Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes ...

Aus dem

Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes Detomidin hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Severine Tobias (geb. Gerber) aus Stadthagen

Hannover 2004

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. E. Deegen

Tag der mündlichen Prüfung: 25.November 2004

„Mit dem Doping ist es genauso wie mit der Liebe.

Jeder weiß, was es ist, aber niemand vermag es klar zu umschreiben.“

Anonym

Meiner Mutter & Christoph

in Liebe und Dankbarkeit

INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS

1 Einleitung ........................................................................................................... 1

2 Literaturübersicht .............................................................................................. 3

2.1 Doping........................................................................................................... 3

2.1.1 Definition und Geschichtliches .............................................................. 3

2.1.2 Notwendigkeit der Dopingbestimmungen.............................................. 4

2.1.3 Doping im Pferdesport........................................................................... 5

2.1.3.1 Bestimmungen der Pferdesportverbände....................................... 7

2.1.3.2 Leistungsprüfungsordnung (LPO) der Deutschen Reiterlichen Vereinigung e. V. (Stand 2004) ...................................................... 7

2.1.3.3 Rennordnung (RO) des Direktoriums für Vollblutzucht und Rennen (Stand Januar 2002) ......................................................... 8

2.1.3.4 Satzung und Ordnungen des Hauptverbandes für Traber-Zucht und –Rennen e. V. (HVT) vom 01. Februar 2003........................... 8

2.1.4 Dopingformen........................................................................................ 9

2.1.4.1 Positives Doping............................................................................. 9

2.1.4.2 Negatives Doping oder Doping auf Niederlage ............................ 11

2.1.4.3 Unabsichtliches Doping ................................................................ 11

2.1.4.4 Maßnahmen zur Erschwerung des Dopingnachweises................ 12

2.1.5 Statistische Daten zu Dopingkontrollen in Deutschland ...................... 13

2.1.6 Beurteilung von Analyseergebnissen .................................................. 13

2.1.6.1 Null-Lösung und Grenzwerte........................................................ 13

2.2 Physiologie und Pharmakologie von α2-Rezeptoren ................................... 16

2.2.1 Rezeptorklassifizierung ....................................................................... 17

2.2.2 α2-Agonisten und Antagonisten beim Pferd......................................... 17

2.2.3 Wirkungsmechanismus ....................................................................... 18

2.2.4 α2-Antagonisten................................................................................... 19

2.3 Detomidin .................................................................................................... 20

2.3.1 Chemie................................................................................................ 20

2.3.2 Pharmakokinetik.................................................................................. 21

2.3.3 Pharmakodynamische Wirkung........................................................... 22

2.3.4 Applikationsformen.............................................................................. 27

2.3.5 Klinische Anwendung von Detomidin .................................................. 27

INHALTSVERZEICHNIS

2.3.6 Einsatz von Detomidin im Pferdesport zur Beeinflussung der Leistung............................................................................................... 27

2.4 Analytik........................................................................................................ 28

2.5 Analytischer Nachweis von Detomidin ........................................................ 29

2.5.1 Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit Tandem-Massenspektrometer (MS/MS)............................................................ 29

2.6 Pharmakokinetik.......................................................................................... 32

2.6.1 Allgemeine Pharmakokinetik ............................................................... 32

2.6.2 Eliminationskinetische Parameter ....................................................... 36

3 Material und Methoden.................................................................................... 38

3.1 Versuchsplanung ........................................................................................ 38

3.2 Versuchsdurchführung ................................................................................ 38

3.2.1 Versuchstiere ...................................................................................... 38

3.2.2 Konditionierungsphase und Vorbereitung des Versuches................... 40

3.2.2.1 Substanz und Dosierung .............................................................. 42

3.2.3 Applikation des Medikamentes (Vor- und Hauptversuch).................... 42

3.2.4 Erhebung der Messdaten .................................................................... 43

3.2.4.1 Abnahme, Verarbeitung und Aufbewahrung der Blutproben ........ 43

3.2.4.2 Herzfrequenz................................................................................ 44

3.2.4.3 Atemfrequenz ............................................................................... 45

3.2.4.4 Körpertemperatur ......................................................................... 45

3.2.4.5 Feststellung des Sedationsgrades ............................................... 45

3.2.4.6 Überprüfung der Analgesie........................................................... 47

3.2.4.7 Andere Beobachtungen................................................................ 51

3.2.4.8 Gewinnung, Messung und Aufbewahrung von Urinproben .......... 51

3.2.4.9 Transport der Plasma- und Urinproben ........................................ 52

3.3 Analytik........................................................................................................ 52

3.3.1 Methodenentwicklung Plasma und Urin .............................................. 52

3.3.1.1 Herstellung der Standardlösungen im Plasma ............................. 53

3.3.1.2 Herstellung der Standardlösungen im Urin................................... 54

3.3.1.3 Variation der Messmethode.......................................................... 55

3.3.1.4 Variation der Aufarbeitung und Extraktionsmethode .................... 56

3.3.2 Validierung der Methode in Plasma und Urin ...................................... 59

INHALTSVERZEICHNIS

3.3.2.1 Selektivität und Spezifität ............................................................. 59

3.3.2.2 Überprüfung auf Linearität............................................................ 60

3.3.2.3 Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, Limit of detection = LOD) ... 61

3.3.2.4 Bestimmungsgrenze (Limit of quantification = LOQ oder Sensitivität)................................................................................... 62

3.3.2.5 Richtigkeit (Accuracy)................................................................... 62

3.3.2.6 Präzision....................................................................................... 63

3.3.2.7 Stabilität........................................................................................ 64

3.3.2.8 Wiederfindung (Recovery)............................................................ 65

3.3.3 Chromatographische Trennung und Detektion von Detomidin und seinen Metaboliten .............................................................................. 66

3.3.3.1 Gerät und Gerätebedingungen..................................................... 66

3.3.3.2 Reagenzien und Lösungsmittel .................................................... 68

3.3.4 Messung der Proben aus dem Hauptversuch ..................................... 69

3.3.4.1 Erstellung der Kalibrationskurven im Plasma des Hauptversuches ........................................................................... 69

3.3.4.2 Erstellung der Kalibrationskurven im Urin..................................... 71

3.3.4.3 Aufarbeitung der Plasmaproben................................................... 73

3.3.4.4 Aufarbeitung der Urinproben ohne und mit Hydrolyse.................. 74

3.4 Pharmakokinetische Auswertung (Methode und Software)......................... 80

3.5 Statistische Auswertung.............................................................................. 81

4 Ergebnisse ....................................................................................................... 82

4.1 Massenspektren und Strukturformeln der zu analysierenden Substanzen und der internen Standards......................................................................... 82

4.1.1 Detomidin ............................................................................................ 82

4.1.2 3-Hydroxydetomidin ............................................................................ 83

4.1.3 Medetomidin........................................................................................ 83

4.1.4 Carboxydetomidin ............................................................................... 84

4.1.5 Imidazolylbenzoesäure........................................................................ 85

4.2 Ergebnisse der Validierung ......................................................................... 85

4.2.1 Selektivität und Spezifität .................................................................... 85

4.2.2 Überprüfung auf Linearität................................................................... 87

4.2.3 Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, Limit of detection, LOD) ............ 90

4.2.4 Bestimmungsgrenze (Limit of quantification, LOQ) ............................. 90

INHALTSVERZEICHNIS

4.2.5 Richtigkeit (Accuracy).......................................................................... 91

4.2.6 Präzision ............................................................................................. 92

4.2.7 Stabilität .............................................................................................. 94

4.2.8 Wiederfindung (Recovery)................................................................... 95

4.3 Ergebnisse des Hauptversuchs................................................................... 96

4.3.1 Konzentration von Detomidin im Plasma............................................. 96

4.3.2 Pharmakokinetik von Detomidin im Plasma ...................................... 100

4.3.3 Detomidin im Urin.............................................................................. 102

4.3.4 3-Hydroxydetomidin im Urin .............................................................. 102

4.3.4.1 Aufarbeitung mit und ohne Hydrolyse vergleichend ................... 104

4.3.5 Carboxydetomidin im Urin ................................................................. 105

4.3.5.1 Aufarbeitung mit und ohne Hydrolyse vergeichend .................... 107

4.4 Berechnung der irrelevanten Plasma- und Urin-konzentrationen.............. 108

4.5 Berechnung von Ausscheidungszeiten ..................................................... 110

4.6 Pharmakodynamik von Detomidin............................................................. 113

4.6.1 Herzfrequenz..................................................................................... 113

4.6.2 Atemfrequenz.................................................................................... 115

4.6.3 Körperinnentemperatur ..................................................................... 116

4.6.4 Grad der Sedation ............................................................................. 117

4.6.4.1 Ptosis.......................................................................................... 118

4.6.4.2 Akustischer Reiz......................................................................... 120

4.6.4.3 Visueller Reiz ............................................................................. 121

4.6.4.4 Individueller Sedationsgrad der einzelnen Pferde ...................... 122

4.6.5 Grad der Reaktion auf einen definierten Stromreiz ........................... 123

4.6.6 Andere Beobachtungen..................................................................... 125

5 Diskussion ..................................................................................................... 126

5.1 Eignung der Aufarbeitungs- und HPLC/MS/MS-Methode für den Nachweis von Detomidin und seinen Metaboliten in Plasma und Urin...... 126

5.2 Pharmakokinetik von Detomidin im Plasma .............................................. 129

5.3 Pharmakokinetik von Detomidin im Urin.................................................... 131

5.4 Effektive und irrelevante Plasmakonzentration, irrelevante Urinkonzentration nach TOUTAIN und LASSOURD (2002), Ausscheidungszeit .................................................................................... 134

INHALTSVERZEICHNIS

5.5 Vergleich der pharmakodynamischen Daten mit den Ergebnissen der pharmakokinetischen Berechnungen ........................................................ 137

5.6 Bewertung der Ergebnisse ........................................................................ 142

6 Zusammenfassung........................................................................................ 144

7 Summary ........................................................................................................ 146

8 Literaturverzeichnis....................................................................................... 148

9 Anhang ........................................................................................................... 163

Danksagung .......................................................................................................... 173

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS


Abb. Abbildung APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation AUC Area under the curve b1 Geschwindigkeitskonstante der Elimination C Konzentration Cl Clearance Cmax(gem) maximale gemessene Plasmakonzentration CPlasmaØ durchschnittliche Plasmakonzentration CUrinØ durchschnittliche Urinkonzentration D Dosierung DIR Direktorium für Vollblutzucht und Rennen EHSLC European Horserace Scientific Liason Committee EPC effektive Plasmakonzentration FEI Fédération Équestre International FN Fédération National, Deutsche Reiterliche Vereinigung e.

V., Warendorf g Gramm GC Gaschromatographie h Stunde HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie HQC High Quality Control Standard HVT Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen e.V. HWZ Halbwertszeit i. m. intramuskulär IPC irrelevante Plasmakonzentration ISTD interner Standard IUC irrelevante Urinkonzentration i.v. intravenös kg Kilogramm KM Körpermasse l Liter ln natürlicher Logarithmus LOD Limit of detection LOQ Limit of quantification


LPO Leistungsprüfungsordnung der FN LQC Lower Quality Control Standard µg Mikrogramm µl Mikroliter m Meter max. maximal mg Milligramm min Minute ml Milliliter mm Millimeter mmol Millimol MM Molekülmasse MQC Midrange Quality Control Standard MRT Mean Residence Time, mittlere Verweildauer MS Massenspektrometrie m/z Quotient aus Masse und Ladung ng Nanogramm p. a. post applikationem PK/PD pharmakokinetisch/pharmakodynamisch QC Qualitätskontrolle R2 Regressionskoeffizient RE relativer Fehler, relative Abweichung RO Rennordnung des DIR Rss Urin/Plasmaverhältnis im steady state S Standardabweichung SIM single ion monitoring t Zeit t50(b1) Halbwertszeit für die Eliminationsphase tA(IPC) Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der IPC tA(LOD) Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der LOD tA(LOQ) Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der LOQ Tab. Tabelle tmax(gem) Zeitpunkt der max. gemessenen Plasmakonzentration Vc Verteilungsvolumen im zentralen Kompartiment Vss Verteilungsvolumen im steady state

EINLEITUNG 1

1 EINLEITUNG

Detomidin ist ein potenter α2-Agonist mit starken sedativen und analgetischen

Eigenschaften (JÖCHLE u. HAMM, 1986). Es hat weite klinische Anwendung in

Europa und den USA gefunden. Durch die komplikationslose therapeutische

Anwendbarkeit steht Detomidin im Verdacht, nicht nur nach tierärztlicher Indikation,

sondern auch illegal vor Wettkämpfen verabreicht zu werden. Dabei ist besonders an

nervöse und ängstliche Tiere sowie den Einsatz beim Doping auf Niederlage zu

denken (WOOD et al., 1989; SEYMOR et al., 1990B).

Der Einsatz von Detomidin unmittelbar vor einem Wettkampf ist durch die

Bestimmungen der großen deutschen Pferdesportverbände und des

Tierschutzgesetzes verboten. Die Deutsche Reiterliche Vereinigung, das Direktorium

für Vollblutzucht und der Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen verbieten

nahezu jede Anwendung pharmakologisch wirksamer Stoffe in einem Wettkampf,

auch wenn eine therapeutische Indikation besteht. Nur für einige wenige

Substanzen, für die Grenzwerte festgelegt wurden, gelten Ausnahmen. Die

Problematik besteht in der Unterscheidung zwischen der Verabreichung von

Arzneimitteln im Rahmen der tierärztlichen Therapie und einem vorsätzlichen Einsatz

dieser Substanzen im Sinne des Dopings. Auch wenn keine bewusste

Leistungsbeeinflussung vorliegt, ist der Nachweis eines verbotenen Stoffes

dopingrelevant. Aufgrund der fast unüberschaubaren Vielfalt des Arzneimittelmarktes

und wegen des häufig noch lückenhaften Wissens über Pharmakokinetik und

Pharmakodynamik ist es für Tierärzte, die Sportpferde behandeln, häufig schwierig,

alle möglichen Folgewirkungen einer Arzneimittelanwendung im Hinblick auf die

Dopingbestimmungen zu überblicken (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999).

Aufgrund dieser Problematik wurde im Rahmen dieser Arbeit das

Ausscheidungsverhalten der Wirkstoffes Detomidin bei der Spezies Pferd untersucht.

Die Studie ist Teil eines europaweiten Vorhabens, an dem insgesamt fünf Länder

(Irland, Frankreich, Italien, Großbritannien, Deutschland) teilnehmen. Neben der

Ermittlung der pharmakokinetischen Daten für Detomidin ist die internationale

2 EINLEITUNG

Harmonisierung der Analysemethoden ein zusätzlicher Kernpunkt des Projekts. Das

Ziel dieser Untersuchung war die Erarbeitung einer geeigneten Analysemethode und

die Gewinnung validen Datenmaterials zur Abschätzung der Ausscheidungszeit von

Muttersubstanz und Metaboliten. Grundlage für die Entwicklung der HPLC/MS/MS-

Analysemethode waren Routineverfahren im Institut für Biochemie der Deutschen

Sporthochschule Köln. Die pharmakokinetische Studie wurde begleitet von der

zeitabhängigen Erfassung der pharmakodynamischen Wirkung anhand geeigneter

Parameter (PK/PD-Modell). Diese Kombination ermöglichte einen direkten Vergleich

von Detomidinkonzentration in Plasma und Urin zur pharmakologischen Wirkung am

Pferd.

Einen theoretischen Ansatz zum Vergleich verfolgt das pharmako-

kinetische/pharmakodynamische Modell von TOUTAIN und LASSOURD (2002). Die

durch diese Arbeit ermittelten pharmakokinetischen Daten wurden verwendet, um

Plasma- und Urinkonzentrationen zu errechnen, bei denen keine relevante

pharmakologische Wirkung mehr zu erwarten ist.

LITERATURÜBERSICHT 3

2 LITERATURÜBERSICHT

2.1 Doping

2.1.1 Definition und Geschichtliches

UNGEMACH und NÜRNBERGER (1999) definierten den Begriff des Dopings als „die

Verabreichung von Substanzen an Mensch und Tier mit dem Ziel einer

Beeinflussung der natürlichen und aktuellen Leistungsfähigkeit bei sportlichen

Wettkämpfen“. Dopingfälle bei Tieren stellen vor allen Dingen ein Problem bei den

Tierarten Pferden, Hunden und Reisetauben dar.

Das Wort „Doping“ stammt aus dem Niederländischen, wo das Verb „doopen“

eintauchen beziehungsweise tauchen bedeutet (DEBACKERE, 1989). Von dort aus

gelangte der Begriff durch die Buren nach Südafrika und bezeichnete einen

hochprozentigen, dickflüssigen Likör (Dop), der von den Bantus in Südostafrika als

Stimulans bei religiösen Feierlichkeiten getrunken wurde (BERSCHNEIDER u.

RICHTER, 1980). Erst später wurde der Begriff auf andere stimulierende Getränke

ausgedehnt (PROKOP, 1965). In den amerikanischen Sprachgebrauch

übergegangen, beschrieb „to dope“ später das trickreiche Betäuben und

anschließende Ausrauben von Reisenden (BERSCHNEIDER u. RICHTER, 1980).

Durch den Bezug zum Rauschgift erschien der Begriff „Doping“ 1899 das erste Mal

in einem englischen Wörterbuch, wo es als ein Gemisch aus Opium und Narkotika

zur Verabreichung an Pferde bezeichnet wurde (HERMLE, 1996). Damit hatte sich

das Wort Doping im internationalen Sprachgebrauch als Begriff für die

missbräuchliche Einnahme von Mitteln zur Leistungssteigerung und damit

Wettbewerbsbeinflussung durchgesetzt.

Die ersten Hinweise auf den Gebrauch solcher Mittel gehen bis in das Altertum

zurück. Damals versuchten Krieger durch Drogen und zusätzliche Nährstoffe ihren

Gegnern überlegen zu sein (CROISIER, 1948), und auch Pferde wurden dem

Einfluss leistungssteigernder Mittel ausgesetzt. Aus dem alten Rom ist bekannt, dass

eine als „Hydromel“ bezeichnete wässrige Honiglösung zur Verbesserung der


Geschwindigkeit und Ausdauer bei Rennpferden verabreicht wurde (MORGAN,

1957; PICK, 1993). Um vermeintliche Konkurrenten aus dem Weg zu schaffen,

wurden Wagenrennpferde vergiftet (BERSCHNEIDER u. RICHTER, 1980), was im

kaiserlichen Rom mit der Strafe der Kreuzigung belegt wurde. UNGEMACH (1985)

beschreibt, dass 1881 in Preußen alkoholische Lösungen an „feige“ Pferde

verabreicht wurden.

Die ersten Dopingreglementierungen wurden am 14. Juni 1666 in England

verabschiedet. In dieser ersten „Anti-Doping-Bestimmung“ wurde die Anwendung

anregender Stoffe bei Pferden verboten, wobei diese aber nicht näher definiert

wurden (CROISIER, 1948). Eine zielgerichtete Bekämpfung des Dopings setzte erst

im 20. Jahrhundert ein, da es einerseits durch die Entwicklungen im

Arzneimittelbereich möglich war, immer gezielter zu manipulieren und andererseits

die Analytikmethoden für den Nachweis unerlaubter Substanzen stetig verbessert

wurden (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999).

2.1.2 Notwendigkeit der Dopingbestimmungen

Es ist unumgänglich, Tiere, die in der Obhut des Menschen leben und in allen

Hinsichten von ihm abhängig sind, vor Schmerzen, Leiden und Schäden zu

bewahren. Die gesetzliche Grundlage hierfür bilden das Grundgesetz und das

Tierschutzgesetz in seiner Fassung von Juni 2001.

Artikel 20a des Grundgesetzes wurde am 17.Mai 2002 nach langen Diskussionen

erweitert und lautet nun: „Der Staat schützt auch in Verantwortung für die künftigen

Generationen die natürlichen Lebensgrundlagen und die Tiere im Rahmen der

verfassungsmäßigen Ordnung durch die Gesetzgebung und nach Maßgabe von

Gesetz und Recht durch die vollziehende Kraft und Gewalt und die Rechtsprechung.“

Dadurch garantiert das Grundgesetz nun nicht mehr nur die Rechte der Menschen,

sondern auch den Schutz der Tiere und steht damit im Synergismus zum

Tierschutzgesetz.


Dort ist es nach § 3, Absatz 1 „verboten, einem Tier außer in Notfällen Leistungen

abzuverlangen, denen es wegen seines Zustandes offensichtlich nicht gewachsen ist

oder die offensichtlich seine Kräfte übersteigen“. Absatz 1a verbietet es, einem Tier

Leistungen abzuverlangen, wenn an ihm Eingriffe oder Behandlungen vorgenommen

worden sind, die einen leistungsmindernden körperlichen Zustand verdecken.

Absatz 1b untersagt klar, „an einem Tier bei sportlichen Wettkämpfen [...]

Dopingmittel anzuwenden“. Absatz 11 nimmt Bezug auf das physikalische Doping

und verbietet sogar „ein Gerät anzuwenden, das durch elektrische Reize das

artgerechte Verhalten des Pferdes beeinflusst und insbesondere [...]

außergewöhnliche Bewegungen erzwingt, die dem Tier Schmerzen, Leiden oder

Schäden zufügen können“. Nach § 17 Tierschutzgesetz kann die Anwendung von

Dopingmitteln als Straftat gewertet werden, wenn einem Wirbeltier länger anhaltende

und sich wiederholende Schmerzen zugefügt werden. Dem Berufsstand der Tierärzte

kommt hierbei eine besondere Bedeutung zu, da sie schon laut ihrer Berufsordnung

die „berufenen Schützer der Tiere“ sind. Somit stellen sie ein Bindeglied zwischen

Sport und Tierschutz dar.

Neben dem Aspekt des Tierschutzes ist es Sinn und Zweck der Anti-Doping–

Bestimmungen zu gewährleisten, dass der sportliche Vergleich unter gleichen

Bedingungen für alle Teilnehmer abläuft und somit der ethische Sportgedanke

erhalten bleibt (PICK, 1993). Weitere Gesichtspunkte sind der Schutz vor einer

Gefährdung anderer Teilnehmer oder Pferde durch gedopte Tiere (UNGEMACH,

1985), der Schutz der Interessen des wettenden Publikums (KLAUS u. HAPKE,

1994), die Vermeidung einer falschen Zuchtauslese (PICK, 1993) und der Schutz

des Ansehens der Sportart (PICK 1993).

2.1.3 Doping im Pferdesport

Doping im Pferdesport ist ein internationales Problem. Bereits 1977 definierte die

internationale Konferenz der westlichen Pferdesportverbände in Rom, dass alle

Substanzen äußeren Ursprunges, auch wenn sie im Pferd natürlicherweise


vorkommen können, verboten sind, wenn sie zu den in einer Dopingliste

veröffentlichten unerlaubten Mitteln zu rechnen sind (UNGEMACH, 1985).

Auf einem Kongress in Kentucky 1994 wurden spezifische Fragestellungen zur

Analytik von Dopingproben im Bereich des Pferdesports diskutiert und speziell die

Zusammenarbeit aller Pferdesportverbände gefordert. Die Internationale Reiterliche

Vereinigung (FEI) stellt dabei einen internationalen Pferdesportverband dar, dem mit

Deutschland 111 Nationen angeschlossen sind (DÜE, 1998). So wird ausgeführt,

dass es „der Sinn aller FEI-Wettkämpfe ist, die Talente von Pferden und Reitern im

Vergleich unter gleichen Bedingungen und auf der Grundlage ihrer Fähigkeiten

durchzuführen. Der Gebrauch von verbotenen Substanzen kann die Leistung

beeinflussen oder ein vorliegendes Gesundheitsproblem überdecken und zusätzlich

das Ergebnis eines Wettkampfes verfälschen. Daher ist die Liste der verbotenen

Substanzen so zusammengesetzt worden, dass sie alle Kategorien

pharmakologischer Wirksamkeit umfasst“. Als verbotene Substanzen gelten die

Substanz selbst, ihre Metaboliten, ihre Isomere oder die Isomere der Metaboliten,

unabhängig davon, ob die Substanz auch endogen im Pferd vorkommt. Damit ist

praktisch jede Anwendung von Arzneimitteln im Zusammenhang mit der Teilnahme

am Wettkampf nicht statthaft, unabhängig davon, ob dadurch eine

Leistungsbeeinflussung möglich ist oder nicht (KLAUS u. HAPKE, 1994).

In Deutschland wird die Verabreichung von Substanzen über die

Leistungsprüfungsordnungen der drei großen deutschen Pferdesportverbände

(Deutsche Reiterliche Vereinigung e. V. [FN], Direktorium für Vollblutzucht und

Rennen e. V. [DVR] und Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen e. V. [HVT])

geregelt. Besonders seitens der FN wird eine möglichst große Übereinstimmung mit

den Bestimmungen der FEI angestrebt, aber auch DVR und HVT stimmen

hinsichtlich des generellen Verbots jeglicher körperfremder Substanzen mit der FN

überein.

Nachfolgend werden Ausschnitte aus den Dopingbestimmungen der einzelnen

deutschen Pferdesportverbände dargestellt.


2.1.3.1 Bestimmungen der Pferdesportverbände

2.1.3.2 Leistungsprüfungsordnung (LPO) der Deutschen Reiterlichen

Vereinigung e. V. (Stand 2004)

Die entsprechenden Bestimmungen finden sich im Abschnitt A VIII, §§ 66 – 67a.

§ 66 verbietet die Teilnahme von Pferden und Ponys nach zum Beispiel

Neurektomie, lokaler Schmerzausschaltung, implantiertem Tracheotubus oder

sonstigen Eingriffen beziehungsweise Manipulationen, die zur Beeinflussung der

Leistung, Leistungsfähigkeit oder Leistungsbereitschaft geeignet sind.

In § 67 werden Medikationskontrollen, Verfassungsprüfungen und Pferdekontrollen in

Prüfungen geregelt, wobei sich detaillierte Anweisungen zu deren Ablauf in den

angehängten Durchführungsbestimmungen finden. Ebenfalls in den

Durchführungsbestimmungen geregelt ist die Ahndung bei Nachweis einer gemäß §

67a LPO verbotenen Substanz. Platzierte, positiv getestete Teilnehmer werden

disqualifiziert, der Verstoß nach den Bestimmungen der Rechtsordnung der LPO

geahndet und es besteht die Möglichkeit, die Tat als Verstoß gegen das

Tierschutzgesetz der zuständigen Behörde zu melden.

§ 67a enthält die Liste der kontrollierten Substanzen. Dabei wird zwischen „Punkt 1

Dopingsubstanzen“ und „Punkt 2 Verbotene Arzneimittel“ unterschieden, sowie unter

Punkt 3 die Ausnahmen hiervon geregelt.

Hierbei werden Dopingsubstanzen als Substanzen bezeichnet, die geeignet sind, die

Leistung eines Pferdes/Ponys im Wettkampf zu beeinflussen. Dabei werden nicht

einzelne Arzneimittel, sondern Stoffgruppen wie zum Beispiel Sedativa und

Narkotika, Stimulantien, Diuretika oder Anabolika aufgeführt. Lediglich für einzelne

Substanzen (Testosteron, Nandrolon, Theobromin und Cortisol) gelten Grenzwerte

(Grenzwerte siehe Punkt 2.1.7.1) .


Auch die verbotenen Arzneimittel sind nicht einzeln, sondern als ganze Stoffgruppen

reglementiert. Hierbei handelt es sich um Substanzen, die zwar als Arzneimittel

eingesetzt werden, jedoch im Wettkampf verboten sind (zum Beispiel solche mit

Wirkung auf das Herz-Kreislauf-System, auf das Atmungssystem, auf die Haut,

gegen Infektionserreger). Auch hier gibt es nur für wenige Mittel (Salizylsäure, Arsen,

Dimethylsulfoxyd und verfügbares CO2) Grenzwerte (Grenzwerte siehe Punkt

2.1.7.1).

Ausnahmen von oben genannten Bestimmungen bilden Substanzen zur Pflege und

Vorbeugung wie zum Beispiel Impfstoffe, die bis spätestens 14 Tage vor der Prüfung

appliziert werden oder Insektenschutzmittel.

2.1.3.3 Rennordnung (RO) des Direktoriums für Vollblutzucht und Rennen

(Stand Januar 2002)

Die entsprechenden Bestimmungen finden sich im Abschnitt XIV der Rennordnung

unter Unerlaubte Mittel - Doping. Die Punkte 529 bis 561 regeln das allgemeine

Verbot der Anwendung unerlaubter Mittel, definieren Gruppen erlaubter und

unerlaubter Mittel, Substanzen mit Grenzwerten, sowie die Entnahme, Vorbereitung

und Auswertung von Dopingproben. Im Unterschied zur LPO behält sich das

Direktorium vor, Kontrollen nicht nur während Prüfungen durchzuführen, sondern

auch Trainingsproben entnehmen zu lassen.

2.1.3.4 Satzung und Ordnungen des Hauptverbandes für Traber-Zucht

und –Rennen e. V. (HVT) vom 01. Februar 2003

Die Dopingbestimmungen dieses Pferdesportverbandes werden im Teil B II § 93 und

den Durchführungsbestimmungen zur Feststellung und Verhinderung von Doping

geregelt. Entsprechend der oben genannten Rennordnung darf ein Pferd von Beginn


bis zum Ende des Rennens keine gemäß der Dopingliste verbotenen Substanzen in

seinen Geweben, Körperflüssigkeiten oder Ausscheidungen aufweisen.

Entgegen der LPO oder RO werden keine Grenzwerte (Grenzwerte siehe Punkt

2.1.7.1) für einzelne Mittel angegeben, so dass jeglicher Nachweis verbotener Stoffe

positiv berichtet wird. In den Durchführungsbestimmungen finden sich die Dopingliste

mit Verboten von Substanzen beziehungsweise Stoffgruppen (Diuretika, Herz-

Kreislaufwirksame Mittel, Substanzen, die auf das zentrale oder periphere

Nervensystem wirken usw.) und detaillierten Bestimmungen zur Entnahme, dem

Versand und Auswertung von Proben.

Allen drei Pferdesportverbänden ist in der Reglementierung des Dopings gemein,

dass hauptsächlich Stoffgruppen auf den Verbotslisten aufgeführt werden. Eine

Auflistung einzelner Stoffe oder sogar Warennamen wäre bei der Vielfalt der zur

Verfügung stehenden Medikamente nicht möglich und könnte niemals vollständig

sein.

2.1.4 Dopingformen

UNGEMACH und NÜRNBERGER (1999) unterscheiden verschiedene Formen der

unerlaubten Beeinflussung der natürlichen und aktuellen Leistungsfähigkeit für den

Pferdesport. Die Manipulationen teilen sich in positives, negatives und

unabsichtliches Doping, sowie in Maßnahmen zur Erschwerung des

Dopingnachweises.

2.1.4.1 Positives Doping

Doping auf Sieg

Es werden verbotene Substanzen zum Zwecke der Leistungssteigerung und

Überwindung der natürlichen und autonom geschützten Leistungsbarrieren,


entweder über Tage und Wochen (chronisches Doping) oder kurz vor dem

Rennen/der Prüfung (akutes Doping), verabreicht. Eine paradoxe Form des Doping

stellt die Verabreichung geringer Mengen Sedativa dar, um übererregte Pferde

startfähig zu machen (UNGEMACH, 1985). Mit den modernen Psychopharmaka ist

es möglich, Angst und Erregungszustände zu lindern, ohne eine wesentliche

Änderung des Wachzustandes oder der Leistungsfähigkeit zu provozieren.

Doping zur Wiederherstellung der normalen Leistungsfähigkeit

Diese Form des Dopings zielt darauf ab, die genetisch determinierte

Leistungsfähigkeit des Tieres, die durch den aktuellen Gesundheitszustand

eingeschränkt wird, durch medikamentelle, therapeutische Maßnahmen

wiederherzustellen (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999). Das hat zur Folge, dass

kranke oder nicht voll belastungsfähige Pferde den extremen physischen

Belastungen einer Prüfung ausgesetzt werden. Dabei ist in erster Linie an den

Einsatz von Schmerzmitteln oder antibakteriell wirksamen Substanzen zu denken.

Doping mit körpereigenen Substanzen

Unter diese Form des Dopings fällt unter anderem die Verabreichung von Eigenblut

beziehungsweise dessen Bestandteilen, wie zum Beispiel Erythrozyten oder

Erythropoetin. Dieses in der Niere gebildete Hormon reguliert die Erythropoese

(BERGLUND et al. 1988; Müller, 1999), was genau wie die Verabreichung von

Erythrozytenkonzentrat eine Erhöhung des Anteils der roten Blutkörperchen im

Körper und damit verbesserte Sauerstofftransportkapazität des Blutes zur Folge hat.


Physikalisch-technisches Doping

Darunter versteht man alle Maßnahmen zur Manipulation der Leistungsfähigkeit, die

nicht durch die Applikation chemischer Substanzen, sondern in Form von zum

Beispiel elektrischen Reizen, Akupunktur, Ultraschall oder UV-Strahlen

vorgenommen werden (LOEFFLER, 2000). Die invasivste Form des Dopings sind

Eingriffe, wie der Einsatz eines ständigen Tracheotubus zur Überwindung von

Atemwegsobstruktionen oder Neurektomien im Bereich der distalen Gliedmaßen zur

Desensibilisierung insbesondere des Hufs (SCHOENE, 1996).

2.1.4.2 Negatives Doping oder Doping auf Niederlage

Bei negativem Doping handelt es sich um eine Form der Leistungsminderung, bei

der davon auszugehen ist, dass sie meistens von Außenstehenden,

beziehungsweise Konkurrenten, durchgeführt wird. Sie wird deshalb auch als

„outside job“ bezeichnet (BERSCHNEIDER u. RICHTER, 1980). Häufig wird dabei

auf die Wirkung von Sedativa oder Tranquilizern zurückgegriffen, die nur in niedriger

Dosierung und bei nervösen Pferden einen positiven Effekt hervorrufen. Eine

normale therapeutische Dosierung führt zu lokomotorischen Hemmungen sowie dem

Ausfall bedingter Reflexe, wie dem Fluchtreflex bei Rennpferden, und damit zur

Leistungsminderung (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999).

2.1.4.3 Unabsichtliches Doping

Durch unzureichende Kenntnis der Pharmakokinetik und -dynamik in der Masse der

Arzneimittel, die bei der Therapie erkrankter Pferde zum Einsatz kommen, kann es

zu positiven Dopingbefunden ohne konkreten Vorsatz kommen. Dabei stehen die

behandelnden Tierärzte häufig vor dem Problem, therapeutisch notwendige

Arzneimittelgaben mit der Forderung „kein Nachweis von therapeutisch

wirksamen/leistungsbeeinflussenden Substanzen zum Rennzeitpunkt in Blut


oder/und Urin“ vereinbaren zu müssen (KLAUS u. HAPKE, 1994). Dabei können und

dürfen sie sich nicht an den Wartezeiten für Medikamente für lebensmittelliefernde

Tiere orientieren, da nach Ablauf dieser keine Rückstandsfreiheit gewährleistet wird

(LOEFFLER, 2000). Zusätzlich hängt die Dauer der Nachweisbarkeit von

Medikamenten im Körper des Pferdes neben der Dosis und dem

pharmakokinetischen Verhalten des Arzneimittels von der Sensitivität des

Nachweisverfahrens und von der biologischen Variabilität der Eliminations-

geschwindigkeit des Individuums ab (TOBIN et al., 1989). Ein weiteres Problem

können Wirkstoffkombinationen beziehungsweise -verbindungen wie zum Beispiel

Procain-Penicillin darstellen, da das Lokalanästhetikum in dieser Formulierung über

einen viel längeren Zeitraum verfügbar bleibt als als Monopräparat (UNGEMACH,

1988). Auch bei Einreibungen zum Beispiel mit Kampfer kann es über perkutane

Resorption (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999) zu positiven Blutspiegeln

kommen. Weiterhin tragen pharmazeutische Hilfsstoffe, wie zum Beispiel

Kakaopulver als Trägerstoff eines oral zu verabreichenden Aufbaumittels zu dieser

Problematik bei. Kakao als Bestandteil von Industriefutter enthält Theobromin und in

geringer Menge auch Coffein, was in England bei Kontrollen mehrfach zu positiven

Dopingbefunden führte (TOBIN, 1981).

2.1.4.4 Maßnahmen zur Erschwerung des Dopingnachweises

Hierbei wird versucht, den analytischen Nachweis der verabreichten Substanz durch

sogenannte Maskierungsmittel zu erschweren. Die verwendeten Stoffe führen nicht

zu einer Leistungssteigerung, besitzen aber die Fähigkeit, die verbotene Substanz in

der Analyse zu überlagern. So wird durch den Einsatz von Diuretika versucht, die

Konzentration eines verbotenerweise applizierten Arzneimittels oder Stoffes durch

Verdünnung des Urins zu senken (TOBIN u. WOOD, 1989). Urikostatika (zum

Beispiel Probenicid) auf der anderen Seite hemmen den Sekretionsprozess zum

Beispiel von Benzylpenicillin in den Nierentubuli, da sie eine Affinität zum selben

Carriersystem besitzen (FREY, 1996). Dadurch kann eine Urinprobe trotz

Verabreichung von Benzylpenicillin ein negatives Analyseergebnis bringen.


2.1.5 Statistische Daten zu Dopingkontrollen in Deutschland

Systematische Dopingkontrollen der großen deutschen Pferdesportverbände werden

etwa seit Anfang der 1970er Jahre durchgeführt. Die Auswahl der Pferde, von denen

Urin oder Blut auf das Vorhandensein verbotener Substanzen untersucht wird, erfolgt

nach dem Zufallsprinzip und aufgrund von Verdachtsfällen. Laut DÜE (1998) werden

jährlich etwa 380 000 Analysen von Medikationskontrollen weltweit unter dem Dach

der Association of Official Racing Chemists durchgeführt. Davon entfallen ungefähr

3300 Medikationskontrollen auf den Galopp-, Trab-, Reit- und Fahrsport in

Deutschland, wobei die FN etwa 1000 Proben zur Untersuchung an Laboratorien

sendete. Der Hauptanteil der Proben wird im Institut für Biochemie der deutschen

Sporthochschule Köln analysiert. Eine Übersicht über die Jahre 2000 bis 2003 gibt

Tabelle 1:

Jahr Verband Gesamtzahl der Proben positiv getestete Proben [absolut]

positiv gestestete Proben [%]

FN 707 16 2,26

DIR 1011 20 1,98

FN 469 8 1,70

DIR 1166 8 0,69

FN 456 7 1,54

DIR 1070 15 1,40

FN 358 3 0,83

DIR 883 8 0,91

2000

2001

2002

2003

Tabelle 1: Übersicht der im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln in den Jahren

2000 bis 2003 zur Untersuchung gelangten Pferdeproben

2.1.6 Beurteilung von Analyseergebnissen

2.1.6.1 Null-Lösung und Grenzwerte

Für praktizierende Tierärzte ist die Maxime, Doping im Pferdesport nicht zu dulden,

in einigen Fällen therapeutisch unbefriedigend (KLAUS u. HAPKE, 1994), da bei

Sportpferden von einer hohen Behandlungshäufigkeit auszugehen ist. Dieses


untersuchten ROBINSON und GORDON (1988) in der Rennsaison 1987 an 100

Pferden, die mindestens einmal in Rennen starteten. Von diesen Tieren fielen 47

wegen muskuloskeletaler Verletzungen im Training oder Rennen aus und mussten

sogar teilweise aufgrund der Schwere der Verletzung euthanasiert werden. Der

Therapiebedarf bei Sportpferden ist also offensichtlich. Für die meisten Wirkstoffe gilt

derzeit, dass ihr Nachweis unabhängig von der gefundenen Konzentration als

Doping gewertet wird (vergleiche Punkt 2.1.4). Dies wird auch als sogenannte Null-

Lösung bezeichnet (UNGEMACH, 1988).

Lediglich für einige endogene oder im Futter vorkommende Substanzen sind

Grenzwerte in den Listen der Pferdesportverbände aufgeführt (siehe Tabelle 2).

Verband Grenzwert fürTestosteron

Nandrolon

Theobromin

Cortisol

Salizylsäure

Arsen

Dimethylsulfoxyd

verfügbares CO2

Arsen

Salicylsäure

Nandrolon

Theobromin

Dimethylsulfoxyd

Cortisol

Peptidhormone u. Analoga

Hordenin

Testosteron

verfügbares CO2

Methoxytyramin

Deutsche Reiterliche Vereinigung e. V.

Direktorium für Vollblutzucht und Rennen e. V.

Tabelle 2: Auflistung von Stoffen, für die in den Bestimmungen der Pferdesportverbände Grenzwerte

gelten (Stand Juni 2004)


Sowohl die Null- als auch die Grenzwert-Lösung stellen behandelnde Tierärzte vor

die Frage, ab welchem Zeitpunkt vor einer Prüfung ein Medikament nicht mehr

eingesetzt werden darf, um nicht einen Dopingfall (unabsichtliches Doping) im Sinne

der Bestimmungen zu provozieren. Bis heute liegen diesbezüglich über

Ausscheidungszeiten von Substanzen nur unzureichende Daten vor. Zur Sicherung

der notwendigen medikamentellen Behandlung von Sportpferden halten es KLAUS

und HAPKE (1994) für sinnvoll, für jedes anzuwendende Arzneimittel Karenzzeiten

festzulegen. Dabei ist die Karenzzeit definiert als Zeitraum zwischen dem letzten Tag

der Arzneimittelgabe und dem Tag der Prüfung, nach dessen Ablauf nicht mehr mit

einem positiven Ergebnis einer Dopinganalyse zu rechnen ist. Problematisch ist die

Abhängigkeit der Anwesenheit von Medikamenten von der verabreichten Dosis, der

Pharmakokinetik der Substanz, der Sensitivität der Nachweismethode und der

biologischen Variabilität der Individuen (TOBIN u. WOODS, 1989). Zusätzlich sind

individuelle Eliminationszeiten abhängig vom ausgeschiedenen Urinvolumen, dem

pH-Wert des Urins, der Stoffwechselkapazität der Leber, dem Gesundheitszustand

der Pferde und der Form der Anwendung (zum Beispiel peroral, parenteral,

äußerlich) (PICK, 1993; DYKE u. SAMS, 1994B).

Nach UNGEMACH (1985) erscheint es sinnvoll, für Arzneimittel maximal zulässige

Blutspiegel (Grenzwerte) festzulegen, um zu verhindern, dass der Nachweis

minimaler, mit Sicherheit unwirksamer Mengen als dopingrelevant bezeichnet

werden muss und notwendige Therapien verhindert werden. Allerdings liegen über

den Zusammenhang von Nachweis und Wirkkonzentration bis heute ebenfalls nur

sehr wenige oder unterschiedliche Daten vor (DÜE, 1998; SAMS, 1996).

Blutspiegelverlaufskurven für Dopingmittel gelten nur unter den bei den Messungen

vorherrschenden Bedingungen (UNGEMACH, 1985), was für die quantitative

Analyse eine gleiche Behandlung aller Proben bei ihrer Entnahme, ihrem Transport,

ihrer Aufbewahrung, Aufarbeitung und Messmethode voraussetzt (BEYER, 1998).

TOBIN und WOOD (1989) sowie SAMS (1996) sind der Meinung, dass die

quantitative Analyse im Zuge der Grenzwert-Lösung keinen Vorteil bietet, weil der

individuellen und intraindividuellen Variabilität in Bezug auf Wirkung und


Verstoffwechselung, die beim Pferd sehr groß ist, keine Rechnung getragen wird.

Nach DYKE und SAMS (1994A) steht auch die Harnkonzentration (durch zum

Beispiel starke Belastung in einem Wettkampf) in keinem konstanten Verhältnis zur

Blutkonzentration, so dass Urin schlecht für quantitative Analysen geeignet ist.

Diese Problematik und der Umstand, dass immer sensiblere Analysemethoden

entwickelt werden, veranlasste TOUTAIN und LASSOURD (2002) dazu, ein neues

Modell zu entwickeln. Durch ein Pharmakokinetik-Pharmakodynamik-Modell (PK/PD-

Modell) setzen sie die Konzentration einer Substanz und ihre Wirkung mathematisch

miteinander in Beziehung und ermitteln so effektive und irrelevante Plasma- (IPC)

und Urinkonzentrationen (IUC). Hierbei soll bestimmt werden, ab welcher

Konzentration einer Substanz in Blut und Urin keine pharmakodynamischen

Wirkungen mehr im Tier vorliegen, obwohl eventuell ein analytischer Nachweis

möglich ist. Um diese Berechnungen durchzuführen, müssen von der jeweiligen

Substanz genügend pharmakologische und pharmakokinetische Daten vorliegen

(siehe auch Punkt 4.4).

2.2 Physiologie und Pharmakologie von α2-Rezeptoren

Das autonome Nervensystem besteht funktionell aus sympathischen und

parasympathischen Fasern. Das sympatho-adrenale System ermöglicht dem

Organismus eine graduelle Anpassung an wechselnde äußere oder innere

Erfordernisse. Hierbei vermitteln die körpereigenen Transmitter Noradenalin und

Adrenalin die physiologischen Wirkungen an den Adrenorezeptoren und wirken als

direkte Sympathomimetika (STARKE, 1981). α2-Rezeptoren findet man im

Organismus sowohl zentral als auch peripher; dabei sind sie sowohl prä- als auch

postsynaptisch lokalisiert (CLARKE u. TAYLOR, 1986).


2.2.1 Rezeptorklassifizierung

Im Jahre 1948 klassifizierte AHLQUIST Adrenorezeptoren anhand hämodynamischer

Effekte verschiedener Katecholamine in α und ß-Typen. Die ß-Adrenorezeptoren

wurden mit Hilfe selektiver Agonisten und Antagonisten in ß1- und ß2-Rezeptoren

unterteilt (LANDS et al., 1967). Auch die α-Adrenozeptoren lassen sich weiter

unterteilen. Nach anatomischen Gesichtspunkten gliedern sie sich in postsynaptische

α1- und präsynaptische α2-Rezeptoren (LANGER, 1974). Die pharmakologische

Unterteilung wurde notwendig, als BERTHELSEN und PETTINGER (1977) auch

postsynaptisch lokalisierte α2-Rezeptoren fanden. Daraufhin wurde die Bezeichnung

α1 oder α2-Adrenozeptor auf die Präferenz von Agonist oder Antagonist für den

Rezeptor bezogen und nicht mehr auf die Lokalisation (MACDONALD u. VIRTANEN,

1992). Für α2-Rezeptoren werden zusätzlich vier Subtypen unterschieden: α2a, α2b,

α2c und α2d (RUFFOLO et al., 1994; VAINIO, 1997).

2.2.2 α2-Agonisten und Antagonisten beim Pferd

α2-Agonisten werden seit vielen Jahren aufgrund ihrer sedativen und analgetischen

Eigenschaften beim Pferd eingesetzt (VIRTANEN, 1986). Durch die

pharmakologische Einteilung der α-Rezeptoren wurden die Entwicklung spezifischer

Pharmaka und der gezielte Einsatz der bisher verfügbaren α-Adrenozeptoragonisten

möglich (SCHEININ u. MACDONALD, 1989). Im Gegensatz zu einigen anderen

Sympathomimetika besitzen die im Folgenden aufgeführten Substanzen die

Fähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke zu passieren (LÖSCHER, 2002), was zu

vielfältigen und komplexen Reaktionen im Bereich des zentralen Nervensystems

führt.

Clonidin war 1977 der erste Vertreter dieser Gruppe. Es wird als Prototyp der α2-

Agonisten mit Wirkung auf das zentrale Nervensystem angesehen (BISCHOFF u.

KOCHS, 1993). Seine Selektivität gegenüber den α2-Rezeptoren war allerdings nicht

so ausgeprägt wie die moderner Pharmaka (SHORT, 1992). Im Laufe der Zeit


wurden Substanzen wie Romifidin oder Detomidin mit einer höheren Selektivität

entwickelt.

1962 wurde Xylazin als Antihypertensivum entwickelt. Da man während der

klinischen Studien jedoch eine stark depressive Wirkung auf das zentrale

Nervensystem feststellte, wurde es 1968 als Sedativum, Analgetikum und

Muskelrelaxans in die Veterinärmedizin eingeführt (GREENE u. THURMON, 1988).

Bei Romifidin handelt es sich um einen neueren Vertreter der Gruppe der α2-

Agonisten. Dabei ist es in den sedativen Wirkungen vergleichbar mit Xylazin

(BROWNING u. COLLINS, 1994); über seine analgetischen Eigenschaften wird

kontrovers diskutiert (HAMM et al., 1995; MOENS et al., 2003).

Medetomidin ist als Sedativum für Hunde und Katzen zugelassen. Durch seine

lipophilen Eigenschaften diffundiert es schneller ins Gehirn als Xylazin und führt zu

einer ausgeprägteren zentralen Wirkung (VIRTANEN, 1986). Es besitzt ähnliche

analgetische Potenz wie Xylazin und Detomidin, jedoch können mit Medetomidin

vergleichbare Wirkungen schon in geringeren Dosen erzielt werden.

Detomidin ist ein potenter und selektiver α2-Agonist mit geringer Wirkung auf α1-

Rezeptoren (VAINIO, 1985; VIRTANEN et al., 1985). Es ist als Sedativum und

Analgetikum für Pferde und Rinder zugelassen. Es wird als Testsubstanz der in

dieser Arbeit beschriebenen Studie unter Punkt 2.3 eingehender besprochen.

2.2.3 Wirkungsmechanismus

α2-Sympathomimetika wie Clonidin, Xylazin, Romifidin und Detomidin entfalten ihre

Wirkung vornehmlich im zentralen Nervensystem. Die α2-Rezeptoren im Gehirn

befinden sich hauptsächlich im Gebiet des Locus coerulus (Hirnstammkern) und des

Nucleus tractus solitarius. Sie kontrollieren dort den Noradrenalinhaushalt. Als

Ursprung aufsteigender und absteigender noradrenerger Bahnen nimmt der Locus

coerulus in der Regulation der Vigilanz eine zentrale Stellung ein (STENBERG,


1986), während der Nucleus tractus solitarius an der Kontrolle des Blutdrucks

beteiligt ist (STARKE u. PALM, 1996). α2-Agonisten greifen an peripheren und

zentralen α2-Rezeptoren an und hemmen dort die noradrenalingesteuerte

Übertragung von Nervenimpulsen.

Auf molekularbiologischer Ebene handelt es sich bei α2-Adrenozeptoren um G-

Protein-gekoppelte Rezeptoren in der zytoplasmatischen Membran (MAZE u.

TRANQUILLI, 1991; AANTAA u. SCHEININ, 1993). Durch ein die Synapse

erreichendes Aktionspotential kommt es über einen Ca2+-Einstrom zur Freisetzung

von Noradrenalin in den synaptischen Spalt. Die Aktivierung der Rezeptoren durch

endogene Transmitter oder die oben genannten Substanzen führt zu einer G-Protein

vermittelten Hemmung der Ca2+-Kanäle (LAMMINTAUSTA, 1986; DAUNT u. MAZE,

1992). Einerseits wird dadurch die weitere Freisetzung von Noradrenalin im Sinne

eines negativen Feed-Back-Mechanismus gehemmt (LANGER et al., 1977; Starke,

1977). Andererseits wird durch die Hyperpolarisation der Membran eine

Desensibilisierung erreicht (MAZE u. TRANQUILLI, 1991). Zentral führt die

Aktivitätsabnahme dieser Neurone zur Sedation der Tiere (STENBERG, 1986),

Bradykardie und Hypotension (SHORT et al., 1986). Peripher bedingt die

postsynaptische Stimulation eine initiale Vasokonstriktion mit daraus resultierendem

transientem peripheren Bluthochdruck (CLARKE u. TAYLOR, 1986). Die

analgetischen Effekte von α2-Agonisten nehmen ihren Ursprung sowohl im

Hirnstamm als auch im Rückenmark (STENBERG, 1986; ALITALO u. VAINIO, 1982).

Es wird eine synergistische Wirkung von α2-adrenergen und opioidergen

Rezeptormechanismen angenommen (AANTAA u. SCHEININ, 1993).

2.2.4 α2-Antagonisten

Die Wirkung der α2-Sympathomimetika kann durch α2-Rezeptorblocker wie Idazoxan,

Tolazolin, Yohimbin und Atipamezol aufgehoben werden (VIRTANEN, 1986;

VIRTANEN et al., 1985). Dabei verdrängen diese endogene (Adrenalin,

Noradrenalin) oder exogene (Xylazin, Romifidin, Detomidin) Agonisten vom Rezeptor


(STARKE u. PALM, 1996). Die Wirkung von Detomidin lässt sich beim Pferd durch

den spezifischen α2-Antagonisten Atipamezol aufheben (RAMSEYER et al., 1998;

RAEKALLIO et al., 1990). Atipamezol hat eine Bindungsaffinität α2/α1-Rezeptoren

von 8526:1 (ZIEGLER, 2003). Allerdings ist eine Antagonisierung beim Pferd kaum

notwendig, da die Wirkungsdauer der α2-Agonisten nur kurz ist und beim Pferd in der

Regel nicht zum Niedergehen führt. Auch beim Kleintier wird Atipamezol als

Antagonist eingesetzt (SCHATZMANN, 1995).

2.3 Detomidin

2.3.1 Chemie

Bei Detomidin handelt es sich chemisch um das schwach basische, lipophile 4-[(2,3-

Dimethylphenyl)-methyl]-Imidazol (SALONEN, 1986). Es gehört zur Gruppe der 4

(5)-substituierten Arylalkylimidazole (RUSKOAHO, 1986). Detomidin ist ein weißes,

kristallines und geruchloses Pulver, mit einem Molekulargewicht von 186,25. Es ist

gut wasserlöslich, frei von Isomeren und weitgehend stabil (SALONEN, 1986). Sein

Schmelzpunkt liegt bei 156 – 161°C. Es ist seit 1983 als wässrige Detomidin-

Hydrochlorid-Lösung (Domosedan®, Orion Pharma, Espoo, Finnland, vertrieben

durch Pfizer, Karlsruhe) in Deutschland beim Pferd und Rind zur intravenösen,

intramuskulären und epiduralen Injektion zugelassen. 1 ml Domosedan®

Injektionslösung enthält 10 mg Detomidin-Hydrochlorid. Abbildung 1 zeigt die

Strukturformel, die Summenformel und die Molekülmasse von Detomidin.


CH3

CH3

HNN

DetomidinC12H14N2

186.25

Abbildung 1: Strukturformel, Summenformel und Molekülmasse von Detomidin

2.3.2 Pharmakokinetik

Um seine zentralen α2-agonistischen Wirkungen an präsynaptischen, in höheren

Konzentrationen auch an den postsynaptischen α2-Adrenorezeptoren zu entfalten

(VIRTANEN, 1986), wird Detomidin nach der Applikation schnell und vollständig

resorbiert (JÖCHLE, 1986; SALONEN, 1986). Nach der intravenösen Applikation

werden innerhalb der ersten Minuten die höchsten Plasmakonzentrationen erreicht

(SALONEN, 1986). Beim Pferd werden annähernd 85 % (SALONEN, 1986)

beziehungsweise 68 % (SINGH et al., 1987) an Plasmaproteine gebunden. Durch

seinen lipophilen Charakter verteilt sich Detomidin schnell in die gut durchbluteten

Gewebe (Leber und Niere); es passiert rasch die Blut-Hirn-Schranke (SALONEN,

1992; JÖCHLE, 1986). Die Eliminationshalbwertszeit liegt beim Pferd nach

intravenöser Injektion zwischen einer und zwei Stunden (SALONEN, 1992, DYKE,

1993; Orion Pharma, 2003). Eine Metabolisierung (Hydroxylierung, Dehydro-

genierung, Oxidation und Glukoronidierung) findet in der Leber statt (SALONEN u.

SUOLINNA, 1988; GEISER, 1990). Beim Pferd entstehen bei der

Verstoffwechselung die Metaboliten Carboxydetomidin, 3-3-Hydroxydetomidin und 4-

Hydroxydetomidin (CHUI et al., 1991), die pharmakologisch unwirksam sind (MAC

DONALD u. VIRTANEN, 1992; SALONEN, 1992). Dabei stellen das freie


Carboxydetomidin und das sowohl glukoronidiert als auch frei vorliegende 3-

Hydroxydetomidin die Hauptmetaboliten dar (SEYMOR et al., 1990A; SALONEN et

al., 1992). Da die Metaboliten weniger lipophil sind als Detomidin, werden sie

schneller als die ursprüngliche Substanz ausgeschieden. Detomidin selbst wird im

Urin nur in sehr kleinen Mengen gefunden (VAKKURI et al., 1987; SALONEN, 1988).

Die Ausscheidung erfolgt hauptsächlich renal, ein geringer Teil wird als Glukoronid

über die Faeces ausgeschieden (SALONEN, 1992). Beim Pferd sind nach einer

einmaligen intravenösen Applikation von 80 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM nach

24 Stunden nur in Leber und Lunge noch geringe Mengen Detomidin nachweisbar

(VAKKURI et al., 1987; SALONEN et al., 1989). Nach der Applikation von 20 mg

Detomidin-Hydrochlorid wird 3-Hydroxydetomidin über 48 Stunden im Urin detektiert

(CHUI et al., 1991). Carboxydetomidin hingegen wird nach einer Dosierung von 5

µg/kg KM i. m. bis 23 Stunden p. a. im Urin gefunden (SEYMOR et al., 1991).

2.3.3 Pharmakodynamische Wirkung

Die Applikation von Detomidin bedingt eine Vielzahl von zu beobachtenden Effekten.

Sedation und Analgesie: Detomidin verfügt über potente sedative und analgetische

Eigenschaften (VAINIO, 1985). Sowohl Sedation als auch Analgesie sind beim Pferd

dosisabhängig (LOWE u. HILFIGER, 1984; JÖCHLE u. HAMM, 1986). Die niedrigste

angewendete Dosierung für die intravenöse Applikation liegt bei 5 µg/kg KM. LOWE

und HILFIGER (1984) und GEISER (1990) empfehlen eine Dosis von 10 – 40 µg/kg

KM, um eine ausreichende Sedation und Analgesie zu erreichen. Für eine tiefere

Sedation und bessere Analgesie wird eine Dosierung von 40 bis 80 µg/kg KM

empfohlen (Orion Pharma, 2003). 20 µg/kg KM ergaben in den Studien von HAMM u.

JÖCHLE (1986) eine sehr tiefe und zufriedenstellende Sedation in der ersten Stunde

nach Applikation mit deutlicher Sedation bis 3 zu Stunden Dauer. Zwischen 5 und 20

µg/kg KM wird eine dosisabhängige Verstärkung der Sedation beobachtet; bei

höheren Dosierungen steigt nur noch die Dauer der Sedation, nicht mehr die Tiefe

(JÖCHLE u. HAMM, 1986; ENGLAND u. CLARKE, 1996). Nach der intravenösen


Applikation tritt die Wirkung zwischen 0,5 und 5 Minuten später ein (LOWE u.

HILFIGER, 1984; CLARKE u. TAYLOR, 1986; OHNESORGE, 1991). Maximale

Effekte werden 15 Minuten nach der Applikation beobachtet (JÖCHLE u. HAMM,

1986). Nach der intravenösen Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM

berichten CLARKE u. TAYLOR (1986) von einer tiefen Sedation über eine Dauer von

50 bis 60 Minuten, die Studien von HAMM u. JÖCHLE (1986) ergaben sogar eine

deutliche Sedation mit einer Dauer von bis zu drei Stunden. Nach oraler

Verabreichung von 60 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM war nach 30 Minuten eine

signifikante Tiefhaltung des Kopfes über eine Dauer von 45 Minuten zu beobachten

(RAMSEY et al., 2002). Die Sedation äußert sich durch Hängenlassen des Kopfes,

der Lippen und der Augenlider, verminderte Reaktion auf akustische und visuelle

Reize sowie Ataxie (FEDDERN, 1986; SHORT et al., 1986, ALITALO, 1986;

OHNESORGE, 1991).

Die spontane Bewegungsaktivität geht nach der Applikation von Detomidin-

Hydrochlorid für 4 bis 6 Stunden deutlich zurück (KAMERLING et al., 1988;

HARKINS et al., 1997). VIRTANEN et al. (1985) stellten fest, dass die sedative

Potenz von Detomidin der von Clonidin sehr ähnlich ist. Im Vergleich zu den

Wirkungen von Xylazin ist sowohl der Grad der Sedation als auch die Analgesie,

bedingt durch eine höhere α2-Rezeptorselektivität, bei Detomidin ausgeprägter

(HAMM et al., 1995), so dass 100 µg Detomidin/kg KM eine vergleichbare Wirkung

wie 1200 µg Xylazin/kg KM haben (VAINIO, 1985) Trotz starker Sedationsanzeichen

kann es, bedingt durch äußere Reize, leicht zu einem Durchbrechen der Sedation in

Form plötzlicher Abwehrbewegungen kommen (ROHR et al., 1986; ALITALO, 1986).

Anschließend fallen die Tiere wieder in einen somnolenten Zustand.

Die analgetische Wirksamkeit von Detomidin ist in verschiedenen Studien bewiesen

worden. Trotz der Verwendung unterschiedlicher Schmerzmodelle stimmen die

Ergebnisse der Untersuchungen im wesentlichen überein. VAINIO (1985) überprüfte

die Reaktion auf Nadelstiche an den Gliedmaßen, JÖCHLE und HAMM (1986),

ermittelten die Schmerzschwelle mittels Stromapplikation über Hautelektroden und

CHAMBERS et al. (1990) arbeiteten mit einem druckgasbetriebenen Zylinder, der am


Bein von Pferden montiert wurde. Die analgetische Wirkung von Detomidin war 5 bis

15 Minuten nach der Applikation voll ausgeprägt (ALITALO u. VAINIO, 1982). Die

Dauer der Analgesie richtete sich nach der Dosierung, hält jedoch kürzer an als die

Sedation (VAINIO, 1985). Bei 20 µg/kg KM waren die Gliedmaßen mit etwa 15 bis 60

Minuten am Längsten von der analgetischen Wirkung betroffen (JÖCHLE und

HAMM, 1986). LOWE u. HILFIGER (1984) bescheinigten Detomidin eine

dosisabhängige, analgetische Wirksamkeit bei viszeralen Schmerzen. Sie stellten

mittels ins Zaekum implantierten, luftgefüllten Gummiballons eine analgetische

Wirkung von Detomidin fest, die annähernd gleichzeitig mit der Sedierung einsetzte,

aber früher wieder abklang. CLARKE u. TAYLOR (1986) ermittelten hingegen bei

Dosierungen von 10-20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM keine signifikante

Analgesie.

Laut SCHATZMANN (1995) kann es ein Problem darstellen, die Analgesie von der

Sedation zu unterscheiden. Durch eine Sedation wird die Spontanaktivität und die

Reaktion auf äußere Reize gesenkt, so dass fraglich ist, ob die Tiere bei

schmerzhaften Manipulationen tatsächlich eine verlangsamte Schmerzleitung oder

nur eine verlangsamte Reaktion auf den Schmerz zeigen. Die Studien von HAMM et

al. (1995) hingegen weisen keinen Zusammenhang zwischen Sedation und

Analgesie nach.

Auswirkungen auf das kardiovaskuläre System: Nach der Applikation von

Detomidin-Hydrochlorid führt die Stimulation peripherer postsynaptischer α-

Adrenozeptoren zu einer vaskulären Vasokonstriktion. Dies bedingt einen initialen

Blutdruckanstieg, mit einem Maximum eine Minute nach Applikation (CLARKE u.

TAYLOR, 1986; SHORT et al., 1986). Die Stimulation zentraler α-Rezeptoren im

Bereich des Nucleus tractus solitarii führt jedoch zu einer Senkung des

Sympathikotonus (Überwiegen des Vagotonus) und Hypotension (GASTHUYS et al.,

1990; ENGLAND u. CLARKE, 1996; LÖSCHER, 2002). Der resultierende Blutdruck

ist also eine Mischung aus peripheren und zentralen Effekten (RUSKOAHA, 1986).


Die Herzfrequenz fällt kurz nach der Applikation von Detomidin-Hydrochlorid deutlich

ab (VAINIO, 1985; SHORT et al., 1986). Bei einer Dosis von 20 µg/kg KM ist diese

Herzfrequenzabnahme bereits innerhalb der ersten 5 Minuten (SHORT et al., 1986;

BENSON u. THURMON, 1990) und über einen Zeitraum von 70 Minuten

(FEDDERN, 1986) beziehungsweise 120 Minuten (SRAZAN et al., 1989) zu

beobachten. Diese ist bedingt durch einen Baroceptorreflex, ausgelöst durch den

transienten Hypertonus nach Detomidingabe, die zentrale Dämpfung des

Sympathikotonus und die Verstärkung der vagalen Reflexe (KAMERLING et al.,

1988).

Zusätzlich werden im Elektrokardiogramm Arrhythmien ab der ersten Minute p. a. für

die Dauer von ein bis drei Stunden registriert (CLARKE et al., 1986; FEDDERN,

1986; DAUNT et al., 1991). Dabei handelt es sich in der Mehrzahl der Fälle um

Atrioventrikularblöcke (AV-Blöcke) 2. Grades, seltener um sinuatriale Leitungs-

störungen (CLARK u. TAYLOR, 1986; FEDDERN, 1986; JÖCHLE, 1986). Im

Vergleich zu Xylazin ist bei der Anwendung von Detomidin eher mit dem Auftreten

kardialer Reizleitungsstörungen in Form von AV- und Sinusblöcken zu rechnen

(DYSON et al., 1987).

Auswirkungen auf die Atmung: Über die Veränderung der Atemfrequenz nach der

Applikation von Detomidin-Hydrochlorid wird in der Literatur kontrovers diskutiert.

SHORT et al. (1986) und WAGNER et al. (1991) stellten einen Abfall der

Atemfrequenz innerhalb einiger Sekunden fest. Dieser dauerte einige Minuten an,

bevor wieder die Ruhewerte erreicht wurden. In anderen Studien (REITMEYER et

al., 1986; DAUNT et al., 1993) wurde keine signifikante Veränderung der

Atemfrequenz gemessen. VAINIO (1985) und JÖCHLE (1986) berichteten über

einen kurzen initialen Abfall der Atemfrequenz, gefolgt von einem geringgradigen

Anstieg über die Ruhewerte hinaus. Beide Autoren beschrieben allerdings starke

Schwankungen der Atemfrequenz während der Messungen. Nach einer einmaligen

intravenösen Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM stellte FEDDERN

(1986) einen signifikanten Anstieg der Atemfrequenz über eine Dauer von 10


Minuten fest. In den folgenden 70 Minuten erfolgte eine graduelle Anpassung zurück

auf das Ruheniveau.

Nach der Applikation von Detomidin-Hydrochlorid sinkt der Sauerstoffpartialdruck

(pO2) ab, während der Kohlendioxidpartialdruck (pCO2) geringgradig ansteigt (ROHR

et al., 1986; REITMEYER et al., 1986). FEDDERN (1986) und SHORT et al. (1986)

berichteten nach der intravenösen Injektion von 20 µg/kg KM über einen nicht

signifikanten Abfall des pO2 in einem Zeitraum von 15 Minuten p. a. Gleichzeitig

steigt der pCO2 über 45 Minuten p. a. an (FEDDERN, 1986). In einer weiteren Studie

wurden keine signifikanten Veränderungen des pO2, allerdings ein Anstieg des pCO2

beobachtet (DAUNT et al., 1991). Weiterhin berichtete FEDDERN (1986) über das

Auftreten von in- und expiratorischen Geräuschen während der ersten Stunde nach

der Detomidinapplikation. Ein inspiratorisches Atemgeräusch kann durch eine

Entspannung des Larynx bei sedierten, mit gesenktem Kopf stehenden Pferden

auftreten (REITEMEYER et al., 1986).

Auswirkungen auf die Körpertemperatur: VIRTANEN und MACDONALD (1985)

und VIRTANEN (1986) zeigten in Versuchen mit Ratten eine Detomidin-induzierte

Hypothermie, während FEDDERN (1986) bei Pferden keine signifikanten

Veränderungen feststellen konnte. Dosen von 20 und 40 µg Detomidin-

Hydrochlorid/kg KM führen zu einer Hyperthermie 45 Minuten p. a. (KAMERLING et

al., 1988).

Andere Wirkungen: Als weitere Wirkungen von Detomidin wird über das Auftreten

von reversiblen Penisvorfällen (ALITALO, 1986; JÖCHLE, 1986; DYSON et al., 1987;

HAMM et al., 1995) und verstärktem Schwitzen der Tiere (CLARKE u. TAYLOR,

1986; JÖCHLE, 1986; JÖCHLE u. HAMM, 1986; SHORT et al., 1986) berichtet.

Detomidin führte in der Mehrzahl der Studien zu einem diuretischen Effekt

(FEDDERN, 1986; JÖCHLE, 1986; JÖCHLE u. HAMM, 1986; LOWE u. HILFIGER,


1986; SHORT, 1992). SHORT et al. (1986) beschrieb beim Pferd eine deutlich

verstärkte Diurese ab etwa 60 Minuten nach der Applikation von Detomidin-

Hydrochlorid. Diskutiert wird eine Verringerung von zirkulierendem Antidiuretischen

Hormon, was zu einer vermehrten Harnproduktion führt (ENGLAND et al., 1992). Die

Harndichte sinkt signifikant mit Beginn der verstärkten Diurese ab (GASTHUYS et

al., 1987). CLARKE und TAYLOR (1986) hingegen konnten keine erhöhte

Harnproduktion feststellen.

2.3.4 Applikationsformen

Domosedan® ist in Deutschland wegen guter Gewebeverträglichkeit (SALONEN,

1986) zur intravenösen, intramuskulären und epiduralen Applikation zugelassen.

2.3.5 Klinische Anwendung von Detomidin

Detomidin ist als Sedativum und Analgetikum sowie zur Prämedikation von

Injektions- und Inhalationsnarkosen für Pferde und Rinder im Handel und

zugelassen. Es eignet sich sowohl zur Erleichterung von klinischen Untersuchungen

und Behandlungen (Laryngoskopie, Zahnbehandlungen) als auch für kleinere

chirurgische Eingriffe (Wundnähte). Bei sehr schmerzhaften Eingriffen wird eine

zusätzliche Analgesie empfohlen. Die angeratene Dosierung liegt zwischen 20 und

40 µg/kg Körpermasse. Die Wirksamkeit von Detomidin ist auch bei jungen (OIJALA

u. KATILA, 1988) oder aufgeregten Tieren (MARTIN et al., 1995) nachgewiesen.

2.3.6 Einsatz von Detomidin im Pferdesport zur Beeinflussung der Leistung

Die pharmakologischen Eigenschaften von Detomidin machen seine klinischen

Einsatzmöglichkeiten deutlich. Durch den großflächigen Einsatz in den USA und


Europa steht Detomidin im Verdacht, auch illegal an Pferde verabreicht zu werden

(WOOD et al., 1989), um nervöse und ängstliche Tiere kurz vor einem Wettkampf zu

beruhigen. Subklinische Dosen von 1 mg/Tier oder weniger können geringgradige

sedative Effekte auf die Tiere haben (WOOD et al., 1989), wodurch der Umgang mit

ihnen im Wettkampf erleichtert sein kann. Aufgrund seiner analgetischen Wirkung bei

viszeralen Schmerzen ist sein Einsatz zur Maskierung von Koliksymptomen

(JÖCHLE et al., 1989) oder im Sinne des negativen Dopings als „stopping drug“

möglich (SEYMOR et al., 1990B).

Da die geringen Mengen Detomidin nur schwer nachzuweisen sind, wurden im Laufe

der Zeit verschiedene analytische Methoden entwickelt, um den illegalen Einsatz von

Domosedan® aufzudecken.

2.4 Analytik

Für den Analytiker ist die enorme Zahl an Arzneimitteln beziehungsweise

chemischen Substanzen, die dopingrelevant sind, problematisch (TOBIN, 1989).

Deshalb werden Urin- und Plasmaproben zuerst Screeningprozeduren unterzogen,

die einen Hinweis auf das Vorhandensein bestimmter Substanzgruppen geben

(DÜE, 1998). Der spezifische Nachweis einer körperfremden und/oder verbotenen

Substanz erfolgt dann in einem zweiten Schritt. Der Nachweis und die Identifizierung

einer pharmakologisch wirksamen Substanz und/oder ihrer Metaboliten erfolgt

anhand physikalischer Messmethoden (SCHÄNZER u. SEINSCH, 1997). In der

modernen Dopinganalytik werden hierbei hauptsächlich chromatographische

Analysemethoden verwendet (DYKE u. SAMS, 1994A), die dazu dienen, die

gesuchten Substanzen aus den biologischen Matrices Urin und Plasma

herauszutrennen und von anderen Substanzen zu unterscheiden.


2.5 Analytischer Nachweis von Detomidin

Für den Nachweis von Detomidin werden verschiedene Verfahren in der Literatur

beschrieben.

Der Nachweis von Detomidin im Plasma erfolgte erstmals mittels Radioimmunassay

(RIA) (SALONEN et al., 1989). Eine weitere Möglichkeit für den Nachweis von

Detomidin im Plasma bietet ein ELISA (enzyme-linked-immuno-sorbent-assay),

(CHUI et al., 1991).

Die Detektion von Domosedan® im Urin beschränkt sich in allen Studien auf den

Nachweis der Metaboliten. Um genauere pharmakokinetische Daten zu erhalten,

quantifizierten SINGH et al. (1987) Detomidin mittlels Gaschromatographie (GC/MS),

während SEYMOR et al. (1991) radioaktiv markiertes Detomidin benutzten. Ebenfalls

zum Einsatz kamen HPLC/MS/MS-Verfahren (CHUI et al., 1991), in denen teilweise

ebenfalls radioaktiv markiertes Material verwendet wurde (SALONEN u. SUOLINNA,

1988). SEYMOR et al. (1990B) benutzten ein GC/MS/MS-System, um den

Hauptmetaboliten Carboxydetomidin nach Anwendung von Domosedan® zu

identifizieren.

2.5.1 Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit Tandem-Massenspektrometer (MS/MS)

Die Analytik erfolgte in der vorliegenden Studie mittels Hochdruck-Flüssigkeits-

chromatographie in Kombination mit einem Tandem-Massenspektrometer-System.

Als Chromatographie bezeichnet man eine Stofftrennung durch Verteilung zwischen

einer ruhenden (stationären) Phase und einer sich bewegenden (mobilen) Phase, die

nicht miteinander mischbar sind. Die Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie ist eine

besonders schnelle und leistungsfähige Chromatographiemethode und trennt

innerhalb von Minuten einen umfassenden Bereich von Stoffgruppen (SCHWEDT,

1986). Dazu gehören stark polare und ionische Substanzen, Substanzen mit hoher


Molmasse sowie thermisch instabile und leicht zersetzliche Substanzen (UNGER et

al., 1995). Jede HPLC-Apparatur besteht aus einer Serie von Bausteinen, die

miteinander gekoppelt sind. Ein sogenanntes chromatographisches System enthält

folgende Bausteine:

Die stationäre Phase wird von einer sogenannten „Säule“, als langgestrecktes

Trennbrett in einem Rohr gebildet. Das Innere der Trennsäule wird aus einem

stabilen und dichten Verband aus kleinen, porösen Teilchen gebildet (Säulenbett),

was eine große Oberfläche und hohe Druckstabilität garantiert (UNGER et al., 1995).

Die Trennsäule ist charakteristisch durch ihre Länge, ihren Innendurchmesser und

durch den mittleren Teilchendurchmesser des Packungsmaterials. Sie besteht aus

einem Probenaufgabeteil, durch den auch die Zufuhr der mobilen Phase erfolgt, der

chromatographischen Trennstrecke und dem Säulenende, das in den Detektor

übergeht. Die Trennung der einzelnen Substanzen ist aufgrund ihrer

unterschiedlichen Polaritäten mit unterschiedlichen Sorptions- und Desorptions-

vorgängen auf der Säule möglich.

Die mobile Phase entspricht einem Lösungsmittelgemisch. Es wird infolge der

Schwerkraft oder mittels einer Pumpe unter Überdruck aus dem Fließmittelreservoir

in die Säule eingebracht. Möchte man ein Substanzgemisch mit verschiedenen

polaren Substanzen trennen, so verwendet man zur Trennung die Gradientenelution.

Bei dieser Arbeitsweise wird die Fließmittelstärke kontinuierlich erhöht und damit die

Empfindlichkeit der Detektion im hinteren Teil der Zeitachse erhöht (siehe Punkt

3.3.3.1).

Die Pumpe dient der Erzeugung eines konstanten und regelbaren Flusses des

Lösungsmittels. Für analytische Säulen werden Volumina von 0,5 bis 5 ml/min

angegeben.

Die Dosiervorrichtung oder das Einspritzsystem gibt reproduzierbar ein im Volumen

wählbares, definiertes Aliquot des zu trennenden Gemisches (Probe) aus dem

Probenröhrchen direkt in den Strom der mobilen Phase. So gelangen Probe und


Lösungsmittel über das Probenaufgabeende in die thermostatierte Säule und werden

durch sie hindurch geleitet (SCHWEDT, 1986).

Das Detektionssystem schließt sich der Säule direkt an und macht das

chromatographische Konzentrationsprofil sichtbar (SCHWEDT, 1986). Dabei ist das

Signal proportional zur Menge der Substanz und wird in Abhängigkeit zur Zeit in

Form eines Peaks aufgezeichnet. Das Chromatogramm zeigt die Retentionszeit der

Substanz sowie Höhe und Fläche des Peaks an. Die Retentionszeit entspricht der

Zeitspanne von der Injektion bis zum Durchbruch des Maximums des Peaks. Über

den Vergleich der Fläche der Substanz zur Fläche des internen Standards kann auf

die Konzentration der Probe geschlossen werden (MASSMANN, 2004).

In der vorliegenden Studie wurde das HPLC-System direkt mit einem Tandem-Massenspektrometer als Detektionssystem gekoppelt. Es ist sensibler und

spezifischer als alle anderen flüssigkeitschromatographischen Detektoren und dient

der Darstellung und Identifizierung von Substanzen. Die substanzspezifischen

Fragmentierungsmuster lassen Rückschlüsse auf die Strukturformeln der zu

identifizierenden Substanzen zu, denn unter gleichbleibenden Bedingungen zerfällt

ein Molekül immer in die gleichen Fragmente. Das Massenspektrometer erzeugt

nach der Trennung der Substanzen im Flüssigkeitschromatographen einen Strahl

gasförmiger Ionen. Hierfür werden die Substanzmoleküle unter atmosphärischem

Druck in für die Substanz charakteristische Ionen zerlegt und von den Molekülen des

Lösungsmittels getrennt. Die in der Zeiteinheit gebildeten Mengen an Ionen

bezeichnet man als Ionenströme, die Summe der Ionenströme als Gesamt-

ionenstrom (BUDZIKIEWICZ, 1998).

In dieser Studie wurde als Ionisationsverfahren die chemische Ionisation unter

atmosphärischem Druck (APCI, Atmospheric Pressure Chemical Ionisation)

verwendet. Dabei wird der aus der HPLC-Säule austretende flüssige Eluent bei einer

Temperatur von 350 bis 550°C in einer evakuierten Verdampfungskammer vernebelt.

An einer Glühkathode werden die gasförmigen Teilchen ionisiert und dem

Massenspektrometer zugeleitet. In dem verwendeten Triple-Quadrupole-

Massenspektrometer werden die Ionen dreimal hintereinander mittels


Beschleunigung im elektrischen Feld nach Masse und Ladung getrennt und durch

Kollision mit Stickstoffmolekülen in typische Fragmente zersprengt. Andere Ionen

werden aus dem Feld hinaus in die Umgebung abgeleitet, was eine Aufreinigung und

Konzentration der gesuchten Ionen bedeutet. Diese werden schließlich durch einen

Kollektorspalt in einen Detektor geleitet und dort entladen. Die Ströme führen zur

Aufzeichnung des Massenpektrums (BUDZIKIEWICZ, 1998). Dabei gibt das

Massenspektrum alle Ionen eines Substanzgemisches, das „single ion monitoring“

(SIM) hingegen nur das ausgewählte Spektrum eines Ions an.

Vor Beginn dieser Studie stand im Institut für Biochemie der Deutschen

Sporthochschule Köln kein geeignetes Analyseverfahren für Detomidin oder seine

Metaboliten zur Verfügung. Es ist geplant, den analytischen Nachweis von Detomidin

in den Routineuntersuchungen von Pferdedopingproben zu etablieren.

2.6 Pharmakokinetik

Unter Pharmakokinetik versteht man die Lehre von der quantitativen

Auseinandersetzung zwischen Organismus und Pharmakon (GLADTKE u. von

HATTINGBERG, 1977). Als Teilgebiet der Pharmakologie befasst sie sich mit der

Wirkung des Organismus auf den Arzneistoff. Dabei wird die Konzentration einer

Substanz im Körper von den Faktoren Aufnahme, Verteilung, Metabolisierung und

Ausscheidung in Abhängigkeit von der Zeit beeinflusst (KOCH u. RITSCHEL, 1986).

2.6.1 Allgemeine Pharmakokinetik

Als „Dogma der Pharmazie“ bezeichnet, macht das Merkwort „LADME“ (siehe

Abbildung 2) den Weg eines Arzneistoffes im Organismus deutlich (KOCH u.

RITSCHEL, 1986):


Invasion (Anfluten) Liberation (Freisetzung)

Absorption (Resorption)

Distribution (Verteilung)

Elimination (Abfluten) Metabolismus (Biotransformation)

Exkretion (Ausscheidung)

Abbildung 2: LADME – Das „Dogma der Pharmazie“ nach KOCH und RITSCHEL (1986)

Danach lässt sich der Verlauf einer Arzneimittelkonzentrationskurve in die Invasion

und die Elimination einteilen. Die Anflutung des Arzneimittels beginnt mit der

Liberation, also der Freigabe des Wirkstoffes aus seiner galenischen Arzneiform und

Verteilung in den Körperflüssigkeiten, das heißt Verteilung an den

Resorptionsflächen. Es folgt die Aufnahme des Wirkstoffes durch biologische

Membranen in die Blutbahn oder die Resorption. Im Falle der intravenösen

Applikation entfällt dieser Schritt, da bereits der gesamte Stoff im Blut vorliegt und

verfügbar ist. Die Geschwindigkeit, mit der die Substanz im Blut erscheint, hängt

lediglich von der Applikationsgeschwindigkeit ab. Dadurch kann der Vorgang der

Resorption bei intravenöser Applikation aus den pharmakokinetischen Berechnungen

ausgeklammert werden (GLADTKE u. von HATTINGBERG, 1977). Im Fall einer

nicht-intravasalen Applikation hängt die Resorption von der Liberations-

geschwindigkeit, der Applikationsform und -ort, den physikalisch-chemischen

Eigenschaften und der Stoffkonzentration am Applikationsort ab (KOCH u.

RITSCHEL, 1986). Auch die Distribution, also die weitere Verteilung der Substanz in

den Körperflüssigkeiten, wird von den substanzspezifischen Eigenschaften bestimmt.

Dazu gehören zum Beispiel die Molekülgröße, die Lipidlöslichkeit, der pH-Wert oder

die Bindung an Plasmaproteine. Nur der freie, ungebundene Teil des Wirkstoffes


kann bis zum Rezeptor und damit dem Ort seiner Wirkung permeieren, während der

an Plasmaproteine oder andere Blutbestandteile gebundene Anteil im Blutplasma

fixiert ist. Die Plasmaproteinbindung ist zwar reversibel, kann jedoch die Aktivität

eines Arzneistoffes deutlich beeinflussen. Weiterhin kann auch eine Bindung an

Gewebsproteine oder im Fettgewebe stattfinden. Diese Ablagerung ist ebenfalls

temporär, kann sich aber verzögernd auf die Ausscheidung, beziehungsweise

verlängernd auf die Arzneimittelwirkung auswirken, weil der Wirkstoff nicht durch die

Ausscheidungsorgane filtriert werden kann. Der Metabolisierung unterliegen alle

chemischen Verbindungen im Körper. Schon beim Durchtritt durch die

Darmschleimhaut und beim ersten Durchgang durch die Leber werden viele

Arzneistoffe in ihrer Struktur verändert und büßen ihre Wirksamkeit teilweise oder

völlig ein (englisch: first-pass-Effekt). Gleichzeitig stellt die Metabolisierung die

Vorbereitung des Pharmakons auf die Exkretion dar. Dabei werden zum Beispiel aus

lipophilen Substanzen gut wasserlösliche gebildet, um eine bessere Ausscheidung

über die Nieren (mit dem Urin) oder die Galle (mit der Faeces) zu erreichen. Die

Exkretion über Sekrete wie Speichel, Milch oder Schweiß, sowie die Ausatmungsluft,

spielt zumeist nur eine untergeordnete Rolle (SCHLINGLOFF, 1997).

Metabolisierung und Exkretion werden unter dem Begriff der Elimination

zusammengefasst, weil beide Vorgänge Voraussetzung für die endgültige

Entfernung von Arzneistoffen und Metaboliten aus dem Körper sind (KOCH u.

RITSCHEL, 1986).

Die Vorgänge der Invasion und der Elimination verlaufen zeitgleich nebeneinander.

Der zeitliche Verlauf der Konzentration eines Wirkstoffes, der durch die oben

genannten komplexen Verteilungs- und Eliminationsvorgänge im Körper beeinflusst

wird, lässt sich mathematisch unter Annahme sogenannter Kompartimente

(imaginäre Verteilungsräume) beschreiben (DYKE u. SAMS, 1994B). Als

Kompartimente bezeichnet man Räume, die kinetisch einheitlich sind, wie zum

Beispiel den Magen-Darm-Trakt, das Blut oder bestimmte Gewebe (DOST, 1968). Es

werden verschiedene Kompartiment-Modelle für die pharmakokinetischen

Berechnungen beschrieben.


Beim Ein-Kompartiment-Modell wird der gesamte Organismus als zentraler

Verteilungsraum angesehen. Dabei stehen alle Organe und Gewebe mit dem

Blutkreislauf in direktem Gleichgewicht (JOCHHEIM, 2002). Die Verteilung des

Wirkstoffes in einem solchen System erfolgt in einer vernachlässigbaren Zeit und die

Ausscheidung folgt einer Kinetik 1. Ordnung (GLADTKE u. von HATTINGBERG,

1977). Das bedeutet, das konzentrationsabhängig pro Zeiteinheit ein konstanter

prozentualer Anteil der Stoffmenge transportiert wird (exponentieller Verlauf der

Konzentrations-Zeit-Kurve). Aus der Steigung der Geraden sind die Eliminations-

konstanten und die Halbwertszeit zu ermitteln.

Mehr-Kompartiment-Systeme stellen die Vorgänge im Körper anhand von

mindestens zwei Verteilungsräumen dar. Für die meisten Wirkstoffe ist das Zwei-Kompartiment-System für die Beschreibung der Kinetik am Besten geeignet

(BAGGOT, 1978). Dabei verteilt sich der Wirkstoff zuerst in einem zentralen

Kompartiment, womit in der Regel das Plasma oder aufgrund ihrer starken Perfusion

mit dem Blut in Gleichgewicht stehende Gewebe wie Lunge, Leber oder Nieren

gemeint sind (BAGGOT, 1978). Von dort diffundiert das Arzneimittel in periphere

Räume, wie zum Beispiel Haut, Unterhaut, Muskulatur und Fettgewebe (KLOTZ,

1988). Da jedoch die Ausscheidung der Stoffe ausschließlich über das zentrale

Kompartiment stattfindet, erfolgt zeitgleich auch ein Austausch zurück von

peripherem zu zentralem Kompartiment. Stofftransporte in, aus und zwischen den

verschiedenen Kompartimenten werden durch Geschwindigkeitskonstanten

beschrieben. Die Konzentrations-Zeit-Kurve eines Zwei-Kompartiment-Modells zeigt

in halblogarithmischer Darstellung einen biexponentiellen Verlauf. In der initialen

Verteilungsphase fällt die Konzentration im zentralen Kompartiment schnell ab und

geht nach Erreichen des Gleichgewichts in eine lineare Eliminationsphase über, die

durch einen flacheren Verlauf gekennzeichnet ist (DERENDORF et al., 2002).

Nach welchem Modell die Berechnung der pharmakokinetischen Parameter erfolgt,

hängt von den Messwerten ab. Zeigen diese in halblogarithmischer Darstellung über

einen genügend langen Zeitraum einen monoexponentiellen Verlauf, so ist das Ein-

Kompartiment-Modell anzuwenden. Ist der Verlauf jedoch biexponentiell, findet das


Zwei-Kompartiment-Modell Anwendung. Dabei sollten mindestens vier Messpunkte

pro Kurvenanteil vorhanden sein (KLOTZ, 1984).

2.6.2 Eliminationskinetische Parameter

Pharmakokinetische Parameter beschreiben den zeitlichen Verlauf eines

Arzneimittels im Organismus. Im Folgenden werden einige Parameter genauer

beschrieben, die im Zuge dieser Arbeit bestimmt wurden.

Als Halbwertszeit (HWZ) wird die Zeit bezeichnet, nach der die Konzentration um

die Hälfte ihres ursprünglichen Wertes abgenommen hat (DERENDORF et al.,

2002). Sie wird aus der Eliminationskonstanten errechnet und ist für jeden Stoff

charakteristisch, unabhängig von der verabreichten Dosis. Sie ist ein wichtiger

Parameter zur Berechnung von Dosierungsintervallen und der Berechnung der

Ausscheidungszeit. Im allgemeinen werden etwa 5 Halbwertszeiten benötigt, um

einen Stoff zu 97 % aus dem Organismus eliminiert zu haben (KAMERLING und

OWENS, 1994).

Das Verteilungsvolumen (Vc) beschreibt als fiktive Größe das Flüssigkeitsvolumen,

das erforderlich wäre, um die gesamte im Körper befindliche Arzneistoffmenge in

gleicher Konzentration zu lösen, in der sie im Blut vorliegt (SCHLINGLOFF, 1997).

Die Clearance (Cl) ist ein hypothetisches Volumen der Kreislaufflüssigkeit, welches

pro Zeiteinheit durch die Funktion eines beziehungsweise aller Ausscheidungs-

organe von einem Arzneistoff befreit wird. Die totale Clearance ist also ein Maß für

die Eliminationsleistung des Organismus. Sie setzt sich additiv aus den

Ausscheidungsraten der einzelnen beteiligten Organe zusammen (SAMS, 1992).

Solange keine Sättigung der Prozesse der Elimination vorliegt, verhält sich die

Clearance dosisunabhängig.


Unter der Bioverfügbarkeit versteht man den Anteil des Arzneimittels, der

unverändert im Blut zur Verfügung steht. Diese beträgt bei intravasaler Applikation

100 %, während nach zum Beispiel oraler Applikation die Bioverfügbarkeit vermindert

ist, da durch Darm- und Leberpassage nur noch ein Teil der Dosis zur Verfügung

steht (FICHTL et al., 2001). Zur Berechnung der Bioverfügbarkeit wird die Fläche

unter der Plasmakonzentrationskurve (AUC) herangezogen. Zusammen sind die

Bioverfügbarkeit, die maximale Konzentration (Cmax) und der Zeitpunkt der

maximalen Konzentration (tmax) bedeutende Größen, um die Bioäquivalenz einer

Arzneiform zu bestimmen.

38 MATERIAL UND METHODEN


3.1 Versuchsplanung

Zur Untersuchung der Eliminationskinetik von Detomidin im Pferdeblut und -urin

wurde die Substanz einmalig in therapeutischer Dosis (20 µg/kg KM Detomidin-

Hydrochlorid entsprechen 16,76 µg/kg KM Detomidin) intravenös appliziert.

Außerdem wurden Effekte der Substanz auf ausgewählte Kreislauf- und

Atemparameter sowie seine sedative und analgetische Wirksamkeit überprüft.

Die Studie teilte sich in einen Vorversuch und in einen Hauptversuch. Im Vorversuch

erfolgte an Blut- und Urinproben eines Pferdes die Entwicklung und Validierung der

Analysemethode, sowie eine Auswahl der pharmakodynamischen Parameter. Im

Hauptversuch wurde 10 Pferden Detomidinhydrochlorid appliziert. Während der

Dauer der Versuche wurden den Pferden in festgelegten Zeitabständen Blutproben

entnommen. Ebenfalls zeitlich kontrolliert wurde Spontanurin aufgefangen.

Die Plasma– und Urinproben wurden im Institut für Biochemie der Deutschen

Sporthochschule Köln aufgearbeitet. Mittels High-Performance-Liquid-

Chromatography/Tandem Mass Spectrometry (HPLC/MS/MS) wurden sie

labortechnisch untersucht und die Ergebnisse pharmakokinetischen Berechnungen

unterzogen. Die Werte der Kreislauf- und Atemparameter sowie der sedativen und

analgetischen Wirkung wurden zusätzlich statistisch ausgewertet.

3.2 Versuchsdurchführung

3.2.1 Versuchstiere

Für die Versuche wurde eine Gruppe von 10 Wallachen im Alter von 3 bis 10 Jahren

verwendet. Es handelte sich dabei um 7 Warmblutpferde und 4 Vollblüter. Ihr

mittleres Gewicht betrug 599 kg. Pferd 1 wurde sowohl im Vorversuch als auch im

Hauptversuch eingesetzt, wobei zwischen diesen Versuchen ein zeitlicher Abstand

MATERIAL UND METHODEN 39

von 8 Monaten lag. Rasse, Alter und Gewicht der einzelnen Tiere sind in Tabelle 3

zusammengefasst.

Pferd 1 Warmblut 7 622Pferd 2 Warmblut 9 618Pferd 3 Warmblut 10 640Pferd 4 Warmblut 7 762Pferd 5 Warmblut 9 658Pferd 6 Warmblut 9 730Pferd 7 Vollblut 8 441Pferd 8 Warmblut 7 552Pferd 9 Vollblut 4 538

Pferd 10 Vollblut 3 540

Pferd Rasse Alter [Jahre]

Gewicht [kg]

Tabelle 3: Rasse, Alter und Gewicht der Versuchstiere

Die Pferde waren im Institut für Tierzucht der Forschungsanstalt für Landwirtschaft

(FAL) in Mariensee untergebracht. Seit März 2003 befanden sich die Tiere in einem

festen Herdenverband. Die Gruppe wurde in einem Laufstall auf Stroh mit

unbegrenztem Zugang auf ein Paddock sowie täglichem Weidegang gehalten.

Morgens bekamen alle Tiere Hafer und Mineralfutter in Einzelfressständen. Die

Menge der Ration richtete sich nach dem Ernährungs- und Trainingszustand des

einzelnen Tieres. Tagsüber hatten alle Pferde ad libitum Zugang zu Grassilage und

Wasser.

Alle Tiere waren entwurmt und gegen Tetanus, Equines Herpesvirus und Influenza

geimpft. Vor Versuchsbeginn wurden die Pferde einer kurzen klinischen

Allgemeinuntersuchung unterzogen. Zusätzlich wurden der Ernährungszustand, das

Temperament und der klinische Gesamteindruck beurteilt. Alle Tiere waren klinisch

unauffällig.


Um zu gewährleisten, dass es nicht zu Wechselwirkungen mit anderen

Medikamenten kommt, wurde sichergestellt, dass den Tieren ab 4 Wochen vor

Studienbeginn keine Medikamente mehr verabreicht worden waren. Bei einem Pferd

wurde während des Versuches eine Behandlung aufgrund eines Hufabszesses nötig.

Dafür musste das Tier mit 15 ml Xylazin® und 15 ml Polamivet® sediert werden. Da

die Behandlung aber erst 4 Tage nach der Applikation von Detomidin stattfand, war

ein Einfluss auf die Eliminationskinetik des zu untersuchenden Stoffes nicht zu

erwarten.

3.2.2 Konditionierungsphase und Vorbereitung des Versuches

Im Zuge der Vorbereitung auf die Studie wurden alle Pferde darauf konditioniert, kurz

nach dem Betreten des mit Stroh eingestreuten Laufstalles Spontanurin abzusetzen.

Dabei macht man sich das Phänomen zunutze, dass Pferde meist spontan „stallen“,

sobald sie sich in mit Stroh eingestreuten Boxen befinden. Um dieses Verhalten zu

verstärken, wurden die Tiere zuerst über mehrere Stunden ausgesperrt, dann in den

Laufstall gelassen und für das Absetzen von Urin gelobt. Im Laufe der

Konditionierung konnten die Intervalle für die Urinabgabe auf bis zu 15 Minuten

verringert werden.

Unmittelbar vor Beginn der Versuche wurde das Gewicht der Tiere mittels einer

Zurich Tru-Test AG 500 Viehwaage (Messbereich bis 2000 kg) ermittelt. Nach der

klinischen Allgemeinuntersuchung wurden den Pferden je eine Braunüle MT® (Firma

Braun, Melsungen) in die linke und rechte Vena jugularis externa gelegt und mit

einem Mandrin Vasofix® (Firma Braun, Melsungen) verschlossen. An der linken

Vordergliedmaße wurden medial und lateral zwei jeweils etwa 2 x 2 cm große Stellen

rasiert und mit Kontaktgel befeuchtet. Zwei Elektroden wurden mit Klebeband daran

befestigt. Die Kabelverbindung führte an der Vordergliedmaße nach oben durch

einen Bauchgurt und wurde dann am Stromgerät zur Überprüfung der Analgesie

angeschlossen.


Während der Dauer des Versuches wurden die Pferde nur am Strick gehalten, um

ihnen volle Kopffreiheit zur Beurteilung der Kopftiefhaltung zu gewähren.

Durch den Katheter in der linken Vena jugularis wurde vor der Applikation des

Detomidins mittels vier Monovetten® (á 9 ml, Lithium heparinisiert, Firma Sarstedt,

Nümbrecht) eine Blutprobe von 36 ml entnommen. Spontanurin wurde aufgefangen.

Beide Proben dienten als Nullproben.

Nach einer Eingewöhnungszeit von etwa 30 Minuten wurden die Herz- und

Atemfrequenz sowie die Körperinnentemperatur (dreimalig im Abstand von etwa 10

Minuten) bestimmt. Diese Daten gingen als Basiswerte in das Versuchsprotokoll ein.

Es fand ebenfalls eine Einstufung der Reaktion auf einen visuellen und akustischen

Reiz zur späteren Überprüfung des Sedationsgrades (siehe Punkt 3.2.5.5) statt. Die

Empfindlichkeit gegenüber der Anwendung von Strom mittels zwei Elektroden am

Kronsaum wurde ebenfalls in dreifacher Wiederholung gemessen und die erhaltenen

Werte als Basiswerte vermerkt. Abbildung 3 zeigt ein vollständig vorbereitetes Pferd

vor der Applikation.

Abbildung 3: Für den Versuch vorbereitetes Pferd mit vollständig angeschlossener Apparatur


3.2.2.1 Substanz und Dosierung

Zur Untersuchung der Pharmakokinetik von Detomidin wurde den Versuchstieren

Detomidinhydrochlorid in einer Dosierung von 20 µg pro Kilogramm KM verabreicht.

20 µg Domosedan® (Firma Orion Pharma, Espoo, Finnland, vertrieben durch die

Firma Pfizer, Karlsruhe) entsprechen 16,76 µg Detomidin/kg KM. Die genaue Dosis

für jedes Pferd ist in Tabelle 4 festgehalten.

Pferd 1 12,44 1,20 10,43Pferd 2 12,36 1,20 10,36Pferd 3 12,80 1,30 10,73Pferd 4 15,24 1,50 12,77Pferd 5 13,16 1,30 11,03Pferd 6 14,60 1,50 12,24Pferd 7 8,82 0,90 7,39Pferd 8 11,04 1,10 9,25Pferd 9 10,76 1,10 9,02Pferd 10 10,80 1,10 9,05

Pferd Dosis

Detomidinhydrochlorid [mg/Pferd]

Dosis Detomidinhydrochlorid

[ml/Pferd]

Dosis Detomidin [mg/Pferd]

Tabelle 4: Intravenös verabreichte Dosis von Detomidinhydrochlorid in mg und ml pro Pferd und

entsprechend umgerechnete Menge Detomidin bei den einzelnen Tieren

3.2.3 Applikation des Medikamentes (Vor- und Hauptversuch)

Nach den Vorgaben des EHSLC (2002) erfolgte die Applikation des Arzneimittels

sowohl im Vorversuch als auch im Hauptversuch durch den Venenverweilkatheter in

die rechte Vena jugularis externa.

Die in einer sterilen Einmalspritze aufgezogene Dosis wurde im Vor- und im

Hauptversuch innerhalb von 20 Sekunden langsam durch den Venenverweilkatheter

intravenös gespritzt. Durch zweimalige Aspiration von Blut wurde ein Verbleiben der

Substanz in der Spritze oder im Katheter weitgehend verhindert.


3.2.4 Erhebung der Messdaten

Um eine Beeinflussung der Werte durch Manipulationen am Pferd gering zu halten,

wurden die Behandlungen und Messungen im Vorversuch und im Hauptversuch

immer in folgender Reihenfolge vorgenommen:

• Blutentnahme

• Messung der Herzfrequenz

• Messung der Atemfrequenz

• Messung der Körperinnentemperatur

• Feststellung des Sedationsgrades durch

1. Überprüfung der Kopfhaltung (Ptosis)

2. Reaktion auf akustischen Reiz

3. Reaktion auf visuellen Reiz

• Überprüfung der Analgesie durch die Reaktion auf Strom

• Auffangen von Urin

3.2.4.1 Abnahme, Verarbeitung und Aufbewahrung der Blutproben

Über den Katheter in der linken Halsseite und ab Stunde 24 mittels Einmalkanülen

wurden den Pferden zu den folgenden Zeitpunkten Blutproben von je 45 ml

entnommen: 2, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90 Minuten sowie 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 24

und 36 Stunden nach der Applikation von Detomidin. Hierfür wurden Lithium-

heparinisierte Monovetten® benutzt (EHSLC 2002).


Da die Blutentnahme pro Probe insgesamt etwa 50 Sekunden in Anspruch nahm,

wurde 25 Sekunden vor der genauen Probenentnahmezeit begonnen, so dass die

Gesamtprobe die Konzentration zum exakten Zeitpunkt enthält.

In einem Zeitraum von 2 bis maximal 30 Minuten nach der Entnahme wurden die mit

Vollblut gefüllten Monovetten® bei 2500 Umdrehungen pro Minute 10 Minuten

zentrifugiert. Die Plasmafraktion wurde in Einmalspritzen (20 ml) mit aufgesetzter

Kanüle gepoolt und nach mehrmaligem Schwenken in je drei Glasröhrchen (8 ml,

Wheaton, Millvill) zu je 6 ml überführt. Um eine Verwechslung der Proben zu jedem

Zeitpunkt zu verhindern, waren die Monovetten® mit dem jeweiligen Pferdenamen

und der Probennummer beschriftet. Die Glasröhrchen zur Aufbewahrung des

Plasmas wurden mit Etiketten gekennzeichnet, die mit Codenummern bedruckt

waren.

Nach der Überführung in die Plasmaröhrchen wurden alle Proben im Kühlschrank bei

8°C vorgekühlt, bevor sie am jeweiligen Versuchsabend in einen Kühlraum mit einer

Temperatur von –20°C verbracht wurden (EHSLC 2002).

3.2.4.2 Herzfrequenz

Die Bestimmung der Herzfrequenz erfolgte durch Auskultation des Herzens an der

linken Brustwand im Bereich des 5. Intercostalraumes. Dazu wurden die Herzschläge

über eine Minute gezählt und der Rhythmus beurteilt. Die Messungen wurden zu

folgenden Zeitpunkten durchgeführt: 2, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90 Minuten; 2, 3, 4, 5, 6,

7, 8, 10 und 12 Stunden nach der Applikation von Detomidin.


3.2.4.3 Atemfrequenz

Die Atemfrequenz wurde durch Adspektion des Abdomens und der Flanken über

jeweils 30 Sekunden hinweg bestimmt. Ebenfalls im Protokoll vermerkt wurden

Atemgeräusche. Die Zeitpunkte der Messungen sind unter 3.2.4.2 aufgeführt.

3.2.4.4 Körpertemperatur

Die Messung der Körpertemperatur erfolgte rektal mit einem digitalen Thermometer

(Medizintechnik GmbH) mit einer Messgenauigkeit von ± 0,1°C. Die Messungen

wurden zu folgenden Zeitpunkten durchgeführt: 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90 Minuten; 2,

3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 und 12 Stunden nach der Applikation von Detomidin.

3.2.4.5 Feststellung des Sedationsgrades

Der Grad der Sedation der Pferde wurde allein vom Untersucher beurteilt. Bewertet

wurden hierbei die Haltung des Kopfes sowie die Reaktion auf einen akustischen und

auf einen visuellen Reiz. Für die genannten Parameter wurde ein Punkte-

Bewertungsschema ausgearbeitet, das basierend auf der Summe der Punkte der

einzelnen Parameter den Sedationsgrad jedes Pferdes gesamtheitlich möglichst

objektiv beurteilt.

Grad der Kopftiefhaltung (Ptosis) von 0 – 3

Grad der Reaktion auf akustischen Reiz von 0 – 3

Grad der Reaktion auf visuellen Reiz von 0 – 3

Daraus ergibt sich eine Punktsumme von 0 – 9. Diese wurden folgenden

Sedationsgraden zugeteilt:


0 Punkte = keine Sedation

1 – 3 Punkte = geringgradige Sedation

4 – 6 Punkte = mittelgradige Sedation

7 – 9 Punkte = hochgradige Sedation

Ein nicht sediertes Pferd mit normalen Reaktionen wird demnach immer mit 0

Punkten bewertet; bei einer hochgradigen Sedation ohne Reizantwort ergeben sich

maximal 9 Punkte.

Kopfhöhe

Das Herabsenken des Kopfes (Ptosis) im Verlauf der Zeit nach der Applikation von

Detomidin ist ein Anzeichen für einen zunehmenden Grad der Sedation. Der Grad

der Ptosis wurde im Vor- und Hauptversuch anhand der Tiefe des Kopfes in Relation

zu prominenten Knochenpunkten des jeweiligen Tieres beurteilt. Hierbei wurde als

tiefster Punkt die Unterlippe als Messpunkt ausgewählt.

Die Tiefe des Kopfes wurde wie folgt bewertet:

Grad 0 = Unterlippe oberhalb einer waagerechten Linie vom

Buggelenk des Pferdes ausgehend

Grad 1 = Unterlippe auf der Höhe zwischen Bug- und

Ellenbogengelenk

Grad 2 = Höhe der Unterlippe zwischen Ellenbogen und

Karpalgelenk

Grad 3 = Unterlippe an oder unterhalb des Karpalgelenkes


Akustischer Reiz

Der Grad der Reaktion auf ein Geräusch wurde im Vorversuch und im Hauptversuch

bestimmt. Dafür wurde ein Rasselgeräusch verwendet, das in circa 1 m Abstand,

hinter dem Körper verdeckt, für 2 Sekunden erzeugt wurde. Um die individuell

unterschiedlichen Reaktionen der einzelnen Pferde zu berücksichtigen, wurde die

Reaktion vor der Applikation als Basiswert im Protokoll vermerkt. Folgendes

Beurteilungsschema wurde verwendet:

Grad 0 = volle, normale Reaktion (Erschrecken und Zurückweichen)

Grad 1 = geringgradig gedämpfte Reaktion (leichtes Heben des Kopfes)

Grad 2 = deutlich gedämpfte Reaktion (nur noch Bewegung der Ohren)

Grad 3 = Reaktion vollständig erloschen

Visueller Reiz

Die Reaktion der Pferde auf visuelle Reize unter dem Einfluss von Detomidin wurde

im Vorversuch und Hauptversuch bestimmt. Dabei wurde eine 50 x 50 cm große,

rote Tüte in circa 50 cm Abstand vor dem Kopf des Pferde einmal hin und

hergeschwenkt. Eine Berührung der Tiere wurde streng vermieden. Individuelle

Reaktionen wie Zurückweichen und Hochreißen des Kopfes wurden wiederum als

Basiswert im Protokoll vermerkt und dasselbe Beurteilungsschema wie für den

akustischen Reiz verwendet.

3.2.4.6 Überprüfung der Analgesie

Um die analgetische Wirkung von Detomidin beim Pferd zu erfassen, wurde eigens

für diesen Versuch ein Reizgenerator (Abbildung 4) in Anlehnung an JÖCHLE und

HAMM (1986) sowie HAMM et al. (1995) entwickelt.


Abbildung 4: Reizgenerator zu Überprüfung der Analgesie

Funktionsprinzip:

Durch den Vorwiderstand (Rv) wird mit Hilfe einer Diode (D) und einer Zenerdiode

(ZD) eine konstante Spannung (UB) an der Basis des Transistors (Tr) bereitgestellt.

Zenerdioden sind im Bereich um 6 Volt Durchbruchspannung temperaturunabhängig.

Der P-N-Übergang der Diode verhält sich bei Temperaturänderung entsprechend

dem P-N-Übergang der Basis-Emitter-Strecke des Transistors, wodurch die

Stromquelle in weiten Bereichen von der Außentemperatur und einer

Eigenerwärmung unabhängig ist.

Der Transistor verfügt über eine 100 – 200fache Stromverstärkung, das heißt, ein

Basisstrom IB = 1 mA kann einen Kollektorstrom IC ≈ 100 – 200 mA fließen lassen.

Der Emitterstrom (IE) setzt sich aus Basisstrom IB und Kollektorstrom IC zusammen:

IE = IB + IC

Wird der Basisstrom vernachlässigt, so gilt: IE ≈ IC

Der Transistor benötigt eine Basis-Emitterspannung (UB) von circa 0,6 V um leitend

zu werden. Steigt der Strom durch den Emitterwiderstand RE an, so steigt auch die

Spannung am Emitter:


UE = RE * IE

Die Spannung UB an der Basis ist konstant:

UB = UZD + UD = konst.

UBE = UD ≈ 0,6 V ; UZD = 5,6 V (Zenerdiode)

UB – UBE – UE = 0

UZD + UD – UBE – UE = 0

UZD + 0,6 V – 0,6 V – UE = 0

Bei UE = UZD = 5,6 V stellt sich ein Gleichgewicht ein, bei dem der Strom durch den

Transistor durch den Widerstand RE = UE / IE bestimmt wird. Setzt sich RE aus einer

Serienschaltung eines Festwiderstandes und eines veränderbaren Widerstandes

(Potentiometer) zusammen, lässt sich der Kollektorstrom wie in Abbildung 5

dargestellt justieren:

IE = IC

R (fest)

UE

R (einstellbar)

Abbildung 5: Schaltbild des Reizgenerators zu Überprüfung der Analgesie


UE = UZ = 5,6 V

IE ≈ IC = 5 mA

Wählt man nun den Festwiderstand mit 1 kΩ ergibt sich für UE = 5,6 V ein Einstell-

bereich von Ic = 5 mA ± 0,6.

Um 10 mA Laststrom zu erhalten, muss man einen Festwiderstand von 470 wählen

und so weiter.

Durchführung der Tests:

An der linken Vordergliedmaße direkt oberhalb des Kronsaumes wurden zwei

Elektroden von 2 x 2 cm mittels eines Klebeverbandes jeweils medial und lateral

befestigt (siehe Abbildung 6). Auf die vorher rasierte, gereinigte und gut getrocknete

wurde Kontaktgel aufgetragen.

Abbildung 6: Sitz der Elektroden am Huf


Die Kabelverbindung von den Elektroden führte an der Gliedmaße nach oben, wurde

in der Mähne fixiert und über einen Bauchgurt zum Gerät gelegt (siehe Abbildung 3).

Über die beiden Elektroden wurde zu definierten Zeitpunkten ein Stromreiz gesetzt,

dessen Stärke in 5 mA-Stufen erhöht wurde. In jeder Stufe dauerte der Stromfluss 2

Sekunden. Sobald das Pferd eine Reaktion in Form von Abheben der betroffenen

Gliedmaße vom Boden zeigte, wurde die entsprechende Milliamperezahl im Protokoll

festgehalten.

Zur Evaluierung der individuellen Schmerzschwelle wurde vor der Applikation des

Detomidins mittels dreimaliger Messung die kleinste Strommenge bestimmt, die beim

Pferd zum Anheben der Gliedmaße führte. Der arithmetische Mittelwert dieser drei

Messungen wurde als Basiswert im Protokoll vermerkt.

3.2.4.7 Andere Beobachtungen

Zusätzliche Beobachtungen wurden nach ihrem Auftreten im Protokoll vermerkt.

Dazu zählten die Ataxie im Stand, Hängenlassen der Lippen, der Zunge, der

Augenlider, Ausschachten des Penis, Schwitzen, Speicheln sowie Tremor in

einzelnen Muskelgruppen.

3.2.4.8 Gewinnung, Messung und Aufbewahrung von Urinproben

Zu den im Anhang in den Tabellen 39 bis 42 angegebenen Zeitpunkten wurden die

Pferde zur Gewinnung von Spontanurin von der Stallgasse in den Laufstall geführt.

Die genaue Uhrzeit der Probennahme wurde im Versuchsprotokoll notiert.

Urinproben wurden bis zum 7. Tag p. a. gesammelt.

Für das Auffangen des Urins wurde eine Kunststoffhalterung verwendet, die an

einem etwa ein Meter langen Stiel befestigt war und in die für jede Probe ein

Einmalplastikbecher eingesetzt wurde. Dadurch konnte eine Kontamination der

Proben verhindert werden. Direkt anschließend fand die Messung des pH-Wertes


mittels Universalindikatorstäbchen 0 – 14® (Merck) und die Bestimmung der

Harndichte durch einen Urinprober (Urinometer®, Heiland, Hamburg) statt. Die

Ergebnisse wurden im Protokoll zur Zeit der jeweiligen Probe vermerkt.

Nach Durchmischen durch Schwenken wurden 100 ml der Probe in ein etikettiertes

Kunststoffgefäß überführt und verschlossen. Die Urinbehälter wurden im

Kühlschrank auf 8°C heruntergekühlt und am jeweiligen Versuchsabend in einen

Kühlraum mit –20°C eingelagert.

3.2.4.9 Transport der Plasma- und Urinproben

Der Transport der Plasma- und Urinproben in das Institut für Biochemie in Köln fand

in gefrorenem Zustand statt, wobei eine Temperatur von –15°C nicht überschritten

wurde.

3.3 Analytik

3.3.1 Methodenentwicklung Plasma und Urin

Da für die Untersuchung von Pferdeproben auf Detomidin kein Analyseverfahren zur

Verfügung stand, wurde im Rahmen dieser Studie eine Methode zur quantitativen

Bestimmung von Detomidin in den Matrices Pferdeplasma und -urin entwickelt. Dafür

standen die Proben aus dem Vorversuch zur Verfügung. Die Entwicklung und

Validierung der Methode sowie die Messung der Proben aus dem Vor- und

Hauptversuch erfolgte auf einem HPLC-System. Die Versuche zur

Methodenentwicklung wurden an einem LC-System mit UV-Detektion durchgeführt

(Hewlett Packard HP 1090 Liquid Chromatograph).

Zur Quantifizierung der Proben wurde mit einem HPLC/MS/MS-System (API 2000,

Perkin Elmer Sciex Instruments, gekoppelt mit einem Agilent Series 1100 Liquid

Chromatographen) gearbeitet.


3.3.1.1 Herstellung der Standardlösungen im Plasma

Für die quantitative Bestimmung wurden Lösungen von Detomidin und Medetomidin

(als interner Standard) benötigt. Als Einwaage für den Referenzstandard von

Detomidin wurde Detomidin-Hydrochlorid verwendet und alle Ausscheidungsproben

mit einem Korrekturfaktor von 0,8362967 multipliziert, da in der Messung durch das

HPLC/MS/MS-System das freie Detomidin (siehe Abbildung 7) angezeigt wird.

Dieser ergibt sich aus dem Verhältnis der Molekülmassen von Detomidin (M =

186,26) zu Detomidin-Hydrochlorid (M = 222,72).

Durch Einwiegen von 10 mg Detomidin-Hydrochlorid in einen 10 ml Messkolben

wurde eine 0,1 %ige Stammlösung in Methanol hergestellt. Durch wiederholte 1:10

Verdünnung mit Methanol entstanden aus der Stammlösung Arbeitslösungen mit

Konzentrationen von 1 µg/ml bis 100 µg/ml.

Für den internen Standard wurde eine 0,1 %ige Lösung (1 mg/ml) des Detomidin-

Derivates Medetomidin (siehe Abbildung 7) in Methanol hergestellt.

Ausgangssubstanz hierfür war die Injektionslösung Domitor® der Firma Pfizer,

Karlsruhe in einer Konzentration von 1 mg/ml. Daraus wurden durch zweifache 1:10

Verdünnungen mit Methanol eine Arbeitslösung mit einer Konzentration von 10 µg/ml

hergestellt.

CH3

CH3

HNN

DetomidinC12H14N2

186.25

CH3

CH3

HNN

CH3

MedetomidinC13H16N2

200.28

Abbildung 7: Struktur- und Summenformel, sowie molare Masse von Detomidin und Medetomidin


3.3.1.2 Herstellung der Standardlösungen im Urin

Für die quantitative Bestimmung im Urin wurden Lösungen von Detomidin,

Medetomidin, 3-Hydroxydetomidin (siehe Abbildung 8), Carboxydetomidin (siehe

Abbildung 8) und Imidazolylbenzoesäure (IBS, als interner Standard für

Carboxydetomidin, siehe Abbildung 8) benötigt. Die Lösungen von Detomidin und

Medetomidin wurden wie unter 3.3.1.1 beschrieben angefertigt. Aus 1 mg/ml

Stammlösungen des Hydroxy- und Carboxydetomidins wurden durch mehrfache 1:10

Verdünnungen Arbeitslösungen von 100 µg/ml bis 1 µg/ml in Methanol hergestellt.

Für den internen Standard des Carboxydetomidins wurde eine Stammlösung

(1 mg/ml) der strukturverwandten Imidazolylbenzoesäure in H2O, mit Salzsäure

angesäuert, hergestellt. Daraus wurden durch zweifache 1:10 Verdünnungen mit

H2O eine Arbeitslösung mit einer Konzentration von 10 µg/ml hergestellt.

CH3

OH

HNN

Hydroxy-DetomidinC12H14N2O

202.253-alpha-

Hydroxy-detomidin

CH3

O OH

HNN

Carboxy-DetomidinC12H12N2O2

216.233-Nor-3-

carboxy-detomidin

N

N

O OH

4-(1-Imidazolyl)-benzoesäureC10H8N2O2

188.18

Abbildung 8: Struktur- und Summenformel, sowie molare Masse von Hydroxy-, Carboxydetomidin

und Imidazolylbenzoesäure


3.3.1.3 Variation der Messmethode

Die Messungen am HPLC/UV-System dienten der Optimierung der Bedingungen für

die Identifizierung von Detomidin in der Flüssigkeitschromatographie. Hierzu wurden

unterschiedliche Säulen verwendet. Zum Einsatz kamen die LC-Säule CC125/3

Nucleosil 120-3 C18 (Machery und Nagel), die 5 µm LiChroCART® 250-4 RP-18

encapped Säule (Merck) und die Supercosil® LC-18-DB Säule mit den Maßen 7,5 x

4,6 x 3.

Die Wellenlänge wurde abhängig vom UV-Spektrum des jeweiligen Analyten

zwischen 200 und 280 nm gewählt, wobei Detomidin bei einer Wellenlänge von 210

nm am besten nachzuweisen war.

Als Lösungsmittel wurden zuerst Acetonitril und deionisiertes Wasser benutzt. Dabei

wurde ein Gemisch von 30 % Acetonitril und 70 % Wasser gewählt. Innerhalb von 15

Minuten wurde ein linearer Gradient auf 100 % Acetonitril gefahren. Weitere 3

Minuten wurde das System mit 100 % Acetonitril gespült bevor nach 2 Minuten der

Ausgangsgradient wieder erreicht wurde. Vor jeder Messung erfolgte eine

Equilibrierung des Gerätes über 4 Minuten mit dem Anfangsgradienten. Das

Injektionsvolumen der zu messenden Probenextrakte betrug 25 µl.

Die gewünschten Konzentrationen wurden durch Zusatz der entsprechenden

Volumina aus den Stammlösungen (siehe Punkt 3.3.1.1) in die Proben hergestellt.

Nach dem Einengen der methanolischen Phase am Rotationsvakuumverdampfer

über einem Wasserbad (50°C) wurde der Rückstand in 100 µl deionisiertem Wasser

aufgenommen, in Autosamplervials mit Inlet überführt und zur Messung in den

Autosampler des HPLC-Gerätes gestellt.

Keine der oben erwähnten Säulen erbrachte unter Verwendung der oben

aufgeführten Lösungsmittel eine eindeutige und reproduzierbare Darstellung von

Detomidin, woraufhin eine 3 µm LiChroCart® 55-4 Purpospher® STAR Säule (Merck)

zum Einsatz kam. Als Lösungsmittel wurde anstatt deionisiertem Wasser ein

Ammoniumacetatpuffer verwendet. Das Mischungsverhältnis betrug 95 %


Ammoniumacetatpuffer und 5 % Acetonitril. Nach 5 Minuten wurde das Verhältnis

auf 10 % Ammoniumacetat-Puffer und 90 % Acetonitril verändert, um nach 7 Minuten

die Ausgangszusammensetzung wieder zu erreichen. Die Veränderung der

Mischungsverhältnisse erfolgte linear. Nach 8 Minuten stoppte die Messung. Der

Lösungsmittelfluss wurde auf 1 ml/Minute eingestellt.

Durch den Wechsel der Säule sowie die Änderung des Lösungsmittels konnten die

Chromatographieeigenschaften von Detomidin verbessert werden. Störende Signale

aus der Biomatrix wurden abgetrennt und nahezu symmetrische Peakformen für

Detomidin erzielt.

3.3.1.4 Variation der Aufarbeitung und Extraktionsmethode

Plasma:

Um eine möglichst gute Ausbeute von Detomidin im Plasma zu erzielen, wurden die

Ergebnisse mehrerer Extraktionsmethoden miteinander verglichen. Zuerst wurde

versucht, Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen an Detomidin und

Medetomidin (als interner Standard) mittels Festphasenextraktion aufzuarbeiten.

Dabei wurden mit 1,5 ml Methanol und 1,5 ml deionisiertem Wasser konditionierte

Kartuschen (Chromabond® C18, Macherey und Nagel) verwendet. Nach Aufgeben

der Probe wurde mit 1,5 ml deionisiertem Wasser gespült. Die darauf folgenden

1,5 ml Methanol wurden in Spitzgläsern aufgefangen und am Rotations-

vakuumverdampfer über dem Wasserbad (50°C) eingeengt. Der Rückstand wurde in

100 µl Ammoniumacetatpuffer gelöst und am HPLC/UV-Gerät gemessen.

Versuche zu Flüssig-Flüssig-Extraktionen sollten zeigen, ob Ether ein geeignetes

organisches Lösungsmittel für die apolaren, basischen Verbindungen Detomidin und

Medetomidin darstellt. Um die Extraktionsausbeute zu optimieren, wurde der pH-

Wert variiert. Dabei wurde Proben auf drei verschiedene pH-Werte (7, 9.6, 14)

eingestellt und die Ausbeuten nach Messung im HPLC/UV miteinander verglichen.


Im Vergleich Festphasenextraktion zu Flüssig-Flüssig-Extraktion ergab sich für die

Flüssig-Flüssig-Methode ein besseres Extraktionsergebnis, vor allem bei pH 9,6 und

14. Allerdings wiesen die Chromatogramme der Proben bei pH 9,6 ein hohes

Untergrundrauschen auf, was auf endogene Substanzen zurückzuführen ist, die

überwiegend im neutralen bis schwach basischen pH-Bereich mit in die Etherphase

übergehen. Da diese Störsignale im pH-Bereich 14 wesentlich geringer ausfielen,

wurde dieser als optimaler pH-Wert für die Extraktionsmethode angesehen.

Mit diesen Ergebnissen wechselte die Messung der Proben auf eine HPLC/MS/MS,

die auch für die Messung der Hauptversuchsproben vorgesehen war, wobei die

Probenaufarbeitungsprozedur und Chromatographiebedingungen übernommen

wurden.

Urin:

Im Urin wurde eine Extraktionsmethode benötigt, die spezifisch für die Metaboliten

von Detomidin ist, da Detomidin fast vollständig zu zwei Metaboliten verstoffwechselt

wird. Der erste Metabolit (3-Hydroxydetomidin) stellt genau wie Detomidin eine

basische Verbindung dar, die basisch mit tertiärem Buthylmethylether extrahiert

werden könnte. Bei Carboxydetomidin, dem Hauptmetaboliten im Urin des Pferdes,

handelt es sich um eine saure Verbindung, so dass sowohl ein eigener interner

Standard gefunden werden als auch eine spezielle Extraktion erfolgen musste.

Als interne Standards wurden zuerst Furosemid, Ethacrynsäure und Probenecid

herangezogen. Für die Isolierung der sauren Verbindungen wurden Festphasen aus

unterschiedlichen Materialien getestet. Zunächst wurde der Urin über PAD-1-Säulen

(in Methanol gewaschen und in deionisiertem Wasser gelöst) ohne pH-

Werteinstellung aufgereinigt. Nach Aufgabe der entsprechenden Proben auf die

Säulen wurde ein Spülschritt mit deionisiertem Wasser vorgenommen und dann mit

Methanol versucht, die Substanzen von der Säule zu eluieren. Nach Einengung am

Rotationsvakuumverdampfer über dem Wasserbad (50°C) erfolgte die Aufnahme in


100 µl Ammoniumacetatpuffer und Messung im HPLC/MS/MS. Hierbei konnte keine

der sauren Substanzen detektiert werden. Auch nach Ansäuerung der Proben auf pH

2, 3 und 4 wurde keine Verbesserung der Ausbeute erreicht.

In einem weiteren Versuch kamen 3 ml Oasis® HLB Extraktionskartuschen (Waters,

Deutschland) zum Einsatz. Diese wurden nach einer Konditionierung mit Methanol

und deionisiertem Wasser mit 1 ml der Probenlösung beladen und mit 2 ml 5%igem

Methanol gewaschen. Eine Eluierung mit 4 ml Methanol führte nach Einengung und

Messung im HPLC/MS/MS zu einer guten Wiederfindung von Detomidin,

Medetomidin und 3-Hydroxydetomidin sowie einer geringen Menge

Carboxydetomidin. Furosemid, Ethacrynsäure und Probenicid waren nicht zu

messen. Um die Extraktionsausbeute für Carboxydetomidin zu verbessern, wurden

jetzt 6 ml Oasis® MCX Extraktionskartuschen (Waters, Deutschland) verwendet

(siehe Punkt 3.3.4 .4). Mit Hilfe dieser Ionenaustauschermatrix wurden hohe

Ausbeuten von Detomidin, Medetomidin und 3-Hydroxydetomidin in den ersten

beiden und von Carboxydetomidin im dritten Eluierschritt erzielt.

Furosemid, Ethacrynsäure und Probenecid waren als interner Standard für

Carboxydetomidin ungeeignet, da sie nicht zusammen mit Carboxydetomidin

eluierten. Um einen geeigneten internen Standard für Carboxydetomidin zu

bekommen, begann man am Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule

in Köln mit der Synthese von Carboxymedetomidin. Leider erwies sich diese als sehr

aufwendig, weshalb letztlich auf Imidazolylbenzoesäure zurückgegriffen wurde.

Diese zeigte aufgrund ihrer Strukturverwandtheit ein ähnliches Extraktionsverhalten

wie Carboxydetomidin und konnte ebenfalls im dritten Eluat mittels HPLC/MS/MS

detektiert werden.

Plasma und Urin:

Nach Aufarbeitung aller im Vorversuch genommenen Plasma- und Urinproben eines

Pferdes konnte eine Festlegung bezüglich der Dauer und Frequenz der


Probenentnahme für den Hauptversuch vorgenommen werden. Nach den

Ergebnissen des Vorversuches wurde die Probennahme für Blut auf 24 Stunden und

die für Urin auf Tag 7 p. a. beschränkt.

Die Voruntersuchungen gaben außerdem Aufschluss über die zu erwartenden Urin-

beziehungsweise Plasmakonzentrationen der einzelnen Analyten.

3.3.2 Validierung der Methode in Plasma und Urin

Unter Validierung versteht man den Nachweis und die Dokumentation der

Zuverlässigkeit einer analytischen Methode. Als ein Arbeitsinstrument der

Qualitätssicherung ist sie Voraussetzung für die quantitative Bestimmung der

Analyten. Zielstellung der Validierung ist letztendlich das Erreichen der notwendigen

Ergebnissicherheit innerhalb des Bestimmungsverfahrens. Voraussetzung für eine

Methodenvalidierung ist das Vorliegen einer bereits optimierten Methode. Im

Folgenden sind die Elemente der Validierung aufgeführt, wobei im Plasma Detomidin

und im Urin Hydroxy- und Carboxydetomidin validiert wurden.

3.3.2.1 Selektivität und Spezifität

Um die Spezifität der Methode für Detomidin, 3-Hydroxydetomidin und

Carboxydetomidin sowie der internen Standards Medetomidin und

Imidazolylbenzoesäure zu überprüfen, wurden Leerproben mit Proben, denen die

Substanzen zugesetzt waren, verglichen. Dabei wurde überprüft, ob die Analyten

ohne Verfälschung durch Matrixinhaltsstoffe (Spezifität) und ohne gegenseitige

Störungen bei ausreichender Trennung (Selektivität) erfasst werden konnten.


3.3.2.2 Überprüfung auf Linearität

Die Linearität einer Analysenmethode beschreibt die Proportionalität zwischen den

Messergebnissen und den theoretischen Konzentrationen. Sie gilt für einen

bestimmten Konzentrationsbereich. Durch die Untersuchung der Proben aus dem

Vorversuch konnte der zu erwartende Konzentrationsbereich abgeschätzt werden.

Die Aufarbeitung erfolgte mit Leermatrixproben, die mit unterschiedlichen

Konzentrationen der Analyten dotiert wurden. Dabei war die Abdeckung des

gesamten Messbereiches sowie die Äquidistanz der einzelnen Konzentrationsstufen

zu berücksichtigen. Jede Konzentration wurde doppelt und an drei unterschiedlichen

Tagen aufgearbeitet und gemessen. Die gewählten Konzentrationen für die Matrices

Plasma und Urin sind in Tabelle 5, 6 und 7 aufgeführt:

Matrix Konzentration von Detomidin in ng/ml

Plasma 2.5, 5, 10, 18, 25, 38, 50

Tabelle 5: Konzentration für Detomidin im Plasma zur Bestimmung der Kalibrationskurve

Matrix Konzentration von Hydroxydetomidin in ng/ml

Urin 10, 25, 50, 80, 100, 130, 160

Tabelle 6: Konzentration für 3-Hydroxydetomidin im Urin zur Bestimmung der Kalibrationskurve

Matrix Konzentration von Carboxydetomidin in ng/ml

Urin 50, 130, 250, 500, 800, 1200, 1600

Tabelle 7: Konzentration für Carboxydetomidin im Urin zur Bestimmung der Kalibrationskurve


Die erhaltenen Peakflächenverhältnisse von Analyt zu internem Standard wurden

gegen die Konzentration der Kalibratoren aufgetragen. Aus diesen Datenpunkten

wurden nach der Methode der kleinsten Abstandsquadrate die Kalibriergeraden

ermittelt und visuell auf Ausreißer und Linearität untersucht. Dabei durfte die aus den

Geraden zurückgerechnete Konzentration (back calculation) höchstens 15 %, die an

der unteren Bestimmungsgrenze (LLQC) höchstens 20 % von der theoretischen

Konzentration der Proben abweichen (EHSLC 2002).

3.3.2.3 Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, Limit of detection = LOD)

Die Nachweisgrenze beschreibt die niedrigste Konzentration eines Analyten, die

unter den beschriebenen Bedingungen ein vom Leerwert unterscheidbares

Instrumentensignal ergibt. Mit Hilfe der Kalibrationskurvenmethode nach DIN 32645

wird aus den Residuen der linearen Regression zunächst die Rest-

standardabweichung sx0 aus der Summe der Abweichungsquadrate Qx und den

Freiheitsgraden der linearen Kalibration f berechnet:

fQ

s xx =0

Mit Hilfe dieser Standardabweichung sx0 und dem Mittelwert X aller

Kalibrationskonzentrationen kann das Konfidenzintervall für den Merkmalswert Null

errechnet werden:

112

,00 ++⋅⋅=x

fx QX

ntsVB α

Der Term tf,α kann aus statistischen Tabellen entnommen errechnet werden:

);(, fTINVt f αα =


Mit Hilfe der Steigung a der linearen Regressionsgeraden kann die Nachweisgrenze

(NG) mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von α wie folgt errechnet werden:

α0VB

NG =

3.3.2.4 Bestimmungsgrenze (Limit of quantification = LOQ oder

Sensitivität)

Die Bestimmungsgrenze legt die niedrigste quantitativ bestimmbare Konzentration

einer zu analysierenden Substanz fest, wobei die unter Richtigkeit und Präzision

(siehe Punkt 3.3.2.5 und 3.3.2.6) behandelten Anforderungen gelten. Dabei darf die

Abweichung zwischen den gemittelten Messergebnissen der Konzentration und dem

theoretischen Wert nicht größer als 20 % sein. Zur Bestimmung des LOQ sind im

gewählten Konzentrationsbereich mindestens fünf Proben aufzuarbeiten und zu

quantifizieren.

3.3.2.5 Richtigkeit (Accuracy)

Richtigkeit ist das Maß der Übereinstimmung zwischen dem ermittelten Wert und

einem als richtig angesehenen Wert. Sie hängt von der Größe systematischer Fehler

ab. Ein Beispiel für einen systematischen Fehler wäre eine inkorrekte Einwaage bei

der Herstellung der Stammlösung des Analyten.

Zur Überprüfung der Richtigkeit wurden an drei Tagen jeweils 5 Leermatrixproben

mit einer hohen (HQC = High Quality Control Standard), einer niedrigen (LQC = Low

Quality Control Standard) sowie einer mittleren Kalibrationskonzentration (MQC =

Midrange Quality Control Standard) der Analyten dotiert und quantifiziert. Die

verwendeten Konzentrationen in Plasma und Urin sind Tabelle 8, 9 und 10 zu

entnehmen.



Plasma 2.5, 25, 50

Tabelle 8: Konzentrationen von Detomidin im Plasma zur Überprüfung der Richtigkeit


Urin 25, 80, 130

Tabelle 9: Konzentrationen von 3-Hydroxydetomidin im Urin zur Überprüfung der Richtigkeit


Urin 50, 500, 1200

Tabelle 10: Konzentrationen von Carboxydetomidin im Urin zur Überprüfung der Richtigkeit

Abweichungen der Ergebnisse vom erwarteten Wert sind bis zu einem gewissen

Maß akzeptabel. Als Grenzen gelten eine Abweichung von 15 % des gemessenen

vom erwarteten Wert im Bereich der hohen und mittleren Kalibrationskonzentration

und eine Abweichung von 20 % bei den niedrigen Konzentrationen (EHSLC 2002).

Zur Ermittlung der relativen Abweichung (= relativer Fehler = RE) des gemessenen

vom erwarteten Wert wird die mittlere berechnete Konzentration (A) aus n = 5 mit der

theoretischen Konzentration (B) nach folgender Formel berechnet (EHSLC 2002):

RE (%) = (A-B)/B x 100

3.3.2.6 Präzision

Präzision ist das Maß für die Streuung von Analysenergebnissen. Als Streuungsmaß

und damit als Präzisionsmaß wird die Standardabweichung s, die relative

Standardabweichung srel, die identisch mit dem Variationskoeffizienten Vk ist,


bezeichnet. Dabei unterscheidet man Wiederholpräzision sw (Tagespräzision oder

intraday repeatability) und Zwischenpräzision sb (interday reproducibility).

Zur Bestimmung der Präzision werden jeweils 5 HQC-, MQC- und LQC-Proben an 3

unterschiedlichen Tagen aufgearbeitet und quantifiziert.

Relativ zum gemessenen Mittelwert dürfen die Präzisionen um nicht mehr als 15 %

im Bereich der hohen und mittleren Kalibrationskonzentration beziehungsweise um

nicht mehr als 20 % bei den LQCs abweichen (EHSLC 2002).

HERBOLD und SCHMITT (2000) berechnen die Präzisionen wie folgt:

∑

∑ ⋅=

Tagesserie

TagesserieTagesseriew f

sfs

)( 2

Tage

gesamtTagesserie

b fXX

s ∑ −=

2)(

In den Formeln entspricht f den Freiheitsgraden, X dem Mittelwert und s der

Standardabweichung.

3.3.2.7 Stabilität

Um die Stabilität der Analyten in der jeweiligen Matrix für den gesamten Zeitraum

des Versuches, der Probenlagerung sowie der Analyse gewährleisten zu können,

wurden jeweils drei Konzentrationen (niedrig, mittel, hoch) durch Zusatz von

Leerplasma- und Leerurinproben mit Arbeitslösungen hergestellt. Am Tag der

Herstellung sowie nach 5 Wochen (Plasma) beziehungsweise nach 8 Wochen (Urin)

wurden jeweils eine Plasma- und Urinprobe der niedrigen, mittleren und hohen

Konzentration aufgearbeitet und zusammen mit einer entsprechenden

Kalibrationskurve quantifiziert. Die Proben werden unter denselben Bedingungen wie

die Proben des Ausscheidungsversuches bei –20°C gelagert.


In den Tabellen 11, 12 und 13 sind die Konzentrationen der Aliquote für die

Bestimmung der Stabilität aufgeführt:


Plasma 10, 50, 100

Urin 10, 40, 50

Tabelle 11: Konzentrationen von Detomidin in Plasma und Urin zur Untersuchung der Stabilität


Urin 50, 100, 250

Tabelle 12: Konzentrationen von 3-Hydroxydetomidin im Urin zur Untersuchung der Stabilität


Urin 100, 500, 1000

Tabelle 13: Konzentrationen von Carboxydetomidin im Urin zur Untersuchung der Stabilität

3.3.2.8 Wiederfindung (Recovery)

Die Wiederfindungsrate gibt den Prozentsatz der nach der Probenaufarbeitung und

Messung tatsächlich „wiedergefundenen“ Substanzmenge im Vergleich zur

theoretisch vorhandenen Menge an.

In der vorliegenden Studie wurde die Wiederfindung anhand einer mittleren

Konzentration des jeweiligen Analyten ermittelt. Dabei handelte es sich um 25 ng

Detomidin/ml Plasma und Urin, 50 ng 3-Hydroxydetomidin/ml Urin sowie 500 ng

Carboxydetomidin/ml Urin. Insgesamt wurden 12 Plasmaproben und 12 Urinproben

aufgearbeitet.


Dabei wurde den Proben 1 bis 6 der Analytenstandard in der ausgewählten

Konzentration vor Beginn der Aufarbeitung (siehe Punkt 3.3.4.3 für Plasma und

Punkt 3.3.4.4 für Urin) zugesetzt, während der entsprechende interne Standard erst

nach dem Einengen der Etherphase beziehungsweise des 3. Eluates am

Rotationsvakuumverdampfer hinzugegeben wurde. Um eine möglichst schonende

und verlustfreie Einengung des Methanols aus dem internen Standard zu erreichen,

wurden die Proben für ca. 30 Minuten in einen Exsikkator verbracht. Nach

vollständiger Trocknung wurden die Proben in 100 µl Ammoniumacetatpuffer

angelöst, in ein Autosamplervial überführt und am HPLC/MS/MS gemessen.

Die Plasma- beziehungsweise Urinproben 7 bis 12 wurden wie unter Punkt 3.3.4.3

und Punkt 3.3.4.4 beschrieben aufgearbeitet. Jedoch wurden die Analytenstandards

in der gewählten Konzentration sowie die internen Standards erst nach dem letzten

Aufarbeitungsschritt zum trockenen Probenextrakt hinzugegeben und wiederum im

Exsikkator getrocknet, aufgenommen und gemessen (DIN 17025). Die Berechnung

der Wiederfindung erfolgte nach nachfolgender Formel:

MW (Area d. Analyten/Area d. int. Std.) Proben 1 - 6MW (Area d. Analyten/Area d. int. Std.) Proben 7 - 12Wiederfindung [%] = x 100

3.3.3 Chromatographische Trennung und Detektion von Detomidin und seinen Metaboliten

3.3.3.1 Gerät und Gerätebedingungen

Zur Generierung der Massenspektren von Detomidin, 3-Hydroxydetomidin,

Medetomidin, Carboxydetomidin und Imidazolylbenzoesäure wurden Lösungen in

Ammoniumacetatpuffer hergestellt und mittels direkter Einspritzung auf einem API

2000 Triple-Quadrupole Massenspektrometer (Perkin-Elmer Sciex Instruments)

vermessen. Die Messung der Proben erfolgte durch Flüssigkeitschromatographie


(Agilent Series 1100 Liquid Chromatograph) und Tandem–Massenspektrometrie

unter folgenden Parametern:

Flüssigkeitschromatograph:

Säule: Li Chro CART® 55 x 4 Purospher® STAR 18e, 3 µm (Merck, Darmstadt)

Eluenten: A = 5 mM Ammoniumacetat in H2O, 0,1%ige Essigsäure

B = Acetonitril

Gradienten: 5 % B → 50 % B in 5 min.,

50 % B→100 % B in 4 min.,

Reinigung mit 100 % B für 1 min.,

Reequilibrierung mit 5 % B für 2 min.

Flussrate d. Gradienten: 1 ml/min.

Injektionsvolumen: 10 µl

Massenspektrometer:

Interface / Ionisierung: Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI)

Interface Temperatur: 400°C

Polarität: positiv

Scan-Modus: Multiple Reaction Monitoring (MRM)

Kollisionsgas: Stickstoff (N2), 2,0 x 10e-5 torr aus einem Whatman 75 –

72 K 727 Stickstoffgenerator

Kollisionsenergie: optimiert für jedes Produktion (siehe Tabelle 8)


In Tabelle 14 sind alle Analyten einschließlich zur Identifizierung ausgewählter

Ionenübergänge mit entsprechender Kollisionsenergie dargestellt.

Analyt Molekular-gewicht

Ionen-übergang

Kollisions-energie [eV]

Detomidin 186 187-81 373-Hydroxydetomidin 202 203-81 30

Medetomidin 200 201-95 35Carboxydetomidin 216 217-144 30

Imidazolylbenzoesäure 188 189-91 30

Tabelle 14: Molekulargewicht, Ionenübergang und Kollisionsenergie für die Substanzen Detomidin,

3-Hydroxydetomidin, Medetomidin, Carboxydetomidin und Imidazolylbenzoesäure

3.3.3.2 Reagenzien und Lösungsmittel

Sämtliche verwendeten Chemikalien sind Tabelle 15 zu entnehmen.


Reagenzien u. Lösungsmittel Bemerkungen HerstellerAcetonitril HPLC Grade Mallinckrodt Baker, Deventer

Ammoniaklösung 25%, p.a. Merck, DarmstadtAmmoniumacetat p.a. Merck, Darmstadt

2-Butanol p.a. Merck, Darmstadt

deionisiertes Wasser Elix Wasseraufbereitungssystem, Inst. f. Biochemie, DSHS

Detomidin Carboxysäure Farmos Group, Finland

Detomidin-Hydrochlorid European Pharmacopoeia, Strassbourg

Domitor Injektionslösung Pfizer, KarlsruheEssigsäure 100%, p.a. Merck, DarmstadtEthylacetat HPLC Grade Merck, Darmstadt

3-Hydroxydetomidin Farmos Group, Finland

Imidazolylbenzoesäure 97% Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen

Kaliumdihydrogenphosphat reinst Merck, DarmstadtKaliumdihydroxidplätzchen p.a. Merck, Darmstadt

Methanol destilliert Inst. f. BiochemieNatriumacetat p.a. Merck, Darmstadt

Salzsäure 100%, p.a. Merck, Darmstadt

tertiärer Butylmethylether destilliert KMF Laborchemie Handels GmbH, St. Augustin

Tabelle 15: Zur Aufarbeitung verwendete Chemikalien

3.3.4 Messung der Proben aus dem Hauptversuch

3.3.4.1 Erstellung der Kalibrationskurven im Plasma des Hauptversuches

Für jede Messung von Ausscheidungsproben des Hauptversuches wurde eine

Kalibrationskurve mit 9 Konzentrationen erstellt, wobei der gesamte in den Proben zu

erwartende Konzentrationsbereich abgedeckt wurde (EHSLC 2002). Die gewählten

Konzentrationen, die zugegebene Menge und die verwendeten Arbeitslösungen sind

in Tabelle 16 aufgeführt.


Konzentration in Zugabe Detomidin verwendete Lösung Eichkurve Detomidin

[ng/ml Plasma] [µl] [µg/ml]0 0 0

2,5 12,5 15 25 1

10 50 125 12,5 1050 25 1075 37,5 10

100 50 10130 62,5 10

Tabelle 16: Konzentrationen, verwendete Lösungen und Volumina zu Erstellung der

Kalibrationskurve von Detomidin im Plasma

Zur Überprüfung der Eichkurve auf ihre Tauglichkeit wurden in derselben

Aufarbeitungsprozedur jeweils 3 Konzentrationen als Qualitätskontrollen (QC)

doppelt aufgearbeitet und über die Kalibrationskurve quantifiziert (siehe Tabelle 17).

Konzentration in Zugabe Detomidin verwendete Lösung Eichkurve Detomidin

[ng/ml Plasma] [ng] [µg/ml]20 100 160 30 1090 45 10

Tabelle 17: Qualitätskontrollen zur Überprüfung der Kalibrationskurve von Detomidin im Plasma

Zu jeder Probe wurden 50 ng Medetomidin (10 ng/ml Plasmaprobe) als interner

Standard zugegeben. Die Medetomidinlösung lag in einer Konzentration von 1 µg/ml

Methanol vor, von der 50 µl zugegeben wurden.

Die Konzentrationsreihen wurde gemäß Punkt 3.3.4.3 aufgearbeitet und gemäß

Punkt 3.3.3.1 gemessen.


3.3.4.2 Erstellung der Kalibrationskurven im Urin

Mit Urin wurden Kalibrationskurven für Detomidin, 3-Hydroxydetomidin und

Carboxydetomidin hergestellt. Für Detomidin wurde eine Kurve mit 6

Konzentrationswerten 0, 10, 20, 30, 40 und 50 ng Detomidin/ml Urin erstellt. Die

Konzentrationen wurden in je 5 ml Pferdeurin wie in Tabelle 18 gezeigt hergestellt:

Konzentration Zugabe Detomidin verwendete Lösung Eichkurve Detomidin[ng/ml Urin] [µl] [µg/ml]

0 0 010 50 120 100 130 15 1040 20 1050 25 10


Kalibrationskurve von Detomidin im Urin

Für 3-Hydroxydetomidin wurde eine Kalibrationskurve mit 6 Konzentrationswerten 0,

25, 50, 100, 160, und 200 ng 3-Hydroxydetomidin/ml Urin nach folgendem Prinzip

(Tabelle 19) erstellt.

Konzentration Zugabe Hydroxy- verwendete Lösung Eichkurve Detomidin Hydroxydetomidin[ng/ml Urin] [µl] [µg/ml]

0 0 025 12,5 1050 25 10100 50 10160 80 10200 100 10

Tabelle 19: Konzentrationen, verwendete Lösungen und Volumina zu Erstellung

der Kalibrationskurve von 3-Hydroxydetomidin im Urin


Zur Überprüfung der Kalibrationskurven wurden in derselben Aufarbeitungsprozedur

zusätzlich jeweils die Konzentrationen 80, 120 und 180 ng 3-Hydroxydetomidin/ml

Urin als Qualitätskontrollen doppelt aufgearbeitet (siehe Tabelle 20).

Konzentration Zugabe Hydroxy- verwandte Lösung QC Detomidin Hydroxydetomidin

[ng/ml Urin] [µl] [µg/ml]80 40 10

120 60 10180 90 10

Tabelle 20: Qualitätskontrollen zur Überprüfung der Kalibrationskurven von 3-Hydroxydetomidin

Zu jeder dieser Proben wurden 50 ng Medetomidin (10 ng/ml Urinprobe) als interner

Standard zugegeben. Die Medetomidinlösung lag in einer Konzentration von 1 µg/ml

Methanol vor, von der 50 µl zugegeben wurden.

Für Carboxydetomidin wurden, wie in Tabelle 21 dargestellt, Kalibrationskurven mit 6

Konzentrationen 0, 50, 150, 500, 1000 und 1600 ng Carboxydetomidin/ml Urin

erstellt.

Konzentration Zugabe Carboxy- verwendete Lösung Eichkurve Detomidin Carboxydetomidin[ng/ml Urin] [µl] [µg/ml]

0 0 050 25 10

150 75 10500 25 100

1000 50 1001600 80 100


Kalibrationskurve von Carboxydetomidin im Urin

Auch hier wurden drei zusätzliche Konzentrationen als Qualitätskontrollen der

Kalibrationskurven zweifach in je 5 ml Pferdeurin aufgearbeitet (siehe Tabelle 22).


Konzentration Zugabe Carboxy- verwendete Lösung QC Detomidin Carboxydetomidin

[ng/ml Urin] [µl] [µg/ml]100 50 10300 15 100800 40 100

Tabelle 22: Qualitätskontrollen zur Überprüfung der Kalibrationskurven von Carboxydetomidin

Zu jeder Probe Carboxydetomidin wurden 1000 ng Imidazolylbenzoesäure (200

ng/ml Urinprobe) als interner Standard zugegeben. Die Imidazolylbenzoesäurelösung

lag in einer Konzentration von 10 µg/ml deionisiertem Wasser vor, von der 100 µl

zugegeben wurden.

3.3.4.3 Aufarbeitung der Plasmaproben

Alle Plasmaproben des Hauptversuches wurden innerhalb von 7 Tagen nach

Probennahme im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln nach

dem in Abbildung 9 dargestellten Schema aufgearbeitet.


Probenvorbereitung:

⇓ 5 ml Plasma im Zentrifugenschliffglas

⇓

+ 10 ng Medetomidin pro ml Probe als interner Standard (=50 µl einer methanolischen Lösung, die

1µg/ml Medetomidin enthält)

+ 400 µl 5 M KOH, schütteln (Vortex), mit pH-Papier überprüfen, gegebenenfalls mit KOH (5 M ) auf pH 14

einstellen

+ 5 ml tertiären Butylmethylether mit Stopfen versehen

⇓

20 Minuten schütteln und anschließend 5 Minuten bei 1800 rpm zentrifugieren

⇓ Etherphase mit Pasteurpipette in Spitzglas überführen,

am Rotationsvakuumverdampfer einengen ⇓

Etherphase trocknen, in 100 µl Ammoniumacetatpuffer anlösen (Vortex)

in Autosamplervials überführen und in das HPLC/MS-System stellen

Abbildung 9: Aufarbeitungschema für Detomidin im Plasma

3.3.4.4 Aufarbeitung der Urinproben ohne und mit Hydrolyse

Alle Urinproben des Hauptversuches wurden innerhalb von 8 Wochen nach

Probennahme im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln

aufgearbeitet. Da 3-Hydroxydetomidin und Carboxydetomidin im Urin teilweise als

Glucuronide vorliegen, wurden Urinproben auch vergleichend mit und ohne

Hydrolyse aufgearbeitet, um den Anteil an konjugiertem und freiem Detomidin, 3-

Hydroxydetomidin und Carboxydetomidin erfassen zu können.


Aufarbeitung ohne Hydrolyse

Die Aufarbeitung des Urins ohne Hydrolyse dient der Messung des unkonjugierten

Anteils von Detomidin, Hydroxy- und Carboxydetomidin und ist in Abbildung 10

dargestellt.

Probenvorbereitung: ⇓

5 ml Urin im Zentrifugenschliffglas ⇓

+ 10 ng Medetomidin pro ml Probe als

basischer interner Standard (= 50 µl einer methanolischen Lösung, die

1 µg/ml Medetomidin enthält)

+ 200 ng Imidazolylbenzoesäure pro ml Probe als saurer interner Standard

(= 100 µl einer wässrigen Lösung, die 10 µg/ml Imidazolylbenzoesäure enthält)

+ 200 µl HCl (6 M) hinzugeben, gegebenenfalls weiter je

50 µl hinzugeben um auf pH 3 einzustellen

⇓

10 Minuten bei 3000 rpm zentrifugieren

Überstand abnehmen, Sediment verwerfen

⇓

Waters Oasis MCX Cartridge mit 2 ml Methanol und 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 3 konditionieren

Urinprobe mit 1,5 ml pro Minute über die Säule laufen

lassen Durchlauf verwerfen

⇓

Abbildung 10: Aufarbeitungsschema von Urin ohne Hydrolyse


Cartridge mit 1 ml Essigsäure 1M waschen

Durchlauf verwerfen

⇓

Cartridge mit 6 ml Methanol waschen Durchlauf verwerfen

⇓

Cartridge mit 1ml deionisiertem H2O waschen Durchlauf verwerfen

Säulen in Vakuumkammer 2 min trockenziehen

⇓

Gemisch 1:

5 ml Ethylacetat-Ammoniak-Gemisch (97:3) über die Säule laufen lassen und im Zentrifugenschliffglas

auffangen

Am Rotationsvakuumverdampfer oder in der Vakuumzentrifuge einengen

⇓

Gemisch 2:

5 ml Acetonitril-Ammoniak-Gemisch (95:5) über die Säule laufen lassen und im o.g. Zentrifugenschliffglas

auffangen


⇓

Gemisch 3:

5 ml Butanol-Ammoniak-Gemisch (90:10) über die Säule laufen lassen und im o.g. Zentrifugenschliffglas

auffangen


⇓

weiter Abbildung 10


Eluat 1, 2 und 3

im o.g. Zentrifugenschliffglas in 100µl Ammoniumacetatpuffer anlösen (Vortex), mit

Glasspritze aufnehmen und in Autosamplervials überführen

weiter Abbildung 10

Aufarbeitung mit Hydrolyse durch ß-Glucoronidase/Arylsulfatase

Die Aufarbeitung des Urins mit Hydrolyse dient der Darstellung des freien und des

konjugierten Detomidins, Hydroxy- und Carboxydetomidins und erfolgte nach dem in

Abbildung 11 dargestelltem Schema:

Probenvorbereitung: ⇓

5 ml Urin im Zentrifugenschliffglas ⇓

+ 10 ng Medetomidin pro ml Probe als

basischer interner Standard (=50 µl einer methanolischen Lösung, die

1 µg/ml Medetomidin enthält)

+ 200 ng Imidazolylbenzoesäure pro ml Probe als saurer interner Standard

(= 100 µl einer wässrigen Lösung, die 10 µg/ml Imidazolylbenzoesäure enthält)

⇓

Abbildung 11: Aufarbeitungsschema von Urin mit Hydrolyse


+ 400 µl Na-Acetatpuffer,

schütteln (Vortex), mit pH-Papier auf pH 5 überprüfen,

gegebenenfalls mit Eisessig weiter einstellen

+ 50 µl ß-Glucoronidase/Arylsulfatase von Helix pomatia

schütteln (Vortex)

⇓

2 Stunden bei 50°C ins Wasserbad

abkühlen lassen

⇓

+ 200 µl HCl (6 M) hinzugeben, gegebenenfalls tropfenweise weiter hinzugeben um auf pH 3

einzustellen

⇓

5 Minuten bei 2100 rpm zentrifugieren

⇓

Waters Oasis® Cartridge mit 2 ml MeOH und 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 3 konditionieren

Durchlauf verwerfen

⇓

Urinprobe über die Säule geben und durchlaufen lassen

Durchlauf verwerfen

⇓

Cartridge mit 1 ml Essigsäure 1 M waschen

Durchlauf verwerfen

⇓ weiter Abbildung 11


Cartridge mit 6 ml Methanol waschen

Durchlauf verwerfen

⇓

Cartridge mit 1ml deionisiertem H2O waschen

Durchlauf verwerfen

⇓

Vakuumkammer ausleeren

Säulen auf Vakuumkammer 2 Minuten trockenziehen

⇓

Gemisch 1:

5 ml Ethylacetat-Ammoniak-Gemisch (97:3) über die Säule laufen lassen und im Zentrifugenschliffglas

auffangen

In der Vakuumzentrifuge für 40 Minuten bei 80°C einengen

⇓

Gemisch 2: 5 ml Acetonitril-Ammoniak-Gemisch (95:5) über die

Säule laufen lassen und im o.g. Zentrifugenschliffglas auffangen

In der Vakuumzentrifuge für 40 Minuten bei 80°C

einengen

⇓

Gemisch 3: 5 ml Butanol-Ammoniak-Gemisch (90:10) über die

Säule laufen lassen und im o.g. Zentrifugenschliffglas auffangen

Am Rotationsverdampfer ohne Wasserbad 60 Minuten

einengen, über Nacht im Exsikkator vollständig trocknen

⇓ weiter Abbildung 11


Eluat 1, 2 und 3

in 100 µl Ammoniumacetatpuffer anlösen (Vortex),

bei Trübung für 5 Minuten bei 1800 rpm zentrifugieren, in Autosamplervials überführen

für die Messung in das HPLC/MS/MS stellen

weiter Abbildung 11

3.4 Pharmakokinetische Auswertung (Methode und Software)

Alle pharmakokinetischen Auswertungen basieren auf den durch Einfachbestimmung

ermittelten Konzentrationswerten der einzelnen Plasmaproben von Cmax bis zur

Quantifizierungsgrenze. Die Bestimmung der kinetischen Parameter im Plasma

erfolgte mit Hilfe des Computerprogrammes TOPFIT® 2.0 (HEINZEL et al., 1993).

Aufgrund der Anzahl der Messdaten wurde ein Ein-Kompartiment-Modell für die

Berechnung verwendet und folgende Parameter angegeben:

b1 [1/h] = Eliminationskonstante

t50(b1) [h] = Eliminationshalbwertszeit

MRT(tot) [h] = Mean Residue Time (totale Verweildauer eines Moleküls im Organismus)

Cl [ml/min] = totale Clearance

Vc [l] = Verteilungsvolumen im zentralen Kompartiment

AUC [ng/ml*h] = Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve

Cmax(gem) [ng/ml] = maximale gemessene Plasmakonzentration

tmax(gem) [ng/ml] = Zeitpunkt der maximalen gemessenen Plasma-konzentration


Weiterhin dienten die erhaltenen Daten zur Berechnung der effektiven und

irrelevanten Plasma- und Urinkonzentrationen nach dem Modell von TOUTAIN und

LASSOURD (2002) und der Bestimmung von Ausscheidungszeiten.

3.5 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit dem Programm SAS®. Die Daten

für Herzfrequenz, Atemfrequenz und Körpertemperatur, sowie die Ergebnisse der

Kopftiefhaltung, des akustischen, visuellen und des Stromreizes wurden mittels

Shapiro-Wilk-Test auf Normalverteilung überprüft.

Für die normalverteilten Parameter wurden die Werte nach Applikation des

Arzneimittels mittels T-Test für verbundene Stichproben gegen den jeweiligen

Basiswert (dreifach gemessen zum Zeitpunkt p0) verglichen und auf Signifikanz

überprüft.

Die nicht normalverteilten Parameter wurden mittels Signed-Rank-Test gegen den

p0-Wert verglichen und auf Signifikanz überprüft.

Die Signifikanzschwelle sämtlicher statistischer Tests wurde auf p ≤ 0,01 festgelegt.

82 ERGEBNISSE

50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100% 81.2

187.2

119.2

91.1 117.2

m/z

Rel

ativ

e In

tens

ität

N N

CH2m/z 81

4 ERGEBNISSE

4.1 Massenspektren und Strukturformeln der zu analysierenden Substanzen und der internen Standards

Nachfolgend sind die Massenspektren und Strukturformeln einschließlich der

Fragmentation der einzelnen Analyten Detomidin, 3-Hydroxydetomidin und

Carboxydetomidin aufgeführt. Die als interne Standards verwendeten Substanzen

Medetomidin und Imidazolylbenzoesäure werden mit ihren Strukturformeln

dargestellt.

4.1.1 Detomidin

Unter den in Kapitel 3.3.3.1 angegebenen HPLC-Bedingungen lag die Retentionszeit

von Detomidin bei 4,1 Minuten. Das Massenspektrum in Abbildung 12 zeigt das

typische Fragmentierungsverhalten von Detomidin mit charakteristischen Ionen bei

m/z 187,2 und 81,2 sowie die Strukturformel von Detomidin.

Abbildung 12: ESI-Produktionenspektrum des Detomidins (Molekülmasse = 186)

ERGEBNISSE 83

50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210m/z

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Rel

ativ

e In

tens

ität

185.3

81.2 170.2203.3173.2158.3143.2117.2 183.2141.1

N N

CH2

OH

m/z 81

4.1.2 3-Hydroxydetomidin

Unter den in Kapitel 3.3.3.1 angegebenen HPLC-Bedingungen lag die Retentionszeit

von 3-Hydroxydetomidin bei 2,6 Minuten. Es wird mit den charakteristischen Ionen

bei m/z 203,3 und 81,2 registriert. Abbildung 13 zeigt das Massenspektrum und die

Strukturformel.

Abbildung 13: ESI-Produktionenspektrum des 3-Hydroxydetomidins (Molekülmasse = 202)

4.1.3 Medetomidin

Das als interner Standard verwendete Medetomidin zeigt unter den in Kapitel 3.3.3.1

angegebenen HPLC-Bedingungen eine Retentionszeit von 4,4 Minuten und wird mit

den charakteristischen Ionen m/z 201,0 und 95,0 aufgezeichnet. Abbildung 14 zeigt

die Strukturformel von Medetomidin. Es diente als interner Standard in der Methode

für Detomidin im Plasma und 3-Hydroxydetomidin im Urin.

84 ERGEBNISSE

50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220

81.1

199.1

144.0217.1

103.2 171.0111.0 154.9

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

m/z

Rel

ativ

e In

tens

ität

N N

CH2

COOH

m/z 81

CH3

CH3

HNN

CH3

MedetomidinC13H16N2

200.28

Abbildung 14: Strukturformel von Medetomidin mit Summenformel und Molekülmasse

4.1.4 Carboxydetomidin

Carboxydetomidin zeigt unter den in Kapitel 3.3.3.1 angegebenen HPLC-

Bedingungen eine Retentionszeit von 1,8 Minuten und wird mit den

charakteristischen Ionen m/z 217,1 und 144,0 aufgezeichnet. Abbildung 15 zeigt das

Massenspektrum von Carboxydetomidin mit Strukturformel.

Abbildung 15: ESI-Produktionenspektrum des Carboxydetomidins (Molekülmasse 216)

ERGEBNISSE 85

4.1.5 Imidazolylbenzoesäure

Imidazolylbenzoesäure diente als interner Standard in der Methode für

Carboxydetomidin im Urin. Unter den in Kapitel 3.3.3.1 angegebenen HPLC-

Bedingungen lag die Retentionszeit von Imidazolylbenzoesäure bei 1,3 Minuten.

Abbildung 16 zeigt die Strukturformel von Imidazolylbenzoesäure. Sie wurde mit den

charakterisitschen Ionen m/z 189,0 und 91,0 aufgezeichnet.

N

N

O OH

4-(1-Imidazolyl)-benzoesäureC10H8N2O2

188.18

Abbildung 16: Strukturformel von Imidazolylbenzoesäure mit Summenformel und Molekülmasse

4.2 Ergebnisse der Validierung

4.2.1 Selektivität und Spezifität

Um die Spezifität der Methode für Detomidin, 3-Hydroxydetomidin und

Carboxydetomidin sowie für die internen Standards Medetomidin und

Imidazolylbenzoesäure zu überprüfen, wurden Plasma- und Urinproben, denen die

Substanzen zugesetzt waren, untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass die

Analyten ohne Verfälschung durch Matrixinhaltsstoffe (Spezifität) und ohne

gegenseitige Störungen bei ausreichender Trennung (Selektivität) erfasst werden.

86 ERGEBNISSE

Unter den Messbedingungen waren die Retentionszeiten über den gesamten Verlauf

der Studie in einer Schwankungsbreite von ≤ 2 % konstant.

Abbildung 17 und 18 zeigen Ausschnitte aus Chromatogrammen zum Zeitpunkt der

Retentionszeit von Detomidin (als Beispiel einer Substanz im Plasma) bei 4,1

Minuten sowie zur Retentionszeit von Carboxydetomidin (als Beispiel einer Substanz

im Urin) bei 1,4 Minuten und Leerwertmatrixproben im Vergleich.

Abbildung 17: HPLC/MS/MS-Chromatogramme von Plasmaproben zur Retentionszeit von 4,1

Minuten, denen kein Detomidin, 2,5 ng Detomidin/ml und 50 ng Detomidin/ml

zugegeben wurden (von l. nach r.)

Abbildung 18: PLC/MS/MS-Chromatogramme von Urinproben zur Retentionszeit von 1,4 Minuten,

denen kein Carboxydetomidin, 50 ng Carboxydetomidin/ml und 1200 ng

Carboxydetomidin/ml zugegeben wurden (von l. nach r.)

ERGEBNISSE 87

4.2.2 Überprüfung auf Linearität

Plasma

Die Linearität der Kalibrationskurven für Detomidin im Plasma wurde im

Konzentrationsbereich von 2,5 bis 50 ng/ml an verschiedenen Tagen überprüft und

festgestellt. Dabei wurde die erwartete Konzentration des Analyten gegen den

Quotienten der Peakflächen von Detomidin zu internem Standard (Medetomidin)

aufgetragen. Die Funktion wurde mit linearer Regression errechnet. Abbildung 19

zeigt beispielhaft eine Kalibrationskurve, die Kalibrationsgleichung und den

Korrelationskoeffizienten (Bestimmtheitsmaß = R2) eines Messtages. Die Ab-

weichungen der gemessenen von der erwarteten Konzentration betrugen an allen

Messtagen im Durchschnitt weniger als 15 %, im Bereich der Quantifizierungsgrenze

weniger als 20 %. Das Bestimmtheitsmaß der linearen Regression (R2) lag bei allen

Kalibrationskurven oberhalb von 0.995.

y = 0,1304x - 0,0622R2 = 0,9984

0

1

2

3

4

5

6

7

0 10 20 30 40 50Detomidin-Hydrochlorid [ng/ml Plasma]

Quo

tient

[187

/201

]

Abbildung 19: Kalibrationskurve, Kalibrationsgleichung und Regressionskoeffizient zur Überprüfung

der Linearität für Detomidin im Plasma, ermittelt mit 2 Messungen pro

Kalibrationskonzentration

88 ERGEBNISSE

Urin

Die Linearität der Kalibrationskurven für 3-Hydroxydetomidin im Urin wurde im

Konzentrationsbereich von 10 bis 160 ng/ml und die von Carboxydetomidin im

Bereich von 50 bis 1600 ng/ml Urin an Kalibrationskurven an verschiedenen Tagen

überprüft und festgestellt. Dabei wurde die erwartete Konzentration der Analyten

gegen den Quotienten der Peakflächen von 3-Hydroxydetomidin und

Carboxydetomidin zu internem Standard (Medetomidin beziehungsweise

Imidazolylbenzoesäure) aufgetragen. Die Funktion wurde mit linearer Regression

errechnet.

Abbildung 20 und 21 zeigen beispielhaft eine Kalibrationskurve, die Kalibrations-

gleichung und den Korrelationskoeffizienten von Hydroxy- und Carboxydetomidin

eines Messtages. Die Abweichungen der gemessenen von der erwarteten

Konzentration betrugen an allen Messtagen im Durchschnitt weniger als 15 %, im

Bereich der Quantifizierungsgrenze weniger als 20 %. Das Bestimmtheits-maß (R2)

der Regression lag bei allen Kalibrationskurven von 3-Hydroxydetomidin oberhalb

von 0.993, bei denen von Carboxydetomidin oberhalb von 0.996.

ERGEBNISSE 89

y = 0,0834x + 0,3278R2 = 0,9954

0

2

4

6

8

10

12

14

0 40 80 120 160Hydroxydetomidin [ng/ml Urin]

Quo

tient

[203

/201

]


der Linearität für 3-Hydroxydetomidin im Urin, ermittelt mit 2 Messungen pro


y = 0,0032x + 0,0164R2 = 0,9976

0

1

2

3

4

5

6

0 400 800 1200 1600Carboxydetomidin [ng/ml Urin]

Quo

tient

[217

/188

]


der Linearität für Carboxydetomidin im Urin; ermittelt mit 2 Messungen pro


90 ERGEBNISSE

4.2.3 Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, Limit of detection, LOD)

Plasma

Die Nachweisgrenze von Detomidin im Plasma wurde wie unter Punkt 3.3.2.3

beschrieben ermittelt. Sie liegt bei der in der Studie verwendeten Methode bei

1,67 ng/ml Plasma.

Urin

Die Nachweisgrenze von 3-Hydroxydetomidin im Urin beträgt bei der in der Studie

verwendeten Methode 10 ng/ml. Für Carboxydetomidin wurde eine Nachweisgrenze

von 50 ng/ml Urin ermittelt.

4.2.4 Bestimmungsgrenze (Limit of quantification, LOQ)

Plasma

Aufgrund der Ergebnisse von Präzision und Richtigkeit wurde die

Bestimmungsgrenze für Detomidin im Plasma in der angewandten Methode auf

2,09 ng/ml festgelegt.

Urin

Aufgrund der Ergebnisse von Präzision und Richtigkeit wurde die

Bestimmungsgrenze für 3-Hydroxydetomidin im Urin auf 10 ng/ml und für

Carboxydetomidin auf 50 ng/ml festgelegt.

ERGEBNISSE 91

4.2.5 Richtigkeit (Accuracy)

Plasma

Die Ergebnisse zur Überprüfung der Richtigkeit der Analysemethode im Plasma sind

in Tabelle 23 angegeben. Dabei wurden jeweils die relative Abweichung (RE in %)

der Mittelwerte der gemessenen Konzentrationen eines Tages von den erwarteten

Konzentrationen bestimmt. Alle Ergebnisse liegen unterhalb der vorgegebenen

maximalen Abweichung von 15 %, beziehungsweise unterhalb 20 % an der Quanti-

fizierungsgrenze.

Tag

Erwartete Konzentration

Detomidin-Hydrochlorid

[ng/ml]


Detomidin [ng/ml]

Anzahl der

Proben

Mittelwert der gemessenen

Konzentrationen Detomidin

[ng/ml]

Relative Abweichung

RE [%]

2,5 2,09 5 2,03 2,9225 20,91 5 20,81 0,4650 41,82 5 40,67 2,742,5 2,09 5 1,78 14,8425 20,91 5 20,88 0,1350 41,82 5 44,53 6,502,5 2,09 5 2,18 4,4025 20,91 5 19,95 4,5550 41,82 5 42,25 1,05

2

3

1

Tabelle 23: Relative Abweichung (RE) zur Dokumentation der Richtigkeit der Methode für Detomidin

im Plasma

Urin

Die Ergebnisse zur Überprüfung der Richtigkeit im Urin sind in den Tabellen 24 und

25 angegeben. Auch hier wurden jeweils die relative Abweichung (RE in %) der

Mittelwerte der gemessenen Konzentrationen eines Tages von den erwarteten

Konzentrationen bestimmt. Alle Ergebnisse bis auf eines liegen unterhalb der

92 ERGEBNISSE

vorgegebenen maximalen Abweichung von 15 % beziehungsweise maximal 20 % an

der Quantifizierungsgrenze.

TagErwartete

Konzentration [ng/ml]

Anzahl der Proben


Konzentrationen [ng/ml]

Relative Abweichung

RE [%]

25 5 22,58 9,6780 5 85,11 6,39

130 5 123,65 4,8825 5 25,85 3,4080 5 85,30 6,63

130 5 137,13 14,2825 5 26,21 4,8480 5 80,99 1,24

130 5 130,89 0,69

1

2

3

Tabelle 24: Relative Abweichung (RE) zur Dokumentation der Richtigkeit der Methode für

3-Hydroxydetomidin im Urin

TagErwartete


Anzahl der Proben


Konzentrationen [ng/ml]

Relative Abweichung

RE [%]

50 5 51,36 2,72500 5 522,68 4,54

1200 5 1298,78 8,2350 5 50,53 1,06

500 5 590,24 18,051200 5 1272,21 6,02

50 5 50,80 1,60500 5 529,68 5,94

1200 5 1296,25 8,02

1

2

3

Tabelle 25: Relative Abweichung (RE) zur Dokumentation der Richtigkeit der Methode für

Carboxydetomidin im Urin

4.2.6 Präzision

ERGEBNISSE 93

Plasma

Die Ergebnisse zur Bestimmung der Präzision der Methode für Plasma sind Tabelle

26 zu entnehmen. Die Wiederholpräzision und die Zwischenpräzision wurden wie

unter Punkt 3.3.2.6 beschrieben ermittelt. Die Werte liegen unterhalb der

vorgeschriebenen Abweichungen von nicht mehr als 15 %, an der Quantifi-

zierungsgrenze nicht mehr als 20 %, vom gemessenen Mittelwert.


[ng/ml]

Wiederholpräzision [%]

Zwischenpräzision [%]

2,5 3,99 10,16

25 5,15 2,5

50 5,01 4,57

Tabelle 36: Wiederholpräzision und Zwischenpräzision der Methode für Plasma

Urin

Die Ergebnisse zur Bestimmung der Präzision der Methode für Urin sind den

Tabellen 27 und 28 zu entnehmen. Die Wiederholpräzision und die Zwischen-

präzision wurden wie unter Punkt 3.3.2.6 beschrieben ermittelt. Die Werte liegen

unterhalb der vorgeschriebenen Abweichungen von nicht mehr als 15 %, an der

Quantifizierungsgrenze nicht mehr als 20 %, vom gemessenen Mittelwert.

Erwartete Konzentration [ng/ml]



25 9,57 8,03

80 8,85 2,91

120 6,81 5,17

Tabelle 27: Wiederholpräzision und Zwischenpräzision der Methode für 3-Hydroxydetomidin im Urin

94 ERGEBNISSE

Erwartete Konzentration [ng/ml]



50 13,93 0,84

500 7,46 6,79

1200 4,50 1,14

Tabelle 28: Wiederholpräzision und Zwischenpräzision der Methode für Carboxydetomidin im Urin

4.2.7 Stabilität

Plasma

Am Tag der Herstellung sowie nach 5 Wochen wurden Plasmaproben, denen

Detomidin jeweils in einer niedrigen, einer mittleren und einer hohen Konzentration

zugegeben worden war, aufgearbeitet und zusammen mit einer entsprechenden

Kalibrationskurve quantifiziert. Die Ergebnisse sind Tabelle 29 zu entnehmen.

gemessene Konzentration

[ng/ml]Abweichung [%]



10 10,22 2,21 9,01 9,92

50 45,89 8,22 48,74 2,52

100 97,37 2,63 92,64 7,36

Woche 5Woche 0erwartete


Tabelle 29: Stabilitätsdaten für Detomidin im Plasma in Woche 0 und Woche 5

Urin

Am Tag der Herstellung sowie nach 8 Wochen wurde Urinproben, denen Detomidin,

Hydroxy- beziehungsweise Carboxydetomidin jeweils in einer niedrigen, einer

mittleren und einer hohen Konzentration zugegeben worden war, aufgearbeitet und

zusammen mit einer entsprechenden Kalibrationskurve quantifiziert. Die Tabellen 30,

ERGEBNISSE 95

31 und 32 zeigen die Ergebnisse des Stabilitätstests für Detomidin, 3-

Hydroxydetomidin und Carboxydetomidin im Urin.





10 10,91 9,15 10,77 7,67

40 36,74 8,16 43,08 7,69

50 47,17 5,66 55,14 10,29

erwartete Konzentration

[ng/ml]

Woche 0 Woche 8

Tabelle 30: Stabilitätsdaten für Detomidin im Urin in Woche 0 und Woche 8





50 52,17 4,35 47,94 4,11

100 95,13 4,87 107,11 7,11

250 265,65 6,26 246,08 1,57


[ng/ml]

Woche 0 Woche 8

Tabelle 31: Stabilitätsdaten für 3-Hydroxydetomidin im Urin in Woche 0 und Woche 8





100 104,45 4,45 85,69 14,31

500 507,8 1,56 622,47 24,49

1000 966,02 3,4 1044,35 4,44


[ng/ml]

Woche 0 Woche 8

Tabelle 32: Stabilitätsdaten für Carboxydetomidin im Urin in Woche 0 und Woche 8

4.2.8 Wiederfindung (Recovery)

96 ERGEBNISSE

Die Wiederfindungsrate von Detomidin im Plasma beziehungsweise Urin und von

Hydroxy-, sowie Carboxydetomidin im Urin sind in Tabelle 33 dargestellt.

Matrix Substanz Anzahl der Proben

Mittlere Wiederfindungsrate

[%]

Standard-abweichung [%]

Variations-koeffizient [%]

Plasma Detomidin 6 49,41 7,86 15,87

Detomidin 6 69,49 5,59 8,04

Hydroxy-detomidin 6 63,74 8,83 13,78

Carboxy-detomidin 6 63,44 10,96 17,08

Urin

Tabelle 33: Wiederfindungsrate für Detomidin in Plasma und Urin sowie Hydroxy- und Carboxy-

detomidin im Urin

4.3 Ergebnisse des Hauptversuchs

4.3.1 Konzentration von Detomidin im Plasma

Abbildung 22 zeigt den Konzentrationsverlauf von Detomidin im Plasma nach

einmaliger intravenöser Gabe von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei allen 10

Versuchspferden. Die Quantifizierung erfolgte jeweils anhand einer tagesaktuellen

Kalibrationskurve. Die rote Querlinie stellt die Bestimmungsgrenze (LOQ) von 2,09

ng/ml Plasma dar. Die Ausschnittsgraphik verdeutlicht den Konzentrationsverlauf in

den ersten 30 Minuten. Nach einer Stunde ist die Konzentration von Detomidin

bereits fast bis in den Bereich der Quantifizierungsgrenze abgesunken. Nach 3

Stunden lagen die Konzentrationen bei allen Pferden unterhalb der Nachweisgrenze.

Die bei den einzelnen Pferden gemessenen Konzentrationen zu den jeweiligen

Messzeitpunkten sind im Anhang in Tabelle 38 dargestellt.

ERGEBNISSE 97

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3Zeit [h]

Kon

zent

ratio

n [n

g/m

l Pla

sma]

Pferd 1Pferd 2Pferd 3Pferd 4Pferd 5Pferd 6Pferd 7Pferd 8Pferd 9Pferd 10LOQ

Abbildung 22: Plasmakonzentrationsverlauf von Detomidin nach einmaliger intravenöser Applikation

von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 10 Pferden

Maximale Plasmakonzentrationen werden während der ersten beiden

Messzeitpunkte (2 und 5 Minuten p. a.) gemessen und liegen zwischen 12 und 35

ng/ml Plasma. Auffällig hierbei ist, dass bei fünf Pferden die maximale individuelle

Konzentration nach 2 Minuten, bei den anderen Pferden aber erst nach 5 Minuten

erreicht ist.

Zur übersichtlicheren Darstellung dieses Ergebnisses zeigen die Abbildungen 23 und

24 die Plasmakonzentrationsverläufe der Pferde getrennt nach dem Zeitpunkt der

maximalen Konzentration von Detomidin. Auch hier verdeutlichen die Ausschnitte die

Konzentrationsverläufe in den ersten 30 Minuten nach der Applikation des

Arzneistoffes.

05

10152025303540

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

98 ERGEBNISSE

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3Zeit [h]

Kon

zent

ratio

n [n

g/m

l Pla

sma]

Pferd 4

Pferd 5Pferd 6

Pferd 8Pferd 10

LOQ


von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 5 Pferden mit maximaler Plasma-

konzentration 2 Minuten p.a.

05

10152025303540

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

ERGEBNISSE 99

0

5

10

15

20

25

30

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3Zeit [h]

Kon

zent

ratio

n [n

g/m

l Pla

sma]

Pferd 1Pferd 2Pferd 3Pferd 7Pferd 9LOQ


von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 5 Pferden mit maximaler Plasma-

konzentration 5 Minuten p.a.

Abbildung 25 zeigt zusätzlich den Plasmakonzentrationsverlauf aller Pferde in

halblogarithmischer Darstellung.

0

5

10

15

20

25

30

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

100 ERGEBNISSE

1

10

100

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1Zeit [h]

Kon

zent

ratio

n [n

g/m

l]



von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg Körpermasse bei 10 Pferden in halb-

logarithmischer Darstellung

4.3.2 Pharmakokinetik von Detomidin im Plasma

Aufgrund des monoexponentiellen Verlaufs erfolgte die pharmakokinetische

Berechnung mit dem Ein-Kompartiment-Modell. Die Daten der pharmakokinetischen

Berechnung für Detomidin im Plasma sind in Tabelle 34 aufgeführt. Die Berechnung

erfolgte mit den Konzentrationswerten von Cmax bis zur Quantifizierungsgrenze.

In Tabelle 34 ist jeweils der niedrigste und höchste erreichte Wert durch Fettdruck

gekennzeichnet.

ERGEBNISSE 101

Parameter Einheit Pferd 1

Pferd 2

Pferd 3

Pferd 4

Pferd 5

Pferd 6

Pferd 7

Pferd 8

Pferd 9

Pferd 10

b1 [1/h] 2,10 2,20 2,59 1,79 2,22 1,89 2,14 2,79 2,79 2,83t50 (b1) [h] 0,33 0,32 0,27 0,39 0,31 0,37 0,32 0,25 0,25 0,25MRT(tot) [h] 0,52 0,49 0,43 0,59 0,47 0,55 0,51 0,37 0,39 0,37

Vc [l/kg] 0,78 0,83 0,55 0,78 0,62 0,78 0,83 0,72 0,66 0,46Clearance [ml/min] 27,20 30,40 23,90 23,20 22,90 24,70 29,60 33,50 30,60 21,80

AUC [ng/ml*h] 10,30 9,19 11,70 12,10 12,20 11,30 9,44 8,33 9,13 12,80Cmaxgem [ng/ml] 20 18 28 22 27 22 18 22 22 35Tmaxgem [min] 5 5 5 2 2 2 5 2 5 2

Tabelle 34: Pharmakokinetische Daten nach einmaliger Applikation von 20 µg/kg Detomidin-

Hydrochlorid bei 10 Pferden (der niedrigste und der höchste Wert sind jeweils durch

Fettdruck hervorgehoben)

Erläuterungen zu den Abkürzungen in Tabelle 34 und 35

b1 Eliminationskonstante

t50 (b1) Halbwertszeit für die Eliminationsphase

MRT mittlere Verweildauer

Vc Verteilungsvolumen im zentralen Kompartiment

Clearance Plasmamenge, die pro Minute von Detomidin befreit wird

AUC Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve

Cmaxgem maximale gemessene Plasmakonzentration

Tmaxgem gemessenerZeitpunkt der maximalen Plasmakonzentration

In Tabelle 35 sind die Ergebnisse der pharmakokinetischen Berechnung für

Detomidin im Plasma als Mittelwert, Standardabweichung und der

Variationskoeffizient angegeben.

102 ERGEBNISSE

Parameter Einheit Mittelwert [n=10]

Standard-abweichung

Variations-koeffizient

b1 [1/h] 2,33 0,39 16,56

t50 (b1) [h] 0,30 0,05 16,71

MRT(tot) [h] 0,47 0,08 16,39

Vc [l/kg] 0,70 0,12 17,77

Clearance [ml/min] 26,78 4,03 15,05

AUC [ng/ml*h] 10,65 1,57 14,70

Cmaxgem [ng/ml] 23,40 5,23 22,36

Tmaxgem [min] 3,50 1,58 45,18

Tabelle 35: Pharmakokinetische Daten nach einmaliger Applikation von 20 µg/kg Detomidin-

Hydrochlorid bei 10 Pferden mit Darstellung von Mittelwert, Standardabweichung und

Korrelationskoeffizient (Erläuterungen zu den Abkürzungen siehe Tabelle 34)

4.3.3 Detomidin im Urin

Bereits im Vorversuch wurde deutlich, dass Detomidin nicht oder nur in nicht

quantifizierbaren Mengen im Urin des Pferdes messbar ist. Auf Grund dessen wurde

auf eine Validierung der Methode für Detomidin im Urin verzichtet. Während des

Hauptversuches wiesen nur frühe Urinproben gelegentlich Spuren von Detomidin

auf. Diese Mengen waren nicht quantifizierbar.

4.3.4 3-Hydroxydetomidin im Urin

Abbildung 26 stellt den Konzentrationsverlauf von 3-Hydroxydetomidin im Urin bis 50

Stunden nach der einmaligen Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM

dar. Der Ausschnitt verdeutlicht den Verlauf der Konzentrationskurven in den ersten

25 Stunden. Die rote Querlinie stellt die Quantifizierungsgrenze von 10 ng/ml dar.

ERGEBNISSE 103

0

20

40

60

80

100

120

140

0 10 20 30 40 50Zeit [h]

Kon

zent

ratio

n [n

g/m

l Urin

]


Abbildung 26: Konzentrationsverlauf von 3-Hydroxydetomidin im Urin nach einmaliger intravenöser

Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 10 Pferden (Auf-

arbeitung mit Hydrolyse)

Die maximalen Konzentrationen liegen zwischen 31 und 130 ng/ml Urin und werden

zwischen der dritten beziehungsweise sechsten Stunde p. a. erreicht. Bis zur 12.

Stunde zeigte sich bei allen Pferden ein rascher Abfall der Konzentration. Bei Pferd 1

und 2 ist bereits nach 12 Stunden kein 3-Hydroxydetomidin mehr im Urin

detektierbar. Nach 24 Stunden liegen die Konzentrationen bei allen Pferden im

Bereich der Quantifizierungsgrenze.

Abbildung 27 zeigt die Konzentrationen von 3-Hydroxydetomidin in kumulativer

Darstellung über einen Zeitraum von 48 Stunden.

0

20

40

60

80

100

120

140

0 5 10 15 20 25

104 ERGEBNISSE

0

100

200

300

400

500

0 10 20 30 40Zeit [h]

Men

ge H

ydro

xyde

tom

idin

[µg]

Pferd 1Pferd 2Pferd 3Pferd 4Pferd 5Pferd 6Pferd 7Pferd 8Pferd 9Pferd 10

Abbildung 27: Kumulative Darstellung der im Urin ausgeschiedenen Menge 3-Hydroxydetomidin

nach einmaliger intravenöser Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM

bis 48 Stunden p. a.

Die Einzelwerte sind für jedes Pferd im Anhang in den Tabellen 43 und 44

aufgeführt.

4.3.4.1 Aufarbeitung mit und ohne Hydrolyse vergleichend

Abbildung 28 zeigt die Konzentration von 3-Hydroxydetomidin im Urin nach

Aufarbeitung mit ohne und Hydrolyse vergleichend am Beispiel eines Pferdes.

ERGEBNISSE 105

0

20

40

60

80

100

120

140

2,1 4,03 4,66 6,83 7,9Zeit [h]

Kon

zent

ratio

n [n

g/m

l Urin

]

mit Hydrolyse aufgearbeitetohne Hydrolyse aufgearbeitet

Abbildung 28: Konzentrationen von 3-Hydroxydetomidin im Urin eines Pferdes mit und ohne

Hydrolyse

Es ist deutlich zu erkennen, dass die Aufarbeitung der Urinproben mit Hydrolyse die

Extraktionsausbeute von 3-Hydroxydetomidin verbessert.

4.3.5 Carboxydetomidin im Urin

In Abbildung 29 ist der Konzentrationsverlauf von Carboxydetomidin im Urin bis 50

Stunden nach der einmaligen Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM

dar. Die rote Querlinie stellt die Quantifizierungsgrenze von 50 ng/ml dar.

106 ERGEBNISSE

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0 10 20 30 40 50Zeit [h]

Kon

zent

rario

n [n

g/m

l Urin

]


Abbildung 29: Konzentrationsverlauf von Carboxydetomidin im Urin nach einmaliger intravenöser

Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 10 Pferden

Die maximalen Konzentrationen liegen zwischen 450 und 1550 ng/ml Urin und

werden zwischen der fünften beziehungsweise achten Stunde p. a. erreicht. In den

ersten 20 Stunden zeigte sich bei allen Pferden ein rascher Abfall der Konzentration.

Nach 30 Stunden sind die Konzentrationen bei acht Pferden unterhalb der

Quantifizierungsgrenze angelangt.

Abbildung 30 zeigt die Konzentrationen von Carboxydetomidin in kumulativer

Darstellung über einen Zeitraum von 48 Stunden.

ERGEBNISSE 107

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 12 24 36 48Zeit [h]

Men

ge C

arbo

xyde

tom

idin

[µg]

Pferd 1Pferd 2Pferd 3Pferd 4Pferd 5Pferd 6Pferd 7Pferd 8Pferd 9Pferd 10

Abbildung 30: Kumulative Darstellung der im Urin ausgeschiedenen Menge Carboxydetomidin nach

einmaliger intravenöser Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bis 48

Stunden p. a.

Die Einzelwerte sind für jedes Pferd im Anhang in den Tabellen 45 und 46

aufgeführt.

4.3.5.1 Aufarbeitung mit und ohne Hydrolyse vergeichend

Abbildung 31 zeigt die Konzentration von Carboxydetomidin im Urin nach der

Aufarbeitung mit und ohne Hydrolyse vergleichend am Beispiel eines Pferdes.

108 ERGEBNISSE

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

3,25 4,82 6,08 8,08 9,95Zeit [h]

Kon

zent

ratio

n [n

g/m

l Urin

]

mit Hydrolyse aufgearbeitetohne Hydrolyse aufgearbeitet

Abbildung 31: Konzentrationen von Carboxydetomidin im Urin eines Pferdes mit und ohne Hydrolyse

Auch hier ist deutlich zu erkennen, dass die Aufarbeitung der Urinproben mit

Hydrolyse die Extraktionsausbeute von Carboxydetomidin deutlich verbessert.

4.4 Berechnung der irrelevanten Plasma- und Urin-konzentrationen

Zur Berechnung effektiver beziehungsweise irrelevanter Plasma- und

Urinkonzentrationen wird ein von TOUTAIN und LASSOURD (2002) entwickeltes

PK/PD-Modell (siehe auch Punkt 2.1.7.1) auf die erhaltenen pharmakokinetischen

Parameter angewendet. Anhand der nachstehenden Gleichung wird mit Hilfe der

ERGEBNISSE 109

Dosierung (D) und der ermittelten Clearance (Cl) die effektive

Plasmakonzentration (EPC) pro Dosierungsintervall ermittelt:

Clearance

DosierungEPC = [ng/ml]

Aus der EPC wird durch Einbeziehung eines Sicherheitsfaktors (SF) die irrelevante

Plasmakonzentration (IPC) abgeleitet. Der von TOUTAIN und LASSOURD (2002)

vorgeschlagene Sicherheitsfaktor setzt sich für viele Wirkstoffe aus den Faktoren 10

und 50 zum Ausgleich interindividueller Schwankungen und Gewährleistung der

Validität der Daten zusammen.

SF

EPCIPC = [ng/ml]

Zur Berechnung der irrelevanten Urinkonzentration (IUC) entwickelten TOUTAIN

und LASSOURD (2002) folgende Formel:

ssRIPCIUC ×= [ng/ml]

Dabei stellt Rss das Konzentrationsverhältnis von Urin zu Plasma im Steady State

dar.

entrationPlasmakonz ttlichedurchschnitrationUrinkonzen ttlichedurchschniRss =

Zur Ermittlung der durchschnittlichen Urin- und Plasmakonzentration wurden in

eigenen Untersuchungen folgende Berechnungen angestellt:

Die durchschnittliche Urinkonzentration (CurinØ) wird für ein festgelegtes

Dosierungsintervall durch die Addition aller in diesem Zeitraum gemessenen

Konzentrationen von Carboxydetomidin und anschließender Division durch die

Anzahl der addierten Konzentrationen ermittelt.

110 ERGEBNISSE

Die durchschnittliche Plasmakonzentration (CPlasmaØ) für das Dosierungsintervall

wurde mittels folgender Gleichung unter Verwendung der maximalen

Plasmakonzentration (Cmax) sowie der Eliminationskonstante (b1) errechnet (KIETZ-

MANN, 1983):

CPlasmaØ intervallDosierungsb

C

1

max×

= [ng/ml]

4.5 Berechnung von Ausscheidungszeiten

Zusätzlich wurden weitere Parameter wie die Ausscheidungszeit von Detomidin bis

zum Erreichen der irrelevanten Plasmakonzentration (tA(IPC)), der

Bestimmungsgrenze (tA(LOQ)) beziehungsweise der Nachweisgrenze (tA(LOD))

bestimmt.

Die Ausscheidungszeit von Detomidin aus dem Plasma bis zum Erreichen der

irrelevanten Plasmakonzentration wurde mit folgender Formel berechnet (KIETZ-

MANN, 1983):

tA(IPC)1

IPCmax

blnlnC −= [h]

Zur Berechnung der Zeitspanne bis zum Erreichen der Bestimmungsgrenze tA(LOQ)

und der Nachweisgrenze tA(LOD) können ähnliche Formeln eingesetzt werden:

ta (LOQ) 1

(LOQ)max

b lnClnC −= [h]

ERGEBNISSE 111

ta (LOQ) = Ausscheidungszeit aus dem Plasma bis zum Erreichen des LOQ

C (LOQ) = Konzentration der Bestimmungsgrenze

ta (LOD) 1

(LOD)max

b lnClnC −= [h]

ta (LOD) = Ausscheidungszeit aus dem Plasma bis zum Erreichen der LOD

C (LOD) = Konzentration der Nachweisgrenze

Unter Verwendung des oben genannten Berechnungsweges wurden die effektiven

Plasma- sowie die irrelevanten Plasma- und Urinkonzentrationen anhand der

ermittelten pharmakokinetischen Daten (siehe Tabelle 34) für alle 10 Pferde

berechnet. Dabei stellt die Dosierung (D) die Menge verwendeter Reinsubstanz dar,

was in diesem Fall 20 µg/kg Detomidin-Hydrochlorid abzüglich des Hydrochlorid-

Anteils, also 16,76 µg/kg Detomidin entspricht.

Bei Detomidin als Sedativum kann nicht von einem Dosierungsintervall ausgegangen

werden, da die Substanzen dieser Wirkstoffgruppe im allgemeinen nur einmalig

verabreicht werden. Deshalb schlagen TOUTAIN und LASSOURD (2002) vor, als

Dosierungsintervall den Zeitraum zu bestimmen, nach dem die Substanz ihre

pharmakodynamische Wirkung verloren hat (siehe Kapitel 4.6). Nach den

Ergebnissen dieser Studie hat Detomidin nach einmaliger intravenöser Applikation

von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM nach 4 Stunden bei 10 Pferden keine

Wirkung mehr (vergleiche Punkt 4.6.4.4). Auf Grund dessen erfolgte die Berechnung

auf der Basis eines Dosierungsintervalles von 4 Stunden.

Tabelle 36 zeigt die Ergebnisse der wie unter Punkt 4.4 angegebenen Berechnung

der irrelevanten Plasma- und Urinkonzentration für 10 Pferde.

112 ERGEBNISSE

Pferd 1

Pferd 2

Pferd 3

Pferd 4

Pferd 5

Pferd 6

Pferd 7

Pferd 8

Pferd 9

Pferd 10

Mittel-wert S

EPC (4h)

[ng/ml] 2,96 2,21 3,19 3,01 3,05 2,83 2,64 2,08 2,47 3,20 2,76 0,40

IPC (4h)

[ng/ml] 0,0059 0,0044 0,0064 0,0060 0,0061 0,0057 0,0053 0,0042 0,0049 0,0064 0,0055 0,0008

IUC (4h)

[ng/ml] 0,25 0,67 0,47 0,29 0,70 0,33 0,22 0,67 0,12 0,59 0,43 0,22

Para-meter

Tabelle 36: Ergebnisse der Berechnungen von EPC, IPC und IUC nach TOUTAIN und

LASSOURD (2002) von 10 Pferden und im Mittel nach einer Dosierung von 16,76 µg

Detomidin-Hydrochlorid/kg KM und einem Dosierungsintervall von 4 Stunden

Erläuterungen zu den Abkürzungen in Tabelle 36:

EPC effektive Plasmakonzentration

IPC irrelevante Plasmakonzentration

IUC irrelevante Urinkonzentration

S Standardabweichung

Nach diesen Berechnungen liegt die effektive Plasma Konzentration nur knapp über

der Bestimmungsgrenze von 2,09 ng/ml Plasma (siehe Kapitel 4.2.4). Die irrelevante

Plasmakonzentration liegt immer deutlich unter der Nachweisgrenze von 1,67 ng/ml

Plasma (siehe Kapitel 4.2.3).

In Tabelle 37 sind die Ergebnisse der Berechnungen der Ausscheidungszeiten von

Detomidin bis zum Erreichen der irrelevanten Plasmakonzentration (tA(IPC)) sowie der

Bestimmungs- (tA(LOQ)) und Nachweisgrenze (tA(LOD)) dargestellt.

ERGEBNISSE 113

Pferd 1

Pferd 2

Pferd 3

Pferd 4

Pferd 5

Pferd 6

Pferd 7

Pferd 8

Pferd 9

Pferd 10

Mittel-wert S

ta

(IPC)[h] 5,36 3,90 3,17 4,57 3,78 4,36 4,48 3,09 3,64 3,05 3,94 0,75

ta

(LOQ)[h] 1,43 1,03 1,03 1,30 1,15 1,23 1,21 0,86 1,03 1,01 1,13 0,17

ta

(LOD)[h] 1,58 1,13 1,12 1,43 1,25 1,35 1,33 0,94 1,12 1,09 1,23 0,19

Parameter

Tabelle 37: Ergebnisse der Berechnungen nach Kietzmann (1983) von ta (IPC), ta (LOQ) und ta (LOD)

von allen Pferden und im Mittel nach einer Dosierung von 16,76 µg Detomidin-

Hydrochlorid/kg KM und einem Dosierungsintervall von 4 Stunden

Erläuterungen zu den Abkürzungen in Tabelle 37:

ta (IPC) Ausscheidungszeit aus dem Plasma bis zum Erreichen der IPC

ta (LOQ) Ausscheidungszeit aus dem Plasma bis zum Erreichen des LOQ

ta (LOD) Ausscheidungszeit aus dem Plasma bis zum Erreichen des LOD

S Standardabweichung

4.6 Pharmakodynamik von Detomidin

Als Ausdruck der Wirkung von Detomidin werden die Daten für Herzfrequenz,

Atemfrequenz und Körpertemperatur sowie die Ergebnisse der Kopftiefhaltung, des

akustischen, visuellen und des Stromreizes wie unter Punkt 3.2.5 ermittelt und

dokumentiert. Dadurch ist ein direkter Vergleich von Pharmakokinetik und

Pharmakodynamik möglich.

4.6.1 Herzfrequenz

Abbildung 32 zeigt den durchschnittlichen Verlauf der Herzfrequenz über 12 Stunden

nach der einmaligen intravenösen Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg

KM.

114 ERGEBNISSE

10

20

30

40

50

Her

zfre

q uen

z [S

chlä

g e/m

in]

0 2 4 6 8 10 12Zeit [h]

Abbildung 32: Herzfrequenz von 10 Pferden, Mittelwert mit Standardabweichung zu jedem

Messzeitpunkt vor und nach der intravenösen Applikation von 20 µg Detomidin-

Hydrochlorid/kg KM (signifikante Abweichungen bis drei Stunden p. a.)

Die gemittelten Ruhewerte aller 10 Pferde liegen bei 41 Schlägen pro Minute.

Innerhalb der ersten zwei Minuten nach der Applikation von Detomidin fallen die

Herzfrequenzen auf 17 Schläge pro Minute ab und bleiben über 45 Minuten

signifikant erniedrigt. Auffällig ist hierbei der Abfall der Herzfrequenz eines Pferdes

auf 6 Schläge pro Minute zwei Minuten p. a. Im Zeitraum zwischen 1 und 3 Stunden

nach Detomidinapplikation konnte statistisch noch eine signifikante Abweichung der

durchschnittlichen Herzfrequenz von den Ruhewerten ermittelt werden. 6 Stunden p.

a. werden die Basiswerte der Herzfrequenz wieder erreicht.

ERGEBNISSE 115

4.6.2 Atemfrequenz

Abbildung 33 zeigt den Verlauf der Atemfrequenz über 12 Stunden als Mittelwert

aller 10 Pferde sowie die Standardabweichung zu jedem Messzeitpunkt.

4

8

12

16

20

Ate

mfre

q uen

z [A

tem

züg e

/min

]

0 2 4 6 8 10 12Zeit [h]

Abbildung 33: Darstellung des Verlaufes der Atemfrequenz von 10 Pferden im Mittel mit

Standardabweichung zu jedem Messzeitpunkt vor und nach der intravenösen

Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM (signifikante Abweichungen

bis 3 Stunden p. a.)

Die gemittelten Ruhewerte aller 10 Pferde liegen bei 11 Atemzügen pro Minute.

Innerhalb von 30 Minuten p. a. erfolgt ein leichter Abfall der Atemfrequenz. Im

Zeitraum 45 Minuten bis 3 Stunden nach Detomidinapplikation wurden signifikante

Abweichungen vom Ruhewert erreicht. Anschließend kommt es zu einem Anstieg

der Frequenz, bis nach 7 Stunden der Basiswert wieder erreicht ist. Die

Schwankungen der Atemfrequenz über den Zeitraum von 24 Stunden belaufen sich

116 ERGEBNISSE

im Mittel auf einen Bereich zwischen 8 und 12 Atemzügen pro Minute. Die niedrigste

Atemfrequenz wird 1,5 Stunden p. a. mit 4 Atemzügen pro Minute bei einem Pferd

ermittelt.

4.6.3 Körperinnentemperatur

Abbildung 34 zeigt den Verlauf der Körperinnentemperatur über 12 Stunden als

Mittelwert aller 10 Pferde sowie die Standardabweichung zu jedem Messzeitpunkt.

36.6

36.8

37.0

37.2

37.4

37.6

37.8

38.0

38.2

38.4

Kör

perte

mpe

r atu

r [°C

]

0 2 4 6 8 10 12Zeit [h]

Abbildung 24: Darstellung des Verlaufes der Körpertemperatur von 10 Pferden im Mittel mit

Standardabweichung zu jedem Messzeitpunkt vor und nach der intravenösen

Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM (signifikante Abweichungen 1,5

bis 4 Stunden p. a.)

ERGEBNISSE 117

Die gemittelten Ruhewerte aller 10 Pferde liegen bei 37,4°C mit einer

Schwankungsbreite von 37,0 – 37,8°C. Im Verlauf der ersten 2 Stunden p. a. fällt die

gemittelte Körpertemperatur erst bis auf 36,8°C und damit vergleichsbezogen

signifikant ab. Die niedrigste Temperatur wird mit 36,2°C bei einem Pferd nach 90

Minuten festgestellt. Im weiteren Verlauf kommt es zu einem Wiederanstieg der

Körperinnentemperatur, wobei nach etwa 6 Stunden der Basiswert erreicht wird.

Auffällig ist ein weiterer signifikanter Anstieg der Temperatur über den Ruhewert

hinaus bis auf 38°C.

4.6.4 Grad der Sedation

Der Grad der Sedation wurde jeweils einzeln für die Parameter Kopftiefhaltung,

Reaktion auf einen akustischen sowie auf einen visuellen Reiz als auch gesamthaft

als individueller Sedationsgrad aus der Summe der Einzelparameter für jedes Pferd

beurteilt.

118 ERGEBNISSE

4.6.4.1 Ptosis

Abbildung 35 zeigt eines der Versuchspferde circa 20 Minuten nach der Applikation

von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM. Diese Kopftiefhaltung wurde mit Grad 3

(Unterlippe an oder unterhalb des Karpus) beurteilt und im Protokoll vermerkt.

Abbildung 35: Kopftiefhaltung eines Versuchspferdes circa 20 Minuten nach der Applikation von 20

µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei vollständig angeschlossener Apparatur für die

Messung der Analgesie

In Abbildung 36 ist der Verlauf der Veränderung der Kopfhaltung nach Applikation

von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 10 Pferden im Mittel und mit dem

jeweilig niedrigsten und höchsten Wert pro Messzeitpunkt dargestellt.

ERGEBNISSE 119

1

2

3

Pto

s is

[Gra

d]

0 1 2 3 4 5Zeit [h]

Abbildung 36: Beurteilung der Veränderung der Kopfhaltung nach Applikation von 20 µg Detomidin-

Hydrochlorid/kg KM bei 10 Pferden im Mittel und mit dem jeweilig niedrigsten und

höchsten Wert pro Messzeitpunkt, erstellt mit Hilfe eines Score-Systems (0 =

Unterlippe oberhalb Buggelenk, 1 = Unterlippe zwischen Bug- und Ellenbogengelenk,

2 = Unterlippe zwischen Ellenbogen- und Karpalgelenk, 3 = Unterlippe an oder unter

Karpalgelenk)

Innerhalb der ersten 2 Minuten p. a. sinkt der Kopf bei allen Pferden mindestens bis

zwischen das Ellenbogen- und Karpalgelenk ab. Nach 30 Minuten ist das Maximum

erreicht, alle 10 Pferde lassen den Kopf bis an oder unter das Karpalgelenk hängen.

Statistische Test für gepaarte hierarchische Daten ergaben bis 120 Minuten p. a.

eine hohe Signifikanz für die Veränderung der Kopfhaltung verglichen mit dem

Ruhewert. Im Anschluss nimmt die Höhe der Kopfhaltung wieder zu und erreicht

nach 4 Stunden wieder den Basiswert.

120 ERGEBNISSE

4.6.4.2 Akustischer Reiz

Abbildung 37 zeigt die Änderung der Empfindlichkeit gegenüber einem akustischen

Reiz vor und nach der Applikation von Detomidin.

1

2

3

Rea

ktio

n au

f aku

stis

c hen

Rei

z [G

rad]

0 1 2 3 4 5Zeit [h]

Abbildung 37: Beurteilung der Veränderung der Empfindlichkeit gegenüber einem akustischen Reiz

nach Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 10 Pferden im Mittel

und mit dem jeweilig niedrigsten und höchsten Wert pro Messzeitpunkt, erstellt mit

Hilfe eines Score-Systems (0 = volle Reaktion, 1 = Reaktion geringgradig gedämpft,

2 = Reaktion deutlich gedämpft, 3 = Reaktion vollständig erloschen)

Unmittelbar nach Applikation der Substanz ist die Reaktion fast aller Pferde auf einen

akustischen Reiz, bezogen auf den Ruhewert, deutlich herabgesetzt. Während der

Messzeitpunkte 15 und 30 Minuten p. a. ist die maximale Unempfindlichkeit

festzustellen, danach nimmt die Empfindlichkeit langsam wieder zu und hat bei allen

Pferden nach 4 Stunden wieder den Ausgangswert erreicht. Die statistische

ERGEBNISSE 121

Auswertung der Tests ergab eine hohe signifikante Abweichung für alle

Messzeitpunkte bis einschließlich der 90. Minute verglichen mit den Basiswerten.

4.6.4.3 Visueller Reiz

In Abbildung 38 ist die Veränderung der Empfindlichkeit gegenüber einem visuellen

Reiz vor und nach der Applikation von Detomidin dargestellt.

1

2

3

Rea

ktio

n au

f vis

uelle

n R

eiz

[Gra

d]

0 1 2 3 4 5Zeit [h]

Abbildung 38: Beurteilung der Veränderung der Empfindlichkeit gegenüber einem visuellen Reiz

nach Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 10 Pferden im Mittel

und mit dem jeweilig niedrigsten und höchsten Wert pro Messzeitpunkt, erstellt mit

Hilfe eines Score-Systems (0 = volle Reaktion, 1 = Reaktion geringgradig gedämpft,

2 = Reaktion deutlich gedämpft, 3 = Reaktion vollständig erloschen)

122 ERGEBNISSE

Direkt nach Applikation von Detomidin kam es bei allen Pferden zu einer deutlich

verminderten Reaktion auf das Schwenken einer roten Tüte vor dem Kopf der Tiere.

Die höchste Herabsetzung der Empfindlichkeit wurde 30 Minuten p. a. erreicht. Die

statistische Auswertung der Tests ergab eine hohe signifikante Abweichung für alle

Messzeitpunkte bis 90 Minuten nach der Applikation verglichen mit den Basiswerten.

4.6.4.4 Individueller Sedationsgrad der einzelnen Pferde

Abbildung 39 zeigt den Verlauf des Sedationsgrades im Mittel für alle 10 Pferde der

Studie.

3

6

9

Sed

ati o

nsgr

ad [P

unkt

e ]

0

5

10

15

20

Det

o mid

inko

nzen

tratio

n [n

g/m

l]

0 1 2 3 4 5Zeit [h]

Abbildung 39: linke Größenachse: Grad der Sedation aller Pferde im Mittel im Verlauf des

Versuches, erstellt mit einem Score-System für Ptosis, Reaktion auf einen

akustischen Reiz und die Reaktion auf einen visuellen Reiz (0 = keine Sedation,

1-3 = geringgradige Sedation, 4-6 = mittelgradige Sedation, 7-9 = hochgradige

Sedation)

rechte Größenachse: Plasmakonzentrationsverlauf nach einmaliger intravenöser

Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 10 Pferden im Mittel

ERGEBNISSE 123

Der individuelle Sedationsgrad der einzelnen Pferde wird aus der Summe der

Einzelparameter (Ptosis, Reaktion auf einen akustischen Reiz Reaktion auf einen

visuellen Reiz) für jedes Pferd zu jedem Messzeitpunkt bestimmt. Zusätzlich wurde

der Plasmakonzentrationsverlauf von Detomidin nach einmaliger intravenöser Gabe

von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM aller 10 Pferde im Mittel in der Abbildung

dargestellt, um einen direkten Vergleich von Pharmakokinetik und Pharmakodynamik

zu ermöglichen.

Es wird deutlich, dass das Konzentrationsmaximum bereits nach 2 Minuten p. a.

erreicht wird, während der maximale sedative Effekt erst nach 30 Minuten eintritt. Der

Abfall der beiden Kurven verläuft zeitversetzt nahezu parallel, wobei die

Plasmakonzentration von Detomidin bereits nach 2 Stunden in den Bereich der

Quantifizierungsgrenze absinkt und zu diesem Zeitpunkt noch ein deutlicher

sedativer Effekt zu messen ist.

4.6.5 Grad der Reaktion auf einen definierten Stromreiz

In Abbildung 40 ist der Verlauf der Reaktion auf einen definierten Stromreiz vor und

nach der einmaligen intravenösen Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg

KM dargestellt.

124 ERGEBNISSE

10

20

30

40

Rea

ktio

n a u

f Stro

mre

iz [m

A]

0 1 2 3 4 5Zeit [h]

Abbildung 40: Verlauf der Reaktion auf einen definierten Stromreiz vor und nach der einmaligen

intravenösen Applikation von 20µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 10 Pferden im

MIttel

Bereits 2 Minuten p. a. ist die Toleranzgrenze gegenüber dem Stromreiz deutlich

angestiegen. Bei diesem Modell wird die erhöhte Toleranz mit

Schmerzunempfindlichkeit gleichgesetzt. 10 Minuten nach der Detomidinapplikation

ist die Unempfindlichkeit im Mittel bei 10 Pferden am stärksten. Danach kommt es

langsam wieder zu einer verstärkten Reaktion auf den Stromreiz. Allerdings ist die

volle Reaktion bei allen Pferden im Mittel erst wieder nach 4 Stunden auslösbar.

Nach diesem Zeitpunkt ist die analgetische Wirkung von Detomidin bei allen Pferden

wieder völlig aufgehoben.

ERGEBNISSE 125

4.6.6 Andere Beobachtungen

Nach der Applikation des Detomidins wurde bei 4 Pferden circa 100 bis 180 Minuten

p. a. ein mittelgradiger bis hochgradiger Muskeltremor vor allem in den Muskel-

gruppen von Schulter und Oberschenkel beobachtet. Neun der zehn Pferde zeigten

in der tiefsten Phase der Sedation neben der Kopftiefhaltung auch ein extremes

Hängenlassen von Augenlidern, Lippen und in einem Fall sogar der Zunge (siehe

Abbildung 35). Bei sechs dieser neun Pferde ging dieses mit einem schnarchenden

Atemgeräusch einher. In vier Fällen konnte ein geringradiger bis mittelgradiger

Penisprolaps etwa 40 bis 80 Minuten p. a. beobachtet werden (siehe Abbildung 35).

Bei fünf Pferden konnte übermäßiges Schwitzen, vor allem im Bereich der Flanken,

bei zwei Pferden aber besonders ausgeprägt am Kopf festgestellt werden.

126 DISKUSSION

5 DISKUSSION

Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung pharmakokinetischer und

pharmakodynamischer Parameter nach einmaliger intravenöser Applikation von

Detomidin beim Pferd, um zu prüfen ob die Schaffung von Grenzwerten anstatt der

bisher verwendeten Null-Lösung möglich sei. Im ersten Schritt wurde eine geeignete

HPLC/MS/MS-Analysemethode für die Detektion von Detomidin und seinen

Metaboliten in Plasma und Urin entwickelt und validiert. In der folgenden

Ausscheidungsstudie an 10 Pferden wurden nicht nur Plasma- und Urinproben zur

Errechnung pharmakokinetischer Parameter, sondern auch Daten zur Pharmako-

dynamik gewonnen. Dazu gehörten die Ermittlung der Herz- und Atemfrequenz, die

rektale Körpertemperatur, sowie das Erfassen der Sedationstiefe und der Grad der

Analgesie. Mittels pharmakokinetischer und pharmakodynamischer Modelle wurden

die Daten mathematisch verknüpft. Spezielle Beachtung fand das PK/PD-Modell

nach TOUTAIN und LASSOURD (2002), mit dem Plasma- und Urinkonzentrationen

errechnet wurden, bei denen keine pharmakologische Wirkung der Substanz mehr

zu erwarten ist.

5.1 Eignung der Aufarbeitungs- und HPLC/MS/MS-Methode für den Nachweis von Detomidin und seinen Metaboliten in Plasma und Urin

Vor Beginn dieser Studie stand im Institut für Biochemie der Deutschen

Sporthochschule Köln kein geeignetes Analyseverfahren zum Nachweis von

Detomidin und seinen Metaboliten zur Verfügung. Die in dieser Arbeit entwickelte

Aufarbeitungsprozedur im Plasma basiert auf einer Routinemethode zur Extraktion

basischer Verbindungen. Ether stellt dabei ein geeignetes organisches Lösungsmittel

für die apolaren, basischen Verbindungen Detomidin und Medetomidin dar. Im

Vergleich von Festphasen- und Flüssig-Flüssig-Extraktion, ergab sich für die Flüssig-

Flüssig-Methode ein besseres Extraktionsergebnis, vor allem bei pH 9,6 und 14.

DISKUSSION 127

Allerdings wiesen die Chromatogramme der bei pH 9,6 aufgearbeiteten Proben ein

hohes Untergrundrauschen auf, was auf endogene Substanzen zurückzuführen war.

Diese sauren oder neutralen Verbindungen gehen überwiegend im neutralen bis

schwach basischen pH-Bereich mit in die Etherphase über. Da die Störsignale im

pH-Bereich 14 wesentlich geringer ausfielen, wurde dieser als optimaler pH-Wert für

die Extraktionsmethode im Plasma angesehen.

In der Literatur wurde die Bildung von Metaboliten des Detomidins im Urin eingehend

an Ratten und Pferden untersucht (SEYMOR et al., 1990; CHUI et al., 1991;

SALONEN, 1992; SALONEN et al., 1992). Aus diesen Studien ging ebenfalls hervor,

dass Detomidin selbst im Urin nicht oder nur in sehr geringen Mengen nachgewiesen

werden kann (VAKKURI et al., 1987; SALONEN, 1988). In den eigenen

Untersuchungen konnten diese Ergebnisse bestätigt werden. Es ist deshalb davon

auszugehen, dass Detomidin fast vollständig metabolisiert zur Ausscheidung

gelangt. Da geplant ist, den analytischen Nachweis von Detomidin bei die

Routineuntersuchungen von Pferdedopingproben im Institut für Biochemie der

Deutschen Sporthochschule Köln zu etablieren, war die Entwicklung einer Methode

für den Nachweis von Detomidin im Urin somit nicht angezeigt. Stattdessen wurde

anhand laborinterner Dokumente eine Aufarbeitungsmethode für die Metaboliten 3-

Hydroxydetomidin und Carboxydetomidin entwickelt. Das von CHUI et al. (1991)

erwähnte 4-Hydroxydetomidin wurde nicht in die Messungen mit einbezogen, da das

Hauptaugenmerk auf Carboxydetomidin, den Hauptmetaboliten des Detomidin beim

Pferd, gerichtet wurde. Bei Carboxydetomidin handelt es sich um eine saure

Verbindung, so dass für dessen Analyse und Quantifizierung sowohl ein eigener

interner Standard gefunden werden, als auch eine spezielle Extraktion erfolgen

mussten. Erst Imidazolylbenzoesäure zeigte aufgrund ihrer Strukturverwandtheit ein

ähnliches Extraktionsverhalten wie Carboxydetomidin und wurde deshalb als interner

Standard eingesetzt. Obwohl Detomidin und 3-Hydroxydetomidin von ihren

Extraktionseigenschaften auch in einer Flüssig-Flüssig-Extraktion hätten gewonnen

werden können, wurden erst mit Hilfe einer Ionenaustauschermatrix für alle

Substanzen (Detomidin, Medetomidin, 3-Hydroxydetomidin, Carboxydetomidin,

Imidazolylbenzoesäure) akzeptabel hohe Ausbeuten erzielt. Mittels Oasis® MCX-

128 DISKUSSION

Extraktionskartuschen (Waters, Deutschland) wurden Detomidin, Medetomidin und

3-Hydroxydetomidin in den ersten beiden und Carboxydetomidin sowie

Imidazolylbenzoesäure im dritten Eluierschritt extrahiert (siehe Punkt 3.3.4.4) und mit

einer HPLC/MS/MS-Methode detektiert.

In den an Pferden durchgeführten Studien von SEYMOR et al. (1990) und SALONEN

et al. (1992) lagen Carboxydetomidin frei und 3-Hydroxydetomidin sowohl gluko-

ronidiert, als auch frei vor. Aufgrund der eigenen Untersuchungen konnte bestätigt

werden, dass 3-Hydroxydetomidin im Urin sowohl glukoronidiert, als auch frei

vorliegt. Allerdings wurde durch die Hydrolyse auch der Anteil von Carboxydetomidin

im Vergleich zur Aufarbeitung ohne enzymatische Spaltung erhöht. Das bedeutet,

dass beide Metaboliten im Urin sowohl frei als auch konjugiert vorliegen. 3-

Hydroxydetomidin wird besonders in den ersten vier Stunden, Carboxydetomidin

sechs Stunden p. a. glukoronidiert ausgeschieden, so dass eine enzymatische

Hydrolyse mit ß-Glucoronidase/Arylsulfatase von Helix pomatia die Extraktions-

ausbeute beider Metaboliten deutlich erhöht. Aufgrunddessen wurden alle

Urinausscheidungsproben mit Hydrolyse aufgearbeitet.

Die Wiederfindungsraten von Detomidin im Plasma und Detomidin, 3-

Hydroxydetomidin und Carboxydetomidin im Urin zeigen, dass die

Extraktionsprozedur mit Verlusten verbunden ist. Auffällig ist hierbei die geringere

Wiederfindungsrate von etwa 50 % bei Detomidin im Plasma im Gegensatz zu 63 bis

69 % bei Detomidin und seinen Metaboliten im Urin. Die relativ gesehen einfachere

Aufarbeitungsmethode von Plasma hätte ein umgekehrtes Verhältnis vermuten

lassen.

Die Ergebnisse der Validierung belegen die Eignung der HPLC/MS/MS-

Analysemethode für den Nachweis von Detomidin, 3-Hydroxydetomidin und

Carboxydetomidin. Bei der Überprüfung der Selektivität konnten in Leermatrixproben

keine Störpeaks zu den Retentionszeiten der Analyten oder internen Standards

ermittelt werden. Die Linearität der Methode für Detomidin wurde im Plasma über

einen Konzentrationsbereich von 2,5 bis 50 ng/ml überprüft. Für 3-Hydroxydetomidin

lag der Konzentrationsbereich zwischen 10 und 160 ng/ml, für Caboxydetomidin

DISKUSSION 129

zwischen 50 und 1600 ng/ml Urin. Für jede Kalibrationskurve konnte ein

Regressionskoeffizient von mehr als 0,99 eingehalten werden. Die Kriterien für

Richtigkeit und Präzision, eine Abweichung von 15 %, an der unteren Bestimmungs-

grenze von 20 %, nicht zu überschreiten, wurden an allen Messtagen, für alle

Substanzen erfüllt (EHSLC, 2002). Mit der angewandten Methode liegt die

Nachweisgrenze für Detomidin im Plasma bei 1,67 ng/ml, während CHUI et al.

(1991) über eine Nachweisgrenze von 0,5 ng/ml berichten. Die Nachweisgrenze von

3-Hydroxydetomidin im Urin beträgt bei der in der Studie verwendeten Methode 10

ng/ml. Für Carboxydetomidin wurde eine Nachweisgrenze von 50 ng/ml Urin

ermittelt. Bisher wurde Carboxydetomidin in keiner Studie quantifiziert, weshalb keine

vergleichenden Daten zur Nachweis- und Bestimmunggrenze in der Literatur

vorliegen. Die untere Bestimmungs- oder Quantifizierungsgrenze von Detomidin im

Plasma liegt bei 2,09 ng/ml. Aufgrund der Ergebnisse von Präzision und Richtigkeit

wurde die Bestimmungsgrenze für 3-Hydroxydetomidin im Urin auf 10 ng/ml

festgelegt. Die Stabilität von Detomidin und seinen Metaboliten in den jeweiligen

Matrices wurde für den Zeitraum der Lagerung der Ausscheidungsproben bei

identischen Lagerbedingungen von –20°C überprüft. Der Stabilitätstest der

Substanzen im Urin musste über einen längeren Zeitraum erfolgen, da die

Aufarbeitung und Messung aller Proben knapp 8 Wochen in Anspruch nahm. Die

Plasmaproben wurden innerhalb von 30 Tagen aufgearbeitet, was die Dauer des

Stabilitätstestes auf 5 Wochen verkürzte. Es konnte gezeigt werden, dass Detomidin

und seine Metaboliten in Plasma und Urin über diese Zeiträume stabil und damit

lagerfähig sind.

5.2 Pharmakokinetik von Detomidin im Plasma

Die Ermittlung der pharmakokinetischen Daten für Detomidin im Plasma erfolgte bei

10 Pferden. Die maximalen Konzentrationen wurden zwei und fünf Minuten nach der

Applikation gemessen, es zeigen sich jedoch interindividuelle Schwankungen in

Bezug auf den Zeitpunkt der Höchstkonzentration. Bei fünf Pferden wird die

130 DISKUSSION

individuell gemessene maximale Konzentration bereits nach 2 Minuten, bei den

anderen fünf Tieren erst 5 Minuten nach der Applikation erreicht. Zusätzlich variieren

die Konzentrationen zum ersten Messzeitpunkt zwischen 12 und 35 ng/ml. Auffällig

ist hierbei, dass die niedrigeren Konzentrationen von den Pferden gestellt werden,

die erst am zweiten Messzeitpunkt ihre individuelle Höchstkonzentration erreichen.

Zum Zeitpunkt 5 Minuten p. a. werden Konzentrationen zwischen 15 und 30 ng/ml

gemessen.

Als Ursache für die Schwankungen der Höchstkonzentration zwischen den ersten

beiden Messzeitpunkten könnte eine paravenöse Applikation vermutet werden.

Aufgrund der Verwendung von Venenkathetern, die jeweils kurz vor der

Verabreichung des Arzneimittels auf ihren intravasalen Sitz geprüft wurden, wird

diese Möglichkeit jedoch als unwahrscheinlich angesehen. Es kann vielmehr der

starke negativ chronotrope Einfluss des Detomidins für dieses Phänomen

verantwortlich gemacht werden. Am deutlichsten tritt dieser Effekt bei Pferd 7 ein,

dessen Herzfrequenz von einer durchschnittlichen Ruhefrequenz von 37 auf 6

Schläge pro Minute innerhalb der ersten 2 Minuten nach der Applikation absank.

Berechnet man den prozentualen Abfall der durchschnittlichen Herzfrequenz für die

fünf Pferde mit frühem Konzentrationsmaximum (Ruhewerte im Vergleich der

Herzfrequenz zum ersten Probennahmezeitpunkt 2 Minuten p. a.) so sinkt die

Schlagfrequenz um 53 %, in Bezug auf den zweiten Probennahmezeitpunkt (5

Minuten p. a.), wird ein Abfall der Herzfrequenz um immernoch 38 % ermittelt. Im

Vergleich dazu hatte die Herzfrequenz der Pferde mit Konzentrationsmaximum nach

5 Minuten um 65 % nach 2 Minuten um 43 %, also wesentlich stärker, abgenommen.

Durch die verminderte Schlagfrequenz kann von einer verminderten Herzzeitvolumen

(l/min) ausgegangen werden, was zu einem langsameren Transport aller Stoffe im

Blut führt. Dies kann bei den fünf Pferden mit spätem Konzentrationsmaximum eine

verlangsamte Verteilung des Detomidins im gesamten Blutvolumen zur Folge gehabt

haben. Es konnte hingegen keine Auswirkung des unterschiedlichen Absinkens der

Herzfrequenz auf die absolute Dauer der Ausscheidung festgestellt werden, da bei

allen Pferden innerhalb der ersten halben Stunde nach der Applikation ein deutlicher

DISKUSSION 131

Abfall der Plasmakonzentration erfolgte. Auch die Quantifizierungsgrenze war nach

1,5 Stunden von allen Pferden einheitlich unterschritten.

Die Ermittlung der pharmakokinetischen Daten erfolgte nur mit den Werten der

höchsten Plasmakonzentration bis einschließlich der Konzentrationen oberhalb der

Quantifizierungsgrenze. Obwohl von SALONEN (1986) ein 2-Kompartiment-Modell

zur Berechnung pharmakokinetischer Daten für Detomidin herangezogen wurde, war

in der vorliegenden Studie aufgrund der Datenlage nur eine Berechnung im 1-

Kompartiment-Modell möglich. Als Halbwertszeit wurde eine Zeit von durchschnittlich

18 Minuten errechnet. Damit liegen die Ergebnisse dieser Studie unter den

ermittelten Halbwertszeiten von SALONEN (1992) und DYKE (1993), die bei 72

Minuten lagen. Entsprechend ergibt sich eine mittlere Clearance von 26,8 ± 6,7 ml

/min. Das Verteilungsvolumen im zentralen Kompartiment beläuft sich im Mittel auf

0,7 ± 0,2 l/kg KM. Dies lässt auf eine gute Verteilung der Substanz im intra- und

extrazellulären Raum schließen.

5.3 Pharmakokinetik von Detomidin im Urin

Die Konzentrationen von 3-Hydroxy- und Carboxydetomidin im Urin zeigen starke

interindividuelle Schwankungen in Bezug auf die maximale Konzentration und auf die

Dauer der Ausscheidung. Die maximalen Konzentrationswerte für 3-Hydroxy-

detomidin erreichen Werte zwischen 31 und 130 ng/ml Urin. Sie wurden im Zeitraum

von 3 bis 6 Stunden nach der Applikation erreicht. Bei Carboxydetomidin liegen die

Werte zwischen 448 und 1547 ng/ml Urin und erreichen im Zeitraum von 4 bis 8

Stunden p. a. ihr Maximum. In beiden Fällen erreicht Pferd 2 eine besonders hohe

Konzentration, obwohl dieses Pferd dieselbe Dosierung erhalten hat wie die anderen

Tiere. Die individuelle Ausscheidungszeit von 3-Hydroxydetomidin war bei diesem

Pferd – wie auch bei Pferd 1 - deutlich kürzer als bei den acht anderen Tieren. So

erreichten Pferd 1 und 2 die Nachweisgrenze für 3-Hydroxydetomidin im

Durchschnitt schon nach 7,25 Stunden, während die anderen Pferde durchschnittlich

14,9 ± 9,1 Stunden benötigten. Die Clearance und die Eliminationshalbwertszeit

132 DISKUSSION

lagen bei Pferd 1 und 2 ebenfalls höher als bei den Anderen. Nach FREY (2002) ist

eine hohe Claerance gleichbedeutend mit einer raschen Ausscheidung der Substanz

aus dem Plasma und bietet so einen Erklärungsansatz für das überdurchschnittlich

schnelle Absinken der Konzentrationen dieser beiden Pferde. Die Nachweisgrenze

für Carboxydetomidin wurde relativ einheitlich nach durchschnittlich 31 ± 6 Stunden

unterschritten. In der Studie von CHUI et al. (1991) wurde 3-Hydroxydetomidin nach

der Applikation von 20 mg Detomidin-Hydrochlorid/Tier bis 48 Stunden p. a. im Urin

detektiert. Da in der vorliegenden Arbeit aber selbst das schwerste Tier mit 15,24 mg

Detomidin-Hydrochlorid eine niedrigere Konzentration erhalten hatte, ist die kürzere

Detektionszeit nicht verwunderlich. Carboxydetomidin hingegen wurde nach einer

Dosierung von 5 µg/kg KM i. m. bis 23 Stunden p. a. im Urin gefunden (SEYMOR et

al., 1991). Die längere Ausscheidungszeit in der vorliegenden Arbeit ist also durch

die 4 mal höhere Dosierung erklärbar.

Die interindividuellen Unterschiede in der Ausscheidungszeit machen deutlich, dass

die Beurteilung des Ausscheidungsverhaltens einer Substanz anhand ihrer

Konzentration im Urin mit erheblichen Unsicherheiten verbunden ist. Hierfür ist vor

allem die unterschiedliche Harnproduktion der einzelnen Individuen verantwortlich zu

machen. Sie variiert aufgrund des Einflusses verschiedener physiologischer und

exogener Faktoren erheblich. Dazu gehören die diurale Kapazität der Nieren, das

Nahrungsangebot und die Wasseraufnahme, körperliche Belastung, Haltungs-

bedingungen und auch der Gesundheitszustand der Pferde (SAMS, 1992; DYKE u.

SAMS, 1994B). Zusätzlich können Änderungen des pH-Wertes in den sauren oder

basischen Bereich die Ausscheidung von Arzneimitteln erheblich beeinflussen (PICK,

1993). Im Vorfeld dieser Arbeit war deshalb überlegt worden, den gesamten Urin

aller Pferde über die Dauer der Probennahme mittels Urinauffangschürzen zu

sammeln. Dies hätte die Ermittlung der ausgeschiedenen Menge Hydroxy- und

Carboxydetomidin pro Zeiteinheit ermöglicht. Aufgrund der schlechten praktischen

Durchführbarkeit und der erhöhten Belastung für die Tiere sowie die Einschränkung

der pharmakodynamischen Untersuchungen war auf diesen Ansatz jedoch verzichtet

worden. Dennoch ermöglicht die kumulative Darstellung der im Urin

ausgeschiedenen Mengen der Metaboliten einen anschaulichen Vergleich zwischen

DISKUSSION 133

ursprünglich verabreichter Dosis und Ausscheidungsmenge pro Pferd. Zur

Urinmenge werden 24 bis 48 ml/kg KM/Tag angegeben (SCHÄFER, 1999). In

Abbildung 27 beziehungsweise 30 wurden die ausgeschiedenen Mengen Hydroxy-

und Carboxydetomidin für eine Urinmenge von 24 ml/kg KM/Tag errechnet. So hat

Pferd 4 nach 30 Stunden 502 µg 3-Hydroxydetomidin und nach 36 Stunden 11469

µg Carboxydetomidin mit dem Urin ausgeschieden. Pferd 4 war mit 762 kg zugleich

das schwerste Tier der Studie und scheidet nach einer absolut verabreichten Menge

von 15240 µg Detomidin-Hydrochlorid auch die größte Menge Hydroxy- und

Carboxydetomidin mit dem Urin aus. Vergleichend hierzu stellt Pferd 7 das leichteste

Tier der Studie dar. Mit 441 kg KM erhielt dieses Tier eine Menge von 8820 µg

Detomidin-Hydrochlorid und schied kumulativ 194 µg 3-Hydroxydetomidin in den

ersten 30 Stunden und 2340 µg Carboxydetomidin in den ersten 36 Stunden p. a. mit

dem Urin aus. Auch aus der graphischen Darstellung wird deutlich, dass dieses

Pferd damit die geringste Menge Substanz im Vergleich zu den anderen Pferden der

Studie ausscheidet. Es muss jedoch klar sein, dass die Rückberechnung der

ausgeschiedenen Substanzmenge nicht präzise sein kann, da nicht der gesamte

Urin gesammelt und analysiert wurde. Weiterhin werden geringe Mengen von

Detomidin und seinen Metaboliten auf andere Weise eliminiert (BENET et al., 1996).

Hierbei kommt eine Verstoffwechselung in der Leber, eine längerfristige Ablagerung

in andere Gewebe oder die Ausscheidung mit dem Schweiß oder über die

Ausatemluft in Betracht. Zusätzlich ist mit dem Absinken der Konzentration unter die

Nachweisgrenze zwar keine Detektion der Substanzen mehr möglich, jedoch ist auch

zu diesem Zeitpunkt noch ein beachtenswerter Teil des Arzneimittels im Organismus

vorhanden. TOBIN et al. (1982) berechnet die im Organismus befindliche Zahl an

Wirkstoffmolekülen und beschreibt, dass Substanzen allgemein über einen Zeitraum

von circa 66 Halbwertszeiten aus dem Organismus ausgeschieden werden, bevor

das letzte Molekül eliminiert ist. Im vorliegenden Fall entspricht das einer Dauer von

etwa 20 Stunden.

Für Urin konnten die besten Ergebnisse nach der Aufarbeitung mit Hydrolyse durch

ß-Glukoronidase/Arylsulfatase erzielt werden. Messungen ohne Hydrolyse, die

beispielhaft an zwei Pferden durchgeführt wurden, wiesen darauf hin, dass

134 DISKUSSION

3-Hydroxydetomidin zu etwa 58 % frei und zu etwa 42 % glukoronidiert im Urin

vorliegt. Bei Carboxydetomidin ist das Verhältnis nahezu umgekehrt. Etwa 68 % der

Substanz liegen im Urin frei und nur 32 % konjugiert vor. Aufgrund der geringen

Anzahl Pferde, die an einem Vergleich der Aufarbeitung ohne und mit Hydrolyse

teilgenommen haben, sind die Werte jedoch nur als richtungsweisend einzuschätzen.

In der Literatur wurde noch nicht von einer Konjugation des Carboxymetaboliten

berichtet und freies 3-Hydroxydetomidin wurde nach Dünnschichtchromatographie

nur in geringeren Mengen im Urin des Pferdes gefunden (SEYMOUR et al., 1990).

5.4 Effektive und irrelevante Plasmakonzentration, irrelevante Urinkonzentration nach TOUTAIN und LASSOURD (2002), Ausscheidungszeit

Das pharmakokinetische/pharmakodynamische Modell von TOUTAIN und

LASSOURD (2002) führt zur Ermittlung von effektiven und irrelevanten

Plamsmakonzentrationen, sowie irrelevanten Urinkonzentrationen von Detomidin.

Denkansatz zu diesem Modell ist die Problematik, das mit der aktuellen Regelung,

alle Urin- und Plasmaproben, in denen Substanzen gefunden werden für die keine

Grenzwerte bestehen oder die ihren Grenzwert überschreiten, positiv im Sinne von

Doping eingestuft werden. Dabei ist die Entscheidung unabhängig davon, ob noch

eine pharmakologische Wirkung bei dieser Konzentration vorliegt oder nicht. Da die

üblichen Analysemethoden für Wirkstoffe in Urin und Plasma jedoch sehr sensibel

sind (TOBIN et al., 1999) und ihre Weiterentwicklung dazu führt, dass in Zukunft

immer geringere Konzentrationennachgewiesen werden können, wird von TOBIN et

al. (1999) der Lösungsansatz eines Wirkungs-Schwellenwertes für einzelne

Substanzen vorgeschlagen.

Auch TOUTAIN und LASSOURD (2002) erscheint es sinnvoller, die Auswirkungen

eines Wirkstoffes auf den Körper zu prüfen, als seine reine Anwesenheit als Doping

zu bezeichnen. Daher berechnen sie irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen,

bei denen ein Wirkstoff keine relevante pharmakologische Wirksamkeit mehr besitzt.

DISKUSSION 135

Sind diese Konzentrationen bei einer Dopingprobe unterschritten, müsste keine

Reglementierung vorgenommen werden, da ein relevanter Effekt auf den Körper

ausgeschlossen werden kann. Zur Berechnung dieser Konzentrationen werden

pharmakokinetische und pharmakodynamische Daten der Wirkstoffe an der

Zielspezies benötigt. Da Detomidin meistens einmalig für einen bestimmten Zweck

verabreicht wird, kann das von TOUTAIN u. LASSOURD (2002) in der Berechnung

verwendete Dosierungsintervall für Detomidin nur anhand der in der vorliegenden

Studie beobachteten pharmakodynamischen Effekte abgeschätzt werden. Es wird

ein Dosierungsintervall von 4 Stunden angenommen, da Detomidin nach diesem

Zeitpunk keine signifikanten Wirkungen mehr an den Pferden zeigte (siehe 4.6).

Damit beträgt die für Detomidin berechnete effektive Plasmakonzentration (EPC)

durchschnittlich 2,76 ± 0,68 ng/ml, sie liegt somit knapp über der Bestimmungs-

grenze von 2,09 ng/ml. In der vorliegenden Arbeit wird die EPC im Durchschnitt nach

60 – 90 Minuten unterschritten.

Zur Berechnung der irrelevanten Plasmakonzentration (IPC) wurde ein

Sicherheitsfaktor einbezogen. Dieser setzt sich nach TOUTAIN und LASSOURD

(2002) für viele Wirkstoffe aus den Faktoren 10 und 50 zum Ausgleich

interindividueller Schwankungen und Gewährleistung der Validität der Daten

zusammen. Auch in den eigenen Berechnungen wurde ein Sicherheitsfaktor von 500

angenommen. Dadurch ergab sich für die IPC eine Wert von durchschnittlich 0,0055

ng/ml. Dieser liegt weit unter der Nachweisgrenze von 1,67 ng/ml Plasma. Es muss

also davon ausgegangen werden, dass für keine unter der Quantifizierungsgrenze

liegende Konzentration eine Unterscheidung zwischen effektiver und nicht effektiver

Konzentration möglich ist. Der Einsatz dieses Grenzwertes ist daher wenig sinnvoll,

da eine nachweisbare Menge Detomidin im Plasma nach TOUTAIN und LASSOURD

(2002) immer im Bereich einer effektiven Plasmakonzentration liegen würde. In

diesem Fall würde jede detektierbare Menge Detomidin als Doping angesehen und

positiv berichtet werden.

Zur Berechnung einer irrelevanten Urinkonzentration (IUC) nach TOUTAIN und

LASSOURD (2002) wurde die IPC mit dem Urin/Plasma-Konzentrationsverhältnis im

136 DISKUSSION

Steady State (Rss) multipliziert. Hierfür wurde in eigenen Untersuchungen die

durchschnittliche Plasmakonzentration und die durchschnittliche Urinkonzentration

im Dosierungsintervall von 4 Stunden ermittelt. Danach ergab die Rss einen Wert von

durchschnittlich 80,62 was eine IUC von 0,43 ng/ml (siehe Tabelle 36) bedingt. Das

Verhältnis von Plasma- zu Urinkonzentration ist aber vielen Einflüssen unterworfen.

Deshalb kann der Wert der Rss erheblich schwanken. Beeinflussende Parameter sind

hierbei beispielsweise der pH-Wert des Urins oder die diuretische Leistung der

Nieren (SAMS, 1992). Auch TOUTAIN und LASSOURD (2002) weisen darauf hin,

dass der Einsatz der Rss als nicht konstanter Faktor, eine zusätzliche Unsicherheit in

der Berechnung der IUC darstellt und Urin damit eine eher ungeeignete Matrix zur

Bestimmung irrelevanter Wirkstoffkonzentrationen ist.

Mit einer Gleichung nach KIETZMANN (1983) wurden zusätzlich die

Ausscheidungszeiten von Detomidin bis zum Erreichen der IPC, der

Quantifizierungsgrenze (LOQ) und Nachweisgrenze (LOD) bestimmt (siehe Tabelle

37). Die Zeit bis zum Erreichen der IPC lag durchschnittlich bei allen Pferden bei 3,9

± 1,4 Stunden, was mit der Annahme einer Wirkdauer von etwa vier Stunden

korreliert (siehe 4.6). Die interindividuellen Schwankungen von über einer Stunde

verdeutlichen auch hier die Problematik, auf Grundlage dieser Berechnungen

allgemeingültige Aussagen zu treffen. Die Ausscheidungszeit von Detomidin bis zum

Erreichen der Quantifizierungsgrenze (LOQ) unterliegt weniger großen Variationen,

der berechnete Zeitpunkt ist jedoch, verglichen mit der durchschnittlichen

Konzentrations-Zeit-Kurve als zu früh einzuschätzen. Die berechnete ta(LOQ) liegt im

Durchschnitt bei 1,1 ± 0,3 Stunden, während die visuelle Überprüfung der

Konzentrations-Zeit-Kurve eine Ausscheidungszeit von etwa 1,5 Stunden bis zum

Erreichen der Bestimmungsgrenze ergibt. Dasselbe gilt für die mit 1,2 ± 0,4 Stunden

errechnete Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der Detektionsgrenze. Anhand der

visuellen Überprüfung liegt sie eher im Bereich um 2 Stunden nach der Applikation

und ist mittels der Berechnung zu vorsichtig angegeben.

DISKUSSION 137

5.5 Vergleich der pharmakodynamischen Daten mit den Ergebnissen der pharmakokinetischen Berechnungen

In der vorliegenden Arbeit wurden zusätzlich die Parameter Herzfrequenz,

Atemfrequenz, Körpertemperatur, der Grad der Sedation und das Ausmaß der

analgetischen Wirksamkeit von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM ermittelt. Sie

dienen dem Vergleich zwischen praktisch ermittelten und theoretischen, anhand

mathematischer Berechnungen erstellter, Aussagen über die Wirkdauer dieses

Arzneistoffes.

Die Bewertung der Sedation erfolgte über den gesamten Versuch lediglich von einer

Person, was eine einheitliche Bewertungsgrundlage für die Parameter

Kopftiefhaltung, Reaktion auf einen akustischen und einen visuellen Reiz bedeutete.

Die Kopftiefhaltung wird von vielen Autoren als objektives Anzeichen einer Sedation

angesehen (FEDDERN, 1986; SHORT et al., 1986; ALITALO, 1986; HAMM et al.,

1995). In der vorliegenden Studie erzeugte Detomidin innerhalb von 2 Minuten nach

der Applikation ein deutliches Hängenlassen des Kopfes bei allen Pferden. Im Mittel

hielten alle Pferde ihre Köpfe innerhalb der ersten Stunde p. a. tief gesenkt. Danach

ließ die sedierende Wirkung langsam nach, bis nach 4 Stunden alle Tiere wieder

eine normale Kopfhaltung zeigten. Ein akustischer Reiz erfolgte immer möglichst

einheitlich von einer Person in definiertem Abstand vom Pferd. Problematisch war die

individuelle Reaktivität der Tiere auf den Reiz. Während schreckhafte Tiere eine

deutlichere Reaktion auf das Geräusch zeigten, begegneten zwei der Tiere dem

Rasseln eher mit Neugier. Deshalb wurde die Reaktion während des Versuches auf

den Reaktionszustand vor der Applikation bezogen. Trotz dieser Schwierigkeit

konnte bei allen Pferden eine deutlich verminderte bis erloschene Reaktionsfähigkeit

innerhalb der ersten Stunde p. a. ermittelt werden. Die Basiswerte wurden erst 4

Stunden nach der Applikation wieder erreicht. In Anlehnung an ein Modell von

HAMM et al. (1995) wurde die Reaktion auf einen visuellen Reiz mittels einer roten

Tüte, die vor dem Kopf der Tiere hin und her geschwungen wurde, ermittelt. Es

wurde strikt darauf geachtet, immer denselben Abstand zum Pferd einzuhalten und

während der Bewegung keine zusätzlichen Geräusche zu verursachen. Die Reaktion

138 DISKUSSION

der Tiere war insgesamt intensiver als auf den akustischen Reiz. Bei der Ermittlung

der Ruhewerte war das Schwenken der Tüte in allen Fällen mit einem deutlichen

Zurückweichen und Anzeichen von Nervosität verbunden. Nach der Applikation von

Detomidin-Hydrochlorid konnte eine deutliche Verminderung der Reaktivität

innerhalb der ersten Stunde festgestellt werden, was die sedierende Wirkung von

Detomidin verdeutlicht. Weder in Bezug auf den akustischen Reiz, noch im Fall der

visuellen Provokation, ist von einer Gewöhnung an die Stimuli auszugehen, da alle

Tiere nach etwa vier Stunden wieder ihre Ausgangsreaktivität ohne Anzeichen einer

Konditionierung erreichten.

Für die genannten Parameter wurde ein Punkte-Bewertungsschema ausgearbeitet,

das basierend auf der Summe der Punkte der einzelnen Parameter den

Sedationsgrad jedes Pferdes gesamtheitlich beurteilt. Es wurden sowohl für die

Kopftiefhaltung, als auch für die Reaktion auf den akustischen, beziehungsweise den

visuellen Reiz jeweils 0 – 3 Punkte vergeben. Daraus ergibt sich eine Gesamt-

punktsumme für den Sedationsgrad von 0 – 9. Bei 0 Punkten liegt keine Sedation

vor. Bei einer hochgradigen Sedation ohne Reizantwort ergeben sich maximal 9

Punkte. Der Vergleich des durchschnittlichen Sedationsgrades mit der

Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve (Abbildung 39) macht deutlich, dass die sedative

Wirkung von Detomidin praktisch zeitgleich mit der Applikation einsetzt. Diese für

den Wirkungseintritt ermittelten Ergebnisse stimmen mit den Beobachtungen von

LOWE und HILFIGER (1984), CLARKE und TAYLOR (1986) und JÖCHLE und

HAMM (1986) überein. Über eine Stunde kann eine hochgradige Sedation bei allen

Tieren beobachtet werden, wobei die maximalen Effekte hier nicht nach 15, sondern

nach 30 Minuten zu beobachten waren. Nach zwei Stunden waren immer noch

deutliche Anzeichen der Sedation bei allen Pferden für alle drei Parameter im Mittel

vorhanden. Erst vier Stunden p. a. konnte keine sedative Wirkung mehr festgestellt

werden. Vergleichbar zu den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit führten 20 µg

Detomidin-Hydrochlorid/kg KM in Studien von HAMM und JÖCHLE (1986) zu einer

sehr tiefen und zufriedenstellenden Sedation in der ersten Stunde p. a. mit deutlicher

Sedation von bis 3 zu Stunden Dauer. Auch CLARKE und TAYLOR (1986) sprechen

von einer tiefen Sedation über eine Dauer von etwa 1 Stunde. Vergleicht man die

DISKUSSION 139

Dauer dieser Wirkung mit dem Zeitpunkt des Unterschreitens der nach TOUTAIN

und LASSOURD (2002) ermittelten effektiven Plasmakonzentration von

durchschnittlich 2,76 ± 0,68 ng/ml, so ist ersichtlich, dass bei Erreichen dieser

Konzentration nach 60 bis 90 Minuten noch ein pharmakologischer Effekt

festzustellen ist. Hier sind theoretische Ermittlung und praktische Überprüfung zu

demselben Ergebnis gelangt. Die ineffektive Plasmakonzentration (IPC) hingegen

liegt mit durchschnittlich 0,0055 ng/ml weit unterhalb der Nachweisgrenze von 1,67

ng/ml Plasma.

Alternativ erfolgte die Berechnung der Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der IPC

nach KIETZMANN (1983). Sie liegt bei allen Pferden durchschnittlich bei 4 Stunden

und damit in dem Bereich, der auch praktisch für die Dauer der sedativen Effekte

ermittelt wurde. Der Vergleich der ineffektiven Urinkonzentration (IUC) mit der

ermittelten Dauer der sedativen Effekte ist schwierig, weil der theoretisch ermittelte

Wert der IUC von 0,43 ng/ml weit unterhalb der Nachweisgrenze liegt.

Der Schmerzbeurteilung beim Tier sind enge Grenzen gesetzt, da Schmerz als

subjektives Empfinden einer objektiven Erfassung nicht zugänglich gemacht werden

kann (LANZ, 1998). In der vorliegenden Arbeit wurde in Anlehnung an den von

JÖCHLE und HAMM (1986) sowie HAMM et al. (1995) entwickelten Reizgenerator

ein Stromreiz zur Überprüfung der analgetischen Wirksamkeit von Detomidin

verwendet. Dieses Schmerzmodell wurde ausgewählt, weil es wichtige

Voraussetzungen erfüllt, um aussagekräftige Resultate zu liefern (KAMERLING et

al., 1985; JÖCHLE u. HAMM, 1986; BRUNSON et al., 1987). Dazu gehört, dass der

Stimulus, der eine Antwort auslöst, so gering wie möglich sein soll. Die Antwort soll

möglichst natürlich, schnell und wiederholbar sein und sowohl der Reiz als auch die

Reaktion müssen quantifizierbar sein. Bei einer Reaktion muss der Stimulus sofort

beendet werden können, und es darf keine Gewebeschädigung eintreten. Nach

LANZ (1998) erfüllt ein Stromtestmodell die genannten Anforderungen und liefert

objektivierbare Ergebnisse. In der vorliegenden Studie reagierten alle 10 Pferde im

Ruhezustand schon bei 5 mA mit dem Anheben der gereizten Gliedmaße. Nach der

Applikation von Detomidin wurden individuell stark variierende Stromstärken

140 DISKUSSION

benötigt, um zu einer Reizantwort zu führen. Während Pferd 1 nach 10 Minuten auf

den maximalen Reiz von 40 mA gerade noch reagierte, war es bei Pferd 9 lediglich

einmal nach 30 Minuten möglich, eine erhöhte Reizschwelle von 10 mA zu erreichen.

Dieses Tier verhielt sich in Bezug auf die analgetische Wirksamkeit deutlich anders

als die übrigen 9 Tiere. Da jedoch bei Schmerzmodellen individuelle Grenzen

innerhalb einer Population durchaus zu erwarten waren, wurde Pferd 9 mit in die

durchschnittliche Berechnung für eine Reizantwort einbezogen. Durchschnittlich war

die analgetische Wirksamkeit 2 Minuten p. a. bereits deutlich ausgeprägt und

erreichte nach 30 Minuten ihr Maximum. Diese Ergebnisse bestätigen Resultate von

ALITALO und VAINIO (1982). JÖCHLE und HAMM (1986) beschrieben nach einer

Dosierung von 20 µg/kg KM eine 15 bis 60 Minuten andauernde Analgesie der

Gliedmaßen. In der eigenen Studie sind nach 2 Stunden bereits fast wieder die

Basiswerte erreicht, so dass von einer kürzeren Dauer der Analgesie im Vergleich

zur sedativen Wirkung von Detomidin gesprochen werden kann. Vergleicht man das

Ergebniss der analgetischen Wirkung mit der nach TOUTAIN und LASSOURD

(2002) ermittelten EPC, so ist ersichtlich, dass bei Erreichen dieser Konzentration

bereits kein analgetischer Effekt mehr erkennbar ist. Die theoretische Berechnung

der Parameter EPC, IPC und IUC trifft also nicht für die analgetische Wirksamkeit

von Detomidin zu.

Detomidin führt, wie auch die meisten anderen α2-Adrenozeptor-Agonisten zu einem

deutlichen Absinken der Herzfrequenz. Dies wird sowohl beim Pferd (VAINIO, 1985;

SHORT et al., 1986) als auch beim Rind (ALITALO u. VAINIO, 1982) beschrieben.

Die in dieser Studie für den Wirkungseintritt ermittelte Zeit von 2 Minuten stimmt mit

Ergebnissen von VAINIO (1985) und SHORT et al. (1986) überein. Über einen

Zeitraum von 3 Stunden blieben die Werte für alle Pferde im Mittel signifikant

erniedrigt. Die Ruhewerte wurden erst wieder 6 Stunden p. a. erreicht. FEDDERN

(1986) berichtet über eine signifikante Veränderung der Herzfrequenz über 70

Minuten, während SARAZAN et al. (1989) eine über 120 Minuten anhaltende

Bradykardie feststellten. Eventuell wurde durch die unter Punkt 3.2.4 beschriebene

Versuchsanordnung mit möglichst wenig Irritationen der Tiere durch Personen oder

Handling ein verstärkter vagaler Tonus, verglichen mit anderen Studien,

DISKUSSION 141

aufrechterhalten, was zu einer verlängerten Erniedrigung der Herzfrequenz geführt

haben kann.

Trotz der kontroversen Angaben in der Literatur zur Veränderung der Atemfrequenz

unter dem Einfluss von Detomidin, konnte in der vorliegenden Arbeit eine signifikante

Abnahme der Atemfrequenz über einen Zeitraum von 3 Stunden festgestellt werden.

Dieses Ergebnis widerspricht damit den Angaben von FEDDERN (1986),

REITMEYER et al. (1986) und DAUNT et al. (1993), die einen signifikanten Anstieg

beziehungsweise keine signifikante Veränderung der Atemfrequenz beschrieben.

Die Körperinnentemperatur fiel für die Dauer von zwei Stunden nach der Applikation

signifikant bei allen Pferden ab. Dieses Phänomen war bis dahin nur an Ratten

festgestellt worden (VIRTANEN u. MACDONALD, 1985; VIRTANEN, 1986).

Beachtenswert ist der Anstieg der Temperatur über den Ausgangswert hinaus. Nach

etwa 7 Stunden p. a. erreicht sie 38°C. Eventuell ist dieser Anstieg über den

Basiswert hinaus durch die erhöhte Bewegungsaktivität der Tiere nach der langen

Phase des Stehens im Beobachtungsstand zu erklären. Vergleicht man die Dauer

der signifikanten Veränderungen von Herzfrequenz, Atemfrequenz und Körper-

temperatur mit der nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) ermittelten EPC kann

festgestellt werden, dass für alle drei Parameter der theoretische Wert der EPC

durch die praktische Ermittlung bestätigt werden kann. Für die IPC und IUC ergeben

sich die unter der Bewertung des Sedationsgrades genannten Probleme.

Das Ausmaß der pharmakologischen Wirkung einer Substanz wird durch die Anzahl

an Rezeptoren für den Wirkstoff, sowie dessen Affinität zum Rezeptor bestimmt

(SAMS, 1992; KAMERLING u. OWENS, 1994). Nach intravenöser Applikation wird

für alle überprüften Parameter schnell das Wirkungsmaximum erreicht. Durch die

Verteilung im Organismus und die abhängige Veränderung der Wirkstoff-

konzentration im Zielgewebe, kann die unterschiedliche Dauer verschiedener

pharmakologischer Wirkungen durch verschieden lange Besetzung der Rezeptoren

erklärt werden.

142 DISKUSSION

5.6 Bewertung der Ergebnisse

Mit dieser Arbeit wurde eine geeignete Analysemethode für den Nachweis von

Detomidin und seinen Metaboliten in Plasma und Urin entwickelt und validiert. Die

Etablierung dieser Methode in die internationale Routinediagnosik kann zum

vereinheitlichten Nachweis von Detomidin in Dopingproben genutzt werden.

Die Ermittlung der irrelevanten Plasma- und Urinkonzentrationen von Detomidin nach

TOUTAIN und LASSOURD (2002) sollte der Prüfung der Möglichkeit der

Bestimmung von Grenzwerten dienen. Im Gegensatz zur aktuellen sogenannten

„Null-Lösung“ könnten Grenzwerte den Einsatz von Detomidin zu therapeutischen

Zwecken vor einem Wettkampf ermöglichen. Die Ergebnisse zeigen jedoch, dass

theoretische Werte nicht immer mit den praktisch erhaltenen Ergebnissen

übereinstimmen. Während die effektive Plasmakonzentration nach TOUTAIN und

LASSOURD (2002) durch die Resultate dieser Studie bestätigt wird, liegen die

irrelevante Plasma- und Urinkonzentration unterhalb der Nachweisgrenze der

entwickelten Methode und können daher als nicht praxixsrelevant beurteilt werden.

Die nach KIETZMANN (1983) ermittelte Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der

IPC stellt sich als praktikables Werkzeug für die Bestimmung von Eliminationszeiten

im Plasma dar. Die berechneten Ausscheidungszeiten bis zum Erreichen der

Bestimmungs- und Nachweisgrenze hingegen können durch die Ergebnisse der

Analyse nicht bestätigt werden.

Ein großer Vorteil der erhaltenen Ergebnisse dieser Studie ist die Möglichkeit des

direkten Vergleichs zwischen theoretischer Berechnung und gleichzeitiger

praktischer Überprüfung der Ergebnisse. Es wird deutlich, dass bei der Berechnung

kinetischer Daten interindividuelle Variationen berücksichtigt werden und in die

Interpretation der Ergebnisse einfließen müssen. Aufgrund der relativ zur

Gesamtpopulation noch immer geringen Anzahl von Versuchstieren, können die

ermittelten Daten nicht einfach auf alle Pferde übertragen werden. Um den Schutz

der Tiere vor den Folgen eines missbräuchlichen Einsatzes von Detomidin zum

Zwecke des Dopings zu schützen, müssen klare, auf die Gesamtpopulation

DISKUSSION 143

zutreffende Bestimmungen geschaffen werden. Eine Ermittlung von Grenzwerten für

Detomidin in Dopingproben ist daher zur Zeit nicht sinnvoll. Das bedeutet, dass jeder

Nachweis von Detomidin oder seinen Metaboliten in Plasma oder Urin als positiver

Dopingbefund bewertet werden muss.

144 ZUSAMMENFASSUNG

6 ZUSAMMENFASSUNG

Severine Tobias (2004):

Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes Detomidin hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Validierung einer geeigneten

Analysemethode für Detomidin in Pferdeplasma- und -urinproben, um pharmako-

kinetische Berechnungen sowie pharmakodynamische Untersuchungen an Pferden

durchzuführen.

Grundlage für die Entwicklung der Methode waren im Institut für Biochemie der

Deutschen Sporthochschule Köln etablierte Routineverfahren, die durch in einem

Vorversuch gewonnene Proben speziell für Detomidin modifiziert wurden. Sowohl im

Vor- als auch im Hauptversuch wurde Pferden Detomidin-Hydrochlorid in einer

mittleren therapeutischen Dosierung von 20 µg/kg KM einmalig intravenös appliziert.

Der Nachweis von Detomidin im Plasma erfolgte nach einer Flüssig-Flüssig-

Extraktion mittels HPLC/MS/MS-Methode. Für die Detektion von Detomidin und

seinen Metaboliten 3-Hydroxydetomidin und Carboxydetomidin im Urin wurde eine

Aufarbeitung mit Ionenaustauschersäulen entwickelt. Auch diese Proben wurden

nach Einengung des Volumens der Messung im HPLC/MS/MS zugeführt.

Vergleichsweise wurden Urinproben mit und ohne Hydrolyse aufgearbeitet, um den

Anteil an frei ausgeschiedenem 3-Hydroxy- und Carboxydetomidin bestimmen zu

können. Als interne Standards wurden Medetomidin und Imidazolylbenzoesäure

verwendet.

Die Validierung der Methode umfasste die Parameter Selektivität und Spezifität,

Linearität, Richtigkeit, Präzision, Stabilität und Wiederfindung. Die Bestimmungs-

grenze lag im Plasma bei 2,09 ng/ml und im Urin bei 10 ng/ml für 3-

Hydroxydetomidin und 50 ng/ml für Carboxydetomidin. Die Nachweisgrenze für

Detomidin im Plasma betrug 1,67 ng/ml. Für 3-Hydroxydetomidin lag die

Nachweisgrenze bei 10 ng/ml und für Carboxydetomidin bei 50 ng/ml.

ZUSAMMENFASSUNG 145

Maximale Konzentrationen von Detomidin im Plasma wurden 2 beziehungsweise 5

Minuten p. a. ermittelt und lagen zwischen 12 und 35 ng/ml Plasma. Die maximalen

Konzentration von 3-Hydroxydetomidin wurden mit 31 bis 130 ng/ml Urin 3 bis 6

Stunden p. a. gemessen. Carboxydetomidin erreichte seine höchsten Konzen-

trationen von 450 bis 1550 ng/ml Urin im Zeitraum 5 bis 8 Stunden p. a. Die

Nachweisgrenze wurde im Plasma nach 3 Stunden, im Urin nach 24 Stunden (3-

Hydroxydetomidin) beziehungsweise 30 Stunden (Carboxydetomidin) unterschritten.

Die ermittelten pharmakokinetischen Daten wurden zur Berechnung der effektiven

beziehungsweise irrelevanten Plasma- und Urinkonzentrationen nach dem PK/PD-

Modell von TOUTAIN und LASSOURD (2002) herangezogen. Bei einem

angenommenen Dosierungsintervall von vier Stunden liegen die irrelevante Plasma-

und Urinkonzentration deutlich unterhalb der Nachweisgrenze für die verwendete

Methode. Es ist daher davon auszugehen, dass jeglicher Nachweis von Detomidin

oder seinen Metaboliten als positiver Dopingbefund zu bewerten ist.

Neben der Gewinnung von Plasma- und Urinproben für die pharmakokinetischen

Untersuchungen wurden pharmakodynamische Parameter wie Herz- und

Atemfrequenz, Körpertemperatur, Sedationsgrad und Grad der analgetischen

Wirkung erfasst und mit den berechneten irrelevanten Plasma- und

Urinkonzentrationen nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) und zusätzlich

berechneten Ausscheidungszeiten verglichen. Durch den in dieser Studie

ermöglichten Vergleich zwischen praktischer und theoretischer Ermittlung von

Ausscheidungszeiten und pharmakologischen Wirkungen wurde deutlich, dass

theoretische Berechnungen der irrelvanten Plasma- und Urinkonzentrationen, sowie

verschiedener Ausscheidungszeiten nicht immer mit den im Tierversuch ermittelten

Ergebnissen übereinstimmen. Aufgrund der relativ zu Gasamtpopulation noch immer

geringen Anzahl von Versuchstieren und beachtenswerter interindividueller

Variabilität sollte keine, auf die Gesamtpopulation übertragbare, Aussage zu

Ausscheidungszeiten getroffen und jeder Nachweis von Detomidin oder seinen

Metaboliten als positiver Dopingbefund betrachtet und geahndet werden.

146 SUMMARY

7 SUMMARY

Severine Tobias (2004):

Investigation of pharmacocinetic mechanisms of the drug detomidine with respect to ist relevance in horse-doping

The aim of this study was to develop and validate a suitable method for the analysis

of detomidine in equine plasma and urinesamples and evaluate its application for

pharmacocinetic calculations and pharmacodynamic examinations on horses.

The analytical method was based upon some established routine procedures at the

Institute of Biochemistry at the Deutsche Sporthochschule in Cologne, which were

specially modified for the substance detomidine using samples collected in a

preliminary study. The horses in the preliminary experiment as well as in the main

expermiment received detomidine-hydrochloride in a middle-ranged therapeutical

dose of 20 µg/kg body weight intravenously. The detection of detomidine in plasma

was performed using a HPLC/MS/MS-method after liquid-liquid-extraction. For the

diagnosis of detomidine and its metabolites 3-hydroxydetomidine and

carboxydetomidine in urine an additional recondition step using cation-exchange-

cartridges was developed. Following evaporation of the liquid volume these samples

were prepared for analysis in the HPLC/MS/MS as well. In comparison urinesamples

were prepared with or without hydrolysis to determine the unconjugated 3-hydroxy-

and carboxydetomidine. Medetomidine and imidazolylbencoicacid were used as

internal standards.

The validation of the analytical method was performed on the parameters selectivity

and specitivity, linearity, accuracy, precision, stability and recovery. The limit of

quantification was 2,09 ng/ml in plasma, 10 ng/ml for 3-hydroxydetomidine and 50

ng/ml for carboxydetomidine. The limit of detection was fixed at 1,67 ng/ml in plasma,

at 10 ng/ml for 3-hydroxydetomidine and 50 ng/ml for carboxydetomidine.

SUMMARY 147

Maximum concentrations of detomidine in plasma were detected 2 to 5 minutes p. a.

within the range of 12 and 35 ng/ml plasma. The maximum concentrations for 3-

hydroxydetomidine in urine were measured between 3 to 6 hours p. a. and varied

between 31 to 130 ng/ml. For carboxydetomidine the highest concentrations ranged

from 450 to 1550 ng/ml urine at 5 to 8 hours p. a. Detomidine in plasma samples was

detectable for only three hours p. a., while the concentration of 3-hydroxydetomdine

and carboxydetomidine were below the limit of detection after 24 and 30 hours

respectively.

The calculated pharmacocinetic data were integrated into a pharmacocinetic/

pharmacodynamic model of TOUTAIN and LASSOURD (2002) to calculate the

effective and irrelevant plasma and urine concentrations. Given a dosage interval of 4

hours within this study, it came clear that irrelevant plasma and urinconcentrations

were far below the detection-limit of the analytical method applied in this study.

Therefore, it has been concluded that any detection of detomidine or its metabolites

has to be considered as a positive dopingresult.

Additionally to sampling plasma and urine for the pharmacocinetic approach there

were investigated some pharmacodynamic parameters such as heart rate, respiration

rate, body temperature, level of sedation and analgesia were recorded and compared

to the effective and irrelevant plasma and urine concentrations calculated by the

pharmacocinetic/pharmacodynamic model of TOUTAIN and LASSOURD (2002) as

well as calculated excretion times. With the opportunity of this study to compare

between practically and theoretically investigated data regarding excretion times and

pharmacological effects, it was shown that the thoretical calclation is not always

comparable to the data achieved in an animal experiment. Due to the fact that every

animal experiment has to compromise in the number of animals included, therefore

representing only a small part of the population, and with regards to notable

individual variation, no defined statement can be made for general excretion times.

Thus, every detection of either detomidine or its metabolites can be counted as a

positive doping result and should be punished according to the law.

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ZIEGLER, K. (2003): „Sedativa“, Wie wirken sie? http://www.vetmed.uni-giessen.de/mvk/

ANHANG 163

9 ANHANG

Im Anhang finden sich folgende Tabellen:

Tabelle 38 Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben und ermittelte Konzentrationen

in ng/ml der Pferde 1 – 10 (n.n. = nicht nachweisbar)

Tabelle 39 Entnahmezeitpunkte und Konzentrationen 3-Hydroxydetomidin im Urin


Tabelle 40 Entnahmezeitpunkte und Konzentrationen 3-Hydroxydetomidin im Urin


Tabelle 41 Entnahmezeitpunkte und Konzentrationen Carboxydetomidin im Urin in

ng/ml der Pferde 1 – 5 (n.n. = nicht nachweisbar)

Tabelle 42 Entnahmezeitpunkte und Konzentrationen Carboxydetomidin im Urin in

ng/ml der Pferde 6 – 10 (n.n. = nicht nachweisbar)

Tabelle 43 Entnahmezeitpunkte und kumulative ausgeschiedene Menge 3-

Hydroxydetomidin in ng/ml der Pferde 1 – 5

Tabelle 44 Entnahmezeitpunkte und kumulative ausgeschiedene Menge 3-

Hydroxydetomidin in ng/ml der Pferde 6 – 10

Tabelle 45 Entnahmezeitpunkte und kumulative ausgeschiedene Menge

Carboxydetomidin in ng/ml der Pferde 1 – 5

Tabelle 46 Entnahmezeitpunkte und kumulative ausgeschiedene Menge

Carboxydetomidin in ng/ml der Pferde 6 – 10

164 ANHANG

p19 36 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n.










p9 2 1 n.n. 2 2 2 2 n.n. n.n. 1 n.n.

p8 1,5 2 1 2 2 3 2 1 1 1 2

p7 1 3 3 3 4 3 4 2 2 2 3

p6 0,75 5 4 5 6 6 6 4 3 3 5

p5 0,5 8 7 10 8 9 7 8 6 7 8

p4 0,25 14 12 16 16 14 14 12 11 14 19

p3 0,17 16 16 22 17 21 18 17 16 17 24

p2 0,08 20 18 28 18 23 17 18 19 22 30

p1 0,03 12 16 21 22 27 22 17 22 20 35

p0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Pferd 8 [ng/ml]

Pferd 9 [ng/ml]

Pferd 10 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkt

[h]

Pferd 4 [ng/ml]

Pferd 5 [ng/ml]

Pferd 6 [ng/ml]

Pferd 7 [ng/ml]Probe Pferd 2

[ng/ml]Pferd 1 [ng/ml]

Pferd 3 [ng/ml]

Tabelle 38: Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben und ermittelte Konzentrationen in ng/ml der

Pferde 1 – 10 (n. n. = nicht nachweisbar)

ANHANG 165

ProbeEntnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 1 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 2 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 3 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 4 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 5 [ng/ml]

u17 144 n.n.

u16 120 n.n.

u15 96 n.n. 144 n.n.

u14 72 n.n. 120 n.n. 144 n.n. 144,00 n.n.

u13 48 n.n. 96 n.n. 144,00 n.n. 120 n.n. 120,00 n.n.

u12 36,03 n.n. 69,33 n.n. 120,00 n.n. 96 n.n. 96,00 n.n.

u11 30 n.n. 48 n.n. 96 n.n. 72 n.n. 72 n.n.

u10 24,6 n.n. 35,9 n.n. 70,64 n.n. 48 n.n. 48 n.n.

u9 12,6 n.n. 30 n.n. 46,63 n.n. 35,93 n.n. 36,03 n.n.

u8 11,88 2 23,95 n.n. 36 n.n. 30 n.n. 30 n.n.

u7 8,75 5 12,08 n.n. 30 n.n. 23,9 n.n. 24,03 2

u6 6,6 13 10,08 8 24 1 11,93 16 12,08 32

u5 5,95 28 7,9 18 11,9 21 9,75 26 9,98 47

u4 4,5 32 6,83 24 9,2 37 7,72 45 8,03 41

u3 3,25 56 4,66 47 5,77 63 5,58 59 5,95 76

u2 2,25 5 4,03 130 4,07 101 3,5 48 4,01 106

u1 1,58 10 2,1 114 1,98 42 1,82 22 1,63 23

u0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tabelle 39: Entnahmezeitpunkte und Konzentrationen 3-Hydroxydetomidin im Urin in ng/ml der

Pferde 1 – 5 (n.n. = nicht nachweisbar)

166 ANHANG


[h]

Pferd 6 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 7 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 8 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 9 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 10

[ng/ml]

u17

u16

u15 144 n.n. 144 n.n.

u14 144 n.n. 144 n.n. 120 n.n. 144 n.n. 120 n.n.

u13 120 n.n. 120 n.n. 96 n.n. 120 n.n. 96 n.n.

u12 96 n.n. 96 n.n. 72 n.n. 96 n.n. 72 n.n.

u11 72 n.n. 72 n.n. 48 n.n. 72 n.n. 48 n.n.

u10 48 n.n. 48 n.n. 36,5 10 48 7 35,93 n.n.

u9 36,07 n.n. 35,93 n.n. 30 8 35,88 7 30 n.n.

u8 30 n.n. 30 6 23,97 8 30 8 24 9

u7 23,85 n.n. 23,95 10 11,95 35 24 11 11,95 26

u6 11,92 28 11,93 27 9,95 26 12,12 13 9,98 40

u5 9,92 38 10 29 8,08 27 9,82 25 7,97 47

u4 8,03 55 8,25 23 6,08 34 7,92 23 6,08 73

u3 5,90 66 7,05 25 4,82 33 5,95 31 4,08 95

u2 4,00 85 5,12 49 3,25 22 4,03 27 2,62 78

u1 1,95 8 3,23 5 1,67 14 2,2 19 1,23 34

u0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tabelle 40: Entnahmezeitpunkte und Konzentrationen 3-Hydroxydetomidin im Urin in ng/ml der

Pferde 6 – 10 (n.n. = nicht nachweisbar)

ANHANG 167


[h]

Pferd 1 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 2 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 3 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 4 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 5 [ng/ml]

u17 144 n.n.

u16 120 n.n.

u15 96 n.n. 144 n.n.

u14 72 n.n. 120 n.n. 144 n.n. 144,00 n.n.

u13 48 n.n. 96 n.n. 144,00 n.n. 120 n.n. 120,00 n.n.

u12 36,03 22 69,33 n.n. 120,00 n.n. 96 n.n. 96,00 n.n.

u11 30 35 48 n.n. 96 n.n. 72 n.n. 72 n.n.

u10 24,6 59 35,9 16 70,64 n.n. 48 n.n. 48 n.n.

u9 12,6 369 30 26 46,63 n.n. 35,93 n.n. 36,03 n.n.

u8 11,88 605 23,95 39 36 4 30 340 30 n.n.

u7 8,75 601 12,08 317 30 21 23,9 405 24,03 245

u6 6,6 633 10,08 736 24 53 11,93 454 12,08 682

u5 5,95 223 7,9 1547 11,9 595 9,75 540 9,98 818

u4 4,5 282 6,83 1528 9,2 521 7,72 580 8,03 1253

u3 3,25 159 4,66 830 5,77 960 5,58 621 5,95 1246

u2 2,25 24 4,03 143 4,07 443 3,5 153 4,01 689

u1 1,58 25 2,1 19 1,98 23 1,82 135 1,63 11

u0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tabelle 41: Entnahmezeitpunkte und Konzentrationen Carboxydetomidin im Urin in ng/ml der Pferde

1 – 5 (n.n. = nicht nachweisbar)

168 ANHANG


[h]

Pferd 6 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 7 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 8 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 9 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 10

[ng/ml]

u17

u16

u15 144 n.n. 144 n.n.

u14 144 n.n. 144 n.n. 120 n.n. 144 n.n. 120 n.n.

u13 120 n.n. 120 n.n. 96 n.n. 120 n.n. 96 n.n.

u12 96 n.n. 96 n.n. 72 n.n. 96 n.n. 72 n.n.

u11 72 n.n. 72 n.n. 48 n.n. 72 n.n. 48 n.n.

u10 48 n.n. 48 n.n. 36,5 n.n. 48 n.n. 35,93 n.n.

u9 36,07 n.n. 35,93 n.n. 30 216 35,88 n.n. 30 27

u8 30 n.n. 30 n.n. 23,97 301 30 21 24 19

u7 23,85 86 23,95 40 11,95 1188 24 31 11,95 419

u6 11,92 223 11,93 153 9,95 1365 12,12 366 9,98 479

u5 9,92 394 10 156 8,08 1504 9,82 456 7,97 615

u4 8,03 358 8,25 388 6,08 1143 7,92 516 6,08 834

u3 5,90 448 7,05 1038 4,82 683 5,95 426 4,08 659

u2 4,00 283 5,12 761 3,25 274 4,03 73 2,62 189

u1 1,95 45 3,23 107 1,67 37 2,2 50 1,23 41

u0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tabelle 42: Entnahmezeitpunkte und Konzentrationen Carboxydetomidin im Urin in ng/ml der Pferde

6 – 10 (n.n. = nicht nachweisbar)

ANHANG 169


[h]

Pferd 1 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 2 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 3 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 4 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 5 [ng/ml]

u17 144 418

u16 120 418

u15 96 418 144 377

u14 72 418 120 377 144 502 144,00 464

u13 48 418 96 377 144,00 386 120 502 120,00 464

u12 36,03 418 69,33 377 120,00 386 96 502 96,00 464

u11 30 418 48 377 96 386 72 502 72 464

u10 24,6 418 35,9 377 70,64 386 48 502 48 464

u9 12,6 418 30 377 46,63 386 35,93 502 36,03 464

u8 11,88 418 23,95 377 36 386 30 502 30 464

u7 8,75 402 12,08 377 30 386 23,9 502 24,03 464

u6 6,6 377 10,08 377 24 386 11,93 501 12,08 448

u5 5,95 325 7,9 366 11,9 376 9,75 356 9,98 404

u4 4,5 222 6,83 354 9,2 339 7,72 303 8,03 344

u3 3,25 131 4,66 321 5,77 258 5,58 185 5,95 287

u2 2,25 17 4,03 303 4,07 189 3,5 109 4,01 190

u1 1,58 10 2,1 148 1,98 53 1,82 33 1,63 25

u0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tabelle 43: Entnahmezeitpunkte und kumulative ausgeschiedene Menge 3-Hydroxydetomidin in

ng/ml der Pferde 1 – 5

170 ANHANG


[h]

Pferd 6 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 7 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 8 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 9 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 10

[ng/ml]

u17

u16

u15 144 230 144 413

u14 144 410 144 194 120 230 144 313 120 413

u13 120 410 120 194 96 230 120 313 96 413

u12 96 410 96 194 72 230 96 313 72 413

u11 72 410 72 194 48 230 72 313 48 413

u10 48 410 48 194 36,5 230 48 313 35,93 413

u9 36,07 410 35,93 194 30 230 35,88 267 30 413

u8 30 410 30 194 23,97 230 30 243 24 413

u7 23,85 410 23,95 178 11,95 179 24 217 11,95 355

u6 11,92 408 11,93 127 9,95 141 12,12 147 9,98 327

u5 9,92 368 10 104 8,08 114 9,82 131 7,97 283

u4 8,03 316 8,25 82 6,08 84 7,92 105 6,08 235

u3 5,90 230 7,05 69 4,82 61 5,95 80 4,08 157

u2 4,00 139 5,12 48 3,25 32 4,03 48 2,62 82

u1 1,95 12 3,23 8 1,67 13 2,2 22 1,23 23

u0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tabelle 44: Entnahmezeitpunkte und kumulative ausgeschiedene Menge 3-Hydroxydetomidin in

ng/ml der Pferde 6 – 10

ANHANG 171


[h]

Pferd 1 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 2 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 3 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 4 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 5 [ng/ml]

u17 144 3600

u16 120 3600

u15 96 3600 144 5421

u14 72 3600 120 5421 144 9178 144,00 8316

u13 48 3600 96 5421 144,00 4345 120 9178 120,00 8316

u12 36,03 3600 69,33 5421 120,00 4345 96 9178 96,00 8316

u11 30 3516 48 5421 96 4345 72 9178 72 8316

u10 24,6 3400 35,9 5421 70,64 4345 48 9178 48 8316

u9 12,6 2958 30 5360 46,63 4345 35,93 9178 36,03 8316

u8 11,88 2792 23,95 5262 36 4345 30 9178 30 8316

u7 8,75 1614 12,08 4973 30 4331 23,9 7595 24,03 8316

u6 6,6 810 10,08 4582 24 4249 11,93 3902 12,08 6389

u5 5,95 554 7,9 3591 11,9 3839 9,75 3148 9,98 5447

u4 4,5 352 6,83 2568 9,2 2811 7,72 2313 8,03 4397

u3 3,25 133 4,66 518 5,77 1666 5,58 1367 5,95 2682

u2 2,25 34 4,03 195 4,07 622 3,5 384 4,01 1092

u1 1,58 24 2,1 25 1,98 29 1,82 187 1,63 12

u0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tabelle 45: Entnahmezeitpunkte und kumulative ausgeschiedene Menge Carboxydetomidin in ng/ml

der Pferde 1 – 5

172 ANHANG


[h]

Pferd 6 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 7 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 8 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 9 [ng/ml]

Entnahme-zeitpunkte

[h]

Pferd 10

[ng/ml]

u17

u16

u15 144 8755 144 3397

u14 144 3285 144 2340 120 8755 144 2302 120 3397

u13 120 3285 120 2340 96 8755 120 2302 96 3397

u12 96 3285 96 2340 72 8755 96 2302 72 3397

u11 72 3285 72 2340 48 8755 72 2302 48 3397

u10 48 3285 48 2340 36,5 8755 48 2302 35,93 3397

u9 36,07 3285 35,93 2340 30 8755 35,88 2302 30 3397

u8 30 3285 30 2340 23,97 8037 30 2302 24 3309

u7 23,85 3285 23,95 2340 11,95 6040 24 2236 11,95 3183

u6 11,92 2536 11,93 2127 9,95 4729 12,12 2037 9,98 2736

u5 9,92 2210 10 1997 8,08 3320 9,82 1584 7,97 2216

u4 8,03 1667 8,25 1876 6,08 1659 7,92 1118 6,08 1589

u3 5,90 1109 7,05 1670 4,82 864 5,95 571 4,08 688

u2 4,00 488 5,12 787 3,25 272 4,03 131 2,62 169

u1 1,95 64 3,23 152 1,67 34 2,2 60 1,23 27

u0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tabelle 46: Entnahmezeitpunkte und kumulative ausgeschiedene Menge Carboxydetomidin in ng/ml

der Pferde 6 – 10

174

DANKSAGUNG

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Manfred Kietzmann für das Überlassen

des Themas, die stete Unterstützung und die außerordentlich gute Betreuung mit

Motivationsschüben zu allen Zeitpunkten.

Herzlich bedanken möchte ich mich bei allen Mitarbeitern des Institutes für

Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln, wo insbesondere Herr Prof. Dr. W.

Schänzer, Dr. Marc Machnik, Dr. Mario Thevis, Herrn Opfermann und Sven Guddert

durch ihren fachlichen Beistand und die freundliche Aufnahme und Unterstützung im

Labor zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.

Mein Dank gilt weiterhin der Deutschen Reiterlichen Vereinigung e. V. in Warendorf,

im Besonderen Herrn Dr. Michael Düe für die Organisation der Versuchspferde und

die finanzielle Abdeckung der Kosten.

Außerdem danke ich Herrn Prof. Dr. Dr. Franz Ellendorff der FAL Mariensee für die

freundliche und bereitwillige Überlassung der Versuchspferde und Einrichtungen der

FAL, sowie Herrn Jonny Meyer für seine unersetzliche Hilfe mit den Pferden und

allem was dazugehörte.

Ebenso bedanke ich mich bei Herrn Dr. Frank Niedorf und Herrn Dr. Karl Rohn für

den Einsatz und die Durchsicht der statistischen Auswertung der Ergebnisse, sowie

bei Herrn Hans-Herbert Bohr für die Beseitigung aller kurzfristig auftretenden

logistischen Probleme.

Ein besonderer Dank gilt meiner Mutter und meinen Großeltern, denn sie haben

durch ihre Unterstützung mein Studium, diese Arbeit und unzählige andere Dinge in

meinem Leben erst möglich gemacht und immer an mich geglaubt. Was wäre ich nur

ohne Euch?

Für die liebevolle und moralische Unterstützung, aber besonders die Tatsache, dass

Du mich in dieser stressigen Phase unseres Lebens zu Deiner Frau genommen hast,

möchte ich mich besonders herzlich bei meinem Mann Christoph bedanken.

175

Schließlich danke ich auch allen Freunden, Bekannten und Verwandten, die immer

an meiner Seite waren, wenn Not am Mann war und auf die ich mich immer

verlassen kann. Vor allem aber danke ich Suse und Irene - ohne Euch hätte ich nicht

durchgehalten; Christiane – Du bist und bleibst mein Computerheld; Karin, Ilka,

Marcus, Andi Fischer, Niko, Charlotte und allen, die ich jetzt noch vergessen habe.

Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes ...

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