São Paulo

2018

UNIVERSIDADE PAULISTA - UNIP

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DAS

NANOPARTÍCULAS DE PRATA SOBRE

BIOFILME – MODELO IMPLANTE DENTAL

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Odontologia da Universidade Paulista – UNIP, para

obtenção do título de Mestre em Odontologia.

MÔNICA DE ABREU PESSÔA RODRIGUES

São Paulo

2018

UNIVERSIDADE PAULISTA - UNIP

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DAS

NANOPARTÍCULAS DE PRATA SOBRE

BIOFILME – MODELO IMPLANTE DENTAL

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Odontologia da Universidade Paulista –

UNIP, para obtenção do título de Mestre em

Odontologia.

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Maristela Dutra-Correa.

MÔNICA DE ABREU PESSÔA RODRIGUES

MÔNICA DE ABREU PESSÔA RODRIGUES

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DAS NANOPARTÍCULAS DE

PRATA SOBRE BIOFILME – MODELO IMPLANTE DENTAL

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Odontologia da Universidade

Paulista – UNIP, para obtenção do título de Mestre

em Odontologia.

Aprovada em 08 de fevereiro de 2018.

BANCA EXAMINADORA

_ / /

Profa. Dra. Maristela Dutra-Correa

UNIVERSIDADE PAULISTA – UNIP

_ / /

Profa. Dra. Ivana Barbosa Suffredini

UNIVERSIDADE PAULISTA –UNIP

_ / /

Prof. Dr. Igor Studart Medeiros

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO - FOUSP

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho à minha família, sem a qual nada em

minha vida teria razão ou seria possível.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos os profissionais competentes e as pessoas

especiais que de alguma maneira contribuíram para o

desenvolvimento e realização desse trabalho.

AGRADECIMENTO ESPECIAL

Apoio: CAPES Nº1593624

“Daria tudo o que sei pela metade do que ignoro”.

René Descartes

RESUMO

As bactérias são capazes de desenvolver biofilme em vários tipos de

superfícies, e o processo da adesão bacteriana pode ser alterado pelas

características e micromorfologia dessas superfícies. Dessa forma, as

propriedades dos biomateriais podem ser direcionadas para inibir a adesão e

colonização bacteriana. A utilização da prata é uma estratégia promissora na

tentativa de se evitar a formação do biofilme, observada sua atividade

antimicrobiana. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito

antimicrobiano de um biomaterial experimental, a partir de um adesivo

ortodôntico fotopolimerizável (Orthocem UV Trace), modificado pela adição de

diferentes concentrações de nanopartículas de prata (NAg), sobre o

crescimento de biofilme (S. mutans). Inicialmente, foram avaliadas, a

rugosidade superficial dos discos de titânio, o gap entre implante/componente e

torque/destorque. Para o experimento de biofilme foram utilizados discos titânio

(5 x 2mm) com superfície tratada (óxido de Ti), sobre os quais foi aplicado o

material experimental, sendo: G1: Controle – biomaterial sem adição de NAg;

G2: 50ppm; G3: 100ppm; G4: 150ppm; G5: 200ppm; G6: 250ppm. Ao final,

foram selecionados 2 corpos de prova/grupo para MEV. Os dados não foram

normais, entretanto foram homocedásticos. Dessa forma, Tukey post-hoc

(p<0,005) foi aplicado para comparação entre os grupos (Gráfico 3). O grupo

Controle, sem adição de NAg, apresentou menor crescimento de biofilme,

enquanto que o T200ppm apresentou maior crescimento. Os grupos T100 e

150ppm foram semelhantes entre si, assim como o T50 e T250. Considerando-

se que a adição de NAg não apresentou o efeito antimicrobiano esperado e

que a razão pode ter sido a indisponibilidade dessas na superfície, permitindo o

contato direto com o biofilme bacteriano, pesquisas futuras deverão ser

conduzidas, procurando sanar estas dificuldades e buscando evidenciar o

efeito antimicrobiano das NAg.

Palavras-chave: Nanopartículas de prata. Biofilme bacteriano. Implantes

dentais. Biomateriais dentários. Streptococcus mutans.

ABSTRACT

Bacteria are able to develop biofilm on various types of surfaces, and the

process of bacterial adhesion can be altered by the characteristics and

micromorphology of these surfaces. Thus, the properties of biomaterials can be

targeted to inhibit bacterial adhesion and colonization. The use of silver is a

promising strategy in the attempt to avoid biofilm formation, observing its

antimicrobial activity. Therefore, the objective of this study was to evaluate the

antimicrobial effect of an experimental biomaterial from a photopolymerizable

(Orthocem UV Trace) orthodontic adhesive, modified by the addition of different

concentrations of silver nanoparticles (NAg), on biofilm growth (S mutans).

Initially, the surface roughness of the titanium plates, the gap between implant /

component and torque / torque were evaluated. For the biofilm experiment,

titanium (5 x 2 mm) discs with treated surface (Ti oxide) were used, on which

the experimental material was applied, being: G1: Control - biomaterial without

addition of NAg; G2: 50ppm; G3: 100ppm; G4: 150ppm; G5: 200ppm; G6:

250ppm. At the end, 2 test bodies / group for SEM were selected. The data

were not normal, however they were homocedastic. Thus, post-hoc Tukey (p

<0.005) was applied for comparison between the groups (Graph 3). The Control

group, without addition of NAg, had lower biofilm growth, while T200ppm

presented higher growth. The T100 and 150ppm groups were similar to each

other, as were T50 and T250. Considering that the addition of NAg did not

present the expected antimicrobial effect and that the reason may have been

the unavailability of these on the surface, allowing direct contact with the

bacterial biofilm, future research should be conducted, seeking to remedy these

difficulties and seeking to evidence the antimicrobial effect of NAg.

Key words: Silver nanoparticles. Bacterial biofilm. Dental Implants. Dental

Biomaterials. Streptococcus mutans.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................ 11

2 CONCLUSÃO GERAL ............................................................................ 14

REFERÊNCIAS DA INTRODUÇÃO ........................................................... 15

ANEXOS .................................................................................................... 18

11

1. INTRODUÇÃO

A cavidade oral proporciona um ambiente ideal para a formação de biofilme

de grande complexidade, uma vez que abriga mais de 700 espécies. (1)(2)(3)

Apesar dos tecidos orais possuírem um mecanismo de defesa eficiente para a

redução do biofilme – descamação epitelial (4), a vulnerabilidade dos biomateriais à

contaminação bacteriana ocorre já durante a instalação cirúrgica (5) e se mantém

devido à sua colocação transmucosa, pois parte da estrutura do implante é exposta

à cavidade oral permanentemente, e não existe uma medida efetiva para prevenir a

ligação bacteriana ao material implantado. (6)

As bactérias são capazes de desenvolver biofilme em vários tipos de

superfícies, como tecidos vivos, próteses e implantes dentais.(7)(8) A formação e a

composição da película adquirida podem variar entre as superfícies, porém têm

início com a película adesiva promovida pela saliva, que torna possível a adesão

bacteriana. (9) O acúmulo do biofilme pode acarretar o desenvolvimento de doenças

peri-implantares podendo levar à perda do implante e suas complicações.

(10)(11)(12)(13)

Recentemente, um total de 12 filos bacterianos, 123 gêneros bacterianos e

351 bactérias foram identificadas a partir da leitura do metagenoma/

metatranscriptômica salivar, sendo o gênero mais abundante o Streptococcus, que

juntamente com Prevotella e Veillonella constituem aproximadamente 70% de todos

os DNA e RNA.(14) O processo de adesão bacteriana pode ser alterado por

características das superfícies e micromorfologia dos implantes, assim como pela

energia de superfície, rugosidade e/ou propriedades químicas. Dessa forma, as

propriedades dos biomateriais podem ser direcionadas para inibir a adesão e

colonização bacteriana.(15)(16)(17) As perspectivas são promissoras em encontrar

um tratamento da superfície do titânio que impeça ou reduza a colonização

bacteriana e, ao mesmo tempo, favoreça a valiosa formação dos tecidos peri-

implantares.(18)

A prata (Ag) é apresentada como uma estratégia promissora na tentativa de

se evitar a formação do biofilme, observada sua atividade antimicrobiana. (7)(19)(20)

Ela é capaz de danificar a membrana celular bacteriana, interferir no transporte de

íons, desnaturar proteínas, inibir a respiração celular e a transcrição do DNA, mesmo

em baixas concentrações. (21)(22) É preciso observar também a sua

12

biocompatibilidade, pois na reabilitação com implantes se faz necessária a adesão

dos tecidos conjuntivos para assegurar a estabilidade óssea adequada e impedir a

penetração bacteriana. (23) Contudo, algumas dificuldades, quando da adição de

nanopartículas de prata em biomateriais odontológicos, são observadas,

principalmente, em relação à aglomeração das nanopartículas e heterogeneidade

em sua distribuição. (24)(25)

Para que essas dificuldades fossem minimizadas, foi proposta a síntese de

nanopartículas de prata funcionalizadas, diretamente no biomaterial, que apresente

características físico-químicas de forma a interagir com os componentes do implante

dental, principalmente o titânio. Do ponto de vista tecnológico, o domínio do

processo desse biomaterial com NAg poderá levar à definição de sua potencialidade

como biomaterial odontológico com efeito antimicrobiano, com a manutenção das

características físico-químicas do componente do implante dental, todavia com a

vantagem do efeito antimicrobiano propiciado pela presença das NAg.

A colonização bacteriana na interface implante/componente (gap), formado

nos sistemas de implantes de duas partes, é ainda hoje um grande desafio na

implantodontia. (2)(26) O espaço de conexão do implante com a cavidade interna do

mesmo pode atuar como reservatório para agentes patogênicos, causando

problemas biológicos. (3)(27) A comunicação bacteriana na interface

implante/componente é observada como o fator mais importante na ocorrência de

reações inflamatórias ao redor do implante, independentemente da estabilidade,

design e engenharia da conexão do implante. Desse modo, vários estudos buscam

um protocolo ideal para desinfecção e descontaminação de implantes após doenças

peri-implantares, porém poucos avaliam a eficácia de materiais para prevenir a

contaminação através do gap entre implante/pilar. Atualmente, alguns produtos já

são utilizados para desinfecção e selantes (Berutemp 500 T2, Carl-Bechem, e Kiero

Seal [polivinil siloxano (PVS)], Kuss Dental) e clorexidina (Chlorhexamed [CHX] 1%

Gel, GlaxoSmithKline).(28)(29)(30)(31)(32)

Diante dessas dificuldades, o presente estudo propôs um material que

apresenta a possibilidade de vedação do gap formado pela interface implante/pilar,

na tentativa de reduzir a contaminação peri-implantar e/ou contaminação interna do

implante, pelas propriedades antimicrobianas da prata. Com essa intenção de

aplicabilidade clínica, foi realizada a avaliação prévia da dimensão do gap formado

13

na interface, além da aferição do torque/destorque, caso haja necessidade de

alguma intervenção clínica.

Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito antimicrobiano de um

biomaterial experimental, a partir de um adesivo ortodôntico fotopolimerizável

(Orthocem UV Trace), modificado pela adição de diferentes concentrações de

nanopartículas de prata (NAg), sobre o crescimento de biofilme (S. mutans).

14

2. CONCLUSÃO GERAL

Considerando-se que a adição de NAg não apresentou o efeito antimicrobiano

esperado e que a razão pode ter sido a indisponibilidade dessas na superfície,

permitindo o contato direto com o biofilme bacteriano, pesquisas futuras deverão ser

conduzidas, procurando sanar essas dificuldades e buscando evidenciar o efeito

antimicrobiano das NAg.

15

REFERÊNCIAS DA INTRODUÇÃO

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18

ANEXOS

Figuras:

19

Fig. 4-9: Eletromicrografias do ensaio do biofilme, mostrando o Controle e os Grupos com diferentes concentrações de NAg, variando entre 50 ppm e 250 ppm . Barra= 5µm.

20

Gráficos:

Gráfico 1: Gap (µm) entre implante/componente de diferentes modelos de implantes (HE, HI e Cone

Morse. p=0,003. Letras diferentes indicam diferença estatística significante - Kruskal-Wallis.

Gráfico 2: Resultados mostraram que não houve diferença entre os grupos com o mesmo tipo de tratamento de superfície, polido (P) ou tratado (T).

21

Gráfico 3: Resultados da Densidade Óptica para o crescimento do biofilme bacteriano em função da

Concentração de NAg de 0 a 250 ppm.

22

Tabelas:

C-K O-K Si-K

50 ppm 48.17 39.6 12.23

100 ppm 48.80 41.4 9.80

150 ppm 65.13 33.11 1.76

200 ppm 51.8 39.89 8.31

250 ppm 64.19 32.76 3.05

Tabela 1- Elementos químicos identificados na leitura do EDX, demonstrando a ausência das NAgs na superfície das amostras.

Tratamento

Ângulo de Contato (θ)

Polar

(água deionizada)

Apolar

(propanotriol=glicerol)

Disco Ti Usinado 43 45

Disco Ti Polido 48 48

Disco Ti Tratado 71 71

Sem NAg 49 53

50 ppm 48 53

100 ppm 35 46

150 ppm 50 33

200 ppm 35 35

250 ppm 57 57

Tabela 2: Ângulos de contato aferidos para comparação e avaliação da energia de superfície em relação aos tratamentos de superfície e concentração de NAg.