenz von Fischen aus anderen Familien

hatten vor allem Individuen der Arten Flußbarsch mit 15 bzw. 25 %, gefolgt von Kaulbarsch,

Zwergwels und Stichling (siehe Tabelle 30, Abbildung 14 und 15).

Eine einheitliche Beprobung des gesamten Artenspektrums war nicht umsetzbar, da nicht alle

Fischarten in allen Teichen vorhanden waren

Ergebnisse 95

Tabelle 30: Probenumfang der gefangenen Wildfischarten aus sächsischen Karpfenteichwirtschaften, die auf KHV spezifische DNA-Sequenzen untersucht wurden und der Bereich der nachgewiesenen Kopienzahl an KHV-Genomsequenzen (sanierter Teich hier nicht berücksichtigt).

Beprobte Fischarten Akute Teiche MW WF Latente Teiche MW WF Cyprinidae Brachse 1/2 1,3x100 0 0 Giebel 0 0 0/10 0 Gründling 0 0 2/10 1,2x100 Moderlieschen 0/2 0 0 0 Döbel 0 0 0/1 0 Hasel 0 0 1/10 1,2x100 Plötze 2/13 4,2x100 8/33 1,3x101 Rotfeder 5/32 1,1x100 1/26 1,6x100 Schleie 4/33 1,2x100 10/58 1,5x101 Ictaluridae Zwergwels 1/21 4,0x10-1 1/18 4,0x10-1 Gasterosteidae Dreistacheliger Stichling 0/13 0 1/21 1,8x102 Percidae Kaulbarsch 0/8 0 0/39 0 Flußbarsch 10/43 2,7x100 1/40 4,3x10-1 Zander 0/5 0 0 0 Esocidae Europäischer Hecht 1/7 4,1x10-1 0/8 0 Gesamt WF 24/179 1,6x100 25/274 2,6x101

Erklärungen siehe Auflistung unter 4.2

KHV-Nachweis

In allen an dieser Studie beteiligten Teichen konnten Karpfen gefangen werden, die positiv

auf KHV-Genomäquivalente getestet wurden (siehe Tabelle 31 und 33 sowie Daten aus

(BAUMER 2011)) mit Ausnahme des sanierten Teiches. Insgesamt wurden aus diesen

Teichen 453 Wildfische analysiert und bei 49 Individuen wurden mittels quantitativer real-

time PCR nach GILAD et al. (2004) KHV-spezifische DNA-Sequenzen festgestellt (siehe

Tabelle 30).

Mit einer (hoher) Variation in der Prävalenz und in der Viruslast von 4,3 x 10-1 bis 1,8 x 102

Kopien pro 1250 ng DNA wurden in den Gewebeproben von Brachse (Abramis brama),

Gründling (Gobio gobio), Hasel (Leuciscus leuciscus), Plötze (Rutilus rutilus), Rotfeder

(Scardinius erythrophthalmus), Schleie (Tinca tinca), Zwergwels (Ictalurus nebulosus),

Ergebnisse 96

Dreistacheliger Stichling (Gasterosteus aculeatus), Flußbarsch (Perca fluviatilis) und

Europäischer Hecht (Esox lucius) KHV-Genomäquivalente nachgewiesen.

In den Gewebeproben von Giebel (Carassius carassius gibelio), Moderlieschen (Leucaspius

delineatus), Döbel (Squalius cephalus), Kaulbarsch (Gymnocephalus cernua) und Zander

(Sander lucioperca) wurden hingegen keine KHV-spezifischen DNA-Sequenzen gefunden

(siehe Tabelle 30).

Um diese Ergebnisse zu bestätigen, wurden die zuvor positiv auf KHV-Genomäquivalente

getesteten Proben mit einer weiteren PCR, basierend auf einem anderen Genomabschnitt,

erneut untersucht. Für diese Analyse wurde das ORF72 (Capsid Triplex Protein) nach

(ADAMEK et al. 2012) verwendet und es konnten KHV spezifische DNA-Sequenzen in den

Proben von Schleie, Flußbarsch und Plötze nachgewiesen werden.

Die statistische Auswertung ergab für den Vergleich von Wildfischen aus Teichen mit akut an

KHV-infizierten Karpfen und latentem Besatz keine signifikanten Unterschiede bezüglich der

Anzahl an Genomkopien. Die gemessenen Genomäquivalente in Abhängigkeit von der

Wassertemperatur, der Altersklasse des Karpfenbesatzes und des Jahres, in dem sich der akute

KHV-Ausbruch ereignete, wiesen ebenfalls keine signifikanten Unterschiede auf.

Ergebnisse 97

Abbildung 14: Prozentuales Vorkommen von Wildfischen aus Teichen mit einem Besatz von akut an der KHV-Infektion erkrankten Karpfen

Vorkommen von Wildfischen in Teichen mit akut an KHV infizierten Karpfen

1% 0% 0%

1%

0% 0%

7%

18%

18%

12%

7%

4%

25%

3% 4%

Abramis brama Carassius gibelio Gobio gobio Leucaspius delineatus Leuciscus cephalus Leuciscus leuciscus

Rutilus rutilus Scardinius erythrophthalmus Tinca tinca

Ictalurus nebulosus Gasterosteus aculeatus Gymnocephalus cernua

Perca fluviatilis Sander lucioperca Esox lucius

Ergebnisse 98

Abbildung 15: Prozentuales Vorkommen von Wildfischen aus Teichen mit einem Besatz von latent mit KHV infizierten Karpfen

Vorkommen von Wildfischen in Teichen mit latent an KHV infizierten Karpfen

0% 4% 4%

0% 0%

4%

12%

9%

20% 7%

8%

14%

15% 0%

3%

Abramis brama Carassius gibelio Gobio gobio Leucaspius delineatus Leuciscus cephalus Leuciscus leuciscus

Rutilus rutilus Scardinius erythrophthalmus Tinca tinca

Ictalurus nebulosus Gasterosteus aculeatus Gymnocephalus cernua

Perca fluviatilis Sander lucioperca Esox lucius

Ergebnisse 99

Folgende Aufstellung dient der Beschreibung der in den nachfolgenden Tabellen verwendeten

Abkürzungen:

Kopien Mittelwert der positiv auf KHV-Genomsequenzen getesteten Wildfische

K1: einsömmrige Karpfen

K2: zweisömmrige Karpfen

K3: dreisömmrige Karpfen

MW Mittelwert der Anzahl an Kopien

nb nicht beprobt bzw. Probennahme unmöglich

neg. negativ

T Teich

TK Teichkarpfen

TW Teichwasser

WF Wildfisch

WT Wassertemperatur

x/n KHV-PCR positive Individuen/Gesamtzahl Individuen im Probenumfang

Ergebnisse 100

5.2.1 Proben aus Teichen mit akutem KHV-Geschehen

5.2.1.1 Pathologisch-anatomische Untersuchungen der den Teichen entnommenen

Wildfische

Die pathologisch-anatomische Untersuchung verlief für alle Wildfische ohne besonderen

Befund. Die Fische erschienen alle klinisch unauffällig und makroskopisch gesund. Es konnte

keine für eine KHV-Infektion typische Symptomatik beobachtet werden.

5.2.1.2 Molekularbiologische Untersuchungen

Tabelle 31: Quantitativer Nachweis von KHV-Genomsequenzen in Organen von Wildfischen und Karpfen aus Teichen und deren Ablauf mit Besatz von akut an einer KHV-Infektion erkrankten Karpfen

Teich T A T B T C T D T E Gesamt MW Besatz K3 K3 K1 K1 K3 WT 21 °C 18,5 °C 17,5 °C 17 °C 19 °C Cyprinidae Brachse 1/2 1/2 1,3x100 Giebel 0 0 Gründling 0 0 Moderlieschen 0/2 0/2 0 Döbel 0 0 Hasel 0 0 Plötze 0/2 2/11 2/13 4,2x100 Rotfeder 5/30 0/2 5/32 1,1x100 Schleie 0/1 2/18 2/14 4/33 1,2x100 Ictaluridae Zwergwels 1/9 0/12 1/21 4,0x10-1 Gasterosteidae Stichling 0/6 0/7 0/13 0 Percidae Kaulbarsch 0/3 0/1 0/4 0/8 0 Flußbarsch 0/4 8/22 2/17 10/43 2,7x100 Zander 0/5 0/5 0 Esocidae Hecht 0/2 1/5 1/7 4,1x10-1 Gesamt WF 0/18 18/94 0/16 2/24 4/27 24/179 Prävalenz % - 19,15 - 8,33 14,81 13,41 MW WF (Teich) 0 2,1x100 0 2,4x100 2,7x100 2,3x100 Gesamt TK* 10/10 5/6 15/20 3/3 - 33/39 Median TK* 3,8x101 5,7x103 2,5x102 8,4x104 nb 3,0x103 Median TW* neg neg 1,4x100 neg nb 1,4x100 Erklärungen siehe Auflistung unter 4.2, *aus Baumer (2011)

Ergebnisse 101

Bei Wildfischen, die Teichen entnommen wurden, die mit akut an einer KHV-Infektion

erkrankten Karpfen besetzt waren, oder zu einem Zeitpunkt 14 Tage nach Abklingen der

KHV-bedingten Mortalität, konnten in den Organproben von 24 aus 179 Individuen KHV-

spezifische Genomsequenzen nachgewiesen werden. Dies entspricht einer kumulativen

Häufigkeit von 13,41 %. Bei Temperaturen zwischen 17 und 21 °C wurden Individuen aus

drei von fünf beprobten Teichen positiv auf KHV-Äquivalente getestet, welche den Familien

der Cyprinidae, Ictaluridae, Percidae und Esocidae zugeordnet wurden. Diese entstammten

aus Teichen, welche mit Karpfen der Altersklassen K1 und K3 besetzt waren. Eine hohe

Präsenz in den Teichen hatten vor allem Schleien (33), Rotfedern (32) und Flußbarsche (43),

die jeweils in zwei oder drei Teichen zugegen waren (siehe Tabelle 31). Positiv auf KHV-

Äquivalente getestet wurden Individuen der Arten Brachse, Plötze, Rotfeder, Schleie und als

Vertreter der nicht karpfenartigen Arten Zwergwels, Flußbarsch und Hecht. Fische der Arten

Moderlieschen, Stichling, Kaulbarsch und Zander wurden hingegen negativ getestet. Die

höchste Prävalenz zeigte sich mit 23,26 % bei Flußbarschen (10 von 43) und die geringste mit

4,76 % wiesen Zwergwelse auf (1 von 21). Die Ergebnisse veranschaulichen insgesamt eine

mäßige Variation bezüglich der Prävalenzen zwischen den jeweiligen Teichen. Bei 2 von 24

(8,33 %) Fischen in Teich D und 18 von 94 (19,15 %) Fischen in Teich B konnten KHV-

spezifische DNA-Sequenzen nachgewiesen werden. Ein Nachweis auf KHV in Wildfischen

aus den Teichen A und C war hingegen nicht möglich. In den Organen der beprobten Fische

wurden Viruslasten im Bereich von 4,1 x 10-1 bis 4,2 x 100 Kopien pro 1250 ng DNA

nachgewiesen. Zum jeweiligen Zeitpunkt der Probennahme wurden ebenfalls Karpfen

entnommen und auf KHV-Genomkopien hin untersucht. In allen beprobten Teichen wurden

bei einer Vielzahl an Karpfen KHV-spezifische DNA-Sequenzen nachgewiesen mit KHV-

Äquivalenten von 3 x 101 bis 8,4 x 104 Kopien. Im Teichwasser von Teich D wurden

zusätzlich KHV-spezifische DNA-Sequenzen in geringer Konzentration gefunden (siehe

Tabelle 31).

Ergebnisse 102

5.2.2 Proben aus Ablaufgräben von Teichen mit akutem KHV-Geschehen


Wildfische





Tabelle 32: Nachweis von KHV-Genomsequenzen in Organen von Wildfischen aus Ablaufgräben von Teichen aus sächsischen Teichwirtschaften mit Besatz von akut mit KHV infizierten Karpfen

T A T B Gesamt MW WF Ablaufgraben Graben Graben 1 Graben 2 Besatz K3 K3 WT 21 °C 19 °C 18 °C Cyprinidae Brachse 1/2 1/2 1,3x100 Giebel 0/0 Gründling 0/0 Moderlieschen 0/2 0/2 Döbel 0/0 Hasel 0/0 Plötze 0/2 0/2 Rotfeder 1/10 4/11 5/30 1,1x100 Schleie 0/1 1/9 1/9 2/19 1,2x100 Ictaluridae Zwergwels 1/9 1/9 4,0x10-1 Gasterosteidae Stichling 0/6 0/6 Percidae Kaulbarsch 0/3 0/1 0/4 Flußbarsch 0/4 5/8 3/14 8/26 2,8x100 Zander 0/1 0/4 0/5 Esocidae Europäischer Hecht 0/2 0/3 0/2 0/7 Gesamt WF 0/18 7/31 10/63 17/112 1,4x100 Erklärungen siehe Auflistung unter 4.2

Ergebnisse 103

Bei Wildfischen, die Ablaufgräben von Teichen entnommen wurden, die mit akut an einer

KHV-Infektion erkrankten Karpfen besetzt waren, oder zu einem Zeitpunkt 14 Tage nach

Abklingen der KHV-bedingten Mortalität, konnten in den Organproben von 17 aus 112

Individuen KHV-spezifische Genomsequenzen nachgewiesen werden. Dies entspricht einer

kumulativen Häufigkeit von 15,19 %. Bei Temperaturen zwischen 18 und 21 °C wurden

Individuen aus Ablaufgräben in einem von zwei beprobten Teichen positiv auf KHV-

Äquivalente getestet, welche den Familien der Cyprinidae, Ictaluridae und Percidae

zugeordnet wurden. Diese entstammten aus den Ablaufgräben 1 und 2 von Teich B, der mit

K3 besetzt war. Eine hohe Präsenz in den Ablaufgräben hatten Rotfedern (30), Flußbarsche

(26) und Schleien (19). Positiv auf KHV-Äquivalente getestet wurden insgesamt Individuen

der Arten Brachse, Rotfeder, Schleie und als Vertreter der nicht karpfenartigen Arten

Zwergwels und Flußbarsch. Die höchste Prävalenz zeigte sich bei Flußbarschen mit 30,77 %

(8 von 26) und bei Rotfedern mit 16,67 % (5 von 30). In den Organen von beprobten Fischen

wurden Viruslasten im Bereich von 4,0 x 10-1 bis 2,8 x 100 Kopien pro 1250 ng DNA

nachgewiesen (siehe Tabelle 32).

5.2.3 Proben aus Teichen mit latentem KHV-Geschehen


Wildfische





Ergebnisse 104

Tabelle 33: Nachweis von KHV-Genomsequenzen in Organen von Wildfischen und Karpfen aus Teichen und Ablaufgräben aus sächsischen Teichwirtschaften mit Besatz mit latent mit KHV infizierten Karpfen

T 1 T 2 T 3 T 4 T 5 T 6 T 7 Gesamt MW Besatz K2 K1 K2 K3 K3 K1 K3 Jahr KHVD 2007 2008 2009 2009 2009 2009 2008 WT 19,5 °C 19,5 °C 6 °C 14 °C 6 °C 5 °C 15 °C Cyprinidae Brachse 0 0 Giebel 0/10 0/10 0 Gründling 2/10 2/10 1,2x100 Moderlieschen 0 0 Döbel 0/1 0/1 0 Hasel 1/10 1/10 1,2x100 Plötze 1/3 0/4 7/10 0/16 8/33 1,3x101 Rotfeder 0/1 1/15 0/10 1/26 1,6x100 Schleie 0/11 2/10 0/1 0/14 4/9 4/13 10/58 1,5x101 Ictaluri dae Zwergwels 1/8 0/10 1/18 4,0x10-1 Gasterosteidae Stichling 0/4 0/10 1/7 1/21 1,8x102 Percidae Kaulbarsch 0/5 0/16 0/7 0/1 0/10 0/39 Flußbarsch 0/2 1/11 0/9 0/17 0/1 1/40 4,3x10-1 Zander 0 0 Esocidae Hecht 0/8 0/8 0 Gesamt WF 1/21 3/47 10/50 2/77 0/19 4/40 5/20 25/274 Pravalenz % 4,8 6,34 20,0 2,6 0 10,0 25,0 9,1 MW WF (Teich) 2,0x100 1,5x100 1,1x101 1,0x100 0 3,5x100 6,1x101 1,3x101 Gesamt TK* 1/8 5/20 10/10 7/10 nb 5/10 7/7 35/65 Median TK* 9,4x10-1 7,5x100 2,5x102 4,7x100 nb 6,5x101 nb 6,6x101 Median TW* - - - - nb 7,6x10-1 2,0x10-1 4,8x10-1 Erklärungen siehe Auflistung unter 4.2, *aus Baumer (2011)

Ergebnisse 105

Bei Wildfischen, die Teichen entnommen wurden, die mit latent an einer KHV-Infektion

erkrankten Karpfen besetzt waren, konnten in den Organproben von 25 aus 274 Individuen

KHV-spezifische Genomsequenzen nachgewiesen werden. Dies entspricht einer kumulativen

Häufigkeit von 9,12 %. Bei Temperaturen zwischen 5 und 19,5 °C wurden Individuen aus

sechs von sieben beprobten Teichen positiv auf KHV-Äquivalente getestet, welche den

Familien der Cyprinidae, Ictaluridae, Gasterosteidae und Percidae zugeordnet wurden. Diese

entstammten aus Teichen, welche mit Karpfen der Altersklassen K1, K2 und K3 besetzt waren.

Eine hohe Präsenz in den Teichen hatten vor allem Schleien (58), Kaulbarsche (39) und

Flußbarsche (40), die jeweils in fünf oder sechs von sieben beprobten Teichen zugegen waren

(siehe Tabelle 33). Positiv auf KHV-Äquivalente getestet wurden Individuen der Arten

Gründling, Hasel, Plötze, Rotfeder, Schleie und als Vertreter der nicht karpfenartigen Fische

Zwergwels, Stichling und Flußbarsch. Fische der Arten Brachse, Giebel, Döbel, Kaulbarsch

und Hecht wurden hingegen negativ getestet. Die höchste Prävalenz mit 24,24 % zeigte sich

bei Plötzen (8 von 33) und die geringste mit 2,5 % bei Flußbarschen (1 von 40). Die

Prävalenz bezüglich der Teiche zeigt eine Variation von 2,6 % (2 aus 77) der Fische in Teich

4 und 25 % (5 aus 20) der Fische in Teich 7. Ein Nachweis auf KHV in Wildfischen aus

Teich 5 war hingegen nicht möglich. In den Organen von beprobten Fischen wurden

Viruslasten im Bereich von 4,3 x 10-1 bis 1,8 x 102 Kopien pro 1250 ng DNA nachgewiesen.

In allen beprobten Teichen wurden bei Karpfen KHV-spezifische DNA-Sequenzen

nachgewiesen mit einer hohen Variation der Prävalenzen und mit KHV-Äquivalenten von

9,4 x 10-1 bis 2,5 x 102 Kopien. Im Teichwasser von Teich 6 und 7 wurden zusätzlich KHV-

spezifische DNA-Sequenzen in geringer Konzentration gefunden (siehe Tabelle 33).

Ergebnisse 106

Tabelle 34: Anzahl der KHV-Genomäquivalente in Proben von Wildfischen aus Teichen mit latentem KHV-Geschehen in Abhängigkeit von der Wassertemperatur zum Zeitpunkt der Probennahme

Teich T 3, 5, 6 T 4, 7 T 1, 2 Gesamt MW WF Besatz K1, K3 K3 K1, K2 WT 5-6 °C 14-15 °C 19,5 °C Cyprinidae Brachse 0 0 Giebel 0/10 0/10 0 Gründling 2/10 2/10 1,2x100 Moderlieschen 0 0 Döbel 0/1 0/1 0 Hasel 1/10 1/10 1,2x100 Plötze 7/10 0/16 1/7 8/33 1,3x101 Rotfeder 0/10 1/15 0/1 1/26 1,6x100 Schleie 4/10 4/27 2/31 10/58 1,5x101 Ictaluridae Zwergwels 0/10 1/8 1/18 4,0x10-1 Gasterosteidae Stichling 0/10 1/7 0/4 1/21 1,8x102 Percidae Kaulbarsch 0/11 0/7 0/21 0/39 Flußbarsch 0/10 0/17 1/13 1/40 4,3x10-1 Zander 0 0 Esocidae Hecht 0/8 0/8 0 Gesamt WF 14/109 7/97 4/68 25/274 2,6x101 Spanne WF 7,0x10-2-9,0x101 5,0x10-1-1,8x102 4,3x10-1-2,1x100 MW WF 8,7x100 4,4x101 1,6x100 Erklärungen siehe Auflistung unter 4.2

Ergebnisse 107

KHV-spezifische Genomsequenzen wurden im gesamten Wassertemperaturbereich der

Felduntersuchung zwischen 5 und 19,5 °C in Wildfischen aus Teichen mit latentem KHV-

Geschehen mittels der verwendeten real-time PCR nachgewiesen. Im Bereich von 5 bis 6 °C

lag der Anteil an für KHV positiv befundenen Individuen bei 12,8 % (14 von 109) und im

Temperaturbereich von 14 bis 15 °C waren es 7,2 % (7 von 97) der Individuen. Bei 19,5 °C

wurden 5,9 % (4 von 68) der beprobten Wildfischen positiv getestet. Somit lag die höchste

Prävalenz mit 12,8 % bei den niedrigsten Temperaturen zwischen 5 und 6 °C vor. Bei

Temperaturen von 14 bis 15 °C ist der höchste Mittelwert mit 4,4 x 101 und einer Spanne der

Einzelwerte von 5,0 x 10-1 bis 1,8 x 102 Kopien zu verzeichnen. Bei 19,5 °C ist der niedrigste

Wert mit 1,6 x 100 Kopien im Mittel zu verzeichnen mit Einzelwerten von 4,3 x 10-1 bis

2,1 x 100 Kopien (siehe Tabelle 34). Die statistische Auswertung ergab allerdings keine

signifikanten Unterschiede für die verschiedenen Temperaturbereiche.

Ergebnisse 108

Tabelle 35: Anzahl der KHV-Genomäquivalente in Proben von Wildfischen aus Teichen mit latentem KHV-Geschehen in Abhängigkeit vom Besatz der Teiche mit Karpfen unterschiedlichen Alters

Erklärungen siehe Auflistung unter 4.2

Wildfische wurden Teichen mit latentem KHV-Geschehen entnommen, die mit ein- bis

dreisömmrigen Karpfen besetzt waren. KHV-spezifische DNA-Sequenzen ließen sich bei

verschiedenen Wildfischen in Teichen nachweisen, unabhängig der Alterstufe des jeweiligen

Karpfenbesatzes. In Teichen mit einsömmrigen Karpfen (K1) wurden 8 % (7 von 87), in

Teichen mit K2-Besatz 15,5 % (11 von 71) und in Teichen mit Besatz von dreisömmrigen

(K3) Karpfen wurden 6 % (7 von 116) der Individuen positiv in der PCR auf KHV-

Genomsequenzen getestet. Wildfische aus Teichen mit K3-Besatz wiesen trotz der niedrigsten

Teich T 2, 6 T 1, 3 T 4, 5, 7 Gesamt MW Besatz K1 K2 K3 Jahr KHVD 2008-2009 2007-2009 2008-2009 WT 5°C-19,5°C 6°C-19,5°C 6°C-15°C Cyprinidae Brachse 0 0 Giebel 0/10 0/10 0 Gründling 2/10 2/10 1,2x100 Moderlieschen 0 0 Döbel 0/1 0/1 0 Hasel 1/10 1/10 1,2x100 Plötze 0/4 8/13 0/16 8/33 1,3x101 Rotfeder 0/1 1/25 1/26 1,6x100 Schleie 6/19 0/12 4/27 10/58 1,5x101 Ictaluridae Zwergwels 0/10 1/8 1/18 4,0x10-1 Gasterosteidae Stichling 0/4 0/10 1/7 1/21 1,8x102 Percidae Kaulbarsch 0/36 0/5 0/8 0/39 Flußbarsch 1/12 0/11 0/17 1/40 4,3x10-1 Zander 0 0 Esocidae Hecht 0/8 0 Gesamt WF 7/87 11/71 7/116 25/274 Spanne WF 7,0x10-2-1,4x101 5,7x10-1-9,0x101 7,0x10-2-1,8x102 MW WF 2,6x100 9,9x100 2,9x101

Ergebnisse 109

Prävalenz von 6 % die höchste mittlere Viruslast mit 3,1 x 101 und einer Spanne der

Einzelwerte von 7,0 x 10-2 bis 1,8 x 102 Kopien auf, während für Wildfische aus Teichen mit

Besatz von K1 die niedrigste mittlere Viruslast mit 2,5 x 100 Kopien und einer Spanne der

Einzelwerte von 7,0 x 10-2 bis 1,4 x 101 Kopien ermittelt wurde (siehe Tabelle 35). Die

statistische Auswertung ergab allerdings keine signifikanten Unterschiede für den Besatz mit

Karpfen verschiedenen Altersklassen.

Tabelle 36: Anzahl der KHV-Genomäquivalente in Proben von Wildfischen aus Teichen mit latentem KHV-Geschehen in Abhängigkeit des Jahres in dem sich der akute Ausbruch der KHVD ereignete

Teich T 1 T 2, 7 T 3, 4, 5, 6 Gesamt MW Besatz K2 K1, K3 K1-K3 Jahr KHVD 2007 2008 2009 WT 19,5°C 15°C-19,5°C 6°C-14°C Cyprinidae Brachse 0 0 Giebel 0/10 0/10 0 Gründling 2/10 2/10 1,2x100 Moderlieschen 0 0 Döbel 0/1 0/1 0 Hasel 1/10 1/10 1,2x100 Plötze 1/3 0/4 7/26 8/33 1,3x101 Rotfeder 0/1 1/25 1/26 1,6x100 Schleie 0/11 6/23 4/24 10/58 1,5x101 Ictaluridae Zwergwels 1/18 1/18 4,0x10-1 Gasterosteidae Stichling 1/11 0/10 1/21 1,8x102 Percidae Kaulbarsch 0/5 0/16 0/18 0/39 Flußbarsch 0/2 1/11 0/27 1/40 4,3x10-1 Zander 0 0 Esocidae Hecht 0/8 0/8 0 Gesamt WF 1/21 8/67 16/186 25/274 Spanne WF 2,0x100 5,0x10-1-1,8x102 7,0x10-2-9,0x101 MW WF 2,0x100 3,9x101 7,7x100 Erklärungen siehe Auflistung unter 4.2

Ergebnisse 110

Im Untersuchungszeitraum der Feldstudie wurden Teichen mit latentem KHV-Geschehen

Wildfische entnommen, in denen sich zuvor in den Jahren 2007 bis 2009 ein akuter KHV-

Ausbruch mit erheblichem Verlustgeschehen ereignet hatte. KHV-spezifische DNA-

Sequenzen ließen sich bei verschiedenen Wildfischen nachweisen, unabhängig von dem Jahr

in dem sich der Ausbruch ereignete. In dem Teich mit einem KHV-Ausbruch im Jahr 2007

wurden 4,76 % der untersuchten Fischen (1 von 21) positiv auf KHV-spezifische

Genomsequenzen getestet. In den Teichen mit einem KHV-Ausbruch in den Jahren 2008 und

2009 waren es 11,94 % der Fische (8 von 67) bzw. 8,60 % (16 von 186). Die höchste

Prävalenz zeigte sich in Teichen mit einem KHV-Ausbruch im Jahr 2008 mit 11,94 % sowie

die höchste mittlere Viruslast mit 3,9 x 101 und einer Spanne der Einzelwerte von 5,0 x 10-1

bis 1,8 x 102 Kopien, während für Wildfische aus Teichen mit einem KHV-Ausbruch im Jahr

2007 die niedrigste mittlere Viruslast mit 2,0 x 100 Kopien aufwiesen (siehe Tabelle 36). Die

statistische Auswertung ergab keine signifikanten Unterschiede für die verschiedenen Jahre,

in denen sich der akute Ausbruch der KHVD ereignete.

Ergebnisse 111

5.2.4 Kohabitation von Wildfischen aus Teichen mit latentem KHV-Geschehen

5.2.4.1 Pathologisch-anatomische Untersuchungen

Die pathologisch-anatomische Untersuchung verlief für alle Wildfische und die mit diesen

kohabitierten Karpfen ohne besonderen Befund. Die Fische erschienen alle klinisch

unauffällig und makroskopisch gesund. Es konnte keine für eine KHV-Infektion typische

Symptomatik beobachtet werden.


Tabelle 37: Nachweis von KHV-Genomsequenzen in den Organen von SPF-Karpfen nach Kohabitation mit Wildfischen aus Teichen mit Besatz von latent mit KHV infizierten Karpfen.

WF MW WF Kohabitierte Karpfen MW Karpfen Cyprinidae Giebel 0/10 - 0/6 - Gründling 2/10 1,2x100 1/6 2,6x100 Hasel 1/10 1,2x100 0/6 - Plötze 8/33 1,3x101 0/6 - Rotfeder 1/26 1,6x100 4/6 5,0x10-1 Schleie 10/58 1,5x101 3/18 4,6x103 Ictaluridae Zwergwels 1/18 4,0x10-1 0/6 - Gasterosteidae Stichling 1/21 1,8x102 0/6 - Percidae Kaulbarsch 0/39 - 1/12 1,7x100 Flußbarsch 1/40 4,3x10-1 0/10 - Esocidae Hecht 0/8 - 1/5 1,2x100 Gesamt/MW 25/273 2,6x101 10/87 9,2x102 Erklärungen siehe Auflistung unter 4.2

Ein Kohabitationsexperiment wurde durchgeführt, um zu überprüfen, ob Wildfische aus der

Teichbiozönose das Koi-Herpesvirus auf empfängliche Karpfen übertragen können.

Ergebnisse 112

Wildfische, die Teichen entnommen wurden, die mit latent an einer KHV-Infektion

erkrankten Karpfen besetzt waren, wurden in einem Kohabitationsexperiment eingesetzt und

14 Tage zusammen mit SPF-Karpfen gehalten. Insgesamt wurden 11 verschiedene Fischarten

aus den Familien Cyprinidae, Ictaluridae, Gasterosteidae, Percidae und Esocidae verwendet.

Nach der Kohabitation wurden KHV-spezifische Genomsequenzen in Karpfen nachgewiesen,

die mit Gründlingen, Rotfedern und Schleien als Vertreter der Cyprinidae kohabiert wurden

sowie in Karpfen, die mit Kaulbarschen und Hechten zusammen gehältert wurden, ohne dass

bei Kaulbarschen und Hechten KHV-Äquivalente nachgewiesen werden konnten (siehe

Tabelle 37). Die Prävalenz lag zwischen eins bis vier von sechs kohabitierten Karpfen.

Insgesamt wurden 10 von 87 Karpfen positiv mittels PCR getestet, was einer Prävalenz von

11,5 % entspricht. Die mittlere Kopienzahl für Kohabitationskarpfen lag mit einem Wert von

9,2 x 102 Kopien über dem für Wildfische mit 2,6 x 101 Kopien. Mit Schleien zusammen

gehälterte Karpfen wiesen nach 14 Tagen mit 4,6 x 103 Kopien die höchste

Viruskonzentration auf.

5.2.5 Untersuchungen eines sanierten Teiches nach Besatz mit KHV-freier

Karpfenbrut

In einen nach einem KHV-Ausbruch sanierten Teich wurden Karpfenbrütlinge aus Beständen

eingesetzt, die bisher nicht mit KHV infiziert waren. Über eine Wachstumsperiode von

Frühjahr 2009 bis Herbst 2009 wurden an vier Probennahmen auch Wildfische untersucht.

Außerdem wurden im Frühjahr 2010 bei der Abfischung Wildfische dem Teich entnommen

und nach einer anschließenden Kohabitation mit naiven Karpfen auf Infektion mit KHV

untersucht.

Ergebnisse 113

5.2.5.1 Pathologisch-anatomische Untersuchung der Teichkarpfen und der

Expositionskarpfen

Die pathologisch-anatomische Untersuchung verlief für alle Wildfische und die mit diesen

kohabitierten Karpfen ohne besonderen Befund. Die Fische erschienen alle klinisch

unauffällig und makroskopisch gesund. Es konnte keine für eine KHV-Infektion typische

Symptomatik beobachtet werden.


Tabelle 38: Anzahl der KHV-Genomäquivalente in Proben von Wildfischen und mit diesen kohabitierten SPF-Karpfen aus dem sanierten Teich und dessen Ablaufgraben

WF Ablauf WF Teich Kohabitationskarpfen Cyprinidae Gründling 0/20 0/1 0/6 Plötze 0/19 0/16 0/6 Rotfeder 0/3 - - Schleie 0/1 0/5 - Ictaluridae Zwergwels - 0/18 - Percidae Kaulbarsch 0/11 0/20 0/1 Flußbarsch 0/20 0/11 0/6 Gesamtzahl 0/74 0/71 0/19 Erklärungen siehe Auflistung unter 4.2

Bei 74 Wildfischen, die dem Ablaufgraben des sanierten Teiches bei Temperaturen zwischen

16 und 21°C entnommen wurden, konnten keine KHV-spezifische Genomsequenzen

nachgewiesen werden. Wildfische aus dem Teich wurden bei 7 °C während der

Frühjahrsbefischung aus der Fischsammelgrube nahe dem Mönch gesammelt und

anschließend für 14 Tage mit SPF-Karpfen kohabitiert. Weder in den Geweben der 71

Wildfische noch in den Geweben der 19 Kohabitationskarpfen konnten KHV-spezifische

Ergebnisse 114

Genomsequenzen nachgewiesen werden (siehe Tabelle 38). Außerdem wurden innerhalb

dieses Zeitraumes auch Karpfen und Teichwasser während der Frühjahrs- und

Herbstbefischung beprobt. Bei 100 Karpfen und allen Wasserproben Proben konnten keine

KHV-Genomsequenzen gefunden werden (BAUMER 2011).

5.3 Ergebnisse der Laborinfektion

In den Versuchen zur Laborinfektion sollten vornehmlich Fische des Artenspektrums,

welches in der Feldstudie beobachtet wurde, mit Zellkulturvirus infiziert werden, um die

Empfänglichkeit dieser Wildfischarten für das KHV experimentell zu überprüfen. Es konnten

allerdings nur Arten verwendet werden, die beim Großhändler verfügbar waren, weshalb

etwas vom ursprünglich angedachten und in den Teichen beobachteten Artenspektrum

abgewichen werden musste. Es wurden zwei Infektionsversuche durchgeführt. Zuerst wurden

verschiedene Wildfische direkt über ein KHV-haltiges Infektionsbad mit Zellkulturvirus

infiziert und in einem zweiten Versuch wurden Karpfen mit KHV über das Bad infiziert und

diese anschließend mit verschiedenen Wildfischen über einen definierten Zeitraum

kohabitiert. Organproben dieser Fische wurden daraufhin mit verschiedenen

molekularbiologischen Methoden auf das Vorhandensein von KHV-Genomsequenzen und

eine potentielle Virusvermehrung in verschiedenen Gewebepools untersucht.

5.3.1 Infektionsversuch 1 (Badinfektion)

5.3.1.1 Pathologisch-anatomische und molekularbiologische Voruntersuchungen

an kommerziell erworbenen Wildfischen und an Expositionskarpfen

Die pathologisch-anatomische Untersuchung sowie die parasitologische Untersuchung von

Kiemen und Haut verliefen für alle Wildfische und die mit diesen kohabitierten Karpfen ohne

besonderen Befund. Die Fische erschienen alle klinisch unauffällig und makroskopisch

Ergebnisse 115

gesund. Es konnte keine für eine KHV-Infektion typische Symptomatik beobachtet werden.

Vor Versuchsbeginn wurden pro Fischart fünf Individuen auf das Vorhandensein von KHV-

spezifischen Genomsequenzen untersucht. Die Untersuchung verlief sowohl für die

verwendeten SPF-Karpfen als auch für die Wildfische mittels PCR negativ.


Nach der Infektion über das Bad mit Zellkulturvirus wurden über den gesamten

Versuchszeitraum keine pathologischen Veränderungen bei Wildfischen beobachtet. Die

Fische zeigten durchgehend physiologisches Schwimmverhalten und keinerlei Anzeichen für

eine KHV-Infektion typische Symptomatik. Auch Karpfen, die mit Wildfischen kohabitiert

wurden, zeigten keine KHV-spezifischen Symptome. Bei den molekularbiologischen

Untersuchungen mittels PCR nach GILAD et al. (2004) konnten lediglich bei Flußbarschen,

Orfen und Stichlingen KHV-Genomsequenzen in den Geweben einzelner Individuen in

geringer Kopienzahl gefunden werden. Die Viruslast lag zwischen 6,8 x 10-1 bei einer Orfe an

Tag 17 und 1,07 x 101 Kopien bei einem Stichling an Tag 17. Einer von sechs SPF-Karpfen,

die mit Orfen kohabitiert wurden, konnte mit 5,24 x 10-1 Kopien positiv auf KHV-

Genomsequenzen getestet werden (siehe Tabelle 39). Mit den RT-PCR Systemen zur Analyse

der Transkription von Virusproteinen, basierend auf den Primerpaaren nach ADAMEK et al.

(2012) ließen sich keine KHV-spezifischen RNA-Sequenzen des Thymidinkinase-Gens oder

des Major Capsid Protein-Gens (ORF92) nachweisen.

Karpfen, die mit der ursprünglichen Viruslösung infiziert wurden und Karpfen, die mit diesen

zusammen gehältert wurden, zeigten hingegen nach der Infektion starke Symptome einer

klinischen Erkrankung durch das KHV, begleitet von auffälligen Verhaltensänderungen und

Mortalitäten. An Tag 2 p.i. konnte eine vermehrte Schleimbildung beobachtet werden, welche

sich im weiteren Verlauf deutlich verringerte. An Tag 4 zeigte die Haut schleimfreie Areale

mit „Sandpapier“-artiger Textur und Hämorrhagien, sowie Blutungen an den Flossenansätzen.

Die 12 Karpfen der Infektionskontrolle verstarben zwischen Tag 5 und 17. Von den ab Tag 7

mit diesen Karpfen kohabitierten Karpfen verstarben drei bis zum Tag der Probennahme an

Tag 17. Im Gegensatz zu Wildfischen wiesen die Gewebeproben von infizierten Karpfen

Ergebnisse 116

KHV-Genomsequenzen in hoher Kopienzahl zwischen 2,26 x 102 und 3,55 x 107 auf (siehe

Tabelle 39). In Geweben der nicht infizierten Kontrollgruppe waren KHV-spezifische DNA-

Sequenzen hingegen nicht nachweisbar. Des Weiteren wurden bei dieser Gruppe keine KHV-

spezifischen Krankheitssymptome oder pathologische Veränderungen beobachtet.

Mit den RT-PCR Systemen zur Analyse der Transkription von Virusproteinen ließen sich mit

den Primerpaaren für das Thymidinkinase-Gen zwischen 1,11 x 101 und 1,12 x 103 Kopien

und 1,03 x 100 bis 9,5 x 101 Kopien mit den Primerpaaren für das Major Capsid Protein-Gen

(ORF92) nachweisen.

Während der Inkubation in der Infektionslösung verstarben zwei Gründlinge, 22 Stichlinge

und fünf Flussbarsche auf Grund der physiologischen Belastung und des Mangels an

Sauerstoff in den Infektionsbecken. Diese Individuen wurden nicht in den

Untersuchungsumfang einbezogen.

Tabelle 39: Anzahl der mittels TaqMan real-time PCR nach GILAD et al. (2004) ermittelten KHV-Genomäquivalente in Proben von im Labor über das Bad infizierten Wildfischarten, mit diesen kohabitierten SPF-Karpfen und Karpfen der Infektionskontrolle

Fischart Tag 7 Kopien Tag 17 Kopien SPF Kopien Cyprinidae Gründling (Gobio gobio) 0/8 - 0/10 - 0/6 - Nase (Chondrostoma nasus) 0/7 - 0/8 - 0/6 - Orfe (Leuciscus idus) 0/10 - 1/10 6,80x10-1 1/6 5,24x10-1 Rotfeder (Scardinius erythrophthalmus) 0/10 - 0/10 - 0/6 - Schleie (Tinca tinca) 0/10 - 0/10 - 0/6 - Gasterosteidae Stichling (Gasterosteus aculeatus) - - 1/8 1,07x101 0/6 - Percidae Flussbarsch (Perca fluviatilis) 1/7 1,17x100 0/8 - 0/6 - Infektionskontrolle Karpfen (Cyprinus carpio)

6/6 1,43x105-3,53x107

6/6 4,31x105-4,48x106

6/6 2,26x102-3,55x107

5.3.2 Infektionsversuch 2 (Kohabitation)

Ergebnisse 117

5.3.2.1 Pathologisch-anatomische und molekularbiologische Voruntersuchungen

an kommerziell erworbenen Wildfischen und Expositionskarpfen

Die pathologisch-anatomische Untersuchung sowie die parasitologische Untersuchung von

Kiemen und Haut verliefen für alle Wildfische und die mit diesen kohabitierten Karpfen ohne

besonderen Befund. Die Fische erschienen alle klinisch unauffällig und makroskopisch

gesund. Es konnte keine für eine KHV-Infektion typische Symptomatik beobachtet werden.

Vor Versuchsbeginn wurden pro Fischart fünf Individuen auf das Vorhandensein von KHV-

spezifischen Genomsequenzen untersucht. Die Untersuchung verlief sowohl für die

verwendeten SPF-Karpfen als auch für die Wildfische mittels PCR negativ.


Nach der Kohabitation mit akut an KHV erkrankten Karpfen wurden über den gesamten

Versuchszeitraum keine pathologischen Veränderungen bei Wildfischen beobachtet. Die

Fische zeigten durchgehend physiologisches Schwimmverhalten und keinerlei Anzeichen für

eine KHV-Infektion typische Symptomatik. Auch Karpfen, die mit Wildfischen kohabitiert

wurden, zeigten keine KHV-spezifischen Symptome. Bei den molekularbiologischen

Untersuchungen mittels PCR nach GILAD et al. (2004) konnten bei einzelnen Individuen

aller im Versuchsumfang eingesetzten Arten KHV-Genomsequenzen in den Geweben von

Haut und Flosse oder Organpools in geringer Kopienzahl gefunden werden. Die Viruslast lag

zwischen 1,9 x 10-1 und 1,04 x 101 Kopien in den Geweben. Bei drei von sechs mit

Goldfischen kohabiterten SPF-Karpfen wurden KHV-Genomsequenzen in Konzentrationen

zwischen 1,84 x 100 und 2,08 x 100 detektiert und zwei der drei Goldfische verstarben an Tag

13 und 14. Bei allen anderen mit Wildfischen kohabitierten Karpfen konnten keine KHV-

spezifischen Genomsequenzen festgestellt werden (siehe Tabelle 40). Mit den RT-PCR

Systemen zur Analyse der Transkription von Virusproteinen, basierend auf den Primerpaaren

nach ADAMEK et al. (2012) ließen sich keine KHV-spezifischen RNA-Sequenzen des

Thymidinkinase-Gens oder des Major Capsid Protein-Gens (ORF92) nachweisen.

Ergebnisse 118

Karpfen, die mit der ursprünglichen Viruslösung infiziert wurden und Karpfen, die mit diesen

zusammen gehältert wurden, zeigten hingegen nach der Infektion starke Symptome einer

klinischen Erkrankung durch das KHV (s. Infektionsversuch 1). Die sechs Infektionskarpfen

verstarben zwischen Tag 5 und 7 p.i. und wiesen hohe Kopienzahlen zwischen 5,29 x 103 bis

5,67 x 105 für Haut- und Flossengewebepools und 7,07 x 103 bis 3,77 x 106 für

Organgewebepools auf. Fünf der sechs markierten Infektionskontrollkarpfen verstarben

zwischen Tag 8 und 15 nach Kohabitation und wiesen ebenfalls eine hohe Anzahl an KHV-

Genomäquivalenten auf. Zwei der mit den markierten Kontrollkarpfen kohabitierten Karpfen

verstarben an Tag 7 nach Kohabitation. Nur drei dieser Karpfen wiesen virusspezifische

Sequenzen in geringer Konzentration auf mit 7,5 x 10-1 bis 5,76 x 100 Kopien auf (siehe

Tabelle 40). Die sechs Karpfen, die 72 Stunden nach Entnahme der anderen zuvor infizierten

Fische zur Kontrolle der Tenazität des Virus in das Hälterungswasser eingesetzt wurden,

zeigten hingegen weder klinische Symptome einer KHVD noch wurden spezifische

Genomsequenzen in ihren Geweben detektiert. In Geweben der nicht infizierten

Kontrollgruppe waren KHV-spezifische DNA-Sequenzen hingegen nicht nachweisbar. Des

Weiteren wurden bei dieser Gruppe keine KHV-spezifischen Krankheitssymptome oder

pathologische Veränderungen beobachtet.

Mit den RT-PCR Systemen zur Analyse der Transkription von Virusproteinen ließen sich mit

den Primerpaaren für das Thymidinkinase-Gen in Haut- und Flossengewebepools 1,19 x 105

bis 7,76 x 105 und in Gewebepools 4,53 x 105 bis 1,70 x 107 Kopien bei Karpfen nachweisen.

Mit den Primerpaaren für das Major Capsid Protein-Gen (ORF92) wurden in Haut- und

Flossengewebepools 1,26 x 104 bis 5,21 x 105 und in Gewebepools 3,76 x 103 bis 1,30 x 106

Kopien bei Karpfen nachgewiesen.

Ergebnisse 119

Tabelle 40: Anzahl der mittels TaqMan real-time PCR nach GILAD et al. (2004) ermittelten KHV-Genomäquivalente in Proben von Wildfischen, die mit akut an einer KHV-Infektion erkrankten Karpfen kohabitiert wurden, sowie deren Infektionskontrolle und im Infektionswasser inkubierten SPF-Karpfen

Fischart HF Kopien GP Kopien SPF Kopien Infektionsgruppe Karpfen (Cyprinus carpio)

6/6 5,29x103 - 5,67x105

6/6 7,07x103 - 3,77x106

s. IK s. IK

Kohabitationsgruppe Goldfisch (Carassius auratus) 1/10 2,22x100 0/10 - 3/6 1,84 x 100 -

2,08 x100 Orfe (Leuciscus idus) 0/10 - 2/10 1,01x100 -

3,03x100 0/6 -

Schleie (Tinca tinca) 2/10 1,90x10-1 - 1,04x101

3/10 9,80x10-1 - 2,98x100

0/6 -

Gründling (Gobio gobio) 0/3 - 1/3 2,07 0/6 - Infektionskontrolle Karpfen (Cyprinus carpio)

6/6 1,24x104 - 2,24x105

6/6 1,56x102 - 2,70x106

3/6 7,50x10-1 - 5,76x100

Kontrolle Infektionswasser Karpfen (Cyprinus carpio)

0/6 - 0/6 - - -

Erkärung: HF: Haut/Flosse; GP: Gewebepool; IK: Infektionskontrolle; IG: Infektionsgruppe; Kohabitationsgruppe: KG

Diskussion 120

6 Diskussion

Seit dem Erstnachweis im Jahre 1998 hat sich das KHV weltweit verbreitet und übt

mittlerweile einen enormen Einfluss auf die Karpfenteichwirtschaft und den Zierfischhandel

mit Koi (PIKARSKY et al. 2004) aus. In Europa werden Karpfen überwiegend in

traditionellen Karpfenteichen mit einem natürlichen limnischen Ökosystem kultiviert, welche

einen hohen Wert als Landschaft, Erholungsgebiet und als natürliches Habitat aufweisen

(BILLARD 1999; SEVRIN-REYSSAC 1999). Karpfenteiche stellen Habitate für ein weites

Spektrum an planktischen und benthischen Organismen dar, zu welchem auch eine Vielzahl

verschiedener Fischarten der natürlichen Fischfauna zählen, die durch Zu- und Abläufe aus

den Teichen in verschiedene aufnehmende Gewässer migrieren können. Zusätzlich werden

häufig andere Cyprinidenarten wie Schleien oder Fischarten wie Zander und Hecht in Teichen

zusammen mit gewöhnlichen Karpfen aufgezogen (BILLARD 1999).

In diesem Zusammenhang eröffnet sich die Frage, ob Fischarten aus Polykulturen oder

Fische, die zum natürlichen Artenumfang der Teichbiozönose in der traditionellen

Karpfenteichwirtschaft gehören, eine Infektion mit KHV tragen und auch die Quelle eines

Krankheitsausbruches darstellen können.

Von vielen aquatisch verbreiteten Viren, die poikilotherme Vertebraten als Wirt nutzen, ist

bekannt, dass eine Empfänglichkeit verschiedener Fischarten für eine Infektion mit dem

gleichen viralen Erreger besteht, und dass Wirtsarten teilweise auch ohne selbst Symptome

der Erkrankung zu entwickeln infektiöses Virus an die Umgebung abgeben können.

Dies ist typischerweise bei Rhabdoviren zu beobachten. Prominente Vertreter sind zum

Beispiel das Virus der Viralen Hämorrhagischen Septikämie (VHS-V) die hauptsächlich

Regenbogenforellen betrifft (MEYERS u. WINTON 1995; SKALL et al. 2005; ZAK et al.

2007), die SVC (Frühlingsvirämie der Karpfen), welche hauptsächlich Cypriniden infiziert

(HAENEN u. DAVIDSE 1993; AHNE et al. 2002; SIWICKI et al. 2003; JEREMI et al. 2006)

sowie die IHN (Infektiöse Hämatopoetische Nekrose) zu deren Wirtsspektrum auch eine

Reihe verschiedener Fischarten unterschiedlicher Familien gehören (OIE 2010). Infektionen

mit Vertretern der Iridoviridae, wie dem Red Sea Bream Iridovirus (RSIVD) (SATORU

MATSUOKA 1996; KAWAKAMI u. NAKAJIMA 2002) oder dem Epizootische

Diskussion 121

Hämatopoetische Nekrosevirus (EHNV) (LANGDON et al. 1986; LANGDON u.

HUMPHREY 1987; LANGDON 1989) sind ebenfalls bei einer Vielzahl von Fischen zu

beobachten und unter experimentellen Bedingungen erweisen sich meist noch weitere Arten

als empfänglich und zeigen mitunter sogar Mortalitäten.

Im Vergleich dieser Fischseuchen auslösenden Viren scheint das Koi-Herpesvirus ein sehr

enges Wirtsspektrum, wie es für Vertreter der Herpesviren typisch ist, zu besitzen, sodass

Übertragungen auf andere Spezies Ausnahmen sind. Zoonosen durch Herpesviren sind daher

bisher unbekannt (DAVISON 2002; ROLLE u. MAYR 2007; MODROW et al. 2010).

Die Koi-Herpesvirose stellt eine virulente und hochkontagiöse Krankheit dar, doch

beschränkt sich das Krankheitsgeschehen mit Morbidität und Mortalität auf Fische aus der

Spezies Cyprinus carpio und wurde bislang nur in Koi- und Speisekarpfenpopulationen

beobachtet (ARIAV et al. 1999; WALSTER 1999).

In Experimenten, in denen Cypriniden und andere Wildfischarten mit Karpfen kohabitiert

wurden, die an einer manifesten klinischen KHVD erkrankt waren, konnten keine

Krankheitsausbrüche bei anderen Arten als gewöhnlichen Karpfen und Koi beobachtet

werden. Goldfische und Karauschen (Carassius carassius), welche phylogenetisch eng mit

dem gewöhnlichen Karpfen (Cyprinus carpio) verwandt sind (HE et al. 2008), ebenso wie

Silberbarsche (Carassius aurata) und Silberkarpfen (Hypophthalmichthys molitrix) (HE et al.

2008) mit geringerem Verwandtschaftsgrad entwickelten keine klinischen Symptome einer

durch KHV bedingten Erkrankung nach einer experimentellen Infektion mit dem Virus oder

nach Kohabitation mit erkrankten Karpfen (GILAD et al. 2002; PERELBERG et al. 2003;

PIKARSKY et al. 2004; HEDRICK et al. 2006). Deshalb wurde angenommen, dass diese

Arten nicht für eine Infektion mit KHV empfänglich sind. Später konnte das KHV-Genom

jedoch in Geweben von Goldfischen nachgewiesen werden, die mit an einer KHVD

erkrankten Karpfen zusammen gehalten wurden (EL-MATBOULI et al. 2007; SADLER et al.

2008). Das Spektrum der Arten, die für das Virus empfänglich sind, scheint sich stetig zu

erweitern. Russische und atlantische Störe (A. gueldenstaedtii und A. oxyrinchus), die häufig

in Aquakulturanlagen zusammen mit Karpfen gehalten werden, wurden positiv auf KHV

getestet, ohne dass bei diesen Fischen klinische Symptome beobachtet werden konnten. In

diesem Zusammenhang wurde allerdings nicht überprüft, ob diese Fische das Potential haben,

Diskussion 122

gesunde Karpfen zu infizieren und wie hoch dieses ist, weshalb von einer sehr geringen

Viruslast, wie bei latent infizierten Karpfen, auszugehen ist (KEMPTER et al. 2009).

Verglichen mit der zellkulturbasierten Virusisolation, welche sich trotz hoher Titer in den

Geweben als schwierig erweist (POKOROVA et al. 2005) oder ELISA-Nachweisverfahren,

anhand welcher keine Aussagen darüber getroffen werden können, ob der getestete Fisch das

Virus noch trägt (ADKISON et al. 2005; MATSUI et al. 2008), stellt die PCR ein Verfahren

dar, welches dies gewährleistet und sich dabei außerdem als äußerst sensitiv erweist.

Auf Grund dieser Tatsache wurde in der vorliegenden Arbeit für die Detektion des KHV und

die Quantifizierung der Viruslast in Wildfischen aus der sächsischen Teichbiozönose

vorrangig die quantitative real-time PCR nach GILAD et al. (2004) zum Nachweis von KHV

verwendet. Dieses Protokoll stellt eines der sensitivsten Nachweismethoden für die Detektion

von KHV-DNA in frischen Gewebeproben dar und ermöglicht ebenfalls die Detektion von

subklinischen Virusinfektionen (BERGMANN et al. 2010c; BAUMER et al. 2013). Bei

gesund erscheinenden Karpfen, die eine KHVD überlebt haben, liegen meist nur

Viruskonzentrationen im Bereich von 5–10 Viruspartikel pro 25–30 µg

Gewebeprobenmaterial vor (BERGMANN et al. 2010c). Diese Karpfen mit einer latenten

Infektion sind deshalb nur schwer mit einer Nachweismethode zu erfassen. Durch einen

Stressor induziert kann die Viruskonzentration in den Geweben von Karpfen mit einer

persistierenden Infektion allerdings rapide zunehmen. Als geeignet dazu stellten sich

beispielsweise eine simulierte Befischung mittels Handkescher und der Fischtransport dar,

wodurch im Anschluss ein erheblich zuverlässigerer Virusnachweis gewährleistet wird

(MEYER 2007b; BERGMANN u. KEMPTER 2011). Um eine Virusreaktivierung zu

induzieren, wurden die Fische in der vorliegenden Studie im Anschluss an den Fang und den

Transport zusätzlich durch eine simulierte Befischung gestresst.

Diskussion 123

Feldstudie

In der Feldstudie dieser Arbeit konnten mittels der verwendeten PCR-Methode KHV-

Genomäquivalente in Geweben von Fischen unterschiedlichster Arten detektiert werden, die

der sächsischen Teichbiozönose entnommen wurden. Die Probennahmen fanden während

akuter KHV-Ausbrüche in den Sommermonaten und überwiegend zu Zeitpunkten im Herbst

oder Frühjahr bei nicht permissiven Wassertemperaturen an Teichen mit latent infizierten

Karpfenbeständen statt, während der Wasserspiegel in diesen abgesenkt wurde, um die

Bestände abzufischen.

Die Prävalenz des KHV bei den Wildfischen war gering, aber nicht nur auf Fische begrenzt,

die während einer akuten KHVD oder bei Wassertemperaturen über 20 °C gefangen wurden.

Insgesamt wurden zwischen 2008 und 2010, aus allen an dieser Studie beteiligten Teichen,

453 Wildfische aus 15 unterschiedlichen Fischarten analysiert und bei 49 Individuen aus 10

unterschiedlichen Arten wurden mittels quantitativer real-time PCR nach GILAD et al. (2004)

KHV-spezifische DNA-Sequenzen festgestellt. Diese positiv auf KHV-Genomäquivalente

getesteten Individuen aus der Wildfischpopulation waren nicht nur Vertreter der Cypriniden,

sondern konnten auch anderen Familien, wie Ictaluridae, Percidae und Esocidae zugeordnet

werden. Bei insgesamt 10 % der untersuchten Fische konnten in den Gewebeproben von

Brachse (Abramis brama), Gründling (Gobio gobio), Hasel (Leuciscus leuciscus), Plötze

(Rutilus rutilus), Rotfeder (Scardinius erythrophthalmus), Schleie (Tinca tinca), Zwergwels

(Ictalurus nebulosus), Dreistacheliger Stichling (Gasterosteus aculeatus), Flußbarsch (Perca

fluviatilis) und Europäischer Hecht (Esox lucius) KHV-Genomäquivalente nachgewiesen

werden. In den Gewebeproben von Giebel (Carassius carassius gibelio), Moderlieschen

(Leucaspius delineatus), Döbel (Squalius cephalus), Kaulbarsch (Gymnocephalus cernua)

und Zander (Sander lucioperca) wurden hingegen keine KHV-spezifischen DNA-Sequenzen

gefunden.

Auf Grund der geringen Stichprobengröße in den letztgenannten Arten kann nicht

ausgeschlossen werden, dass bei einer umfangreicheren Beprobung KHV-Genomsequenzen

auch bei Individuen dieser Arten nachweisbar werden.

Diskussion 124

Neben einer geringen Prävalenz konnten KHV-spezifische Sequenzen in Wildfischen auch

nur in niedrigen Konzentrationen nachgewiesen werden, während vergleichsweise Karpfen

aus der Biozönose zum gleichen Zeitpunkt hohe Viruslasten trugen.

Der Vergleich von Teichen mit Besatz von akut infizierten Karpfen und Beständen mit einer

latenten KHV-Infektion bezüglich der Prävalenzen und Viruslasten verdeutlicht, dass der

Infektionsstatus des Bestandes und die Jahreszeit kaum Auswirkungen auf die Virusbelastung

der Wildfische haben. Bei Wildfischen, die Teichen oder Ablaufgräben von Teichen, die mit

akut an einer KHV-Infektion erkrankten Karpfen besetzt waren bei Temperaturen zwischen

17 und 21 °C entnommen wurden, konnten in 24 Organproben aus 179 Individuen KHV-

spezifische Genomsequenzen nachgewiesen werden. Dies entspricht einer Prävalenz von

13,41 % und einer mittleren Viruslast von 2,3 x 100 Kopien. Von 39 Karpfen aus den gleichen

Gewässern ließ sich das Virus jedoch bei 33 Individuen mit einer mittleren Viruslast von

3,0 x 103 Genomkopien finden (BAUMER et al. 2013).

Bei Wildfischen, die bei Temperaturen zwischen 5 und 19,5 °C Teichen entnommen wurden,

die mit latent an einer KHV-Infektion erkrankten Karpfen besetzt waren, konnten in 25

Organproben aus 274 Individuen KHV-spezifische Genomsequenzen nachgewiesen werden.

Dies entspricht einer Prävalenz von 9,12 % mit einer mittleren Viruslast von 1,3 x 101

Kopien. Bei 35 von 65 Karpfen aus den gleichen Gewässern wurde das Virus nachgewiesen

mit einer mittleren Viruslast von 6,6 x 101 Genomkopien.

Akut mit KHV infizierte Karpfen tragen hohe Viruslasten, die beispielsweise auch in

Ausscheidungen wie Kot und Urin nachweisbar sind und ebenfalls geeignet sind

karpfenbasierte Zellkulturen zu infizieren (DISHON et al. 2005; NEGENBORN 2009). Des

Weiteren lassen sich hohe Viruskonzentrationen auch im Hautgewebe und Schleim feststellen

(GILAD et al. 2004; YUASA et al. 2008; COSTES et al. 2009). Deshalb können vor allem

auf den Boden absinkende Exkremente sowie der direkte Fischkontakt über Haut oder

Schleim als Übertragungsquelle angesehen werden. In dieser Situation wären nicht nur

Karpfen, sondern auch verschiedene Wildfische der Teichbiozönose dem Risiko einer

Infektion durch Viruspartikel ausgesetzt, die von erkrankten Karpfen mit hohen Viruslasten

ausgeschiedenen wurden. Eine Übertragung auf Cypriniden wie Schleien und Plötzen könnte

durch den direkten Hautkontakt mit erkrankten Karpfen, die eine verminderte Fluchtreaktion

Diskussion 125

zeigen oder durch Exkremente vom Gewässerboden bei der Nahrungsaufnahme, erfolgen.

Dieses erkrankungsbedingt verminderte Fluchtverhalten ermöglicht außerdem

Verfolgungsjägern wie Flußbarschen, Hechten und Zwergwelsen einen erleichterten

Beutefang. Bei dieser Art des Erwerbs der Beute sehen sich räuberische Arten ebenfalls

hohen Viruskonzentrationen ausgesetzt.

Das charakteristische Merkmal aller Herpesviren ist die Fähigkeit, nach der Erstinfektion

lebenslang latent im Wirtsorganismus zu verbleiben. Infizierte Zellen überleben in dieser

Phase und die Produktion von Viruspartikeln ist unterbunden (ROIZMAN u. PELLET 2001).

Eine Reaktivierung aus diesem Zustand zurück zum lytischen Infektionszyklus ist jedoch

wiederholt möglich. Dieses äußert sich meist in einem Krankheitsbild, das dem der

Primärinfektion entspricht (MODROW et al. 2010). Diese Reaktivierung mit erneuter

Virusausschüttung wird vor allem unter Einwirkung von Stressoren beobachtet (GILAD et al.

2004; MEYER 2007b; BERGMANN et al. 2009; BAUMER 2011).

Der Abfischvorgang in der Karpfenteichwirtschaft ist verbunden mit einem langsamen

Absenken des Wasserspiegels, um die Fische vor dem Mönch in einem sehr geringen

Wasservolumen zu sammeln (BOHL 1999), was vermutlich mit einer Stressbelastung für die

Fische verbunden ist.

Dieser Prozess scheint der Grund dafür zu schein, dass auch bei nicht permissiven

Temperaturen im Frühjahr oder im Herbst, im Anschluss an die Befischung, bei

verschiedenen Arten aus der Wildfischpopulation wie Plötze, Schleie und Zwergwels KHV-

Genomäquivalente nachgewiesen wurden, die Teichen mit latentem KHV-Geschehen

entstammten. Karpfen des selben Wasservolumens trugen zu diesem Zeitpunkt teilweise hohe

Viruslasten und schieden darüber hinaus auch infektiöse Viruspartikel aus, die als

Infektionsquelle für andere Karpfen und Wildfische angesehen werden können (BAUMER

2011). Ebenfalls konnte beobachtet werden, dass das Zusammendrängen der

Karpfenpopulation vor der Befischung einen geeigneten Stressor darzustellen scheint, da bei

Temperaturen von 5 und 8 °C bis zu 6,0 x 103 Virusgenomäquivalente in einzelnen

Individuen nachgewiesen werden konnten. Zum selben Zeitpunkt wurden außerdem in

geringen Mengen auch Viruspartikel in Plankton, Teichwasser und Ablaufwasser detektiert

(BAUMER et al. 2013), was weiterhin für das Ausscheiden größerer Virusmengen spricht.

Diskussion 126

Die Haut, besonders an den Extremitäten durch Schleimhaut reduzierende Verletzungen, dient

als Eingangspforte des CyHV-3 in den Wirtsorganismus und auch als Ort der Replikation.

Diese Virusvermehrung in der Haut ist somit nicht nur als Ausgangspunkt für die

Virusvermehrung im Fisch anzusehen, sondern auch als Ausgangspunkt für die Verbreitung

der Infektion in einer ganzen Population (COSTES et al. 2009; RAJ et al. 2011).

In der vorliegenden Studie wurden die Karpfen gemeinsam mit den Wildfischen in einem

geringen Wasservolumen unter Stresseinwirkung mit Netzen aus den Fischgruben

entnommen. Bei diesem Prozess findet ein intensiver Hautkontakt der Fische statt. Weiterhin

kommt es auch zu verschiedenen Verletzungen an den Schleimhäuten und den Extremitäten,

weshalb zu diesem Zeitpunkt eine Übertragung des Virus von Karpfen auf Wildfische als sehr

wahrscheinlich anzusehen ist.

Auch japanische Studien im Lake Biwa haben gezeigt, dass in natürlichen Gewässern die

Viruskonzentrationen sehr gering sind, es allerdings während der Laichzeit zu einem

erheblichen Anstieg in Bereichen der Laichplätze der Karpfen kommt. Durch das

Laichgeschäft bilden sich partielle, saisonale „hot spots“ für das Virus (UCHII et al. 2011).

Zudem verdeutlicht diese Tatsache, dass das Auftreten von KHV nicht zwangsläufig an hohe

Temperaturen gebunden sein muss, sondern auch in latenten Beständen unter natürlichen

Bedingungen bei nicht permissiven Temperaturen in Erscheinung treten kann.

UCCHI et al. (2014) stellten fest, dass die Virusmehrung meist im Frühjahr begann. Sie sind

der Auffassung, dass zu diesem Zeitpunkt das Immunsystem geschwächt sein muss und es

deshalb auch bei nicht optimalen Temperaturen zu einer Virusmehrung kommen kann.

In der vorliegenden Studie konnten diese Beobachtungen für Wildfische bestätigt werden, da

bei dem Vergleich der Temperaturen zum jeweiligen Zeitpunkt der Befischung bei Teichen

mit latent und akut infizierten Karpfen keine signifikanten Unterschiede bezüglich der

Viruslast in den Geweben der Wildfische festgestellt werden konnten.

Außerdem geht aus der vorliegenden Studie hervor, dass weitere Faktoren scheinbar wenig

Einfluss auf die Infektion von Wildfischen mit KHV haben. Die statistische Auswertung der

Diskussion 127

Felddaten zeigt ebenfalls, dass neben dem Infektionsstatus des Karpfenbestandes, der

Temperatur auch die Altersklasse des Karpfenbestandes und der Zeitpunkt der Erstinfektion

keine signifikanten Auswirkung auf die Viruslast und die Prävalenz des Virus bei Wildfischen

haben.

Des Weiteren deuten die Ergebnisse daraufhin, dass auch die phylogenetische Nähe der

Wildfische in der Verwandtschaftssystematik zu Karpfen nicht entscheidend für die

Empfänglichkeit für das Virus ist. Vielmehr scheint hierfür die Ökologie bezogen auf die

Lebensweise und den Aufenthaltsort der Fische in der Wassersäule entscheidend zu sein.

Entgegen vorheriger Erwartungen konnte in der Feldstudie kein signifikanter Unterschied in

der Virusprävalenz und Viruslast zwischen Cypriniden und Vertretern anderer Arten

festgestellt werden.

Somit ist davon auszugehen, dass die Nähe und der Kontakt zu infizierten Karpfen den

wesentlichen Beitrag zum Infektionsstatus des Wildfisches leisten und die Höhe der

Wahrscheinlichkeit einer Infektion davon direkt abhängig ist. Dies verdeutlicht beispielsweise

die Tatsache, dass Flussbarsche aus Teichen und Abläufen mit Besatz von akut an einer

KHV-Infektion erkrankten Karpfen die höchste Prävalenz aller Wildfische mit 23,3 % bzw.

30,8 % besitzen und in Teichen mit latent infizierten Beständen nur eine Prävalenz von 2,5%

aufwiesen. Diese Werte könnten sich durch die Ernährungsweise der Flussbarsche als

Raubfisch erklären. Da sich diese während einer KHVD von moribunden und frisch toten

Fischen am Gewässergrund ernähren, wenn der Fluchtreflex der Karpfen herabgesetzt ist bzw.

nicht mehr vorhanden ist. In Teichen mit latent mit KHV infizierten Fischen kommen

hingegen solche Szenarien zu Untersuchungszeitpunkten im Frühjahr oder im Herbst

vergleichsweise extrem selten vor.

Eine potentielle Sonderstellung könnte jedoch den Schleien als Vertreter der Karpfenfische

zugesprochen werden, da diese in akut und latent infizierten Karpfenbeständen eine relativ

hohe Prävalenz der Infektion von bis zu 17 % aufweisen und in latenten Beständen sogar eine

mittlere Viruslast von 1,5 x 101 Kopien, während bei einem Einzelindividuum zudem ein

Höchstwert von 1,2 x 102 Kopien pro 1250 ng DNA ermittelt wurde.

Diskussion 128

Die Frage, ob das Virus sich in positiv auf KHV-Genomsequenzen getesteten Wildfischarten

aus der Teichbiozönose vermehrt oder nicht, konnte in der Feldstudie nicht abschließend

aufgeklärt werden, da die Viruslasten sowie die Menge an Gewebe in den untersuchten

Individuen zu gering waren. Alle in der Feldstudie beprobten Wildfische wurden Teichen

entnommen, die mit infizierten Karpfen besetzt waren. Somit konnte keine Aussage über die

Dauer der Persistenz des Virus in den Fischen getroffen werden, da diese nicht über einen

längeren Zeitraum in Wasser gehältert werden konnten, welches frei von KHV war. Des

Weiteren konnte keine Aussage darüber getätigt werden, ob sich das Virus in den Geweben

der Wildfische vermehrt oder ob sie lediglich als reine Träger für das Virus anzusehen sind.

Die Ergebnisse der Feldstudie verdeutlichen außerdem, dass die im Rahmen des Programms

des Freistaates Sachsen zur Tilgung der Koi-Herpesvirus-Infektion gemäß Artikel 32 der

Verordnung (EG) Nr. 1198/2006 (KHV-Tilgungsprogramm) umgesetzte Sanierungsstrategie,

bestehend aus einer Phase der Trockenlegung über mindestens vier Wochen, einer darauf

folgenden Branntkalkapplikation und einem anschließendem Besatz mit KHV-freiem

Besatzmaterial, geeignet zu sein scheint, das KHV erfolgreich aus Teichwirtschaftsbetrieben

zu verdrängen. In dem in dieser Studie untersuchten sanierten Teich konnte eine KHV-

Infektion bei insgesamt fünf Probennahmen weder in Wildfischen aus den Ablaufgräben noch

in Fischen aus dem Teich während der Frühjahrsbefischung nachgewiesen werden oder in mit

diesen kohabitierten naiven Karpfen. Außerdem wurden auch sämtliche Karpfen-, Plankton-

und Teichwasserproben negativ auf KHV-Genomäquivalente getestet, die innerhalb des

Studienzeitraums zu verschiedenen Zeitpunkten genommen wurden (BAUMER 2011).

Insofern kann die durchgeführte Maßnahme als erfolgreich bewertet werden und weiterhin

wird deutlich, dass das Infektionsrisiko durch Wildfische als vergleichsweise gering bewertet

werden kann.

Um die Frage nach der Höhe des epidemiologischen Risikos einer Virusübertragung von

KHV-positiven Wildfischen auf naive Karpfen abzuschätzen und zu bewerten inwiefern

Wildfische an der Verbreitung der Infektion beteiligt sind, wurden die Fische aus der

sächsischen Teichwirtschaft, die in der Feldstudie gefangen wurden in

Kohabitationsversuchen mit naiven Karpfen eingesetzt. Des Weiteren wurden virusfreie

Diskussion 129

Wildfische in zwei weiteren Studien unter Laborbedingungen nach Infektion mit

Zellkulturvirus auf ihr Verbreitungspotential bezüglich einer KHVD überprüft.

In den in dieser Studie durchgeführten Kohabitationsexperimenten, wurden Wildfische aus

mit KHV infizierten Teichen im Anschluss an eine vorherige simulierte Befischung mit

naiven Karpfen zusammen gehältert und anschließend auf KHV-Genomsequenzen untersucht.

Die Ergebnisse zeigen, dass nach zwei Wochen der Kohabitation Virusgenomfragmente mit

einer geringen Anzahl an Kopien in einigen Karpfen detektiert werden konnten. Zu einer

Übertragung des Virus kam es nach Kohabitation mit Gründlingen, Rotfedern und Schleien

als Vertretern der karpfenartigen Fische sowie bei Stichlingen, Kaulbarschen und Hechten aus

Reihen der nicht karpfenartigen Fische. Die zuvor bereits beschriebene eventuelle

Sonderstellung der Schleie wurde in den Kohabitationsversuchen durch die Tatsache

unterstrichen, dass in den Geweben von Karpfen, die mit Schleien kohabitiert wurden, eine

mittlere Viruslast von 4,6 x 103 Kopien pro 1250 ng DNA nachgewiesen werden konnte,

während es bei anderen Fischarten maximal 2,6 x 100 waren. Klinische Symptome oder

Mortalitäten wurden über diesen Zeitraum jedoch nicht beobachtet.

Darüber hinaus zeigt dieser experimentelle Ansatz, dass die Nachweismethode durch ein

gewisses Detektionslimit in Bezug auf ihre Sensitivität begrenzt ist, da bei Kaulbarschen und

Hechten aus Teichen mit latent infizierten Besatz keine KHV-Genomfragmente ermittelt

werden konnten, jedoch in Karpfen, die mit ihnen kohabitiert wurden. Aus diesem Umstand

ist anzunehmen, dass einige Carrierfische aus der Teichbiozönose möglicherweise nicht

erfasst werden konnten.

Dieser Umstand könnte weiterhin auch dafür sprechen, dass sich das Artenspektrum eventuell

noch um andere Fische erweitern könnte und auch die Prävalenz weitaus höher sein könnte

als es aus den Ergebnissen dieser Studie hervorgeht.

In der vorliegenden Studie wurden weiterhin Viruslasten bei Wildfischen aus der

Teichbiozönose bestimmt, welche zuvor unter natürlichen Bedingungen in dieser Form und

Umfang noch nicht aufgenommen wurden.

Diskussion 130

Diese Studie ermöglicht es so, eine Aussage über das tatsächliche epidemiologische Risiko zu

tätigen, welches den im Feld erhobenen Ergebnissen zufolge nach als eher niedrig zu

bewerten ist. Die Relevanz von Wildfischen bei der Verbreitung des KHV scheint daher

vergleichbar mit der von abiotischen Faktoren wie unzureichend desinfizierten Arbeitsgeräten

und weiteren Vektoren wie Fischreihern, Kormoranen, Amphibien und Pflanzen zu sein, über

welche das Virus passiv durch Kontakt übertragen wird.

Jedoch konnten KHV-Genomsequenzen in geringer Kopienzahl in Geweben von Wildfischen

aus der sächsischen Teichwirtschaft ermittelt werden und auch geringfügig bei Karpfen, die

mit diesen Individuen über einen gewissen Zeitraum kohabitiert wurden. Es ist somit nach

Exposition nicht vollständig zu negieren, dass verschiedene Wildfischarten eine Infektion

weitergeben können.

Um diese Beobachtungen nachhaltig bestätigen zu können, wurden im Folgenden

weiterführende Studien mit Infektionsversuchen im Labor unter standardisierten Bedingungen

durchgeführt.

Laborstudie

Der Literatur zufolge sind andere Fischarten als Karpfen wie zum Beispiel Goldfische,

Graskarpfen oder Karauschen nicht für eine Infektion mit KHV empfänglich und es konnte

nach Kohabitation mit erkrankten Karpfen sowie nach experimenteller Infektion keine

Anzeichen einer KHVD beobachtet werden (GILAD et al. 2002; PERELBERG et al. 2003;

RONEN et al. 2003).

Sowie in der Feldstudie, konnte auch im Rahmen der Laborstudie keine KHV-bedingte

Symptomatik oder Mortalität bei Wildfischen beobachtet werden, welche in eine Viruslösung

eingesetzt oder mit KHV-ausschüttenden Karpfen kohabitiert wurden. Somit konnte auch in

dieser Studie die Vermutung bestätigt werden, dass nur bei Karpfen mit einer durch das Virus

bedingen Erkrankung zu rechnen ist.

Diskussion 131

Das Vorkommen von Koi-Herpesvirus wurde bisher zumeist in Geweben von karpfenartigen

Fischen beschrieben (EL-MATBOULI et al. 2007; MEYER 2007b; SADLER et al. 2008;

KEMPTER et al. 2009; BERGMANN et al. 2010a; KEMPTER et al. 2012).

Genomsequenzen des Virus wurden vor allem in Goldfischen detektiert (EL-MATBOULI et

al. 2007; SADLER et al. 2008; BERGMANN et al. 2010a), wobei diese Fische nicht an einer

Infektion erkrankten. SADLER et al (2008) generierten in diesem Zusammenhang mittels

quantitativer real-time PCR Ergebnisse, die eine Aussage über die Viruslast in den Geweben

der Fische erlaubten. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass bei Goldfischen, die

zusammen mit erkrankten Koi gehalten wurden, eine geringere Viruslast in den Geweben

vorlag als bei Koi desselben Bestandes.

Diese Daten decken sich ebenfalls mit den in dieser Arbeit beobachteten Ergebnissen aus der

Feldstudie sowie auch mit denen der experimentellen Ansätze aus der Laborstudie, in

welchen sich ein ähnliches Bild abzeichnet.

Wurden virusfreie Wildfische in einer KHV-haltigen Lösung im Labor inkubiert,

entwickelten sie keine Anzeichen einer Erkrankung und des Weiteren konnten auch nur in

Geweben von Einzelindividuen Genomsequenzen des Koi-Herpesvirus gefunden werden und

dies auch nur mit einer sehr geringen Viruslast. Ein Höchstwert von 1,17 x 100 wurde bei

einem Stichling ermittelt. Bei Karpfen, die mit diesen über das Bad infizierten Fischen

kohabitierten wurden, konnte nur bei einem Einzelfisch virusspezifische DNA in geringer

Konzentration nachgewiesen werden. Zur Prüfung der Virulenz des eingesetzten Virus in die

virushaltige Lösung des Infektionsbeckens eingesetzte Karpfen zeigten jedoch eine Mortalität

von 100 % mit ausgeprägter KHV-I Symptomatik und hohen Viruslasten von bis zu

3,55 x 107 Kopien in den Geweben. Dieser Tatsache zufolge kann ausgeschlossen werden,

dass die Infektiosität der Viruslösung für eine erfolgreiche Infektion nicht ausreichend

gewesen wäre und verdeutlicht die unterschiedliche Empfänglichkeit der Fische für KHV.

Diesen Beobachtungen zugrunde liegend lässt sich vermuten, dass eine Infektion von

verschiedenen Fischen aus einem breiten Artenspektrum der Teichbiozönose möglich ist, eine

verstärkte Virusvermehrung in den Geweben, gepaart mit einer starken Ausschüttung von

infektiösen Viruspartikeln, jedoch nicht stattfindet.

Diskussion 132

Um diese Vermutung zu bestätigen, wurde eine zweite Strategie für eine experimentelle

Infektion von Wildfischen entwickelt. In diesem Ansatz wurden die natürlichen Bedingungen

nachempfunden, indem mit Zellkulturvirus infizierte Karpfen mit Wildfischen über einen

längeren Zeitraum zusammen gehältert wurden. Diese wurden daraufhin gestresst und im

Anschluss nochmals mit naiven Karpfen kohabitiert. Des Weiteren wurden in diesem Ansatz

pro Fisch jeweils eine Gewebepoolprobe und eine Probe bestehend aus Flossen- und

Hautmaterial entnommen, um eine Konzentrationsverteilung des Virus im Fischorganismus

genauer bestimmen zu können.

In diesem Zusammenhang konnten jedoch keine signifikanten Unterschiede dokumentiert

werden. Fünf von 20 Proben aus Geweben von Schleien wurden beispielsweise positiv auf

KHV-Genomsequenzen getestet, die sich zwei zu drei auf die beiden untersuchten

Gewebepools verteilten. Die Viruslast lag hier zwischen 1,9 x 10-1 und 1,04 x 101 Kopien,

während Karpfen der Kontrollgruppen eine Mortalität von 100 % mit Viruslasten zwischen

7,07 x 103 und 3,77 x 106 Kopien aufwiesen. Bei drei, der mit Goldfischen kohabitierten

Karpfen, konnten Viruslasten von 1,84 x 100 bis 2,08 x 100 Kopien festgestellt werden und

zwei der infizierten Karpfen verstarben im folgenden Verlauf, jedoch ohne eindeutige

Symptomatik einer KHVD. Auch dies lässt vermuten, dass die Karpfen mit einer nur sehr

geringen Menge an Virus durch die Wildfische infiziert wurden.

Dies spricht dafür, dass in Wildfischen eine erheblich geringere Virusreplikation stattfindet

oder sie lediglich als ein Reservoir für das KHV in attenuierter Form angesehen werden

können, welche das Virus zwar passiv verbreiten, es jedoch aktiv in ihren Geweben nicht zu

einer Vermehrung kommt.

BERGMANN et al. (2010a) stellten die Vermutung auf, dass eine Replikation von KHV in

Goldfischen stattfinden könnte und in diesem Zusammenhang auch infektionsfähiges Virus

auf Koi übertragen werden könnte. Des Weiteren demonstrierten EL-MATBOULI et al.

(2010), dass in den Geweben von Goldfischen eine Expression von viralen Genen, assoziiert

mit einer Replikation von KHV, stattfindet. Dieser Nachweis erfolgte mit einer nicht

quantitativen RT-PCR, mittels den Primern KHV-TKf und KHV-TKr in Anlehnung an

BERCOVIER et al. (2005). Für eine Replikation des Virus in den Geweben einiger andere

Fischarten als Karpfen sprechen auch die Ergebnisse von DAVIDOVIC et al. (2007). In

Diskussion 133

Zellkulturexperimenten konnte eine Virusreplikation in Zelllinien abgeleitet von Goldfischen

(Au) und Silberkarpfenflossen (Tol=FL) beobachtet werden (DAVIDOVICH et al. 2007). Die

Zelllinien CHSE (chinook salmon embryo), RTG-2 (rainbow trout gonad) oder CCO (channel

catfish ovary) erwiesen sich hingegen als resistent (OH et al. 2001; DAVIDOVICH et al.

2007). Das Virus zeigte in den Zellen der Goldfisch- und Silberkarpfenflossen ähnliche

Replikationsmuster wie in den Karpfenzellen CCB und KFC, es wurden jedoch geringere

Mengen an Virus produziert. Ob zelluläre Barrieren oder die zelluläre Immunantwort dies

bedingt konnte in diesem Zusammenhang nicht beantwortet werden.

Um zu überprüfen, ob in den Geweben der häufig in der sächsischen Teichbiozönose

vorkommenden Fischarten ebenfalls eine Replikation des KHV zu beobachten ist, wurden

zwei quantitative RT-PCR Systeme nach ADAMEK et al. (2012) etabliert, um eine mögliche

Virusreplikation ggf. auch quantitativ zu erfassen. Mittels dieser Systeme wurden die Gewebe

aller Fische beider Laborexperimente hinsichtlich einer Transkription von Virusproteinen

untersucht.

KHV-spezifische RNA-Sequenzen des Thymidinkinase-Gens oder des Major Capsid Protein-

Gens (ORF92) ließen sich mit diesen Systemen nicht in Wildfischen nachweisen, sondern nur

in den Geweben von Karpfen. Der Vergleich der Transkriptionsraten der Virusproteine bei

Karpfen aus den beiden Laborinfektionen veranschaulicht allerdings, dass es in Bezug auf die

Anzahl der Kopien deutliche Unterschiede zwischen beiden experimentellen Ansätzen gibt.

Im Zuge der Badinfektion wurden Konzentrationen von 1,03 x 100 bis 1,12 x 103 Kopien mit

beiden Primerpaaren ermittelt. Bei der Transkriptionsanalyse der Karpfen aus dem

Kohabitationsversuch konnten mit den gleichen Primerpaaren nach ADAMEK et al. (2012)

Konzentrationen zwischen 3,76 x 103 und 1,70 x 107 Kopien ermittelt werden. Der Vergleich

der Kopienzahl im Pool aus Haut- und Flossengewebe mit konventionellen Gewebepools

bestehend aus Leber, Niere, Milz, Gehirn und Kieme zeigt, dass in den Organgewebeproben

nur eine geringfügig höhere Virusvermehrung stattgefunden hat und für die Diagnosefindung

bezüglich einer Replikation des KHV unterschiedliche Gewebetypen geeignet zu sein

scheinen.

Auf Grund der Tatsache, dass in Karpfen eine sehr hohe Transkriptionsrate von KHV-

spezifischen Virusproteinen beobachtet werden konnte und diese Daten mit zwei auf

Diskussion 134

unterschiedlichen Genen basierten Primerpaaren generiert wurden, kann im Folgenden

ausgeschlossen werden, dass durch einen Mangel an Sensitivität der Nachweismethode keine

Anzeichen einer Virusmehrung bei Wildfischen beobachtet werden konnten.

Die These von BERGMANN et al. (2010a), dass in Goldfischen eine Virusvermehrung

stattfinden könnte, konnte in dieser Studie nicht bestätigt werden. Ebenfalls konnten die

Ergebnisse der Studie von EL-MATBOULI et al. (2010) nicht reproduziert werden, obwohl

ebenfalls ein auf dem Thymidinkinase-Gen basiertes RT-PCR Protokoll verwendet wurde.

Der Goldfisch sowie die anderen in der Laborstudie eingesetzten Wildfische agieren nicht wie

bei EL-MATBOULI et al.(2010) beschrieben als „True Carrier“, sondern den Daten dieser

Arbeit folgend eher als Vektoren, die das Virus passiv verbreiten.

Es kann allerdings nicht völlig ausgeschlossen werden, dass eine Virusvermehrung auf einem

so niedrigen Level stattfindet, dass selbst sensitivste PCR-Methoden noch über der

Nachweisgrenze liegen, da DAVIDOVIC et al. (2007) zumindest auf kultivierten Zellen von

Goldfischen einen CPE beobachten konnte.

Jedoch ist dies bei Betrachtung der Ergebnisse dieser Studie als ziemlich unwahrscheinlich zu

bewerten, da die Fische bei permissiven Temperaturen gehältert wurden, welche bei Karpfen

eine starke Virusvermehrung induzierten und zusätzlich vor den Probennahmen einem

nachweislich geeigneten Stressoren ausgesetzt wurden. Diese Vermutung wird durch die

Tatsache, dass auf DNA-Ebene bei Wildfischen nur sehr geringe Kopienzahlen des KHV

festgestellt werden konnten, ebenfalls unterstützt.

Die über den gesamten Studienzeitraum ermittelten Virusmengen bei Wildfischen, die mit der

quantitativen real-time PCR nach GILAD et al. (2004) ermittelt wurden, entsprachen in etwa

den geringen Viruskonzentrationen, die auch in Teichen mit latent KHV-infizierten

Beständen für Karpfen mit persistierender Infektion sowie für Wasser- und Planktonproben

ermittelt wurden.

UCCHI et al. (2014) erkannten saisonale Expressionsmuster verschiedener KHV-spezifischer

Gene. Sie stellten fest, dass verschiedene mit dem lytischen Zyklus in Verbindung stehende

Gene nur ab bestimmten permissiven Temperaturen exprimiert werden oder zu Zeitpunkten

Diskussion 135

im Frühjahr kurz vor der Paarung, wenn das Immunsystem der Fische noch geschwächt ist.

Virale Genexpression, die mit dem latenten Zyklus in Verbindung steht, lässt sich jedoch

mittels RT-PCR auch in Phasen ermitteln, wenn sich KHV unter nicht permissiven

Konditionen nicht im Wirtsorganismus vermehrt.

Da die Virusmengen bei Wildfischen dieser Studie und Karpfen im latenten Stadium, die zum

selben Zeitpunkt gefangen wurden nahezu identisch sind (BAUMER 2011; BAUMER et al.

2013; FABIAN et al. 2013), könnte vermutet werden, dass das KHV sich in Wildfischen nicht

replizieren, sondern nur Gene exprimieren kann, die am latenten Zyklus beteiligt sind, jedoch

keine, die der lytischen Phase zugeordnet werden können. Somit wären die Wildfische nur ein

passives Reservoir für das KHV und eine Reaktivierung des Virus durch Stress oder

permissive Temperaturen könnte nicht stattfinden. Dies würde die Ergebnisse dieser Studie

bestätigen und die niedrigen Virusmengen und die geringe Ausschüttung erklären.

Andererseits könnte die Resistenz der Wildfische auch in einem Fehlen spezifischer

Virusrezeptoren, einer angeborenen zellulären Immunität oder einer wesentlich intensiveren

Immunantwort des Wirtsorganismus begründet sein (DAVIDOVICH et al. 2007).

Methodik

Eine abschließende Betrachtung der in dieser Arbeit verwendeten Methodik zeigt auf, wie

belastbar die in dieser Studie generierten Daten angesehen werden können.

Da bei Wildfischen bisher noch keine Symptome einer durch KHV-bedingten Erkrankung

festgestellt werden konnten, war davon auszugehen, dass potentiell detektierte

Viruskonzentrationen, ähnlich wie bei symptomlosen, latent mit KHV infizierten Karpfen,

sich als sehr gering darstellen würden. Deshalb sollte in dieser Studie eine sehr sensitive

Nachweismethode verwendet werden.

Diskussion 136

Des Weiteren sollte mittels dieser Studie die epidemiologische Relevanz von Wildfischen aus

der Teichbiozönose ermittelt werden, weshalb eine standardisierte Methode mit der

Möglichkeit zur Quantifizierung die Grundlage für die Erfassung der Daten sein sollte.

Infolgedessen wurde ein quantitatives real-time PCR-Verfahren ausgewählt, da alternative

KHV-Nachweismethoden, die auf Zellkulturen oder ELISA-Verfahren basieren, entweder

nicht sensitiv genug sind oder keine Aussage darüber erlauben, ob der Fisch noch Träger des

Virus ist (ADKISON et al. 2005; POKOROVA et al. 2005; MATSUI et al. 2008).

Zur Auswahl standen hier das von GILAD et al (2004) sowie das von BERCOVIER et al.

(2005) entwickelte PCR-Verfahren. Der Vergleich der beiden auf unterschiedlichen Primern

basierten Nachweismethoden zeigte, dass das PCR-Verfahren nach GILAD et al. (2004)

kombiniert mit einem internen Kontrollsystem (HOFFMANN et al. 2006) dem von

BERCOVIER et al. (2005) nicht nur in Bezug auf die Spezifität, sondern auch auf die

Sensitivität überlegen war. Mittels eines internen Standards eines zuvor klonierten Plasmids

(GILAD et al. 2002; BERGMANN et al. 2010c; BAUMER 2011) ermöglichte diese Methode

einen Nachweis von KHV-DNA bis zu einer Konzentration von 1–5 Kopien.

Dieses Protokoll stellt eines der sensitivsten Nachweismethoden für die Detektion von KHV-

DNA in frischen Gewebeproben dar und ermöglicht ebenfalls die Detektion von

subklinischen Virusinfektionen (BERGMANN et al. 2010c; BAUMER et al. 2013). Bei

gesund erscheinenden Karpfen, die eine KHVD überlebt haben, liegen meist nur

Viruskonzentrationen im Bereich von 5–10 Viruspartikel pro 25–30 µg

Gewebeprobenmaterial vor (BERGMANN et al. 2010c).

Auch das Nationale Referenzlabor für die Koi-Herpesvirusinfektion, Friedrich-Loeffler-

Institut, Bundesinstitut für Tiergesundheit, Insel Riems, rät dazu, diese PCR weiterhin für die

Diagnostik zu verwenden und bezeichnet es nach heutigem Stand der Wissenschaft als den

Goldstandard (BERGMANN et al. 2010b).

Durch die größtenteils sehr geringen Konzentrationen an KHV-DNA in den Geweben von

Wildfischen, die im Rahmen dieser Studie untersucht wurden, bestand teils auch das Risiko

einer potentiellen Fehlinterpretation der Ergebnisse, da es trotz der hohen Spezifität des

Diskussion 137

verwendeten PCR-Systems zu Artefaktbildung kommen konnte. Um falsch-positive

Ergebnisse basierend auf dieser Tatsache auszuschließen, wurden über den Zeitraum der

Studie alle Fluoreszenzmuster vergleichend betrachtet. Es wurde somit eine Art

Qualitätsmanagement betrieben. Dies beinhaltete die Wiederholungen für Proben mit sehr

geringer Viruslast, welche meist bestätigt werden konnten. Proben mit etwas höheren

Viruslasten ließen sich hingegen immer bestätigen. Des Weiteren fand auch ein

epidemiologischer Vergleich mit Proben statt, die in einer parallel an Karpfen aus diesen

Teichen entnommen Studie generiert wurden (BAUMER 2011). In diesem Zusammenhang

konnte festgestellt werden, dass wenn in Teichen mit latent infizierten Beständen wenig

KHV-DNA bei Karpfen gefunden wurde, auch die Viruslasten und die Prävalenz für

Wildfische sehr gering war. So konnte ein immer gleiches Muster zwischen den Viruslasten

bei Karpfen und Wildfischen beobachtet werden, was weiterhin für die Belastbarkeit der

Ergebnisse spricht. Außerdem erfolgte, um die Ergebnisse zu bestätigen, eine weitere Analyse

der zuvor positiv auf KHV-Genomäquivalente getesteten Proben mit einer SYBR Green real-

time PCR mittles Primersequenzen nach ADAMEK et al (2012), die auf einem anderen

Genomabschnitt des KHV basierend entwickelt wurden. Für diese Analyse wurde das Capsid

Triplex Protein-Gen (ORF 72) verwendet und es konnten KHV spezifische DNA-Sequenzen

in den Proben von Schleie, Flußbarsch und Plötze nachgewiesen werden.

Ein weiterer Nachteil von konventionellen PCR basierten Methoden ist es, dass anhand dieser

keine Aussage über den Infektionsstatus des Fisches ermittelt werden kann, beziehungsweise

keine Unterscheidung zwischen infektiösem Virus, uninfektiösen Viruspartikeln und viraler

Nukleinsäure möglich ist.

Im Rahmen dieser Studie sollte aber vor allem eine Aussage über die Rolle der Wildfische bei

der Verbreitung, also über die epidemiologische Relevanz ermittelt werden.

Mit Reversen Transkriptions (RT)-PCR-Analysen, die auf exprimierte Gene abzielen, kann

dieser Umstand allerdings umgangen werden, da hierbei in situ der Nachweis viraler Aktivität

möglich ist. Dieser Ansatz ist besonders bei Viren interessant, die einen lytischen und einen

latenten Zyklus haben, wie es der Fall bei Herpesviren ist. Aktives Virus, welches auf andere

Wirte übertragbar ist, kann somit von persistierendem, nicht aktivem Virus unterschieden

Diskussion 138

werden, wenn eine Expression von Genen, die der Replikation zugeordnet werden, nicht

stattfindet (UCHII et al. 2014).

Deshalb wurden im Folgenden zwei RT-PCR basierte Ansätze nach ADAMEK et al. (2012)

auf Grundlage zweier Gene des KHV etabliert, um zusätzlich zu der quantitativen Aussage

über die Menge an DNA auch eine Aussage zum Verbreitungspotential und der

epidemiologischen Relevanz der Wildfische zu ermitteln.

KHV-spezifische RNA-Sequenzen des Thymidinkinase-Gens oder des Major Capsid Protein-

Gens (ORF92) ließen sich mit diesen Systemen jedoch nicht in den Geweben von

Wildfischen nachweisen. Karpfen, die mit der gleichen Viruslösung oder durch Kohabitation

infiziert wurden, wiesen allerdings sehr hohe Transkriptionswerte von 1,03 x 100 bis zu 1,70 x

107 Kopien auf. Dies kann als Beleg für die hohe Sensitivität der Methode angesehen werden.

Die im Rahmen der Kohabitationsversuche gemachten Beobachtungen bestätigen weiterhin

auch die mittels RT-PCR ermittelten Ergebnisse und veranschaulichen eindeutig, dass die in

dieser Arbeit verwendete Methodik qualitativ und quantitativ geeignet war, eine fundierte

Aussage über die Rolle von Wildfischen bei der Übertragung einer KHVD in der sächsischen

Teichwirtschaft zu treffen.

Fazit

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, die Rahmen dieser Studie im Feld sowie im Labor

generiert wurden, dass bei Cypriniden und Vertretern anderer Wildfischarten aus der

Teichbiozönose eine Infektion einzelner Individuen mit KHV erfolgen kann. Allerdings ist

bei diesen Fischen nur eine sehr geringe Viruslast in den Geweben zu beobachten. Somit

können diese Arten als epidemiologisches Risiko bei der Infektion von Karpfen mit KHV

nicht ausgeschlossen werden, allerdings kann ihnen wesentlich weniger Bedeutung als zuvor

angenommen zugesprochen werden, da in ihren Geweben weder eine Virusreaktivierung noch

eine Virusvermehrung stattzufinden scheint.

Zusammenfassung 139

7 Zusammenfassung

Marc Fabian (2015):

Untersuchungen zu Übertragungswegen der Koi-Herpesvirose (KHV) in Wildfischen

In der vorliegenden Arbeit wurde die epidemiologische Relevanz von Wildfischen für die

Verbreitung des KHV in der sächsischen Karpfenteichwirtschaft untersucht. Hierzu wurden

verschiedene Fischarten aus der Teichbiozönose hinsichtlich ihrer Empfänglichkeit für KHV

untersucht. In diesem Zusammenhang wurde die Viruslast in den Geweben infizierter Fische

bestimmt, untersucht inwiefern durch Stressoren eine Ausschüttung von infektiösen

Viruspartikeln induziert werden kann und somit eine Übertragung auf virusfreie, naive

Karpfen möglich ist. Um dies zu überprüfen, wurden verschiedene Fischarten aus

Karpfenteichen mit einer KHV-Historie entnommen. Die Probennahmen fanden während

akuter Ausbrüche der Infektion bei Karpfen im Sommer sowie in latent infizierten Beständen

während der Frühjahrs- und Herbstbefischung statt. Die Ergebnisse zeigen, dass unabhängig

von Jahreszeit, Wassertemperatur, Altersklasse und Infektionsstatus des Karpfenbestandes

einzelne Individuen aus verschiedene Fischarten der Wildfischfauna in Karpfenteichen und

aus Ablaufgräben in der Teichwirtschaft mittels real-time PCR positiv auf KHV-

Genomäquivalente getestet werden konnten. Bei allen im Rahmen dieser Feldstudie

untersuchten Fischarten wies die Virusinfektion eine niedrige Prävalenz auf und bei

infizierten Fischen lagen nur geringe Viruslasten in den Geweben vor, unabhängig von der

phylogenetischen Verwandtschaft der Fischart zum Karpfen. In einem Kohabitationsversuch

von Wildfischen mit virusfreien Karpfen konnte ein Virustransfer nur auf einzelne Karpfen

festgestellt werden, jedoch ohne bei diesen hohe Viruslasten oder Symptome einer KHVD zu

erzeugen. Um diese Beobachtungen zu bestätigen, wurden zwei Infektionsversuche im Labor

unter standardisierten Bedingungen durchgeführt. Nach experimenteller Infektion von

Wildfischen mit Zellkulturvirus sowie nach Kohabitation von Wildfischen mit Virus

ausschüttenden Karpfen konnten auch unter Laborbedingungen vergleichbare Ergebnisse wie

im Feld beobachtet werden. Infektionen traten bei Wildfischarten in niedriger Prävalenz und

mit geringer Viruslast auf. Eine Übertragung des Virus von Wildfischen auf Karpfen erfolgte

nur bei einzelnen Individuen, die keine Krankheitssymptome entwickelten. Eine

Zusammenfassung 140

Transkription von Genen die Virusproteine codieren konnte in Geweben PCR-positiver

Wildfische mittels RT-PCR nicht beobachtet werden, was dafür spricht, dass sich das Virus in

Wildfischen nicht oder nur in sehr geringem Maße repliziert und es nicht zu einer

Reaktivierung kommt. In einem nach einem KHV-Ausbruch sanierten Teich konnte in dieser

Studie eine KHV-Infektion bei Wildfischen aus dem Teich und aus den Ablaufgräben nicht

nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte auch nach Kohabitation der Wildfische mit

virusfreien Karpfen kein Virustransfer auf naive Karpfen festgestellt werden.

Den Ergebnissen dieser Arbeit zufolge können Cypriniden und Vertreter anderer

Wildfischarten aus der Teichbiozönose als epidemiologisches Risiko bei der Infektion von

Karpfen mit KHV nicht ausgeschlossen werden, allerdings mit weniger Bedeutung als zuvor

angenommen.

Summary 141

8 Summary

Marc Fabian (2015):

Examination of the transmission of koi herpesvirus (KHV) by wild fish species

The current work examines the epidemiological relevance of wild fish species from carp

farms in Saxony for a spreading of KHV. For this purpose, various wild fish species were

sampled from carp ponds with a history of KHV infection and examined for their

susceptibility to the virus. In this context, the viral load in the tissues of these fish was

determined and it was tested whether a release of the virus could be induced by stress and the

virus then could be transferred to naïve carp by cohabitation. Wild fish were sampled from

carp ponds during acute outbreaks of virus-induced mortality in summer and from ponds

stocked with carp carrying a latent KHV infection. From these ponds, wild fish were collected

during the harvesting process in autumn or spring, when the ponds were drained. The results

show that regardless of season, water temperature, age and infection status of the carp stock,

individuals from various wild fish species in carp ponds and its outlets could be found

positive for KHV genome equivalents by real-time PCR. The sampled fish as part of the field

study showed only a low prevalence and a low virus load in the tissues regardless of their

phylogenetic relationship to common carp. Furthermore, virus transfer to individual naive

carp was observed, but without producing high virus loads or symptoms of KHVD in the

tissues after a period of cohabitation.

To confirm these observations, two further infection experiments were carried out in the

laboratory under standardized conditions. After experimental infection of wild fish from

various species with cell culture derived virus or by cohabitation with virus shedding carp,

comparable results were observed as in the field study. Individuals from the wild fish species

were found positive for KHV with a low virus load, in a low prevalence and a low rate of

virus transfer to individual naive carp. Recipient carp as well showed no symptoms of the

disease while carp used as infection controls experienced 100 % mortality with high virus

loads in the tissue. Futhermore by RT-PCR no transcription of viral proteins was found in

tissues of KHV exposed wild fishes, which suggests no replication of the virus or a replication

at a very low rate in the tissues of wild fish species and it presumably will not be reactivated.

Summary 142

In a pond which had been disinfected after an outbreak of KHV D, no KHV specific DNA

sequences could be observed in wild fishes collected from the pond and its outlet at five

different time points during one year of observation. Furthermore, KHV could also not be

detected in naïve carps after cohabitation with wild fishes taken from this pond.

According to the results of the present study, fishes from different cyprinid species and from

other wild species can not be excluded as epidemiological risk of transmitting KHV to carp

form the ponds in carp farms, however, with less importance than previously assumed.


9 Literaturverzeichnis

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Danksagung 158

10 Danksagung

An erster Stelle möchte ich Herrn Prof. Dr. Dieter Steinhagen für die Überlassung des

Themas, die Bereitstellung der Arbeitsmöglichkeiten, die äußerst kompetente und über alle

Maße geduldige Betreuung, auf die ich mich zu jeder Zeit verlassen konnte, bedanken. Einen

besseren Doktorvater hätte ich mir weder fachlich noch persönlich wünschen können. Vielen

Dank.

Bedanken möchte ich mich auch bei Dr. Gert Füllner, Dr. Kerstin Böttcher, Dr. Grit Bräuer

und Dr. Cornelia Mohr, die Agnes und mir stets zur Seite standen und uns immer herzlich in

Sachsen aufgenommen haben.

Dr. Agnes Baumer gilt mein ganz besonderer Dank für die wunderbare Zeit, die wir

gemeinsam in Sachsen und im Labor verbracht haben.

Weiterhin möchte ich mich bei Dr. Verena Jung-Schroers, Dr. Karina Retter, Marian van der

Marel PhD, Dr. Mikolaj Adamek, Graham Brogden PhD, Birgit Luckardt, Patricia Lowels

und bei meinem ehemaligen Kollegen Dr. Arne Hübner für die theoretische und praktische

Hilfe bei der Durchführung dieser Arbeit bedanken. Des Weiteren danke ich meinem lieben

Fastkollegen Adam Rosalski für die nicht selbstverständliche Hilfestellung mit Spinnern und

Blinkern.

Ganz besonders danke ich meiner Oma, meiner Mama, meinem Papa und Angela sowie

meiner Schwester Miriam, Benny, Christian und Damian, die wirklich eine schwere Zeit mit

mir hatten, aber trotzdem bis zum Schluss nicht aufgehört haben an mich zu glauben.

Des Weiteren gilt auch ein ganz herzlicher Dank meinem außergewöhnlichen Freund und

Lebensberater Jürgen Keller, ohne den diese Arbeit nicht zustande gekommen wäre, was nicht

nur auf der Kostenübernahme für das Binden dieser Arbeit beruht.

Zu guter letzt gilt ein riesiger Dank meiner lieben Melanie für die persönliche Unterstützung

und den wertvollen Rückhalt, den ich während dieser nicht leichten Zeit genießen durfte. Ich

danke dir sowie Luise und Lenny von Herzen.

Danksagung 159

Lieber Opa, am meisten hätte ich mich gefreut, wenn ich dich noch zu meiner

Promotionsfeier hätte einladen können.

Untersuchungen zu Übertragungswegen der Koi-Herpesvirose (KHV… · 2019. 1. 10. · 1. Gutachter:...

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