Untersuchung zur Pharmakokinetik der Methylxanthine ... · Untersuchung zur Pharmakokinetik der...

Aus dem Institut für

Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der

Tierärztlichen Hochschule Hannover

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Untersuchung zur Pharmakokinetik der Methylxanthine

Theophyllin und Theobromin hinsichtlich der

Dopingrelevanz beim Pferd

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von

Sophie Koppe (geb. Richers) aus Berlin

Hannover 2007

Wissenschaftliche Betreuung: Universitätsprofessor Dr. M. Kietzmann

1. Gutachter: Universitätsprofessor Dr. M. Kietzmann

2. Gutachter: Universitätsprofessor Dr. Dr. h.c. E. Deegen

Tag der mündlichen Prüfung: 25.05.2007

Meinem Mann

und

meinen Eltern

INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG 13

2 LITERATURÜBERSICHT 14

2.1. Definition von Doping 14

2.2. Bestimmungen 16

2.3. Methylxanthine 18

2.3.1. Vorkommen 18

2.3.2. Wirkung 19

2.3.3. Theophyllin 27

2.3.4. Theobromin 30

2.4. Pharmakokinetische Grundlagen 32

2.5. Pharmakokinetische Parameter 39

3 MATERIAL UND METHODE 45

3.1. Aufbau des Experiments und Vers uchsplanung 45

3.1.1. Versuchstiere und Haltungsbedingungen 45

3.1.2. Testsubstanzen 46

3.1.3. Vorversuch 47

3.1.4. Hauptversuch 47

3.1.5. Aufbereitung der Proben und Aufbewahrung 48

3.2. Analytik 49

3.2.1. Chemikalien 49

3.2.2. Instrumente 50

3.2.3. Methodenentwicklung 51

3.2.4. Aufarbeitung der Urinproben 55

3.2.5. Aufarbeitung der Plasmaproben 56

INHALTSVERZEICHNIS

3.3. Validierung der Methode 58

3.3.1. Selektivität und Spezifität 58

3.3.2. Linearität 58

3.3.3. Nachweisgrenze 60

3.3.4. Bestimmungsgrenze 61

3.3.5. Richtigkeit 61

3.3.6. Präzision 62

3.3.7. Stabilität 63

3.3.8. Wiederfindung 64

3.4. Pharmakokinetische Auswertung 65

4 ERGEBNISSE 66

4.1. Ergebnisse der Analysemethoden

4.1.1. Massenspektren der zu analysierenden Substanzen und

ihrer internen Standards 66

4.1.1.1. Massenspektrum von Theophyllin und 1,3-15N2- Theophyllin 66

4.1.1.2. Massenspektrum von Theobromin und D6- Theobromin 67

4.1.1.3. Massenspektrum von Coffein und D3- Coffein 69

4.1.1.4. Massenspektrum von Paraxanthin 70

4.2. Ergebnisse der Validierung 71

4.2.1. Selektivität 71

4.2.2. Linearität 74

4.2.3. Nachweisgrenze (LOD) 77

4.2.4. Bestimmungs-/Quantifizierungsgrenze (LOQ) 78

4.2.5. Richtigkeit 79

4.2.6. Präzision 83

4.2.7. Stabilität 85

4.2.8. Wiederfindung 87

INHALTSVERZEICHNIS

4.3. Ergebnisse des Hauptversuches 88

4.3.1. Plasma 88

4.3.1.1. Theophyllin und Metaboliten nach intravenöser Applikation 88

4.3.1.2. Theophyllin und Metaboliten nach oraler Applikation 91

4.3.1.3. Theobromin und Metaboliten nach intravenöser Applikation 94

4.3.2. Pharmakokinetische Berechnungen 96

4.3.2.1. Pharmakokinetik von Theophyllin nach intravenöser Applikation 96

4.3.2.2. Pharmakokinetik von Theophyllin nach oraler Applikation 97

4.3.2.3. Pharmakokinetik von Theobromin nach intravenöser Applikation 99

4.3.3. Urin 101

4.3.3.1. Theophyllin und Metaboliten nach intravenöser Applikation 101

4.3.3.2. Theophyllin und Metaboliten nach oraler Applikation 104

4.3.3.3. Theobromin und Metaboliten nach intravenöser Applikation 107

4.3.4. Pharmakodynamische Effekte von Theophyllin und Theobromin 109

4.3.4.1. Herzfrequenz 109

4.3.4.2. Atemfrequenz 109

4.4. Berechnung effektiver und irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen 109

4.4.1. Berechnung effektiver und irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen von

Theophyllin 111

4.4.2. Berechnung effektiver und irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen von

Theobromin 112

4.5. Ausscheidungszeiten 113

4.5.1. Ausscheidungszeiten von Theophyllin nach intravenöser Applikation 113

4.5.2. Ausscheidungszeiten von Theophyllin nach oraler Applikation 114

4.5.3. Ausscheidungszeiten von Theobromin nach intravenöser Applikation 115

INHALTSVERZEICHNIS

5 DISKUSSION 116

5.1. Eignung der Aufarbeitungs- und Analysemethode (HPLC/MS/MS) zur

Quantifizierung von Theophyllin und Theobromin im Plasma und Urin 116

5.2. Ausscheidungsverhalten von Theophyllin und Theobromin 118

5.3. Bewertung der Ergebnisse 129

6 ZUSAMMENFASSUNG 130

7 SUMMERY 132

8 LITERATURVERZEICHNIS 134

9 TABELLENVERZEICHNIS 148

10 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 153

11 ANHANG 158

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS


µg Mikrogramm

µl Mikroliter

µmol Mikromol

Abb. Abbildung

AC Adenylatcyclase

APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation

ATP Adenosintriphosphat

AUC Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve (area under the curve)

bzw. beziehungsweise

C Konzentration

ca. circa

Ca++ Calcium

cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat

CL Clearance

CO2 Kohlendioxid

D Gesamtdosis

DIR Direktorium für Vollblutzucht und Rennen

EHSLC European Horserace Liaison Committee

EPC effektive Plasmakonzentration

ESI Electro Spray Ionisation

F Bioverfügbarkeit

f Freiheitsgerade der linearen Kalibration

FAL Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft

FEI Fédération Équestre International

FN Fédération National

g Gramm

ºC Grad Celsius

h Stunde

H+ Proton

H2O Wasser

HCl Salzsäure

HPLC High Performance Liquid Chromatography


HQC High Quality Control Standard

HVT Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen e.V.

HWZ Halbwertszeit

IPC irrelevante Plasmakonzentration

i.v. intravenös

k10 Eliminationsgeschwindigkeitskonstante

k12 Transferkonstante, Übertritt vom zentralen ins periphere

Kompartiment

k21 Transferkonstante, Übertritt vom peripheren ins zentrale

Kompartiment

ka Resorptionskonstante

ke Eliminationskonstante

kel Eliminationskonstante

kg Kilogramm

KGW Körpergewicht

KM Körpermasse

l Liter

LC Liquid Chromatography

ln natürlicher Logarithmus

LOD Limit of Detection

LOQ Limit of Quantification

LPO Leistungsprüfungsordnung der FN

LQC Low Quality Control Standard

λ Hybridkonstante

M Konzentration

Mg++ Magnesium

m/z Masse zu Ladung Verhältnis

mg Milligramm

mmol Millimol

min Minute

ml Milliliter

MQC Midrange Quality Control Standard

MS Massenspektrometrie

ng Nanogramm


n.n. nicht nachweisbar

n.m. not measured (nicht gemessen)

p.a. post applicationem

p.a. pro analysi

PDE Phosphordiesterase

PK/PD pharmakokinetisch/pharmakodynamisch

Q Organdurchblutung

QCS Quality Control Standard

Qx Summe der Abweichungsquadrate

R2 Korrelationskoeffizient

Sb totale Präzision, interday repeatability

SF Sicherheitsfaktor

SW Tagespräzision, intraday repeatability

SxO Reststandardabweichung

Rss Verhältnis von Harn- zu Plasmakonzentration im Steady State

t Zeit

t1/2 Halbwertszeit

tA Ausscheidungszeit

Tab. Tabelle

TINV t-Wert der t-Verteilung

V Verteilungsvolumen

Vdβ Verteilungsvolumen im Pseudo-Steady State

Vss Verteilungsvolumen im Steady State

WADA World Anti-Doping Agency

x Mittelwert

z.B. zum Beispiel

EINLEITUNG

1 EINLEITUNG

Zur Zeit gilt im Pferdesport eine sogenannte „Nulllösung“, das heißt, dass bis auf wenige klar

definierte Ausnahmen jeglicher Nachweis einer körperfremden Substanz oder ihrer

Metaboliten im Blut oder Urin eines Pferdes am Wettkampftag als Einsatz unerlaubter Mittel

und damit als Verstoß gegen die Dopingregeln gilt (KIETZMANN et al., 2006a; KLUGE,

2002). Das bedeutet, dass neben tatsächlich verbotenerweise zur Leistungsbeeinflussung

eingesetzten Stoffen auch Therapeutika bei nicht ausreichend lang angesetzter Karenzzeit bis

zur nächsten Wettkampfteilnahme zur positiven Medikationskontrolle / Dopingkontrolle

führen können. Durch diese sogenannte „Nulllösung“ wird die wettkampfnahe Behandlung

von Sportpferden sehr schwierig, da erhebliche Unterschiede in Dosierung, Nachweisgrenzen

und Pharmakokinetik der einzelnen Wirkstoffe und Ausscheidungsverhalten der Pferde keine

Aussage über einheitliche Karenzzeiten erlauben. Um unabsichtliches Doping besser

vermeiden und trotzdem eine adäquate Therapie der Sportpferde gewährleisten zu können, hat

das European Horserace Scientific Liaison Committee (EHSLC) ein europaweites Projekt

begründet, in dem pharmakokinetische Untersuchungen unter standardisierten Bedingungen

stattfinden. Die ermittelten Daten dienen in einem PK/PD-Modell nach TOUTAIN und

LASSOURD (2002) zur Berechnung unwirksamer Wirkstoffkonzentrationen im Plasma und

im Urin.

Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Erarbeitung und Validierung einer geeigneten

Analysemethode zur Quantifizierung von Methylxanthinen im Urin und im Plasma von

Pferden sowie der Berechnung der Eliminationskinetik von Theophyllin nach intravenöser

und oraler Verabreichung sowie von Theobromin nach intravenöser Gabe.

13

LITERATURÜBERSICHT

2 LITERATURÜBERSICHT

2.1. Definition von Doping

Laut UNGEMACH und NÜRNBERGER (1999) ist Doping „die Verabreichung von

Substanzen an Mensch und Tier mit dem Ziel der Beeinflussung der natürlichen und aktuellen

Leistungsfähigkeit bei sportlichen Wettkämpfen“.

Es werden verschiedene Formen des Dopings unterschieden, wobei man grundsätzlich

„positives Doping“ mit dem Ziel der Leistungssteigerung und „negatives Doping“ mit dem

Ziel der Leistungsverminderung voneinander trennen muss. Neben dem „Doping auf Sieg“

mit leistungssteigernden Mitteln wie Stimulanzien (akutes Doping auf Sieg), die kurz vor dem

Start appliziert werden (SCHOENE, 1996), oder der Gabe von Anabolika (chronisches

Doping auf Sieg) hat im Pferdesport vor allem das „paradoxe Doping auf Sieg“ und das

„Doping auf Wiederherstellung der eigentlichen Leistungsfähigkeit“ Bedeutung

(UNGEMACH und NÜRNBERGER, 1999; DEBACKERE, 1989). Unter „paradoxem

Doping auf Sieg“ versteht man die Verabreichung zum Teil sehr geringer Mengen von

Sedativa an nervöse oder ängstliche Pferde, um diese startfähig zu machen (SCHOENE,

1996). Das „Doping auf Wiederherstellung der eigentlichen Leistungsfähigkeit“ ist beim

Pferd ebenfalls verbreitet (UNGEMACH 1985). Der Mensch darf einen Wettkampf unter

Schmerzmittel- oder Antibiotikawirkung bestreiten, da man davon ausgeht, dass der Athlet

diese Entscheidung selbst trägt. Dies ist aus Tierschutzgründen im Pferdesport nicht erlaubt.

Nach den Dopingbestimmungen besteht zum Zeitpunkt des Wettkampfes kein Unterschied

zwischen Therapie und Doping, deshalb ist jede Arzneitherapie zur Wiederherstellung der

normalen Leistungsfähigkeit während des Wettkampfes verboten (UNGEMACH 1985).

Grundlage hierfür ist das Tierschutzgesetz, welches in § 3 Absatz 1 verbietet, Tieren außer in

Notfällen Leistungen abzuverlangen, denen sie offensichtlich nicht gewachsen sind, oder die

ihre Kräfte übersteigen und das in Absatz 1b auch ausdrücklich die Verabreichung von

Dopingmitteln verbietet (BUNDESMINISTERIUM FÜR VERBRAUCHERSCHUTZ,

ERNÄHRUNG UND LANDWIRTSCHAFT, 2001). Ausnahmen bilden lediglich Impfungen,

Entwurmungsmittel, Immuninducer, Homöopathika sowie einige Desinfektionsmittel.

14

LITERATURÜBERSICHT

Paragraph 11 des Tierschutzgesetzes verbietet auch das sogenannte „physikalische Doping“.

Damit sind Maßnahmen gemeint, die nicht durch Verabreichung chemischer Substanzen zur

Leistungsbeeinflussung führen, sondern die zum Beispiel durch Anbringen von spitzen

Gegenständen oder durch elektrische Reize die Schmerzempfindlichkeit des Pferdes

verstärken. Unter „Doping mit körpereigenen Substanzen“ versteht man vor allem das

Blutdoping und die Verabreichung von Erythropoetin (MÜLLER, 1999). Diese Form des

Dopings spielt beim Pferd, im Gegensatz zum Menschen, aufgrund seiner unter Belastung

physiologischen Erythrozytenfreisetzung aus der Milz, eher eine untergeordnete Rolle

(UNGEMACH und NÜRNBERGER, 1999). Unter „negativem Doping“ bzw. „Doping auf

Niederlage“ versteht man eine Leistungsverschlechterung des Pferdes zum Beispiel durch

Verabreichung von Sedativa oder ähnlichem (UNGEMACH und NÜRNBERGER, 1999).

Eine große Problematik stellt das „unabsichtliche Doping“ im Pferdesport dar. Wenn ein zur

Therapie einer akuten Erkrankung eingesetztes Arzneimittel dopingrelevante

Nebenwirkungen hat, nach perkutaner Anwendung ein Wirkstoff auch systemisch

nachzuweisen ist, oder ein Wirkstoff dopingrelevante Metaboliten bildet, kann es zu positiven

Dopingbefunden kommen, ohne dass jemand vorsätzlich gehandelt hat. Das größte Problem

hierbei sind häufig unbekannte Absetzfristen von Arzneimitteln, bzw. die individuell sehr

unterschiedlichen Eliminationszeiten, bedingt durch verschiedene Stoffwechselleistungen des

Organismus und eventuell nicht bedachte Wechselwirkungen zwischen zusammen

verabreichten Arzneimitteln (UNGEMACH, 1985; TOBIN und WOOD, 1989). Früher wurde

durch sogenannte Maskierungsmittel versucht, den Nachweis von verbotenen Substanzen zu

erschweren (SCHOENE, 1996; KLUGE, 2002). Dies hat aber heutzutage aufgrund der sehr

empfindlichen Nachweisverfahren kaum noch Relevanz. In Tab.1 sind die verschiedenen

Dopingformen nochmals aufgeführt.

15

LITERATURÜBERSICHT

▫ Doping auf Sieg (akute, chronische, paradoxe Form) ▫ Doping auf Wiederherstellung der normalen Leistungsfähigkeit positives Doping ▫ Doping mit körpereigenen Substanzen ▫ Physikalisches Doping _________________________________________________________________________ ▫ Doping auf Niederlage negatives Doping __________________________________________________________________________ ▫ unabsichtliches Doping ▫ Maßnahmen zur Erschwerung des Dopingnachweises

Tab.1: Dopingformen nach UNGEMACH und NÜRNBERGER (1999)

2.2. Bestimmungen

Das Direktorium für Vollblutzucht und Rennen unterteilt die sogenannten Mittel in fünf

Listen: Liste I sind die erlaubten Substanzen wie Impfungen, Liste II enthält Substanzen, für

die ein Grenzwert besteht, und Liste III enthält Antiinfektiva, deren Einsatz bei

Dokumentation im Medikamentenbuch und Deklaration bei Probenentnahme erlaubt ist. Die

unerlaubten Mittel werden in den Listen IV und V geführt, wobei die Liste IV Doping-

Substanzen enthält und die Liste V alle Substanzen, welche nicht in einer der Listen I bis IV

aufgeführt sind (DIREKTORIUM FÜR VOLLBLUTZUCHT UND RENNEN e.V., 2002).

Der Rennbahntierarzt hat eine strenge Dokumentationspflicht und muss jegliche

Verabreichung mit genauer Indikation im Medikamentenbuch eintragen. Dadurch besteht die

Möglichkeit eines wettkampfnahen therapeutischen Einsatzes von zum Beispiel Antibiotika.

Die Liste der verbotenen Substanzen der Deutschen Reiterlichen Vereinigung unterteilt alle

Substanzen in drei Klassen: Die erste Klasse enthält die Dopingsubstanzen, also Substanzen

welche geeignet sind, die Leistung des Pferdes zu beeinflussen, wobei für einige Hormone

und Theobromin eine Grenzwertregelung besteht.

Die zweite Klasse beinhaltet die verbotenen Arzneimittel. Das sind therapeutisch eingesetzte

Arzneimittel, deren Einsatz aber während des Wettkampfes verboten ist. Auch in dieser Liste

gilt für manche Substanzen ein Grenzwert.

16

LITERATURÜBERSICHT

Die dritte Klasse listet Ausnahmen auf. Das sind Impfstoffe, Antiendoparasitika,

Paraimmunitätsinducer, Insektenschutzmittel und Desinfektionsmittel (DEUTSCHE

REITERLICHE VEREINIGUNG e.V., 2004).

Diese unterschiedlichen Bestimmungen zeigen auf, dass im Renn- und Turniersport

unterschiedliche Regeln gelten:

Der Rennbahntierarzt hat eine strenge Dokumentationspflicht und muss jegliche

Verabreichung mit genauer Indikation im Medikamentenbuch eintragen. Es besteht dadurch

aber die Möglichkeit des wettkampfnahen therapeutischen Einsatzes von Stoffen der Liste III.

Diese Möglichkeit hat der Tierarzt auf nationaler Ebene nicht. Er muss die Medikation so

wählen, dass keine Substanz, außer den Ausnahmen, am Wettkampftag nachweisbar ist, sonst

darf er das Pferd nicht starten lassen.

Auf internationaler Ebene besteht nach dem Regelwerk der FEI wiederum die Möglichkeit

des wettkampfnahen Einsatzes bestimmter Therapeutika, wenn diese vom Mannschaftstierarzt

deklariert und vor Anwendung genehmigt worden sind.

Die Pferdesportverbände führen neben den Wettkampfkontrollen auch Trainingskontrollen

durch, die je nach Verband und Bundesland im WADA-akkreditierten Labor am Institut für

Biochemie der Sporthochschule Köln oder in der Abteilung für Dopinganalytik im

Veterinärmedizinischen Analysezentrum in Geesthacht untersucht werden.

Im Jahre 2006 wurden im Auftrag der deutschen Pferdesportverbände im Institut für

Biochemie der Sporthochschule Köln 1462 Analysen durchgeführt. Davon wurden 22 Proben

positiv getestet und 26 Substanzen nachgewiesen. Die Auflistung ist in Tab.2 tabellarisch

dargestellt (www.dshs-koeln.de).

17

LITERATURÜBERSICHT

gesamt positiv Substanzen Wirkstoff

Trainingskontrollen120 2 2 1x Flunixin

1x Morphin Wettkampfkontrollen

1342 20 24 1x Acepromacin 1x Ambroxol 2x Betamethason 1x Boldenon 1x Clenbuterol 2x Dembrexin 1x Diclofenac 1x Flunixin 1x Koffein 1x Kokain 1x Lidocain 2x Methocarbamol 1x Morphin 1x Oxyphenbutazon 1x Pentobarbital 4x Phenylbutazon 1x Theophyllin 1x Xylazin

Summe 1462 22 26

Tab.2: Zusammenfassung der 2006 im Institut für Biochemie der Sporthochschule Köln im Auftrag der Pferdesportverbände durchgeführten Analysen

2.3. Methylxanthine

2.3.1 Vorkommen

Die Methylxanthine Coffein (1,3,7-Trimethylxanthin), Theophyllin (1,3-Dimethylxanthin)

und Theobromin (3,7-Dimethylxanthin) zählen zu den ältesten Genuß- und Arzneimitteln und

kommen natürlicherweise in mehreren Pflanzen vor. Die Kaffeebohne enthält Coffein,

Spuren von Theobromin (LEHMANN u. MARTINOD 1967) und in geringen Mengen

Theophyllin (ca. 5 mg/kg) (FRANZKE et al., 1968). In Teeblättern lassen sich Theophyllin

(ca. 15 mg/kg), Coffein und Theobromin nachweisen. Kakaobohnen enthalten Theobromin

(bis zu 3%) und Coffein. Das in Abb.1 mit aufgeführte Paraxanthin (1,7-Dimethylxanthin) ist

ein Metabolit von Coffein und Theophyllin und kommt nicht in Pflanzen vor.

18

LITERATURÜBERSICHT

Coffein: Theophyllin: Theobromin: Paraxanthin:

Abb.2: Strukturformeln der Methylxanthine

2.3.2. Wirkung

Pharmadynamische Wirkung

Zentrale Wirkungen

Zentral wirken Methylxanthine erregend, besonders im Bereich der Großhirnrinde

(SAWYNOK u. YAKSH, 1993; LÖSCHER, 2006). Dies geschieht laut FREY et al. (2002)

durch Dämpfung mediothalamischer Strukturen, Stimulation der Großhirnrinde sowie

Erregung autonomer Zentren des Gehirns. Die Erregung der Großhirnrinde führt zur

allgemeinen Steigerung der psychischen und motorischen Funktionen. Kaffee bzw. Coffein in

den üblichen Dosierungen von ca. 50-200 mg bewirkt, dass bei müden Personen die

Ermüdung aufgehoben und die Leistungen gesteigert werden, bei ausgeruhten Personen ist

allerdings keine Leistungssteigerung zu erzielen (MUTSCHLER, 1996; CHOU, 2003). Laut

STAMFORD (1989) bewirkt Coffein eine Verzögerung des Eintrittes der Müdigkeit und eine

Erhöhung der Unruhe. In höheren Dosierungen oder bei parenteraler Applikation soll es auch

zur Stimulation des Stammhirnes und somit zur direkten Stimulation der autonomen Zentren

für Atmung und Kreislauf kommen (LÖSCHER, 2006). ELDRIDGE et al. (1983) konnten bei

ihrer Studie nach intracerebroventriculärer Applikation von Theophyllin nicht die gleichen

19

LITERATURÜBERSICHT

stimulierenden respiratorischen Effekte wie nach intravenöser Verabreichung von

Theophyllin beobachten. RALL (1993) erklärt die Steigerung des Atemminutenvolumens

durch die Methylxanthine durch eine Erhöhung der CO2-Empfindlichkeit. Laut

WETTENGEL (1998) zeigt sich diese zentrale atemstimulierende Wirkung nur bei

Theophyllin.

Die Kontraktion von Hirngefäßen und die Senkung des Liquordruckes durch Methylxanthine

werden in der Humanmedizin zur Therapie von vasomotorischen Kopfschmerzen genutzt

(MUTSCHLER, 1996). In hohen bis toxischen Dosen können sie allerdings zu Krämpfen

führen (LÖSCHER, 2006). Laut MUTSCHLER (1996) besitzt Theobromin diese

zentralerregenden Effekte praktisch nicht.

STAHLE et al. (1991) erklären anhand ihrer Studien den stärker ausgeprägten

zentralnervösen Effekt von Coffein, im Gegensatz zu Theophyllin, durch eine stärkere

Penetration von Coffein in das Gehirn, bedingt durch eine geringe Plasmaproteinbindung.

Periphere Wirkungen

Peripher bewirken die Methylxanthine über Relaxation der Bronchialmuskulatur eine

Bronchodilatation (SAWYNOK u. YAKSH, 1993; LÖSCHER, 2006). Sie ist bei Theophyllin

am stärksten ausgeprägt. Allerdings konnte von MAGNUSSEN (1986) gezeigt werden, dass

Theophyllin im Vergleich mit den β2-Sympathomimetika ein eher schwacher

Bronchodilatator ist. Theophyllin steigert außerdem die mucoziliäre Clearence, verbessert die

Zwerchfellskontraktionskraft und senkt den pulmoarteriellen Mitteldruck (WETTENGEL,

1998).

Theophyllin hat bereits bei Plasmakonzentrationen von 5-10 mg/l eine protektive Wirkung

gegenüber bronchokonstriktorischen Stimuli wie Histamin (WETTENGEL, 1998). Außerdem

hemmt es die T-Lymphocytenanhäufung im Lungengewebe und verhindert die Migration der

eosinophilen Granulozyten durch Hemmung der Interleukin-5-Freisetzung (MARKHAM u.

FAULDS, 1998; MUTSCHLER, 1990). Am Herzen stimulieren die Methylxanthine alle

Herzfunktionen (SAWYNOK u. YAKSH, 1993; LÖSCHER, 2006). Am stärksten ist die

Steigerung der Kontraktilität des Herzmuskels, also die positiv inotrope Wirkung

(MUTSCHLER, 1996). Außerdem führen Methylxanthine zur Zunahme des coronaren

Blutflusses (WETTENGEL, 1998) und zur Coronargefäßerweiterung (MUTSCHLER, 1996).

Dies, zusammen mit der peripheren Vasodilatation, erklärt die verstärkte Organdurchblutung

(RALL, 1980). Theophyllin ist dem Coffein hinsichtlich der therapeutisch ausnutzbaren

Effekte Broncholyse und Herzstimulation deutlich überlegen (LÖSCHER, 2006).

20

LITERATURÜBERSICHT

Methylxanthine führen zu einer Verstärkung der Lipolyse (LÖSCHER, 2006; MUTSCHLER,

1996; STAMFORD, 1989; DODD et al., 1993; GRAHAM et al., 1994). Laut MUTSCHLER

(1996), LÖSCHER (2006) und GRAHAM et al. (1994) verstärken Methylxanthine auch die

Glycogenolyse. STAMFORD (1989) und DODD et al. (1993) hingegen gehen davon aus,

dass Coffein die Glycogenolyse reduziert.

Erhöhte Nierendurchblutung und Gefäßerweitung erklären den diuretischen Effekt der

Methylxanthine (SAWYNOK u. YAKSH, 1993). Laut MUTSCHLER (1996) können sie als

schwache bis maximal mittelstarke Diuretika eingestuft werden.

Außerdem stimulieren sie die Magensaftsekretion (LÖSCHER, 2006) und hemmen die

Mastzelldegranulation (MUTSCHLER, 1996). Laut WETTENGEL (1998) und MARKAM

und FAULDS (1998) sind im Konzentrationsbereich von 5000-10000 ng/ml antientzündliche

und immunmodulierende Effekte nachweisbar.

Die unterschiedlichen Hauptwirkungen der verschiedenen Methylxanthine sind in Tab. 3

zusammenfassend dargestellt.

Wirkung Coffein Theophyllin Theobromin

zentrale Erregung +++ ++ - Herzstimulation + +++ ++ Broncho- und Vasodilatation ++ +++ +++ Stimulation der Skelettmuskulatur +++ ++ + Diurese + +++ ++ Tab.3: Pharmakodynamische Wirkungen der Methylxanthine (LÖSCHER, 2006)

Als unerwünschte Wirkungen können Tachycardie, Extrasystolen sowie gastrointestinale

Störungen durch Erhöhung der Magensaftsekretion auftreten. Coffein löst im Magen lokale

cholinerge Reflexe und die Freisetzung von Gastrin aus (MUTSCHLER, 1996). Daneben

kann es zu zentralnervösen Erregungszuständen kommen, weshalb die Anwendung bei

epileptischen Patienten besonderer Vorsicht bedarf (LÖSCHER, 2006). In der Humanmedizin

wird von der Verabreichung von Methylxanthinen in der Stillzeit abgeraten. In Tierversuchen

zeigten sich teratogene Wirkungen (MUTSCHLER, 1996). Während großer körperlicher

21

LITERATURÜBERSICHT

Anstrengungen besteht eine erhöhte Gefahr von Dehydration aufgrund der

Herzfrequenzerhöhung und der gesteigerten Diurese (STAMFORD, 1989).

Beim Pferd kann es bereits bei Dosierungen von 10-30 mg/kg zur Tachycardie,

Tachyarrhytmie, Blutdruckabfall, Muskelrigidität und Muskelzittern, Unruhe bis hin zu

Krämpfen kommen (LÖSCHER, 2006).

CURRY et al. (1985) konnten die cardiovaskulären Folgen einer experimentellen

Theophyllinintoxikation bei Hunden effektiv mit α-Agonisten behandeln. BIBERSTEIN et al.

(1984) berichten von intravenöser Verabreichung von β-Antagonisten als effektivste Therapie

des Blutdruckabfalls bei Theophyllinintoxikationen.

Wechselwirkungen

Methylxanthine verstärken die Wirkung von Digitalispräparaten und β2-Sympathomimetika

(LÖSCHER, 2006). Coffein greift in die Stoffwechselvorgänge der Leber ein, die für die

Bildung von Gerinnungsfaktoren verantwortlich sind (KLÖCKING, 1996). Die Wirkungen

von Adenosin und von Benzodiazepinen werden abgeschwächt (NEHLIG et al., 1992).

Cimetidin, synthetische Methylxanthine, Tuberculoseimpfstoff, Gyrasehemmer und

Makrolidantibiotika verzögern die Biotransformation von Theophyllin und führen so zu einer

verstärkten und verlängerten Wirkung des Theophyllins. Barbiturate und Carbamazetin

erniedrigen den Theophyllinplasmaspiegel (MUTSCHLER, 1996). Bei gleichzeitiger

Anwendung von Aciclovir muss die Theophyllindosis vermindert werden. Coffein hat eine

entzündungshemmende Wirkung und unterstützt auch die antiinflammatorische Wirkung

einiger Cyclooxygenasehemmer, ohne selbst die Prostaglandinsynthese zu hemmen

(VINEGAR et al., 1976).

Molekulare Wirkungsmechanismen

Die Wirkungen der Methylxanthine werden durch verschiedene Mechanismen erklärt. Da die

therapeutischen Plasmakonzentrationen von Theophyllin oder Coffein im Bereich von 10-50

µmol/l liegen, wird die kompetitive Hemmung der Adenosinrezeptoren, die im

Konzentrationsbereich von 10-100 µmol/l nachgewiesen wurde, als der

Hauptwirkungsmechanismus angesehen (DUNWIDDIE und MASINO, 2001; FREDHOLM,

1980; DODD et al. 1993; RALL, 1982; NEHLING et al., 1992; SAWYNOK u. YAKSH,

1993). Andere Autoren erklären die Wirkung durch die Hemmung der Phosphordiesterase

22

LITERATURÜBERSICHT

und dem dadurch bedingten Anstieg der intrazellulären Konzentration von cyclischem

Adenosinmonophosphat. Desweiteren führen Methylxanthine zur Calciummobilisation aus

dem Sarkoplasmatischen Reticulum und verhindern deren Rückspeicherung. Aufgrund der

benötigten Plasmaspiegel von 0,1-1 mmol/l, scheinen die beiden letztgenannten

Wirkungsmechanismen von untergeordneter Bedeutung zu sein.

Adenosin- Rezeptor- Blockade

Adenosin-Rezeptoren gehören zu den P1- Purinozeptoren mit den Subtypen A1, A2 und A3

(SAWYNOK u. YAKSH, 1993; MUTSCHLER, 1996; DALY et al., 1983). A1- und A2-

Rezeptoren werden aufgrund ihrer unterschiedlichen Stärke auf die Adenosin-Analoga

unterteilt. A1 wird nochmals in A1a und A1b nach der nötigen Agonistenkonzentration und A2

in A2a und A2b nach der unterschiedlichen Affinität zu N-Ethylcarboxamidadenosin an

verschiedenen Stellen unterschieden. A3 wird als Rezeptor beschrieben, der den Calciumfluss

reguliert, wobei hierbei Adenosin die Aktivität von Ionenkanälen ohne Wirkung auf die

cAMP-Konzentration beeinflusst (SAWYNOK u. YAKSH, 1993). Nach RALEVIC und

BURNSTOCK (1998) wird heute eine Einteilung der Adenosin-Rezeptoren in die vier

Subtypen A1, A2A, A2B und A3 durchgeführt. A1-Rezeptoren sind an Gil/2/3 oder an G0-Proteine

gekoppelt, A2A- Rezeptoren an GS, Golf oder an G15/16, A2B-Rezeptoren ebenfalls an GSoder an

Gq/11 und A3-Rezeptoren an Gi2/3 oder an Gq/11-Proteine (LELIEUR, 2004). Für die Rezeptoren

A1, A2A und A3 konnten bereits spezifische Agonisten und Antagonisten synthetisiert werden

(KLOTZ, 2000). Die Kopplung an die Phosphorlipase C zeigt sich bei allen Adenosin-

Rezeptoren. Die Aktivierung der Phophorlipase C führt zur Hydrolyse von

Phophatidylinositol-4,5-Diphosphat (PIP2), wodurch Diacylglycerol (DAG) und Inositol-

1,4,5-Triphosphat (IP3) entstehen. Dies führt zur Aktivierung der Proteinkinase C und zu

einer Erhöhung des intrazellulären Calcium-Spiegels. Außerdem haben die Adenosin-

Rezeptoren Einfluss auf die Regulation der Adenylatcyclase. Die A1- und A3-Rezeptoren

bewirken eine Inhibition und die A2A- und A2B- Rezeptoren hingegen eine Stimulation der

Adenylatcyclase und haben auf diese Weise Einfluss auf den intrazellulären Gehalt an cAMP

(LELIEUR, 2004).

Adenosin ist an der Blutdruckregulation im Gehirn und an der Niere beteiligt, am Schlaf-

Wach-Rhythmus sowie sehr wahrscheinlich an der Induktion und Aufrechterhaltung des

Schlafes. Außerdem hat Adenosin eine thrombocytenaggregationshemmende Wirkung

(MUTSCHLER, 1996).

23

LITERATURÜBERSICHT

Die autoregulatorische Steigerung der Coronardurchblutung ist ebenfalls adenosinvermittelt.

Sauerstoffmangel im Myocard bewirkt eine unzureichende Resynthese von ATP, was

wiederum zu einer Zunahme von Adenosin führt, welches eine Dilatation der Coronargefäße

bewirkt (MUTSCHLER, 1996; GROTHE, 1990).

Wird durch Adenosin über die A1-Rezeptoren am Herzen die Adenylatcyclase gehemmt,

öffnen sich die Kalium-Kanäle im Sinusknoten, das Membranruhepotential nimmt zu und die

Herzfrequenz sinkt. Adenosin hat eine negativ chronotrope Wirkung. Am AV-Knoten werden

durch Adenosin die Calcium-Kanäle blockiert, was zu einem negativ dromotropen Effekt

führt. An den Herzkammern hat Adenosin keine Wirkung.

Methylxanthine schwächen durch Blockade der Adenosin-Rezeptoren die Wirkung von

Adenosin ab (DUNWIDDIE und MASINO, 2001), und führen so am Herzen zu positiv

chronotropen und positiv dromotropen Effekten (MUTSCHLER, 1996).

Adenosin wirkt vasokonstriktorisch an den Vasa afferentia. Die Blockade des Adenosin-

Rezeptors durch Methylxanthine führt zu einer Mehrdurchblutung der Niere mit einer

Durchblutungssteigerung des Nierenmarks. Der Widerstand der Vasa afferentia sinkt stärker

als der der Vasa efferentia, somit steigt die glomeruläre Filtrationsrate. Die Wirkung beruht

zumindest teilweise auf einer vermehrten Primärharnbildung. Die verstärkte Durchblutung

des Nierenmarks verhindert zusätzlich die Aufrechterhaltung des dort normalerweise hohen

Konzentrationsgradienten. Das führt zu einer verstärkten Diurese (MUTSCHLER, 1996).

Wird die adenosinvermittelte Inhibition der Lipolyse durch Coffein antagonisiert, soll dies zu

einer Erhöhung der freien Fettsäuren im Blut führen (DODD et al., 1993).

Die kompetetive Adenosin-Rezeptor-Blockade durch Methylxanthine findet laut SAWYNOK

u. YAKSH (1993) im Konzentrationsbereich von 10-100 µmol/l statt und liegt damit im

Bereich der erreichbaren Plasmaspiegel. Theophyllin ist ein geringgradig potenterer

Antagonist als Coffein, und beide Methylxanthine weisen eine geringe

Rezeptorsubtypenselektivität auf.

Konzentrationen von 10-300 µmol/l blockieren Adenosin-Effekte prä- und postsynaptisch im

zentralen sowie im peripheren Nervensystem. A3-Rezeptoren sind auf ähnliche

Methylxanthin-Konzentrationen sensibel, intrazelluläres Andenosin ist nicht methylxanthin-

sensibel (SAWYNOK u. YAKSH, 1993). Laut DODD et al. (1993) bewirken bereits

Plasmakonzentrationen von 40 µmol/l eine 50 %ige Blockierung der Adenosin-Rezeptoren.

24

LITERATURÜBERSICHT

Phosphodiesterase- Hemmung

Viele Reaktionen im Organismus laufen über „second messenger“ ab: Der „erste Bote“ (zum

Beispiel ein Hormon) bindet an einen speziellen Hormonrezeptor an der Plasmamembran.

Diese Bindung führt zur Stimulierung des membrangebundenen Effektorenzyms

Adenylatcycase. Dieses Enzym katalysiert intrazellulär die Umwandlung von

Adenosintriphosphat (ATP) zu cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP). Dieser „second

messenger“ cAMP steuert über allosterische Interaktionen die Aktivität von sekundären

Effektorenzymen, die wiederum bestimmte Proteine in der Zelle phophorylieren und dadurch

biologische Wirkungen auslösen (KALSON et al., 1994). Das intrazelluläre Enzym

Phosphodiesterase (PDE) baut cAMP wieder ab. Stoffe, die die PDE hemmen, bewirken

durch Verhinderung der Spaltung von cAMP, dass der intrazelluläre cAMP-Spiegel hoch

bleibt und führen somit zu einer Verlängerung und Intensivierung der cAMP-Wirkung

(STRYER, 1990a).

Über diesen Wirkmechanismus führen die Methylxanthine zu ähnlichen Effekten wie die β-

Sympathomimetika, welche durch Stimulation der Adenylatcyclase die cAMP- Konzentration

erhöhen. Es resultieren Relaxation der glatten Gefäß- und Bronchialmuskulatur, Stimulation

der Herzfunktionen und Verstärkung der Lipolyse (LÖSCHER, 2006; MUTSCHLER, 1996;

STRYER, 1990b; VOET und VOET, 1994). Die Erhöhung der cAMP-Konzentration in den

Thrombocyten hemmt viele Plättchenfunktionen, wodurch Theophyllin

aggregationshemmend wirken kann (KLÖCKING, 1996). Phosphodiesterasen werden je nach

Substratspezifität und subzellulärer Lokalisation in elf Unterfamilien unterteilt. Coffein und

Theophyllin inhibieren sowohl Ca++-abhängige als auch unspezifische, freie und

membrangebundene Phosphodiesterasen im Zentralen Nervensystem. Da sie nicht nur die

PDE III hemmen, die für die cardialen Effekte verantwortlich gemacht wird, ergeben sich die

vielen extracardialen Wirkungen (SPONER, 1996). Eine ungefähr 50%ige PDE-Hemmung

durch Coffein wird bei 480-750 µmol/l und durch Theophyllin im Bereich von 350-1000

µmol/l beobachtet (SAWYNOK u. YAKSH, 1993). DODD et al. (1993) geben für eine

50%ige PDE-Hemmung durch Methylxanthine eine Plasmakonzentration von ca. 1000 µmol/l

an. FREDHOLM (1985) gibt Plasmakonzentrationen von > 1000 mol/l zur vollständigen

PDE-Hemmung an. Laut DALY et al. (1983) werden für diese Hemmung lediglich

Konzentrationen von 500-1000 µmol/l erfordert.

Also ist dieser Wirkmechanismus vor allem im Konzentrationsbereich von 100-1000 µmol/l

relevant und therapeutische Konzentrationen von 10-50 µmol/l können nicht ausschließlich

25

LITERATURÜBERSICHT

über diesen Weg zu ihrem Effekt führen. Die PDE-Hemmung ist zu einem gewissen

Prozentsatz an der Wirkung beteiligt und ist eventuell für die Toxizität mitverantwortlich

(SAWYNOK u. YAKSH, 1993).

Mobilisation von Calcium

Der Effekt von Coffein auf den Calciumhaushalt der Zelle wurde zuerst am Skelettmuskel

untersucht (BIANCHI, 1961; NEHLIG et al., 1992). Bei Untersuchungen im Labor ließ sich

durch Coffein die Kontraktion erhöhen und bei höheren Konzentrationen trat eine

Dauerkontraktion auf. Die Kontraktion resultiert aus der Zunahme des intrazellulär

verfügbaren Ca++, da Coffein die Freisetzung von Ca++ aus dem Sarkoplasmatischen

Retikulum fördert und die Rückspeicherung hemmt (JOHNSON und INESI, 1969).

Außerdem soll Coffein eine Erhöhung der Sensibilität der Myofilamente für Calcium

bewirken ( DODD et al., 1993).

Dies geschieht im Konzentrationsbereich von ca. 1000-2500 µmol/l und trägt somit nur bei

höheren Konzentrationen zur Wirkung der Methylxanthine bei und ist eventuell

mitverantwortlich für die Toxizität der Methylxanthine (SAWYNOK u. YAKSH, 1993;

KATZ et al., 1977). FREDHOLM (1995) hält einen Einfluss der Calciummobilisation auf die

Gesamtwirkung der Methylxanthine für nahezu ausschließbar, da er die nötigen

Konzentrationen im millimolaren Bereich angibt. DALY (1993) gibt die nötigen

Konzentrationen mit 1-10 mmol/ l an. Laut DODD et al. (1993) werden invitro für die Ca++-

Mobilisation und die Verhinderung der Rückspeicherung lediglich Konzentrationen von 500-

750 µmol/l benötigt.

Bei Konzentrationen von 200-2000 µmol/l kann Coffein laut SAWYNOK u. YAKSH (1993)

nur durch Verbesserung der Ca++-induzierten Ca++-Ausschüttung indirekt die Calcium-

Konzentration erhöhen.

Benzodiazepin – Antagonismus

Anhand von In-vitro-Versuchen an Ratten- und Menschengehirnen konnten MARANGOS et

al. (1979) eine kompetitive Hemmung der Diazepamwirkung durch Theophyllin, Theobromin

und Coffein nachweisen. Die Hemmwirkung durch Coffein ist stärker als die von Theophyllin

und Theobromin und zeigte sich bei Konzentrationen von 500-700 µmol/l. Dies bestätigen

auch klinische Studien von MATTILA et al. (1982). Auch BOULANGER (1982) stufte die

Methylxanthine als Benzodiazepinantagonisten ein. Laut NEHLIG et al. (1992) binden

26

LITERATURÜBERSICHT

Methylxanthine an Benzodiazepinrezeptoren, ihre Affinität zu diesen ist aber im Vergleich zu

Adenosinrezeptoren sehr schwach.

Auswirkungen auf den Noradrenalinabbau

Coffein und Theophyllin verstärken die Noradrenalinwirkungen an Blutgefäßen. Sie hemmen

die Wiederaufnahme von Noradrenalin in das Neuron und den Abbau der Katechol-O-

Methyltransferase (KALSNER, 1971; KALSNER et al, 1975). Laut NEHLIG, DAVAL und

DEBRY (1992) induzieren Coffein und Theophyllin eine Zunahme der

Noradrenalinsyntheserate und vermindern die Dichte der β-Adrenorezeptoren im Gehirn. Dies

tritt bei Konzentrationen von 150 µmol/l auf und wird an den Wirkungen der Methylxanthine

auf das Gefäßsystem beteiligt sein. Laut DODD et al. (1993) und ROBERTSON et al. (1978)

verursacht Coffeinaufnahme bei nicht coffeingewöhnten Menschen eine Erhöhung der

Plasmacatecholamine.

2.3.3. Theophyllin

1888 entdeckte Albrecht Kossel das Theophyllin als Bestandteil des Tees (WETTENGEL,

1998). Aber erst nachdem die industrielle Herstellung von Theophyllin rund um die

Jahrhundertwende möglich wurde, konnte es als Reinsubstanz genutzt werden. Zunächst

wurde es allerdings lediglich als Diuretikum eingesetzt. Die bronchospasmolytische Wirkung

entdeckte 1922 der Arzt S. R. Hirsch. Seine auf seinen Studien begründete Empfehlung,

Theophyllin zur Asthmatherapie einzusetzen, fand allerdings lange Zeit keine Beachtung.

Auch Veröffentlichungen der Ärzte Herrmann und Aynesworth 1936 zum erfolgreichen

Einsatz von Theophyllin beim Status asthmaticus hatten zunächst kaum Auswirkungen auf

die Anwendung in der Asthmatherapie (WETTENGEL, 1998).

Durchsetzen konnte sich Theophyllin erst nach der Entwicklung von Retard-Präparaten in den

70er Jahren und weiteren Studien, die den therapeutischen Stellenwert als

Asthmatherapeutikum zusätzlich begründeten. In den 80er Jahren wurde das Theophyllin von

den topischen Steroiden als Basisasthmatherapeutikum verdrängt. Inzwischen ist der

kombinierte Einsatz in der Asthmatherapie, gerade bei der Behandlung der schwereren

Verlaufsformen, wieder üblich (WETTENGEL, 1998).

27

LITERATURÜBERSICHT

Physikalisch- chemische Eigenschaften

Theophyllin (1,3-Dimethylxanthin bzw. 1,3-Dimethyl-2,6(1H,3H)-purindion) hat eine

Molmasse von 180,16 und die Summenformel C7 H8 N4 O2 (MERCK INDEX, 2001). 1 g löst

sich in 120 ml Wasser, besser in heißem Wasser (PHARMAZEUTISCHE STOFFLISTE,

2006), 80 ml Ethanol oder 110 ml Chloroform (MERCK INDEX, 2001). Theophyllin zersetzt

sich in verdünnten Mineralsäuren, Ammoniak und Alkalihydroxid-Lösungen

(PHARMAZEUTISCHE STOFFLISTE, 2006). Durch die heterozyklisch gebundenen N-

Atome reagieren die Methylxanthine schwach basisch, Theophyllin hat einen pKa-Wert von

8,77 (MERCK INDEX, 2001). Theophyllin ist weißes, geruchloses, bitter schmeckendes,

kristallines Pulver mit einem Schmelzpunkt bei 270°C. Die Strukturformel wird in Abb.1

gezeigt.

Pharmakokinetik

Nach oraler Applikation ist die Resorption von Theophyllin aus dem Magen-Darmtrakt des

Menschen und auch des Hundes nahezu vollständig (OGILVIE, 1978). TSE und SZETO

(1981) geben die orale Absorption beim Hund mit > 90% an, MC KIERNAN et al. (1981) mit

91%. Die Bioverfügbarkeit wird mit 80-90% und das Verteilungsvolumen mit 0,6 l/kg

angegeben (LÖSCHER et al., 2006b; MC KIERNAN et al., 1981). BOURAOUI et al. (1994)

ermittelten bei Kaninchen ein Verteilungsvolumen von 0,79 l/kg. LOEFFLER et al.(2000b)

konnten bei Hunden eine Bioverfügbarkeit nach oraler Verabreichung von 73% nachweisen.

Die Plasmahalbwertzeit nach intravenöser Applikation liegt bei Hunden bei 5 Stunden

(LOEFFLER et al., 2000b) bzw. 3,8-6,4 Stunden (TSE und SZETO, 1981), und nach oraler

Verabreichung bei 4,3-7,5 Stunden (TSE und SZETO, 1981). LOEFFLER et al. (2000b)

ermittelten in ihrer Studie kürzere Halbwertzeiten von 3,2 Stunden nach oraler Applikation.

Laut LÖSCHER (2006) ist die Halbwertzeit tierartlich sehr unterschiedlich. Er gibt sie beim

Hund mit 6 Stunden, beim Schwein mit 11 Stunden und beim Pferd mit 10-17 Stunden an.

Methylxanthine werden hauptsächlich in der Leber durch oxidative Demethylierung,

Kohlenstoff-Oxidation und Acetylierung metabolisiert. Theophyllin kann zu den

Monomethylxanthinen 3- bzw. 1-Methylxanthin demethyliert und weiter zu

Harnsäurederivaten oxidiert werden oder durch Ringspaltung direkt zu Uracilderivaten

hydriert und oxidiert werden (ARNAUD 1987). Nach TANG- LUI und RIEGELMAN (1981)

werden ca. 90% des verabreichten Theophyllins per Ringoxidation und N-Demethylierung zu

1,3-Dimethylharnsäure, 3-Methylxanthin und 1-Methylharnsäure verstoffwechselt. Rund 10%

28

LITERATURÜBERSICHT

des aufgenommenen Theophyllins werden unverändert über die Niere ausgeschieden

(OGILVIE, 1978).

Aus Theophyllin kann im Organismus Coffein gebildet werden. Nach TANG-LIU u.

RIEGELMAN (1981) werden beim Menschen ca. 6% des verabreichten Theophyllins zu

Coffein metabolisiert, bevor dieses vor der renalen Ausscheidung weiter verstoffwechselt

wird. Diese endogene Coffeinsynthese konnte auch bei Pferden beobachtet werden (TODI et

al., 1999). STAHLE et al. (1991) konnten in ihren Studien diesen Metabolismus von

Theophyllin zu Coffein bei Ratten nicht nachweisen. Eine Synthese von Coffein aus

Theobromin oder Paraxanthien konnte nicht beobachtet worden.

Die letale Dosis 50 liegt beim Hund bei 290 mg/kg KM und bei Katzen bei 800 mg/kg KM

(SUTTON, 1981).

Therapeutischer Einsatz

Laut MUTSCHLER (1990) ist Theophyllin in der Humanmedizin im Stufenplan der

Asthmatherapie bei schweren bis sehr schweren Symptomen vorgesehen, wobei der

therapeutische Plasmaspiegel im Bereich von 6000-12000 ng/ml liegt. Humanmedizinisch

sind neben Theophyllin als Injektionslösung und als Retardpräparate auch Formen des

wasserlößlichen Ethyldiaminkomplexes (Aminophyllin) und Theophyllin- Natriumglycinat

im Handel (LÖSCHER, 2006).

Zulassungssituation in der Veterinärmedizin

In der Veterinärmedizin ist zur Zeit kein Präparat mit dem Hauptwirkstoff Theophyllin

zugelassen.

Die Dosierung von Theophyllin zur Behandlung von Bronchialasthma und anderen

Indikationen für Bronchodilatation wird mit 5-6 mg/kg Körpergewicht intravenös und bis zu

10 mg/kg Körpergewicht oral angegeben. Pferde sollen initial 10 mg/kg appliziert bekommen

und anschließend als Erhaltungsdosis 5 mg/kg täglich über 10 bis 14 Tage (LÖSCHER,

2006).

29

LITERATURÜBERSICHT

2.3.4. Theobromin

Theobromin wurde 1842 erstmals von Woskresensky isoliert (ARNAUD, 1984). Früher

wurde es als Diuretikum und Herzstimulanz genutzt, bis es von neueren, wirksameren

Präparaten ersetzt wurde ( BOOTH, 1977).

Physikalisch- chemische Eigenschaften

Theobromin (3,7-Dimethylxanthin) hat genau wie Theophyllin eine Molmasse von 180,16

und die Summenformel C7 H8 N4 O2 (MERCK INDEX, 2001). Theobromin ist eine schwache

Base (pKs1 < 1) und eine schwache Säure (pKs2 = 10). Ein Gramm Theobromin löst sich in

2000 ml Wasser, in 150 ml kochendem Wasser oder in 2220 ml 95%igem Alkohol. In Ether,

Benzol oder Chloroform ist Theobromin fast unlöslich (PHARMAZEUTISCHE

STOFFLISTE, 2006). Bei der Komplexbildung mit Natriumacetat oder Natriumsalicylat

entsteht ein stark hygroskopisches Pulver, welches CO2 aus der Luft adsorbiert. Auch

Theobromin ist ein weißes, geruchloses kristallines Pulver allerdings mit einem

Schmelzpunkt bei 357°C (MERCK INDEX, 2001). Die Strukturformel wird in Abb.1 gezeigt.

Pharmakokinetik

Aus dem Gastrointestinaltrakt von Säugetieren wird Theobromin schnell und gut resorbiert.

Es passiert aufgrund seiner hydrophoben Eigenschaften biologische Membranen gut und

verteilt sich in sämtliche Körperkompartimente. So passiert es die Plazentaschranke und

penetriert in die Milch. Die Penetration der Blut-Hirn-Schranke erfolgt ebenfalls, allerdings in

geringerem Ausmaß als bei Coffein (SNYDER et al., 1981).

Theobromin wird genau wie Theophyllin hauptsächlich in der Leber metabolisiert. Die

Ausscheidung erfolgt auch bei Theobromin überwiegend renal. Im Harn sind beim Menschen

nach Theobrominaufnahme die Metaboliten 7-Methylxanthin (28-30%), 3-Methylxanthin (14-

21%) und 7-Methylharnsäure sowie 11-12% unverändertes Theobromin enthalten (CORNISH

und CHRISTMAN, 1957). Im Harn von Ratten fanden ARNAUD und WELSCH (1979) nach

Theobrominverabreichung ursprüngliches Theobromin (49%), 6-Amino-5-[N-

Formylmethylamino]-1-Methyluracil (36%), 7-Methylxanthin (7%), 7-Methylharnsäure (4%),

3,7-Dimethylharnsäure (3%) sowie geringe Mengen Dimethylallantoin und N-

Methylharnstoff.

30

LITERATURÜBERSICHT

Therapeutischer Einsatz

Theobromin findet heute als Medikament keine Anwendung mehr.

Durch den Theobromingehalt der Kakaobohne und ihren Einsatz in der Futtermittelindustrie

sowie als Bestandteil von Schokolade kommt dem Theobromin eher eine Bedeutung als

Ursache von Vergiftungen zu. Während des zweiten Weltkrieges wurden dem Viehfutter

häufig kakaohaltige Abfälle zugemischt, um den Energiegehalt des Futters preiswert zu

erhöhen (LAMBERT et al., 1985). Dies führte zu zahlreichen Intoxikationen (DROLET et al.,

1984; SUTTON, 1981). Ebenso wird in der Literatur über Vergiftungen von Haustieren durch

die Aufnahme von Schokolade berichtet (SUTTON, 1981; DROLET et al., 1984;

STRACHAN und BENNET, 1994; DECKER und MYERS, 1972).

Die letale Dosis beim Hund wird von STACHAN und BENNETT (1994) mit 100 mg/kg

Körpergewicht reinem Theobromin angegeben. Dunkle Schokolade mit einem hohen

Kakaoanteil kann bis zu 630 mg Theobromin pro 100 g enthalten, so dass ein kleiner Hund

nach dem Verzehr von zwei Tafeln dunkler Schokolade bereits Theobromin in letaler Dosis

zu sich genommen hat. Der LD 50- Wert bei Katzen liegt bei ca. 200 mg/kg (SUTTON,

1981).

Zulassungssituation in der Veterinärmedizin

Weder in der Veterinär- noch in der Humanmedizin ist zur Zeit ein Präparat mit dem

Hauptwirkstoff Theobromin zugelassen.

31

LITERATURÜBERSICHT

2.4. Pharmakokinetische Grundlagen

Die Wirkung eines Arzneimittels ist das Ergebnis zahlreicher komplexer Vorgänge im

Organismus, die in die pharmazeutische, die pharmakokinetische und in die

pharmakodynamische Phase unterteilt werden können (MUTSCHLER, 1996). Die

pharmazeutische Phase umfasst den Zerfall bzw. das Auflösen des verabreichten Pharmakons

in einen resorptionsfähigen Zustand und hängt somit vor allem mit der Galenik des

Arzneimittels zusammen. Zur pharmakokinetischen Phase gehören alle Einflüsse des

Organismus auf das Arzneimittel (FICHTL et al., 1996). Sie umfasst die Resorption, die

Verteilung, den Metabolismus (Biotransformation) und die Exkretion (Ausscheidung) eines

Pharmakons (KOCH und RITSCHEL, 1986). Die pharmakodynamische Phase beinhaltet alle

Wirkungen des Pharmakons auf den Organismus.

Resorption:

Unter der Resorption eines Pharmakons versteht man dessen Aufnahme in die Blutbahn, über

die es dann im Organismus verteilt wird (MUTSCHLER, 1996). Wie schnell und vollständig

ein Arzneimittel resorbiert wird, hängt neben vielen Faktoren vor allem von seinen

physikalisch-chemischen Eigenschaften, von der Teilchengröße, der Applikationsart und des

Applikationsortes, von der verwendeten Arzneiform, der Größe der Resorptionsfläche, dem

Maß der Zerstörung durch z.B. Darmenzyme und der Interaktion mit andern Arzneimitteln ab

(BENET et al., 1996; KOCH und RITSCHEL, 1986). Bei der intravasalen Applikation

entfällt die Resorption, da das Pharmakon direkt in die Blutbahn verbracht wird. Aufgrund

dessen ist der Wirkungseintritt bei der intravasalen Applikation am schnellsten.

Verteilung:

Ist ein Pharmakon in die Blutbahn gelangt, wird es mit dem Blut in alle Organe des Körpers

transportiert. Nach DOST (1968) erstreckt sich die Verteilung eines Stoffes auf das Plasma,

den Extra- und Intrazellularraum und auf die Anreicherung in bestimmten Geweben.

Stoffeigenschaften wie Lipophilie, Molekülgröße, Plasma- und Gewebsproteinbindung

beeinflussen die Verteilung. Ein Pharmakon ist bestrebt die Blutbahn zu verlassen, um sich

anhand des Konzentrationsgefälles im gesamten Körper gleichmäßig zu verteilen. Aufgrund

dessen wird das Arzneimittel schneller in die stärker durchbluteten Gewebe verteilt als in die

weniger gut durchbluteten. Dies gleicht sich nach Erreichen des Verteilungsgleichgewichts

wieder aus. Der Austritt des Stoffes aus der Blutbahn geschieht auf ähnlichem Wege wie der

32

LITERATURÜBERSICHT

Eintritt. Allerdings variieren die Bedingungen, wie z.B. das Konzentrationsgefälle, stark in

Abhängigkeit des Gewebes oder der Körperflüssigkeit. Neben den bereits oben aufgeführten

Faktoren ist auch die Bindung an Plasmaproteine bedeutsam, die eine Abgabe an das Gewebe

deutlich verringert.

Unter funktionellen Gesichtspunkten kann der gesamte Organismus in verschiedene

Verteilungsräume (Kompartimente) eingeteilt werden. Zum Intrazellularraum (75%) gehören

die intrazelluläre Flüssigkeit und die intrazellulären festen Zellbestandteile. Zum

Extrazellularraum (25%) gehören das intravasale Plasmawasser, die Flüssigkeit im

Intestinum, sowie diejenige im festen Bindegewebe und die transzellulären Flüssigkeiten.

Hinsichtlich ihrer Verteilung und Anreicherung auf die verschiedenen Kompartimente lassen

sich Arzneimittel in drei verschiedene Gruppen aufteilen: Stoffe, die sich nur im Plasma

verteilen, solche die sich nur im Plasma und im restlichen Extrazellularraum verteilen und

Stoffe, die sich sowohl im Extra- als auch im Intrazellularraum verteilen (MUTSCHLER,

1996).

Biotransformation:

Die Metabolisierung von Fremdstoffen erfolgt vor allem in der Leber, aber zum Teil auch in

anderen Organen wie dem Darm, der Niere, der Lunge oder der Milz (KOCH und

RITSCHEL, 1986). Sie hat den Zweck, Stoffe in eine ausscheidbare Form zu bringen. Dazu

werden die Stoffe von Enzymen in einer Phase-I-Reaktion meist zunächst oxidativ, reduktiv

oder hydrolytisch verändert, um die Polarität zu erhöhen und besser chemische Bindungen

eingehen zu können (FRAIGLE, 1981). Anschließend werden sie in einer Phase-II-Reaktion

an einen körpereigenen Stoff gekoppelt, um damit ausgeschieden werden zu können.

Manche der durch Biotransformation entstehenden Stoffe sind weiterhin wirksam, werden

erst durch die Biotransformation wirksam oder haben sogar schädliche Wirkungen. Andere

Stoffe wiederum behindern ebenfalls auszuscheidende Stoffe bei der Ausscheidung oder

beschleunigen diese. Diese Mechanismen können die Wirksamkeit mancher Arzneimittel

stark verändern und müssen als Neben- oder Wechselwirkungen beachtet werden

(MUTSCHLER, 1996).

Ausscheidung:

Die Ausscheidung eines Pharmakons erfolgt entweder in unveränderter Form oder als

Metabolit. Das Hauptausscheidungsweg ist renal über den Urin. Desweiteren kann ein Stoff

biliär und intestinal über die Faezes oder pulmonal über die Ausatemluft ausgeschieden

33

LITERATURÜBERSICHT

werden. Eine Ausscheidung über die Milchdrüse, die Haut und den Speichel oder Schweiß

sind ebenfalls möglich, quantitativ allerdings von untergeordneter Rolle (BENET et al.,

1996).

Die renale Ausscheidung von Stoffen kann je nach Löslichkeit, Proteinbindung und pka- Wert

und pH-Wert des Urins in Form von glomerulärer Filtration, tubulärer Rückresorption sowie

als aktive tubuläre Sekretion erfolgen. Durch die glomeruläre Filtration wird in der Niere ein

Ultrafiltrat des Plasmas abgepresst. Auf diesem Weg gelangen freie, nicht proteingebundene

Stoffe in den Primärharn. Die tubuläre Rückresorption der Stoffe erfolgt durch passive

Diffusion. Daher ist diese durch den pH-Wert des Urins zu verändern. Ansäuerung oder

Alkalisierung des Urins kann dazu führen, dass ein Pharmakon überwiegend in der

nichtionisierten Form vorliegt, somit nicht rückresorbiert und dadurch schneller

ausgeschieden wird (KAMERLING und OWENS, 1994). Bei der tubulären Sekretion werden

Stoffe durch aktiven Transport ausgeschieden. Starke Säuren und Basen werden auf diesem

Weg ausgeschieden. Eine Proteinbindung beeinflusst die tubuläre Sekretion nicht.

Stoffe mit einem Molekulargewicht von über 500 Dalton werden meist über die Galle

ausgeschieden. Sie treten entweder durch Diffusion oder durch aktiven Transport aus der

Leberzelle in die Gallenkapillare über. Die pulmonale Ausscheidung erfolgt nur per Diffusion

anhand des Konzentrationsgefälles zwischen Blut und Atemluft.

Basierend auf gemessenen Plasmakonzentrationen erfolgen pharmakokinetische

Berechnungen unter Verwendung verschiedener Modellvorstellungen:

Kinetik 0. Ordnung:

Hierbei wird pro Zeiteinheit eine konstante Menge eine Pharmakons resorbiert oder

eliminiert. Die Größe der Änderung erfolgt dabei unabhängig von der Ausgangskonzentration

(FORTH et al., 1996). Es wird pro Zeiteinheit eine konstante Menge resorbiert oder eliminiert

bis schließlich das gesamte Depot resorbiert/ eliminiert ist (KOCH und RITSCHEL, 1986).

Ein solcher Verlauf kommt dann vor, wenn der aufnehmende (z. B. ein aktiver

Transportmechanismus) bzw. ausscheidende (z.B. ein Enzym) Mechanismus gesättigt ist.

34

LITERATURÜBERSICHT

t

M

Abb.3: Resorption nach einer Kinetik 0. Ordnung (FREY, 2002)

M = Konzentration t = Zeit

Kinetik 1. Ordnung:

Bei einer Kinetik 1. Ordnung wird ein Pharmakon proportional seiner jeweiligen

Konzentration resorbiert oder eliminiert (KOCH und RITSCHEL, 1986). Trägt man die

Menge im Depot (M) gegen die Zeit (t) auf, erhält man eine Exponentialkurve, die sich

n,

er Menge im Depot) kann diese Kurve in eine Gerade umgewandelt werden (FREY, 2006;

.

asymptotisch der Nulllinie nähert. Durch Logarithmierung der Ordinate (der Konzentratio

d

KIETZMANN, 1983)

t

M

Abb.4: Lineare Darstellung einer Resorption nach einer Kinetik 1. Ordnung (MUTSCHLER, 1996)

M = Konzentration t = Zeit

35

LITERATURÜBERSICHT

1

10

log M

t

Abb.5: Halblogarithmische Darstellung einer Resorption nach einer Kinetik 1. Ordnung

(MUTSCHLER, 1996)

M = Konzentration

4). Dabei

ird der Organismus in einzelne Verteilungsräume (Kompartimente) unterteilt, die kinetisch

betrachtet werden und in denen jeweils die Wirkstoffkonzentration identisch ist

OCH und RITSCHEL, 1986). Je nach Applikationsart, Verteilungsverhalten,

artimentmodelle

ngewendet werden (KIETZMANN, 1983).

Kinetik nach i.v. Injektion:

ravenöser Applikation im Körper als in

t = Zeit

Pharmakokinetische Modelle:

Zur Beschreibung der Konzentrationsverläufe von Wirkstoffen werden in der

Pharmakokinetik häufig Kompartiment-Modelle verwendet (DYKE und SAMS, 199

w

als einheitlich

(K

Metabolisierungs- und Eliminationsverhalten können Ein- oder Mehrkomp

a

Ein-Kompartiment-Modell /

Hierbei wird angenommen, dass sich ein Stoff nach int

einem einzigen Kompartiment gleichmäßig verteilt (DERENDORF, 2002).

Abb.6: Ein-Kompartiment-Modell nach intravenöser Applikation 1 = zentrales Kompartiment K 10 = Eliminationsgeschwindigkeitskonstante

36

LITERATURÜBERSICHT

Folgt die Elimination dabei einer Kinetik 1. Ordnung, lässt sich die Abnahmegeschwindigkeit

des Plasmaspiegels berechnen und ergibt nach Integration die Exponentialfunktion:

t = C0 · e -kel · t

rade mit der Gleichung:

C = ln C0 – kel · t

Geschwindigkeit der Elimination.

wei-Kompartiment-Modell / Kinetik nach i.v. Injektion:

esem Modell geht man davon aus, dass sich der Stoff nach intravenöser Verabreichung

it unterschiedlicher Geschwindigkeit in die verschiedenen Kompartimente verteilt. Man

s timent, welches sich kinetisch wie das Transportorgan Blut

e ripheres Kompartiment (DERENDORF, 2002). Laut BAGGOT (1978)

sc t d s rmakokinetik der meisten Therapeutika am besten.

C

Bei logarithmischer Umformung erhält man eine Ge

ln kel = Eliminationskonstante C0, Ct = Plasmaspiegel zur Zeit t bzw. Ausgangskonzentration

Die Steigung der Geraden ist ein Maß für die

Z

Bei di

m

unter cheidet das zentrale Kompar

verhält und in pe

be hreib ie es Modell die Pha

Abb. 7: Zwei-Kompartiment-Modell nach intravenöser Applikation

1 = zentrales Kompartiment 2 = peripheres Kompartiment

12 = Transferkonstante für den Transport von 1 nach 2 21 = Transferkonstante für den Transport von 2 nach 1 K 10 = Eliminationsgeschwindigkeitskonstante

KK

37

LITERATURÜBERSICHT

Bei halblogarithmischer Darstellung der Plasmakonzentrationen fallen diese zunächst rasch

bfallenden Geraden zu liegen. Es zeigt sich ein

n n.

ie Gleichung für die Plasmakonzentrationskurve lautet wie folgt:

C =

C = Plasmakonzentration

C1 und Cz = Ordinatenabschnitte C und C = C0

ab, um später auf einer weniger stark a

biexpo entieller Phasenverlauf der Gerade

D

tzt eCeC ⋅−⋅− ⋅+⋅ λλ2

11

1 2

λ 1 und λ z = Hybridkonstanten

ohl Verteilungs- als auch

Hybridkonstanten sind Geschwindigkeitskonstanten, in die sow

Eliminationsvorgänge einfließen.

λ 1 charakterisiert vorwieg λ zend die Verteilungsgeschwindigkeit, vorwiegend die

inetik bei einmaliger oraler Gabe:

ei oraler Verabreichung laufen Resorption, Verteilung und Elimination parallel zueinander

Eliminationsgeschwindigkeit,.

K

B

ab. Bei einem diese Situation beschreibenden Modell muss ein Eingangskompartiment

hinzugefügt werden, welches das Substanzdepot enthält (MUTSCHLER, 1996).

Abb. 8: Zwei-Kompartiment-Modell nach einmaliger oraler Applikation

0 = Eingangskompartiment

K 01 Resorptionsgeschwindigkeitskonstante K 10 Eliminationsgeschwindigkeitskonstante

1 = zentrales Kompartiment

==

38

LITERATURÜBERSICHT

Abb. 9: Drei-Kompartiment-Modell nach einmaliger oraler Applikation

Funktion gibt die Gleichung für die Kurvenverläufe für Resorption,

limination und gleichzeitige Resorption und Elimination linear und halblogarithmisch

r 10):

=

0 = Eingangskompartiment 1 = zentrales Kompartiment 2 = peripheres Kompartiment K 01 = Resorptionsgeschwindigkeitskonstante K 10 = Eliminationsgeschwindigkeitskonstante K 12 = Transferkonstante für den Transport von 1 nach 2 K 21 = Transferkonstante für den Transport von 2 nach 1

Die sogenannte Bateman-

E

wiede (BATEMAN, 19

( )tktkel

el

eekkkC ⋅−⋅− −⋅

−⋅ 1

1

10 C

.

2.5. Pharmakokinetische Parameter

):

ls Bioverfügbarkeit (F) wird das Ausmaß und die Geschwindigkeit bezeichnet, mit der ein

m freigesetzt, resorbiert und am Wirkort verfügbar ist. Somit

erabreichten Arzneimittels nahezu 100%. Nach

xtravasaler Verabreichung beträgt die Bioverfügbarkeit weniger als 100% (FICHTL et al.,

Bioverfügbarkeit (F

A

Wirkstoff aus einer Arzneifor

beträgt die Bioverfügbarkeit eines intravenös v

e

1996).

Stellvertretend für die nicht messbare Konzentration am Wirkort, wird die Bioverfügbarkeit

durch Konzentrationsmessung im Plasma oder Urin ermittelt. Diese Methode ist nicht für

39

LITERATURÜBERSICHT

topisch angewendete Stoffe zulässig, da diese nicht über den Blutweg zu ihrem Zielorgan

elangen.

it ermittelt, indem zunächst der Wirkstoff intravasal

erabreicht wird, um so die volle Bioverfügbarkeit zu erhalten. Anschließend wird die gleiche

achdem die Flächen unter den beiden Plasma-Konzentratrions-

rve / AUC), die das Maß für die Konzentration im Organismus

l den, kann die Bioverfügbarkeit wie folgt berechnet werden (KOCH

nd RITSCHEL, 1986):

g

Praktisch wird die Bioverfügbarke

v

Dosis extravasal verabreicht. N

Kurven (Area under the cu

darstel en, berechnet wur

u

F = 100..viAUC⋅xAUC [%]

zentration- Zeit- Kurve bei extravasaler Applikation AUC . = Fläche unter der Konzentration- Zeit- Kurve bei intravenöser Applikation

aß für die Ausscheidungsgeschwindigkeit eines Stoffes. Sie

asmavolumen, welches pro Zeiteinheit von dem Stoff gereinigt

wird wie folgt berechnet:

F = Bioverfügbarkeit AUCx = Fläche unter der Kon

i.v.

Clearance (CL):

Die Clearence ist ein M

bezeichnet das virtuelle Pl

wird. Die Gesamtkörper-Clearance

CL = AUC

D [ml/min]

CL = Gesamtkörper-Clearance D = Dosis AUC = Fläche unter der Konzentration- Zeit- Kurve

Wird ein Stoff ausschließlich durch ein Organ eliminiert, entspricht die Gesamtkörper-

learance der Organ-Clearance. Ist jedoch, wie in den meisten Fällen, mehr als ein Organ an

Clearances zusammen (SAMS, 1992):

C

der Eliminierung des Arzneimittels beteiligt, setzt sich die Gesamtkörper-Clearance aus den

verschiedenen Organ-

40

LITERATURÜBERSICHT

CL = CLr + CLh + CLx [ml/min]

CL = Gesamtkörper-Clearance CLr = renale Clearance CLh = hepatische Clearance CLx = sonstige Clearance

Die Organ-Clearance lässt sich wie folgt berechnen:

CLorgan = Q · E [ml/min]

CLorgan = Organ- Clearance Q = Organdurchblutung

E = Extraktionsquotient = ( )

arteriell

venösarteriell

ccc −

Für die hepatische Clearance ergibt sich demnach:

CLh = Qh · Eh [ml/min] CLh = hepatische Clearance

Qh = Leberdurchblutung otient der Leber

unktion berechnen:

Eh = Extraktionsqu Bei der hepatischen Clearance lassen sich zwei Gruppen von Arzneimitteln unterscheiden:

Stoffe, die perfusionslimitiert eliminiert werden, sogenannte „high clearance drugs“, deren

Extraktionsquotient über 0,8 liegt und die bei einer Leberpassage nahezu vollständig aus dem

Blut eliminiert werden. Dagegen stehen die kapazitätslimitiert eliminierten Stoffe, die „low

clearance drugs“ mit einem Extraktionsquotienten unter 0,2 bei deren Ausscheidung die

Enzymkapazität der Leber der geschwindigkeitsbestimmende Faktor ist (MUTSCHLER,

1996).

Die renale Clearence lässt sich neben der oben aufgeführten Funktion auch durch folgende

F

( )P

U

CCLr =

ateurineflowrC ⋅ [ml/min]

r CU = Pharmakon- Konzentration im Urin CP = Pharmakon- Konzentration im Plasma

urine flow rate = Umfang der Harnbildung

CL = renale Clearance

41

LITERATURÜBERSICHT

Mit dieser Funktion lässt sich ein Zusammenhang zwischen Urinkonzentration und

Plasmakonzentration eines Stoffes herstellen. Demnach müsste man theoretisch von der

nzentra die Plasmakonzentration schließen können. Dies ist aber durch

Sammlung des Urins in der Blase und Absetzen verschieden großer Urinmengen sehr

ngenau. Die renale Clearance unterliegt außerdem Beeinflussungen durch Veränderungen

Ur r wiederum durch Faktoren wie Ernährung oder intensive körperliche

tren rden kann (UNGEMACH und NÜRNBERGER, 1999; WOOD et

l., 1990). Im Anschluss an intensives Training oder einen Wettkampf kann der Urin-pH

urch vermehrte Ausscheidung von sauren Stoffwechselprodukten absinken, was sich

ngsgrad von Arzneimitteln auswirken könnte, so dass saure Stoffe

ortional zur Clearence. Die Halbwertzeit wird meist

½ =

Urinko tion auf

u

des in-pH, welche

Ans gung verändert we

a

d

wiederum auf den Ionisieru

langsamer ausgeschieden und alkalische Stoffe durch den erhöhten Ionisationsgrad nicht

rückresorbiert und somit schneller ausgeschieden werden (UNGEMACH und

NÜRNBERGER, 1999; SCHOENE, 1996; SAMS, 1996).

Halbwertzeit (t ½ )

Die Eliminations- oder Plasmahalbwertzeit ist die Zeit, in der die Plasmakonzentration auf die

Hälfte des ursprünglichen Wertes abfällt (MUTSCHLER, 1996; DERENDOERF et al., 2002;

KIETZMANN, 1983). Es gilt allgemein, dass eine Substanz ca. 5 Halbwertszeiten benötigt,

um zu etwa 97% ausgeschieden zu sein (KAMERLING und OWENS, 1994). Laut KLAUS

und HAPKE (1994) benötigt ein Stoff zur völligen Ausscheidung beim Pferd ca. 70

Halbwertzeiten. Nach FREY (2002) ist die Halbwertzeit proportional zum

Verteilungsvolumen und umgekehrt prop

graphisch aus Plasmaspiegelkurven ermittelt, lässt sich aber bei Kenntnis der

Eliminationsgeschwindigkeitskonstanten ( kel ) wie folgt errechnen:

elk2lnt [h]

t ½ = Halbwertzeit ln2 = 0,693 kel = Eliminationsgeschwindigkeitskonstanten

a die Halbwertzeit von der Clearance und dem Verteilungsvolumen abhängt, kann die

albwertzeit auch anders errechnet werden:

D

H

42

LITERATURÜBERSICHT

t ½ = Cl

Vd⋅2ln [h]

t ln

½ = Halbwertzeit 2 = 0,693

indung wenig in das umliegende Gewebe

iffundiert, hat ein geringes Verteilungsvolumen, welches nicht wesentlich größer ist als das

P men (SAMS, 1996). Ein Stoff, der sich im Fettgewebe anreichert, hat ein sehr

ohes, das Gesamtvolumen des Körpers übersteigendes Verteilungsvolumen, da die

rhältnis zur verabreichten Gesamtmenge ist

Z 1983). Multipliziert man die Konzentration im Blut mit dem

hält man die Substanzmenge im Organismus als reale Größe.

Praktische Bedeutung hat das Verteilungsvolumen durch seine Beeinflussung der

Plasmakonzentration (BAGGOT 1978).

Unter der Annahme, dass sich der gesamte Organismus wie ein Verteilungsraum verhält, lässt

sich das initiale Verteilungsvolumen (Vc) bei rascher intravenöser Injektion wie folgt

errechnen:

Vc =

Vd = Verteilungsvolumen Cl = Clearance

Verteilungsvolumen (V):

Das Verteilungsvolumen beschreibt als fiktive Größe das Flüssigkeitsvolumen, welches

erforderlich wäre, um die gesamte im Körper befindliche Arzneistoffmenge in gleicher

Konzentration zu lösen, in der sie im Blut vorliegt (GLADKE und VON HATTENBERG,

1977). Es ist somit ein Maß für die Gewebegängigkeit eines Arzneimittels. Ein Stoff, der zum

Beispiel aufgrund von starker Plasmaproteinb

d

lasmavolu

h

Konzentration im Blut sehr gering im Ve

(KIET MANN,

Verteilungsvolumen, er

0CD [l]

Vc = initiales Verteilungsvolumen des zentralen Kompartiments D = applizierte Dosis C0 = Anfangskonzentration

Nachdem sich das Pharmakon gleichmäßig in die Gewebe verteilt hat, wird ein

Verteilungsvolumen im Steady State (Vss ) erreicht, welches man wie folgt berechnen kann:

43

LITERATURÜBERSICHT

Vss = cpc

cp Vk

⋅⎟⎞

+ [l/kg] k ⎟

⎠⎜⎜⎝

⎛1

k cp = Transferkonstante, Übertritt vom zentralen ins periphere Kompartiment k = Transferkonstante, Übertritt vom peripheren ins zentrale Kompartiment

Vss = Verteilungsvolumen im Steady State pc Vc = initiales Verteilungsvolumen des zentralen Kompartiments

Durch die Ausscheidung des Wirkstoffes aus dem zentralen Kompartiment sinkt in diesem die

Konzentration. Durch den entstandenen Konzentrationsgradienten diffundiert nun umgekehrt

der Stoff vom peripheren ins zentrale Kompartiment. Dieser Zustand wird als Pseudo-Steady-

State bezeichnet. Die Konzentration fällt linear ab und kann über die Hybridkonstante (β)

beschrieben werden. Das Verteilungsvolumen der Eliminationsphase ( βdV ) kann wie folgt

berechnet werden (DERENDORF et al., 2002):

ββCLVd = [l/kg]

= Verteilungsvolumen der Eliminationsphase βdV CL = Clearance β = Hybridkonstante

44

MATERIAL UND METHODE

3 MATERIAL UND METHODE

3.1. Aufbau des Experiments und Versuchsplanung

Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der E ationskinetik der Methylxanthine

Theophyllin und Theobrom erden.

Dazu wurde Pferden im Ins Tierzu lt für Landwirtschaft

(FAL) in Mariensee Theophyllin intravenös, Theophyllin oral bzw. Theobromin intravenös

verab cht un gne nterval sowohl - als auch Urinproben entnommen.

Diese Proben wurden im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule in Köln

sowohl auf die Konzentration der verabreichten Substanz als auch ihrer Metaboliten

untersucht. Hierzu wurde eine Methode zur Analyse und Quantifizierung optimiert und

valid . Die nen akonze ationen wurden anschließend im Institut für

harmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

d Haltungsbedingungen

h standen insgesamt 13 Wallache unterschiedlichen Alters und Gewichts

mit freiem Paddock-

durch die vorangegangenen pharmakokinetischen

tudien sehr gut darauf konditioniert, bei Betreten des mit frischem Stroh eingestreuten

ntanurin abzusetzen, was die Einhaltung der gewünschten

t, dass keinem der Pferde innerhalb der letzten drei Wochen ein Medikament

erabreicht worden war. Direkt vor Versuchsbeginn wurden alle Probanden auf einer Zurich

ru-Test AG 500 Viehwaage (Messbereich bis 2000 kg) gewogen, damit die Medikamente

limin

in bei Pf

titut für cht der Bundesforschungsansta

rei d in geei ten Zeiti len Blut

iert gemesse Plasm ntr

P

pharmakokinetischen Berechnungen unterzogen.

3.1.1. Versuchstiere un

Für den Tierversuc

zur Verfügung.

Die Pferde waren in einem festen Herdenverband in Laufstallhaltung

und Weidegang untergebracht. Heulage und Wasser stand jederzeit ad libitum zur Verfügung.

Die Pferde waren regelmäßig entwurmt und gegen Tetanus, Equines Herpesvirus und Equine

Influenza geimpft. Alle Pferde waren

S

Laufstalles Spo

Urinentnahmezeitpunkte ermöglichte. Vor Versuchsbeginn wurden die Pferde einer

klinischen Allgemeinuntersuchung unterzogen, die bei keinem Probanden eine Auffälligkeit

zeigte. Um Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten ausschließen zu können, wurde

sichergestell

v

T

45


genau dosiert werden konnten. Angaben zu Gewicht, Rasse und Alter der Pferde sind der

abelle 4 zu entnehmen. T

Pferd Rasse Geschlecht Alter Gewicht [Jahre] [kg]

1 Warmblut Wallach 10 680 2 Warmblut Wallach 10 644 3 Warmblut Wallach 10 622 4 Warmblut Wallach 10 680 5 Vollblut Wallach 11 458 6 Vollblut Wallach 7 582 7 Warmblut Wallach 10 674 8 Warmblut Wallach 10 630 9 Warmblut Wallach 10 658

10 Warmblut Wallach 11 640 11 Warmblut Wallach 10 648 12 Warmblut Wallach 10 660 13 Warmblut Wallach 10 638

Tab.4: Rasse, Geschlecht, Alter und Gewicht der Versuchspferde

3.1.2. Testsubstanzen

THEOPHYLLIN:

Zur intravenösen Applikation wurde Solosin® Infusionslösungskonzentrat der Firma Aventis

harma gewählt. Eine Ampulle enthält 15 ml mit 624 mg Theophyllin.

, dass auch keine Theobrominlösung zur intravenösen Verabreichung

P

Zur oralen Applikation wurde im Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der

Tierärztlichen Hochschule Hannover eine 4 %ige sterile Lösung hergestellt, da kein

Handelspräparat zur Verfügung stand.

THEOBROMIN:

Aufgrund der Tatsache

im Handel erhältlich war, wurde diese ebenfalls als 4 %ige sterile Lösung im Institut für

Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

hergestellt.

46


3.1.3. Vorversuch

Zur Überprüfung der Durchführbarkeit, zur Ermittlung sinnvoller Probenentnahmezeitpunkte

sowie der nötigen Probenentnahmedauer und Feststellung der zu erwartenden

die Substanz einem jeweils zufällig ausgewähltem Pferd verabreicht und im

nschluss daran Blut- und Urinproben entnommen. Der genaue Ablauf der Probenentnahme

ird unter 3.1.4. b ieser kompl tversuch üb de.

ediglich der Zei in dem en entnommen wurden, wurde im Hauptversuch von 60

Stunden auf 108 Stunden nach pplik n The und Stund

intravenöser Gabe von Theobrom verlänger

3.1.4. auptversu

Eine Viertelstunde vor Versuchbeginn wurd

Desinfektion mit 70%igem Alkohol im Punktionsbereich, in die Vena jugularis sinister ein

Venenverweilkatheter (Braunüle MT®, Firma Braun, Melsungen) gelegt. Über diesen

Kath wurde vo pplikation Testsubs eine Lee in

beschichteten Monovetten® (Sa t) entnom n. Danach urde der K heter mit einem

Mandrin (Vasofix erschlosse Ebenso w n Leer-U roben du Auffange n

Spontanurin nach Hereinführen in den Laufstall genommen.

Um eine Verschleppung der Testsubstanz durch Nutzung des gleichen Venenverweilkatheters

zur Substanzapplikation und Probenentnahme zu verhindern, wurde den Pferden, denen die

Testsubstanz intravenös verabreicht werden sollte, auch in die Vena jugularis dexter ein

ene rwei atheter gele

uhewerte der Herz- und

temfrequenz erfasst.

vor in sterile Einwegspritzen aufgezogene, nach dem jeweiligen Körpergewicht

nn intravenös über den dafür gelegten

enenverweilkatheter appliziert. Hierbei wurden genau wie bei der oralen Verabreichung

Konzentrationsbereiche der Analyten sowie zur Entwicklung einer geeigneten

Untersuchungsmethode im Labor wurde ein Vorversuch durchgeführt.

Dafür wurde

A

w eschrieben, da d ett für den Haup ernommen wur

L traum, Prob

oraler A ation vo ophyllin auf 168 en nach

in t.

H ch

e den Pferden, nach Rasur und mehrfacher

eter r A der tanz r-Blutprobe mit Lithium-Hepar

rsted me w at®) v n. urde rinp rch n vo

V nve lk gt.

Vor Verabreichung der Substanzen wurden bei den Pferden die R

A

Die kurz zu

berechnete Testsubstanzmenge, wurde zu Versuchsbegi

V

Einmalhandschuhe getragen, um eine Verschleppung zu verhindern.

47


Die Blutproben innerhalb der ersten drei Stunden wurden über den Venenverweilkatheter

entnommen, danach wurde dieser zur Schonung der Vene entfernt und die weiteren Proben

durch Venenpunktion mit einer Einmalkanüle (1,2 x 40mm/ 18 G1,5“) gewonnen.

THEOPHYLLIN THEOPHYLLIN THEOBROMIN

Die Entnahmezeitpunkte der Blut- und Urinproben nach intravenöser und oraler

Theophyllinverabreichung sowie nach intravenöser Gabe von Theobromin sind Tab.5 zu

entnehmen.

intravenöse Applikation orale Applikation intravenöse Applikation Blut Urin Blut Urin Blut Urin

Proben-Nr.: Zeit [h] Zeit [h] Zeit [h] Zeit [h] Zeit [h] Zeit [h] 1 0 0 0 0 0 0 2 0,033 1 0,08 0,5 0,033 1 3 0,08 3 0,16 1,5 0,08 3 4 0,166 6 0,33 3 0,166 6 5 0,25 9 0,66 6 0,25 9 6 0,33 12 1 9 0,33 13 7 0,5 15 3 11 0,5 24 8 0,75 24 6 13 0,75 28 9 1 28 9 15 1 36

10 2 32 12 24 2 48 11 3 36 24 30 3 72 12 5 48 30 48 5 96 13 7 54 48 54 7 120 14 9 60 54 60 9 144 15 12 60 72 13 168 16 15 72 96 24 17 24 96 108 28 18 28 108 36 19 32 48 20 36 72 21 48 96 22 54 120 23 60 144 24 168

Tab. 5: Entnahmezeitpunkte von Blut- und Urinproben im Hauptversuch

36 m ® entnommen. Dies

0 Minuten zentrifugiert

(Zentrifuge Rotana IS, Hettich). Anschließend wurde das Plasma gleichmäßig auf zwei 10ml

3.1.5. Aufbereitung der Proben und Aufbewahrung

Pro Entnahmezeitpunkt wurden jeweils l Blut mit vier Monovetten

wurde innerhalb einer halben Stunde nach Entnahme bei 1000g 1

48


fassende, deutlich gekennzeichnete Glasgefäße mit Plastikschraubdeckel verteilt. Diese

im ühls rank bei –20°C

eingefroren.

astikbeche aufg l fassende

Plastikbecher mit Schraubverschluss überfü Urinproben wurden umgehend bei

°C im Kühlschrank gekühlt und anschließend bei –20°C eingefroren, um zusammen mit den

orenen Zustand nach Köln transportiert zu werden.

Coffein, wasserfrei, M % Sigma- Aldrich Chemie, Steinheim

n, w sserfr

Sigma- Aldrich Chemie, Steinheim

nheim

D3-Coffein

Köln 1993

Laborsynthese des Institutes für Biochemie,

Köln 2003

,3-15N2-Theophyllin Cambridge Isotope Laboratories Inc.,

Andover, USA

aborchemie- Handels GmbH,

St. Augustin

lland

dt

li-Q- ass emie, Köln

isessig, p.a. Merck, Darmstadt

wurden sofort bei 4ºC K ch gelagert und spätestens am Abend

Die in sauberen Pl rn efangenen Urinproben wurden direkt in 100 m

hrt. Auch die

4

Plasmaproben im gefr

3.2. Analytik

Die Analytik wurde im Institut für Biochemie an der Deutschen Sporthochschule Köln

durchgeführt.

3.2.1. Chemikalien

inimum 99

Theobromi a ei, Minimum 99% Sigma- Aldrich Chemie, Steinheim

Theophyllin, wasserfrei, Minimum 99%

Paraxanthin, wasserfrei, Minimum 99% Sigma- Aldrich Chemie, Stei

Laborsynthese des Institutes für Biochemie,

D6-Theobromin

1

Aceton KMF, L

Acetonitril J.T. Baker, Deventer, Ho

Ammoniumacetat Merck, Darmsta

Wasser, reinst (Mil W er) Institut für Bioch

E

49


Methanol, destilliert Institut für Biochemie, Köln

atriumhydroxid, p.a. KMF, Laborchemie- Handels GmbH,

St. Augustin

rotease aus Rinderpancreas, Typ1 Sigma- Aldrich Chemie, Steinheim

N

P

Salzsäure, 32%ig KMF, Laborchemie- Handels GmbH,

St. Augustin

3.2.2. Instrumente

Die Quantifizierung der Proben des Vor- und Hauptversuches und die Validierung wurden

mittels Flüssigkeitschromatographie und Tandem-Massenspektrometrie durchgeführt. Hierfür

wurde eine HPLC der Agilent Technologies LC 1100 Serie gewählt, gekoppelt mit einem

Perkin Elmar Sciex API 3200 LC/MS/MS-System und unter folgenden Bedingungen

angewendet:

HPLC Agilent Series 1100 LC:

Säule: Nucleodur C18 Pyramid, (70 x 4 mm; Partikelgröße 5µm), Machery

und Nagel

Eluenten: A : Ammoniumacetat (5mM) in H2O und 0,1% Essigsäure,

B : Acetonitril

Gradienten: 5% Acetonitril → 50% Acetonitril in 5 Minuten,

50% Acetonitril → 100% Acetonitril in 6 Minuten;

Reinigung mit 100% Acetonitril für 1 Minute, Reequilibrierung mit 5%

Acetonitril für 2 Minuten

Flussrate: 800µl/min

Injektionsvolumen: 10 µl

Massenspektrometer:

Ionenquelle: ESI bei 550 °C

Ionisationseinstellung: positiv

Aquistionseinstellung: Multiple Reaction Monitoring (MRM)

senergie: optimiert für jedes Produktion

Kollisionsgas: Stickstoff (N2), 2,5x 10-5 torr

Kollision

50


3.2.3. Methodenentwicklung

Herstellung der Standardlösungen:

Vor der Aufarbeitung wurden die zur quantitativen Bestimmung notwendigen Standard-

Lösungen hergestellt. Mit den Internen Standards wurde anschließend ebenso verfahren. Zur

Ermittlung des geeigneten Lösungsmittels wurden die Methylxanthine in den verschiedenen

Lösungsmitteln 0,06 molare Salzsäure, destillierter Methanol, Milli-Q-Wasser und 0,05

olare Natronlauge gelöst: Zuerst wurde eine Lösung in Methanol versucht. Sie gelang nur

wurde als Mischstandard aus stickstoffmarkiertem Theophyllin

,3-15N2-Theophyllin), deuteriertem Coffein (D3-Coffein) und deuteriertem Theobromin (D6-

heobromin) hergestellt. Als Interner Standard für Paraxanthin wurde ebenfalls das markierte

6-Theobromin ca.

alb so groß war wie die Intensitäten der anderen internen Standards, wurde bei der

m

unvollständig. Erst nach Zugabe von 32%iger HCl und Verbringung in ein 50°C warmes

Ultraschallwasserbad lösten sich die Analyten rückstandsfrei. Jedoch kristallisierte die

Lösung bei Erreichen der Raumtemperatur wieder. Die beste Löslichkeit bestand bei 0,05

molarer Natronlauge, jedoch war die Stabilität der Analyten in diesem Lösungsmittel nicht

ausreichend. Als am besten geeignet erwies sich schließlich die Lösung in Milli-Q-Wasser.

Die Standardlösung wurde als Mischstandard mit den Methylxanthinen Theophyllin, Coffein,

Theobromin und dem möglichen Metaboliten Paraxanthin hergestellt. Dazu wurden jeweils

10 mg dieser Substanzen per Feinwaage eingewogen und in Milli-Q-Wasser gelöst und so

eine 0,1%ige Stammlösung hergestellt. Aus dieser 100µg/ml Stammlösung wurde durch 1:10

Verdünnung die Arbeitslösung mit der Konzentration von 10 µg/ml hergestellt.

Auch der Interne Standard

(1

T

Theophyllin genutzt. Da die massenspektrometrische Signalintensität für D

h

Herstellung des internen Mischstandards die Konzentration von D6-Theobromin verdoppelt.

Es wurden also je 10 mg des D3-Coffeins und des markierten Theophyllins und 20 mg des D6-

Theobromins per Feinwaage eingewogen und ebenfalls in 100 ml Milli-Q-Wasser gelöst. Aus

dieser Stammlösung wurden dann durch Verdünnungen Arbeitslösungen mit der

Konzentration von 10 µg bzw. 20µg/ml hergestellt.

Beide Lösungen wurden sowohl zur Quantifizierung der Urin- als auch der Plasmaproben

genutzt.

51


Überprüfung der Messmethode:

Zur Überprüfung der Messmethode des LC/MS/MS-Systems musste als erstes das sogenannte

Tuning des HPLC-Gerätes erfolgen. Dabei werden die Substanzen anhand ihrer spezifischen

Ionenübergänge in die einzelnen Ionenfragmente identifiziert und konnten anhand dieser im

Computersystem des Gerätes gespeichert werden. Per Direkteinlass wurden anschließend die

n aus beiden Stoffen handelte. Um dieses Problem zu lösen, wurden alle weiteren

nenübergänge der beiden Stoffe verglichen. Als einziger Unterschied erwies sich der

erhält man die

1 ml Methanol konditioniert und mit 1 ml Milli-Q-Wasser

equilibriert, bevor 50 µl des Internen Mischstandards per Hamilton-Spritze auf die Säule

Kollisionsenergie und die Linsensysteme des Massenspektrometers für jeden einzelnen

Analyten optimiert.

Im Rahmen dieser Untersuchungen wurde festgestellt, dass der Ionenübergang in die beiden

Hauptfragmente, der die substanzspezifische Identifikation ermöglichen soll, bei Theophyllin

und Paraxanthin identisch ist. Somit ließ sich bei einer Probe anhand dieses Ionenüberganges

181.0/124.0 nicht eindeutig ersehen, ob es sich um Theophyllin, Paraxanthin oder eine

Kombinatio

Io

Ionenübergang 181.0/55.0, welcher nur beim Paraxanthin auftrat. Also konnte Paraxanthin

anhand dieser Fragmentierung identifiziert und quantifiziert werden. Theophyllin musste

deshalb durch die Differenzmethode quantifiziert werden. Das bedeutet, dass man die

Intensität des gemeinsamen Ionenübergangs als Summe der beiden Analyten betrachtet. Von

der errechneten Summenkonzentration subtrahiert man die Paraxanthinkonzentration, welche

aus der Intensität des einzelnen Ionenübergangs errechnet wurde. Somit

Theophyllinkonzentration.

Ermittlung der geeigneten Urinaufarbeitung:

Zur Optimierung der Analytenausbeute wurden bei der Methodenentwicklung der

Urinaufarbeitung zunächst verschiedene Festphasenextraktionen angewandt und deren

Ergebnisse miteinander verglichen. Aus verschiedenen vorangegangenen Untersuchungen

war bereits bekannt, dass eine Flüssig-Flüssig-Extraktion bei Methylxanthinen wenig ergiebig

ist. Zum Vergleich wurden Oasis® HBL 3cc (60mg) Extraction Cartridges der Firma Waters,

C 18-Ionentauschersäulen Chromabond® 6ml/ 500mg, octadecyl- modifiziertes Kieselgel und

selbsthergestellte PAD-Säulen eingesetzt.

Beide C 18 Säulen wurden mit

52


aufgetragen wurde. Im Anschluss daran wurden die 2 ml mit unterschiedlichen Mengen der

Standardlösung versetzten Urinproben zugegeben. Die Säulen wurden anschließend mit

einem Wasser-Methanol-Gemisch (95:5) gewaschen und mit 1 ml Methanol eluiert. Das Eluat

wurde am Rotationsverdampfer eingeengt, anschließend mit 100µl LC-Puffer (80%

Ammoniumacetat, 20% Acetonitril und 0,1% Eisessig) angelöst und in die Messgefäße für die

HPLC überführt.

Die PAD-Säulen wurden durch Einhängen von Pasteurpipetten in eine Halterung, Einlegen

einer kleinen Glaskugel in die Pipettenmündung und anschließendem Aufbringen von ca. 2ml

uilibriert und konditioniert wurde durch

weimaliges Waschen mit Milli-Q-Wasser. Der Interne Standard und die 2 ml Urinproben

1 ml Aceton, das Eluat

benfalls am Rotationsverdampfer eingeengt und in 100 µl LC-Puffer gelöst in Messgefäße

xtraktionsergebnis zeigten die Oasis®-Säulen, aber da die Ausbeute und das

viel besseren Ausbeute, reduzierte aber die Störpeaks noch nicht

etzte Messschwankungen konnten durch Intensivierung der Reagenzgläserwaschschritte

1 ml 6-molare Salzsäure zugegeben und wiederum fünfmal mit Wasser

nd zum Schluss zweimal mit einem Methanol-Aceton-Gemisch gespült. Die LC-MS-

hromatogramme zeigten weniger Störpeaks, so dass die Interpretation der Analytenpeaks

produzierbar und präzise war.

einer Polystyrolharzlösung selbsthergestellt. Eq

z

wurden wie bei den anderen Säulen aufgetragen und anschließend mit ca. 2 ml Milli-Q-

Wasser gewaschen. Eluiert wurde bei diesen Säulen zweimal mit

e

überführt.

Das beste E

deutliche Vorhandensein von Störpeaks noch nicht zufriedenstellend waren, wurde die

Methode weiter modifiziert. Die Konditionierung und Equilibrierung wurden auf jeweils 2 ml

erhöht, das Urinprobenvolumen auf 2,5 ml erhöht, der Waschschritt nach Aufbringen der

Probe auf zweimal 1 ml Methanol-Wasser-Gemisch verdoppelt und anstatt mit Methanol

wurde dreimal mit 0,5 ml Aceton eluiert und in 120 µl LC- Puffer angelöst.

Dies führte zu einer sehr

ausreichend. Dies gelang erst durch mehrfaches Zentrifugieren der Urinprobe während der

Aufarbeitung: Einmal 10 Minuten bei 1800 U/min vor Auftragen der Probe auf die Säule und

noch ein zweites Mal nach dem Anlösen in LC-Puffer, so dass nur der Überstand in das

Messgefäß überführt wurde.

L

deutlich reduziert werden. Die Reagenzgläser wurden nach Gebrauch einmal mit der Bürste

und viermal ohne Bürste mit heißem Wasser gewaschen, dann mit je 1 ml 6-molarer

Natronlauge für eine Stunde bei 100°C gekocht. Anschließend wieder fünfmal mit Wasser

gespült, danach wurde

u

C

re

53


Der Einfluss von unterschiedlichen pH-Werten wurde wie folgt untersucht: Von sechs

rinproben der gleichen Konzentration wurden zwei mit 1-molarer Salzsäure auf einen sauren

von 12 eingestellt. Zwei Proben blieben unverändert bei dem

hysiologischen pH-Wert von ca. 8. Danach wurden alle Proben nach oben aufgezeigtem

n wurden vor Aufbringen auf die Säulen mit 500µg einer Proteaselösung (aus

inderpancreas, Typ 1, 5mg/ml) versetzt, eine Stunde im 50°C -warmen Wasserbad inkubiert

rstand wurde

nschließend auf die Oasis®-Säule überführt. Die weitere Aufarbeitung verlief genau wie bei

ich zwischen der Festphasenextraktion und der von BEAUDRY et al. (2006)

ublizierten Direktinjektion von Pferdeplasma nach Proteinfällung mit Methanol und

entrifugation in die HPLC zeigte eine wesentlich bessere Empfindlichkeit bei der

estphasenextraktion.

U

pH-Wert von 2,5 und zwei Proben durch 1-molare Kaliumhydroxidlösung auf einen

alkalischen pH-Wert

p

Schema aufgearbeitet und gemessen. Es zeigten sich keine gravierenden Unterschiede, weder

bei der Ausbeute noch beim biologischen Untergrundrauschen in den einzelnen Ionenspuren.

Ermittlung der geeigneten Plasmaaufarbeitung

Für die Plasmaprobenaufarbeitung wurde zunächst die Aufarbeitung der Urinproben

übernommen und zur Optimierung der Ausbeute weiter modifiziert.

Um den Einfluss von Proteinbindungen der Methylxanthine im Plasma auf die

Substanzausbeute bei der Aufarbeitung zu untersuchen, wurden folgende Versuchsreihen

verglichen:

Die ersten zwölf Proben wurden genau wie die Urinproben aufgearbeitet, und die zweiten

zwölf Probe

R

und anschließend 10 Minuten bei 1800 U/min zentrifugiert. Nur der Übe

a

den ersten zwölf Proben.

Die Auswertung zeigte eine fast doppelt so hohe Theophyllin-, Theobromin- und

Paraxanthinausbeute bei den Proben mit Proteindenaturierung im Gegensatz zu der

Probenreihe ohne Proteolyse. Somit wurde die Proteindenaturierung in die

Plasmaprobenaufarbeitung übernommen.

Ein Vergle

p

Z

F

54


3.2.4. Aufbereitung d

Für die Aufarbei enextraktion dienten Oasis®- Säulen 3cc

(60mg) als Absorbens.

Die Urinproben wurden aufgetaut und pro Probe wurden 2,5 ml per Pipette entnommen und

in ein Reagenzspitzglas überführt. Ansch

(10µg/ml) d h wurde die Probe 10 Minuten bei

1800 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Die Oasis®- Säulen 3cc (60mg) wurden mit 2

ml Me i Der Überstand der

zentrifugierten P liquotiert und zweimal mit 1 ml eines

Meth wurden Spitzgläser in die

Reagenzgla um das Probeneluat aufzufangen.

Eluiert wurde dreim Anschluss wurde das Eluat am

Rotationsverda be wurde schließlich mit 120µl

Ammoniumac bei 1800 Umdrehungen pro Minute

zentrifugiert, der Überstand in HPLC-Probengefäße überführt und zur Messung in die HPLC

verbrach

Die Aufarbeitu enfassend dargestellt.

Die beschriebene Aufarbeitung wurde zur Quantifizierung von Proben mit Konzentrationen

bis zu 10.000ng er analytischen Säule und des Detektors

ei Konzentrationen über 10.000 ng/ml zu vermeiden, wurde die Aufarbeitung wie folgt

terner

ischstandard wurde von 50 µl auf 100 µl erhöht und anstatt in 120 µl wurde das eingeengte

luat in 250µl Ammoniumacetatpuffer gelöst. Ebenso wurde mit der Kalibrationsreihe

erfahren.

er Urinproben

tung der Urinproben mittels Festphas

ließend wurde 50 µl Interner Mischstandard

azugegeben und die Probe gevortext. Danac

thanol kondit oniert und mit 2 ml Milli-Q-Wasser equilibriert.

robe wurde nun auf die Säulen a

anol-Milli-Q-Wasser-Gemisches (10:90) gespült. Hiernach

shalterung der Unterdruckkammer gestellt,

al mit jeweils 0,5 ml Aceton. Im

mpfer eingeengt. Die trockene Pro

etatpuffer angelöst, erneut 10 Minuten

t.

ng der Urinproben wird in Abb.9 zusamm

/ml angewendet. Um eine Sättigung d

b

modifiziert: Es wurden lediglich 1 ml statt 2,5 ml der Probe aufgearbeitet, die Menge in

M

E

v

55


Probenvorbereitung (Konzentrationsbereich bis 10.000ng/ml)

↓ 2,5 ml Urin in ein Reagenzspitzglas

↓ + 50 µl Interner Mischstandard [10µl/ml]

mittels Hamiltonspritze, schütteln (Vortex)

↓ Zentrifugation : 10 min bei 1800 U/min

Überstand dekantieren, Sediment verwerfen ↓

®Waters Oasis HLB 3cc (60mg) Extraction Cartridges:

mit 2 ml Methanol konditionieren mit 2 ml Milli-Q-W sser equilibrieren a

2, n 5 ml des Urinprobenüberstandes auf die Säule überführemit 2 x 1 ml Methanol/Wasser (10/90)spülen

mit 3 x 0,5 ml Aceton eluieren

Eluat in Reagenzspitzgläsern auffangen ↓

Elua gen t am Rotationsverdampfer einen↓

Subst sen, rat in 120 µl Ammoniumacetatpuffer anlöschütteln (Vortex)

↓ Zentrifugation : 10 min bei 1800U/min

↓ Überstand mit Pasteur plervials überführen pipetten in Autosam

10µl in das HPLC/MS/MS injizieren

Abb.9: Pferdeurin mittels

H is 10.000 ng/ml

.2.5. Aufbereitung der Plasmaproben

lasmaproben erfolgte wie die der Urinproben mit der Modifikation der

roteindenaturierung:

Probenaufarbeitung zum Nachweis von Methylxanthinen imPLC/MS/MS im Konzentrationsbereich b

3

Die Aufarbeitung der P

P

56


Probenvorbereitung (Konzentrationsbereich bis 10.000ng/ml)

↓ 2,5 ml Plasma in ein Reagenzspitzglas

↓ + 50 µl Interner Mischstandard [10 µl/ml]

mittels Hamiltonspritze, schütteln (Vortex)

↓ + 100µl einer 0,5%igen Proteaselösung (P 4630 Typ 1)

↓ Inkubation für 60 Min. bei 50 °C im Wasserbad

↓ Zentrifugation : 10 min bei 1800 U/min

Überstand dekantieren, Sediment verwerfen ↓

Waters Oasis®HLB 3cc (60mg) Extraction Cartridges:

mit 2 ml Methanol konditionieren mit 2 ml Milli-Q-Wasser equilibrieren

2,5 ml des Plasmaprobenüberstandes auf die Säule überführen mit 2 x 1 ml Methanol/Wasser (10/90)spülen

mit 3 x 0,5 ml Aceton eluieren

Eluat in Reagenzspitzgläsern auffangen ↓

am Rotationsverdampfer einengen Eluat ↓

Substrat in 120 µl Ammoniumacetatpuffer anlösen, schütteln (Vortex)

↓ Zentrifugation : 10 min bei 1800U/min

↓ Überstand mit Pasteurpipetten in Autosamplervials überführen

10µl in das HPLC/MS/MS injizieren

ich bis 10.000 ng/ml

Abb.10: Probenaufarbeitung zum Nachweis von Methylxanthinen im Pferdeplasma mittels

HPLC/MS/MS im Konzentrationsbere

Auch diese Aufarbeitung wurde im Konzentationsbereich über 10.000ng/ml entsprechend der

Urinproben verändert.

57


3.3. Validierung der Methode

Da jede experimentelle Messung mit Fehlern behaftet ist, soll mit der Validierung der

Eignungsnachweis einer Methode für den vorgesehenen Zweck erbracht werden. Nachfolgend

ufgeführte Kriterien sind in dieser Studie in die Validierung eingegangen:

3.3.1. Selektivität und Spezifität

Unter der Selektivität versteht man deren Fähigkeit, verschiedene Substanzen

unterscheiden zu können. Bei der HPLC/MS/MS-Methode ist dies durch unterschiedliche

etentionszeiten der Analyten und ausreichende Trennung von coeluierten Störpeaks im

at

ie Spez iges Erfassen und Identifizieren einer Substanz

falls in der zu untersuchenden Probe

vorkommender Substanzen. Dazu mussten aus dem Product-Ion-Scan einer Substanz

charakteristische Ionenübergänge a onitoring

(MRM) aufgezeichnet und mit den atrixproben

vergli

Zur B ivität und Sp Proben, denen

die Analyten zugesetzt wurden, verglic die Analyten

a- oder Urininhaltstoffen (Spezifität) und mit ausreichender

ng

erschiedlichen Mengen der Analyten gespikt. Diese Konzentrationen müssen den

a

einer Methode

R

Chrom ogramm gekennzeichnet.

ifität einer Methode ist deren eindeutD

ohne Störung oder Verfälschung anderer, eben

usgewählt und mittels multile Reaction M

entsprechenden Ionenspuren von Leerm

chen werden.

estimmung der Selekt ezifität wurden Leermatrixproben mit

hen. Es konnte festgestellt werden, dass

ohne Verfälschung durch Plasm

Trennu und ohne gegenseitige Störung im Chromatogramm darzustellen sind.

3.3.1. Linearität

Die Linearität beschreibt den mathematischen Zusammenhang von Konzentration des

Analyten und der Signalstärke/Detektorantwort.

Für die Überprüfung der Linearität wurden an drei unterschiedlichen Tagen Kalibrierreihen

sowohl für Plasma als auch für Urin erstellt, wobei jede Konzentration doppelt aufgearbeitet

und dann gemessen wurde. Pro Kalibriergerade wurden mindestens fünf Leermatrixproben

mit unt

58


gesamten Konzentrationsbereich abdecken (DIN 38402 A51, 1986). Da sich der

alibrierbereich der Analyten über vier Zehnerpotenzen erstreckte, wurde bei beiden Matrices K

die Linearität im niedrigen, mittleren und im hohen Bereich überprüft. Die gewählten

Konzentrationen sind in den Tabellen 6 und 7 aufgeführt.

PLASMA Konzentration von Coffein, Theobromin

und Theophyllin in ng/ml

Kalibrationsgerade I 0,20,60,100,300,600,1000

Kalibrationsgerade II 100, 2000, 4000, 6000, 8000, 10000

K atalibr ionsgerade III 10000, 20000, 30000, 40000, 50000

trationen von Coffein, Theobromin und Theophyllin im Plasma zur eraden

Tab.6: Verwendete KonzenErstellung der drei Kalibrationsg

URIN Konzentration von Coffein, Theobromin,

Theophyllin und Paraxanthin in ng/ml

Kalibratio sg ran e de I 0,25, 50, 100, 250, 500, 1000

Kalibrationsgerade II 1000, 2000, 4000, 6000, 8000, 10000

Kalibrationsgerade III 1000, 2500, 5000, 10000, 20000, 30000

Tab.7: Verwendete Konzentrationen von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im i Kalibrationsgeraden

in nd des Internen Standards (D3-Coffein, 1,3-15N2-Theophyllin

rde visuell auf Ausreißer und

inearität untersucht (U.S. DERPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES,

nte Einbezug der Geradensteigung wurde auf die gemessende Konzentration

zurückgerechnet. Diese sogenannte „back calculation“ durfte dabei um maximal 15%, an der

maximal 20% vom theoretischen Wert abweichen (EHSLC

Urin zur Erstellung der dre

Aus dem Integral der erhaltenen Peakflächen der Analyten (Coffein, Theophyllin,

Theobromin und Paraxanth ) u

und D6-Theobromin) wurde der Quotient gebildet und gegen die Konzentration der

Kalibratoren aufgetragen. Die entstandene Kalibiergerade wu

L

1999). U r

unteren Bestimmungsgrenze um

2002).

59


3.3.3. Nachweisgrenze

Die Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, limit of detection, LOD) stellt die niedrigste

Konzentration dar, bei der sich der Analyt noch qualitativ bestimmen lässt, indem ein sicher

vom Untergrundrauschen der Blankproben abzugrenzendes Instrumentensignal zu erkennen

xO =

ist. Die Ermittlung dieser Nachweisgrenze wird anhand der Kalibrierkurvenmethode nach

DIN 32645 durchgeführt. Dazu wird aus den Residuen der linearen Regression zuerst die

Reststandardabweichung SxO aus der Summe der Abweichungsquadrate Qx und den

Freiheitsgeraden der linearen Kalibration f berechnet:

f

Qx S

SxO = Standardabweichung Qx = Summe der Abweichungsquadrate f = Freiheitsgerade der linearen Kalibration

Mit Hilfe dieser Standardabweichung SxO und dem Mittelwert x aller

Kalibrationskonzentrationen kann das Konfidenzintervall für den Merkmalswert Null

errechnet werden.

VB0 = SxO · t f ,α · 11 2

++xQ

xn

VB0 = Konfidenzintervall für den Merkmalswert Null

x = Mittelwert t wurde aus statistischen Tabellen entnommen und errechnet: f,α

αt f,α = TINV ( ; f )

INV = t-Wert der t-Verteilung unter den Bedingungen der Freiheitsgeraden (f) sowie der T

Fehlerwahrscheinlichkeit (α ).

Mit Hilfe der Steigung a der linearen Regressionsgeraden wurde die Nachweisgrenze (LOD)

mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von α wie folgt errechnet:

LOD = α

0VB

LOD = Nac

hweisgrenze α = Fehlerw rscheinlichkeit ah

60


3.3.4. Bestimmungsgrenze

Die Best e (Quantifizierungsgrenz fication, LOQ) ist die

iedrigste Konzentration, bei der eine quantitative Aussage über den Analyten noch möglich

en dem mittleren

essergebnis und dem erwarteten Referenzwert dürfen dabei nicht mehr als 20 % betragen

HSLC, 2002).

Zur Bestimmung der LOQ wurden fünf Plasmap onzentration 100 ng/ml

Coffein, Theobromin und Theophyllin an drei unter en Tagen aufgearbeitet und

chromatographisch-massenspektometrisch quantifizier ung der LOQ im Urin

wurde mit Urinproben der Konzentrationen 50 ng/m offein, Theophyllin

und Paraxanthin und 100 ng/ml der Substanz Theobrom

ie Richtigkeit gibt die Abweichung des gemessenen Mittelwertes von dem erwarteten

eferenzwert an. Um diese zu überprüfen, wurden jeweils fünf Blankproben beider Matrices

n (low quality control standard, LQC), einer mittleren (midrange quality

ontral standard, MQC) und mit einer hohen (high quality control standard, HQC)

lwert aller fünf Konzentrationen eines Konzentrationsbereiches (A) und die

immungsgrenz e, limit of quanti

n

ist (DIN 32645, 1994). Die Abweichungen der Konzentration zwisch

M

(E

roben mit der K

schiedlich

t. Bei Bestimm

l der Substanzen C

in ebenso verfahren.

3.3.5. Richtigkeit

D

R

mit einer niedrige

c

Konzentration innerhalb des Konzentrationsbereiches des jeweiligen Analyten gespikt,

aufgearbeitet und quantifiziert (EHSLC, 2002).

Zur Errechnung der relativen Abweichung des gemessenen Wertes von dem erwarteten Wert

wird der Mitte

theoretische Konzentration (B) zueinander in Beziehung gesetzt und wie folgt berechnet:

RE (%)= ( )⎥⎦⎤

⎢⎣⎡ ⋅

− 100B

BA

Im niedrigen Konzentrationsbereich sind Abweichungen von den zu erwarten Ergebnissen

von maximal 20 % und in den mittleren und hohen Konzentrationsbereichen von maximal

5% zulässig.

ie gewählten Konzentrationen sind in den Tabellen 8 und 9 aufgeführt:

1

D

61


Substanz Konzentration

[ng/ml]

Coffein 100, 1000, 10000

T 1heobromin 00, 1000, 10000

Theophyllin 100, 1000, 10000

Tab.8: Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung asma

Substanz

der Richtigkeit im Pl

Konzentration

[ng/ml]

Coffein 50, 100, 2000

Theobromin 100, 2500, 20000

Theophyllin 50, 2500, 20000

Paraxanthin 50, 250, 1000

Tab.9: Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Richtigkeit im

ie Präzision beschreibt die Übereinstimmung von wiederholten Messungen von Proben

leicher Konzentration. Man unterscheidet die Wiederholpräzision (SW) (Tagespräzision,

bility) und die Zwischenpräzision (Sb) (totale Präzision, interday

epeatability).

MITT, 2000):

Urin

3.3.6. Präzision

D

g

intraday repeata

r

Zur Bestimmung der Präzision wurden pro Analyt in beiden Matrices je 5 LQCs, 5 MQCs

und 5 HQCs an drei unterschiedlichen Tagen aufgearbeitet, gemessen und

chromatographisch-massenspektrometrisch quantifiziert. Die Variation durfte im niedrigen

Konzentrationsbereich maximal 20% und im mittleren und hohen Konzentrationsbereich

maximal 15% betragen (EHSLC 2002).

Die Wiederholpräzision (SW) und der Zwischenpräzision (Sb) wurden anhand folgender

Funktion berechnet (HERBOLD und SCH

62


( )∑

∑ ⋅ TagesserieTagesserie Sf 2

SW = Tagesserief

Sb = ( )

TagefgesamtTagesserie XX∑ − 2

Su

bstanz Konzentration

[ng/ml]

Coffein 100, 1000, 10000

Theobromin 100, 1000, 10000

Theophyllin 100, 1000, 10000

Paraxanthin 100, 1000 Tab.10: Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Präzision im Plasma

Substanz Konzentration

[ng/ml]

Coffein 50, 100, 2000

Theobromin 100, 2500, 20000

Theophyllin 50, 2500, 20000

Paraxanthin 50, 250, 1000 Tab.11: Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Präzision im Urin

.3.7. Stabilität

m die Stabilität der Analyten in der jeweiligen Matrix für den gesamten Zeitraum des

Proben des Hauptversuches

3

U

Versuches, der Probenlagerung und des Probentransportes sowie des Zeitraumes der Analyse

zu beweisen, wurden pro Matrix jeweils zwölf LQCs und zwölf HQCs hergestellt. Davon

wurden jeweils sechs sofort im Anschluss aufgearbeitet und quantifiziert. Die jeweils anderen

sechs Proben wurden unter den gleichen Bedingungen wie die

63


über einen Zeitraum von 12 Wochen bei –20°C gelagert. Nach Ablauf dieser Zeit wurden sie

benfalls aufgearbeitet und quantifiziert.

Die gewählten Konzentrationen sind in Tabelle 12 aufgeführt:

Matrix

e

Konzentration

[ng/ml]

Urin 100, 1000

Plasma 100, 1000

Tab.12: Konzentrationen von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin in den Matrices Urin und Plasma für den Stabilitätstest

3.3.8. Wiederfindung

Die Wiederfindung beschreibt den prozentualen Anteil des Analyten, der nach allen

Aufarbeitungsschritten noch wiedergefunden werden kann.

Zur Bestimmung der Wiederfindung wurden pro Matrix jeweils zweimal sechs Proben

aufgearbeitet und gemessen. Bei der Sequenz der ersten sechs Proben wurde der Analyt wie

gewohnt am Anfang dazu gegeben und der Interne Standard erst nach dem

Rotationsverdampfer bei der Überführung in die Vials. Bei der Sequenz der zweiten sechs

Proben wurde sowohl der Analyt als auch der Interne Standard erst bei der Überführung in die

Vials dazu gegeben.

Die Berechung der Wiederfindung erfolgte nach folgender Funktion:

Wiederfindung [%] =

( )

( )

( )

( )127Pr*

61Pr*

−⎥⎥⎦

⎤

⎢⎢⎣

⎡

−⎥⎥⎦

⎤

⎢⎢⎣

⎡

obenAreaArea

MW

obenAreaArea

MW

ISTD

Analyt

ISTD

Analyt

·100

64


3.4. Pharmakokinetische Auswertung

ie pharmakokinetischen Berechnungen erfolgten bei intravenöser Applikation von

nem Zwei-Kompartiment-Modell und nach oraler

erabreichung von Theophyllin nach einem Ein-Kompartment-Modell mit dem Programm

inNonlin® 4.1 (Pharsight, Mountain View California, USA).

D

Theophyllin und Theobromin nach ei

V

W

65

ERGEBNISSE

4 ERGEBNISSE

4.1. Ergebnisse der Analysemethoden

.1.1. Massenspektren der zu analysierenden Substanzen und ihrer internen Standards

nalyten

ach folgenden Retentionszeiten mit dem charakteristischen Produktion registriert:

.1.1.1. Massenspektrum von Theophyllin und 1,3-15N2- Theophyllin

heophyllin hat, wie Abb. 11 zeigt, unter den beschriebenen Bedingungen eine Retentionszeit

die Quantifizierung

ufgezeichnet.

4

Unter den im Kapitel 3.2. beschriebenen Gerätebedingungen werden die einzelnen A

n

4

T

von 3,28 Minuten und wird mit dem Produktion m/z 181.0 → 124.0 für

a

60 80 100 120 140 160 180m/z, amu

20%

40%

60%

80%

100%

Rel

. Int

. (%

)

181

124

69 96

9454

Abb. 11: ESI-Produktionenspektrum und Strukturformel von Theophyllin

66

ERGEBNISSE

Die Retentionszeit von 1,3-15N2-Theophyllin bei 3,29 Minuten und das charakteristische

Produktion m/z 183.0 → 125.0 sind in Abb. 12 dargestellt.

60 80 100 120 140 160 180m/z, amu

20%

40%

60%

80%

100%

Rel

. Int

. (%

)

183

125

9770

1,3-15N2-Theophyllin wurde als interner Standard sowohl für die Bestimmung von

Theophyllin als auch für den Metaboliten Paraxanthin im Urin und Plasma eingesetzt.

4.1.1.2. Massenspektrum von Theobromin und D6- Theobromin

Theobromin wird mit einer Retentionszeit von 2,91 Minuten und dem charakteristischen

Produktion m/z 181.0 → 138.0 unter den genannten Bedingungen detektiert. Das ESI-

Produktionenspektrum und die Strukturformel von Theobromin sind in Abb. 13 aufgeführt.

54

Abb. 12: ESI-Produktionenspektrum von 1,3-15N2-Theophyllin

67

ERGEBNISSE

60 80 100 120 140 160 180m/z, amu

20%

40%

60%

80%

100%R

el. I

nt. (

%)

181

67 138108 163110 1226953 83

Abb.13: ESI-Produktionenspektrum und Strukturformel von Theobromin

bb. 14 zeigt D6-Theobromin, den internen Standard zu Theobromin im Urin und Plasma,

elches nach einer Retentionszeit von 2,86 Minuten mittels des Produktions m/z 187.0 →

44.0 registriert wird.

A

w

1

60 80 100 120 140 160 180m/z, amu

20%

40%

R

60%t. (%

80

100%187

%

)

105

16911472

el. I

n

70 14412553 116

Abb.14: ESI-Produktionenspektrum von D6-Theobromin

68

ERGEBNISSE

69

4.1.1.3. Massenspektrum von Coffein und D3- Coffein

Coffein weist unter den entsprechenden Bedingungen eine Retentionszeit von 3,80 Minuten

auf und wird im Massenspektrometer mit dem Produktion m/z 195.0 → 138.0 registriert. Abb.

15 zeigt das ESI-Produktionenspektrum und die Strukturformel.

60 80 100 120 140 160 180 200

m/z, amu

20%

40%

60%

80%

100%

Rel

. Int

. (%

)

195

138

110123

ESI-Produktionenspektrum und Strukturformel von Coffein

69 83

Abb. 15:

D3-Coffein, welches als interner Standard für Coffein im Plasma und Urin eingesetzt wurde,

weist eine Retentionszeit von 3,78 Minuten auf. Seine Registrierung erfolgt

massenspektrometrisch über das Produktion m/z 198.0 → 141.0, wie in Abb. 16 dargestellt

wird.

ERGEBNISSE

ERGEBNISSE

70

60 80 100 120 140 160 180 200m/z, amu

20%

40%

60%

80%

100%198

141

el. I

113866953 126

Rnt

. (%

Abb.16: ESI-Produktionenspektrum von D3-Coffein

4.1.1.4. Massenspektrum von Paraxanthin

Paraxanthin zeigt eine Retentionszeit von 3,29 Minuten und wird im Massenspektrometer mit

dem Produktion m/z 181.0 → 55.0 aufgezeichnet, wie Abb. 17 zeigt.

)

60 80 100 120 140 160 180m/z, amu

20%

60%

80%

100%181

67 138163

9612255

40%

Rel

. Int

. (%

)

9469 83

124

uktionenspektrum und Strukturformel von Paraxanthin

Abb.17: ESI-Prod

70

ERGEBNISSE

4.2. Ergebnisse der Validierung

4.2.1. Selektivität

Die Analyten konnten bei ausreichender Trennung und ohne Verfälschung von fremden, in

der Probe vorkommenden Matrixinhaltstoffen erfasst werden.

Lediglich die Unterscheidung von Theophyllin und Paraxanthin gelang zunächst nicht, da sie

eine nahezu identische Retentionszeit und beide das Produktion m/z 181.0→ 124.0 aufwiesen.

Nach weiteren Untersuchungen fand sich als einziges Unterscheidungsmerkmal das

Produktion m/z 181.0→ 55.0, welches nur bei Paraxanthin dedektierbar war. Somit mu

llin und

Paraxanthin angesehen werden, und die Quantifizierung über die Differenzmethode erfolgen.

as bedeutet, dass wenn in Proben das Produktion m/z 181.0→ 55.0 keinen Peak zeigt, davon

usgegangen werden kann, dass der Peak des Produktions m/z 181.0→ 124.0 allein durch

hervorgerufen wird. Ist jedoch ein Peak des Produktions m/z 181.0→ 55.0

orhanden, muss hierüber die Paraxanthinkonzentration quantifiziert werden und von der über

en Peak des Produktions m/z 181.0→ 124.0 als Summenkonzentration von Theophyllin und

araxanthin ermittelten Wertes abgezogen werden.

den Abbildungen 18 und 19 sind beispielhaft Chromatogramme von Theobromin und

araxanthin im Urin dargestellt. Es wird jeweils ein Chromatogramm einer Leerurinprobe und

iner Pro onzentration von 100 ng Analyt pro 1ml Urin gezeigt.

sste

der Peak des Produktions m/z 181.0→ 124.0 als ein Summenpeak von Theophy

D

a

Theophyllin

v

d

P

In

P

eines e be mit der K

71

ERGEBNISSE

Abb.18: HPLC/MS/MS- Chromatogramme von Leerwerturinproben zu den entsprechenden

Retentionszeiten von Theobromin und Paraxanthin.

Abb.19: HPLC/MS/MS-Chromatogramme von Urinproben, denen 100 ng Theobromin

respektive Paraxanthin pro ml Urin zugesetzt wurden, zu den entsprechenden Retentionszeiten.

Die Abbildungen 20 und 21 zeigen Chromatogramme von Plasmaproben. Hier werden

zunächst Chromatogramme von Leerplasmaproben und anschließend Chromatogramme von

jeweils mit 100 ng/ml Plasma dotierten Coffein- bzw. Theophyllinproben dargestellt.

72

ERGEBNISSE

Abb.20: HPLC/MS/MS- Chromatogramme von Leerwertplasmaproben zu den entsprechenden

Retentionszeiten von Coffein und Theophyllin

Abb.21: HPLC/MS/MS–Chromatogramme von Plasmaproben, denen 100 ng Coffein

respektive Theophyllin pro ml Plasma zugesetzt wurden, zu den entsprechenden Retentionszeiten.

73

ERGEBNISSE

4.2.2. Linearität

lasma:

a wurden Theophyllin, Theobromin und Coffein in den Bereichen von 20 bis 1000

its in den Vorversuchen zeigte, dass mit keiner höheren Plasmakonzentration

ieses Metaboliten zu rechnen ist.

Die Abweichungen der geme ten Konzentrationen der Analyten betrug

an allen Messtagen im niedrigsten trationsbereich weniger als 20% und in den

höheren Konzen

Als Beispiel für die Linearität der Analyten im Plasma sind in Abbildung 22 und 23 jeweils

eine Kalibrationsgerade von Coffein und Theobromin im Konzentrationsbereich von 20 bis

l Plasm tellt.

P

Im Plasm

ng/ml, von 1000 bis 10000ng/ml sowie von 10000 bis 50000 ng/ml überprüft. Die Linearität

von Paraxanthin im Plasma wurde lediglich in dem Bereich von 20 bis 1000 ng/ml untersucht,

da sich bere

d

ssenen von den erwarte

Konzen

trationsbereichen weniger als 15%.

1000 ng/m a darges

y = 0.0058x - 0.0126R2 = 0.9991

0

1

2

3

4

5

7

6

st./I

S)

0 200 400 600 800 1000

Quo

tient

(Sub

bb.22: Kalibrationskurve mit Angabe der Kalibrationsgleichung und des

Messpunkte vor

Konzentration [ng/ml]

A Korrelationskoeffizienten für Coffein im Plasma; je Konzentrationsstufe liegen zwei

74

ERGEBNISSE

4

4.5

y = 0.0040x + 0.0087R2 = 0.9987

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 200 400 600 800 1000

Konzentration [ng/ml]

Quo

tient

(Sub

st./I

S)

: Kalibrationskurve mit Angabe der Kalibrationsgleichung und des Korrelationskoeffizienten für Theobromin im Plasma; je Konzentrationsstufe

Urin:

Bei der Prüfung der Kalibrationskurven konnte für Coffein im Konzentrationsbereich von 25

bis 1000 ng/ml ohl im reich von 25 bis 1000 ng/ml, als auch von 1000

bis 30000 ng/m raxanthin im zentrationsbereich von 25 bis 1000 ng/ml die

Linearität angenommen werden. Die Linearität von Theobromin konnte weder in den

iedrigen noch in den hohen Konzentrationsbereichen bestätigt werden, so dass in diesem Fall

erdeutlichten anhand des F- Tests, dass diese signifikant kleinere Varianzen beim

uadratischen Regressionsmodell aufwiesen, als es bei der linearen Regression der Fall war.

bbildung 24 und 25 zeigen beispielhaft je eine Kalibrationskurve von Theophyllin und

heobromin eines Messtages.

Abb.23 liegen zwei Messpunkte vor

, für Theophyllin sow Be

l und für Pa Kon

n

das quadratische Regressionsmodell gewählt wurde. Die Untersuchungen der Residuen

v

q

A

T

75

ERGEBNISSE

y = 0.0160x + 0.1451R2 = 0.9996

14

16

18

6

8

10

12

Quo

tient

(Sub

st./

0

2

4

0 200 400 600 800 1000 1200

n ation [ng/ml]Konze tr

Abb rve der Kalibrationsgleichung und des

Korrelationskoeffizienten für Theophyl in; je Konzentrationsstufe liegen zwei Messpunkte vor

.24: Kalibrationsku mit Angabe lin im Ur

y = -1E-07x2 + 0.01x9963

+ 10.773R2 = 0.

0

50

100

150

0

50

0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000Konzentration [ng/ml]

Quo

tient

(t./

IS)

bb.25: Kalibrationskurve mit Angabe der Kalibrationsgleichung und des

Korrelationskoeffizienten für Theobromin im Urin; je Konzentrationsstufe liegen zwei Messpunkte vor

20

2

Subs

A

76

ERGEBNISSE

Die Abweichungen der gemess en er onzentrationen betrugen auch im

Urin an allen Messtagen bei Coffein, Theobr Theophyllin und Paraxanthin im

niedrigsten Konzentrationsbereich weniger als 20% und in den höheren

Konzentrationsbereichen weniger als 15%.

4.2.3. Na isgrenze (L

lasma:

LOD) für

heophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im Plasma werden in Tabelle 13

aufgeführt.

N (LOD

enen von d warteten K

omin,

chwe OD)

P

Die nach Kapitel 3.3.3. ermittelten Nachweisgrenzen (limit of detection,

T

achweisgrenze ) ml] [ng/

Theophyllin 13

Theobromin 15

Paraxanthin 9 2

Coffein 4 1

Tab.13: Nachweisgrenzen von Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im Plasma

rin:

Die ittelten Nachweisgrenzen für Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im

rin sind T elle 14 zu entnehme

Nach enze (LOD)

U

erm

U ab n.

weisgr [ng/ml]

Theophyllin 20

Theobromin 26

Paraxanthin 32

Coffein 33

Tab.14: Nachweisgrenzen von Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im Urin

77

ERGEBNISSE

4.2.4. Bestimmungs-/Quantifizierungsgrenze (LOQ)

Plasma:

Die nach Kapitel 3.3.4. ermittelten Bestimmungs- bzw. Quantifizierungsgrenzen (limit of

B r ze (LOQ)

quantification, LOQ) für Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im Plasma

werden in Tabelle 15 aufgeführt.

estimmungsg en [ng/ml]

Theophyllin 100

Theobromin 100

Paraxanthin 100

Coffein 100 Tab.1 eophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im

Pla

rin:

ttelten Paraxanthin

Urin sind Tabelle 16 zu entnehmen.

Besti ze

5: Bestimmungsgrenzen von Thsma

U

Die ermi Bestimmungsgrenzen für Theophyllin, Theobromin, Coffein und

im

mmungsgren (LOQ) [ng/ml]

Theophyllin 50

Theobromin 100

Paraxanthin 50

Coffein 50

Tab.16: Bestimmungsgrenzen eophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im Urin

von Th

78

ERGEBNISSE

4.2.5. Richtigk

lasma

Die Tabellen 17, 18, 19 und 20 enthalten die Ergebnisse der Überprüfung der Methode auf

Richtigkeit. In den Tabellen ist jew er Mittelwert der gemessenen Konzentrationen aus 5

Einzelbestimmungen und die relative Abweichung aufgelistet.

Die ative Abw ng betrug i eren Konzentrationsbereich weniger als 20% und in

den oberen Konzentrationsbereich eniger als 1 . Allerdings waren am dritten Tag

sowohl bei Coffein als auch bei Theobromin bei einer Konzentration von 100 ng/ml relative

bweichungen knapp oberhalb von 20% erkennbar.

eit

P

eils d

rel eichu m unt

en w 5%

A

Mittelwert der erwartete gemessenen Relative

Tag Konzentrationen T - heophyllin Abweichung

[ng/ml] Konzentrationen RA [%] [ng/ml]

100 100,3 0,3 1000 1 1049,7 5,0

10000 10127,5 1,3 100 116,6 16,6

1 1000 2 008,0 0,8 10000 10000,4 0 100 109,0 9,0 1000 3 998,2 -0,28

10000 10358,0 3,6

Tab.17: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Theophyllin im Plasma

79

ERGEBNISSE

Mittelwert der

erwartete gemessenen Relative

Tag Konzentrationen Theobromin- Abweichung


100 95,0 -5,0 1 1000 996,6 -0,3 10000 10098,0 1,0 100 91,6 -8,4 2 1000 1039,5 4,0 10000 9739,6 -2,6 100 127,4 27,4 3 1000 976,7 -2,3

5,610000 1056,8

Tab.1 Ergebnisse der Überprüfung der R igkeit vo eobromin im Plasma

M ert der

8: icht n Th

ittelw erwartet senen Relative e gemes

Tag Konzentrationen Paraxanthin- Abweichung [ng/ml] Konzentrationen RA [%]

[ng/ml]

100 92.9 -7.1 1 1000 990.0 -1.0 100 88.7 -11.3 2 1000 1025.9 2.6 100 108.1 8.1

0.11000 3 1001.4

Tab.1 Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Paraxanthin im Plasma

M ert der

9:

ittelw erwa ssenen Relative rtete geme

Tag Konzentrationen Coffein- Abweichung


100 105,1 5,1 1 1000 967,2 -3,3 10000 9554,6 -4,5 100 96,6 -3,4 2 1000 1138,9 13,9 10000 10555,3 5,6 100 121,2 21,2 3 1000 1062,6 6,3 10000 10172,2 1,7

Tab.20: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Coffein im Plasma

80

ERGEBNISSE

Urin:

Die Überprüfung der Methode auf Richtigkeit im Urin wurde für die Konzentrationen 50,

2500 und 20000 ng/ml Urin bei Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein bestätigt.

ie entsprechenden Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 21, 22, 23 und 24 aufgeführt.

Im lag lativ eich i allen Substanzen im niedrigen

Konzentrationsbereich unter 20% und in höheren Konzentrationsbereichen unter 15%.

M ert der

D

Urin die re e Abw ung be

ittelw

erwa senen elative rtete gemes R

Tag Konzentrationen Theophyllin- eichung Abw


50 47,0 -6,0 1 2500 2285,7 -8,6 20000 19150,9 -4,3 50 43,7 -12,4 2 2500 2402,8 -3,9 20000 18510,0 -7,5 50 43,2 -13,6 3 2500 2568,2 2,7 20000 20400,3 2,0

Tab.21: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Th llin im eophy Urin

Mittelwert der


Tag Konzentrationen Theobromin- Abweichung


100 98,3 -1,7 1 2500 2460,7 -1,6 20000 19254,9 -3,7 100 114,8 14,8 2 2500 2505,3 0,2 20000 18504,1 -7,5 100 118,3 18,3 3 2500 2631,5 5,3 20000 20497,8 2,5

ab.22: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Theobromin im Urin T

81

ERGEBNISSE

Mittelwert der


Tag Konzentrationen Paraxanthin- Abweichung


50 55,1 10,3 1 250 228,4 -8,7 1000 935,0 -6,5 50 41,9 -16,2 2 250 248,2 -0,7 1000 1021,2 2,1 50 54,4 8,8 3 250 246,9 -1,3 1000 1040,0 4,0

Tab.23: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Paraxanthin im Urin

M

ittelwert der

erwa geme Relative rtete ssenen

Tag Konzentra Cof Abw g tionen fein- eichun

[ng/ml] Konzentrationen RA [%] [ng /ml]

50 58 1,1 6,2 1 100 103,1 3,1 20000 1975 -18,4 ,3 50 55,8 11,7 2 100 87,9 -12,1 2000 1973 -0 9,6 1,2 50 44 -1,8 0,3 3 100 98,2 -1,8 20000 19051,0 -4,8

Tab.24: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Coffein im Urin

82

ERGEBNISSE

4.2.6. Präzision

Plasma

e Ergebnisse der Präzisionsberechnung der

traday- und der Präzi A ma aufgeführt. Sowohl die

Intra ls a day lagen bei allen Substanzen innerhalb der

bweichungsgrenze vo 20% im 1 nzentrationsbereich.

ophyllin Theobromin

In den folgenden Tabellen 25 und 26 sind di

In Interday- sion der vier nalyten im Plas

day- a uch die Inter -Präzision

A n niedrigen und 5% im hohen Ko

The

erwartete Intrad nterday Intraday I ay ay I nterd

K Präz Präzision Präzision ision onzentrationen ision Präz

[ng/ml] [% [%] [%] [%] ]

100 1 7,5 9,8 19,3 5,5

1000 9, 2,7 6,8 3,2 0

10000 8 1,8 3,8 4,4 ,0

Tab.25: Intraday- und Interdaypräzision von Theophyllin und Theobromin im Plasma

Coffein Paraxanthin

erwartete Intraday Interday Intraday Interday

Konzentrationen Präzision Präzision Präzision Präzision

[ng/ml] [%] [%] [%] [%]

100 15,8 11,7 14.79 10.58

1000 7,3 5,0 5.4 1.8

10000 10,8 8,4 n.m. n.m.

Tab.26: Intraday- und Interdaypräzision von Coffein und Paraxanthin im Plasma

83

ERGEBNISSE

Urin:

Die Ergebnisse der Präzision für die Quantifizierung von Theophyllin und Theobromin sowie

anthin und Coffein im Urin sind den unten aufgeführten Tabellen 27 und 28 zu

Theophyllin Theobromin

von Parax

entnehmen.

erwartete Intraday y erwartete Intraday Interday Interda

Ko Prä nzentrationen Präzision Präzision nzentrationen zision Präzision Ko

[ng/ml] [%] [%] [ng/ml] [%] [%]

50 8,2 4,6 100 3,2 9,7

2500 8,3 9 2500 6,9 3,5 5,

20000 14,9 20000 16,8 5,2 5,2

Intraday- und Interdaypräzision von Theophyllin und Theobromin im Urin

Paraxanthin Coffein

Tab.27:

erwartete Intraday Interday erwartete Intraday Interday

Konzentrationen Präzision Präzision Konzentrationen Präzision Präzision

[ng/ml] [%] [%] [ng/ml] [%] [%]

50 9,1 14 50 14,2 13,3 ,8

250 7 100 13,3 13,0 ,4 4,6

1000 14,9 20000 8,1 2,1 5,6

Ta - und Interdaypräzision von Coffein und Paraxanthin im Urin

b.28: Intraday

84

ERGEBNISSE

85

, Theobromin und Paraxanthin sind innerhalb des Zeitraums von 28 Tagen stabil.

on geltenden Abweichung

15% im hohen Konzentrationsbereich liegt.

it den jeweiligen Konzentrationen am Tag 0 und am Tag 28 sind in der folgenden Tabelle

4.2.7. Stabilität

Plasma:

Theophyllin

Die Ergebnisse und der Vergleich der Messdaten mit Hilfe des U-Tests lassen darauf

schließen, dass Coffein zwar nach einem Zeitraum von 28 Tagen einen Substanzverlust

aufweist, dieser jedoch innerhalb der für die Richtigkeit und Präzisi

von 20% im niedrigen Konzentrationsbereich und

Die Ergebnisse der Stabilitätsprüfung von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein

m

29 dargestellt.

Tag 0 Tag 28 erwartete Mittelwert der Mittelwert der

Analyt Konzentrationen gemessenen gemessenen Abweichung

Konzentrationen Konzentrationen [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [%]

100 100,0 98,5 -1,5

Theophyllin 1000 977,5 970,8 -0,7

100 97,3 97,4 0,1

Theobromin 1000 1066,3 984,8 -7,6

100 82.62 79.94 -3.2

Paraxanthin 1000 996.36 907.92 -8,9

100 95,4 78,8 -17,2

Coffein 1000 953,9 901,7 -5,5

Tab.29: Stabilitätsdaten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein im Plasma

Urin:

ERGEBNISSE

Die Ergebnisse der Stabilitätsuntersuchungen der Substanzen im Urin sind in der folgenden

Tabelle 30 aufgeführt.

Tag 0 Tag 28

erwartete Mittelwert der lwert der Mitte

Analyt Konzentrationen gemessenen gemessenen Abweichung

Konzentrationen onzentrationen K

[ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [%]

100 96,7 100,7 -3,9

Theophyllin 1000 1051,0 1001,5 -4,7

100 100,3 98,0 -2,3

Theobromin 1000 1134,2 982,7 -13,6

100 104,3 103,3 -1,0

Paraxanthin 1000 946,9 896,6 -5,3

100 89,0 92,1 3,4 Coffein 1000 943,2 1134,2 4,7

Tab.30: Stabilitätsdaten von Theophyllin, T min, Paraxanthin und Coffein im Urin

Diese Ergebnisse verdeutlichen unter Berücksi ng des U-Tests, dass sowohl Coffein und

Theobromin, als auch Theophyllin und Par in in einem Zeitraum von 28 Tagen

geringgradige Konzentrationsveränderungen aufweisen. Diese Abweichungen liegen jedoch

innerhalb der Messungenauigkeit, so dass tabilität dieser Substanzen für diesen

Zeitraum angenommen werden kann.

heo

cht

ax

ein

bro

igu

anth

e S

86

ERGEBNISSE

4.2.8. Wiederfindung

Plasma:

Die Ergebnisse der Berechnung der Wiederfindung der Substanzen Theophyllin, Theobromin,

Paraxanthin und Coffein im Plasma sind in Tabelle 31 beschrieben.

Mittlere Substanzen Wiederfindungsrate [%]

Theophyllin 90,2

Theobromin 84,9

Paraxanthin 90,2

Coffein 100,0 T Wiederfindungsraten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin unab.31: d Coffein im

Plasma

rin:

Mittlere

U

Die Wiederfindungsergebnisse der Analyten im Urin sind der Tabelle 32 zu entnehmen.

Substanzen Wiederfindungsrate [%]

Theophyllin 96,1

Theobromin 93,4

Paraxanthin 95,9

Coffein 92,4

Tab.32: Wiederfindungsraten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein im Plasma

87

ERGEBNISSE

4.3. Ergebnisse des Hauptversuches

4.3.1.

In Anlehnung an den Hauptversuch gliedert sich die Untersuchung der Plasmaproben in drei

ischen der applizierten

Substanz sowie den entstandenen Metaboliten unterschieden wird.

8.834 ng pro ml Plasma gemessen werden. Wie

allen Pferden

ml Plasma nicht unterschritten. In Abb.

6 sind die Plasmakonzentrationsverläufe von Theophyllin aller Pferde dargestellt.

anthin erst nach zwei Stunden gemessen werden. Die gemessenen

Coffeinplasmakonzentrationen der Pferde 2 und 4 blieben unterhalb der ermittelten

ierun Wert

oberhalb d ale

offeinplasmakonzentration von 1.283 ng/ml wies Pferd 5 nach zwei Stunden auf. Abb. 27

nd 28 zeigen die gemittelten Plasmakonzentrationsverläufe von Paraxanthin und Coffein und

Theophyllin, Abb. 29 das prozentuale Verhältnis von Theophyllin und Paraxanthin. Die

Einzelwerte der Theophyllin-, Paraxanthin- und Coffeinplasmakonzentrationen aller Pferde

sind in den Tabellen 43, 44 und 45 im Anhang aufgeführt.

Plasma

Abschnitte (Kapitel 4.3.1.1. bis Kapitel 4.3.1.3), in denen jeweils zw

4.3.1.1. Theophyllin und Metaboliten nach intravenöser Applikation

Nach intravenöser Verabreichung von Theophyllin konnten im Plasma maximale

Theophyllinkonzentrationen von 5.165 bis

aus Abbildung 26 ersichtlich, wurden diese bei allen Pferden innerhalb der ersten zwei bis

fünf Minuten erreicht. In den darauffolgenden zehn Minuten fielen die Konzentrationen

zunächst stark ab, um dann bei den Pferden 1, 2, 4, 5 und 6 nochmals geringgradig

anzusteigen, bevor sie nach 30 Minuten langsam kontinuierlich abnahmen. Bei

wurde innerhalb des Probenentnahmezeitraumes von sechzig Stunden die

Quantifizierungsgrenze von 100 ng Theophyllin pro

2

Im Plasma ließen sich außerdem die Metaboliten Paraxanthin und Coffein nachweisen.

Theobromin hingegen konnte nicht detektiert werden.

Die maximalen Paraxanthinkonzentrationen von 370 bis 868 ng/ml wurden bei den Pferden 1,

2, 3, 4 und 6 nach zwei Minuten gemessen. Lediglich bei Pferd 5 konnten die höchste

Konzentration von Parax

Quantifiz gsgrenze von 100 ng/ml. Bei den Pferden 1 und 3 konnte jeweils nur ein

er Quantifizierungsgrenze gemessen werden. Die maxim

C

u

88

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

0 10 20 30 40 50 60 70

Stunden nach Applikat

Kon

zent

ratio

n Th

eoph

yllin

[ng/

ml]

Pferd 1 Pferd 2 Pferd 3 Pferd 4 Pferd 5 Pferd 6

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

0 0.2 0.4 0.6

ion

0.

m

8 1 1.2

Abb. 26 : Plasmakonzentrationsverläufe von Theophyllin bei sechs Pferden nach ein aliger intravenöser Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht, Ausschnittsvergrößerung zeigt den Konzentrationsverlauf innerhalb der ersten Stunde

89

ERG

EBN

ISSE

ERGEBNISSE

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

0 10 20 30 40 50 60 70

Stunden nach Applikation

Kon

zent

ratio

n [n

g/m

Paraxanthin- Mittelwerte

Coffein- MittelwerteTheophyllin- Mittelwerte

Abb. 27: Gemittelter Plasmakonzentrations uf von Theophyllin und den Metaboliten Paraxanthin und Coffein (Theobro wurde nicht nachgewiesen)

verlamin

0

100

200

300

400

500

600

0 10 20 30 40 50 60 7

Stunden n

0

pplikation

Kon

zent

ratio

n [n

g/

ach A

m Paraxanthin- MittelwerteCoffein- MittelwerteLOQLOD

Abb.28: Gemittelter Plasmakonzentrationsv der Metaboliten Paraxanthin und Coffein nach intravenöser Applikation von g Theophyllin sowie der Quantifizierungsgrenze (LOQ) un chweisgrenze (LOD)

erl 4 m

d de

auf g/k

r Na

90

ERGEBNISSE

91

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

0 0.08 0.25 0.5 1 3 7 12 24 32 48 60

Zeit [h]

Theophyllin Paraxanthin Theobromin Coffein

Abb. 29: Prozentuales Verhältnis von Theophyllin und dem Metaboliten Paraxanthin und Coffein im Plasma nach intravenöser Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen von LOQ (es wurde kein Theobromin nachgewiesen)

4.3.1.2. Theophyllin und Metaboliten nach oraler Applikation

Die maximalen Plasmakonzentrationen von The

zwischen 1.791 ng/ml und 3.483 ng/ml. Der

Konzentration variiert von vierzig Minuten bis zwölf Stunde

wurde von zwei Pferden nach 60 Stunden, von dr

Pferd erst nach 108 Stunden unterschritten.

Auch nach oraler Applikation konnte der Me

maximalen Konzentrationen lagen zwischen

40 Minuten und 12 Stunden erreicht. Ab 48 Stunde

die Werte aller Pferde die Quantifik

Coffein war lediglich in Spuren im Bere

Theobromin konnte nicht nachgewiesen werden.

ophyllin nach oraler Verabreichung lagen

Zeitraum des Erreichens der maximalen

n. Die Quantifizierungsgrenze

ei Pferden nach 96 Stunden und von einem

tabolit Paraxanthin nachgewiesen werden. Die

157 ng/ml und 370 ng/ml und wurden zwischen

n nach der Verabreichung unterschritten

ationsgrenze für Paraxanthin von 100ng/ml.

ich der Nachweisgrenze von 14 ng/ml erkennbar.

Die Einzelwerte d ind in

en Tabellen 46 und 47 im Anhang aufgeführt. Abb. 30 zeigt die

akonzentrationsverläufe aller sechs Pferde, Abb. 31 die gemittelten Plasm

d

er Theophyllin- und Paraxanthinplasmakonzentrationen aller Pferde s

ERGEBNISSE

Plasmakonzentrationsverläufe von Theophyllin und Paraxanthin und Abb. 32 deren

prozentuales Verhältnis.

0

500

1000

1500

2000

2500

0 20 40 60 80 100 120


Kon

zent

ratio

n [n

g/m

Theophyllin- MittelwerteP

rlau

The

araxanthin- Mittelwerte

Abb. 30: Gemittelter Plasmakonzentrationsve f von Theophyllin und Paraxanthin im Plasma nach oraler Applikation von 4 m ewicht im Mittel bis zum Erreichen von LOQ (es wurde kein in und kein Coffein nachgewiesen)

g/kg Körpergobrom

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

0 0.16 0.66 3 9

Ze24 48 60

]it [h


Abb. 31: Prozentuales Verhältnis von Theophyl d dem Metaboliten Paraxanthin im Plasma nach oraler Applikation von g Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen von LOQ (es wurde kein in und kein Coffein nachgewiesen)

lin ung/k

obrom 4 mThe

92

0

5 0 0

1

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

2 5 0 0

3 0 0 0

3 5 0 0

4 0 0 0

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 2 0

S tu n d e n n a c h A p p lik a t io n

Kon

zent

ratio

n [n

g/m

l]

P fe rd 1 P fe rd 2 P fe rd 3 P fe rd 4 P fe rd 5 P fe rd 6

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

2 5 0 0

3 0 0 0

3 5 0 0

4 0 0 0

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5

Abb. 32: Plasmakonzentrationsverläufe von Theophyllin nach einmaliger oraler Applikation von 4mg Theophy gewicht, Ausschnittsvergrößerung zeigt die ersten 25 Stunden nach Applikation

93

ERG

EBN

ISSE

3 0

llin pro kg Körper

ERGEBNISSE

4.3.1.3. he in te i ö p

W n u m n d im Pla nze nen der

ein lnen de W zw en ng nd 2 an und wurden zwischen

zw und inu ach ave V eich erre De zent sverlauf

f ach initialer Maximalkonzentration bei Pfer 1, 4, 5 und 6 ab, u ann zehn

M en n der ika kon rlic gsa eite

und 3 weicht der Verlauf wie folgt ab: Die Pl akonzentrationen schwanken innerhalb der

ersten zwanzig Minuten stark zwischen hohen

im rla n ferde kontinuierlic a o ati erli

ie Werte der Pferde 1, 2 und 5 unterschreiten bereits nach 96 Stunden die

isen über

en Probenentnahmezeitraum von 168 Stunden Theobrominplasmakonzentrationen oberhalb

er Quantifizierungsgrenze auf. Wie die prozentuale Darstellung in Abb. 33 zeigt, läßt sich

im Plasma lediglich Theobromin

br inap werden. Die Einzelwerte der

r inpl in Tab. 48 im Anhang aufgeführt.

T obrom und Metaboli n nach ntraven ser Ap likation

ie der Abbildu g 34 z entneh en ist, ahmen ie max alen smako ntratio

ze Pfer erte isch 5.715 /ml u 12.40 ng/ml

ei 45 M ten n intr nöser erabr ung icht. r Kon ration

ällt n den den stark m d

inut ach Appl tion tinuie h lan m w r abzufallen. Bei den Pferden 2

asm

und niedrigen Werten, um danach ähnlich wie

Ve uf der a deren P h langs m an K nzentr on zu v eren.

D

Quantifizierungsgrenze, die des Pferdes 6 nach 144 Stunden. Die Pferde 3 und 4 we

d

d

nach intravenöser Verabreichung von Theobromin

nachweisen. Coffein, Theophyllin und Paraxanthin konnten nach intravenöser

Theo om plikation nicht nachgewiesen

Theo om asmakonzentrationen aller Pferde sindb

0%10%2030%40%50%60%70%80%9

100%0%

%

0 0.08 0.25 0.5 1 3 7 13 28 48 96 144

Zeit [h]


Abb. 33: Prozentuales Verhältnis von Theobr

omin und Metaboliten im Plasma nach intravenöser Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht im Mittel (es wurde kein Theophyllin, kein Paraxanthin und kein Coffein nachgewiesen)

94

0

2000

4000

6000

8000

10

12

14

Kon

zent

ratio

n [n

g/m

l]

000

000

000

0 2 0 60 80 120 140 180

S tu n d en n ach A p p tio n0 4 100

lika160

P ferd 1 P fe rd 2 P fe rd 3 P fe rd 4 P fe rd 5 P fe rd 6 0

2000

0 0.4

Abb. 34: Plasmakonzentrationsverläufe von Theobromin nach einmaliger intravenöser Applikation von 4 mg Theobro kg Körpergewic Ausschnittsvergrößerung gt die erste Stunde nach Applikation

95

ERG

EBN

ISSE

ht,

4000

00

00

00

00

00

60

80

100

120

140

0.2 0 .6 0 .8 1 1.2

min pro zei

ERGEBNISSE

4.3.2. Pharmakokinetische Berechnungen

4.3.2.1. Pharmakokinetik von Theophyllin nach intravenöser Applikation

Die Berechnung der pharmakokinetischen Parameter für Theophyllin nach intravenöser

Verabreichung erfolgte anhand eines Zwei-Kompartiment-Modells, da aufgrund der in Abb.

5 dargestellten halblogarithmischen Darstellung der gemittelten

lasmakonzentrationsverläufe des Theophyllins von einem biexponentiellen Phasenverlauf

ausgegangen werden konnte.

3

P

1

10

100

1000

10000

0 10 20 0 50 60

Z

30 4

eit [h]

Kon

zent

ratio

n [n

g/m

l]

MittelwertLOQLOD

bb.35: Halblogarithmische Darstellung der gemittelten Theophyllinkonzentrationsverläufe im r

ie Ergebnisse der pharmakologischen Berechnungen durch das Programm WinNonlin® 4.1

lle 33 dargestellt.

APlasma nach einmaliger intravenöser Applikation von Theophyllin, sowie deQuantifizierungsgrenze (LOQ) und der Nachweisgrenze (LOD)

D

(Pharsight, Mountain View California, USA) sind in Tabe

96

ERGEBNISSE

Para- Einheit Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard-

meter 1 2 3 4 5 6 wert abweichung

AUC [ng/ml*h] 87652 80682 49055 53372 89035 74065 72310 17249

α [h-1] 2.64 3.17 31.95 4.33 38.75 15.02 15.98 15.83

β [h-1] 0.04 0.06 0.07 0.05 0.04 0.06 0.05 0.01

α 0,5 [h] 0.3 0.2 0.1 0.2 0.1 0.1 0.2 0.1

β 0,5 [h] 16.6 12.6 10.1 14.5 15.6 12.3 13.6 2.4

C max [ng/ml] 8808 6657 16149 4941 11786 10323 9777 3975

CL [ml/h/kg] 45.6 49.6 81.5 74.9 44.9 54.0 58.4 15.8

MRT [h] 23.5 17.9 14.5 20.7 22.5 17.6 19.4 3.4

Vss [ml/kg] 1071.2 890.1 1180.4 1548.4 1008.9 949.5 1108.1 237.9

Tab.33: Pharmakokinetische Daten bis zur Quantifizierungsgrenze nach einmaliger intravenöser Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht

nter der Kurve (area under the curve) = Hybridkonstante Verteilungsphase = Hybridkonstante der Eliminationsphase

0,5 = Halbwertzeit für die Eliminationsphase

ax = maximale Konzentration

AUC = Fläche uαβα 0,5 = Halbwertzeit für die Verteilungsphase βC mCL = Clearance MRT = mittlere Verweildauer eines Moleküls im Organismus Vss = Verteilungsvolumen im Steady State

4.3.2.2. Pharmakokinetik von Theophyllin nach oraler Applikation

Die Berechnungen der pharmakokinetischen Parameter für Theophyllin nach oraler

Applikation wurde anhand eines Ein-Kompartiment-Modells durchgeführt, da die in Abb. 36

gezeigte halblogarithmische Darstellung der gemittelten Plasmakonzentrationen von

Theophyllin sich monoexponentiell verhielt.

Die Ergebnisse der pharmakokinetischen Berechnungen sind in Tabelle 34 zusammengefasst.

97

ERGEBNISSE

98

1

10

100

1000

0 20 40 60 80 100 120

Zeit [h]

Kon

zent

ratio

n [n

g/m

l]10000 Theophyllin- Mittelwerte

LOQLOD

Abb.36: Halblogarithmische Darstellung der gemittelten Theophyllinkonzentrationsverläufe im Plasma nach einmaliger oraler Applikation von Theophyllin, sowie der

Nachweisgrenze (LOD)

Pferd Pferd Mittel- Standard-

Quantifizierungsgrenze (LOQ) und der

Para- Einheit Pferd Pferd Pferd Pferd


AUC [ng/ml*h] 56495 40490 84566 66423 79068 41928 61495 18517

K01 HL [h-1] 3.37 1.03 0.95 2.09 0.12 2.25 1.64 1.16

K10 HL [h-1] 13.86 6.76 21.44 11.52 17.49 14.17 14.21 5.02

CL [ml/h/kg] 70.8 98.8 47.3 60.2 50.6 95.4 70.5 22.2

Tmax [h] 9.08 3.29 4.48 6.28 0.86 7.1 5.18 2.93

Cmax [ng/ml] 1794 2964 2366 2738 3029 1449 2390 648

Kel [h-1] 0.04 0.05 0.04 0.05 0.03 0.03 0.04 0.01

Tab.34: Pharmakokinetische Daten bis zur oraler Applikation von 4 mg Theoph

AUC = Fläche unter der Kurve (area under the curve)K01 HL = Halbwertszeit der ResorptionskonstanteK10 HL = Halbwertszeit der EliminationskonstanteCL = Clearance Tmax = Zeit bis zum Erreichen der maximaCmax = maximale KonzentrationKel = Eliminationskonstante

Quantifizierungsgrenze nach einmaliger yllin pro kg Körpergewicht

n n

len Konzentration (Cmax)

ERGEBNISSE

Aus den ermittelten Parametern lässt sich zusätzlich die orale Bioverfügbarkeit (F) von

Theophyllin bestimmen. Sie wird über das Verhältnis der Flächen unter den Kurven nach

intravenöser (AUC i.v.) und nach oraler (AUC oral) Verabreichung wie folgt berechn

et:

100..

⋅⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=

vi

oral

AUCAUC

F [%]

Die orale Bioverfügbarkeit von Theophyllin wurde mit 85% errechnet.

4.3.2.3. Pharmakokinetik von Theobromin nach intravenöser Applikation

Zur Berechnung der pharmakokinetischen Parameter des intravenös verabreichten

Theobromins wurde, aufgrund des in Abb. 37 dargestellten biexponentiellen Verlaufes der

halblogarithmischen Darstellung der Plasmakonzentrationsmittelwerte, ein Zwei-

Kompartiment-Modell gewählt. Die Ergebnisse der pharmakokinetischen Berechnungen sind

in Tabelle 35 zusammengefasst.

1

10

100

1000

10000

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Zeit [h]

Kon

zent

ratio

n [n

g/m

l]

Theobromin- MittelwerteLOQLOD

Abb.37: Halblogarithmische Darstellung der gemittelten Theobrominkonzentrationsverläufe im Plasma nach einmaliger intravenöser Applikation von Theobromin, sowie der Quantifizierungsgrenze (LOQ) und der Nachweisgrenze (LOD)

99

ERGEBNISSE



AUC [ng/ml*h] 28895 111380 94570 131372 90244 97882 92391 34500

α [h-1] 23.72 0.08 0.13 5.68 23.53 6.2 9.89 10.96

β [h-1] 0.2 0.02 0.02 0.02 0.04 0.03 0.06 0.07

α 0,5 [h] 0.1 9.1 5.2 0.1 0.1 0.1 2.2 3.8

β 0,5 [h] 3.5 30.9 25.1 29.1 18.5 21.3 21.4 9.9

C max [ng/ml] 20382 6585 5174 5626 18911 6397 8539 5827

CL [ml/h/kg] 138.4 35.9 42.3 30.5 44.3 40.9 55.4 41.0

MRT [h] 4.9 23.2 28.9 41.8 26.5 30.5 25.9 12.1

Vss [ml/kg] 680.6 834.5 1221.7 1272.1 1174.5 1247 1071.7 250.3 Tab.35: Pharmakokinetische Daten bis zur Quantifizierungsgrenze nach einmaliger

intravenöser Applikation von 4 mg Theobromin pro kg Körpergewicht

UC = Fläche unter der Kurve (area under the curve) = Hybridkonstante Verteilungsphase = Hybridkonstante der Eliminationsphase 0,5 = Halbwertzeit für die Verteilungsphase 0,5 = Halbwertzeit für die Eliminationsphase max = maximale Konzentration L = Clearance RT = mittlere Verweildauer eines Moleküls im Organismus ss = Verteilungsvolumen im Steady State

AαβαβCCMV

100

ERGEBNISSE

101

ten im Urin Theophyllin und

l. Theobromin konnte nicht nachgewiesen werden.

izierungsgrenze von 50 ng Theophyllin pro ml

ten Probenentnahmezeitraum in Konzentrationen

ungsgrenze von 50 ng pro ml Urin nachzuweisen. Die höchsten

chen 745 ng/ml und 2.980 ng/ml und wurden

rei bis zwölf Stunden gemessen. Die Einzelwerte der

- und Paraxanthinurinkonzentrationen aller Pferde sind in den Tabellen 49 und 50

Anhang aufgeführt. Das prozentuale Verhältnis von Theophyllin und Paraxanthin wird in

Abb. 39 veranschaulicht. In Abb.38 werden die Theophyllinkonzentrationsverläufe aller

Pferde im Urin nochmals graphisch dargestellt.

4.3.3. Urin

4.3.3.1. Theophyllin und Metaboliten nach intravenöser Applikation

Nach intravenöser Verabreichung von Theophyllin konn

Paraxanthin nachgewiesen werden. Coffein war in Spuren erkennbar, die Werte überschritten

aber nicht die Bestimmungsgrenze von 50 ng pro ml Urin, somit kann Coffein nicht sicher

quantifiziert werden. Die gemittelten rein rechnerischen Coffeinkonzentrationen lagen alle

unter der Detektionsgrenze von 14 ng/m

Theophyllin wies maximale Konzentrationen von 21.636 ng/ml bis 93.373 ng/ml auf. Diese

wurden nach drei bis neun Stunden im Anschluss an die Injektion erreicht. Im weiteren

Verlauf fielen die Konzentrationen zunächst rasch ab, danach sanken sie langsam und

kontinuierlich. Über den Zeitraum der Urinprobenentnahmen von 60 Stunden fiel bei keinem

Pferd die Urinkonzentration unter die Quantif

Urin. Auch Paraxanthin war über den gesam

über der Bestimm

Paraxanthinurinkonzentrationen lagen zwis

ähnlich dem Theophyllin nach d

Theophyllin

im

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

0 10 20 30 40 50 60 70


Kon

zent

ratio

n [n

g/m

l]


Abb. 38: Urinkonzentrationsverläufe von Theophyllin nach einmaliger intravenöser Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht

102

ERG

EBN

ISSE

ERGEBNISSE

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

0 1 3 6 9 12 15 24 28 32 36 48 54 60Zeit [h]


Abb. 39: Prozentuales Verhältnis von Theophyllin und Paraxanthin im Urin nach intravenöser

Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen von LOQ (es wurde kein Theobromin und kein Coffein nachgewiesen)

103

ERGEBNISSE

104

gemessen. Die Konzentrationen stiegen bei allen

Pferden innerhalb dieser ersten Stunden stark an, um danach wieder stark abzufallen. Nach

zwanzig Stunden stellte sich der Konzentrationsabfall deutlich langsamer dar. In dem

Zeitraum der Probenentnahmen unterschritten lediglich die Konzentrationen der letzten

beiden Proben von Pferd 1 die Quantifizierungsgrenze von 50 ng Theophyllin pro ml Urin.

Diese Werte befanden sich jedoch noch oberhalb der Nachweisgrenze.

Wie auch nach intravenöser Verabreichung von Theophyllin konnte im Urin der Metabolit

Paraxanthin sicher nachgewiesen und quantifiziert werden. Coffein war auch bei diesen

Proben in Spuren erkennbar, die Konzentrationen erreichten aber nicht die

Quantifizierungsgrenze und überschnitten im Mittel nicht die Detektionsgrenze von 33 ng/ml.

Theobromin konnte nicht nachgewiesen werden.

Maximale Paraxanthinkonzentrationen zwischen 842 ng/ml und 1864 ng/ml konnten in einem

von drei bis elf Stunden nach der Verabreichung gemessen werden. Die

sgrenze von 32 ng/ml wurde im Verlauf des Probenentnahmezeitraums von allen

Pferden unterschritten.

den Tabellen 51 und 52 heophyllin

Theophyllinkonzentrationsverläufe aller Pferde im Urin nochmals graphisch dargestellt.

4.3.3.2. Theophyllin und Metaboliten nach oraler Applikation

Nach oraler Verabreichung von 4mg Theophyllin pro kg Körpergewicht wurden im Urin

maximale Theophyllinkonzentrationen von 16.365 ng/ml bis 41.256 ng/ml innerhalb der

ersten drei bis elf Stunden nach Applikation

Zeitraum

Detektion

Die Einzelwerte der Theophyllin- und Paraxanthinurinkonzentrationen aller Pferde sind in

im Anhang aufgeführt. Das prozentuale Verhältnis von T

und Paraxanthin wird in Abb. 41 veranschaulicht. In Abb. 40 werden die

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

0 20 40 60 80 100 120


Kon

zent

ratio

n [n

g/m

l]


Abb. 40: Urinkonzentrationsverläufe von Theophyllin nach einmaliger oraler Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht

105

ERG

EBN

ISSE

ERGEBNISSE

0%10%20%30%

80%

40%50%60%70%

90%100%

0 1.5 6 11 15 30 54 72 108

Zeit [h]


bb.41: Prozentuales Verhältnis von Theophyllin und Paraxanthin im Urin nach oraler Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen von LOQ (es wurde kein Theobromin und kein Coffein nachgewiesen)

A

106

ERGEBNISSE

4.3.3.3. Theobromin und Metaboliten nach intravenöser Applikation

Abb.43 zeigt den Theobrominkonzentrationsverlauf im Urin nach intravenöser Applikation

mg Theobrom Die maximalen Konzentrationen schwanken

zwischen 65.771 ng/ml und 94.889 ng/ml. Sie werden nach drei bis neun Stunden erreicht.

ach diesem anfänglichen starken Anstieg fallen die Konzentrationen zunächst rasch wieder

ung von

heobromin im Urin dedektiert werden. Das prozentuale Verhältnis der im Urin

2

ie Einzelwerte der Theobrominurinkonzentrationen aller Pferde sind in der Tabelle 53 im

rt. In werden die Theobrominkonzentrationsverläufe aller Pferde im

rin nochmals graphisch dargestellt.

von 4 in pro kg Körpergewicht.

N

ab. Dieser Konzentrationsabfall stellt sich in der Folgezeit langsamer dar. Die

Quantifizierungsgrenze von 100 ng/ml wird bei vier der sechs Pferde bereits während des

Probenentnahmezeitraumes von 168 Stunden unterschritten.

Weder Theophyllin, Coffein noch Paraxanthin konnten nach intravenöser Verabreich

T

dedektierbaren Substanzen nach intravenöser Applikation von Theobromin wird in Abb. 4

gezeigt.

D

Anhang aufgefüh Abb. 43

U

0%

100%

50%60%70%80%90%

10%20%30%40%

1 3 6 9 13 24 28 36 48 72 96 120 144 168

Zeit [h]


: nis von Theobromin und Metaboliten im Urin nach intravenöser Applikation von 4 mg Theobromin pro kg Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen von LOQ (es wurde kein Theophyllin, kein Paraxanthin und kein Coffein nachgewiesen)

Abb.42 Prozentuales Verhält

107

0

00

00

00

00

00

00

00

00

00

100

200

300

400

500

600

700

800

900

100000

0 20 40 60 0 0 140 180

St en nach Appli on

Kon

zent

ratio

n [n

g/m

l]

160

Pferd 1 P ferd 2 P ferd 3 P ferd 4 P ferd 5 P ferd 6

8

und1 0

kati120

000

00000000

den

10002000

300040005000600070008000900000001

0 10 5 20

Abb. 43: Urinkonzentr bromin nach einmaliger intravenöser pli o on 4 mg Theobromin gewicht, Aus ni er ße g gt die ersten 28 Stun nac pp ati

108

ERG

EBN

ISSE

25 30

pro kg Körper

5 1

Apon

kati n vh A lik

ationsverläufe von Theorunsch ttsv grö zei

ERGEBNISSE

4.3.4. Pharmakodynamische Effekte von Theophyllin und Theobromin

ikante Herzfrequenzsteigerung beobachtet

erden.

.3.4.2. Atemfrequenz

Keines der Pferde zeigte während der drei Versuchsabschnitte signifikante Veränderungen der

Atemfrequenz.

.4. Berechnung effektiver und irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen

OUTAIN un harmakodynamik-

odell, anhand dessen aus den ermittelten pharmakokinetischen Parametern effektive und

relevante Plasma- und Urinkonzentrationen berechnet werden können.

Die effektive Plasmakonzentration

4.3.4.1. Herzfrequenz

Direkt im Anschluss an die intravenöse Applikation von Theophyllin und Theobromin zeigten

sich bei einigen Pferden geringgradige Erhöhungen der Herzfrequenz. Nach oraler

Applikation von Theophyllin konnte keine signif

w

4

4

T d LASSOURD (2002) entwickelten ein Pharmakokinetik-/P

M

ir

(EPC) pro Dosierungsintervall wird unter

Be cht er u d v r u c h

folgender Gleichung berechnet:

rücksi igung d Dosier ng (D), er Bio erfügba keit (F) nd der Clearan e (CL) nac

EPC = Cleara

arkeitBioverfügbDosierung ⋅ g/m

die

leichung bei intravenöser Verabreichung wie folgt vereinfacht werden:

nce [µ l]

Da bei intravenöser Applikation die Bioverfügbarkeit gleich 1 zu setzen ist, kann

G

ClearanceDosierung [µg/ml] EPC =

109

ERGEBNISSE

Die irrelevante Plasmakonzentration (IPC) lässt sich aus der EPC unter Annahme eines

icherheitsfaktors (SF) wie folgt berechnen: S

IPC = SF

EPC [µg/ml]

er eingesetzte Sicherheitsfaktor soll individuelle Schwankungen ausgleichen und die

eisten. Er ergibt sich aus dem Faktor 50, der die Umrechnung der

tor 10, welcher die Variationen innerhalb der

icherheitsfaktor (SF) = 500.

ie irrelevante Urinkonzentration

D

Validität der Daten gewährl

EPC in die IPC darstellt und dem Fak

Tierpopulationen berücksichtigen soll. Somit beträt der S

D (IUC) wird nun anhand der IPC und der Rss (Ratio Steady

e folg

ss

State) wi t berechnet:

IUC = IPC · Rss [ng/ml]

Rss (Ratio Steady State) stellt das Urin-/ Plasmakonzentrationsverhältnis im Steady State dar

und errechnet sich wie folgt:

R = rationsmakonzentttlichePladurchschnitionnkonzentrattlicheUridurchschni

Die durchschnittliche Urinkonzentration errechnet sich durch Addition der

Urinkonzentrationen, die in dem Zeitraum angenommenen Dosierungsintervalls liegen

und anschließender Division durch die Anzahl der addierten Konzentrationen.

Die hnitt e ko ra D ch ch r ziehu er

maximalen Plasmakonzentration (Cma ), der Eliminationskonstanten (β) und des

Dosierungsintervalls (τ) nach KIETZMANN (1983) wie folgt:

des

durchsc lich Plasma nzent tion (C ) erre net si unte Einbe ng d

x

CD = τβ ⋅

mC [ng/ml] ax

110

ERGEBNISSE

4.4.1. Berechnung effektiver und irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen

von Theophyllin

mik-Modells von TOUTAIN und

ASSOURD (2002). Dabei fanden die in Kapitel 4.4. beschriebenen Formeln Anwendung.

ie Ergebnisse sind in Tab. 36 und 37 aufgeführt.


Die Berechnung der irrelevanten Plasma- und Urinkonzentrationen von Theophyllin erfolgte

mit Hilfe des Pharmakokinetik-/Pharmakodyna

L

D

meter w abwei g1 2 3 4 5 6 ert chun

EPC (12 h g/ml] 7303 6723.1 4087.9 4447.4 7418.9 6171.6 ) [n 6025.3 1437.1

IPC (12 h) [ng/ml] 14.6 13.4 8.2 8.9 14.8 12.3 12.0 2.9

IUC (12 h) [ng/ml] 15.9 39.9 16.3 19.9 10.6 15.3 19.6 10.4

Tab.36: Irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen von Theophyllin nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) in einem Dosisintervall von 12 Stunden



EPC (24 h) [ng/ml] 3651.7 3361.5 2043.9 2223.7 3709.4 3085.8 3012.7 718.6

IPC (24 h) [ng/ml] 7.3 6.7 4.1 4.5 7.4 6.2 6.0 1.4

IUC (24 h) [ng/ml] 14.6 35.7 13.4 18.9 105.1 13.7 33.6 36.1

Tab.37: Irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen von Theophyllin nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) in einem Dosisintervall von 24 Stunden

111

ERGEBNISSE

4.4.2. Berechnung effektiver und irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen

von Theobromin

Par Einheit Pferd Pferd Pferd Pf Pferd Pferd Mittel Standard-

Die Berechnung der irrelevanten Plasma- und Urinkonzentrationen von Theobromin erfolgte

mit Hilfe des Pharmakokinetik-/Pharmakodynamik-Modells von TOUTAIN und

LASSOURD (2002). Dabei fanden die in Kapitel 4.4. beschriebenen Formeln Anwendung.

Die Ergebnisse sind in Tab. 38 und 39 aufgeführt.

a- erd -


EPC (1 [ng/ml 2222 8568 274 1010 6942 5283 h) ] .7 .4 7 .0 4.8 .5 7 .6 7106 653.9 2 .7

IPC [ng/m 4. 1 1 2 1 1 (13 h) l] 4 7.1 4.5 0.2 3.9 5.1 1 54.2 .3

IU g/m 29 3 4 6 1 4C (13 h) [n l] .9 3.7 4.3 5.0 6.8 9.5 3 169.9 .8

ab.38: Irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen von Theobromin nach TOUTAIN


T und LASSOURD (2002) in einem Dosisintervall von 13 Stunden


EPC (24 h) [ng/ml] 1204.0 4641.2 3940.1 5473.5 3760.5 4078.0 3849.5 1437.4

IPC (24 h) [ng/ml] 2.4 9.3 7.9 10.9 7.5 8.2 7.7 2.9

IUC (24 h) [ng/ml] 27.3 30.0 41.1 57.0 15.9 44.1 35.9 14.5

Tab.39: Irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen von Theobromin nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) in einem Dosisintervall von 24 Stunden

112

ERGEBNISSE

4.5. Ausscheidungszeiten

ie Ausscheidungszeiten aus dem Plasma wurden anhand der folgenden Funktion berechnet

D

(KIETZMANN, 1983):

tA = β

GrenzeCC lnln max − [h]

tA = Ausscheidungszeit Cmax = maximale Konzentration im Plasma CGrenze = Konzentrationsgrenze (IPC, LOQ oder LOD) β = Eliminationskonstante 4.5.1. Ausscheidungszeiten von Theophyllin nach intravenöser Applikation

Die Berechnung der Ausscheidungszeiten von

Theophyllin aus dem Plasma wurden bis zum

rreichen der Nachweisgrenze (LOD), und der Quantifizierungsgrenze (LOQ) sowie bis zum

rreichen der irrelevanten Plasmakonzentration (IPC) unter Berücksichtigung der

osierungsintervalle von 12 und 24 Stunden durchgeführt. Grundlage der Berechnungen sind

aufgefü

E

E

D

die in Tabelle 32 aufgeführten Daten. In der folgenden Tab. 40 sind die Ergebnisse

hrt.



tA LOQ [h] 112.0 70.0 72.7 78.1 119.3 77.3 88.2 21.6

tA LOD [h] 163.0 104.0 101.8 118.9 170.3 111.3 128.2 30.4

tA IPC (12h) [h] 160.1 103.5 108.4 126.5 167.0 112.2 129.6 27.5

tA IPC (24h) [h] 177.4 115.1 118.3 140.1 184.4 123.7 143.2 30.6

Tab.40: Ausscheidungszeiten von Theophyllin aus dem Plasma nach intravenöser Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht bis zum Erreichen von LOQ, LOD bzw. der IPC (nach einem Dosierungsintervall von 12 bzw. 24 Stunden)

113

ERGEBNISSE

4.5.2. Ausscheidungszeiten von Theophyllin nach oraler Applikation

Die Berechnungen der Ausscheidungszeiten von Theophyllin nach oraler Applikation wurden

nach der oben angegebenen Formel bis zum Erreichen der Nachweis- und der

Quantifizierungsgrenze durchgeführt, und sind in Tab. 41 aufgeführt. Die benötigten

pharmakologischen Daten sind Tab. 35 entnommen.



tA LOQ [h] 81.3 71.1 83.6 72.5 114.6 96.2 86.5 16.4

tA LOD [h] 132.3 111.9 134.6 113.3 182.6 164.2 139.8 28.3

Tab.41: Ausscheidungszeiten von Theophyllin aus dem Plasma nach oraler Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht bis zum Erreichen von LOQ und der LOD

114

ERGEBNISSE

4.5.3. Ausscheidungszeiten von Theobromin nach intravenöser Applikation

Die Berechnung der Ausscheidungszeiten von Theobromin aus dem Plasma wurden wie beim

Theophyllin bis zum Erreichen der Nachweisgrenze (LOD) und der Quantifizierungsgrenze

(LOQ), sowie bis zum Erreichen der irrelevanten Plasmakonzentration (IPC) unter

Berücksichtigung der Dosierungsintervalle von 13 und 24 Stunden durchgeführt. Anhand der

in Tabelle 35 aufgeführten pharmakokinetischen Parameter konnten diese Werte berechnet

werden. In der folgenden Tab. 42 sind die Ergebnisse aufgeführt.



tA LOQ [h] 26.6 210.1 198.1 201.6 131.1 138.6 151.0 69.7

tA LOD [h] 36.1 305.0 292.9 296.4 178.5 201.9 218.5 104.1

tA IPC (13h) [h] 42.2 298.3 294.5 281.5 180.4 201.8 216.5 98.9

tA IPC (24h) [h] 45.3 329.0 325.1 312.2 195.8 222.2 238.3 110.1

Tab.42: Ausscheidungszeiten von Theobromin aus dem Plasma nach intravenöser Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht bis zum Erreichen von LOQ, LOD bzw. der IPC (nach einem Dosierungsintervall von 13 bzw. 24 Stunden)

115

DISKUSSION

5 DISKUSSION

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mittels pharmakologischer Studien an jeweils sechs

Pferden und anschließender quantitativer Untersuchungen der Plasma- und Urinproben

Aussagen über das Ausscheidungsverhalten der Methylxanthine Theophyllin und Theobromin

nach intravenöser und oraler Applikation machen zu können. Anhand der ermittelten Daten

sollte geprüft werden, ob konkrete Aussagen über Nachweisfristen und Ausscheidungszeiten

von Theophyllin und Theobromin im Plasma und im Urin von Pferden gemacht werden

können, und wie sich dies hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd auswirkt.

Dazu wurden nach Optimierung und Validierung der Analysemethode die Plasma- und

Urinproben quantitativ analysiert und die Ergebnisse anschließend pharmakokinetischen

Berechnungen unterzogen. Durch Einbringen der berechneten Daten in das PK/PD-Modell

von TOUTAIN und LASSOURD (2002) konnten die effektiven Plasmakonzentrationen

(EPC), die irrelevanten Plasmakonzentrationen (IPC) und daraus schließlich die irrelevanten

Urinkonzentrationen (IUC) berechnet werden.

5.1. Eignung der Aufarbeitungs- und Analysemethode (HPLC/MS/MS) zur

Quantifizierung von Theophyllin und Theobromin im Plasma und Urin

Die Grundlage der in dieser Arbeit angewendeten Analysemethode für Theophyllin und

Theobromin im Pferdeplasma und -urin bildete eine Routinemethode, die im Institut für

Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln im Rahmen der Dopinganalytik polarer

Substanzen angewendet wird.

Die im Vorversuch entnommenen Plasma- und Urinproben wurden mittels dieser Methode

untersucht. Dabei zeigte sich, das diese Methode weiter modifiziert werden musste, um die

gewünschte Empfindlichkeit zu erreichen.

ls interne Standards wurden ein am Stickstoffatom markiertes Theophyllin (1,3-15N2-A

Theophyllin) sowie deuteriertes Theobromin (D6-Theobromin) und Coffein (D3-Coffein)

gewählt.

116

DISKUSSION

Als am besten geeignetes Lösungsmittel für die Standardlösungen erwies sich Milli-Q-

Wasser. Bei der Herstellung der internen Standardlösungen musste die D6-Theobromin-

m ca. 10% steigern. Diese Ergebnisse stimmen weitestgehend mit den Angaben von KELLY

ichtigkeit, Präzision, Ermittlung der

uantifizierungsgrenze (LOQ) und der Detektionsgrenze (LOD) sowie Wiederfindung und

Konzentration aufgrund der nur halb so großen Signalintensität von D6-Theobromin im

Gegensatz zu den restlichen internen Standards verdoppelt werden, um eine gut zu

integrierende Peakfläche zu erhalten. Beim sogenannten Tuning des HPLC- Gerätes zeigte

sich, dass der Ionenübergang 181.0/ 124.0 bei Theophyllin und Paraxanthin identisch ist und

somit diese Stoffe über die Differenzmethode anhand des nur bei Paraxanthin

nachgewiesenen Ionenüberganges 181.0/ 55.0 quantifiziert werden mussten.

Als geeignete Säule für die Plasma- und Urinaufarbeitung erwies sich die Oasis® HBL 3cc

(60mg) Extraction Cartridges der Firma Waters. Das im Konzentrationsbereich bis 10000

ng/ml verwendete Volumen von 2,5 ml Urin bzw. Plasma führte zu einer guten Ausbildung

und Integration des Messsignals. Um einer Sättigung der analytischen Säule und des

Detektors vorzubeugen, wurde das Probenvolumen bei Konzentrationen über 10000 ng/ml auf

1 ml reduziert. Um die bei der Urinaufarbeitung zunächst beobachteten und durch

Matrixbestandteile verursachten Störpeaks zu verhindern, wurden die Urinproben vor

Aufbringen auf die Säule zentrifugiert. Die in die Plasmaaufarbeitung eingefügte

Proteindenaturierung führte bei Theophyllin und Theobromin zu einer nahezu doppelt so

hohen Substanzausbeute. Bei Coffein ließ sich die Ausbeute durch die Proteolyse lediglich

u

und LAMBERT (1978), GREEN et al. (1983), INGVAST-LARSSON et al. (1992) und

CHOU et al. (2001) überein, die für Theophyllin eine Proteinbindung von rund 20% bei

Pferden angeben. INGVAST-LARSSON et al. ermittelten allerdings 1989 in einer anderen

Studie eine Plasmaproteinbindung von lediglich 12% für oral verabreichtes Theophyllin. Für

Coffein wird eine Proteinbindung von 2 bzw. 12% angeben. Die von KELLY und

LAMBERT (1978) für Theobromin veröffentliche Proteinbindung von lediglich 3% im

Pferdeplasma deckt sich mit den anhand dieser Studie ermitteln Daten nicht.

Sowohl die Methode zur Aufarbeitung von Plasma als auch die Methode zur Aufarbeitung

von Urin wurden einer Validierung nach den Vorgaben der EHSLC (2002) unterzogen, um

die Eignung der in dieser Studie entwickelten Analysemethode zu beweisen. Die Validierung

umfasste die Parameter Selektivität, Linearität, R

Q

Stabilität.

117

DISKUSSION

Die zur Überprüfung der Selektivität untersuchten Chromatogramme zeigten, dass im Bereich

der Retentionszeiten der Analyten sowie der internen Standards keine Störpeaks erschienen.

Die Substanzen konnten somit ohne Verfälschung von fremden Matrixstoffen dargestellt

werden. Die Kriterien für die Linearität, Richtigkeit und Präzision wurden im Plasma bei

Theophyllin, Theobromin und Coffein anhand von drei Kalibrationskurven über den Bereich

ischen 29 ng/ml und 1.000 ng/ml im Plasma und 32 ng/ml

und 30.000 ng/ml belegt worden.

war im Rahmen der Validierungskriterien ebenfalls sowohl im

rin als auch im Plasma gegeben.

von 20 ng/ml bis 50.000 ng/ml untersucht und erfüllt. Für Paraxanthin war dies nur im

Bereich von 20 ng/ml bis 1.000 ng/ml nötig und konnte ebenfalls bestätigt werden. Im Urin

konnte die geforderte Linearität, Richtigkeit und Präzision bei Theophyllin über drei

Kalibrationskurven im Bereich von 25 ng/ml bis 30.000 ng/ml belegt werden und bei

Paraxanthin und Coffein im relevanten Konzentrationsbereich von 25 ng/ml bis 1.000 ng/ml

ebenfalls. Bei Theobromin wurden über Anwendung eines quadratischen Regressionsmodells

die Kriterien erfüllt.

Die Ergebnisse belegen somit, dass die Methoden geeignet sind, Theophyllin im

Konzentrationsbereich von 13 ng/ml bis 50.000 ng/ml im Plasma und von 20 ng/ml bis

30.000 ng/ml im Urin nachzuweisen. Dies gilt für Theobromin im Plasma von 15 ng/ml bis

50.000 ng/ml und im Urin von 26 ng/ml bis ebenfalls 30.000 ng/ml. Für die Metaboliten

Paraxanthin ist dies im Bereich zw

und 30.000 ng/ml im Urin und bei Coffein im Bereich von 14 ng/ml bis 50.000 ng/ml und im

Urin zwischen 33 ng/ml

Die im Plasma für Theophyllin und ihre Metaboliten ermittelten Quantifizierungsgrenzen

liegen mit 100 ng/ml höher als die im Urin für diese Substanzen berechneten

Bestimmungsgrenzen von 50 ng/ml. Für Theobromin gilt die Quantifizierungsgrenze von 100

ng/ml sowohl im Plasma als auch im Urin. Die Ursache hierfür liegt neben den

Matrixunterschieden in den Validierungskriterien der Leitlinien der EHSLC (2002)

begründet, nach denen die Validierungskriterien bei jeder Substanz einzeln erfüllt sein

müssen.

Die Stabilität der Analyten

U

5.2. Ausscheidungsverhalten von Theophyllin und Theobromin

Die im Plasma ermittelten Maximalkonzentrationen von Theophyllin nach intravenöser

Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht lagen mit 5.165 - 8.834 ng/ml (Mittelwert ±

118

DISKUSSION

Standardabweichung = 7.167 ng/ml ± 1.348 ng/ml) deutlich höher als die nach oraler

Applikation gleicher Menge. Diese Maximalkonzentrationen lagen zwischen 1.791-3.483

ng/ml (Mittelwert ± Standardabweichung = 2.805 ng/ml ± 648 ng/ml). Nach intravenöser

Verabreichung von 4 mg/kg Körpergewicht Theobromin konnten maximale

Plasmakonzentrationen von 5.715 ng/ml – 12.402 ng/ml (Mittelwert ± Standardabweichung =

8.379 ng/ml ± 2.717 ng/ml) ermittelt werden. Die Maximalwerte wiesen in den drei

Versuchsreihen große Schwankungen zwischen den einzelnen Probanden auf. Zu ähnlichen

Ergebnissen kamen LÖFFLER et al. (2000a), welche nach intravenöser Gabe von 5 mg/kg

Theophyllin an Hunde durchschnittliche Konzentrationen von 8.882 ng/ml und nach oraler

Verabreichung von 10 mg/kg gemittelte Konzentrationen von 7.657 ng/ml im Plasma

nachwiesen. MC KIERNAN et al. (1981) ermittelten im Anschluss an intravenöse

Applikation von 9,4 mg/kg Körpergewicht Theophyllin an Hunde etwas geringere

aximalkonzentrationen von 13.800 ng/ml und nach oraler Verabreichung der gleichen

n konnte bei zwei Pferden bereits nach 60 Stunden kein

M

Dosierung von 3.600 ng/ml im Plasma. Im Gegensatz dazu lagen bei der Studie von TSE und

SZETO (1982) die Plasmakonzentrationen nach intravenöser und oraler Verabreichung im

Verhältnis zur verabreichten Dosierung im gleichen Konzentrationsbereich. Nach

intravenöser Applikation von Theobromin an Hunde in einer Dosierung von 5 mg/kg

Körpergewicht ermittelte LOEFFLER (2000) deutlich höhere

Theobrominplasmakonzentrationen von etwa 42 µg/ml ± 11 µg/ml.

Nach intravenöser Applikation von Theophyllin konnten bei allen Pferden die maximalen

Plasmakonzentrationen innerhalb der ersten 5 Minuten gemessen werden. Die Zeit bis zum

Erreichen der maximalen Konzentration im Plasma nach oraler Applikation betrug im Mittel

5,18 Stunden ± 56%. Bei LOEFFLER et al. (2000a) wurde die maximale

Plasmakonzentration nach oraler Gabe im Mittel nach 4,8 Stunden erreicht. Alle Pferde

wiesen bei der letzten Blutprobenentnahme 60 Stunden nach der intravenösen Verabreichung

noch Plasmakonzentrationen oberhalb der Quantifizierungsgrenze (LOQ) von 100 ng/ml auf.

Im Anschluss an die orale Applikatio

Theophyllin mehr im Plasma quantifiziert werden. Bei den anderen vier Pferden war dies

nach 72 bzw. 96 Stunden der Fall.

Die in dieser Studie ermittelte orale Bioverfügbarkeit für Theophyllin von 85% deckt sich

weitestgehend mit den Angaben in der Literatur. LOEFFLER et al. (2000b) ermittelten für

Theophyllin bei Hunden eine orale Bioverfügbarkeit von 73%, LÖSCHER (2006) gibt diese

119

DISKUSSION

mit 80-90% an, TSE und SZETO (1981) mit > 90% und MC KIERNAN et al. (1981) mit

91%.

Die Resorptionsrate und Resorptionsgeschwindigkeit nach oraler Applikation hängen neben

der oralen Bioverfügbarkeit vor allem von der Konkurrenzsituation im Gastrointestinaltrakt

ab. Gleichzeitige Nahrungsaufnahme wirkt sich auf die Resorptionsgeschwindigkeit meist

hemmend aus. Auch das Flüssigkeitsvolumen, mit dem ein Stoff peroral zugeführt wird, die

Wasserlöslichkeit, welche Voraussetzung für den Transport mit dem Magen-Darm-Inhalt ist

und die Partikelgröße wirken sich auf die Resorption aus. Lipophile Pharmaka werden nach

fettreicher Nahrung schlechter resorbiert, da sie sich im Fett anreichern. Stark lipophile und

somit wenig wasserlösliche Stoffe wiederum können durch fettreiche Nahrung besser

resorbiert werden, da der Stoff durch die Verteilung im Fett und dessen Emulgierung durch

rt werden. Über das

die Galle eine größere Oberfläche erhält (FORTH et al., 1996). Des weiteren kann eine

reduzierte orale Bioverfügbarkeit durch einen ausgeprägten first-pass-Effekt bedingt sein.

Bereits bei der Mukosapassage kann ein Stoff enzymatisch verände

Pfortadersystem gelangt ein aus dem Gastrointestinaltrakt resorbierter Stoff zunächst in die

Leber. Dort kann dieser bereits vor Gelangen in den großen Kreislauf metabolisiert und

ausgeschieden werden (FORTH et al., 1996). Genauere Angaben über das Vorhandensein

eines first-pass-Effektes bei Theophyllin konnten anhand der Literatur nicht ermittelt werden.

Auffällig war, dass es bei allen Pferden nach intravenöser Applikation von Theophyllin und

Theobromin während des Konzentrationsabfalls im Plasma immer wieder zu geringgradigen

Anstiegen der Konzentration kam. Dies lässt einen enterohepatischen Kreislauf, also die

erneute Resorption eines über die Gallenflüssigkeit in den Darm gelangten Stoffes, vermuten.

Dieser wurde aber lediglich für Coffein beschrieben (ARNOUD, 1993). Laut FORTH et al.

(1996) werden Stoffe mit einer Molekülmasse unter 300 allerdings bevorzugt mit dem Harn

ausgeschieden. Eine andere Erklärung wäre ein „Recyclingprozess“ von Theophyllin und

Theobromin. Wird bereits über den Urin oder den Kot ausgeschiedenes Theophyllin als

Futtermittelverunreinigung wieder aufgenommen, wird es recycelt. Da die Pferde dieser

Studie neben dem uneingeschränkten Zugang zu Heu, Stroh und Gras auch unkontrolliert

Harn und Kot absetzen konnten, erscheint ein Recyclingprozess als Erklärung der

wiederholten Plasmakonzentrationsanstiege plausibel.

Sowohl nach intravenöser als auch nach oraler Verabreichung von Theophyllin war nach

kurzer Zeit der Metabolit Paraxanthin im Plasma nachweisbar. Die maximalen

120

DISKUSSION

Konzentrationen nach intravenöser Applikation lagen im Mittel bei 580 ng/ml (± 39%) und

wurden nach zwei Minuten bis zwei Stunden erreicht. Nach oraler Gabe wurden die höchsten

Plasmakonzentrationen von gemittelt 230 ng/ml (± 31%) in der Zeit von 40 Minuten bis 12

Stunden erreicht. LOEFFLER (2000) konnte weder nach intravenöser noch nach oraler

erabreichung von Theophyllin an Hunde Paraxanthin im Plasma nachweisen.

von Theophyllin konnten TANG-LIU und RIEGELMAN (1981) aber auch lediglich

al. (2000a) wiesen nach

travenöser Theobrominapplikation und KAISER (2006) nach oraler

Parameter, die für intravenös appliziertes Theophyllin und

Theobromin anhand eines Zwei-Kompartiment-Modells und für oral verabreichtes

Theophyllin anhand eines Ein-Kompartiment-Modells berechnet wurden, entsprechen

weitestgehend den Angaben in der Literatur. Die ermittelte Eliminationshalbwertzeit nach

intravenöser Applikation von Theophyllin beträgt im Mittel 13,6 Stunden (± 21%) und nach

oraler Applikation 18,1 Stunden (± 23%). Dies entspricht in etwa den Angaben von

V

Coffein konnte in der vorliegenden Studie nach beiden Applikationsarten von Theophyllin

lediglich in Spuren nachgewiesen werden. Die Konzentrationen lagen nach intravenöser Gabe

bis auf wenige Ausnahmen unter der Quantifizierungsgrenze von 100 ng/ml und nach oraler

Applikation im Bereich der Nachweisgrenze von 14 ng/ml im Plasma. Dies deckt sich mit den

Angaben in der Literatur. TANG-LIU und RIEGELMAN (1981) wiesen in ihrer Studie einen

Metabolismus von Theophyllin zu Coffein beim Menschen nach. Nach ihren Untersuchungen

werden rund 6% des mehrfach oral verabreichten Theophyllins zu Coffein metabolisiert,

bevor dieses vor der renalen Ausscheidung weiter verstoffwechselt wird. Nach einmaliger

Gabe

Spuren von Coffein nachweisen. Laut LOEFFLER (2000) ist nach Theophyllinapplikation bei

Hunden im Plasma Coffein nicht nachweisbar. MC KIERNAN et al. (1981) untersuchten in

ihrer Studie die Metaboliten nicht.

Theobromin konnte weder nach intravenöser noch nach oraler Applikation von Theophyllin

nachgewiesen werden.

Nach intravenöser Verabreichung von Theobromin waren im Plasma lediglich sehr geringe

Spuren von Coffein und Theophyllin erkennbar, die im Bereich der Nachweisgrenzen von 14

ng/ml für Coffein und 13ng/ml für Theophyllin lagen. Paraxanthin konnte nach intravenöser

Theobrominapplikation nicht nachgewiesen werden. LOEFFLER et

in

Theobrominverabreichung ebenfalls lediglich Theobromin im Plasma nach. Demzufolge

scheint keine quantifizierbare Metabolisierung des Theobromins zu Paraxanthin, Theophyllin

oder Coffein stattzufinden.

Die pharmakokinetischen

121

DISKUSSION

LÖSCHER (2006), der diese als tierartlich sehr unterschiedlich und für Pferde mit 10-17

Stunden angibt. LOEFFLER et al. (2000b) ermittelten in ihrer Studie eine

Eliminationshalbwertzeit von 5 Stunden nach intravenöser und von 3 Stunden nach oraler

Verabreichung. Diese Werte sind mit den hier ermittelten schlecht vergleichbar, da es sich bei

den Probanden bei LOEFFLER et al. (2000b) um Hunde und in dieser Studie um Pferde

handelt. Die Clearance nach intravenöser Applikation von Theophyllin beträgt im Mittel 58,4

ml/h/kg (± 27%), nach oraler Verabreichung 70,5 ml/h/kg (± 31%) und nach intravenöser

Applikation von Theobromin 55,4 ml/h/kg (± 74%). KAISER (2006) ermittelte für oral

verabreichtes Theobromin bei Pferden eine durchschnittliche Clearance von 67,2 ml/h/kg (±

29%). Das in dieser Studie ermittelte Verteilungsvolumen von Theophyllin beträgt 1,1 l/kg.

MC KIERNAN et al. (1981) geben dies mit 0,67 l/kg an, GREENBLATT und SHADER

(1985) mit 0,4 l/kg.

ie Theophyllinkonzentration im Plasma beträgt nach intravenöser Applikation in dieser

er

or ng/ml (± 146%) und

ach 108 Stunden noch 27.6 ng/ml (± 86%) im Plasma nachweisbar. Leitet man aus den

lasma die LOQ

nterschritten wird. Diese gemessenen Werte liegen bei Theophyllin nur undeutlich unter der

nach KIETZMANN (1983) für Theophyllin berechneten Ausscheidungszeiten bis zur LOQ

ikation. Die für

Theobromin n unden nur

eringgradig unter den gemessenen.

Urin konnten nach intravenöser Applikation Maximalkonzentrationen von 21.636 ng/ml

is 93.373 ng/ml und nach oraler Verabreichung Maximalkonzentrationen von 18.287 ng/ml

bis 41.256 ng/ml nachgewiesen werden. Theobromin ließ sich im Urin in

Maximalkonzentrationen von 65.771 ng/ml bis 94.889 ng/ml nachweisen. Diese im

Verhältnis zu den Plasmakonzentrationen sehr viel höheren Urinkonzentrationen belegen die

Anreichung des Theophyllins im Urin. Bei dem physiologischen Plasma-pH-Wert von 7,36

bis 7,44 liegt Theophyllin zu 96% und Theobromin zu 99,7% in der ionisierten Form vor.

D

Studie bei d letzten Blutprobenentnahme nach 60 Stunden im Mittel noch 373,5 ng/ml (±

aler Applikation sind nach 96 Stunden im Mittel noch 8565%). Nach

n

Verlaufskurven der Plasmakonzentrationen die Zeit ab, bei der die Quantifizierungsgrenze

von 100 ng/ml unterschritten wird, ergibt sich, dass nach intravenöser Theophyllingabe im

Mittel nach 71,5 ± 19 Stunden und nach oraler Verabreichung im Mittel nach 79,8 ± 20

Stunden im Plasma die LOQ unterschritten wird. Für Theobromin nach intravenöser Gabe

lässt sich ableiten, dass nach durchschnittlich 156 ± 18 Stunden im P

u

von 88 ± 22 Stunden nach intravenöser und 86 ± 17 Stunden nach oraler Appl

Stach KIETZMANN (1983) berechneten Werte liegen mit 151 ± 70

g

Im

b

122

DISKUSSION

Diese wird stark glomerulär filtriert. Im alkalischen Milieu des Pferdeurins mit einem pH-

Wert von 7,6-9,0 (SAMS, 1992; KRAFT und DÜRR, 1991) bzw. von 6,8-8,4 laut SCHÄFER

(1999) sinkt die Ionisationsrate auf bis zu 85% bei Theophyllin und auf 99,0% beim

Theobromin. Lediglich die 15% bzw. die 1% des glomerulär filtrierten Theophyllins bzw.

Theobromins, welche jetzt in nicht-ionisierter Form vorliegen, können tubulär rückresorbiert

werden. LOEFFLER (2000) ermittelte nach intravenöser und oraler Verabreichung von

Theophyllin an Hunde im Verhältnis zu dieser Studie doppelt so hohe Urinkonzentrationen

und eine erheblich geringere Zeitspanne, in welcher Theophyllin in Urin nachweisbar ist. Dies

lässt sich auch durch den sauren Urin des Hundes erklären. Im pH-Wert-Bereich zwischen

5,5-7,0 liegt Theophyllin zu 99% in der ionisierten Form vor, so dass eine tubuläre

Rückresorption nahezu ausgeschlossen werden kann.

Die starken interindividuellen Schwankungen der Urinkonzentrationen von ± 67% nach

intravenöser T

rheblichen E ussrate. Eine

rhöhte Urinflussrate führt zu einer geringeren tubulären Rückresorption und einer

esteigerten Clearance (GRAMATTE, 2002). Die renale Clearance unterliegt außerdem

edliche Flüssigkeitsaufnahme begründet sein. Da es sich bei diesem Versuch um

intravenöser und ± 34% nach oraler Theophyllinverabreichung und von ± 16% nach

heobromingabe resultieren aus verschiedenen Ursachen.

E influss auf die Konzentration eines Stoffes im Urin hat die Urinfl

e

g

Beeinflussungen durch Veränderungen des Urin-pH, welcher wiederum durch Faktoren wie

Ernährung und körperliche Belastung verändert werden kann. Laut TOBIN (1986) kann der

Urin-pH aufgrund von körperlicher Anstrengung auf Werte von unter 5 sinken. Auch

aufgrund von Hungerzuständen kann der Urin-pH absinken (SCHÄFER, 1999).

Vergleichende Untersuchungen des Urin-pH-Wertes in Abhängigkeit von der Fütterung von

WOOD et al. (1990) zeigten, dass dieser bei Weidepferden durchschnittlich um 0,5 höher

liegt als bei Stallpferden. Da Theophyllin und Theobromin nur im geringen Maße tubulär

rückresorbiert werden, führt eine gesteigerte Urinflussrate zu einer verminderten

Urinkonzentration dieser Stoffe (SAMS, 1992; DELBEKE und DEBACKERE, 1991). Eine

unterschiedlich ausgeprägte Harnproduktion kann außerdem durch Stress oder

unterschi

eine „dirty“-Studie handelt, können weder unterschiedliche körperliche Belastung,

individueller Stress noch unterschiedliche Flüssigkeitsaufnahme der Pferde ausgeschlossen

werden, und werden somit zum Teil eine Ursache der interindividuellen Schwankungen der

Ergebnisse sein. Laut DYKE und SAMS (1994) hätte der gesamte Urin der Probanden über

die Versuchsdauer gesammelt werden müssen, um über die Harnproduktion eine genauere

Aussage über die Substanzmenge im Urin und somit genaue Angaben zur Ausscheidungsrate

123

DISKUSSION

der Substanzen machen zu können. Auch Nierenerkrankungen der Probanden könnten die

Nierenfunktionen und somit die Harnproduktion beeinträchtigen. Da die Kreatininwerte der

Pferde untersucht wurden und sich im Normbereich befanden, erscheint diese Ursache

allerdings sehr unwahrscheinlich.

Sowohl nach der intravenösen als auch nach der oralen Verabreichung von Theophyllin war

der Metabolit Paraxanthin im Urin nachweisbar. Die maximalen Konzentrationen nach

intravenöser Applikation lagen im Mittel bei 1.375 ng/ml (±60%) und wurden nach drei bis

zwölf Stunden erreicht. Nach oraler Gabe wurden die höchsten Urinkonzentrationen von

gemittelt 1.388 ng/ml (±27%) in der Zeit von drei bis elf Stunden erreicht. Coffein war in

Spuren erkennbar, die Werte überschritten aber nicht die Bestimmungsgrenze von 50 ng pro

ml Urin, und Theobromin wurde nicht nachgewiesen. LOEFFLER (2000) wies weder nach

travenöser noch nach oraler Verabreichung von Theophyllin an Hunde Paraxanthin im Urin

unter identischen Bedingungen das Ausscheidungsverhalten von

in

nach.

Nach intravenöser Applikation von Theobromin konnten weder Theophyllin, Coffein noch

Paraxanthin sondern ausschließlich Theobromin im Urin detektiert werden. KAISER (2006)

wies ebenfalls nur Theobromin nach oraler Applikation von Theobromin an Pferde im Urin

nach. Vergleicht man nach Verabreichung verschiedener Methylxanthine die prozentualen

Verhältnisse der im Urin nachweisbaren Substanzen, so lässt sich am Metabolitenmuster

eindeutig auf die verabreichte Muttersubstanz schließen. Da sich die Metaboliten der

einzelnen Stoffe im Urin nach intravenöser und oraler Verabreichung nur unwesentlich

unterscheiden, sind in den folgenden Abbildungen zur Veranschaulichung lediglich die

prozentualen Verhältnisse nach intravenöser Applikation dargestellt.

KAISER (2006) untersuchte

Coffein nach intravenöser und oraler sowie von Theobromin nach oraler Verabreichung. Sie

ermittelte das in Abb. 44 dargestellte Metabolitenmuster, welches deutlich zeigt, dass nach

Coffeinapplikation neben dem Coffein auch Paraxanthin, Theophyllin und Theobromin im

Urin nachzuweisen sind.

124

DISKUSSION

0%

20%

90%

100%

40%

50%

60%

70%

80%

30%

10%

0 1 3 6 9 13 24 28 36 48 72 96

Zeit [h]


sen werden.

Abb. 44: Prozentuales Verhältnis von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im Urin nach intravenöser Applikation von 4 mg Coffein pro kg Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen der LOQ dargestellt (nach KAISER, 2006)

In Abbildung 45 ist das prozentuale Metabolitenmuster im Urin nach Applikation von

Theophyllin dargestellt. Es können neben dem hauptsächlich detektierten Theophyllin

lediglich bis zu 5% Paraxanthin und weder Coffein noch Theobromin nachgewie

Abbildung 46 zeigt das prozentuale Metabolitenmuster im Urin nach Applikation von

Theobromin. Hier wird ausschließlich Theobromin im Urin nachgewiesen.

125

DISKUSSION

100%

20%

30%

60%

90%

70%

80%

40%

50%

0%

10%

0 1 3 6 9 12 15 24 28 32 36 48 54 60

Zeit [h]


Abb. 45: Prozentuales Verhältnis von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im Urin nach intravenöser Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen der LOQ dargestellt

70%80%90%

100%

60%

0%10%20%30%40%50%

1 3 6 9 13 24 28 36 48 72 96 120 144 168Zeit [h]


Abb. 45: Prozentuales Verhältnis von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im Urin nach intravenöser Applikation von 4 mg Theobromin pro kg Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen der LOQ dargestellt

126

DISKUSSION

Die nach dem Pharmakokinetik-/Pharmakodynamik-Modell von TOUTAIN und LASSOURD

(2002) berechneten irrelevanten Plasmakonzentrationen von Theophyllin in einem

Dosisintervall von 12 Stunden betrugen 12 ng/ml (± 24%) und in einem Dosisintervall von 24

Stunden 6 ng/ml (± 24%). Die irrelevanten Urinkonzentrationen von Theophyllin in einem

Dosisintervall von 12 Stunden lagen bei 20 ng/ml (± 53%) und in einem Dosisintervall von 24

Stunden bei 34 ng/ml (± 107%). Anhand dieser Werte zeigt sich, dass sowohl die irrelevante

42%) und in

inem Dosisintervall von 24 Stunden bei 36 ng/ml (± 40%). Da für die LOQ von Theobromin

ppm im Pferdefutter. Da bei Nachweis von Theobromin aufgrund des

derartiger Untersuchungen keine sicheren Informationen

ur Streuung der Gesamtpopulation gewinnen lassen und somit eine allgemeingültige

Aussage nicht möglich ist. Nimmt man jedoch an, dass die ermittelte Streuung der Ergebnisse

Plasmakonzentration als auch die irrelevante Urinkonzentration von Theophyllin im Bereich

der in dieser Studie ermittelten Nachweisgrenzen dieses Stoffes im Plasma bzw. im Urin

liegen. Wird also mit der hier beschriebenen Methode Theophyllin im Plasma oder Urin

nachgewiesen, kann eine pharmakologische Wirkung von Theophyllin nicht ausgeschlossen

werden.

Das gleiche gilt für Theobromin. Für Theobromin wurden irrelevante Plasmakonzentrationen

in einem Dosisintervall von 12 Stunden von 14 ng/ml (± 37%) und in einem Dosisintervall

von 24 Stunden von 8 ng/ml (± 37%) errechnet. Die irrelevanten Urinkonzentrationen von

Theobromin in einem Dosisintervall von 12 Stunden lagen bei 40 ng/ml (±

e

im Plasma 15 ng/ml und im Urin 26 ng/ml ermittelt wurde, kann auch bei einem

Theobrominnachweis im Plasma oder Urin anhand dieser Untersuchungsmethode eine

pharmakologische Wirkung nicht ausgeschlossen werden. Dem entgegen steht der

international geltende Grenzwert von 2000 ng Theobromin pro ml Urin. Da es weder in der

Human- noch in der Veterinärmedizin zugelassene Theobrominpräparate gibt, sind die

Hauptursachen von Theobrominnachweisen bei Pferden Futtermittelkontaminationen. Diese

sind laut HAYWOOD et al. (1990) und HARKINS et al. (1998) aus produktionstechnischen

Gründen nicht generell zu vermeiden. Nach der Anlage 1 der Futtermittelverordnung vom

7.03.2005, zuletzt geändert am 02.11.2006, ist die Verwendung von Kakaoschalen im

Rahmen der Tierernährung statthaft und es gilt nach Anlage 5 eine Höchstmengenbegrenzung

von 300

Metabolitenmusters im Urin sicher zwischen Theobromin und Coffein als verabreichte

Muttersubstanz unterschieden werden kann, ist diese Grenzwertregelung sinnvoll.

Betrachtet man die Streuung der Ausscheidungszeitenergebnisse bei nur jeweils sechs

Pferden, wird klar, dass sich anhand

z

127

DISKUSSION

dieser Studie den Durchschnitt der Gesamtpopulation widerspiegelt, könnte anhand zu

rrechnender Konfidenzintervalle eine Abschätzung der Ausscheidungszeit erfolgen

. Setzt man z.B. den für die Ausscheidungszeit von Theophyllin bis

um Erreichen der LOD ermittelten Wert von 128 Stunden gleich 100 Zeiteinheiten, so kann

unter 192 Stunden liegt. Eine

icherheit von 99,9% kann für eine Ausscheidungszeit von 180 Zahleneinheiten, also 230

Stunden, erwartet werden.

eine Sicherheit von 95% bzw. 99,9% bieten.

e

(KIETZMANN, 2006a)

z

anhand der Standardabweichung von 24 % errechnet werden, dass die Ausscheidungszeit bei

95% der Gesamtpopulation unter 150 Zahleneinheiten, also

S

Nach KIETZMANN (2006a) kann davon ausgegangen werden, dass die Annahme einer

Standardabweichung von 50% des Mittelwertes ein ausreichend hohes Maß an Sicherheit

bietet. Die auf dieser Basis abgeleitete Karenzzeit, die das Doppelte oder Dreifache der

errechneten Ausscheidungszeit beträgt, würde

50

100

150

200

250

300

ober

es K

onfid

enzi

nter

vall

99,9 % 99 %

95 %

Mittelwert = 100

00 10 20 30 40 50

Standardabweichung in der Stichprobe

Abb. 47: Konfidenzintervalle (nur oberer Grenzbereich angezeigt) für eine ermittelte

cherheit Ausscheidungszeiten bis zum

grenze von 384 Stunden für intravenös appliziertes Theophyllin und

Kenngröße (z.B. Ausscheidungszeit, angenommen mit einem Mittelwert von 100 Zeiteinheiten) in Abhängigkeit von der Streuung der Stichprobe (nach KIETZMANN, 2006a)

Somit ergeben sich für die Gesamtpopulation, bei maximal angenommener

Standardabweichung von 50%, mit 99,9%iger Si

Erreichen der Nachweis

von 654 Stunden für intravenös verabreichtes Theobromin.

128

DISKUSSION

5.3. Bewertung der Ergebnisse

Mit dieser Studie wurde eine geeignete Analysemethode für den Nachweis von Theophyllin,

heophyllin ist in der Veterinärmedizin nicht als Therapeutikum zugelassen ist, und somit ist

rechneten irrelevanten

zu ahnden.

Theobromin, Paraxanthin und Coffein im Blutplasma und Urin von Pferden entwickelt und

validiert. Diese kann in der Routinediagnostik zum einheitlichen Nachweis von

Methylxanthinen in der Dopinganalytik genutzt werden.

Durch die Ermittlung der irrelevanten Plasma- und Urinkonzentrationen von Theophyllin und

Theobromin nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) sollte geprüft werden, ob die

Festlegung eines Grenzwertes für Theophyllin im Plasma und/oder Urin möglich und sinnvoll

ist.

T

auch kein Handelspräparat für Pferde erhältlich. Ein Einsatz von Theophyllin wäre daher nur

auf der Basis einer Umwidmung im Rahmen eines Therapienotstandes möglich.

Die anhand des Modells von TOUTAIN und LASSOURD (2002) be

Plasma- und Urinkonzentrationen von Theophyllin lagen nach einem Dosierungsintervall von

12 Stunden unter der Nachweisgrenze und in einem Dosierungsintervall von 24 Stunden im

Bereich der Nachweisgrenze von 13 ng/ml im Plasma bzw. von 20 ng/ml im Urin. Somit ist

bei Nachweis von Theophyllin im Plasma oder im Urin eine pharmakologische Wirkung nicht

auszuschließen. Während für Theobromin international ein Grenzwert von 2000 ng/ml Urin

besteht, ist von der Einführung eines Grenzwertes für Theophyllin im Pferdeplasma oder

Pferdeurin abzuraten und jeglicher Nachweis von Theophyllin als dopingrelevant zu

interpretieren und

129

ZUSAMMENFASSUNG

6 ZUSAMMENFASSUNG

Sophie Koppe (2007):

nsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd

iel der vorliegenden Arbeit war, neben der Optimierung und Validierung einer geeigneten

rden, die Untersuchung

von Theophyllin und Theobromin.

en mit angeschlossenem Tandemmassenspektometer. Die

alidierung umfasste die Kriterien Selektivität, Linearität, Richtigkeit, Präzision, Stabilität

ng/ml für Theobromin. Die Detektionsgrenzen im Plasma

gen bei 13 ng/ml für Theophyllin, 15 ng/ml für Theobromin, 14 ng/ml für Coffein und 29

rmittelt.

alig 4

ravenös verabreicht und anschließend über einen

eitraum von 60 bis 108 Stunden Plasma- und Urinproben entnommen.

inprobenentnahmen von 60 Stunden fiel bei

einem Pferd die Urinkonzentration unter die Quantifizierungsgrenze von 50 ng Theophyllin

ze erkennbar, Theobromin

Untersuchungen zur Pharmakokinetik der Methylxanthine Theophyllin und

Theobromin hi

Z

Analysemethode zur Detektion und Quantifizierung von Theophyllin und Theobromin sowie

der Metaboliten Paraxanthin und Coffein im Plasma und Urin von Pfe

des pharmakokinetischen Verhaltens

Die Validierung und Messung der Plasma- und Urinproben erfolgte auf einem

Hochflüssigkeitschromatograph

V

und Wiederfindung. Die Quantifizierungsgrenzen für Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin

und Coffein betrugen im Plasma 100 ng/ml und im Urin 50 ng/ml für Theophyllin,

Paraxanthin und Coffein und 100

la

ng/ml für Paraxanthin. Im Urin wurden Nachweisgrenzen von 20 ng/ml für Theophyllin, 26

ng/ml für Theobromin, 33 ng/ml für Coffein und 32 ng/ml für Paraxanthin e

In drei Versuchsabschnitten wurden jeweils sechs Pferden einmalig 4 mg/kg Körpergewicht

Theophyllin intravenös, einmalig 4 mg/kg Körpergewicht Theophyllin oral bzw. einm

mg/kg Körpergewicht Theobromin int

Z

Nach intravenöser Applikation von Theophyllin lagen die Maximalkonzentrationen von

Theophyllin im Plasma in einem Bereich von 5.165 bis 8.834 ng/ml und im Urin bei 21.636

bis 93.373 ng/ml. Über den Zeitraum der Ur

k

pro ml Urin. Es wurde sowohl im Plasma als auch im Urin der Metabolit Paraxanthin

nachgewiesen, Coffein war in Spuren im Bereich der Nachweisgren

wurde nicht nachgewiesen.

130

ZUSAMMENFASSUNG

Nach oraler Verabreichung von Theophyllin konnten Maximalkonzentrationen von

in Höhe von 16.365

is 41.256 ng/ml gemessen werden. Lediglich bei einem Pferd sank die Urinkonzentration

renze

öser Applikation nur der Metabolit Paraxanthin

obromin lagen die Maximalkonzentrationen von

heobromin im Plasma bei Werten von 5.715 bis 12.402 ng/ml und im Urin bei 65.771 bis

on 8 Stu den fi bei keinem

. Es

auch im Urin weder Theophyllin, Paraxanthin noch Coffein in

uantifizierbarer Menge nachgewiesen. Somit kann anhand des nachweisbaren

n erden. Wird

rden

eophyllin appliziert worden.

hnungen

002)

echnungen wurden sogenannte irrelevante Plasma- und

rinkonzentrationen ermittelt, bei denen eine Wirkung von Theophyllin auf den Organismus

ante Plasmakonzentration in einem

. im Bereich der Nachweisgrenzen von Theophyllin in den

in im

ußerdem kann aufgrund der erheblichen interindividuellen Streuung und geringen Anzahl

Theophyllin

phyllin im Plasma oder im Urin sollte als dopingrelevant gelten

nd entsprechend geahndet werden.

Theophyllin im Plasma in Höhe von 1.791 bis 3.483 ng/ml und im Urin

b

innerhalb des Probenentnahmezeitraumes von 108 Stunden unter die Quantifizierungsg

von 50 ng/ml. Es wurde wie nach intraven

nachgewiesen.

Nach intravenöser Applikation von The

T

94.889 ng/ml. Über den Zeitraum der Urinprobenentnahmen v 16 n el

Pferd die Urinkonzentration unter die Nachweisgrenze von 26 ng Theobromin pro ml Urin

wurde sowohl im Plasma als

q

Metabolitenmusters eindeutig auf die verabreichte Muttersubstanz geschlosse w

lediglich Theobromin nachgewiesen, ist reines Theobromin verabreicht worden. We

Theophyllin und Paraxanthin nachgewiesen, ist Th

Die ermittelten Ergebnisse wurden anschließend pharmakokinetischen Berec

unterzogen und mit Hilfe des PK-/PD-Modells nach TOUTAIN und LASSOURD (2

quantitativ verknüpft. Durch diese Ber

U

ausgeschlossen werden kann. Die ermittelte irrelev

Dosisintervall von 12 Stunden lag bei 14 ng/ml und die irrelevante Urinkonzentration bei 40

ng/ml, und somit unter bzw

verschiedenen Matrices. Daraus lässt sich schließen, dass jeder Nachweis von Theophyll

Plasma oder im Urin anhand der beschriebenen Analysemethode als positiver Dopingbefund

zu betrachten ist. Deswegen erscheint die Einführung eines Grenzwertes für Theophyllin nicht

sinnvoll.

A

von Probanden keine absolut sichere Aussage über die Ausscheidungszeiten von

und Theobromin gemacht werden.

Jeglicher Nachweis von Theo

u

131

SUMMARY

7 SUMMARY

Sophie Koppe (2007):

he methylxanthines theophylline and

vance in horse-doping

ethod for the analysis detection

f horses and to investigate the pharmacokinetic behaviour of

affeine and theobromine.

of samples was made by using a high performance liquid

hromatograph (HPLC) with connected tandem-mass-spectrometer. Validation contained the

it of

eobromine, paraxanthine and caffeine was fixed at 100

g/ml in plasma and at 50 ng/ml in urine for theophylline, paraxanthine and caffeine. For

eobromine it was fixed at 100 ng/ml. The limit of detection was found at 13 ng/ml for

9 ng/ml for

he limit of detection was found at 20 ng/ml for theophylline,

t 26 ng/ml for theobromine, at 33 ng/ml for caffeine and at 32 ng/ml for paraxanthine.

body

theobromine at a single

ns of theophylline in

lasma after intravenous administration ranged between 5165 and 8834 ng/ml.

centrations in urine ranged between 21636 and 93373 ng/ml. 60

a ons o all si horses were not below limit of

uantification. In plasma and urine the metabolites paraxanthine and caffeine were detectable.

eobromine was not

aximum concentrations of theophylline in plasma after oral administration ranged between

791 and 3483 ng/ml. Maximum concentrations of theophylline in urine ranged between

Investigation of pharmacokinetic mechanisms of t

theobromine with respect to its rele

Aim of this study was to optimize and validate a suitable m

and quantification of theophylline, theobromine and the metabolites paraxanthine and caffeine

in blood and urine samples o

c

Validation and measurement

c

criteria selectivity, linearity, accuracy, precision, stability and recovery. The lim

quantification for theophylline, th

n

th

theophylline, at 15 ng/ml for theobromine, at 14 ng/ml for caffeine and at 2

paraxanthine in plasma. In urine t

a

Theophylline was administered to six horses at a single intravenous dose of 4 mg/kg

weight, theophylline at a single oral dose of 4 mg/kg body weight, or

travenous dose of 4 mg/kg body weight. Maximum concentratioin

p

Maximum theophylline con

hours after administration urine concentr ti f x

q

But caffeine concentrations were mainly around limit of detection. Th

detectable.

M

1

132

SUMMARY

16365 and 41256 ng/ml. 108 hours after administration the urine concentration of only one

fter administration of theobromine its maximum concentrations in plasma ranged between

ours after

orses were still above limit of detection. No

etabolites could be detected in plasma and urine.

ected

ication of theobromine can be submitted, and

heophylline and paraxanthine in plasma or urine, application of

eophylline can be submitted.

pharmacokinetic/pharmacodynamic approach of

OUTAIN and LASSOURD (2002) to calculate the irrelevant plasma and urine

ntration, irrelevant plasma concentration and irrelevant

rine concentration by the pharmacokinetic/pharmacodynamic model of TOUTAIN and

ne the irrelevant plasma concentration (at 14

l of 2 hou are elow

. Therefore it is concluded that any detection of theophylline

plasma or urine by this method has to be considered as a positive result of dopingtest. That

al

ariability. It must be concluded that a prediction about excretion times of theophylline and

ible.

les should be considered as relevant for

d appropriately.

horse was below limit of quantification. In plasma and urine the metabolite paraxanthine was

detectable.

A

5715 and 12402 ng/ml and in urine between 65771 and 94889 ng/ml. 168 h

administration all urine concentrations of the six h

m

Using the pattern of metabolites the parent substance can be concluded. If there is det

almost sole theobromine in plasma or urine, appl

if there is detected t

th

Afterwards the results were integrated into a

T

concentrations where caffeine has no effect on the organism anymore.

Calculation of effective plasma conce

u

LASSOURD (2002) showed that for theophylli

ng/ml) and urine concentration (at 40 ng/ml) at a dosing interva 1 rs b

respectively at limit of detection

in

is why an establishment of a selected cut-off value for therapeutics seems not to be acceptable

for theophylline.

In addition a considerable variance of measured data demonstrates the interindividu

v

theobromine based on this data by a small number of probands is not reliably poss

Any detection of theophylline in plasma or urine samp

doping and should be punishe

133

LITERATURVERZEICHNIS

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TABELLENVERZEICHNIS

9 TABELLENVERZEICHNIS

Dopingformen nach UNGEMACH und NÜRNBERGER (1999)

Tab. 2:

Tab. 4:

Tab. 6: in und Theophyllin im

Plasma zur Erstellung der drei Kalibrationsgeraden

Tab. 7:

Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Richtigkeit im Plasma

Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Richtigkeit im Urin

Tab. 10: Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Präzision im Plasma

Tab. 11: Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Präzision im Urin

Tab. 12: Konzentrationen von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin in

den Matrices Urin und Plasma für den Stabilitätstest

Tab. 13: Nachweisgrenzen von Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im

Plasma

Tab. 1:

Zusammenfassung der 2006 im Institut für Biochemie der Sporthochschule

Köln im Auftrag der Pferdesportverbände durchgeführter Analysen

Tab. 3: Pharmakodynamische Wirkungen der Methylxanthine (LÖSCHER, 2006)

Rasse, Geschlecht, Alter und Gewicht der Versuchspferde

Tab. 5: Entnahmezeitpunkte von Blut- und Urinproben im Hauptversuch

Verwendete Konzentrationen von Coffein, Theobrom

Verwendete Konzentrationen von Coffein, Theobromin, Theophyllin und

Paraxanthin im Urin zur Erstellung der drei Kalibrationsgeraden

Tab. 8:

Tab. 9:

148

TABELLENVERZEICHNIS

Tab. 14: Nachweisgrenzen von Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im

Urin

in, Coffein und Paraxanthin

im Plasma

Bestimmungsgrenzen von Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin

a

Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Theobromin im Plasma

Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Paraxanthin im Plasma

Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Coffein im Plasma

Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Theophyllin im Urin

Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Theobromin im Urin

Tab. 23: Urin

Intraday- und Interdaypräzision von Theophyllin und Theobromin im Plasma

Intraday- und Interdaypräzision von Coffein und Paraxanthin im Plasma

Intraday- und Interdaypräzision von Theophyllin und Theobromin im Urin

Intraday- und Interdaypräzision von Coffein und Paraxanthin im Urin

Tab. 15: Bestimmungsgrenzen von Theophyllin, Theobrom

Tab. 16:

im Urin

Tab. 17: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Theophyllin im Plasm

Tab. 18:

Tab. 19:

Tab. 20:

Tab. 21:

Tab. 22:

Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Paraxanthin im

Tab. 24: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Coffein im Urin

Tab. 25:

Tab. 26:

Tab. 27:

Tab. 28:

149

TABELLENVERZEICHNIS

Tab. 29: Stabilitätsdaten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein im

offein im

Urin

Tab. 31: Coffein

im Plasma

Tab. 32:

wicht

ab. 35: Pharmakokinetische Daten bis zur Quantifizierungsgrenze nach einmaliger

cht

konzentrationen von Theophyllin nach TOUTAIN

und LASSOURD (2002) in einem Dosisintervall von 12 Stunden

ab. 37

nem Dosisintervall von 24 Stunden

h TOUTAIN

ab. 39: Irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen von Theobromin nach TOUTAIN

Plasma

Tab. 30: Stabilitätsdaten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und C

Wiederfindungsraten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und

Wiederfindungsraten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein

im Plasma

Tab. 33: Pharmakokinetische Daten bis zur Quantifizierungsgrenze nach einmaliger

intravenöser Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körperge

Tab. 34: Pharmakokinetische Daten bis zur Quantifizierungsgrenze nach einmaliger

oraler Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht

T

intravenöser Applikation von 4 mg Theobromin pro kg Körpergewi

Tab. 36: Irrelevante Plasma- und Urin

T : Irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen von Theophyllin nach TOUTAIN

und LASSOURD (2002) in ei

Tab. 38: Irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen von Theobromin nac


T


150

TABELLENVERZEICHNIS

Tab. 40: Ausscheidungszeiten von Theophyllin aus dem Plasma nach intravenöser

OD

den)

Tab. 41: eophyllin aus dem Plasma nach oraler Applikation

von 4 mg/kg Körpergewicht bis zum Erreichen von LOQ und der LOD

Tab. 42: Theobromin aus dem Plasma nach intravenöser

Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht bis zum Erreichen von LOQ, LOD

bzw. der IPC (nach einem Dosierungsintervall von 13 bzw. 24 Stunden)

Tab. 43:

Mittelwert und Standardabweichung der sechs Pferde

Tab. 44: einmaliger intravenöser

kg Körpergewicht einschließlich

Tab. 45: ach einmaliger intravenöser Applikation

t einschließlich Mittelwert und

Tab. 46:

von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert und

Tab. 47:

von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert und

Tab. 48: akonzentrationen von Theobromin nach einmaliger intravenöser

Applikation von 4 mg Theobromin pro kg Körpergewicht einschließlich


Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht bis zum Erreichen von LOQ, L

bzw. der IPC (nach einem Dosierungsintervall von 12 bzw. 24 Stun

Ausscheidungszeiten von Th

Ausscheidungszeiten von

Plasmakonzentrationen von Theophyllin nach einmaliger intravenöser

Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich

Plasmakonzentrationen von Paraxanthin nach

Applikation von 4 mg Theophyllin pro


Plasmakonzentrationen von Coffein n

von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewich

Standardabweichung der sechs Pferde

Plasmakonzentrationen von Theophyllin nach einmaliger oraler Applikation


Plasmakonzentrationen von Paraxanthin nach einmaliger oraler Applikation


Plasm

151

TABELLENVERZEICHNIS

Tab. 49: Urinkonzentrationen von Theophyllin nach einmaliger intravenöser

Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht e


inschließlich

Tab. 51: Urinkonzentrationen von Theophyllin nach einmaliger oraler Applikation von

4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert und

Tab. 52:

Körpergewicht einschließlich Mittelwert und


Tab. 53:

ichung der sechs Pferde

Tab. 50: Urinkonzentrationen von Paraxanthin nach einmaliger intravenöser

Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich



Urinkonzentrationen von Paraxanthin nach einmaliger oraler Applikation von

4 mg Theophyllin pro kg

Urinkonzentrationen von Theobromin nach einmaliger intravenöser

Applikation von 4 mg Theobromin pro kg Körpergewicht einschließlich

Mittelwert und Standardabwe

152

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

10 ABBILDUNGSVERZEICHNIS

Abb. 1:

Abb. 3:

Ein- Kompartiment- Modell nach intravenöser Applikation

Abb. 7:

Abb. 9: ittels

PLC/MS/MS im Konzentrationsbereich bis 10.000 ng/ml

Abb. 10:

bb.11: ESI-Produktionenspektrum und Strukturformel von Theophyllin

bb. 12: ESI-Produktionenspektrum von 1,3-15N2-Theophyllin

Abb. 13: ESI-Produktionenspektrum und Strukturformel von Theobromin

Abb. 14: ESI-Produktionenspektrum von D6-Theobromin

Abb. 15: ESI-Produktionenspektrum und Strukturformel von Coffein

Strukturformeln der Methylxanthine

Abb. 2: Resorption nach einer Kinetik 0. Ordnung (FREY, 2002)

Resorption nach einer Kinetik 1. Ordnung (MUTSCHLER, 1996)

Abb. 4: Halblogarithmische Darstellung einer Resorption nach einer Kinetik

1. Ordnung (MUTSCHLER, 1996)

Abb. 5:

Abb. 6: Zwei- Kompartiment- Modell nach intravenöser Applikation

Zwei- Kompartiment- Modell nach einmaliger oraler Applikation

Abb. 8: Drei- Kompartiment- Modell nach einmaliger oraler Applikation

Probenaufarbeitung zum Nachweis von Methylxanthinen im Pferdeurin m

H

Probenaufarbeitung zum Nachweis von Methylxanthinen im Pferdeplasma

mittels HPLC/MS/MS im Konzentrationsbereich bis 10.000 ng/ml

A

A

153


Abb. 16: ESI-Produktionenspektrum von D3-Coffein

bb. 18: HPLC/MS/MS- Chromatogramme von Leerwerturinproben zu den

entsprechenden Retentionszeiten von Theobromin und Paraxanthin.

HPLC/MS/MS-Chromatogramme von inprobe denen ng

t xa ro z t z tsp en

Retentions iten.

Abb. 20: /M - at e L rtpl obe den

rec R ns on in eop

Abb. 21: /M –C tog von Plasma , d 0 ng in

kti op ro sma zugesetzt wurden, zu den

rec R ns

Abb. 22: ra rv ng K on ung es

la ef n f ei asm on ions iegen

Messpunkte

Abb. 23: rat rve nga r K ons ung es

elat eff n f eob im a; zent sstufe

n z ess vo

bb. 24: Kalibrationskurve mit Angabe der Kalibrationsgleichung und des

tufe

bb. 25: Kalibrationskurve mit Angabe der Kalibrationsgleichung und des

Korrelationskoeffizienten für Theobromin im Urin; je Konzentrationsstufe

liegen zwei Messpunkte vor

Abb. 17: ESI-Produktionenspektrum und Strukturformel von Paraxanthin

A

Abb. 19: Ur n, 100 Theobromin

respek ive Para nthin p ml Urin ugesetz wurden, u den en rechend

ze

HPLC S/MS Chrom ogramm von eerwe asmapr n zu

entsp henden etentio zeiten v Coffe und Th hyllin

HPLC S/MS hroma ramme proben enen 10 Coffe

respe ve The hyllin p ml Pla

entsp henden etentio zeiten.

Kalib tionsku e mit A abe der alibrati sgleich und d

Korre tionsko fiziente ür Coff n im Pl a; je K zentrat stufe l

zwei vor

Kalib ionsku mit A be de alibrati gleich und d

Korr ionsko iziente ür Th romin Plasm je Kon ration

liege wei M punkte r

A

Korrelationskoeffizienten für Theophyllin im Urin; je Konzentrationss

liegen zwei Messpunkte vor

A

154


A akonzentrationsverläufe von T llin ch n

li v p n g y kg

Körpergewicht, Ausschnittsv rößerung zeigt den Konzentrationsverlauf

innerhalb der ersten Stunde

Abb. 27: ittelter Plasm entr ver n T ylli den Metaboliten

Abb. 28: ittelter Plasm verlauf der M

Coffein ntra er Applikation von 4 mg/kg Theophyllin sowie der

tifi gsg (LO d d hw nze )

Abb. 29: ntu erh von phy nd d etab Para n im

a nach intravenöser Applikatio g Körp icht i ttel

m Erreichen von LOQ

Abb. 30: ittelter Plasma zentr sverl on T ylli Parax n im

a nach oraler Applikation von 4 g K gewi Mit zum

chen LOQ

g/kg Körpergewicht im Mittel bis zum

Erreichen von LOQ

bb. 32: Plasmakonzentrationsverläufe von Theophyllin nach einmaliger oraler

Applikation von 4mg Theophyllin pro kg Körpergewicht,

Ausschnittsvergrößerung zeigt die ersten 25 Stunden nach Applikation

bb. 33: Prozentuales Verhältnis von Theobromin und Metaboliten im Plasma nach

intravenöser Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht im Mittel

bb. 26 : Plasm heophy bei se s Pferde nach

einma ger intra enöser A plikatio von 4 m Theoph llin pro

erg

Gem akonz ations lauf vo heoph n und

Paraxanthin und Coffein

Gem akonzentrations etaboliten Paraxanthin und

nach i venös

Quan zierun renze Q) un er Nac eisgre (LOD

Proze ales V ältnis Theo llin u em M oliten xanthi

Plasm n von 4 m /kg ergew m Mi

bis zu

Gem kon ation auf v heoph n und anthi

Plasm mg/k örper cht im tel bis

Errei von

Abb. 31: Prozentuales Verhältnis von Theophyllin und dem Metaboliten Paraxanthin im

Plasma nach oraler Applikation von 4 m

A

A

155


Abb. 34: Plasmakonzentrationsverläufe von Theobromin nach einmaliger intravenöser

ka n 4 eo p örpergewic

h r z erste Stunde nach Applikation

Abb. 35: ische Darstellung der ge

ophy onze onsverläufe im Plasma nach einm intra er

likati on T hyllin wie ant ungs e (LO d der

Abb. 36: ische Darstellung der g

phy onzentrationsv fe i a nach einm orale

likati on T yllin wie d ant ungs e (LO d der

Abb. 37: loga ische Darstellung der gemittelten

obrom onze onsv fe im ma nach einm r intra er

likat n T omin, sowie der Quantifizierungsgrenze (LOQ) und

ach grenz OD)

bb. 38: Urinkonzentrationsverläufe von Theophyllin nach einmaliger intravenöser

Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht

bb. 39: Prozentuales Verhältnis von Theophyllin und Paraxanthin im Urin nach

intravenöser Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht im

Mittel bis zum Erreichen von LOQ

bb. 40: Urinkonzentrationsverläufe von Theophyllin nach einmaliger oraler

Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht

bb. 41: Prozentuales Verhältnis von Theophyllin und Paraxanthin im Urin nach

oralerApplikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht im Mittel bis

zum Erreichen von LOQ

Appli tion vo mg Th bromin ro kg K ht,

Aussc nittsverg ößerung eigt die

Halblogarithm mittelten

The llink ntrati aliger venös

App on v heop , so der Qu ifizier grenz Q) un


Halblogarithm emittelten

Theo llink erläu m Plasm aliger r

App on v heoph , so er Qu ifizier grenz Q) un


Halb rithm

The ink ntrati erläu Plas alige venös

App ion vo heobr

der N weis e (L

A

A

A

A

156


Abb. 42: ntu erh on Theobro d liten im Urin nach

intravenöser Applikation von 4 mg Theobromin kg K ge

b Er v

Abb. 43: on tion ufe he aliger intravenöser

ika n 4 heo n p örpergewich

chnittsvergr z er St nac ikat

Abb. 44: nt er vo in ro eo und

an Urin nach intravenös lika on offe kg

erg t im l b Er de da t

Abb. 45: ntuales Verh von in, rom heo und

ant Urin nach intravenös lik on heop

g K gew M is z reic er LO arges

:

obromin

Erreichen der LOQ dargestellt

bb. 47: Konfidenzintervalle (nur oberer Grenzbereich angezeigt) für eine ermittelte

Kenngröße (z.B. Ausscheidungszeit, angenommen mit einem Mittelwert von

100 Zeiteinheiten) in Abhängigkeit von der Streuung der Stichprobe

(KIETZMANN, 2006)

Proze ales V ältnis v min un Metabo

pro örper wicht im

Mittel is zum reichen on LOQ

Urink zentra sverlä von T obromin nach einm

Appl tion vo mg T bromi ro kg K t,

Auss ößerung eigt die sten 28 unden h Appl ion

Proze uales V hältnis n Coffe , Theob min, Th phyllin

Parax thin im er App tion v 4 mg C in pro

Körp ewich Mitte is zum reichen r LOQ rgestell

Proze ältnis Coffe Theob in, T phyllin

Parax hin im er App ation v 4 mg T hyllin

pro k örper icht im ittel b um Er hen d Q d tellt

Abb. 46 Prozentuales Verhältnis von Coffein, Theobromin, Theophyllin und

Paraxanthin im Urin nach intravenöser Applikation von 4 mg The

pro kg Körpergewicht im Mittel bis zum

A

157

ANHANG

11 ANHANG

Konzentrati n h d o i e n P

und Coffein im Pla a nac intra öser Applikation von Theophyllin und

Theobromin und oraler Verabreichung von Theophyllin

Zeit nach

onen vo Theop yllin un Theobr min sow e den M tabolite araxanthin

sm h ven

Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Sta - ndardAppl on ikati 1 2 3 4 5 6 wert abweichung

[h] [ [ [ [ [ [ [ [ng/ml] ng/ml] ng/ml] ng/ml] ng/ml] ng/ml] ng/ml] ng/ml]

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 6 1 .033 8834.4 7027.3 818.5 4024.7 6120.4 8038.6 977.3 716.80 8 5 4 5 5 1 .08 140.2 193.0 145.0 165.0 4316.9 5678.7 439.8 443.80 5 5 4 3 3 4 45 1174.0 .166 798.9 869.4 179.3 099.3 415.7 805.4 28.00 5 5 3 4 4 4 46 8 78.25 162.5 906.5 701.1 125.7 425.4 715.5 72. 3.4 0 6 4 3 2 2 3 4 1 .33 561.2 408.6 385.6 749.5 964.8 950.4 003.3 395.80.5 5 5 3 2 4003.3 3 639.6 364.4 611.1 206.6 914.2 41 12 23.2 51.7

0 4 4 2 2 3 3 36 2 80.75 463.0 471.0 872.1 563.1 901.2 852.9 87. 2.2 1 3 3843.0 2 2437.6 3 4194.2 438.7 854.0 614.3 33 0 6497. 7.9 2 3282.2 3688.9 2429.0 2500.2 3546.9 2957.0 3067.4 529.9 3 268.8 4507.2 2188.1 2359.6 3925.2 4278.6 3 3421.2 983.8 5 2779.2 3345.6 1914.3 2416.2 4113.9 3353.5 2987.1 781.3 7 2682 037.6 2811.0 .9 3300.4 1947.1 1521.0 3 2550.0 679.5 9 2 2408.6 2181.6 335.4 2341.8 1726.7 1637.1 2105.2 337.4

12 2326.4 1375.8 1610.8 1323.9 2219.0 1937.7 1798.9 427.6 15 1518.9 2258.1 1388.4 766.9 1884.1 1536.8 1558.9 500.6 24 1240.6 1159.4 755.0 931.1 935.0 848.3 978.2 185.7 28 1107.1 1139.2 662.5 734.6 1065.8 835.8 924.2 205.9 32 945.3 780.0 514.2 549.9 1095.7 889.0 795.7 228.5 36 946.0 795.7 464.4 549.7 335.1 1163.1 709.0 314.6 48 651.1 391.0 205.0 402.8 621.9 200.6 412.1 194.6 54 337.8 313.8 238.3 230.4 597.2 182.4 316.6 148.8 60 521.3 157.2 170.3 193.7 754.9 443.7 373.5 241.9

Tab.43: Plasmakonzentrationen von Theophyllin nach einmaliger intravenöser

Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert

und Standardabweichung der sechs Pferde

158

ANHANG

Zeit nach Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard-

Applikation 1 2 3 4 5 6 wert abweichung[h] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml]

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.033 868.0 476.6 428.6 369.3 324.4 459.3 487.7 194.8 0.08 535.2 256.4 201.4 235.3 227.1 417.7 312.2 133.7 0.166 342.7 345.2 198.5 345.2 224.5 306.3 293.7 65.9 0.25 281.1 427.2 193.2 329.0 265.6 310.2 301.0 77.5 0.33 374.3 272.5 170.9 333.0 145.6 412.3 284.8 108.7 0.5 394.8 316.4 223.1 263.7 310.5 216.0 287.4 67.4

0.75 287.0 373.6 311.4 157.7 329.3 378.7 306.3 81.0 1 214.0 269.0 247.6 142.8 239.4 685.5 299.7 193.9 2 142.4 213.6 145.4 271.5 870.9 166.0 301.6 283.1 3 291.3 246.6 125.6 300.8 279.5 262.1 251.0 64.5 5 242.7 205.1 94.9 259.1 212.9 413.7 238.1 103.5 7 0.0 239.8 108.1 290.7 255.5 146.5 173.4 109.5 9 477.2 133.7 111.8 304.4 237.4 n.n. 210.8 167.7

12 242.6 183.1 102.4 282.0 n.n. n.n. 135.0 120.8 15 112.3 159.8 130.3 245.0 180.2 n.n. 138.0 81.8 24 139.0 62.2 n.n. 132.7 n.n. 88.7 70.4 61.5 28 n.n. n.n. n.n. 40.3 140.7 n.n. 100.8 63.6 32 n.n. n.n. n.n. n.n. 173.6 n.n. 28.9 70.9 36 46.7 54.1 n.n. n.n. 8.9 196.5 51.0 75.1 48 430.6 n.n. n.n. n.n. n.n. 87.8 86.4 172.2 54 n.n. 1n.n. n.n. n.n. 78.1 n.n. 29.7 72.7 60 154.0 n.n. n.n. n.n. 51.5 n.n. 34.2 62.2

Tab.44: Plasmakonzentrationen von Paraxanthin nach einmaliger intravenöser

Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert

und Standardabweichung der sechs Pferde

159

ANHANG


Applikation 1 2 3 4 5 6 wert abweichung[h] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml]

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.033 153.4 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. 25.6 62.6 0.08 n.n. n.n. 14.3 n.n. n.n. 228.5 40.5 92.3 0.166 n.n. .4 .7 n.n.n. 32 n.n. 80 n. 18.9 33.0 0.25 30.9 n. . 11 8 n.n. n n.n. 7. 314.5 77.2 124.9 0.33 n.n. n n n .n. .n. n .n. .n. n.n. 0 0 0.5 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. 0 0

0. n n n n.n. 1 1875 .n. .n. .n. 9.8 0.7 3 72.6 3.41 n.n. n.n. n.n. 62.0 n.n. 992.3 175.7 400.8 2 n.n. n.n. n.n. n.n. 1283.2 n.n. 213.9 523.9 3 38.3 n.n. n.n. n.n. 1177.8 84.8 216.8 472.0 5 n.n. n.n. 16.6 n.n. 14.5 306.6 56.3 122.8 7 n.n. 15.1 n.n. n.n. 27.2 22.0 10.7 12.3 9 17.1 n.n. n.n. 15.7 34.2 n.n. 11.2 13.9

12 67.8 17.7 24.2 14.8 35.9 n.n. 26.8 23.3 15 36.6 n.n. 17.7 28.0 25.3 16.0 20.6 12.5 24 45.1 n.n. 25.7 33.0 24.2 47.3 29.2 17.2 28 23.2 19.6 n.n. n.n. 92.6 46.2 30.3 35.0 32 17.8 n.n. n.n. n.n. 224.1 31.8 45.6 88.4 36 n.n. 15.1 22.1 16.0 140.0 238.8 72.0 96.4 48 36.0 40.1 15.4 n.n. n.n. n.n. 15.2 18.7 54 46.0 22.5 n.n. n.n. 217.6 n.n. 47.7 85.2 60 76.9 n.n. 15.5 n.n. 59.2 180.8 55.4 69.2

Tab.45: Plasmakonzentrationen von Coffein nach einmaliger intravenöser Applikation von



160

ANHANG


A 1 6 pplikation 2 3 4 5 wert abweichung[h] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ ng/ml] [ng/ml]

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 203.6 1 2 1 3 6 8 7 58.4 2 0 3 8 .08 33. 80. 3.8 72. 52. 09.0 .16 385.0 319.8 244.1 79.3 1824.8 168.2 503.5 656.2 0 2947.3 247.4 .33 392.8 413.4 602.8 472.9 846.1 1035.8 0.66 562.6 1248.2 1439.7 1354.9 3483.0 236.8 1387.5 1133.0

1 674.0 2019.4 1502.6 1522.5 2896.5 286.5 1483.6 935.3 3 1064.5 3464.2 1717.8 1803.9 3041.9 1066.6 2 1 026.5 008.96 1169.8 2174.9 1892.0 2419.8 1912.4 1791.1 1 422.1 893.39 2412.5 2053.2 2090.8 2730.5 2029.5 1570.9 2147.9 392.1

12 1599.3 1130.5 2949.4 2660.4 1625.3 920.5 1814.2 818.9 24 1110.4 692.9 1349.9 1021.8 1481.5 690.6 1057.9 327.7 30 634.3 422.1 1101.8 692.3 956.0 568.0 729.1 253.3 48 461.7 177.1 411.7 233.7 718.0 405.3 401.2 191.0 54 221.7 173.6 349.2 373.4 396.8 170.4 280.8 103.8 60 237.4 53.1 337.1 66.8 378.0 152.6 204.2 136.6 72 183.4 69.8 223.3 80.2 174.8 103.6 139.2 63.0 96 48.8 13.2 56.9 14.1 335.6 41.3 85.0 124.1

108 18.9 35.8 20.3 81.3 36.7 n.n. 32.2 27.6

Plasmakonzentrationen von Theophyllin nach einmaliger oraler Applikation von



Tab.46:

161

ANHANG


A 4 pplikation 1 2 3 5 6 wert abweichung[h] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ ng/ml] [ng/ml]

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. n n n n 10 n 1 4 08 .n. .n. .n. .n. 0.2 .n. 6.7 0.90.16 n.n. n.n. n.n. 39.3 171.8 36.3 41.2 66.6 0.33 n.n. n.n. 99.4 79.4 301.7 n.n. 80.1 117.2 0. 66 n.n. n.n. 138.8 59.9 369.5 29.1 99.6 142.0

1 n.n. 175.1 201.9 100.1 286.2 99.2 143.8 99.2 3 95.4 74.2 231.4 125.8 94.3 151.0 128.7 57.1 6 n.n. 106.1 120.3 170.5 230.8 96.7 120.7 77.4 9 176.8 132.7 130.7 198.8 225.6 156.7 170.2 37.6

12 215.7 114.4 215.9 201.1 252.5 42.4 173.7 79.1 24 187.4 58.9 86.2 100.3 128.6 n.n. 93.6 63.4 30 96.2 n.n. 78.8 31.8 108.6 n.n. 52.6 48.4 48 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. 0 0 54 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. 0 0 60 n.n. n.n. 27.1 74.0 n.n. n.n. 16.9 30.0 72 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. 0 0 96 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. 0 0

108 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. 0 0 Tab.47: Plasmakonzentrationen von Paraxanthin nach einmaliger oraler Applikation von



162

ANHANG


A 2 pplikation 1 3 4 5 6 wert abweichung[ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [h] [ng/ml]

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 124 8346.5 45 46 106 61 7780.7 32 033 02.7 14.3 63.6 28.2 28.6 52.90.08 7 3 5 5 5 500.0 333.2 698.3 715.2 5082.3 4304.7 272.3 1419.4 0 .166 6135.8 7651.1 3910.7 3609.0 5558.9 5041.5 5317.8 1493.2 0. 087.2 813.4 25 6505.5 3996.2 5 3806.6 2 3861.5 4345.1 1281.4 0. 5212.5 33 6851.2 4992.5 3167.8 1753.2 3382.2 4227 1811 0 5293.1 .5 5126.2 3701.4 3575.4 3241.4 2838.4 3963 1013

0 4541.2 .75 8831.0 6565.9 2626.2 3658.4 3443.2 4 944.3 2331.51 4386.7 6052.0 5779.6 2622.2 3306.5 3085.4 4205.4 1448.4 2 1928.3 7566.3 3886.7 3414.6 3193.0 3761.9 3958.5 1900.7 3 3192.9 5838.6 4970.0 2321.5 2319.3 2623.8 3544.3 1500.9 5 2360.5 3814.9 3152.7 2667.4 3880.1 1725.4 2933.5 846.1 7 1 1 3 2287.8 640.2 3592.7 2040.8 540.9 171.5 2379.0 833.3 9 1276.0 3791.6 2 3 1 323.2 357.2 889.4 2869.8 2 584.5 938.0

13 1 2 1 4 2 1 006.3 494.2 935.7 144.9 1534.3 2139.2 209.1 078.024 1 1 1 2 1 1 1 109.9 407.1 393.8 138.4 962.7 578.3 598.3 385.2 28 7 9 1 2 1 1 1 18.3 12.4 190.9 093.2 093.8 637.4 274.3 506.4 36 9 8 779.7 6 5 7 7521.3 30.8 71.2 81.1 72.6 9.4 119.6 48 357.5 744.5 333.9 432.4 499.6 476.4 474.1 147.5 72 12.6 180.0 127.8 233.0 208.1 173.5 1 172.5 46.0 96 27.8 77.5 59.1 21.6 29.4 174.0 64.9 57.6

120 n.n. n.n. n.n. 30.6 277.4 n.n. 51.3 111.4 144 n.n. n.n. 16.1 n.n. n.n. 283.1 49.9 114.4 168 n.n. n.n. 125.9 127.3 n.n. n.n. 42.2 65.4

Tab.48: Plasmakonzentrationen von Theobromin nach einmaliger intravenöser Applikation

von 4 mg Theobromin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert und


163

ANHANG

Konzentrationen von Theophyllin und Theobromin sowie des Metaboliten Paraxanthin

i ac av A io

Verabreichung von Theophyllin

Zeit nach

m Urin n h intr enöser pplikat n von Theophyllin und Theobromin und oraler

Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard- Appl on ikati 1 2 3 4 5 6 wert ab gweichun

[h] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml]

0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 14093.3 10409.2 12153.3 9235.0 9159.9 16555.4 11934.4 2945.3 3 24597.4 16633.4 19152.6 16306.3 21188.4 21636.3 19919.1 3190.1 6 20004.7 34175.6 93372.7 36982.0 21844.1 21005.7 37897.5 28126.1 9 21352.8 48508.4 45959.3 15952.6 16237.1 15300.2 27218.4 15674.4

12 19560.0 27523.5 21311.4 13665.1 19033.4 14606.0 19283 5012 15 1 1 1 1 7649.1 8992.8 16282.1 5500.0 8144.6 14230.8 16800 1783 24 11419.0 15686.0 1 1 1 1948.5 5235.0 6892.5 8113.7 13215.8 3303.4 28 1 1 1 1 1 2160.8 0965.6 0471.3 2359.4 6035.6 8871.6 1 1810.7 2425.7 32 10011.9 9329.4 9349.4 10400.1 10029.4 6818.0 9323.0 1296.9 36 383.7 8544.4 12823.0 9200.7 9620.0 5009.4 9 9096.9 2500.5 48 5094.3 3326.3 5973.4 4152.5 4501.7 3998.3 4507.7 924.5 54 3 4859.1 2693.8 135.5 2359.6 2966.2 5083.1 3516.2 1159.3 60 2782 616.5 1692.6 .2 1838.3 953.7 2657.1 4 2423.4 1267.2

Tab.49: Urinkonzentrationen von Theophyllin nach einmaliger intravenöser Applikation von



164

ANHANG

Zeit nach Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard- Applikation 1 2 3 4 5 6 wert abweichung


0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 560.4 402.9 454.6 258.1 383.6 579.1 439.8 119.7 3 1389.3 972.3 2979.2 900.0 744.8 866.5 1308.7 847.5 6 1464.6 1218.5 2116.4 751.7 624.6 701.1 1146.2 578.6 9 1251.6 911.1 903.3 555.4 385.0 622.6 771.5 311.7

12 839.8 892.4 424.7 966.6 628.7 522.1 712 219 15 532.2 312.5 1061.2 722.9 458.8 575.5 610 259 24 401.8 657.6 344.8 976.8 189.5 230.8 466.9 299.4 28 552.9 434.0 491.5 859.5 675.9 370.6 564.1 178.6 32 395.1 297.5 308.2 480.3 367.5 248.9 349.6 82.5 36 422.9 237.3 328.5 412.1 216.2 279.4 316.0 87.5 48 146.5 160.6 677.5 183.6 66.7 24.8 209.9 236.9 54 107.4 74.4 50.8 242.7 165.5 86.1 121.2 71.1 60 112.1 78.5 76.9 183.7 216.7 96.2 127.3 58.8

Tab.50: Urinkonzentrationen von Paraxanthin nach einmaliger intravenöser Applikation von



165

ANHANG



0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 71.4 85.1 2112.9 533.9 12744.8 132.1 2613.4 5024.6 1.5 9960.9 7167.7 28413.3 12419.8 12343.8 5120.2 12571.0 8277.4 3 18287.4 11711.5 32806.7 17828.1 41256.3 7551.1 21573.5 12902.0 6 16817.7 18457.9 34106.2 21418.5 32812.8 16358.8 23328.7 8055.4 9 15180.2 23981.4 29340.2 28723.9 27037.0 16365.1 23438 6233

11 12264.5 24569.9 30674.1 26663.9 27477.9 13565.7 22536 7717 13 10651.6 20288.3 26937.0 18662.0 22427.9 12871.8 18639.8 6049.7 15 8828.5 17889.0 21021.4 17470.0 21662.3 11851.1 16453.7 5107.1 24 5898.2 7900.3 20402.5 12603.4 10849.0 11975.3 11604.8 5007.9 30 5449.2 7417.2 11587.2 9299.6 11498.5 11062.9 9385.8 2510.0 48 2361.1 2708.7 9667.2 3327.4 7505.1 3180.0 4791.6 3037.1 54 1427.9 1736.1 3802.4 2776.2 3035.9 3446.6 2704.2 942.2 60 942.8 1521.1 4780.4 502.2 4599.3 739.5 2180.9 1973.3 72 177.3 844.2 1461.3 223.3 1783.4 965.6 909.2 645.4 96 49.4 323.0 557.5 178.5 441.2 321.6 311.9 181.1

108 34.5 133.7 511.1 135.7 256.0 129.7 200.1 167.8 Tab.51: Urinkonzentrationen von Theophyllin nach einmaliger oraler Applikation von



166

ANHANG

167



0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 n.n. n.n. 49.2 n.n. 468.7 40.2 93.0 169.2 1.5 337.2 133.7 923.4 262.6 313.8 281.0 375.3 253.5 3 1311.3 330.8 1262.0 567.7 729.9 303.8 750.9 405.3 6 856.6 842.4 1456.6 801.0 270.8 816.4 840.6 343.2 9 495.0 367.3 1123.6 1006.0 1286.8 1053.6 889 337

11 378.4 425.4 1864.0 1236.0 949.3 1786.4 1107 588 13 374.6 598.3 1218.9 1143.3 483.4 1414.9 872.2 400.4 15 363.8 710.7 542.6 580.2 1004.0 1483.6 780.8 369.6 24 119.1 237.6 433.8 506.5 115.8 524.1 322.8 172.3 30 178.3 217.5 188.9 332.8 250.0 471.0 273.1 102.0 48 67.0 107.6 390.1 96.1 62.6 167.8 148.6 113.4 54 129.2 51.0 82.3 37.6 n.n. 143.6 73.9 50.5 60 50.5 n.n. 36.9 n.n. 156.1 49.2 48.8 52.3 72 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. 96.0 16.0 35.8 96 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. 42.1 7.0 15.7

108 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. 0 0 Tab.52: Urinkonzentrationen von Paraxanthin nach einmaliger oraler Applikation von



ANHANG

168



0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 22273.4 10020.9 41224.0 36589.8 33901.0 58824.6 33805.6 16658.0 3 42932.0 66981.5 94889.0 71394.7 65771.8 67199.0 68194.7 16549.1 6 74184.2 93563.2 71217.4 86119.8 51056.6 55081.5 71870.4 16700.2 9 89278.9 42795.9 59565.6 83857.8 35619.1 44578.8 59282.7 22591.0

13 34893.4 35778.3 36331.0 69942.7 33943.6 43899.7 42465 13924 24 25759.8 16667.6 34007.1 18309.4 29235.4 18988.1 23828 6953 28 15536.6 17069.5 25530.4 21890.2 15781.0 18719.9 19087.9 3927.2 36 10808.6 1042.2 16925.8 11609.6 15232.7 10729.5 11058.1 5525.4 48 7095.7 1087.6 8139.0 9861.5 10231.3 4354.8 6795.0 3511.0 72 4767.5 3283.9 3781.0 1475.1 7240.9 13357.0 5650.9 4224.4 96 1055.0 1445.2 1749.5 1395.5 2990.6 5166.6 2300.4 1555.4

120 653.8 245.3 1191.7 390.3 277.0 1798.5 759.4 618.2 144 5443.6 181.9 280.2 63.6 87.3 1060.9 1186.2 2118.4 168 890.6 70.6 55.6 37.0 53.2 475.8 263.8 350.5

Tab.53: Urinkonzentrationen von Theobromin nach einmaliger intravenöser Applikation von

4 mg Theobromin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert und


Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation

„Untersuchung der Pharmakokinetik der Methylxanthine Theophyllin und Theobromin

hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd“

selbstständig verfasst habe.

Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:

1. Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln

2. Institut für Tierzucht der Forschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) in Mariensee

Ich habe keine entgeldliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten

(Promotionsberater oder andere Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir

unmittelbar oder mittelbar entgeldliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im

Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.

Ich habe die Dissertation an folgendem Institut angefertigt:

1. Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche

Hochschule Hannover

Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen

Zweck zur Beurteilung eingereicht.

Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach besten Wissen vollständig und der

Wahrheit entsprechend gemacht habe.

Sophie Koppe Hannover,27.02.2007

DANKSAGUNG

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Manfred Kietzmann für die Überlassung des

Themas und die humorvolle und freundliche Art, Fragen zu beantworten, Probleme zu

beseitigen und immer für die richtige Motivation zu sorgen.

Mein Dank gilt ebenfalls den Mitarbeitern des Instituts für Biochemie der Deutschen

Sporthochschule Köln, insbesondere Prof. Dr. W. Schänzer und Dr. Marc Machnik, Dr. Sven

Guddat, Herrn Andreas Thomas, Herrn Michael Bredehöft und den vielen anderen für die

stets freundliche und aufmunternde Art, mir mit Rat und Tat zur Seite zu stehen.

Ich danke weiterhin Herrn Dr. Michael Düe von der Reiterlichen Vereinigung e.V. für die

Organisation der Versuchspferde und die gute Unterstützung.

Mein Dank gebührt auch Herrn Prof. Dr. Dr. Franz Ellendorf der FAL Mariensee für die

Überlassung der Versuchspferde sowie insbesondere Herrn Jonny Meier und Herrn Heinrich

Wassmann für die sehr freundschaftliche und tatkräftige Unterstützung im Stall.

Ebenso bedanke ich mich bei Herrn Dr. Frank Niedorf für die Unterstützung bei der

statistischen Auswertung der Ergebnisse und bei Herrn Hans Herbert Bohr aus dem Institut

für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover.

Ich danke ganz besonders meinem Mann, meiner Familie, meiner Kollegin Britta

Kreutzberger und den vielen Freunden, die alle direkt oder indirekt zum Gelingen dieser

Arbeit beigetragen und mich stets unterstützt haben.

Nicht zuletzt danke ich meinen Mitdoktorantinnen Maren und Simone für die stete Hilfe und

Unterstützung.

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