Untersuchung zur Pharmakokinetik der Methylxanthine ... · PDF file Untersuchung zur...

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  • Aus dem Institut für

    Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der

    Tierärztlichen Hochschule Hannover

    ___________________________________________________________________________

    Untersuchung zur Pharmakokinetik der Methylxanthine

    Theophyllin und Theobromin hinsichtlich der

    Dopingrelevanz beim Pferd

    INAUGURAL-DISSERTATION

    Zur Erlangung des Grades einer

    Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

    durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

    vorgelegt von

    Sophie Koppe (geb. Richers) aus Berlin

    Hannover 2007

  • Wissenschaftliche Betreuung: Universitätsprofessor Dr. M. Kietzmann

    1. Gutachter: Universitätsprofessor Dr. M. Kietzmann

    2. Gutachter: Universitätsprofessor Dr. Dr. h.c. E. Deegen

    Tag der mündlichen Prüfung: 25.05.2007

  • Meinem Mann

    und

    meinen Eltern

  • INHALTSVERZEICHNIS

    INHALTSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

    1 EINLEITUNG 13

    2 LITERATURÜBERSICHT 14

    2.1. Definition von Doping 14

    2.2. Bestimmungen 16

    2.3. Methylxanthine 18

    2.3.1. Vorkommen 18

    2.3.2. Wirkung 19

    2.3.3. Theophyllin 27

    2.3.4. Theobromin 30

    2.4. Pharmakokinetische Grundlagen 32

    2.5. Pharmakokinetische Parameter 39

    3 MATERIAL UND METHODE 45

    3.1. Aufbau des Experiments und Vers uchsplanung 45

    3.1.1. Versuchstiere und Haltungsbedingungen 45

    3.1.2. Testsubstanzen 46

    3.1.3. Vorversuch 47

    3.1.4. Hauptversuch 47

    3.1.5. Aufbereitung der Proben und Aufbewahrung 48

    3.2. Analytik 49

    3.2.1. Chemikalien 49

    3.2.2. Instrumente 50

    3.2.3. Methodenentwicklung 51

    3.2.4. Aufarbeitung der Urinproben 55

    3.2.5. Aufarbeitung der Plasmaproben 56

  • INHALTSVERZEICHNIS

    3.3. Validierung der Methode 58

    3.3.1. Selektivität und Spezifität 58

    3.3.2. Linearität 58

    3.3.3. Nachweisgrenze 60

    3.3.4. Bestimmungsgrenze 61

    3.3.5. Richtigkeit 61

    3.3.6. Präzision 62

    3.3.7. Stabilität 63

    3.3.8. Wiederfindung 64

    3.4. Pharmakokinetische Auswertung 65

    4 ERGEBNISSE 66

    4.1. Ergebnisse der Analysemethoden

    4.1.1. Massenspektren der zu analysierenden Substanzen und

    ihrer internen Standards 66

    4.1.1.1. Massenspektrum von Theophyllin und 1,3-15N2- Theophyllin 66

    4.1.1.2. Massenspektrum von Theobromin und D6- Theobromin 67

    4.1.1.3. Massenspektrum von Coffein und D3- Coffein 69

    4.1.1.4. Massenspektrum von Paraxanthin 70

    4.2. Ergebnisse der Validierung 71

    4.2.1. Selektivität 71

    4.2.2. Linearität 74

    4.2.3. Nachweisgrenze (LOD) 77

    4.2.4. Bestimmungs-/Quantifizierungsgrenze (LOQ) 78

    4.2.5. Richtigkeit 79

    4.2.6. Präzision 83

    4.2.7. Stabilität 85

    4.2.8. Wiederfindung 87

  • INHALTSVERZEICHNIS

    4.3. Ergebnisse des Hauptversuches 88

    4.3.1. Plasma 88

    4.3.1.1. Theophyllin und Metaboliten nach intravenöser Applikation 88

    4.3.1.2. Theophyllin und Metaboliten nach oraler Applikation 91

    4.3.1.3. Theobromin und Metaboliten nach intravenöser Applikation 94

    4.3.2. Pharmakokinetische Berechnungen 96

    4.3.2.1. Pharmakokinetik von Theophyllin nach intravenöser Applikation 96

    4.3.2.2. Pharmakokinetik von Theophyllin nach oraler Applikation 97

    4.3.2.3. Pharmakokinetik von Theobromin nach intravenöser Applikation 99

    4.3.3. Urin 101

    4.3.3.1. Theophyllin und Metaboliten nach intravenöser Applikation 101

    4.3.3.2. Theophyllin und Metaboliten nach oraler Applikation 104

    4.3.3.3. Theobromin und Metaboliten nach intravenöser Applikation 107

    4.3.4. Pharmakodynamische Effekte von Theophyllin und Theobromin 109

    4.3.4.1. Herzfrequenz 109

    4.3.4.2. Atemfrequenz 109

    4.4. Berechnung effektiver und irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen 109

    4.4.1. Berechnung effektiver und irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen von

    Theophyllin 111

    4.4.2. Berechnung effektiver und irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen von

    Theobromin 112

    4.5. Ausscheidungszeiten 113

    4.5.1. Ausscheidungszeiten von Theophyllin nach intravenöser Applikation 113

    4.5.2. Ausscheidungszeiten von Theophyllin nach oraler Applikation 114

    4.5.3. Ausscheidungszeiten von Theobromin nach intravenöser Applikation 115

  • INHALTSVERZEICHNIS

    5 DISKUSSION 116

    5.1. Eignung der Aufarbeitungs- und Analysemethode (HPLC/MS/MS) zur

    Quantifizierung von Theophyllin und Theobromin im Plasma und Urin 116

    5.2. Ausscheidungsverhalten von Theophyllin und Theobromin 118

    5.3. Bewertung der Ergebnisse 129

    6 ZUSAMMENFASSUNG 130

    7 SUMMERY 132

    8 LITERATURVERZEICHNIS 134

    9 TABELLENVERZEICHNIS 148

    10 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 153

    11 ANHANG 158

  • ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

    ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

    µg Mikrogramm

    µl Mikroliter

    µmol Mikromol

    Abb. Abbildung

    AC Adenylatcyclase

    APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation

    ATP Adenosintriphosphat

    AUC Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve (area under the curve)

    bzw. beziehungsweise

    C Konzentration

    ca. circa

    Ca++ Calcium

    cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat

    CL Clearance

    CO2 Kohlendioxid

    D Gesamtdosis

    DIR Direktorium für Vollblutzucht und Rennen

    EHSLC European Horserace Liaison Committee

    EPC effektive Plasmakonzentration

    ESI Electro Spray Ionisation

    F Bioverfügbarkeit

    f Freiheitsgerade der linearen Kalibration

    FAL Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft

    FEI Fédération Équestre International

    FN Fédération National

    g Gramm

    ºC Grad Celsius

    h Stunde

    H+ Proton

    H2O Wasser

    HCl Salzsäure

    HPLC High Performance Liquid Chromatography

  • ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

    HQC High Quality Control Standard

    HVT Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen e.V.

    HWZ Halbwertszeit

    IPC irrelevante Plasmakonzentration

    i.v. intravenös

    k10 Eliminationsgeschwindigkeitskonstante

    k12 Transferkonstante, Übertritt vom zentralen ins periphere

    Kompartiment

    k21 Transferkonstante, Übertritt vom peripheren ins zentrale

    Kompartiment

    ka Resorptionskonstante

    ke Eliminationskonstante

    kel Eliminationskonstante

    kg Kilogramm

    KGW Körpergewicht

    KM Körpermasse

    l Liter

    LC Liquid Chromatography

    ln natürlicher Logarithmus

    LOD Limit of Detection

    LOQ Limit of Quantification

    LPO Leistungsprüfungsordnung der FN

    LQC Low Quality Control Standard

    λ Hybridkonstante

    M Konzentration

    Mg++ Magnesium

    m/z Masse zu Ladung Verhältnis

    mg Milligramm

    mmol Millimol

    min Minute

    ml Milliliter

    MQC Midrange Quality Control Standard

    MS Massenspektrometrie

    ng Nanogramm

  • ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

    n.n. nicht nachweisbar

    n.m. not measured (nicht gemessen)

    p.a. post applicationem

    p.a. pro analysi

    PDE Phosphordiesterase

    PK/PD pharmakokinetisch/pharmakodynamisch

    Q Organdurchblutung

    QCS Quality Control Standard

    Qx Summe der Abweichungsquadrate

    R2 Korrelationskoeffizient

    Sb totale Präzision, interday repeatability

    SF Sicherheitsfaktor

    SW Tagespräzision, intraday repeatability

    SxO Reststandardabweichung

    Rss Verhältnis von Harn- zu Plasmakonzentration im Steady State

    t Zeit

    t1/2 Halbwertszeit

    tA Ausscheidungszeit

    Tab. Tabelle

    TINV t-Wert der t-Verteilung

    V Verteilungsvolumen

    Vdβ Verteilungsvolumen im Pseudo-Steady State

    Vss Verteilungsvolumen im Steady State

    WADA World Anti-Doping Agency

    x Mittelwert

    z.B. zum Beispiel

  • EINLEITUNG

    1 EINLEITUNG

    Zur Zeit gilt im Pferdesport eine sogenannte „Nulllösung“, das heißt, dass bis auf wenige klar

    definierte Ausnahmen jeglicher Nachweis einer körperfr