PTH EMBEBIDO EM ESPONJA DE COLÁGENO AUMENTA A
OSTEOCONDUTIVIDADE ASSOCIADA A CO-EXPRESSÃO DE
IGF-1, OSTEOCALCINA E FGF-23
Odontologia, pelo programa de
mestrado profissional em Odontologia
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Biblioteca da Universidade Positivo - Curitiba – PR
Elaborado pela Bibliotecária Damaris Cardoso de Oliveira Vieira (CRB- 9/201803/P)
R433 Resende, Rafaela Guimarães. PTH embebido em esponja de colágeno aumenta a
osteocondutividade associada a co-expressão de IGF-1, osteocalcina e FGF-23 / Rafaela Guimarães Resende. Curitiba : Universidade Positivo, 2019. 45 f. : il
Dissertação (Mestrado) – Universidade Positivo, Programa de Pós-graduação em Odontologia, 2019.
Orientador: Profa. Dra. Tatiana Miranda Deliberador. Co-orientador: Prof. Dr. Allan Fernando Giovanini.
1. Odontologia. 2. Osteocalcina. 3. Pesquisa - Avaliação. I. Deliberador, Tatiana Miranda. II. Giovanini, Allan Fernando. III. Título.
CDU 616.314(043.3)
iii
iv
Este trabalho de pesquisa foi realizado no Laboratório de Pesquisa e Desenvolvimento em Odontologia (LPDO) da Universidade Positivo.
v
DEDICATÓRIA
À minha família, minha mãe Fabiana França Guimarães, meu padrasto Luiz
Henrique Camargo Bigarelli, que é como um pai para mim e meu irmão Felippo
Guimarães Bigarelli, por nunca me deixarem desistir, por me dedicarem tempo,
amor e confiança e por sempre me apoiarem em todos os momentos.
vi
AGRADECIMENTOS
A Universidade Positivo, por me proporcionar esse oportunidade de desfrutar de uma
universidade incrível.
Ao Professor Allan Fernando Giovanini, a quem tenho muita admiração e respeito.
Obrigada por toda a dedicação e paciência, por acreditar que eu conseguiria, por
sempre me direcionar ao caminho certo, e por ser esse grande mestre com suas idéias
sempre certeiras.
A Professora Tatiana Miranda Deliberador, a quem também admiro muito, pela
paciência e por ajudar a construir esse trabalho de forma brilhante.
Ao Professor Felipe Rychuv, por participar da qualificação, contribuindo para a
melhora do trabalho com suas sugestões e críticas contrutivas.
Aos meus pais por entenderem a correria e ausência em alguns momentos, por todo o
apoio e dedicação e palavras de carinho.
Ao meu irmão Felippo de 5 anos que com a sua ingenuidade de criança me ajudou a
ter distrações e ser mais feliz durante essa caminhada.
Ao meu namorado Renan Ulbrich Zakrzevski por todo carinho, por sempre me apoiar,
me incentivar e escutar com muita paciência todas as minhas apresentações.
A minha madrinha Vera Lúcia por sempre torcer por mim.
Ao meu avô Orlei por sempre me acalmar nas horas de desespero.
A minha avó Mariland que sempre torceu para que eu chegasse até aqui.
Aos meus amigos se fizeram presentes e sempre me incentivaram a continuar.
Aos professores e alunos que de alguma forma contribuíram para esse trabalho.
A todos que participam da minha vida e que torcem por mim, meus sinceros
agradecimentos e carinho.
vii
EPÍGRAFE
“Se cheguei até aqui foi porque me apoiei no ombro dos gigantes”
Isaac Newton
viii
Resende RG. PTH embebido em esponja de colágeno aumenta a osteocondutividade
associada a co-expressão de IGF-1, Osteocalcina e FGF-23. [Dissertação de
Mestrado]. Curitiba: Universidade Positivo; 2019.
RESUMO
A utilização de análogos hormonais sintéticos para modular o remodelamento ósseo
parece constituir uma alternativa plausível para a recuperação de defeitos ósseos
segmentares e críticos. O objetivo do presente estudo é avaliar a imunolocalização das
proteinas IGF-1 e FGF23 e Osteocalcina em defeitos críticos tratados com esponja de
colágeno contendo PTH e livre de PTH. Foram utilizados 28 espécimes de ratos
machos, divididos em 2 grupos, sendo um com esponja de colágeno e membrana de
cortical bovina e o outro grupo com esponja de colágeno embebida em PTH e
membrana de cortical bovina. Após a eutanásia dos animais em 15 e 60 dias foram
obtidos os resultados da imunohistoquímimica. Os dados foram submetidos à análise
estatística (Shapiro-Wilk, Kruskall-Wallis). Em todos os espécimes analisados foi
verificada a presença das proteínas pesquisadas. Concluiu-se que o uso de PTH
associado à esponja de colágeno parece estimular a osteogênese no inicio do processo
de reparo e em longo prazo, a osteocondutividade nos espécimes PTH é diminuído e
volta a ocorrer um processo reparador por segunda intensão.
Palavras-chave: Esponja de colágeno, PTH, FGF-23, Osteocalcina, IGF-1
ix
Resende RG. PTH embebido em esponja de colágeno aumenta a osteocondutividade
associada a co-expressão de IGF-1, Osteocalcina e FGF-23. [Dissertação de
Mestrado]. Curitiba: Universidade Positivo; 2019.
ABSTRACT
The use of synthetic hormone analogs to modulate bone remodeling seems to be a
plausible alternative for the recovery of segmental and critical bone defects. The aim
of the present study is to evaluate the immunolocalization of IGF-1 and FGF23 and
Osteocalcin proteins in critical defects treated with PTH-containing and PTH-free
collagen sponge. Twenty-eight specimens of male rats were divided into two groups,
one with collagen sponge and bovine cortical membrane and the other group with
collagen sponge embedded in PTH and bovine cortical membrane. After the
euthanasia of the animals at 15 and 60 days the results of the immunohistochemistry
were obtained. Data were submitted to statistical analysis (Shapiro-Wilk, Kruskall-
Wallis). In all the analyzed specimens the presence of the proteins was verified. It was
concluded that the use of PTH associated with the collagen sponge seems to stimulate
osteogenesis at the beginning of the repair process and in the long term, the
osteoconductivity in the PTH specimens is diminished and a restorative process
occurs again for a second intension.
Key words: Collagen sponge, PTH, FGF-23, Osteocalcin, IGF-1
x
SUMÁRIO
3. PROPOSIÇÃO ............................................................................................... 10
Utilização de biomateriais ou fármacos que apresentem propriedades
osteoindutoras e osteocondutoras comumente tem sido testados in vivo e in vitro e
posteriormente aplicados na prática clínica à fim de melhorar o processo de reparo
óssea, assim promovendo o desenvolvimento de volume ósseo adequado para
restabelecimento das condições homeostáticas da topografia anatômica local. Uma
das alternativas para aumento da osteogênese é por meio de uso de enxerto ósseo
particulado autólogo (Burchardt, 1983; Faour et al., 2011).
O uso desse autoenxerto comumente não induz reações imunológicas
indesejadas e também contém células osteogênicas; como resultado, é considerado um
padrão ouro na regeneração óssea (Taylor et al., 1975; Schroeder e Mosheiff, 2011).
Contudo, é relevante ressaltar que quando há uma quantidade limitada de osso
autógeno (Banwart et al., 1995; De Long et al., 2007), a escolha da área doadora do
enxerto ósseo deve tomar por base a forma do defeito a ser reconstruído, as condições
locais e sistêmicas do paciente, a habilidade técnica do cirurgião (Rocha et al., 2015)
e a quantidade de osso disponível para suprir a necessidade do leito receptor, antes da
eleição da área doadora (Junqueira e Carneiro.,1995). Além do mais, seu acesso
requer práticas cirúrgicas que comumente aumentam o quadro de morbidade ao
paciente. Diante desta premissa, novas alternativas que visem à regeneração óssea
vem sendo inquiridas no intuito de promover maior neoformacão óssea, sem
promover morbidades a estruturas adjacentes ou à distância (Amaral, 2013).
Dentro desta perspectiva, uso de análogos hormonais sintéticos que possam
modular diretamente ou indiretamente o remodelamento ósseo, proporcionando maior
2
atividade blástica, bem como atuar em sintonia com o metabolismo da homeostase do
cálcio parecem constituir uma alternativa plausível e atraente para a recuperação ou
defeitos ósseos segmentares e críticos (Aggarwal e Zavras, 2012; Li et al., 2013;
Tokunaga et al., 2011).
Corroborando com este ponto de vista, o paratormônio (PTH) é considerado
um hormônio chave na regulação da homeostase do cálcio e fósforo e na renovação
óssea (Giovanini et al.,2018). Sua função primordial é sustentar os níveis normais de
cálcio sérico, aumentando a direta absorção de cálcio renal, e manter níveis ótimos de
fosfato. (Stanislaus et al., 2000).
A ação positiva da sinalização do PTH no osso é mediada por um receptor
acoplado à proteína G, denominado receptor-1 do PTH (PTH1R). Desta forma, a
interação PTH/PTH1R estimula a ativação mediada por Gas da adenilato ciclase, que,
por sua vez, parece aumentar a atividade de fatores de crescimento que atuam
diretamente sobre o metabolismo ósseo, que inclui o fator de crescimento semelhante
a insulina-1 (IGF-1) e fator de crescimento fibroblástico-23 (FGF-23) (Gracitelli et
al., 2002).
O IGF-1 é um dos principais reguladores da diferenciação e proliferação de
osteoblastos. Além do mais, este fator de crescimento promove ativação de uma via
metabólica que pode estimular a atividade da fosfatase alcalina bem como regular a
atividade de proteínas osteodiferenciadoras, como RUNX2, Osteoprotegerina e
osteocalcina (OC) (Kanbur et al., 2005, Tiago et al., 2010, Yao et al., 2008).
Em contrapartida, o Fator de Crescimento de Fibroblastos-23 (FGF23) é uma
quimiocitocina hormonal sintetizada por células ósseas. Este fator de crescimento age
como regulador endócrino aos circuitos do metabolismo mineral, controlando níveis
3
orgânicos de cálcio, fosfato e vitamina D. Como resultado controla e diminui os
efeitos deletérios proporcionados por um desequilíbrio iônico. Ainda age como um
fator proliferativo, aumentando o contingente celular em locais de reparo, à medida
em que também age no controle da matriz extracelular mineral, o que proporcionam
novas evidencias da sua importância durante a osteogênese (Oliveira et al., 2010;
Wöhrle et al., 2011).
Diante do exposto o objetivo desse estudo é mensurar a expressão
imunoistoquímica do IGF-1, FGF-23 e Osteocalcina em defeitos criados
artificialmente em calvária de ratos tratados com esponja de colágeno embebidas ou
não em PTH e membrana de cortical bovina, pensando ter o grupo com PTH uma
maior osteocondutividade associada a expressão de IGF-1, Osteocalcina e FGF-23.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
O reparo ósseo constitui um processo complexo e constitui um evento de suma
importância uma vez que é necessário para restabelecimento de um tecido mais
próximo do original e que também possa proporcionar funções e homeostase de forma
adequada (Amadei et al., 2006; Nakamura et al.,2007)
A duração do reparo bem como todo o processo de consolidação da fratura é
dependente de vários parâmetros intrínsecos e extrínsecos inerentes ao paciente, e a
recuperação completa pode levar vários meses quando ocorre em local de osteo-
comprometimento não crítico. Em áreas de significativa perda tecidual, em especial
em topografias de perda óssea, um reparo adequado não se perfaz, proporcionando
uma neoformação cicatricial deficiente (Nyary e Scammel, 2015).
Portanto, uma terapêutica farmacológica que proporcione uma atividade
osteocondutora e osteoindutora no defeito ósseo, sem promover morbidades na
requisição de áreas doadoras de osteoenxertos torna-se necessário. Dentro desta
proposta, o uso do análagos hormonais, especialmente os que atuam no metabolismo
do osso e fosfato, parecem ser uma alternativa plausível e atraente (Mendes, 2006).
O paratormônio (PTH) é um peptídeo composto de 84 aminoácidos, e é
sintetizado e secretado pelas células principais- não oxínticas- das glândulas
paratireoides (Stanislaus et al., 2000) .
Embora seja considerado um hormônio de ação complexa e que pode nos
proporcionar tanto atividade anabólica (blástica) quanto catabólica (clástica) no tecido
ósseo. (Li et al., 2013; Aggarwal e Zavras, 2012; Takunaga et al., 2011; Yun et al.,
2010). A literatura nos indica que quando a administração de PTH ocorre de forma
intermitente e consecutiva, seus efeitos parecem estimular a atividade osteogênica,
5
bem como estimular a propriedade osteocondutora do local do defeito ósseo (Bracco
et al.,2003). Este efeito proporciona áreas de reserva do cálcio não iônico em forma
de matriz, condição que é sinequanon ao aumento da formação óssea local. Esse
princípio nos fornece níveis de evidencia de que o uso do PTH é uma alternativa
plausível e considerada para a reconstituição do metabolismo ósseo em pacientes que
sofrem de osteopenia ou osteoporose, ou mesmo para recompor áreas perdidas por
diversas condições como cistos, neoplasias, fraturas patológicas (Wojda, 2018;
Alkhiary et al., 2005, Andreassen et al., 1999; Kuroshima et al.,2013; Mair et
al.,2009).
Consoante a essa perspectiva, o tratamento intermitente com uso de PTH foi
posto a prova em modelos experimentais com osteoporose, provocada por salpingo-
utero-ovariectomia (OVX). No decorrer da pesquisa, os autores verificaram que o uso
do PTH incitou um aumento recuperação da massa óssea e aumento da resistência
mecânica. Estes efeitos anabólicos estão em antítese com as ações catabólicas
observadas após a exposição contínua ao PTH (Armamento-Villareal et al., 1997).
Para tratamento, o análogo comercial do PTH (Forteo) parece ser mais
comum. Esse é um hormônio polipeptídico sintético que contém o fragmento de 1 a
34 aminoácidos do PTH recombinante humana (rhPTH), que tornou-se alternativa
clínica para o tratamento da osteoporose. Quando administrado uma vez ao dia em
pacientes com osteoporose, estimula a formação de osso esponjoso, aumenta a
densidade mineral óssea (DMO) e reduz o risco de fratura corroborando com os
resultados demonstrados na pesquisa do parágrafo anterior (De oliveira et al., 2003).
Um dos estudos pioneiros para análise da função do PTH na osteoformação
pós fratura foi realizado por Andreassen et al. (2000). Esses autores investigaram os
efeitos do PTH (Forteo-1-34) em doses de 60 e 200μg/kg/dia para averiguação de
6
provável formação de calos ósseos em fraturas fechadas de tíbia criadas
artificialmente em ratos. Diante dos experimentos, os autores evidenciaram aumento
na dimensão de calo, volume de calo externo e densidade mineral de calo ósseo
neoformado no 20 o dia em espécimes que receberam maior dose do análogo do PTH
(200μg/kg/dia), enquanto os espécimes que haviam recebido a menor dose
apresentavam um calo ósseo evidente apenas no 40 o dia, período em que ainda não
evidenciava um calo ósseo no controle. Dentro dos limites do estudo os autores
concluíram a importância de uma terapêutica PTH em fraturas não segmentares.
Ainda acrescentaram que a eficiência do PTH poderia estar condicionada a relação
ação blástica e dose dependente.
Em estudo similar Ejersted et al. (1993), mostrou que doses baixas de PTH
(30 μg/kg/dia) também são eficazes em melhorar a consolidação da fratura quando
comparado a um grupo controle. Esses autores descrevem que a significância dos
resultados começam a aparecer por volta da 3ª semana de análise. Para tal conclusão
os autores respaldaram suas evidencias nos espécies tratados com PTH por meio de
uso de mensurações por força de tração óssea (grupo PTH mostrou melhora +35%
quando comparado a um controle sem uso terapeutico), densitometria óssea (melhora
em +21%) e volume de cartilagem ( melhora em +82%) nos locais da fratura. Estes
resultados estão em concordância com as descobertas anteriores de Holzer et al.
(1999). Esses autores verificaram que em período de 3 semanas pós tratamento
intermitente com 80 μg/kg de PTH (aa 1–34) em ratos, as áreas de fraturas do fêmur
do animal mostravam aumento da área do calo em 45%, resistência óssea em +25% e
aumento de densitometria óssea em 29%. Adiciona-se aos resultados deste estudo,
que na quinta semana, o efeito na consolidação óssea, conforme determinado pelos
7
parâmetros acima mencionados também foram evidenciado quando alguns espécimes
foram submetidos a menores doses (5 e 30 μg/kg/dia).
O uso do PTH foi posto a prova também em áreas de defeitos críticos. Nesse
sentido, uma osteotomia craniana de tamanho crítico foram criados em 42 ratos
machos por Auersvald et al. (2017). Neste estudo o PTH foi inserido junto a um
carreador de colágeno e coberta com membrana cortical bovina. Após eutanásia em
15 e 60 dias os autores verificaram que os espécimes que receberam PTH exibiu uma
porcentagem significativamente maior de formação óssea em comparação ao controle,
tanto em 15 quanto em 60 dias, corroborando com a perspectiva de que o PTH pode
exercer seus efeitos osteoestimulador também em áreas de descontinuidade óssea.
Embora os resultados apresentados sejam de caráter promissor, fatores
intermediários e imuno marcadores que possam nos dar evidenciam de como o PTH
coordena e estimula a osteoneogenese ainda são incertos.
Nesse caminho, Esen et al.(2015), verificaram que a ação do PTH na
osteogênese advém de da capacidade do PTH em estimular o fator de crescimento
semelhante a insulina (IGF-1).
O IGF1 é um hormônio polipeptídico implicado na diferenciação celular,
proliferação e apoptose. O IGF1 é principalmente transportado no sangue dentro de
um complexo ternário com a proteína 3 de ligação ao IGF (IGFBP3). Este complexo
estabiliza o IGF1 de tal forma que a sua depuração é reduzida e o seu fornecimento às
células alvo seja prolongado (Boguszewski et al., 2016)
Em células osteoprogenitoras, a indução celular via IGF-1 parece ser direta e
promove uma cascata de eventos que finda na diferenciação osteogênica. O efeito
inicia-se quando o IGF-1 interage a seu receptor, o qual é autofosforilado
8
intracelularmente no domínio da quinase permitinado trasncrição de proteinas
gênicas, entre elas, o BMP-2 e -9, o Runx e a fosfatase alcalina (Rico-Llanos et al.,
2017).
Além do mais, IGF-1 também parece favorecer a osteogenese por meio de sua
interação com o metabolismo do cálcio. Tem sido demonstrado que o IGF-1 aumenta
a atividade da 1α-hidroxilase que é uma enzima que promove hidroxilação da inerte
25-hidroxivitamina-D, cujo resultado é sua hidroxilação, cujo resultado é a
modificação estrutural da vitamina em sua forma ativa, agora com quimioconstrição
em 1,25-diidroxivitamina D (DiMeglio e Imel, 2014). É relevante ressaltar que a
vitamina D ativa é bem conhecida ser um captador de cálcio sérico nos enterócitos,
contribuindo não apenas para aumento de cálcio no sangue mas contribuindo também
para que esse ion possa ligar-se ao fosfato para formar a reserva fosfato de cálcio, que
em suma é o alicerce da matriz óssea (Witkowska-Sdek et al., 2018)
É necessário adicionar que o envolvimento nas ações regulatórias na
homeostase do cálcio e fosfato também envolve o fator de crescimento fibroblástico
23 (FGF-23). (DiMeglio e Imel, 2014; Wöhrle et al., 2011).
O FGF-23 é um peptídeo que exercem efeitos pleiotrópicos em uma gama de
processos biológicos, incluindo desenvolvimento, organogênese e metabolismo
celular. É sintetizada por diversas células no organismo como intestino delgado,
fígado e osso, denotando sua atividade endócrina a distancia, bem como atividade
parácrina no metabolismo ósseo (Hu et al., 2013; Wohrle et al., 2011; DiMeglio e
Imel, 2014)
Tal como a osteocalcina, o FGF-23 parece ser um genuíno hormônio
endócrino osteogênico uma vez que seu sítio principal de secreção é por ativação dos
9
osteócitos jovens e maduros. Uma vez secretados, o FGF-23 e atua no rim à fim de
promover excreção de Pi na urina (fosfatúria) e supressão da síntese ativa de vitamina
D (1,25-dihidroxivitamina D3 ou calcitriol) (David et al., 2013; Oliveira e Moyses,
2010; DiMeglio e Imel, 2014).
Em contramão a osteoneogenese, o FGF-23 por si só parece ser um inibidor da
mineralização. Wang et al. (2008), mostraram que a superexpressão a do FGF-23 em
células calvárias de ratos in vitro promoveu inibição da mineralização óssea
independente de seus efeitos sistêmicos sobre o fósforo.
O anticlímax do FGF-23 ainda não é bem estabelecido, contudo há evidências
que sua via parece estar intimamente interligada também ao PTH, uma vez que
paratormônio e FGF-23 são contra regulados, o aumento do PTH induz a FGF-23,
mas quando em hipercalcemia e hiposfatemia, as células principais do paratireoide
parecem ser inibidas pelo fator de crescimento FGF-23 por meio do aparecimento de
um receptor FGF-23 específico, denominado de Khloto (Clinkenbeard, 2016; Martin
et al., 2012; Hu et al., 2013; Martin et al., 2012; Wöhrle et al., 2011). É relevante
ressaltar aqui, que este efeito ocorre em situações usuais, e em regulação de
retroalimentaçãoo negativa, mas nenhuma evidencia da correlação de administração
de PTH, correlacionando a imunopresença de IGF-1 e FGF-23 são abordadas na
literatura.
10
Osteocalcina em defeitos ósseos críticos tratados com esponja de colágeno embebida
ou não em PTH e membrana de cortical bovina ,
11
MATERIAIS M S
4.1 Delineamento experimental
Foram utilizados 28 ratos machos (Rattus norvegicus, albinus, Wistar), com idade
variando 3 e 5 meses, pesando em média 387 g provenientes do biotério da
Universidade Positivo Curitiba-PR. Os animais receberam ração comercial (Presence
Ratos e Camundongos, São Paulo, São Paulo, Brasil) e água filtrada ad libitum.
Durante todo o período experimental, as condições ambientais de luz, temperatura e
umidade das salas foram controladas em painel digital de maneira a manter o
fotoperíodo de 12 horas, com a temperatura variando de 18 a 22°C e umidade de 65%.
Os animais foram aleatoriamente divididos em 2 grupos: no Grupo E
(esponja/controle), os defeitos foram preenchidos com esponja de colágeno
hidrolizado e cobertos com membrana de cortical bovina, no Grupo PTH
(paratormônio/teste) os defeitos foram preenchidos esponja de colágeno hidrolizado
embebida em PTH e cobertos com membrana de cortical bovina (Tabela 1). Os
grupos foram subdivididos em dois para eutanásia com 15 e 60 dias de pós-operatório
(Auersvald et al., 2017).
Tabela 1: Grupo dos animais com os respectivos tempos experimentais e tratamento proposto.
GRUPOS 15 dias 60 dias Tratamento
GRUPO E 7 espécimes 7 espécimes Esponja de colágeno + membrana de cortical bovina
GRUPO PTH 7 espécimes 7 espécimes Esponja de colágeno embebida em PTH + membrana de
cortical bovina
4.2 Procedimento Cirúrgico
Para a realização dos procedimentos cirúrgicos experimentais, os animais foram
12
com oxigênio e isoflurano 3L/min (Cristália, Itapira, SP, Brasil) e posteriormente
anestesiados por injeção intramuscular na parte posterior da coxa com xilazina 10
mg/kg (Vetbrands, Paulínia, SP, Brasil) e quetamina 80 mg/kg (Vetbrands, Paulínia,
SP, Brasil). A anestesia foi mantida pela vaporização de isoflurano (Cristália, Itapira,
SP, Brasil) por máscara facial, caso fosse necessário. O procedimento cirúrgico foi
executado por um único operador treinado e calibrado.
Foi realizada incisão em forma “U” com lâmina de bisturi n.o 15c (Advantive,
Xishan City, China) para acesso cirúrgico na região da calvária e um retalho de
espessura total foi levantado em direção posterior. Um defeito de tamanho crítico
(DTC) de 5mm de diâmetro, transósseo, (Schmitz e Hollinger, 1986) foi criado por
meio de uso de uma trefina (Neodent, Curitiba, PR, Brasil) acoplada em um contra
ângulo de implante (20:1, Kavo, Joinville, SC, Brasil), sob irrigação abundante com
solução salina estéril. Foi realizado um defeito em calvária em cada animal,
totalizando 28 defeitos ósseos. O defeito foi centralizado entre a sutura sagital
mediana, 1 mm anterior ao osso occipital.
Nos animais do grupo E, o defeito foi preenchido com esponja de colágeno
hidrolizado (Hemospon, Technew, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) de 5mm de diâmetro
que foi cortada com a própria trefina para que o tamanho fosse compatível com o do
defeito, e em seguida foi coberto com membrana de cortical bovina (GenDerm,
Baumer, São Paulo, SP, Brasil), cortada no tamanho de 8x8mm, para que cobrisse
totalmente a esponja e o defeitos. No grupo PTH, o defeito foi preenchido de forma
similar ao grupo E, porém, a esponja foi embebida com 20µg de PTH (Fortéo,
Indianápolis, Indiana, Estados Unidos)
13
Os tecidos foram reposicionados e suturados com fio de seda 4-0 (Ethicon),
com 7 pontos simples: um ponto central, um ponto em cada extremidade do U
(incisão) e dois pontos no meio do ponto central e do ponto da extremidade
Como medicações pós-operatórias, os animais receberam pentabiótico 24 UI
intramuscular (0,1ml) e morfina 0,1ml subcutânea, imediatamente após a cirurgia.
Durante 3 dias receberam paracetamol dissolvido em água (20 gotas/400ml). Ficaram
3 animais em cada caixa até o período de eutanásia (Auersvald et al., 2017).
4.3 Eutanásia
Os animais foram eutanasiados aos 15 e 60 dias de pós-operatório, por meio de
câmara de gás (CO2) por 5 a 10 minutos. Após a eutanásia, a área original dos
defeitos cirúrgicos em calvária e os tecidos circunjacentes foram removidos em bloco.
Estes foram fixados em formaldeído 10% por 24 horas. As peças foram utilizadas
para fazer a análise imunohistoquímica.
4.4 Processamento tecidual
processamento laboratorial. Após a fixação (10% em formaldeído), os espécimes
foram lavados em água corrente e colocados em solução de ácido fórmico a 20% para
a descalcificação.
Após a descalcificação, os blocos dos defeitos em calvária foram seccionados
ao meio, paralelamente a sutura sagital mediana, pela técnica de macroscopia e
colocados em cassetes. Para o processamento histotécnico, as peças passaram por uma
sequencia de 6 tubos de álcool absoluto etílico, 3 tubos de xilol P.A. 100% e 3 tubos
14
de parafinas histológicas. No total, as peças passaram por 12 tubos e o processo
demorou 12 horas. Após a hidratação, as peças foram incluídas em parafina a 65º C
onde foram colocadas em moldes e para assim fundir a parafina em cassetes com os
espécimes cortados com o centro do defeito para baixo. Para a confecção das lâminas,
foram realizados cortes seriados longitudinais, com 5 μm de espessura,iniciados a
partir do centro do defeito cirúrgico original.
4.5 Imunohistoquímica
Para a detecção das proteínas foi realizada a técnica imunohistoquímica por meio
do método da streptoavidina-biotina imunoperoxidase, obtendo cortes histológicos
seriados de 3 µm de cada espécime emblocado em parafina (Sigma Chemical CO., St
Louis, MO, USA). As lâminas foram incubadas em solução de pepsina 1%, pH 1.8,
em estufa à 37º C por 45 minutos. Após a lavagem das lâminas em água destilada,
seguiu-se o bloqueio da peroxidase endógena através de solução de peróxido de
hidrogênio a 3%. Os cortes foram submetidos à rápida incubação em solução tampão
PBS (solução tampão fosfato) na concentração de 0,05 M e pH 7,4. A seguir, as
secções foram incubadas com anticorpo anti IGF-1, FGF-23 e osteocalcina durante 18
horas (overnight) a 4º C, em câmara úmida com fator de diluição respectivamente de
1:100, 1:1000 e 1:200 em solução de PBS, pH 7,4, acrescido de albumina bovina a
1% contendo azida sódica a 0,1% (BSA- Biotest S/A, São Paulo, Brasil).
Como controle negativo, foram utilizados cortes dos espécimes incubados
com isótopo policlonal de Imunoglobulina G de coelhos incubados por 10 minutos
como se fosse o anticorpo primário. Para a incubação do anticorpo secundário e
complexo terciário (strepto avidina biotina com peroxidase) foi utilizado o “kit
LSAB” ( AK número K , 690) segundo instruções do fabricante. ssas etapas
foram realizadas em câmara úmida durante 30 minutos à temperatura ambiente. Para
15
revelar a reação, as lâminas foram incubadas em 300 mg do cromógeno
diaminobenzidina (3,3-diaminobenzidina, Sigma Chemical CO., St Louis, MO, USA)
em 100 ml de tampão PBS, pH 7,4, previamente filtrados e ativados sob indução de
600 µl de H2O2 a 6%, na temperatura ambiente, por 3 minutos em câmara escura.
Após a incubação, as lâminas contendo os cortes foram lavadas em água corrente e,
posteriormente, contra-coradas com hematoxilina de Mayer por 10 minutos. As
lâminas contendo os cortes então foram desidratadas em bateria ascendente de etanol
durante 5 minutos cada, seguida de diafanização em xilol e montagem com Permount
(Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA) para análise em microscópio de luz
(Verbicaro et al., 2015; Schroeder et al., 2016; Giovanini et al., 2018).
4.6
Os resultados obtidos foram submetidos à análise descritiva e estatística. A
avaliação estatística foi realizada utilizando o programa Statistical Packger for Social
Science ® - (SPSS; version 18.0; SPSS inc. Chicago, IL – USA), com intervalo de
confiança de 95%. A análise da normalidade foi por meio dos testes de Shapiro-Wilk,
e para a comparação das variáveis ordinais entre os grupos, foi utilizado o teste de
Kruskall-Wallis com p<0.05 para análise da significância entre os grupos.
16
4. RESULTADOS
4.1 Imunohistoquímica
Abaixo estão o padrão de distribuição da imunolocalização das proteínas IGF-
1, FGF- 23 e osteocalcina, apresentados nas figuras 1, 3 e 5. Os resultados quantitavos
da imunohistoquímica estão apresentados nas figuras 2, 4 e 6.
4.2 IGF-1
Grupo E (esponja/controle)– Em todos os casos analisados foi verificada a presence
da proteina IGF-1. Aos 15 dias pós operatório, a presença do IGF-1 foi discreta e
localizava-se ao redor do tecido ósseo que compunha as paredes do leito cirúrgico.
Não foi obervado a presença da proteina IGF-1 no tecido colagenico depositado no
processo de reparo. Aos 60 dias pós operatório o padrão da imunoexpressão foi
similar. Embora seus valores absolutos fossem maior quando comparado aos 15 dias,
não observamos diferença estatistica no IGF-1 entre os tempos analisados.
Grupo PTH (paratormônio/teste) - A imunopresença do IGF-1 nos espécimes que
receberam PTH foi intensa aos 15 dias pós operatório. A imunoexpressão do IGF-1
foi detectada tanto nas áreas que circundavam o leito ósseo, em células osteoblasticas,
quanto em matriz e células fusiformes que compunham o tecido conjuntivo denso
reparador. Este padrão permaneceu aos 60 dias pós cirurgico, mas seus valores
decairam a medida em que a matriz ossea periférica foi sendo depositada no defeito.
17
Figura 1. Immunolocalização do IGF-1 nos espécimes. A- revela a imunolocalização da proteína no grupo controle em 15 dias, Verificar (seta) a
imunopositividade restrita a área óssea. B- controle aos 60 dias, nota-se o mesmo padrão, embora haja discreta deposição de matriz óssea. C e D- demonstra a intensa positividade do IGF-1 no grupo que recebeu PTH. Verificar a intensa deposição do fator de crescimento em 15 dias onde a imunolocalização era
visível perifericamente à matriz ossea remanescente e depositada (setas), quanto em matriz extracelular e contingente celular fusiforme (Chevron). Em D
verificar a perda da immunoexpressão do IGF-1 que passa a se concentrar peritrabecular.
Grupo E (esponja/controle) Grupo PTH (paratormônio/teste)
15 dias
60 dias
Figura 2. Demonstra gráfico boxplot, revelando mediana e valores mínimos máximos, e
percentis para cada espécime para o percentual de IGF-1. C = Grupo E (esponja/controle) e PTH = Grupo PTH (paratormonôni/teste).
19
4.3 FGF-23
Grupo E (esponja/controle) - Aos 15 e 60 dias pós operatório, a presença do FGF-23
foi intensa e difusa e exibiu o mesmo padrão para os dois tempos analisados. O FGF-
23 foi expresso em células osteoblasticas que circundavam o tecido ósseo que
compunha as paredes do leito cirurgicos, como também nas fibras colágenas e
escassas células fibroblasticas que compunham o tecido reparador.
Grupo PTH (paratormônio/teste) - O padrão de imunoexpressão do FGF-23 foi
similar ao grupo controle, tanto no padrão de expressão, como nos valores percentuais
qualitativos, como mostra a figura 4.
20
Figura 3. Immunolocalização do FGF-23 nos espécimes. A- revela a imunolocalização da proteína no grupo controle em 15 dias, Verificar (seta) a
imunopositividade na area ossea (seta) e exuberante immunopositividade na matriz extracelular (chevron). Notar também que o padrão de distribuição do FGF-23 permaneceu similar no controle em 60 dias (B), bem como no grupo PTH aos 15 (C) e 60 dias (D)
Grupo E (esponja/controle)
Grupo PTH (paratormônio/teste)
Figura 4. Demonstra gráfico boxplot, demonstrando mediana e valores mínimos máximos, e
percentis para cada espécime para o percentual de FGF-23. C = Grupo E (esponja/controle) e
PTH = Grupo PTH (paratormonônio/teste).
5.4 Osteocalcina (OC)
Grupo E (esponja/controle) - Tanto aos 15, quanto aos 60 dias pós operatório, a
preseça da OC foi discreta. A imunoexpressão da proteína ocupava entre uma a duas
camadas de células peri óssea, seja na área do leito cirurgico remanescente da ciurgia,
quanto no discreta matriz óssea neo formada nas bordas do defeito.
Grupo PTH (paratormônio/teste) - O padrão usual da imunoexpressão peri matriz
óssea da OC também foi identificado nos espécimes que receberam a embebição de
PTH. Contudo, diferentemente dos espécimes livre do PTH, a imunolocalização da
OC foi difusa e ocupou várias camadas de osteoblastos que extendiam-se a matriz
extracelular depositada no processo de reparo.
23
Figura 5. Imunolocalização do Osteocalcina nos espécimes. A- revela a imunolocalização da proteína no grupo controle. Verificar em A a imunopositividade
na área óssea (seta) em 15 dias, e discreta imunopositividade aos 60 dias (B). Notar o padrão de distribuição intensa da OC no grupo PTH aos 15 (C) e 60 dias (D).
Grupo E (esponja/controle)
Grupo PTH (paratormônio/teste)
Figura 6. Mostra gráfico boxplot, demonstrando mediana e valores mínimos máximos, e
percentis para cada espécime para o percentual de OC. C = Grupo E (esponja/controle) e PTH = Grupo PTH (paratormonôni/teste).
25
5. DISCUSSÃO
Há inúmeras evidências que o uso sist mico e de forma intermitente do
análogo do PTH pode favorecer a osteogênese, osteocondução e aumentar a
deposição de matriz ósseo no leito cirúrgico onde o reparo sseo se faz necessário
(Tsunori et al., 2015a; Tsunori et al., 2015b; Yun et al., 2010). Contudo, estudos que
nos forneça dados substanciais sobre a administração local em dose única,
principalmente associada a uma esponja de colágeno são escasssos. Um único estudo
foi realizado por Auersvald et al (2017) que demonstraram que por análise
microtomográfica e histomorfológica que o uso da esponja de colágeno associada ao
PTH encorajaria a deposição de matriz óssea.
De acordo com Bracco et al (2003) a administração intermitente de PTH
promove um aumento rápido e prolongado da remodelação óssea e considera o PTH
(1-34) uma medicação segura, com freqüência pequena de eventos adversos, os quais
desaparecem após a descontinuação do tratamento, sendo uma medicação de ação
anabólica no osso quando administrada via subcutânea na dose de 20µg diariamente.
Aumentando a densidade mineral, a massa e a conectividade óssea.
Partindo dessa premissa, aqui averiguamos não só a quantificação de matriz
óssea depositada na área de defeito, mas também realizamos a análise
imunohistoquímica do IGF-1, FGF-23 e Osteocalcina para compreender o efeito
biológico no reparo da esponja de colágeno associada ou não à embebição de PTH.
Os resultados obtidos aqui demonstraram que houve presença das três proteínas
imunomarcadas tanto aos 15 quanto aos 60 dias de eutanásia.
A imunolocalização da proteína IGF-1 apresentou difença estatística
significante no grupo E e no grupo PTH quando comparados aos 15 dias. A proteína
26
FGF-23 não apresentou diferença estatística relevante em nenhum dos tempos
analisados, assim como a osteocalcina. Esses resultados nos indicam duas situações
antagônicas que devem ser analisadas e abordadas separadamente, uma em 15 dias e
outra em 60 dias, uma vez que nos permite referenciá-las como processos biológicos
distintos.
Aos 15 dias, foi evidente maior celularidade na área de defeito, e maior
deposição óssea adjacente às paredes que definiam o leito cirúrgico nos espécimes
que receberam PTH. Nesta área verificamos intensa quantidade de células osteo-
simile, e significante área maior de matriz óssea, indicando que o PTH pode mesmo
produzir um efeito osteocondutor.
No inicio do processo cicatricial houve maior deposição óssea no grupo que
recebeu PTH. Contudo, após este período a progressão da osteogênese nos espécimes
que receberam dose única do PTH parecem ter sido minimizados.
No grupo E aos 15 dias analisamos remanescentes da loja óssea e um tecido
conjuntivo denso e imunopositividade para o IGF1, e não notamos mudança na
imunomarcação aos 60 dias.
No grupo PTH aos 15 dias verificamos intensa imunomarcação IGF -1, devido a
essa proteína ter capacidade osteoindutora quando associada ao PTH, o qual é
regulado pelas proteínas de receptores de cálcio e IGF-1, nos demonstrando que o
IGF-1 esta controlando a neoformação óssea. Aos 60 dias a neoformação
praticamente se iguala ao grupo E, possivelmente pelo esgotamento do PTH.
Os grupos imunomarcados com a proteína FGF23 não apresentaram diferença
nos tempos analisados devido ao FGF 23 ser um ante osteogênico que inibe a
formação óssea e inibe o PTH através de um feedback negativo por proteína renal que
27
inibe a possibilidade da vitamina D ser usada como padrão osteoblástico. O PTH
apresenta seu efeito suprimido por causa do feedback negativo, porém quando é
colocado endógeno, como na esponja de colágeno, ele se sobrepõe a esse efeito e é
ativado pelo IGF gerando o efeito anabólico.
O mesmo padrão pode ser avaliado na imunolocalização da osteocalcina que
aos 15 dias tem muitas células osteoblasticas delineando a trabécula óssea, e tem o
decréscimo ao passar do tempo, perdendo a capacidade osteoindutora.
Esses resultados podem ser explicados por Esen et al. (2015), que verificaram
que o PTH possui a capacidade de excitar a osteoneogênese, por meio de estimulação
da glicólise aeróbica. Para tanto, há supressão da oxidação da glicose através do ciclo
do ácido tricarboxílico em células da linhagem osteoblástica. O resultado deste efeito
é uma reprogramação metabólica mediada pela sinalização de IGF-fosfatidilinositol-
3'-quinase (PI3K). Assim, a estimulação da glicólise aeróbica parece ser um
importante mecanismo sobrepujante ao efeito anabólico do PTH, via indução da
expressão do IGF-1.
Independentemente deste mecanismo, a estimulação da produção e liberação
de IGF-1 parece ser fisiologicamente relevante, porque o PTH mostrou aumentar a
IGF-1 associada à matriz óssea in vivo. Além disso, estudos mostraram que a IGF-1
foi indutora a diferenciação dos osteoblastos durante a remodelação óssea (Amadei et
al., 2006; Borba et al., 2003; Amadei et al, 2006). Assim, no organismo intacto, o
PTH pode exercer seu efeito anabólico ósseo através da síntese de IGF-1 de forma
autócrina e parácrina pelas células da linhagem osteoblástica e da liberação mediada
por reabsorção de IGF-1 da matriz óssea (Osagie-Clouard et al.,2017).
Essa hipótese torna-se plausível uma vez que quando células
28
osteoprogenitoras são submetidas aos efeitos do IGF-1, ocorre proliferação de células
osteogênicas e também modificação em sua morfologia em verdadeiros osteoblastos.
Além disso, o IGF-1 pode regular positivamente a atividade de fosfatase alcalina, a
aumentar a capacidade de mineralização e a expressão de outros marcadores
relacionados a osteoblastos como RUNX2 e osteocalcina (Rico-Llanos et al., 2017).
Esse efeito pode ser sugerido no presente estudo, uma vez que verificamos
intima correlação e imunocoexpressão de IGF-1 e osteocalcina em células espraiadas
pelo reparo. Essas condições parecem dar subsídeos e promover uma situação
sinequanon para explicar a estimulação da maior formação de matriz óssea nos nossos
espécimes, porém esse fenômeno não parece ter ocorrido em 60 dias. Neste período
temos uma expressão do IGF-1 e osteocalcina similares aos efeitos do grupo livre do
PTH em 15 e 60 dias. Assim, nesses grupos, podemos atribuir, de fato, a lenta
deposição de matriz óssea a imunoexpressão sobrepujante ao FGF-23 no tecido
conjuntivo depositado na área reparativa.
Quando utilizamos a esponja de colágeno sem PTH, verificamos pouca
quantidade de fator de crescimento IGF-1 e osteocalcina, quais foram co-localizados
apenas nas paredes ósseas que delimitavam o leito cirúrgico. Esses resultados
demonstram pouca atividade osteocondutora, com discreta progressão de matriz no
intuito de formar osso em todo defeito.
Contudo os resultados do presente estudo apoiam-se nos resultados obtidos
por Wang et al., (2008), que mostraram que a indução da expressão de FGF-23
ativada por um adenovirus em células obtidas de calvárias de ratos in vitro promoveu
a inibição da mineralização óssea, independente de seus efeitos benéficos e
independente dos fatores circulantes sistêmicos na homeostase do fosfato.
29
Esses resultados suscitam que em defeitos críticos o FGF-23 pode ser um fator
limitador, inibindo a mineralização em favor de construção de um reparo por segunda
intensão, tanto em períodos do grupo E (esponja/controle), quanto período tardio do
grupo PTH.
No grupo dependente do PTH, o que pode ser inferido é que, apesar de
coexistir uma membrana carreadora, os níveis anabólicos do PTH parecem ser
limitados, tomando assim os efeitos catabolicos sobrepujantes em 60 dias.
É um fato bem aceito que quando o PTH induz a síntese de 1,25-di-
hidroxivitamina D no rim, por mais que esta contribua com o metabolismo do Cálcio,
o FGF-23 pode inibir a secreção de PTH pelas glândulas paratireoides, suscitando um
efeito catabólico (Inda Filho e Melamed 2013; Castro, 2011).
30
7. CONCLUSÃO
Ao realizar a imunolocalização de IGF-1, FGF-23 e osteocalcina em defeitos
ósseos tratados com esponja de colágeno e membrana de cortical bovina e esponja de
colágeno embebida em PTH e membrana de cortical bovina, pode-se concluir que o
uso de PTH embebido a esponja de colágeno parece estimular a osteogênese no inicio
do reparo, porém a longo prazo devido o esgotamento do PTH, a osteocondutividade
nos espécimes é diminuído e volta a ocorrer um processo reparador por segunda
intensão.
Quando existe a coexpressão de IGF-1 com FGF-23 é possível a neoformação óssea,
em defeitos não críticos pode ser uma boa opção de tratamento, porém em defeitos
críticos não seria suficiente para uma grande regeneração óssea, sendo necessário
outro método de tratamento, como enxertos ósseos, para gerar um melhor resultado.
31
8. REFERÊNCIAS
Aggarwal P, Zavras A. Parathyroid hormone and its effects on dental tissues. Oral
Diseases. 2011;18(1):48-54.
Alkhiary YM, Gerstenfeld LC, Krall E, Westmore M, Sato M, Mitlak BH, Einhorn
TA. Enhancement of experimental fracture-healing by systemic administration of
recombinant human parathyroid hormone (PTH 1-34). J Bone Joint Surg Am. 2005
Apr;87(4):731-41
Amadei S, Silveira V, Pereira A, Carvalho Y, Rocha R. A influência da deficiência
estrogênica no processo de remodelação e reparação óssea. J. Bras. Patol. Med. Lab.
2006, vol.42, n.1, pp.5-12.
Amadei SU, Silveira VA, Pereira AC, Carvalho YR, da Rocha RF. Effect of estrogen
deficiency on bone turnover and bone repair. J Bras Patol Med Lab v. 42 n. 1 p. 5-12
fevereiro 2006
Amaral MB. Novas alternativas que visem à regeneração óssea vem sendo inquiridas
no intuito de promover maior deposição óssea, sem promover morbidades a estruturas
adjacentes ou à distância. [Tese de Doutorado]. São Paulo. Universidade de São
Paulo.;2013.
Andreassen TT, Ejersted C, Oxlund H. Intermittent parathyroid hormone (1-34)
treatment increases callus formation and mechanical strength of healing rat fractures.
J Bone Miner Res. 1999 Jun;14(6):960-8.
Andreassen TT, Skripitz R, Aspenberg P. Strong effect of PTH (1-34) on regenerating
bone: a time sequence study in rats. Send to. Acta Orthop Scand. 2000
Dec;71(6):619-24.
Armamento-Villareal R, Ziambaras K, Abbasi-Jarhomi S, Dimarogonas A, Halstead
L, Fausto A et al. An Intact N Terminus Is Required for the Anabolic Action of
Parathyroid Hormone on Adult Female Rats. Journal of Bone and Mineral Research.
1997;12(3):384-392.
Auersvald CM, Santos FR, Nakano MM, Leoni GB, de Sousa Neto MD, Scariot
R, Giovanini AF, Deliberador TM. The local administration of parathyroid hormone
encourages the healing of bone defects in the rat calvaria: Micro-computed
tomography, histological and histomorphometric evaluation.Arch Oral Biol. 2017
Jul;79:14-19.
Banwart JC, Asher MA, Hassanein RS. Iliac crest bone graft harvest donor site
morbidity. A statistical evaluation. Spine (Phila Pa 1976). 1995 May 1;20(9):1055-60.
growth factor system, and carcinogenesis Endokrynologia Polska Tom/Volume 67;
numer/number 4/2016 issn 0423–104x
Borba VZC, Kulak CAM, Catro ML. Neuroendocrine control of bone mass: myth or
reality? Arq Bras Endocrinol Metab vol.47 no.4 São Paulo Aug. 2003
Bracco OL, Kayath MJ, Vieira JG. Parathyroid hormone (1-34 PTH) for the treatment
of osteoporosis. Arq Bras Endocrinol Metab vol.47 no.3 São Paulo June 2003
Burchardt H. The biology of bone graft repair. Clin Orthop Relat
Res. 1983 Apr;(174):28-42.Clinkenbeard EL. Systemic Control of Bone Homeostasis
by FGF23 Signaling. Curr Mol Biol Rep. 2016 March 1; 2(1): 62–71
Castro LCG. The vitamin D endocrine system. Arq Bras Endocrinol
Metab vol.55 no.8 São Paulo Nov. 2011
David V, Dai B, Martin A, Huang J, Han X, Quarles L. Calcium Regulates FGF-23
Expression in Bone. Endocrinology. 2013;154(12):4469-4482.
De Long WG Jr, Einhorn TA, Koval K, McKee M, Smith W, Sanders R, Watson T.
Bone grafts and bone graft substitutes in orthopaedic trauma surgery. A critical
analysis. J Bone Joint Surg Am. 2007 Mar;89(3):649-58.
De Oliveira JHA; Bracco OL. Kayath M. Guarniero R. Teriparatida (PTH[1-34]rh):
Uma nova perspectiva no tratamento da osteoporose. Acta ortop.
bras. vol.11 no.3 São Paulo July/Aug. 2003
DiMeglio LA, Imel EA. Calcium and Phosphate: Hormonal Regulation and
Metabolism. In Basic and Applied Bone Biology. Indiada, USA. 2014, Pages 261-282
Ejersted C, Andreassen TT, Oxlund H, Jorgensen PH, Bak B, Häggblad J, Tørring
O, Nilsson MH. Human parathyroid hormone (1-34) and (1-84) increase the
mechanical strength and thickness of cortical bone in rats. J Bone Miner Res. 1993
Sep;8(9):1097-101
Esen E, Lee SY, Wice BM, Long F. PTH Promotes Bone Anabolism By Stimulating
Aerobic Glycolysis via IGF Signaling. Send toJ Bone Miner Res. 2015
Nov;30(11):1959-68.
Faour O, Dimitriou R, Cousins CA, Giannoudis PV. The use of bone graft substitutes
in large cancellous voids: any specific needs?. Injury. 2011 Sep;42 Suppl 2:S87-90.
Giovanini AF, Göhringer I, Tavella R, Linzmeyer MC, Priesnitz TF, Bonetto
LM, Resende RG, Scariot R, Zielak JC. Intermittent administration of PTH induces
the expression of osteocalcin and BMP-2 on choroid plexus cells associated with
suppression of sclerostin, TGF-β1, and Na + K
+ ATPase.
Giovanini AF, de Sousa Passoni GN, Göhringer I, Deliberador TM, Zielak JC, Storrer
CLM, Costa-Casagrande TA, Scariot R. Prolonged use of alendronate alters the
biology of cranial repair in estrogen-deficient rats' associated
simultaneous immunohistochemical expression of TGF-β1+, α-ER+, and BMPR1B.
Clin Oral Investig. 2018 Jun;22(5):1959-1971.
Gracitelli M, Vidoris A, Luba R, Lazaretti-Castro M. Paratormônio e osteoporose:
encontrando o fio da meada. Bases fisiológicas para utilização do PTH no tratamento
da osteoporose. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia.
2002;46(3):215-220.
Holzer G, Majeska R, Lundy M, Hartke J, Einhorn T. Parathyroid Hormone Enhances
Fracture Healing. Clinical Orthopaedics and Related Research. 1999;366:258-263.
Hu M, Shiizaki K, Kuro-o M, Moe O. Fibroblast Growth Factor 23 and Klotho:
Physiology and Pathophysiology of an Endocrine Network of Mineral Metabolism.
Annual Review of Physiology. 2013;75(1):503-533.
Inda Filho AJ, Melamed ML. Vitamina D e doença renal. O que nós sabemos e o que
nós não sabemos. J Bras Nefrol 2013;35(4):323-331
Junqueira, LC, Carneiro J. Histologia básica. 8. ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan; 1995.
Kanbur NO, Derman O, Kinik E. The relationships between pubertal development,
IGF-1 axis, and bone formation in healthy adolescents. J Bone Miner
Metab. 2005;23(1):76-83.
Kuroshima S, Al-Salihi Z, Yamashita J. Parathyroid hormone related to bone
regeneration in grafted and nongrafted tooth extraction sockets in rats. Implant
Dent. 2013 Feb;22(1):71-6.
Li F, Li G, Hu H, Liu R, Chen J, Zou S. Effect of parathyroid hormone on
experimental tooth movement in rats. American Journal of Orthodontics and
Dentofacial Orthopedics. 2013;144(4):523-532
Li YF, Li XD, Bao CY, Chen QM, Zhang H, Hu J. Promotion of peri-implant bone
healing by systemically administered parathyroid hormone (1-34) and zoledronic acid
adsorbed onto the implant surface. Osteoporos Int. 2013 Mar;24(3):1063-71.
Mair B, Tangl S, Feierfeil J, Skiba D, Watzek G, Gruber R. Age-related efficacy of
parathyroid hormone on osseointegration in the rat. Clinical Oral Implants Research.
2009;20(4):400-405.
Martin A, David V, Quarles L. Regulation and Function of the FGF23/Klotho
Endocrine Pathways. Physiological Reviews. 2012;92(1):131-155.
histomorphometric evaluation of heterogenous demineralized bone or compound bone
with and without bone morphogenetic protein (bmp) in rat tíbia. Revista Odontológica
de Araçatuba, 2006, v.27, n.1, p. 34-40
Nakamura S, Sato Y, Kobayashi T, Oike T, Kaneko Y, Miyamoto K, Funayama
A, Oya A, Nishiwaki T, Matsumoto M, Nakamura M, Kanaji A, Miyamoto T.
Insulin-like growth factor-I is required to maintain muscle volume in adult mice. J
Bone Miner Metab. 2018 Oct 15.
Nakamura T, Imai Y, Matsumoto T, Sato S, Takeuchi K, Igarashi K et al. Estrogen
Prevents Bone Loss via Estrogen Receptor a and Induction of Fas Ligand in
Osteoclasts. Cell. 2007;130(5):811-823.
Nyary T, Scammell B. Principles of bone and joint injuries and their healing. Surgery
(Oxford). 2015;33(1):7-14.
Oliveira R, Moysés R. FGF-23: estado da arte. Jornal Brasileiro de Nefrologia.
2010;32(3):323-331.
Osagie-Clouard L, Sanghani A, Coathup M, Briggs T, Bostrom M, Blunn G.
Parathyroid hormone 1-34 and skeletal anabolic action: The use of parathyroid
hormone in bone formation. Bone Joint Res. 2017 Jan;6(1):14-21.
Rico-Llanos G, Becerra J, Visser R. Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) enhances the
osteogenic activity of bone morphogenetic protein-6 (BMP-6) in vitro and in vivo,
and together have a stronger osteogenic effect than when IGF-1 is combined with
BMP-2. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 2017;105(7):1867-1875.
Rocha JF, De Oliveira JCS, Ramos JWN, Araujo Filho JCWP, Eduardo Sanches
Goncales ES, Hochuli-Vieira E, Carvalho PS. Enxerto ósseo mandibular,
complicações associadas às áreas doadoras e receptoras, e sobrevivência de implantes
dentários: um estudo retrospectivo. Rev Odontol UNESP. 2015 Nov-Dec; 44(6): 340-
344
Schroeder JE, Mosheiff R. Tissue engineering approaches for bone repair: concepts
and evidence. Injury. 2011 Jun;42(6):609-13.
Schroeder CC, Vieira JS, Scariot R, Zielak JC, Ribeiro GM, Deliberador TM,
Marcaccini, Giovanini AF. Platelet Rich Plasma (PRP) Produces an Atherofibrotic
Histophenotype During Craniofacial Bone Repair Due to Changes
of Immunohistochemical Expression of Erk1/2, p38α/β, Adiponectin and Elevated
Presence of Cells Exhibiting B-scavenger Receptor (CD36+). Braz Dent J. 2016 May-
Jun;27(3):243-54.
Stanislaus D, Devanarayan V, Hock J. In vivo comparison of activated protein-1 gene
activation in response to human parathyroid hormone (hPTH)(1–34) and hPTH(1–84)
in the distal femur metaphyses of young mice. Bone. 2000;27(6):819-826.
reconstructive surgery. 1975;55(5):533-544.
Tiago DM, Cancela ML, Laizé V. Proliferative and mineralogenic effects of
insulin, IGF-1, and vanadate in fish osteoblast-like cells. J Bone Miner Metab. 2011
May;29(3):377-82.
Tokunaga K, Seto H, Ohba H, Mihara C, Hama H, Horibe M, Yoneda S, Nagata T.
Topical and intermittent application of parathyroid hormone recovers alveolar bone
loss in rat experimental periodontitis. J Periodontal Res. 2011 Dec;46(6):655-62.
Tsunori K Effects of parathyroid hormone dosage and schedule on bone regeneration.
J Oral Sci. 2015 Jun;57(2):131-6.
Tsunori K, Sato S, Hasuike A, Manaka S, Shino H, Sato N, Kubota T, Arai Y, Ito
K, Miyazaki M. Effects of intermittent administration of parathyroid hormone on
bone augmentation in rat calvarium. Implant Dent. 2015 Apr;24(2):142-8.
Verbicaro T, Giovanini AF, Zielak JC, Baratto Filho F, de Araujo MR, Deliberador
TM. Osteocalcin immunohistochemical expression during repair of critical-sized bone
defects treated with subcutaneous adipose tissue in rat and rabbit animal model. Braz
Dent J. 2013 Nov-Dec;24(6):559-64.
Wang H, Yoshiko Y, Yamamoto R, Minamizaki T, Kozai K, Tanne K et al.
Overexpression of Fibroblast Growth Factor 23 Suppresses Osteoblast Differentiation
and Matrix Mineralization In Vitro. Journal of Bone and Mineral Research.
2008;23(6):939-948.
Witkowska-Sdek , Stelmaszczyk- mmel A, Majcher A, emkow U, Pyrak B. he
relationships of alkaline phosphatase and bone alkaline phosphatase to the growth
hormone/insulin-like growth factor-1 axis and vitamin D status in children with
growth hormone deficiency. Acta Biochimica Polonica. 2018;65(2).
Wöhrle S, Bonny O, Beluch N, Gaulis S, Stamm C, Scheibler M, Müller M, Kinzel
B, Thuery A, Brueggen J, Hynes NE, Sellers WR, Hofmann F, Graus-Porta D. FGF
receptors control vitamin and phosphate homeostasis by mediating renal FGF23
signaling and regulating FGF23 expression in bone. J Bone Miner Res. 2011
Oct;26(10):2486-97
Wojda S, Donahue S. Parathyroid hormone for bone regeneration. Journal of
Orthopeedic Research. 2018;36(10):2586-2594.
Yao W, Zhong J, Yu J, Warner T, Bozic T, Ye P, D'Ercole AJ, Hock JM, Lee WH.
IGF-I improved bone mineral density and body composition of weaver mutant mice.
Send to Growth Horm IGF Res. 2008 Dec;18(6):517-25.
Yun JI, Wikesjö UM, Borke JL, Bisch FC, Lewis JE, Herold RW, Swiec GD, Wood
JC, McPherson JC 3rd. Effect of systemic parathyroid hormone (1-34) and a
betatricalcium phosphate biomaterial on local bone formation in a critical-size rat
calvarial defect model. J Clin Periodontol. 2010 May;37(5):419-26.