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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E CULTURA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE CANDIDA NÃO ALBICANS DE ORIGEM

CLÍNICA

MAIZA ROCHA DE ABRANTES

NATAL/RN 2013

ii


AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE CANDIDA NÃO ALBICANS DE ORIGEM

CLÍNICA

Tese apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências da

Saúde da Universidade Federal do

Rio Grande do Norte como requisito

para a obtenção do título de Doutor

em Ciências da Saúde.

Orientador: Profa. Dra. Eveline Pipolo Milan

Colaborador: Profa. Dra. Edeltrudes de Oliveira Lima - UFPB

NATAL/RN

2013

v


AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE CANDIDA SPP DE ORIGEM CLÍNICA

Aprovada em: 06 de dezembro de 2013

BANCA EXAMINADORA:

Prfa. Dra. Eveline Pipolo Millan - UFRN (Presidente)

Prfa. Dra. Maria de Fátima Vitória Moura - UFRN (Membro Interno)

Prof. Dr. Cícero Flavio Soares Aragão - UFRN (Membro Interno)

Profa. Dra Raimunda Samia N. Brilhante - UFC - Fortaleza (Membro Externo)

Profa. Dra Hilzeth de Luna Freire Pessôa - UFPB (Membro Externo)

iv

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde

Profa. Dra. Ivonete Batista de Araújo.

vi

A Deus, à minha família e a todos os que acreditam

que a evolução do ser humano ocorre através da

busca do saber.

vii

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pela oportunidade da vida, pelo seu amor, seu sacrifício e

sua paixão por todos nós. Sem ele eu não seria nada, mas com ele me

sinto forte;

Aos meus pais, Manoel e Marluce por priorizar a educação na vida de seus

filhos. Agradeço em particular pelo amor incondicional e pelo incentivo;

Aos meus irmãos Sales, Jackeline, Maria do Socorro e Magna que sempre

foram parceiros;

A meu esposo, João José, por estar sempre ao meu lado, incentivando,

confiando e torcendo pelo sucesso desse trabalho;

Aos meus filhos, Ramon e Luiza, cuja existência é fonte constante de

aprendizagem, de inspiração e grande bênção;

Aos meus sobrinhos Samuel e Manuela que são alegrias em minha vida;

Às minhas orientadoras Profª. Dra. Eveline Pipolo Milan e Profª. Dra

Edeutrudes de Oliveira Lima pelas orientações, aprendizagem, confiança,

paciência e companheirismo. Vocês foram fundamentais para o meu

crescimento como profissional e como humano nesse processo, pois me

fizeram entender que nenhum obstáculo é intransponível quando a

necessidade de vencer supera as impossibilidades;

Aos companheiros de laboratório: Felipe Queiroga Sarmento Guerra,

Camilla Pinheiro de Menezes, Janiere Pereira, Elizabeth Cristina Gomes

dos Santos e Mariana Araújo Paulo de Medeiros por terem me ajudado na

execução dos experimentos e terem sido luz nos momentos de dúvidas;

À Profa. Dra. Zélia B. V. S. Pontes e à farmacêutica Maria de Fátima F. P.

Carvalho pela ajuda e contribuição;

Aos Professores Ivanaldo Amâncio da Silveira, Guilherme G. Chaves,

Geraldo B. Cavalcanti Jr. e Francisco Ricardo Lins Vieira de Melo, pelo

apoio e incentivo em prol da conquista dessa meta;

Agradeço em particular às Professoras Doutoras Telma Maria Araújo Moura

Lemos e Tereza Neuma de Souza Brito pelo apoio logístico na construção

desse doutorado;

viii

Aos professores, técnicos e funcionários do Programa de Pós-Graduação

em Ciências da Saúde, minha gratidão pelas grandiosas informações e

experiências adquiridas no decorrer dessa jornada;

Ao Hospital Giselda Trigueiro (HGT) e ao Hospital Pediátrico Maria Alice

Fernandes, Natal-RN, pela doação e identificação bioquímica do Banco de

Leveduras, em especial às farmacêuticas Ana Cristina Santos Fernandes e

Maria Narriman Guimarães Goveia;

A todos vocês, o meu apreço, e que Deus os abençoe sempre.

ix

“Ao longo da torrente, em cada uma de suas margens, crescerão

árvores frutíferas de toda espécie, e sua folhagem não

murchará, e não cessarão jamais de dar frutos: todos os meses

frutos novos, porque essas águas vêm do santuário. Seus

frutos serão comestíveis e suas folhas servirão de remédio.”

(Eze. 47:12)

x

RESUMO

Candidíase é um problema de importância crescente, devido o aumento do

número de indivíduos imunocomprometidos e o surgimento de cepas

resistentes aos antifúngicos convencionais. É de fundamental importância a

busca por novos agentes antifúngicos mais eficazes, menos tóxicos, sendo os

óleos essenciais (OEs) excelentes alternativas para esse propósito. Esse

estudo investigou a atividade biológica do OE de Mentha spicata L. sobre

Candida guilliermondii de origem anal e vaginal. Para tanto foram determinadas

a Concentração Inibitória Mínima (CIM), Concentração Fungicida Mínima

(CFM), cinética do crescimento das leveduras (Time-Kill), alterações

micromorfológicas (técnica do microcultivo em câmara úmida) e investigação

do mecanismo de ação antifúngico, utilizando o bioensaio do sorbitol. O OE de

M. spicata foi obtido pelo processo de extração por destilação a vapor. Na

análise fitoquímica desse óleo foi observada a presença de carvona com

84,32%, seguida pelo limoneno (13,70%) e traços de iso-dihidrocarvona

(0,82%). Os resultados da análise da CIM variou entre 32 e 128 μg/mL. A CFM

variou entre 64 e 1024 μg/mL. Na avaliação da ação de OE e da nistatina

100UI/mL, o antifúngico padrão apresentou o efeito fungicida a partir de 4

horas e para OE de M. spicata foi observado efeito fungistático na CIM, CIMX2

e CIMX4 frente às cepas avaliadas. O OE de M. spicata apresentou forte

atividade antifúngica contra as cepas de C. guilliermondii, promovendo

alterações micromorfológicas visíveis por microscopia óptica, nas

concentrações testadas (CIM, CIMx2), resultado semelhante ao que se

observou com a nistatina (100UI/mL). Na investigação do mecanismo de ação

antifúngico foi constatado que houve alteração da CIM na presença de sorbitol,

com elevação dos valores quatro vezes maior que a concentração inicial, o que

indica que os componentes desse OE apresentam ação direta sobre a parede

celular das leveduras. Conclui-se que o OE de Mentha spicata é um potencial

agente terapêutico no tratamento de candidíase.

PALAVRAS CHAVES: Antifúngicos, Candidíase, Óleos voláteis, Produtos

naturais, Sorbitol.

xi

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

PNPIC Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares 14

SUS Sistema Único de Saúde 14

PNPMF Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos 14

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária 14

OMS Organização Mundial de Saúde 15

ISO International Standard Organization 15

OEs Óleos Essenciais 15

CG Cromatógrafo Gasoso 19

EM Espectrômetro de Massa 19

CIM Concentração Inibitória Mínima 19

CFM Concentração Fungicida Mínima 19

DCF Departamento de Ciências Farmacêuticas 20

CCS Centro de Ciências da Saúde 20

UFPB Universidade Federal da Paraíba 20

UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte 20

LUDEM Laboratório Unificado de Desenvolvimento e Ensaios de Medicamentos

20

CECON Centro de Controle e Produtos para Diagnósticos Ltda 21

ASD Ágar Sabouraud Dextrose 21

DMSO Dimetilsulfóxido 22

CSD Caldo Sabouraud Dextrose 22

HGT Hospital Giselda Trigueiro 23

YPD Extrato de levedura, Peptona, Dextrose 23

CHROMagar Ágar Cromogênico 24

UFC Unidades Formadoras de Colônias 24

A Origem Anal 29

V Origem Vaginal 29

M Molar 30

PM Peso Molecular 31

xii

LISTA DE FIGURAS, QUADROS E TABELAS

Quadro 1. Óleos essenciais utilizados no “screening” para determinação

da atividade antifúngica sobre cepas de Candida spp.

21

Tabela 1. Laudo técnico do óleo essencial de M. spicata (hortelã-

peluda)

22

Figura 1. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) - Ellof (1998)

26

Figura 1. Determinação da concentração fungicida mínima (CFM) - Ellof (1998)

27

Figura 2. Efeito do óleo essencial sobre o tempo de morte das leveduras - Klepser et al. (1998)

28

Figura 3. Efeito do óleo essencial de M. spicata L. sobre a morfogênese de cepas de C. guilliermondii - Técnica do microcultivo

30

Figura 4: Investigação do mecanismo de ação antifúngico - método do sorbitol

31

xiii

Sumário

Páginas

1 Introdução 13

2 Justificativa 18

3 Objetivos 19

3.1 Objetivo Geral 19

3.2 Objetivos Específicos 19

4 Métodos 20

4.1 Desenho do estudo 20

4.2 Local do trabalho 20

4.3 Obtenção do material botânico 20

4.4 Análise dos componentes do óleo essencial de M. spicata L. 22

4.5 Controle de qualidade 23

4.6 Microrganismos 23

4.7 Verificação da viabilidade e pureza das leveduras 24

4.8 Inóculo 24

4.9 Ensaios microbiológicos 24

4.9.1 Determinação da concentração inibitória mínima e concentração

fungicida mínima

24

4.9.2 Efeito do óleo essencial de M. spicata sobre o tempo de morte

das leveduras

27

4.9.3 Efeito do óleo essencial de M. spicata sobre a morfogênese de

cepas de C. guilliermondii

29

4.9.4 Investigação do mecanismo de ação antifúngico - método do

sorbitol

30

5 Artigos Produzidos 32

5.1 Artigo 1: Plant essential oils and their antimicrobial activity - review

2010-2013

32

5.2 Artigo 2: Atividade antifúngica de óleos essenciais sobre leveduras

Candida não albicans

52

5.3 Artigo 3: Antifungal activity of the essential oil of M. spicata L. on

clinical strains of Candida guilliermondii

69

xiv

5.4 Artigo 4: Antifungal mechanism of essential oil from Mentha spicata

L. on clinical strains of Candida guilliermondii

87

6 Comentários, Críticas e Sugestões 107

7 Referências 109

Anexos 115

Anexo 1 Laudo técnico do óleo essencial de Mentha spicata 115

Anexo 2 Parecer da aprovação do projeto 116

13

1 INTRODUÇÃO

Candidíase é um problema relevante devido à sua frequência e

gravidade das suas complicações. Trata-se de infecção fúngica,

predominantemente endógena, de caráter oportunista e que causa significante

mortalidade e morbidade em pacientes imunocomprometidos (Rukayadi et al.,

2011, Jin et al., 2010; Kothavade et al., 2010).

A maioria dos casos de candidíase é causada por C. albicans.

Entretanto, espécies de C. não albicans têm recentemente contribuído como

agentes de infecções, indicando uma tendência de mudança na etiologia desse

agravo. As espécies de C. não albicans comumente isoladas de material clínico

são C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei, C. guilliermondii, C.

kefyr, C. lusitaniae, C. viswanathii , C. famata, C. haemulonii e C. norvegensis

(Oberoi et al., 2012; Rukayadi et al., 2011; Couto et al., 2011; Santos, 2009).

Os principais agentes antifúngicos utilizados para o tratamento da

candidíase são os azóis e polienos. Os azóis, como cetoconazol, miconazol,

clotrimazol, fluconazol, itraconazol, voriconazol e, mais recentemente, o

posaconazol; atuam através da interação com a citocromo P-450-dependente

14--desmetilase, e, como resultado, inibem a síntese de ergosterol, que é o

principal componente da membrana celular fúngica. Já os polienos, nistatina,

anfotericina B e as suas formulações lipídicas atuam ligando-se aos esteróis na

membrana celular e formam canais, permitindo que os íons de K+ e Mg++ saiam

da célula. Alguns farmácos, como a anfotericina B, são muito tóxicos, e outros,

como fluconazol, são limitados por causa da alta taxa de resistência (Oliveira et

al., 2011; Lima, 2011; Mendes, 2011).

É importante ressaltar a real existência de resistência in vitro e in vivo

em isolados de Candida, pricipalmente em espécies de Candida não-albicans.

Espécie como C. krusei apresenta resistência intrínseca ao fluconazol, ao

passo que outras, como C. tropicalis e C. glabrata, têm apresentado crescente

resistência adquirida (Khan & Malik, 2012; Mendes, 2011).

A disseminação de leveduras resistentes aos antifúngicos é uma das

mais graves ameaças para o sucesso do tratamento das doenças micóticas.

Apesar da existência de antifúngicos potentes, cepas resistentes ou multi-

resistentes estão aparecendo continuamente. A necessidade de terapia

14

supressiva com antifúngicos por longo período pode ser responsável pela

seleção de cepas resistentes (Khan & Malik, 2012).

A crescente resistência aos antifúngicos, o reduzido número de

medicamentos disponíveis, limitações terapêuticas, ineficácia, toxicidade,

neutropenia grave, interações medicamentosas e a biodisponibilidade

insuficiente dos antifúngicos atualmente disponíveis tornam o tratamento das

micoses humanas muito difícil e estimulam a busca por novas alternativas

terapêuticas entre as plantas aromáticas e seus óleos essenciais,

empiricamente usados por apresentar propriedades antifúngicas (Khan & Malik,

2012; Silva, et al., 2009). Dessa forma, destaca-se a importância da busca de

novas fontes terapêuticas para o tratamento das infecções fúngicas, que se

apresentem mais eficazes e com menos efeitos adversos para o hospedeiro.

Plantas medicinais e aromáticas são amplamente empregadas na

medicina popular e têm sido extensivamente estudadas a fim de encontrar

compostos mais eficazes e menos tóxicos. Seus produtos e derivados são

reconhecidamente importantes na pesquisa farmacológica e no

desenvolvimento de novas ferramentas terapêuticas. Assim, constituem uma

importante fonte de novos compostos biologicamente ativos e podem ser

utilizadas como uma nova possibilidade de intervenção terapêutica. Nesse

sentido, o estudo apropriado da química e farmacologia de plantas medicinais

se apresenta como um instrumento relevante de investigação de suas

propriedades (Saad, 2010).

No Brasil, país com vasta biodiversidade, experiências atreladas ao

conhecimento popular aproximam a utilização de produtos naturais aos

recursos terapêuticos disponíveis, sendo, inclusive, esta prática recomendada

pelo poder público. Em 3 de maio de 2006, o Ministério da Saúde, através da

Portaria 971, aprovou a Política Nacional de Práticas Integrativas e

Complementares (PNPIC) no âmbito do Sistema Único de Saúde (SUS)

(Ministério da Saúde (Brasil), 2006).

Em 2007, o Ministério da Saúde do governo brasileiro lançou a Política

Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF), que visa garantir à

população brasileira o acesso seguro, o uso racional de plantas medicinais e

fitoterápicos através do SUS. Atualmente, doze medicamentos fitoterápicos

com registro da ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) são

15

distribuídos pela rede pública em quatorze estados (Acre, Amazonas, Bahia,

Espírito Santos, Goiás, Pará, Paraíba, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul,

Santa Catarina, Sergipe, São Paulo, Tocantins e Distrito Federal). Entre os

fitoterápicos distribuídos, estão a Aloe vera (Babosa) para o tratamento de

psoríase e queimaduras, o Salix alba (Salgueiro) usado contra dores na região

lombar e a Rhamnus purshiana (Cáscara sagrada) para prisão de ventre.

Os benefícios da fitoterapia são reconhecidos pela Organização

Mundial de Saúde (OMS). Assim, medicamentos fitoterápicos assumem papel

relevante na área farmacêutica, desde que usados de forma adequada e com

qualidade assegurada (portalsaude.saude.gov.br, 2012; Ministério da Saúde

(Brasil), 2007).

A ISO (International Standard Organization) define óleos essenciais

(OEs) como produto obtido de partes de plantas através de destilação por

arraste com vapor d’água, bem como os produtos obtidos por compressão dos

pericarpos de frutos cítricos (Silva, 2011; Mendes, 2011).

Os óleos essenciais são misturas de compostos voláteis originados do

metabolismo secundário das plantas, de composição química complexa,

destacando-se a presença de terpenos e fenilpropanóides. São uma rica fonte

de compostos biologicamente ativos, conhecidos desde a antiguidade (Silva et

al., 2013; Lima et al., 2012; Saad et al., 2010) e que apresentam diversas

propriedades farmacológicas, tais como: antioxidante (Maskovic et al., 2013; Xu

et al., 2013), antiflamatória (Ramos et al., 2013; Salud et al., 2013; Arumugam

et al., 2008), larvicida (Govindarajan et al., 2012; Souza et al., 2012), inseticida

(Arango et al., 2013; Salama et al., 2012 ), antibacteriana (Guerra et al., 2013;

Castro, et al., 2011) e antifúngica (Tyagi et al., 2013; Khan & Malik, 2012;

Oliveira et al., 2011).

A atividade anticandida dos OEs vem sendo extensivamente

investigada na tentativa de disponibilizar alternativas terapêuticas para o

tratamento da candidíase. Entretanto, os mecanismos de ação desses

compostos e seus constituintes não estão totalmente elucidados. Especula-se

que a maioria dos OEs exerçam sua atividade antifúngica através de

modificações na estrutura da parede celular (Palmeira - de - Oliveira et al.,

2009).

16

O gênero Mentha (família Lamiaceae), de origem europeia, é

atualmente cultivado em todo o mundo, devido a sua utilização como

flavorizante, aromatizante e pelas aplicações farmacêuticas. A Índia produz

cerca de 80% do total mundial de óleo de menta. Embora oito espécies desse

gênero sejam cultivadas na Índia, apenas três (Mentha arvensis L., Mentha

piperita L e Mentha spicata L.) foram aprovadas pela International Standard

Organization (ISO). Esse gênero apresenta dificuldades para sua classificação

devido à grande variabilidade em suas características morfológicas e a

facilidade de hibridização (Peixoto, 2010; Ferreira, 2008).

Mentha spp. possui um dos óleos essenciais mais consumidos do

mundo, com atividade antimicrobiana comprovada e seus derivados são

largamente utilizados na produção de alimentos, de produtos de higiene,

cosméticos, farmacêuticos, tabaco e bebidas. Os fitoconstituintes do óleo de

Mentha spp. variam de acordo com a idade da planta, variedade da espécie,

região geográfica, clima e condições do processamento. Os principais

constituintes identificados são os monoterpenóides como mentol, mentona, iso

mentona, carvona, limoneno, pulegona, iso-dihidrocarvona e s-carvona

(Peixoto, 2010; Mkaddem, 2009). Alguns deles possuem alta atividade

antioxidante (Abdullah et al., 2010). A planta também é conhecida por sua ação

inseticida, propriedades antimicrobianas, antiespasmódica, antiplaquetária,

estimulante, antihelmintica e carminativa (Mkaddem, 2009).

Mentha spicata L. é uma planta comestível e medicinal, distribuída

principalmente no sudeste e sul da Ásia. É uma rizomatosa rastejante, erva

perene glabra e com um forte odor aromático. É popularmente conhecido como

hortelã peluda, hortelã rateiro, hortelã vilhoça ou hortelã verde. É um híbrido

entre M. sylvestris e M. suaveolens. A carvona e o limoneno são os principais

constituintes químicos do óleo essencial (Govindarajan et al., 2012; Mkaddem,

2009; Ferreira, 2008). Popularmente foi indicada para o tratamento de afecções

respiratórias, calmante, estomáquica como estimulante gástrico, antiflatulento,

antigripal e vermífurgo. Outras propriedades são as de antiséptico,

antiespasmódica, adstringente, carminativa, descongestionante, digestivo,

diurético e pode ser utilizada como aromatizante. Utilizada em temperos, em

gomas de mascar, bombons, pastas dentais, creme de barbear, não só pelas

suas características aromatizantes, como também pelas suas propriedades

17

bactericida e antiséptica (Ferreira, 2008). O óleo essencial de M. spicata

mostrou atividade inseticida e mutagênica forte (Chauhana et al., 2009).

Com base nessas considerações e na alta incidência da candidíase,

aumento do número de indivíduos imunocomprometidos, surgimento de cepas

resistentes aos antifúngicos comercialmente utilizados, do elevado custo do

tratamento, toxicidade dos antifúngicos existentes, é de fundamental

importância a busca por novos agentes antifúngicos mais eficazes, menos

tóxicos, economicamente viáveis, sendo os produtos derivados de plantas

medicinais, excelentes alternativas para esse propósito (Machado et al., 2013;

Peixoto, 2010).

O desenvolvimento de estratégias eficazes para o tratamento da

candidíase e outras doenças causadas por fungos é um desafio, considerando

o aumento em infecções fúngicas oportunistas em pacientes HIV positivos e

imunocomprometidos (Khan & Malik, 2012; Zirkel,et al., 2012). O objetivo

principal da busca por novos fitoterápicos não é substituir os medicamentos já

existentes, mas sim aumentar o arsenal terapêutico disponível, ofertando

medicamentos equivalentes, talvez mais baratos, com espectro de ação mais

adequado e baixo risco de desenvolvimento de resistência microbiana in vitro

(Carmo, 2011).

A pesquisa de um novo antifúngico com ação sobre fungos

potencialmente patogênicos ou oportunistas se faz necessária. Este trabalho se

propõe a avaliar a composição química, atividade biológica e mecanismo de

ação do óleo essencial de Mentha spicata L. sobre Candida guilliermondii de

origem clínica.

18

2 JUSTIFICATIVA

O gênero Candida compreende leveduras oportunistas colonizantes da

microbiota humana. Em pacientes imunocomprometidos são a causa mais

comum de infecções fúngicas, cujo espectro varia desde patologias

mucocutâneas não-fatais, a processos invasivos que podem envolver qualquer

órgão (Oliveira et al., 2011, Mendes, 2011).

A elevada incidência de candidíase nos últimos anos se deve à baixa

sensibilidade de algumas cepas aos antifúngicos utilizados na prática clínica,

necessitando diversificadas estratégias terapêuticas, tais como aumento da

dose ou do tempo de uso do antifúngico. (Oliveira et al, 2011).

Outro determinante do agravamento dessa patologia é a grande

dificuldade no tratamento, relacionado aos seus efeitos adversos, sendo

observada alta taxa de mortalidade em pacientes imunocomprometidos

(Peixoto, 2010).

Pesquisas desenvolvidas na expectativa de se obter novos produtos

antifúngicos de origem natural tornam-se relevantes, levando-se em

consideração a crescente importância clínica e epidemiológica dispensada às

infecções micóticas e a necessidade de tratamentos mais eficazes e menos

tóxicos para os indivíduos acometidos (Khan & Malik, 2012; Peixoto, 2010).

É dentro desse contexto que pesquisadores de todo o mundo têm se

dedicado ao estudo de alternativas viáveis aos tratamentos destas

enfermidades. Uma destas alternativas são os estudos com plantas medicinais

e seus derivados, considerando os aspectos fitoquímicos e atividades

biológicas (Khan & Malik, 2012; Oliveira et al., 2011; Mendes, 2011).

Nossa proposta de trabalho foi avaliar a atividade biológica,

composição química e mecanismo de ação do óleo essencial de Mentha

spicata L. sobre Candida guilliermondii provenientes de vulvovaginites e

material anal.

19

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a atividade biológica, composição química e mecanismo de

ação do óleo essencial de Mentha spicata L. sobre Candida guilliermondii de

origem clínica.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Realizar um “screening” da atividade antifúngica de óleos essenciais

sobre espécies de Candida não albicans de origem clínica;

Identificar a composição química do óleo essencial de Mentha spicata,

utilizando um Cromatógrafo Gasoso (CG) acoplado com Espectrômetro

de Massa (EM);

Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração

Fungicida Mínima (CFM) desse produto sobre as cepas de Candida

guilliermondii provenientes de vulvovaginites e material anal;

Avaliar a interferência dos efeitos desse óleo essencial sobre a cinética

de crescimento das leveduras;

Analisar o efeito do óleo essencial de Mentha spicata sobre a

micromorfologia das cepas de Candida guilliermondii em estudo;

Pesquisar ação desse óleo essencial sobre a parede celular fúngica.

20

4 MÉTODOS

4.1 Desenho do estudo

Trata-se de um estudo “in vitro”, onde foram coletados dados

micológicos e químicos, com o intuito de observar e estimar a composição

química e a ação antifúngica do óleo essencial de M. spicata frente à Candida

guilliermondii de origem clínica.

4.2 Local do trabalho

O trabalho foi realizado no Laboratório de Micologia do Departamento

de Ciências Farmacêuticas (DCF), do Centro de Ciências da Saúde (CCS), da

Universidade Federal da Paraíba (UFPB) e no Laboratório de Microbiologia

Clínica do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas do Centro de

Ciências da Saúde (CCS), da Universidade Federal do Rio Grande do Norte

(UFRN). Parcerias, para o apoio no desenvolvimento do trabalho, foram

também realizadas para análise da composição do óleo essencial de M. spicata

(hortelã peluda) ocorrida no Laboratório Unificado de Desenvolvimento e

Ensaios de Medicamentos (LUDEM), do Centro de Ciências da Saúde (CCS),

da Universidade Federal da Paraíba (UFPB). A concordância dos resultados da

identificação bioquímica do Banco de Levedura foi realizada no Laboratório de

Microbiologia do Hospital Pediátrico Maria Alice Fernandes, Natal (RN), através

do Sistema MicroScan®.

4.3 Obtenção do material botânico:

O óleo essencial (OE) de M. spicata L. (FERQUIMA – Indústria e

Comércio Limitada, Vargem Grande/ São Paulo) veio acompanhado de uma

ficha técnica com informações sobre o produto, onde destacamos o lote (184) e

a composição química: L- carvona 70%, Limoneno 19%, outros 11% (Anexo 1).

O óleo essencial de M. spicata foi selecionado para a realização desse

estudo após realização do “Screening” microbiológico. Nesta etapa foram

21

avaliados onze óleos essenciais extraídos dos espécimes botânicos

especificados no quadro 1. Nessa avaliação os óleos foram utilizados “in

natura“, ou seja, 100% puros. O método microbiológico utilizado foi o de

difusão em meio sólido com discos de papel (Sensiobiodisc do Centro de

Controle e Produtos para Diagnósticos Ltda – CECON/SP) impregnados com

10 µL dos óleos essenciais, desenvolvidos em ágar sabouraud dextrose (ASD -

Difco® - France). O sistema foi incubado a 35°C por 48 horas (Koneman et al.,

2008; Yaya, 2008; Ostrosky et al., 2008; Craveiro, 1981). Os ensaios foram

realizados em duplicatas e os resultados considerados positivos, quando a

média aritmética dos halos de inibição apresentaram valores iguais ou

superiores a 15mm de diâmetro, em pelo menos, 50% do total das cepas

testadas (Mendes, 2011).


da atividade antifúngica sobre cepas de Candida spp.

Fonte: www.plantamed.com.br

O óleo essencial de M. spicata foi escolhido para estudos posteriores,

por ter apresentado um dos melhores resultados na triagem microbiológica.

Esse produto teve seu parâmetro de qualidade (coloração, pureza, odor,

Espécie

Família Nome popular

Cinnamomum zeylanicum Blume Lauraceae canela-da-índia

Citrus limonum Burm. F. Rutaceae limão-siciliano

Coriandrum sativum L. Krause Apiaceae coentro

Eucalyptus globulus Labill Myrtaceae eucalipto

Eugenia coryophyllata Thumb. Lamiaceae cravo-da-índia

Mentha arvensis L. Stewart Lamiaceae hortelã comum

Mentha piperita L. Briq. Lamiaceae hortelã-pimenta

Mentha spicata Schrad. ex Willd Lamiaceae hortelã-peluda

Ocimum basilicum Schumach. & Thonn Lamiaceae manjericão

Origanum vulgare L. (G. Beck) Klok Lamiaceae orégano

Pimpinella anisum Gaertn.

Apiaceae erva-doce

http://www.plantamed.com.br/

22

densidade a 20°C e índice de refração a 20°C) descrito em um laudo técnico

enviado pela empresa (Tabela 1).

Tabela 1 - Laudo técnico do óleo essencial de M. spicata (hortelã-peluda)

Itens Controlados Resultados

Aparência Líquido límpido

Cor Amarelo palha

Impurezas Isento

Odor Característico

Densidade (20°C) 0,934

Índice de Refração (20°C) 1,490

CAS 84696-51-5

Origem China

Principais componentes L-carvone = 70%, Limonene = 19%

Fonte: Ferquima Ind. E Com. Ltda. Engenheira Química Responsável: Alice Elizabet Lasthaus, CRQ: IV 04330754.

Este óleo foi conservado em um frasco de alumínio e mantido sob

refrigeração. No momento da utilização foi preparada uma emulsão do óleo

essencial de M. spicata, conforme o protocolo de Allegrini et al (1993). Em um

tubo de ensaio esterilizado, foi colocado 16.389μg do óleo essencial, 0,4mL de

dimetilsulfóxido (DMSO - Merck), 0,08mL de Tween 80 (INLAB/Indústria

Brasileira) e quantidade suficiente para 8mL de água destilada estéril. Através

de diluições em Caldo Sabouraud Dextrose (CSD - Difco® - France)

duplamente concentrado foram obtidas as concentrações desejadas do óleo

essencial.

4.4 Análise dos componentes do óleo essencial de M. spicata

Para a análise dos fitoconstituintes foi utilizado um Cromatógrafo

Gasoso (CG) da Shimadzu (GC17-A), equipado com um Espectrômetro de

Massa (EM). A coleta de dados e integração foi realizada com o software

Class5000. A fase móvel foi composta por hélio e bombeada na vazão de 1,6

mL/min com split 1:5.

A separação cromatográfica foi realizada utilizando uma coluna capilar

DB-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm). A temperatura do forno da coluna foi

23

programada para passar de uma temperatura inicial de 60°C a 120°C a

5°C/min e de 120°C a 280°C a 20°C/min. A temperatura do injetor e do detector

foram 260 e 280°C respectivamente. O tempo total foi de 20 minutos e o

volume de injeção foi 1,0 μL.

A identificação dos constituintes do OE foi efetuada junto ao sistema de

computação e processamento de dados (workstation) interligado ao CG-EM. O

sistema é equipado com uma biblioteca Wiley, 6ª Edição da classe-5000 1999,

com 229.119 espectros.

4.5 Controle de qualidade

A nistatina (Sigma-Aldrich®) foi selecionada como antifúngico padrão,

após realização do antifungigrama pelo método microbiológico de difusão em

ASD, o qual apresentou melhor perfil de sensibilidade para esse banco de

leveduras. As soluções também foram preparadas no momento de execução

dos testes.

4.6 Microrganismos

Para o estudo de atividade antifúngica com óleos essenciais, foram

utilizadas quatorze cepas de Candida guilliermondii obtidas de um banco

preexistente, provenientes de vagina e ânus. Este banco foi coletado e

identificado pelo Laboratório de Micologia do Hospital Giselda Trigueiro (HGT)

Natal-RN, mediante aprovação do Comitê de Ética do Centro de Ciências da

Saúde da UFRN, sob o protocolo 154/06. As cepas foram identificadas através

de sua macro e micromorfologia, comportamento fisiológico e bioquímico,

conforme o protocolo recomendado por Kurtzman & Feel, 1998. A

concordância dos resultados da identificação bioquímica do Banco de

Leveduras foi realizada no Laboratório de Microbiologia do Hospital Pediátrico

Maria Alice Fernandes, Natal (RN), através do Sistema MicroScan®. As cepas

estoques das leveduras foram mantidas em criotubos devidamente

identificados e contendo YPD (Extrato de levedura, Peptona, Dextrose), glicerol

e miçangas estéreis. Os criotubos contendo as leveduras, o meio de cultura

24

com glicerol e as miçangas foram colocados na estufa a 35°C. Posteriormente,

foram armazenadas sob-refrigeração a 8°C e no freezer a -70°C.

4.7 Verificação da viabilidade e pureza das leveduras

Previamente aos experimentos, as cepas foram submetidas à

verificação de sua viabilidade e pureza. Para isso, foram semeadas em meio

Ágar Sabouraud Dextrose (Difco® - France), a fim de obter culturas recentes.

Para avaliação da pureza, as leveduras foram semeadas com alça

descartável pela técnica de esgotamento em meio CHROMagar Candida®

(meio cromogênico, que permite a identificação de culturas mistas de leveduras

- Difco® - France) e depois incubação a 35C, durante 24-48 horas.

4.8 Inóculo

A partir das culturas recentes e mantidas em Ágar Sabouraud

Dextrose - ASD (Difco® - France), durante 24-48 horas a 35C, o inóculo foi

preparado e padronizado em solução fisiológica a 0,9% estéril (Fresenius Kabi

Brasil Ltda). Inicialmente, preparou-se uma suspensão comparativa com o

tubo 0,5 da escala de McFarland. A mesma foi ajustada no espectrofotômetro

(Leitz-Fhotometer 340-800) para conter aproximadamente 106 UFC/mL. Em

seguida, essa suspensão foi diluída com água destilada numa proporção de

1:9, resultando em um inóculo contendo aproximadamente 105 UFC/mL, que foi

utilizado nos ensaios (Koneman et al., 2008; Ostrosky et al., 2008).

4.9.Ensaios microbiológicos

4.9.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima – (CIM) e

Concentração Fungicida Mínima (CFM)

Os ensaios de atividade antifúngica do óleo essencial de M. spicata

sobre cepas de C. guilliermondii foram realizados pela técnica de microdiluição

25

(Koneman et al., 2008; Ostrosky et al., 2008; Hadacek & Greger, 2000; Ellof,

1998).

A partir das culturas recentes e mantidas em Ágar Sabouraud Dextrose

- ASD (Difco® - France), durante 24-48 horas a 35C, o inóculo foi preparado e

padronizado em solução fisiológica a 0,9% estéril (Fresenius Kabi Brasil Ltda).

Inicialmente, preparou-se uma suspensão comparativa com o tubo 0,5 da

escala de McFarland. Em seguida, essa suspensão foi diluída com água

destilada numa proporção de 1:9, resultando em um inóculo contendo

aproximadamente 105 UFC/mL, que foi utilizado nos ensaios.

Foram utilizadas placas de microtitulação com 96 orifícios estéreis

(INLAB). Em cada orifício da placa, foram adicionados 100 µl do meio Caldo

Sabouraud Dextrose (CSD - Difco® - USA/France). Em seguida, foi adicionado

100 µl da emulsão do OE na concentração inicial de 1024 µg/mL nas cavidades

da primeira linha da placa. Por meio de uma diluição seriada a uma razão de

dois, foram obtidas concentrações de 1024 µg/mL até 4 µg/mL. Por fim, foram

adicionados 10 µl da suspensão das espécies das leveduras nas cavidades,

onde cada coluna da placa refere-se a uma cepa de C. guilliermondii.

Em conjunto com os ensaios microbiológicos, foram realizados os

controles de esterilidade (meio líquido CSD sem a suspensão da levedura), de

viabilidade/crescimento do microrganismo (no meio líquido isento de produto

antifúngico) e com antifúgico padrão (nistatina 100 UI/mL).

Os ensaios microbiológicos foram incubados à temperatura de

35ºC/24-48 horas. Decorrido o tempo de incubação adequado, foi feita a leitura

e interpretação dos resultados. A CIM foi definida como a menor concentração

capaz de inibir visualmente o crescimento fúngico verificado nas cavidades,

quando comparado com o crescimento controle. Os ensaios foram realizados

em duplicata e o resultado expresso pela média aritmética dos valores da CIM

obtidas nos dois ensaios (Eloff, 1998; Cleeland & Squires, 1991).

A atividade antifúngica dos produtos foi interpretada e considerada

ativa ou não, conforme os seguintes parâmetros: CIM até 500 μg/mL= forte

atividade antimicrobiana, CIM entre 600 e 1600 μg/mL= possuem atividade

moderada e CIM acima de 1600 μg/mL= considerado com fraca atividade

(Sartoratto et al., 2004).

26

Koneman, et al., 2008; Ostrosky et al., 2008; Hadacek & Greger, 2000; Cleeland & Squires, 1991

Crescimento de

C. guilliermondii

de 24-48h, em Ágar

Sabouraud

Inóculo em salina

estéril a 0,9%

Escala 0,5 de

McFarland

Inóculo em salina

estéril a 0,9% com 105

UFC/mL (diluição 1:9)

Preparo do inóculo Microdiluição em caldo

µg/mL

10

24

51

2

25

6

12

8

64

32

16 8 4

Co

ntr

ole

-

Co

ntr

ole

+

Nis

tati

na

10

0 U

I/m

L

Incubar a

35-37 C/ 24-48h

100 µL da emulsão

de OE a 2048

µg/mL

Leitura e

Interpretação

100 µL de

Caldo Sabouraud

10 µL das cepas

C. guilliermondii (105 UFC/mL)

Figura 1: Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) - Ellof (1998)

A CFM foi definida após a determinação da CIM, alíquotas de 20 μL

foram retiradas de cada poço da placa de microtitulação correspondente à

concentração inibitória e às duas imediatamente superiores, bem como os

controles positivos e subcultivados em placas de ágar Sabouraud dextrose.

Após 24 horas de incubação a 35C, as leituras das CFMs foram realizadas

com base no crescimento dos controles, sendo considerada CFM a menor

concentração semeada em placa de ASD em que houve crescimento menor

que três (03) UFCs (Amato Neto et al., 1994; Zaror & Espinel-Ingroff, 1989).

27

Amato Neto et al., 1994; Zaror & Espenel-Ingroff, 1989

µg/mL1024

512

256

128

64

32

16

8 4

Co

ntr

ole

-

Co

ntr

ole

+

Nis

tati

na 1

00

UI/

mL

Incubar a

35 C/ 24hLeitura e

Interpretação

Após

incubação e

Determinação

da CIMs 20 µL de cada poço

CIM, CIMx2, CIMx4 e

Controle positivoÁgar Sabouraud

Dextrose

Subcultivo

Considerado crescimento menor que três (03) UFCs

Concentração Fungicida Mínima (CFM)

Figura 2: Determinação da concentração fungicida mínima (CFM) - Ellof (1998)

4.9.2 Efeito do óleo essencial de M. spicata sobre o tempo de morte das

leveduras

Procedimentos para curva de tempo de morte foram realizados

utilizando a metodologia de Klepser et al. (1998). Foram selecionadas duas

cepas representativas de C. guilliermondii. Antes do ensaio, as leveduras foram

cultivadas em ASD. As suspensões fúngicas foram preparadas de acordo com

o padrão 0,5 de McFarland (1-5x106 UFC/mL) (Cleeland & Squires, 1991;

Hadacek & Greger, 2000). Um mililitro da suspensão fúngica ajustada foi

adicionado a cada tubo que continha 9 mL de CSD, com ou sem drogas. Isto

resultou em uma diluição de 1:10 da suspensão fúngica e forneceu um inóculo

inicial de cerca de 1-5 x 105 UFC/mL. As concentrações do OE testadas foram

de 1, 2 e 4 vezes o valor da CIM. A nistatina foi testada na concentração de

100UI/mL. Em pontos de tempo predeterminados (0, 2, 4, 8 e 24 h após a

adição do OE ou nistatina), 0,1 mL da amostra foi removida de cada tubo de

cultura e serialmente diluída com água destilada estéril. Uma alíquota de 10 μL

de cada diluição foi semeada uniformemente em placas de ASD. Quando

suspeitou-se que o número de colônias fosse menor que 1000 UFC/mL, 10 μL

da amostra foi retirada e semeada sem diluição (Giannuzzi, 1996).

28

As placas foram incubadas a 35°C por 24 a 48 h. Após esse período de

incubação, o número de unidades formadoras de colônia (UFC) em cada placa

foi contado e multiplicado pelo fator da diluição utilizada, para obter, assim, o

número de UFC/mL. O limite de detecção mínimo foi de 100 UFC/mL.

As curvas foram construídas plotando-se a contagem média de

colônias (log10UFC/mL) em função do tempo (horas) com o GraphPad Prism

version 5.0 for Windows. Foi considerada atividade fungicida da droga quando

houve redução no crescimento maior ou igual a 3 log10 (≥ 99,9%) a partir do

inóculo inicial, e atividade fungistática quando houve redução no crescimento

menor que 3 log10 (< 99,9%) UFC/mL (Correa-Royero et al., 2010; Ernst et al.,

2002; Keele et al., 2001; Cleeland & Squires, 1991).

Inóculo de C.

guilliermondii

106 UFC/mL

1 mL

Caldo Sabouraud

Dextrose – 9mL

Inóculo fúngico de 1 a 5 x 105

UFC/mL

Nistatina

100UI/mL

Controle 1 X CIM 2 X CIM 4 X CIM

Óleo essencial de M. spicata

Incubar a 35 C

Sob agitação a 200 rpm

Alíquota de 10 µL

Semeio em ágar

Sabouraud

Diluições seriadas em

água destilada

Tempo 0, 2, 4, 8 e 24hs

Incubar a 35 C/

24-48h

Atividade fungicida

crescimento ≥ a 3 log10 (≥ 99,9%)

Atividade fungistática

crescimento <3 log10 (< 99,9%)

Hadacek & Greger, 2000; Cleeland & Squires, 1991

Alíquota de 0,1mL

As curvas foram construídas

plotando-se a contagem média

de colônias em função do tempo

– GraphPad Prism version 5.0

for Windows

Figura 3: Efeito do óleo essencial sobre o tempo de morte das leveduras - Klepser et al. (1998)

29

4.9.3 Efeito do óleo essencial de M. spicata sobre a morfogênese de cepas

de C. guilliermondii

Para o estudo de possíveis alterações na micromorfologia de C.

guilliermondii, provocadas pela ação dos óleos essenciais, foi empregada à

técnica do microcultivo. Com base nos resultados dos valores de CIM

encontrados, foram selecionadas duas cepas representativas, uma de origem

anal (C. guilliermondii 9A) e outra de origem vaginal (C. guilliermondii 9V)

(Sidrim & Rocha, 2004; Lacaz, 2002; Dalmau, 1929). Utilizando o meio sólido

ágar-fubá com Tween 80 (Difco® - France) em câmara úmida, o ensaio foi

realizado em placas de Petri 90 x 15 mm, contendo uma lâmina sobre um

suporte para o microcultivo e papel de filtro (30 x 30 mm), devidamente

esterilizados.

O óleo essencial e o antifúngico padrão em quantidade suficiente para

obtenção da concentração final desejada foram solubilizados em tubos

estéreis. Em seguida, foi adicionado 4 mL de Agar-fubá-Tween 80 fundido em

cada um desses tubos: sem óleo nem antifúngico (Controle), com o óleo

essencial em concentração correspondente a CIM, CIMx2, e nistatina em

concentração correspondente a 100UI/mL.

Os tubos foram homogeneizados e para evitar que o meio solidificasse,

rapidamente, 1mL foi transferido e espalhado sobre a lâmina, formando uma

camada delgada. Após a solidificação do meio, a levedura foi semeada com o

auxílio de alça bacteriológica, fazendo uma estria central. A estria foi coberta

com lamínula esterilizada. Foi adicionado 1mL de água destilada estéril sobre o

papel de filtro para manter a umidade do meio (câmara úmida). A placa foi

fechada e incubada à temperatura de 35ºC durante 24-48 horas. Decorrido o

tempo de incubação, as lâminas foram analisadas em um microscópio óptico

comum (Zeiss® model Primo Star), em um aumento de 400x, para a

observação da formação ou não de estruturas características como

blastoconídios nas constrições de pseudomicelio e pseudomicelio delicado.

30

Ágar-fubá com Tween 80

fundido – 4mL

Inóculo fúngico de 1 a 5 x 105

UFC/mL

Nistatina

100UI/mL

Controle CIM 2 X CIM

Óleo essencial

de M. spicata

agitar

Placas de Petri 90x15 mm com lâmina

sobre um suporte e papel de filtro

Incubar a 35 C/

24-48h Sidrim & Rocha, 2004; Lacaz, 2002; Dalmau, 1929

Alíquota de 1mL

Crescimento de

C. guilliermondii

9A e 9V

de 24-48h, em

Ágar Sabouraud

Aumento de 400x

Figura 4: Efeito do óleo essencial de M. spicata L. sobre a morfogênese de cepas de C.

guilliermondii - Técnica do microcultivo

4.9.4 Investigação do mecanismo de ação antifúngico – método do

sorbitol

Este método se baseia na medida dos danos que os produtos com

atividade antifúngica produzem aos componentes da parede celular fúngica.

Caso o composto atue de alguma forma sob a parede celular do fungo, ele

provocará lise de suas células quando na ausência de um estabilizador

osmótico, mas permitirá seu crescimento na presença desse suporte osmótico.

Dessa maneira, este ensaio compara as CIM’s dos produtos antifúngicos na

ausência e presença de sorbitol a 0,8 M, um protetor osmótico usado para

estabilizar os protoplastos de fungos.

A determinação da CIM dos produtos, na presença do sorbitol, foi

realizada pela microdiluição, utilizando placas de microtitulação contendo 96

31

cavidades, com fundo em forma de “U” e em duplicata, semelhante ao item

4.9.1. Em cada orifício da placa, foram adicionados 100 µL do meio líquido

CSD previamente adicionado de sorbitol (PM = 182,17) (VETEC Química Fina

Ltda – Rio de Janeiro/RJ), ambos duplamente concentrados. Posteriormente,

100 µL da solução dos produtos, também duplamente concentrados, foram

dispensados nas cavidades da primeira linha da placa. E por meio de uma

diluição seriada a uma razão de dois, foram obtidas concentrações de 1024

µg/mL até 4 µg/mL dos produtos e, no caso do sorbitol, uma concentração final

de 0,8 M em cada cavidade. Por fim, foram adicionados 10 µL do inóculo das

espécies nas cavidades, onde cada coluna da placa refere-se a uma cepa

fúngica, especificamente.

Um controle de microrganismo foi realizado colocando-se nas

cavidades 100 µL do mesmo CSD e sorbitol (0,8 M), 100 µL de água destilada

estéril e 10 µL do inóculo de cada espécie. Um controle de esterilidade também

foi realizado, onde foi colocado 200 µL do CSD em um orifício sem a

suspensão dos fungos. Por último, foi realizado o mesmo procedimento com o

antifúngico padrão (Nistatina 100 UI/mL). As placas foram seladas e incubadas

a 35°C por 48 horas, posteriormente foi realizada a leitura (Zacchino, 2001;

Frost et al., 1995).

Zacchino, 2001; Frost et al., 1995;

Crescimento de

C. guilliermondii

de 24-48h, em Ágar

Sabouraud

Inóculo em salina

estéril a 0,9%

Escala 0,5 de

McFarland

Inóculo em salina

estéril a 0,9% com 105

UFC/mL (diluição 1:9)

Preparo do inóculo Microdiluição em caldo

µg/mL

10

24

51

2

25

6

12

8

64

32

16 8 4

Co

ntr

ole

-

Co

ntr

ole

+

Nis

tati

na

10

0 U

I/m

L

Incubar a

35-37 C/ 24-48h

100 µL da emulsão

de OE a 2048

µg/mL

Leitura e

Interpretação

100 µL de CSD + Sorbitol

(PM = 182,17)

10 µL das cepas

C. guilliermondii (105 UFC/mL)

Figura 5: Investigação do mecanismo de ação antifúngico – método do sorbitol

32

5 ARTIGOS PRODUZIDOS

5.1 Artigo 1:

Periódico: Pharmaceutical Biology - ISSN: 1388-0209. Status: a ser submetido.

Plant essential oils and their antimicrobial activity – review 2010-2013

Maiza Rocha de Abrantes1*, Edeltrudes de Oliveira Lima2, Mariana Araújo Paulo

de Medeiros1, Felipe Queiroga Sarmento Guerra2, Eveline Pipolo Milan3

1Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Centro de Ciências da

Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte

2Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde,

Universidade Federal da Paraíba

3Departamento de Infectologia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade

Federal do Rio Grande do Norte

*Corresponding author. Mailing address: Departamento de Análises Clínicas e

Toxicológicas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio

Grande do Norte, R. Gal. Gustavo Cordeiro de Farias, S/N, 1o andar,

Petrópolis, Natal, RN, Brazil. CEP: 59012-570. Phone: +55 (84) 3342-99797,

3342-9801. Mobile: + 55 (84) 9955-1703. E-mail: [email protected].

Keywords: Natural products, Volatile oils, Lamiaceae.

mailto:[email protected]

33

ABSTRACT

The use of essential oils of vegetable origin is rooted in popular

knowledge and has now been evoked by scientific studies. This study included

an inventory of oils extracted from plants with antimicrobial activity, highlighting

their applications and use. The literature review included any scholarly, peer-

reviewed journal articles published in databases such as Google Scholar,

PubMed (Medical Publications), MEDLINE (International Literature on Health

Sciences), LILACS (Latin American and Caribbean Health Sciences Literature),

SciELO (Scientific Electronic Library Online) as well as a wide range of

academic dissertations and theses from 2010 to 2013. We found 29 essential

oils of vegetable origin with antimicrobial activity, several of which from the

Lamiaceae family. This review suggests that progress has been made in the

study of essential oils.

Introduction

Essential oils (EOs) are complex mixtures of volatile, lipophilic, liquid

and colorless or slightly yellowish compounds with a strong and pleasant

aroma. They originate from the secondary metabolism of plants, and are very

unstable, especially in the presence of air, light, heat, moisture and metals

(Peixoto, 2010; Oliveira, 2011; Ehlert et al., 2013).

These oils can be found in the leaves, flowers, branches, buds, stems,

fruits, seeds, bark and roots of the plants (Lavinik, 2013) and perform various

necessary functions for their survival, playing a key role in the defense against

34

microorganisms, in attracting pollinators, in protecting the plant from heat,

amongst other functions (Bassolé & Juliani, 2012; Trajano, 2012; Gomes, 2013;

Silva et al., 2013).

Medicinal plants require different techniques for growing, harvesting,

and postharvest processing in order to determine which methods provide higher

biomass accumulation and chemical constituents of interest (Ehlert et al., 2013).

The chemical and biological properties of EOs may vary according to the

environment in which the plant develops, the type of cultivation technique, the

collection of plant material, the season, the climate, the vegetative stage, the

plant organ, age, the time of vegetative phase and the extraction method used

(Zheljazkov et al., 2010; Ehlert et al., 2013; Machado, Ribeiro, Druzian, 2013;

Zhaoa et al., 2013). Plants rich in essential oils should be collected in the

morning or evening since sun exposure may cause loss of a significant amount

of oil. Nevertheless, one can not predict or establish the use of a single

standard technique, since each species reacts differently to environmental

changes (Peixoto, 2010).

There are various methods for extracting essential oils, some of which

include: steam distillation, hydrodistillation (Clevenger method), organic solvent

extraction, microwave-assisted distillation, microwave hydrodiffusion and

gravity, high-pressure solvent extraction, supercritical fluid CO2 extraction,

ultrasonic extraction and solvent-free microwave extraction. However, steam

distillation is the most commonly used method for commercial production scale

(Okoh, Sadimenko, Afolayan, 2010).

Phytochemicals derived from EOs include terpene hydrocarbons,

alcohols, terpene alcohols, aldehydes, ketones, phenols, esters, ethers, oxides,

35

peroxides, organic acids, lactones, coumarins and sulfur compounds.

Chemically, the vast majority of EOs are derived from phenylpropanoid and

predominantly from terpenoids (Lima, 2011), whereas the majority of their

antimicrobial activity derive from oxygenated terpenes, particularly terpene

phenolics, phenylpropanoids and alcohols (Bassolé & Juliani, 2012).

Essential oils have been widely used by pharmaceutical, sanitary,

cosmetic, agricultural and food industries because of their biologically active

compounds, which present several pharmacological activities: antioxidant

(Maskovic et al., 2013, Xu et al., 2013), anti-inflammatory (Salud et al., 2011;

Ramos et al., 2013), larvicide (Govindarajan et al., 2012; Souza et al., 2012),

insecticide (Salama et al., 2012; Arango et al., 2013), antibacterial (Castro, et

al., 2011; Guerra et al., 2013) and antifungal activities (Oliveira et al., 2011;

Tyagi et al., 2013). Moreover, EOs may be used alone or in combination with

existing methods, which is considered an interesting alternative to reduce or

eliminate resistant pathogens (Khan et al., 2012).

The antifungal properties of EOs of vegetable origin have been

demonstrated through intensive research, driven by the growing trend towards

replacing synthetic agents (Zuzarte et al., 2012). The use of natural antifungal

compounds is important not only for food preservation, but also in the control of

diseases that affect both plants and humans. The search for new antifungal

agents is needed due to the emergence of resistant microorganisms and fatal

opportunistic infections (Carmo, 2011).

The antimicrobial properties of EOs of vegetable origin have been

empirically known for centuries, but only recently has science recognized their

importance. Such properties have been systematically investigated by different

36

research groups, which study the biological activity of medicinal plants

throughout the world, according to their popular use. In contrast,

microorganisms that cause disease have developed resistance to most of the

available antibiotics, which further fosters the search for natural antibiotics

(Machado, Ribeiro, Druzian, 2013).

The mechanism of action of EOs on microorganisms is complex and not

yet fully elucidated. As is well known, the hydrophobic properties of EOs and

their components cause their binding to lipids in the cell membrane, altering its

structure and increasing its permeability, thus leading to cell leakage and cell

death (Guerra et al., 2012; Gomes, 2013; Lavinik, 2013). This mechanism of

action can not be assigned to a specific target, although there may be many of

them within the cell (Kacániová et al., 2012).

Essential oils of vegetable origin with antifungal action present two

important characteristics: their natural origin (safe for consumers and for the

environment) and lower risk of development of microbial resistance. The latter is

based on the fact that EOs have a complex chemical composition and,

consequently, different mechanisms of activity, making it difficult for

microorganisms to adapt and mutate (Carmo, 2011).

In this retrospective study, we developed an inventory of oils extracted

from plants with antifungal activity, highlighting their applications for humans.

Methods

This is a descriptive study with quantitative and qualitative approaches.

The literature review included any scholarly, peer-reviewed journal articles and

37

academic dissertations and theses from 2010 to 2013. The following databases

were used: Google Scholar, PubMed (Medical Publications), MEDLINE

(International Literature on Health Sciences), LILACS (Latin American and

Caribbean Health Sciences Literature) and SciELO (Scientific Electronic Library

Online). The keywords used for the search were: essential oils, natural products

and antimicrobials.

Results and Discussion

The sample consisted of 29 EOs with antifungal, antibacterial and

antimicrobial (antifungal + antibacterial) properties. As shown in Table 1,

Lamiaceae has been the most studied family.

Studies have reported the antifungal and antibacterial properties of

some Cymbopogon species. According to Carmo (2011), the EO of

Cymbopogon citratus (Gramineae - Poaceae) is indicated for the treatment of

dermatoses (urticaria, ulcers, spots and rashes), acting against clinical strains

of Malassezia isolated from patients at the Hospital Universitário Lauro

Wanderley (Universidade Federal da Paraíba, Brazil). Moreover, Oliveira (2011)

investigated the activity of the EO of Cymbopogon winterianus (lemongrass) on

Candida albicans, Aspergillus flavus and Aspergillus fumigatus using time-kill

methodology. In this study, is was suggested that this EO had a concentration-

dependent antifungal effect for all strains tested.

In order to develop an alternative therapy for candidiasis - since the one

currently available has become problematic as a result of the toxicity of

antifungal agents and the increasing prevalence of antibiotic-resistance -, Khan,

38

Malik and Ahmad (2012) studied the effect of 21 plant EOs against multidrug-

resistant (MDR) strains of C. albicans. According to the study, the oil of

Cymbopogon martini showed a strong inhibitory activity against C. albicans with

Minimal Inhibitory Concentrations ranging from 90 to 100 µg/ml.

While studying the antifungal effect of microcapsules containing EO of

Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae) on Aspergillus flavus, Trajano

(2012) noted that in in vitro assays this EO showed fungistatic (650μg/mL) and

fungicide (2600μg/mL) activities. According to the searched literature, C.

zeylanicum have some medicinal properties such as astringent, aphrodisiac,

antiseptic, aromatic, carminative, digestive, stimulant, hypertensive, sedative,

tonic and vasodilator (www.plantamed.com.br).

Antifungal properties have also been found in plant species from genera

Cicuta and Eugenia. An EO extracted from the fruits of Cicuta virosa L. var.

latisecta Celak was used against four food-borne fungi: Aspergillus flavus, A.

oryzae, A. niger and Alternaria alternata. Results showed that this EO had a

strong inhibitory effect on spore production and germination in all tested fungi

(Jun et al., 2011). Furthermore, Mendes (2011) evaluated the activity of the EO

of Eugenia caryophyllata Thunb on strains of C. tropicalis using Minimal

Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal Fungicidal Concentration (MFC)

values, and micromorphology, fungal viability (time-kill) and checkerboard

methodologies. Therefore, they observed a concentration-dependent antifungal

activity in the EO, which is potentialized in association with amphotericin B.

An study with Hyptis spp. (Lamiaceae) has shown the antimicrobial

activity of H. suaveolens, H. rhomboidea and H. Brevipes (Xu et al., 2013),

whereas Guerra-Boone et al. (2013) have shown that the EO of Magnolia

39

grandiflora presents an antifungal activity against dermatophyte strains.

While investigating the antifungal activity of EOs of Lavandula viridis,

Zuzarte et al. (2011) showed that dermatophyte fungi and Cryptococcus

neoformans were the most sensitive to the EOs (0.32 to 0.64 mL μL⁻¹), followed

by Candida spp. (0.64 to 2.5 ml μL⁻¹). For most of these strains, MIC values

were equal to MLC values, showing the fungicidal effect of the essential oils.

Additionally, it has been observed that the EOs had completely inhibited the

filamentation of C. albicans at concentrations sixteen times below the MIC

value.

Additionally, Zuzarte et al. (2012) studied the activity of the EO of

Lavandula luisieri against dermatophyte fungi and Aspergillus strains as well as

its influence on the dimorphic transition in C. albicans, evaluated through the

inhibition of germ tube formation assay. As previously reported (Zuzarte et al.,

2011), the filamentation in all strains was completely inhibited at concentrations

below sixteen times the MIC. The results support the use of EOs of L. luisieri for

the development of new phytochemicals and food preservatives, emphasizing

their antifungal properties at non-cytotoxic concentrations or at concentrations

with very low negative effects on mammalian cells.

Studies with species of Mentha have made progress in reporting their

antifungal properties on different pathogenic fungi. Peixoto (2010), for instance,

evaluated the anti-Candida action of EOs and fractions of different accessions

of Mentha spp. against C. albicans and C. dubliniensis. Four of the EOs

analyzed showed strong activity with broad spectrum: M. canadensis (MC 05) -

(<0,007 to 0,500 mg/mL); M. spicata (MC 30) (0,062 mg/mL to 0,500 mg/mL);

M. arvensis (MC 36) (<0,007 mg/mL to 1 mg/mL) and M. suaveolens x spicata

40

(MC 52) - (0,062 mg/mL to 0,500 mg/mL). In addition, Abdullah et al. (2010)

have also investigated the antifungal activity of the EO extracted from aerial

parts of Mentha spicata L. (mint) against five pathogenic fungi: Aspergillus

niger, Mucor mucedo, Fusarium solani, Botryodiplodia theobromae, and

Rhizopus solani. In this study, all tested microorganisms were strongly affected

by the EO, indicating an appreciable antimicrobial potential of spearmint oil.

In a study by Castro et al. (2011), it was suggested the use of the EO of

Lippia sidoides Cham. (Verbenaceae) as an antibacterial agent in food. For this

purpose, they studied the antimicrobial activity of the EO against

Staphylococcus aureus and Escherichia coli isolated from artisanal Minas

cheese produced in Brazil and found that both strains were sensitive to its

bactericidal activity.

A multiple-species approach has been used in many researches. In the

in vitro evaluation of the antimicrobial activity of EOs of Cinnamomum cassia

(Chinese cinnamon), Origanum vulgare (oregano), Piper nigrum (black pepper)

and Thymus vulgaris (white thyme), Lavinik (2013) has found that only P.

nigrum showed no inhibitory effect on the growth of enteric Salmonella samples

isolated from poultry. In contrast, T. vulgaris and C. cassia were effective

against 91.3% of the strains, while O. vulgare had an effectiveness of 100%.

The high antimicrobial activity of Thymus and Origanum species has been

associated to their phenolic components such as thymol and carvacrol (Bassolé

& Juliani, 2012). Additionally, similar results were observed by Cleff et al.

(2010). They studied the EO of O. vulgare against strains of Candida spp.

isolated from animals and found that this oil may represent an alternative for the

treatment of candidiasis.

41

By investigating the antibacterial activity of EOs from Coriandrum

sativum L. (coriander), Ocimum basilicum L. (sweet basil), Origanum majorana

L. (marjoram) and Rosmarinus officinalis L. (rosemary), Guerra et al. (2012)

found that they presented an effective antibacterial activity against MDR strains

of Acinetobacter spp., except for coriander, which presented lower activity. A

latter study by Guerra et al. (2013) suggested that the EO of Citrus limonun is

also effective against MDR strains of Acinetobacter spp.

Following the multiple-species approach, Silveira et al. (2012) studied

the antimicrobial activity of EOs of herbs grown in the southern Brazil against 12

important bacterial species in food. They noted that the EOs with greater activity

against the bacteria tested were, in descending order, Cymbopogon flexuosus

(lemongrass), Ocimum basilicum L. (sweet basil), Origanum vulgare (oregano),

Cinnamomum zeylanicum (cinnamon) and Laurus nobilis (bay laurel). The

bacterium Yersinia enterocolitica was the most sensitive pathogen to all EOs

tested (MIC 0.62 mg mL-1).

Furthermore, Rana et al. (2011) investigated the antibacterial activity of

19 EOs against four species of bacteria: Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium and Bacillus subtilis. Various

degrees of antibacterial activity were found: Cinnamomum zeylanicum, with the

most prominent antibacterial activity, was followed, respectively, by

Cymbopogon ciatrus and Carum copticum.

Recent researches have aimed to detect in vitro antifungal action of

EOs extracted from plant species native to other biomes. Cyclotrichium

leucotrichum (Lamiaceae), a plant species native to Iran, and Thymus

broussonetii Boiss, native to Morocco, were suggested to be effective against

42

Candida albicans (Mirjalili et al., 2013; Bellete et al., 2012). The latter was

further suggested to have an antifungal action against Aspergillus fumigatus

and dermatophytes (Bellete et al., 2012).

Calamintha nepeta L (Lamiaceae) Savi subsp. nepeta and Smyrnium

olusatrum L. (Apiaceae), two species native to the Mediterranean coast (Island

of Sardinia, Italy) and to Portugal’s Atlantic coast, were used by Marongiu et al.

(2010, 2012) in order to evaluate the antifungal activity of their EOs against five

species of Candida (C. albicans, C. tropicalis, C. krusei, C. guillermondii, C.

parapsilosis), three species of Aspergillus (A. niger, A. fumigatus, A. flavus), two

species of Microsporum (M. canis, M. gypseum), two species of Trichophyton

(T. rubrum, T. mentagrophytes), Cryptococcus neoformans and

Epidermophyton floccosum. Using MIC and MLC values, it was observed that

C. nepeta L populations rich in pulegone exhibited significant antifungal activity

against Aspergillus and dermatophyte strains (MIC = 0.32 to 1.25 mL mL⁻¹). In

the other hand, S. olusatrum L. oils were particularly active against

dermatophytes strains and C. neoformans (MIC = 0.32 to 0.64 mL mL⁻¹).

Concerning the cell wall structure of bacteria, some studies have

reported that EOs show better activity against Gram-positive bacteria rather

than Gram-negative bacteria. Marzoug et al. (2010), for example, observed this

phenomenon by studying the antimicrobial activity of the EO of Eucalyptus (E.

gracilis, E. oleosa, E. salubris, and E. salmonophloia). Furthermore, Zarai et al.

(2011) reported the same antimicrobial activity while studying the EO of

Marrubium vulgare.

Finally, after analyzing all data collected in this literature review and as

pointed out in a previous study by Lavinik (2013), we noted that it is difficult to

43

compare results from different studies because of the considerable variation

among the methods used to evaluate the inhibitory effect of EOs on different

microorganisms, such as: exposure of the microorganism to the oil, amount of

emulsifier used, oil solubility and the type of microorganisms used in different

tests.

Conclusion

This review suggests that there has been an improvement in the study

of essential oils of vegetable origin and in the elucidation of their antimicrobial

activity. Undoubtedly, essential oils have proven to be a promising source of

biologically active compounds. Hence, further studies are needed in order to

understand their therapeutic potential and to establish new treatments for

pathogenic diseases.

Declaration of interest

The authors report no declarations of interest

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50

Table 1 - Distribution of essential oils and their respective therapeutic actions (2010-2013)

Essential Oil Therapeutic Actions

Family Authors Species

Common name Popular use Scientific use

Calamintha nepeta Lesser Calamint

Digestive, stimulant, expectorant, sudorific,

tonic

Antifungal (Aspergillus,

dermatophytes) Lamiaceae Marongiu

et al., 2010

Carum copticum Ajowan

Aphrodisiac, antiasthmatic, antidiarrhoeal,

antimicrobial, fungicidal, anthelmintic, tonic, digestive, aromatic

Antibacterial

Apiaceae Rana et al.,

2011

Cicuta virosa L Cowbane or

Northern Water Hemlock

Analgesic, anticonvulsant

Antifungal (filamentous) Apiaceae Jun et al.,

2011

Cinnamomum cassia

Chinese cinnamon Cough, cold Antibacterial

(Salmonella) Lauraceae Lavinik, 2013

Cinnamomum zeylanicum

Blume

Indian cinnamo

n

Aphrodisiac, antiseptic,

aromatic, digestive,

stimulant, hypertensive,

sedative, vasodilator

Antifungal (A. flavus)

Antibacterial

Antibacterial

(Food pathogens)

Lauraceae

Trajano, 2011

Rana et al.,

2011

Silveira et al., 2012

Citrus limonun Lime

Stress, arteriosclerosis, fatigue, capillary

fragility, astringent,

diuretic, antiseptic,

anti-inflammatory

Bactericide Acinetobacter

(MDR) Rutaceae Guerra et

al., 2013

Coriandrum sativum L Coriander Diuretic, stomachic,

tonic Bactericide

Acinetobacter (MDR)

Apiaceae Guerra et al., 2012

Cyclotrichium leucotrichum -------------

Sedative, carminative, respiratory disorders

Antimicrobial Lamiaceae Mirjalili et

al., 2013

Cymbopogon citratus Stapf.

Lemongrass

Dermatoses (urticaria, ulcers, spots and rashes), venereal

diseases, urinary tract infections,

gastrointestinal, fevers, pain

Antifungal (Malassezia spp)

Antibacterial

Gramineae - Poaceae

Carmo, 2011

Rana et al., 2011

Cymbopogon flexuosus

East Indian Lemongrass

Anxiolytic, antibacterial, antidiarrheal,

antipyretic, digestive, carminative, sedative,

insect repellent.

Antibacterial (Food pathogens) Poaceae Silveira et

al., 2012

Cymbopogon martini Ginger

Antiseptic, analgesic, anesthetic, mosquito

repellent

Antifungal (fluconazole-

resistant C. albicans) Poaceae

Khan; Malik;

Ahmad. 2012

Cymbopogon winterianus Citronella

Sedative, bactericidal, carminative, insect

repellent

Antifungal (C. albicans, A.

flavus, A. fumigatus) Poaceae Oliveira et

al., 2011

Eucalyptus Eucalyptus expectorant, antipyretic,

vaginal irritation, enema, burn

Antimicrobial Myrtaceae Marzoug et al, 2010

Eugenia caryophyllata

Thunb Clove

Antiseptic, analgesic, anesthetic, mosquito

repellent

Antifungal (C. tropicalis)

Antibacterial

Anticariogenic

Lamiaceae

Mendes, 2011

Nuñez & Aquino,

2012

Kouidhi et al., 2010

Hyptis spp Lavender Basil bush Mint bush

fever, headache, gastrointestinal

bloating, rheumatism, Antimicrobial Lamiaceae Xu et al.,

2013

51

hepatitis, ulcer, malaria.

Laurus nobilis L Bay laurel Digestive, stimulant, expectorant, hepatic

Antibacterial (Food pathogens) Lauraceae Silveira et

al., 2012

Lavandula luisieri

Lavandula viridis

Tunisian Lavender ____________

Antifungal (Dermatophytes,

Aspergillus, Candida)

Antifungal

(Dermatophytes, Aspergillus, Candida)

Lamiaceae

Zuzarte et al 2012

Zuzarte et al 2011

Lippia sidoides Cham. Pepper-rosmarin Antioxidant,

antimicrobial Bactericidal Verbenaceae Castro et al., 2011

Magnolia grandiflora Magnolia

Astringent, antiseptic, antibacterial,

antiparasitic, antiviral, flavoring, carminative,

digestive, diuretic, hypertensive, muscle

relaxant, sedative, tonic

Antimicrobial

Magnoliaceae

Guerra-Boone et al., 2013

Mentha spp Mint

Insecticidal, antimicrobial,

antispasmodic, stimulant, anthelmintic,

carminative

Antifungal Lamiaceae Peixoto, 2010

Mentha spicata Spearmint

Antioxidant insecticidal, antimicrobial,

antispasmodic, anti-platelet, stimulant,

carminative, anthelmintic

Antimicrobial Lamiaceae Abdullah et al., 2010

Marrubium vulgare

White Horehound,

Common Horehound

Diuretic, cardiac stimulant, digestive,

expectorant. Antimicrobial Lamiaceae Zarai et al

2011

Ocimum basilicum L. Sweet Basil Flavoring, seasoning

Antibacterial Acinetobacter

(MDR) Antibacterial

(Food pathogens)

Lamiaceae

Guerra et al., 2012


Origanum majorana L.

Marjoram

Antioxidant,

antimicrobial, flavoring Bactericide

Acinetobacter (MDR)

Lamiaceae Guerra et al., 2012

Origanum vulgare Oregano Flavoring, antioxidant

Antibacterial (Salmonella)

Antifungal

(Candida pp.)

Antibacterial (Food pathogens)

Lamiaceae

Lavinik, 2013

Cleff, et al., 2010


Schinus molle L.

Peruvian pepper, American pepper,

escobilia, pepper tree

Astringent, aphrodisiac, balsamic, healing,

depurative, diuretic, laxative

Antibacterial

Anacardiaceae

Guerra-Boone et al., 2013

Thymus broussonetii

Boiss ----------- ---------------

Antifungal

Lamiaceae Bellete et

al., 2012

Thymus vulgaris Common thyme Flavoring, antioxidant Antibacterial (Salmonella) Lamiaceae Lavinik,

2013

Rosmarinus offinalis Rosemary Antioxidant,

antimicrobial Bactericide

Acinetobacter (MDR)

Lamiaceae Guerra et al., 2012

Supplemented with information from www.plantamed.com.br


52

5.2 Artigo 2:

Enviado para publicação em 18/09/2012 no periódico _Revista Brasileira de

Farmácia_ recebeu o número 539/847 - ISSN 2176-0667 - Status: publicado

(94 (3): 227 – 233, 2013).

Atividade antifúngica de óleos essenciais sobre leveduras Candida não

albicans

Antifungal activity of essential oils on non Candida albicans yeasts

Maiza Rocha de Abrantes1, Edeltrudes de Oliveira Lima

2, Mariana Araújo Paulo de

Medeiros1, Camilla Pinheiro de Menezes

2, Felipe Queiroga Sarmento Guerra

2 & Eveline

Pipolo Milan3.

1Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas – UFRN

2Departamento de Ciências Farmacêuticas / Centro de Ciências da Saúde – UFPB

3Departamento de Infectologia – UFRN

Endereço para contato: Maiza Rocha de Abrantes. Rua Maria Nazaré de

Araújo, 365, Capim Macio, Natal, Rio Grande do Norte, RN. CEP:59082-380.

Telefones do Trabalho: (84)33429796, (84)334299797, (84)33429801. Celular:

(84) 99551703. E-mail: [email protected]


53

RESUMO: Os produtos oriundos de plantas medicinais com atividade

antimicrobiana vêm ganhando grande perspectiva e tem como meta a obtenção

de princípios ativos para uma possível aplicação prática no tratamento das

infecções. Neste trabalho foi realizada uma avaliação da atividade antifúngica

desses óleos essências (OE) obtidos de plantas medicinais sobre Candida não

albicans, isoladas das mucosas vaginal e anal. A metodologia empregada foi a

técnica de difusão com disco, em ágar Sabouraud dextrose. Os ensaios foram

realizados em duplicata e os resultados considerados positivos quando as

médias aritméticas dos halos de inibição apresentaram valores iguais ou

superiores a 15 mm de diâmetro, em pelo menos, 50% do total das cepas

testadas. Dentre os produtos testados, as leveduras foram resistentes ao OE

de Coriandrum sativum. No entanto, apresentaram boa sensibilidade aos OEs

de Citrus limonum, Cinnamomum zeylanicum, Eucalyptus globulus, Eugenia

coryophyllata, Mentha arvensis, Mentha piperita, Mentha spicata, Origanum

vulgare, Pimpinella anisum com média de halos de inibição entre 18 a 49 mm

de diâmetro. Considerando os resultados obtidos no estudo, conclui-se que os

OEs acima citados, exceto o C. sativum, mostraram forte atividade anticandida.

Planeja-se realizar investigações mais amplas de tais produtos para a inibição

do crescimento de leveduras Candidas não albicans.

PALAVRAS CHAVES: Plantas medicinais, Produtos naturais, Resistência a

medicamentos.

54

ABSTRACT: The products from medicinal plants with antimicrobial activity have

been gaining great perspective and aims to achieve active principles for a

possible practical application in the treatment of infections. This work was

carried out an evaluation of the antifungal activity of these essential oils (EO)

obtained from medicinal plants on non-Candida albicans isolated from vaginal

and anal mucosa. The methodology used was the disk diffusion technique in

Sabouraud dextrose agar. Assays were performed in duplicate and the results

considered positive when the averages of inhibition halos show values equal or

superior to 15 mm in diameter, at least 50% of strains tested. Among the

products tested, the yeasts were resistant OE Coriandrum sativum. However

showed good sensitivity to the EOs of Citrus Limonum, Cinnamomum

zeylanicum, Eucalyptus globulus, Eugenia coryophyllata, Mentha arvensis,

Mentha piperita, Mentha spicata, Origanum vulgare, Pimpinella anisum mean

inhibition zones between 18 and 49 mm in diameter. Considering the results

obtained in the study, it is concluded that the EOs listed above, except C.

sativum, showed strong anti-Candida activity. It is planned to carry out more

extensive investigation of such a product for inhibiting yeast growth Candidas

not albicans.

KEYWORDS: Medicinal plants, Natural products, Drug resistance.

55

INTRODUÇÃO

Candidíase é a mais frequente infecção fúngica oportunista endógena,

por isso somente ocorre em tecidos de hospedeiros que apresentam

comprometimento de seus sistemas específicos ou inespecíficos de defesa,

causando significante mortalidade e morbidade (Rukayadi et al., 2011; Yang et

al., 2011; Kothavade et al., 2010).

Atualmente leveduras não Candida albicans como C. glabrata, C.

guilliermondii, C. parapsilosis e outras espécies têm apresentado maior

importância na etiologia das infecções fúngicas, quanto ao problema da

resistência antifúngica (Rukayadi et al., 2011; Asadzadeh et al., 2008; Yaya et

al., 2008).

Preocupações com o surgimento de cepas resistentes aos antifúngicos

convencionais têm aumentado e a realização de estudos de vigilância da

resistência antimicrobiana de leveduras têm ocorrido frequentemente. Um

exemplo é um estudo, publicado em 2008 por Yang e colaboradores, realizado

com um total de 964 isolados de Cândida coletados em Taiwan, onde os

autores observaram que 16 dos 17 isolados anfotericina B - resistentes

pertenciam a espécies de Candida não-albicans.

É bom ressaltar a questão da resistência in vitro versus in vivo em

isolados de Candida não-albicans, bem como da resistência inata e adquirida.

Espécies como C. krusei apresentam resistência intrínseca ao fluconazol, ao

passo que outras espécies, como C. tropicalis e C. glabrata têm apresentado

crescente resistência adquirida (Tan et al., 2008).

56

De forma convencional, o tratamento da candidíase não tem se mostrado

abrangente em sua totalidade, pelo surgimento de constantes barreiras

ocasionadas, principalmente, pela reduzida quantidade de agentes

antimicóticos disponíveis para tratamento sistêmico, como também a elevada

toxicidade dos mesmos e o crescente aumento de espécimes resistentes aos

antifúngicos (Khan et al., 2012; Kiraz & Yasemin, 2011).

A crescente preocupação com a resistência e com a toxicidade dos

antifúngicos fez surgir importantes estudos relacionados com atividade

antifúngica de produtos vegetais, destacando-se entre eles os realizados por

Yaya el al., 2011, Oliveira el al., 2011, Zapata et al., 2010; Coutinho et al.,

2009, os quais testaram compostos derivados de produtos naturais contra

várias espécies fúngicas. A tendência atual nas pesquisas com produtos

naturais é a obtenção de princípios ativos contidos nas espécies vegetais para

uma possível aplicação no tratamento de infecções causadas por

microrganismos, entre eles, os fungos.

Os óleos essenciais são compostos químicos oriundos do metabolismo

secundário das espécies vegetais, constituindo uma rica fonte de compostos

biologicamente ativos. São conhecidos desde a antiguidade por possuir

propriedades antifúngicas cuja utilização pode representar um avanço contra os

mecanismos de resistência que inativam antifúngicos padrões (Castro, 2010;

Saad et al., 2010; Tempone et al., 2008). Assim, a descoberta de produtos

naturais com princípios ativos de atividade antifúngica pode representar uma

nova ferramenta à produção e ao uso de fitoterápicos no combate aos agentes

infecciosos (Khan, et al., 2012; Mendes, 2011; Silva, et al., 2009).

57

Dentro desse contexto, o objetivo desse estudo foi realizar um “screening”

da atividade antifúngica de óleos essenciais sobre leveduras Candida não

albicans o qual será utilizado em futuras investigações.

MATERIAIS E MÉTODOS

Desenho do estudo

Trata-se de um estudo “in vitro”, onde foram estimadas as ações

biológicas de óleos essenciais de plantas medicinais brasileiras frente às

leveduras Candida não albicans isoladas das mucosas vaginal e anal.

Óleos Essenciais

Os óleos essenciais selecionados para a realização do estudo foram

extraídos dos espécimes botânicos especificados no quadro 1.


da atividade antifúngica sobre cepas de Candida não albicans.

Fonte: www.plantamed.com.br

Espécie Família Nome popular

Cinnamomum zeylanicum Blume Lauraceae canela-da-índia

Citrus limonum Burm. F. Rutaceae limão-siciliano

Coriandrum sativum L. Krause Apiaceae coentro

Eucalyptus globulus Labill Myrtaceae eucalipto

Eugenia coryophyllata Thumb. Lamiaceae cravo-da-índia

Mentha arvensis L. Stewart Lamiaceae hortelã comum

Mentha piperita L. Briq. Lamiaceae hortelã-pimenta

Mentha spicata Schrad. ex Willd Lamiaceae hortelã-peluda

Ocimum basilicum Schumach. & Thonn Lamiaceae manjericão

Origanum vulgare L. (G. Beck) Klok Lamiaceae orégano

Pimpinella anisum Gaertn. Apiaceae erva-doce


58

Os óleos essenciais foram obtidos pelo processo de extração por

destilação a vapor, segundo as técnicas adotadas pela FERQUIMA – Indústria

e Comércio Limitada, Vargem Grande / São Paulo.

Microrganismos

Para o estudo de atividade antifúngica com óleos essenciais, foram

utilizados isolados de Candida não-albicans obtidos de um banco preexistente,

provenientes de vagina e ânus. Este banco foi coletado e identificado pelo

Laboratório de Micologia do Hospital Giselda Trigueiro (HGT), Natal-RN,

mediante a aprovação do Comitê de Ética do Centro de Ciências da Saúde da

UFRN, sob protocolo 154/06. As cepas foram identificadas através de sua

macro e micromorfologia, comportamento fisiológico e bioquímico, conforme o

protocolo recomendado por Kurtzman & Feel, 1998. A concordância dos

resultados da identificação bioquímica do Banco de Leveduras foi realizada no

Laboratório de Microbiologia do Hospital Pediátrico Maria Alice Fernandes,

Natal (RN), através do Sistema MicroScan®.

Inóculo

A partir das culturas recentes e mantidas em Ágar Sabouraud Dextrose -

ASD (Difco® - France), durante 24-48 horas a 35C, o inóculo foi preparado e

padronizado em solução fisiológica a 0,9% estéril. Inicialmente, preparou-se

uma suspensão comparativa com o tubo 0,5 da escala de Mc Farland. A

mesma foi ajustada no espectrofotômetro (Leitz-Fhotometer 340-800), para

conter aproximadamente 106 UFC/mL. Em seguida, essa suspensão foi diluída

com água destilada numa proporção de 1:9, resultando em um inóculo

59

contendo aproximadamente 105 UFC/mL, que foi utilizado nos ensaios

(Koneman et al., 2008; Ostrosky et al., 2008).

“Screening” microbiológico Para a realização do estudo, os óleos essenciais foram utilizados “in

natura”. O método microbiológico utilizado foi o de difusão em meio sólido com

discos de papel (Sensiobiodisc do Centro de Controle e Produtos para

Diagnósticos Ltda – CECON/SP) impregnados com 10 µL dos óleos essenciais,

desenvolvidos em ASD. O sistema foi incubado a 350C, por 48 horas (Koneman

et al., 2008; Yaya, 2008; Ostrosky et al.,2008). Os ensaios foram realizados em

duplicatas e os resultados considerados positivos quando a média aritmética

dos halos de inibição apresentaram valores iguais ou superiores a 15 mm de

diâmetro, em pelo menos, 50% do total das cepas testadas (Mendes, 2011).

A nistatina (Centro de Controle e Produtos para Diagnósticos Ltda –

CECON/SP) foi selecionada como antifúngico padrão, após realização do

antifungigrama pelo método microbiológico de difusão em ASD, o qual

apresentou melhor perfil de sensibilidade para esse banco de leveduras.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O presente estudo permitiu identificar através da avaliação pré-clínica a

atividade antifúngica de óleos essenciais sobre Candida não albicans,

utilizando o método de investigação preliminar, difusão em meio sólido. Tal

método fornece informação qualitativa, mas bastante útil para estabelecer a

sensibilidade de microrganismos aos óleos essenciais.

60

Na tabela 1 estão apresentados os resultados dos óleos essenciais

testados sobre leveduras Candida não albicans, isoladas da mucosa vaginal.

Dentre, os onze produtos testados, as leveduras apresentaram-se resistentes

apenas ao óleo essencial de C. sativum, os demais óleos (C. limonum, C.

zeylanicum, E. coryophyllata, E. globulus, M. arvensis, M. piperita, M. spicata,

O. basilicum, O. vulgare e P. anisum) produziram intensa atividade, pois a

média dos seus halos de inibição oscilou entre 17 a 49 mm de diâmetro,

mostrando-se superiores à média daqueles obtidos com a droga padrão

nistatina (16 mm).

61

Tabela 1 – Halos de inibição de onze óleos essenciais e nistatina sobre Candida não albicans de origem vaginal

Os resultados apresentados na tabela 2 são referentes aos ensaios para

avaliação da atividade antifúngica dos óleos essenciais testados sobre o

crescimento de leveduras Candida não albicans, isoladas da mucosa anal.

Essas leveduras apresentaram resistência ao óleo essencial de C. sativums,

perfil semelhante ao observado nas de origem vaginal. O óleo de O. basilicum

também apresentou perfil de resistência para essas leveduras desse sítio, pois

a média aritmética dos halos de inibição apresentaram valores inferiores a

15mm de diâmetro, em mais de 50% das cepas testadas. Os demais óleos

produziram intensa atividade, onde a média dos seus halos de inibição foi entre

24 a 49 mm de diâmetro, mostrando-se bem superiores à média da droga

padrão nistatina com 17 mm de diâmetro.

Óleos essenciais (mm)

CCepas

C.

limo

num

C.

sativum

C.

zeyla

nic

um

E. c

ory

ophylla

ta

E.

glo

bulu

s

M.

arv

ensis

M.

pip

erita

M. spic

ata

O.

basili

cum

O. vulg

are

P.

anis

um

Contr

ole

nis

tatin

a (

NY

)

C. parapsiloses 02V 50 0 23 0 50 50 50 50 20 14 50 15

C. parapsiloses 15V 50 0 22 17 50 50 50 50 19 23 50 15

C. guillermondii 30V 50 0 20 22 50 50 50 50 18 50 50 18


C. parapsiloses 50V 50 0 22 12 50 50 50 50 16 50 25 19



C. parapsiloses 71V 50 0 35 50 50 50 50 50 20 50 50 15



C. glabrata 82V 50 0 23 50 50 50 50 50 20 50 50 16

C. glabrata 85V 50 0 20 18 30 50 50 50 16 15 24 13



62

Tabela 2 – Halos de inibição de onze óleos essenciais e nistatina sobre Candida não albicans de origem anal

Os melhores resultados foram observados para os óleos essenciais de C.

limonum, E. globulus, M. arvensis, M. piperita, M. spicata, O. vulgare e P.

anisum. A maioria destes óleos é originada de plantas pertencentes à família

Lamiaceae. Isto pode significar que os mesmos compostos sejam responsáveis

pela atividade anticandida nestas plantas.

Mendes, 2011, observou halos médios de inibição de 42mm, 21mm,

39mm e 43mm, respectivamente para os óleos essenciais de C. zeylanicum

(canela-da-índia), C. sativum L (coentro), E. coryophyllata (cravo-da-índia) e O.

vulgare L. (orégano), sobre Candida tropicalis. Em nosso estudo também

foram observados bons resultados para C. zeylanicum (canela-da-índia), E.

coryophyllata (cravo-da-índia) e O. vulgare L. (orégano). Apenas C. sativum L

(coentro) não apresentou perfil de sensibilidade.

Óleos essenciais (mm)

CCepas

C.

limo

num

C.

sativum

C.

zeyla

nic

um

E. corp

ophylla

ta

E. g

lobulu

s

M.

arv

ensis

M.

pip

erita

M. spic

ata

O.

basili

cum

O. vulg

are

P.

anis

um

Contr

ole

nis

tatin

a

(NY

)

C. parapsiloses 02A 50 0 18 0 50 50 50 50 14 50 50 13

C. glabrata 15A 50 0 20 15 40 50 50 50 12 50 30 22

C. parapsiloses 30A 50 0 34 34 50 50 50 50 16 30 50 19

C. guillermondii 31A 50 0 30 30 50 50 50 50 16 50 50 17


C. glabrata 50A 50 0 22 12 50 50 50 50 14 50 25 15


C. parapsiloses 71A 50 0 30 22 50 50 50 50 15 50 50 15


C. glabrata 81A 50 0 25 25 50 50 50 50 22 50 50 15

C. glabrata 82A 50 0 18 20 40 50 50 50 14 50 50 17

C. glabrata 85A 38 0 18 15 34 30 30 30 10 40 20 14



C . guillermondii 96A 50 0 22 20 44 50 50 50 15 50 50 17


63

Kouidhi et al., 2010, utilizando o método de difusão em disco relataram a

potente atividade antibacteriana e antifúngica do óleo de Eugenia caryophyllata

(cravo) contra 114 cepas de bactérias cariogênicas e 46 cepas de leveduras,

entre elas Candida albicans, Candida guilliermondii, Candida glabrata e

Candida tropicalis.

Os resultados desta investigação também se assemelham aos de Lima et

al., (2007) que avaliando atividade anticandida, pelo método de difusão em

meio sólido, acompanhada de microdiluição, observaram que o óleo essencial

de C. zeylanicum apresentava destacável resultado, visto que inibiu o

crescimento de 58% das cepas ensaiadas e CIM de 4%.

Fu et al.,2007, também poderam constatar que o óleo essencial de

Syzygium aromaticum (cravo) apresentava atividade antifúngica contra cepas

de C. albicans, com halos de inibição de 32mm, resultados semelhantes ao que

foi descrito nesta investigação para C. não albicans.

Utilizando a técnica de microdiluição, Yaya et al., (2008 e 2011)

observaram que o extrato de Albizia myriophylla Benth (Fabaceae) e Curcuma

xanthorrhiza Roxb (Zingiberaceae) também apresentam atividades anticandida.

As pesquisas envolvendo plantas medicinais têm crescido

significativamente em número e importância, principalmente quanto aos

aspectos químicos, etnobotânicos e atividade biológica, no entanto, muitas são

as espécies vegetais que ainda carecem de investigação. A possibilidade de

se obter produtos menos agressivos, de menor custo e, portanto, mais

acessíveis tem incentivado a avaliação de compostos quimicamente puros,

óleos essenciais e extratos brutos no que diz respeito às suas ações

terapêuticas, efeitos tóxicos, entre outros, fundamentando a validade dos

64

princípios medicamentosos com o intuito de atender às necessidades básicas

de saúde (Kurtzman & Feel, 1998). Neste contexto, os produtos naturais

representam uma importante e interessante área de desenvolvimento e sua

completa apreciação permite comprovar a legitimidade dos seus inúmeros

benefícios.

CONCLUSÕES

Os óleos essenciais C. limonum, C. zeylanicum, E. globulus, M. arvensis,

M. piperita, M. spicata, O. vulgare e P. anisum mostraram forte atividade

anticandida independentemente do sítio de origem das espécies, superando os

valores de inibição da nistatina.

O óleo essencial de C. sativum (Coentro) não apresentou atividade

antifúngica contra as espécies de Candida não-albicans.

O óleo de O. basilicum apresentou perfil de resistência para as leveduras

do sítio anal.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Hospital Giselda Trigueiro (HGT) e ao Hospital

Pediátrico Maria Alice Fernandes, Natal-RN, pela doação e identificação

bioquímica do Banco de Leveduras.

65

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69

5.3 Artigo 3:

Periódico Journal of Medical Microbiology (JMM) - Print ISSN: 0022-2615;

Online ISSN: 1473-5644. Status: a ser submetido

Antifungal activity of the essential oil of Mentha spicata L. on clinical

strains of Candida guilliermondii

Maiza Rocha de Abrantes1, Edeltrudes de Oliveira Lima2, Camilla Pinheiro de

Menezes2, Felipe Queiroga Sarmento Guerra2, Fábio Santos de Souza3,

Vinicius Nogueira Trajano3, Valmir Gomes de Souza3 & Eveline Pipolo Milan4.

Author affiliation

1Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Centro de Ciências da Saúde,

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil;

2Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade

Federal da Paraíba, João Pessoa, PB, Brazil;

3Laboratório Unificado de Desenvolvimento e Ensaios de Medicamentos, Universidade Federal

da Paraíba, João Pessoa, PB, Brazil;

4Departamento de Infectologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN,

Brazil.

Corresponding author. Mailing address:

Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Centro de Ciências da Saúde,

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, R. Gal. Gustavo Cordeiro de Farias, S/N, 1o

andar, Petrópolis, Natal, RN, Brazil. CEP: 59012-570. Phone: +55 (84) 3342-99797, 3342-9801.

Mobile: + 55 (84) 9955-1703. E-mail: [email protected].

Abbreviations:

Eos - essential oils

MIC - Minimal Inhibitory Concentration

MFC - Minimal Fungicidal Concentration

Keywords: Candidiasis, Volatile oils, Natural products.


70

ABSTRACT

Candidiasis is a relevant issue because of the increasing number of

immunocompromised individuals and the emergence of strains resistant to

conventional antifungal agents. The search for new, more effective and less

toxic antifungal agents is of fundamental importance to the treatment of this

disease, and essential oils (EOs) are an excellent alternative for this purpose.

The present study investigated the antifungal activity of the EO of Mentha

spicata on anal and vaginal Candida guilliermondii. Thus, we determined the

Minimal Inhibitory Concentration (MIC), Minimal Fungicidal Concentration

(MFC) and antifungal activity of the EO. The EO of M. spicata was extracted by

steam distillation. Phytochemical analysis of M. spicata showed the presence of

carvone (84.32%), followed by limonene (13.70%) and isodihydrocarvone

(0.82%). Results for MIC varied from 32 to 128 μg/mL, whereas MFC values

ranged between 64 and 1024 μg/mL. Evaluating the effect of the EO and

nystatin 100 Ul/mL, we observed that the standard antifungal agent had a

fungicidal effect after a 4-hour exposure, whereas the EO of M. spicata showed

a fungistatic effect in MIC, MICX2 and MICX4 on all evaluated strains.

Therefore, we concluded that the EO of M. spicata showed strong antifungal

activity against all evaluated strains.

INTRODUCTION

Candidiasis is a relevant issue because of its incidence and severe

complications. It consists of opportunistic and predominantly endogenous fungal

infections, causing significant morbidity and mortality in immunocompromised

patients (Rukayadi et al., 2011, Jin et al., 2010; Kothavade et al., 2010).

Most cases of candidiasis are caused by C. albicans. However, non-albicans

Candida species have recently shown to be infectious agents for candidiasis,

indicating a changing trend in the etiology of this disease. The non-albicans

Candida species commonly isolated from clinical material are C. glabrata, C.

tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei, C. guilliermondii, C. kefyr, C. lusitaniae, C.

viswanathii, C. famata, C. norvegensis and C. haemulonii (Oberoi, et al., 2012;

71

Rukayadi et al., 2011; Couto et al., 2011; Santos, 2009).

Increasing resistance to antifungal agents, the limited number of available

drugs, therapeutic limitations, ineffectiveness, toxicity, severe neutropenia, drug

interactions and insufficient bioavailability of the currently available antifungal

drugs make the treatment of human mycoses very difficult, increasing the

search for new therapeutic alternatives among aromatic plants and their

essential oils, empirically used for their antifungal properties (Khan, et al., 2012;

Silva, et al., 2009).

M. spicata L., a creeping rhizomatous, perennial herb with a strong aromatic

odor, belongs to the Lamiaceae family. It is commonly known as spearmint, and

it is a hybrid between M. sylvestris and M. suaveolens. Carvone and limonene

are the major chemical constituents of the essential oil of M. spicata L.

(Govindarajan et al., 2012; Mkaddem, 2009; Ferreira, 2008). In alternative

medicine, it has been used to treat respiratory diseases and the common flu, as

well as tranquilizer, gastric stimulant, and antiflatulent, anthelmintic,

antibacterial and antiseptic agents (Peixoto, 2010; Ferreira, 2008).

The development of effective strategies for the treatment of candidiasis and

other fungal diseases is a challenge, considering the increase in opportunistic

fungal infections in human immunodeficiency virus-positive patients and in other

immunocompromised patients (Khan, 2012; Zirkel et al., 2012). The main goal

of the search for new herbal drugs is not to replace existing drugs, but to

broaden the available therapeutic arsenal and to offer equivalent drugs at lower

prices or with more appropriate action spectra (Carmo, 2011). Thus, the search

for a new product that acts on potentially pathogenic or opportunistic fungi is

pivotal for the treatment of candidiasis: a product with a broad spectrum action,

short-term use, minimal adverse effects on the host and high levels of efficacy.

Hence, our purpose was to investigate the antifungal activity of the essential oil

of M. spicata on clinical strains of Candida gulliermondii.

72

METHODS

Essential Oil of M. spicata and chemical analysis

Chemical composition of the essential oil (EO) of M. spicata L. (FERQUIMA –

Indústria e Comércio Limitada, Vargem Grande/São Paulo, batch 184) was L-

carvone 70%, Limonene 19%, others 11%.

Phytochemical analysis was performed by a Shimadzu Gas Chromatograph

(GC-17A) equipped with a Mass Spectrometer (MS). Data collection and

integration were carried with the software Class5000. The carrier gas was

helium at 1.6 mL/min with split ratio of 1:5.

Chromatographic separation was performed on a DB-5 capillary column (30 m x

0.25 mm x 0.25 μm). The temperature of the column oven was initially set to

60°C and subsequently increased to 120°C (5°C/min) and then to 280°C

(20°C/min). Injector and detector temperatures were 260°C and 280°C,

respectively. The total run time for each injection was 20 min and the injection

volume was 1.0 μl. The identification of the EO was performed using a

computer system and data processing (workstation) connected to the GC-MS

and equipped with a Wiley library, 6th Edition 5000-class 1999 with 229.119

spectra.

Microorganisms

We used fourteen strains of Candida guilliermondii from an existing database,

originally obtained from vaginal and anal orifices. This database was collected

and identified by the Mycology Laboratory of the Hospital Giselda Trigueiro

(HGT) Natal, RN, Northeastern Brazil, with the approval from the Ethics

Committee of the Centro de CIências da Saúde of the Universidade Federal do

Rio Grande do Norte (protocol 154/06). The concordance in the results from

biochemical identification tests of the Banco de Leveduras was performed by

the Laboratory of Microbiology of the Hospital Pediátrico Maria Alice Fernandes

by MicroScan® System.

73

Standard antifungal drug

In order to test the biological activity of the EO of M. spicata on strains of C.

guilliermondii, we used the standard antifungal drug Nystatin (Sigma-Aldrich®)

as a control treatment.

Microbiological assays

Determination of the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal

Fungicidal Concentration (MFC)

Antifungal activity assays were performed by microdilution (Koneman et al.,

2008; Ostrosky et al., 2008; Hadacek & Greger, 2000; Ellof, 1998). Prior to

testing, cultures on Sabouraud Dextrose Agar (SDA; Difco®-France) were

incubated at 35°C for 24 to 48 h. The inoculum was prepared and standardized

in sterile saline solution (0.9%). Initially, a McFarland 0.5 standard suspension

was prepared. The suspension was then diluted in distilled water at 1:9 ratios

resulting in an inoculum of approximately 105 CFU/mL.

Sterile 96-well microtiter plates (INLAB) were used. To each well, we added 100

µl of Sabouraud Dextrose Broth (SDB; Difco®-USA/France) followed by the

addition of 100 µl of an emulsion of the EO at an initial concentration of 1024

µg/mL to the first row of wells. This solution was then serially diluted twofold to

obtain final concentrations ranging from 1024 µg/mL to 4 µg/mL. Finally, 10 µL

of yeast cell suspension were added to each column of wells, with each column

corresponding to a different strain of C. guilliermondii. In conjunction with

microbiological assays, we performed sterility control (SDB medium with no

yeast suspension), microorganism growth and viability control (antifungal-free

medium) and standard antifungal control (nystatin 100 UI/mL).

The assays were incubated at 35ºC for 24-48 h, followed by the reading and

interpretation of the results. MIC was defined as the lowest concentration

capable of inhibiting any visible fungal growth in the wells when compared to

the control treatment. Assays were performed in duplicate and the results were

74

expressed as the geometric mean of MIC values obtained in both assays (Eloff,

1998; Cleeland & Squires, 1991). The antifungal activity was evaluated

according to the following parameters: MIC ≤ 500μg/mL = strong antimicrobial

activity; MIC = 600-1600μg/mL = moderate activity; MIC ≥ 1600μg/mL = low

activity (Sartoratto et al., 2004).

Following MIC determination, MFCs were determined for: drug concentrations

that inhibited growth after incubation, the two immediately above concentrations

and the positive controls. For this purpose, 20 μL of each of these wells were

transferred onto Sabouraud dextrose agar plates. The plates were then

incubated at 35°C for 24 h and MFC readings were defined based on the

controls’ growth. MFC was defined as the lowest concentration yielding a

growth rate lower than three (03) CFUs on a streaked SDA plate (Amato Neto

et al., 1994; Zaror & Espenel-Ingroff, 1989).

Effect of the essential oil on C. guilliermondii (time-kill)

Time-kill curves were obtained according to the methodology used previously

by Klepser et al. (1998) and by selecting two representative strains of C.

guilliermondii. Prior to the assay, yeasts were grown on SDA. Fungal

suspensions were prepared in accordance with 0.5 McFarland standard (1-

5x106 CFU/mL) (Hadacek & Greger, 2000; Cleeland & Squires, 1991). One

milliliter of the adjusted fungal suspension was added to 9 mL of either SDB

with drugs or SDB without drugs. This resulted in a 1:10 dilution of the fungal

suspension and yielded a starting inoculum of approximately 1-5 x 105 CFU/mL.

Nystatin and EO concentrations in test solution were, respectively, 100UI/mL

and equal to 1, 2 and 4 times the MIC value. At predetermined time points (0, 2,

4, 8 and 24 h) following the addition of either EO or Nystatin, a 100-μL aliquot

was removed from each culture tube and then serially diluted with sterile

distilled water. A 10-μL aliquot from each dilution was uniformly streaked onto

SDA plates for colony count determination. When the number of colonies was

less than 1000 CFU/mL, 10 μL of sample were removed and plated undiluted

(Giannuzzi, 1996).

75

Following incubation at 35°C for 24 to 48 h, the number of CFU on each plate

was determined and multiplied by the dilution factor in order to get the number

of CFU per mL. The minimum detection limit was 100 CFU/mL.

Concentration time-kill curves were constructed by plotting the log10 CFU per

milliliter values versus time with GraphPad Prism 5.0 for Windows (GraphPad

Software, San Diego, CA). Fungicidal activity was defined as a drop in the

starting inoculum by at least 3 log10 CFU/ml (≥ 99,9%) whereas fungistatic

activity as a drop in the starting inoculum by less than 3 log10 CFU/ml (< 99,9%)

(Hadacek & Greger, 2000; Cleeland & Squires, 1991).

RESULTS

The chemical composition of EO from tested M. spicata leaves was determined

by GC-MS analysis. Table 1 shows their quantitative and qualitative

composition and their respective retention times and percentages. The major

component was carvone (84.32%) followed by limonene (13.70%). In addition,

there were traces of isodihydrocarvone (0.82%).

MIC analysis showed a variation from 32 to 128 μg /mL (Table 2). MIC50 and

MIC90 values were, respectively, 64 μg/mL and 128 μg/mL. Fungal strains were

all able to grow in SDB alone (without EO), showing its viability.

The MFC values for the EO of M. spicata ranged between 64 and 1024 μg/mL.

The results showed that 12/14 (86%) of the strains subjected to biological

assays had MFC values ≤ 512 μg/mL. Only 1/14 (7.1%) was 1024 μg/mL.

MFC50 was 256 μg/mL.

The effect of different concentrations of the EO on microbial death was based

on the MIC values of two representative strains of C. guilliermondii. Time-kill

curves were plotted graphically as log10CFU/mL versus time, for C.

guilliermondii strain 9A (Figure 1) and C. guilliermondii strain 9V (Figure 2), in

the absence of EO (control), in the presence of MIC, MICX2 and MICX4, and in

76

the presence of nystatin 100 UI/mL.

According to Figure 1, only nystatin 100 UI/mL showed fungicidal effect after a

4-hour exposure (drop in the starting inoculum by at least 3 log10 CFU/ml).

However, the fungistatic effect was observed in the presence of MIC, MICX2

and MICX4 of the EO of M. spicata against C. guilliermondii strain 9 A.

Figure 2 shows that the time-kill curve of C. guilliermondii strain 9V with EO of

M. spicata is similar to the results of C. guilliermondii strain 9 A (Figure 1).

However, the rate and extent of antifungal activity varied slightly between the

two strains.

DISCUSSION

Plant-originated substances have been used for the treatment of

various diseases. However, the potential use of plants as a source of new drugs

has not been fully explored. In fact, the available data show that only 15 to 17%

of plants have had their pharmacological properties sufficiently studied (Laviniki,

2013; Oliveira et al., 2011). Thus, the search for new drugs in plants with

therapeutic potential is pivotal for the development of new treatments.

Moreover, EOs are important because of their several pharmacological

activities: antioxidant (Maskovic et al., 2013; Xu et al., 2013), anti-inflammatory

(Ramos et al., 2013; Salud et al., 2013), larvicide (Govindarajan et al., 2012;

Souza et al., 2012), insecticide (Arango et al., 2013; Salama et al., 2012),

antibacterial (Guerra et al., 2013; Castro, et al., 2011) and antifungal (Tyagi et

al., 2013; Khan et al., 2012; Oliveira et al., 2011).

The EOs, complex mixtures of volatile compounds originating from the

secondary metabolism of plants, are a rich source of biologically active

compounds, especially terpenes and phenylpropanoids, found in broad-

spectrum antimicrobials (Silva et al., 2013; Lima, 2011; Saad et al., 2010).

GC-MS analysis of the EO of M. spicata L. resulted in the identification of two

77

major components: carvone and limonene. In other studies, these

phytochemicals have been among the most commonly isolated compounds

(Govindarajan et al., 2012; Abdullah et al., 2010; Hussain et al., 2010;

Chauhana et al., 2009; Mkaddem et al., 2009; Soković, et al., 2009).

In medicine, carvone has been used to treat respiratory diseases, the common

flu, as well as tranquilizer, gastric stimulant, and as antiflatulent, anthelmintic,

antibacterial, antifungal and antiseptic agents. It has also been used in

condiments, chewing gum, candy, toothpaste and shaving cream, not only for

its flavor, but for its antibacterial and antiseptic properties (Ehlert et al., 2013).

Limonene is the key precursor of the main Mentha monoterpenes, including

carvone. It has been directly used in the production of natural flavors and

fragrances (Silva, 2011) and artificial essential oils, and as solvents and

dispersants (Ehlert et al., 2013).

According to Sartoratto and colleagues (2004), EOs with MIC values of 500

μg/mL or lower have strong antimicrobial activity. Based on this principle, the

EO of M. spicata showed an excellent antimicrobial potential against the studied

strains of C. guilliermondii (MIC values ranged from 128 to 32 μg/mL). Using

microdilution assays, Soković, at al. (2009) have observed a strong antifungal

activity in the EO of Mentha spp, which may be used as a natural preservative.

A clear understanding of the pharmacodynamic properties of antifungal agents

is important for the adequate treatment of fungal infections such as candidiasis.

For certain antifungal agents, determining the MFC and time-kill curve could be

clinically more relevant than the determination of MIC (Lemos et al., 2009).

Drug-concentration time-kill curves have shown that the higher the EO

concentration, the greater the antifungal activity (Guerra, et al., 2013). Hence,

the EO of M. spicata used on C. guilliermondii strains selected for our study

showed a concentration-independent fungistatic effect. In contrast, Oliveira

(2011) investigated the activity of the EO of Cymbopogon winterianus

(lemongrass) on C. albicans, A. flavus and A. fumigatus using time-kill

78

methodology and observed that this EO had a concentration-dependent

antifungal effect for all strains tested.

Clinically, differences in fungal dynamics may influence the selection of optimal

dose regimens for antifungal therapies. Agents in which the rate and extent of

antifungal activity improve with increasing concentration (e.g. amphotericin B

and nystatin) may be optimized by the administration of prolonged therapeutic

regimens. In contrast, the efficacy of antifungal agents such as fluconazole

does not improve with increasing concentration because of its concentration-

independent fungistatic effect (Oliveira, et al., 2011).

Several studies using fungal cell viability test (time-kill) have investigated the

activity of the EOs in plants from the Lamiaceae family. Among them, Mendes

(2011) has observed a concentration-dependent antifungal activity in the EO of

Eugenia caryophyllata Thunb on C. tropicalis strains.

The increased resistance of Candida species have valued the search for new

antifungal agents. The antifungal activity demonstrated by the essential oil of M.

spicata L makes it a potential candidate as a major agent in controlling fungi

growth that cause Candidiasis.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank to the Hospital Giselda Trigueiro (HGT) and Hospital Pediátrico Maria

Alice Fernandes for the donation and biochemical identification (Banco de

Leveduras), especially to pharmacists Ana Cristina Santos Fernandes and

Maria Guimaraes Narriman Goveia; to Professors Telma Maria Araújo Moura

Lemos and Tereza Neuma de Souza Brito for logistical support in the

elaboration of this study; and to everyone who work in the Laboratory of Clinical

Microbiology at the Universidade Federal do Rio Grande do Norte and in the

Laboratory of Mycology at the Universidade Federal da Paraíba.

79

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Table 1 – Chemical composition of the essential oil from M. spicata leaves.

Picos Retention time (min) Phytochemicals Area % formulation

1 7.45

limonene

1031 13,70

2 11.71

iso-dihidrocarvona

1193 0,82

3 12.74

carvone

1242 84,32

4

other compounds

1,15

85

Table 2 – Minimal Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal Fungicidal

Concentration (MFC) of the EO of M. spicata on clinical strains of C.

guilliermondii.

+ ꞉ Microorganism growth - ꞉ Microorganism growth inhibition A = anal e V= Vaginal MIC and MFC were determined by geometric mean

Strains

Essential oil (µg/mL)

Nystatin 100 UI

Strain

Control

MIC MFC

3A - C. guilliermondii 128 512 - +


5A- C. guilliermondii 64 512 - +

7A - C. guilliermondii ≥2048 ≥2048 - +

8A- C. guilliermondii 32 128 - +



11A- C. guillermondiii ≥2048 ≥2048 - +

4V - C. guilliermondii 64 128 - +

5V- C. guilliermondii 64 128 - +



8V- C. guilliermondii 64 256 - +


86

0 4 8 12 16 20 240

1

2

3

4

5

6

7Control

MIC

MIC X 2

MIC X 4

Nistatine

limit

Hours

Lo

g C

FU

/mL

Figure 1 - Time-kill curve (Log CFU/mL) of C. guilliermondii strain 9A with EO

of M. spicata and nystatin.

0 4 8 12 16 20 240

1

2

3

4

5

6

7Control

MIC

MIC X 2

MIC X 4

Nistatine

Limit

Hours

Lo

g C

FU

/mL

Figure 2 - Time-kill curve (Log CFU/mL) of C. guilliermondii strain 9V with EO of M.

spicata and nystatin.

87

5.4 Artigo 4:

Periódico: Brazilian Journal of Microbiology (JMM) - ISSN: 1517-8382 versão

impressa. ISSN: 1678-4405 versão on-line. Status: a ser submetido

Antifungal mechanism of essential oil from Mentha spicata L.

on clinical strains of Candida guilliermondii

Maiza Rocha de Abrantes1, Edeltrudes de Oliveira Lima2, Camilla Pinheiro

de Menezes2, Felipe Queiroga Sarmento Guerra2, Fábio Santos de Souza3,

Vinicius Nogueira Trajano3, Valmir Gomes de Souza3 & Eveline Pipolo

Milan4.

1Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Centro de Ciências da

Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil;

2Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde,

Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, PB, Brazil; 3Laboratório

Unificado de Desenvolvimento e Ensaios de Medicamentos, Universidade

Federal da Paraíba, João Pessoa, PB, Brazil; 4Departamento de Infectologia,

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.

Corresponding author. Mailing address: Departamento de Análises Clínicas e

Toxicológicas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio

Grande do Norte, R. Gal. Gustavo Cordeiro de Farias, S/N, 1o andar,

Petrópolis, Natal, RN, Brazil. CEP: 59012-570. Phone: +55 (84) 3342-99797,

3342-9801. Mobile: + 55 (84) 9955-1703. E-mail: [email protected].


88

ABSTRACT

The study of the antifungal activity of medicinal plants has achieved a great

importance in recent years, and aims to find active principles to develop new

practical applications such as the development of new treatment for pathogenic

diseases. The present study verified the biological activity of the essential oil

(EO) of Mentha spicata L., extracted by steam distillation, on anal and vaginal

Candida guilliermondii. For this purpose, we determined the Minimal Inhibitory

Concentration (MIC), observed micromorphological changes in C. guilliermondii

using a microculture chamber and investigated the antifungal action mechanism

using the sorbitol bioassay. Phytochemical analysis of M. spicata showed the

presence of carvone (84.32%), followed by limonene (13.70%) and

isodihydrocarvone (0.82%). Results for MIC varied from 32 to 128 μg/mL. The

EO of M. spicata showed strong antifungal activity against all strains tested.

Micromorphological changes in C. guilliermondii were observed by optical

microscopy at all concentrations tested (MIC, MICx2), which were similar to

results found using 100 Ul/mL nystatin. During the experiment, we observed a

change in MIC values when sorbitol concentration was increased by 4 times the

initial concentration, which suggests that the components of the EO have a

direct effect on the cell wall. Therefore, we concluded that M. spicata may be a

potential candidate as a major agent in controlling fungi growth that cause

Candidiasis.

Keywords: Candidiasis, Sorbitol, Natural products.

89

INTRODUCTION

Mentha spicata L., a creeping rhizomatous, perennial herb with a strong

aromatic odor, belongs to the Lamiaceae family. It is commonly known as

spearmint, and it is a hybrid between M. sylvestris and M. suaveolens. Carvone

and limonene are the major chemical constituents of the essential oil of M.

spicata L. (Govindarajan et al., 2012; Abdullah et al., 2010, Hussain et al., 2010,

Chauhan et al., 2009, Mkaddem, 2009; Soković et al., 2009). It has been used

in folk medicine to treat respiratory diseases and the common flu, as well as

tranquilizer, gastric stimulant, and antiflatulent, anthelmintic, antibacterial and

antiseptic agents (Peixoto, 2010; Ferreira, 2008). The EO of M. spicata has also

shown a strong antioxidant (Abdullah et al., 2010), insecticide and mutagenic

activity (Chauhan et al., 2009).

Medicinal and aromatic plants are widely used in folk medicine and

have been extensively studied in order to find more effective and less toxic

compounds. Plant-originated products and their derivatives are known to be

important in pharmacological research and in the development of new

therapeutic tools. Therefore, they constitute an important source of biologically

active compounds that can be used as an alternative for therapeutic

intervention. Accordingly, the proper study of the pharmacology of medicinal

plants has shown to be an important tool to study their biological properties

(Saad, 2010).

The dissemination of antifungal drug-resistant yeasts is one of the most

serious threats to the successful treatment of mycotic diseases. Despite the

outcome of potent antifungal therapies, drug-resistant or multidrug-resistant

90

strains have continuously emerged. The need for long-term suppressive therapy

with antifungal agents may be responsible for the selection of resistant strains

(Khan & Malik, 2012).

Increasing resistance to antifungal agents, the limited number of

available drugs, therapeutic limitations, ineffectiveness, toxicity, severe

neutropenia, drug interactions and insufficient bioavailability of the currently

available antifungal drugs make the treatment of human mycoses very difficult,

increasing the search for new therapeutic alternatives among aromatic plants

and their essential oils, empirically used for their antifungal properties (Khan, et

al., 2012; Oliveira, et al., 2011; Silva, et al., 2009).

Based on these considerations, and on other factors such as the high

incidence of candidiasis, the increasing number of immunocompromised

individuals, the emergence of resistant strains and the toxicity of existing

antifungal compounds, we highlight the importance of finding new therapies for

the treatment of fungal infections. Such therapies should include biological

agents with a broad spectrum action, short-term use, minimal adverse effects

on the host and high levels of efficacy. For this purpose, medicinal plant-derived

products are an excellent alternative. Hence, our purpose was to investigate the

biological activity of the EO of M. spicata by determining the MIC,

micromorphological changes in C. guilliermondii and the antifungal action

mechanism of this EO on clinical strains of C. guilliermondii.

91

MATERIAL AND METHODS

Essential Oil of M. spicata and chemical analysis

Chemical composition of the essential oil (EO) of M. spicata L.

(FERQUIMA – Indústria e Comércio Limitada, Vargem Grande/São Paulo,

batch 184) was L-carvone 70%, Limonene 19%, others 11%.

Phytochemical analysis was performed by a Shimadzu Gas

Chromatograph (GC-17A) equipped with a Mass Spectrometer (MS). Data

collection and integration were carried with the software Class5000. The carrier

gas was helium at 1.6 mL/min with split ratio of 1:5.

Chromatographic separation was performed on a DB-5 capillary column

(30 m x 0.25 mm x 0.25 μm). The temperature of the column oven was initially

set to 60°C and subsequently increased to 120°C (5°C/min) and then to 280°C

(20°C/min). Injector and detector temperatures were 260°C and 280°C,

respectively. The total run time for each injection was 20 min and the injection

volume was 1.0 μl. The identification of the EO was performed using a

computer system and data processing (workstation) connected to the GC-MS

and equipped with a Wiley library, 6th Edition 5000-class 1999 with 229.119

spectra.

Microorganisms

We used 14 strains of Candida guilliermondii from an existing database,

originally obtained from vaginal and anal orifices. This database was collected

92

and identified by the Mycology Laboratory of the Hospital Giselda Trigueiro

(HGT) Natal, RN, Northeastern Brazil, with the approval from the Ethics

Committee of the Centro de CIências da Saúde of the Universidade Federal do

Rio Grande do Norte (protocol 154/06). The concordance in the results from

biochemical identification tests of the Banco de Leveduras was performed by

the Laboratory of Microbiology of the Hospital Pediátrico Maria Alice Fernandes

by MicroScan® System.

Standard antifungal drug

In order to test the biological activity of the EO of M. spicata on strains

of C. guilliermondii, we used the standard antifungal drug Nystatin (Sigma-

Aldrich®) as a control treatment.

Microbiological assays

Determination of the Minimal Inhibitory Concentration (MIC)

Antifungal activity assays were performed by microdilution (Ellof, 1998).

Prior to testing, cultures on Sabouraud Dextrose Agar (SDA; Difco®-France)

were incubated at 35°C for 24 to 48 h. The inoculum was prepared and

standardized in sterile saline solution 0.9% (Fresenius Kabi Brasil Ltda). Initially,

a McFarland 0.5 standard suspension was prepared. The suspension was then

diluted in distilled water at 1:9 ratios resulting in an inoculum of approximately

105 CFU/mL (Koneman, et al., 2008; Ostrosky et al., 2008; Hadacek & Greger,

93

2000; Cleeland & Squires, 1991).

Sterile 96-well microtiter plates (INLAB) were used. To each well, we

added 100 µl of double-concentrated Sabouraud Dextrose Broth (SDB; Difco®-

USA/France) followed by the addition of 100 µl of an emulsion of the EO at an

initial concentration of 2048 µg/mL (double-concentrated) to the first row of

wells. This solution was then serially diluted twofold to obtain final

concentrations ranging from 1024 µg/mL to 4 µg/mL. Finally, 10 µL of yeast cell

suspension were added to each column of wells, with each column

corresponding to a different strain of C. guilliermondii. In conjunction with

microbiological assays, we performed sterility control (SDB medium with no

yeast suspension), microorganism growth and viability control (antifungal-free

medium) and standard antifungal control (nystatin 100 UI/mL).

The assays were incubated at 35ºC for 24-48 h, followed by the reading

and interpretation of the results. MIC was defined as the lowest concentration

capable of inhibiting any visible fungal growth in the wells when compared to

the control treatment. Assays were performed in duplicate and the results were

expressed as the geometric mean of MIC values obtained in both assays (Eloff,

1998; Cleeland & Squires, 1991). The antifungal activity was evaluated

according to the following parameters: MIC ≤ 500μg/mL = strong antimicrobial

activity; MIC = 600-1600μg/mL = moderate activity; MIC ≥ 1600μg/mL = low

activity (Sartoratto et al., 2004).

94

Effect of the essential oil of M. spicata on the morphogenesis of C.

guilliermondii

We used the microculture technique to observe any micromorphological

changes in C. guilliermondii as a result of the use of the essential oil. Based on

the MIC values previously obtained by microdilution, we selected two

representative strains of C. guilliermondii: C. guilliermondii 9A (anal strain) and

C. guilliermondii 9V (vaginal strain) (Sidrim & Rocha, 2004; Lacaz, 2002;

Dalmau, 1929). In a moist chamber, the microculture assay was carried out in

90 x 15 mm sterile Petri dishes containing Cornmeal Dextrose Agar (CMDA)

with Tween 80 (Difco® - France), a sterile slide and filter paper (30 x 30 mm).

The essential oil and nystatin, both used in sufficient quantity to obtain

the desired final concentration, were solubilized (Tween 80 - INLAB and DMSO

- Merck) in sterile tubes. Then, 4 mL of CMDA-Tween 80 were added to each of

the following tubes: control (no oil or antifungal drug), essential oil at a

concentration corresponding to the MIC, essential oil at a concentration

corresponding to the MICx2, and 100 Ul/mL nystatin.

The tubes were homogenized and 1 mL of the medium was quickly

transferred and spread onto the sterile slides, forming a thin layer. After

solidification of the medium, the C. guilliermondii strains were seeded in the

center of the plate using an inoculation loop and then covered with a sterile

coverslip. One milliliter of sterile distilled water was added on the filter paper to

keep a moist environment. The Petri dishes were then incubated at 35ºC for 24

to 48 h. Finally, the slides were analyzed in an optical microscope (Zeiss Primo

Star ® model) with 400x magnification in order to look for reproductive

95

structures such as blastoconidia in the constrictions of pseudomycelium and

ultrathin pseudomycelium.

Investigation of the antifungal mechanism - sorbitol method

Antifungal activity assays were performed by microdilution and MIC

values were determined in the presence of 0.8 M sorbitol (MW = 182.17)

(VETEC Química Fina Ltda – Rio de Janeiro/RJ) against the two representative

strains of C. guilliermondii: C. guilliermondii 9A (anal strain) and C.

guilliermondii 9V (vaginal strain). This method is based on the degree of

damage caused by the antifungal compounds on components of the fungal cell

wall. Antifungal compounds may cause lysis of cells in the absence of an

osmotic stabilizer, but allow cells to grow in the presence of this osmotic

support. Thus, this assay compares MIC values of the antifungal compounds in

the absence and in the presence of 0.8 M sorbitol, an osmotic protector used to

stabilize fungal protoplasts (Zacchino, 2001; Frost et al., 1995).

RESULTS

The chemical composition of EO from tested M. spicata leaves was

determined by GC-MS analysis. Table 1 shows their quantitative and qualitative

composition and their respective retention times and percentages. The major

component was carvone (84.32%) followed by limonene (13.70%). In addition,

there were traces of isodihydrocarvone (0.82%).

96

Table 1 – Chemical composition of the essential oil from M. spicata

Peaks Retention time (min)

Phytochemicals Area %

1 7.45 limonene 1031 13.70

2 11.71 isodihydrocarvone 1193 0.82

3 12.74 carvone 1242 84.32

4 other compounds 1.15

MIC analysis showed a variation from 32 to 128 μg /mL (Table 2). MIC50

and MIC90 values were, respectively, 64 μg/mL and 128 μg/mL. Fungal strains

were all able to grow in SDB alone (without EO), showing its viability.

Table 2- Minimal Inhibitory Concentration (MIC) mean values (n=2) of the EO of

M. spicata L. on clinical strains of C. guilliermondii, by microdilution.

C. guilliermondii strain EO of M. Spicata L

MIC (µg/mL)

Nystatin 100 Ul

Growth control

3A 128 - +

4A 64 - +

5A 64 - +

7A ≥2048 - +

8A 32 - +

9A 64 - +

10A 128 - +

11A ≥2048 - +

4V 64 - +

5V 64 - +

6V 64 - +

7V 64 - +

8V 64 - +

9V 64 - +

+ ꞉ Microorganism growth - ꞉ Microorganism growth inhibition A = anal e V= Vaginal MIC was determined by geometric mean

The use of micromorphological techniques allowed to observe changes

in C. guilliermondii caused by the EO of M. spicata L. on C. guilliermondii 9A

(Figure 1) and C. guilliermondii 9V (Figure 2). The treatments used were as

97

follows: A) negative control (yeast alone); B) positive control (yeast + 100 Ul/mL

nystatin); C) yeast + EO of M. spicata L. at the MIC; D) yeast + EO of M. spicata

L. at the MICx2. Micromorphological analysis using optical microscopy showed

that C. guilliermondii underwent notable micromorphological changes when

treated with the EO of M. spicata L. and nystatin.

A B

C D

Figure 1 - Effect of the essential oil of M. spicata on the morphogenesis of C.

guilliermondii 9A ((anal strain): A) negative control (yeast alone); B) positive

control (yeast + 100 Ul/mL nystatin); C) yeast + EO of M. spicata L. at the MIC; D)

yeast + EO of M. spicata L. at the MICx2, (400x).

AB

ADC

Figure 2 - Effect of the essential oil of M. spicata on the morphogenesis of C.

guilliermondii 9V (vaginal strain): A) negative control (yeast alone); B) positive

control (yeast + 100 Ul/mL nystatin); C) yeast + EO of M. spicata L. at the MIC; D)

yeast + EO of M. spicata L. at the MICx2,(400x).

A B

C DC D

98

As depicted in Figures 1A and 2A (negative control), evidence of fungal

growth was observed to occur with modification of the morphological structures:

blastoconidia in the constrictions of pseudomycelium and ultrathin

pseudomycelium (Sidrim & Rock, 2004). These data support the viability of cell

samples and their capacity to undergo normal morphogenesis (Mendes, 2011).

The assays with the standard antifungal (100 UI/mL nystatin) resulted in

different types of hyaline blastoconidia but revealed the absence of

pseudomycelium and blastoconidia with fragmented pseudomycelia (Figures 1B

and 2B, respectively).

Yeasts grown in EO of M. spicata L. at the MIC (Figures 1C and 2C)

and at the MICx2 (Figures 1D and 2D) showed morphological changes similar

to the ones observed in the positive control but with a significant reduction in

pseudomycelia, an important pathogenic factor (Zhu & Filler, 2010).

In all assays, we observed the presence of hyaline blastoconidia

(Figures 1 and 2), which should be observed since it is the commensal form of

the yeast (Zhu & Filler, 2010).

The results of the investigation of the antifungal mechanism are shown

in Table 3. When comparing the antifungal potential of the EO of M. spicata L.

in the presence and in the absence of sorbitol, we found that there was a

change in MIC values when sorbitol concentration was increased by 4 times the

initial concentration. The negative control (sorbitol alone without the EO)

ensured that there were no contamination, since the strains were able to grow

in the presence of sorbitol and in the absence of the EO of M. spicata L.

99

Table 3 – Activity of the essential oil of Mentha spicata L. on the yeast cell wall

of two strains of C. guilliermondii (anal and vaginal)

Strains MIC (µg/mL)

EO of M. Spicata L

Controls

C. guilliermondii

Without sorbitol With sorbitol Sorbitol

Nystatin

100UI

Sterility

9A 64 1024 + - -

9V 64 1024 + - -

+ ꞉ Microorganism growth - ꞉ Microorganism growth inhibition

A = anal e V= Vaginal

DISCUSSION

Azoles (fluconazole, itraconazole) and polyenes (nystatin, amphotericin

B and its lipidic formulations) are the main antifungal drugs used in the

treatment of candidiasis. Some drugs, such as amphotericin B, are extremely

toxic, while others, such as fluconazole, are limited because of their high

resistance rate. These factors combined with long-term antifungal therapy may

limit the use of these substances in the future (Oberoi et al, 2012; Oliveira, et

al., 2011).

Due to limitations of current antifungal therapy and to the emergence of

resistant strains, the search for new, more effective and less toxic antifungal

agents has become pivotal. Moreover, essential oils are a excellent alternative

because they are known for their several biological activities such as

antibacterial (Guerra et al., 2013) and antifungal (Oliveira et al., 2011).

The GC-MS analysis of the EO of M. spicata L. resulted in the

identification of two major components: carvone and limonene. In other studies,

these phytochemicals have been among the most commonly isolated

100

compounds (Govindarajan et al., 2012; Abdullah et al., 2010; Hussain et al.,

2010; Chauhan et al., 2009; Mkaddem et al., 2009; Soković, et al., 2009).

According to Sartoratto and colleagues (2004), EOs with MIC values of

500 μg/mL or lower have strong antimicrobial activity. Based on this principle,

the EO of M. spicata showed an excellent antimicrobial potential against the

studied strains of C. guilliermondii (MIC values ranged from 128 to 32 μg/mL).

Using microdilution assays, Soković, at al. (2009) have observed a strong

antifungal activity in the EO of Mentha spp, which may be used as a natural

preservative.

Fungal morphology is an important factor to fungal invasiveness and

virulence. The filamentous form (hyphae and pseudohyphae) is associated with

the parasitical state, serving as a barrier to phagocytosis, while the yeast form is

associated with the commensal state. The ability to switch between the yeast

form and the multi-cellular filamentous form is tightly associated with virulence.

Environmental factors are believed to influence the physiological state of the

commensal yeast, causing infections (Zhu & Filler, 2010).

Hyphae are not only essential for invasion, they also adhere more

readily to host epithelial surfaces than do yeast cells (Martin et al. 2011). The

adhesion to epithelial surfaces is a critical step in the colonization of mucosal

surfaces, and adhesins often exhibit differential expression between yeast and

hyphal forms (Zhu & Filler, 2010).

Several studies have reported antifungal activity of EOs on the

micromorphological level, which significantly reduces the development of key

structures such as pseudo-hyphae, blastoconidia and chlamydospore. These

findings make possible the use of EOs as promising therapeutic agents in the

101

treatment of candidiasis (Oliveira, et al., 2011; Mendes, 2011; Castro, 2010).

Sorbitol is an osmotic protector used to stabilize fungal protoplasts. The

test with 0.8 M sorbitol is based on the degree of damage caused by the

antifungal compounds on components of the fungal cell wall. Antifungal

compounds may cause lysis of cells in the absence of an osmotic stabilizer.

Thus, this assay compares MIC values of the antifungal compounds in the

absence and in the presence of 0.8 M sorbitol (Lima et al, 2012).

We observed that the antifungal potential of the EO of M. spicata L. was

reduced in the presence of sorbitol (MIC values were higher when sorbitol

concentration was increased by 4 times the initial concentration). Since sorbitol

is an osmotic protector, the EO cannot efficiently reach the cell wall. Therefore,

these results suggest that the two major components of this EO (carvone and

limonene) act directly on the fungal cell wall.

Our results are similar to those observed by Oliveira et al. (2011) and

Castro (2010). They reported anti-Candida activity of the EOs of Cymbopogon

winterianus e Cinnamomum zeylanicum, respectively, suggesting their action

on the fungal cell wall.

Finally, as antibiotic resistance becomes a global problem, the search

for new antifungal agents becomes emergent.

CONCLUSION

Our study demonstrated the antifungal activity of the essential oil of

Mentha spicata L. against anal and vaginal Candida guilliermondii. This

antifungal action occurs on the fungal cell wall, leading to micromorphological

102

changes and causing the inhibition of pseudomycelium formation, an important

pathogenic factor for Candida. A similar result was observed in the presence of

nystatin (positive control).

Hence, the antifungal activity demonstrated by the essential oil of M.

spicata L. makes it a potential candidate as a major agent in controlling fungi

growth that cause Candidiasis

ACKNOWLEDGMENTS

We thank to the Hospital Giselda Trigueiro (HGT) and Hospital Pediátrico

Maria Alice Fernandes for the donation and biochemical identification (Banco de

Leveduras), especially to pharmacists Ana Cristina Santos Fernandes and

Maria Guimaraes Narriman Goveia; to Professors Telma Maria Araújo Moura

Lemos and Tereza Neuma de Souza Brito for logistical support in the

elaboration of this study; and to everyone who work in the Laboratory of Clinical

Microbiology at the Universidade Federal do Rio Grande do Norte and in the

Laboratory of Mycology at the Universidade Federal da Paraíba.

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107

6 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES

O anteprojeto que deu origem a essa tese foi intitulado “Estudo da

atividade antifúngica de óleos essenciais e fitoconstituintes sobre o gênero

Candida”, aprovado no Comitê de Ética do Centro de Ciências da Saúde da

UFRN, sob o protocolo 154/06.

Os produtos naturais representam uma importante e interessante área

de desenvolvimento e a sua completa apreciação permite comprovar a

legitimidade dos seus inúmeros benefícios. Tendo em vista a elevada

relevância clínica atribuída às candidiases e considerando a importância de se

verificar a eficácia de meios terapêuticos alternativos através das plantas

medicinais encontradas na nossa região, partindo do conhecimento popular.

Assim, resolvemos estudar as atividades antifúngicas de óleos essenciais e

fitoconstituintes de algumas espécies vegetais contra leveduras do gênero

Candida provenientes de vulvovagites e material anal, fornecidos pelo Hospital

Giselda Trigueiro (HGT), Natal-RN.

Esse estudo mostrou nos ensaios preliminares que dentre os onze

óleos essenciais analisados os de Citrus limonum, Cinnamomum zeylanicum,

Eucalyptus globulus, Eugenia coryophyllata, Mentha arvensis, Mentha piperita,

Mentha spicata, Origanum vulgare e Pimpinella anisum apresentaram forte

atividade anticandida. Então, foi decidido realizar investigações mais amplas de

tais produtos, iniciando pelas Menthas que apresentaram melhor padrão de

sensibilidade.

O óleo essencial de M. spicata apresentou forte atividade antifúngica

contra cepas de C. guilliermondii isoladas de vagina e ânus. O mecanismo de

ação ocorre na parede celular, promovendo alterações micromorfológicas,

108

inibindo o desenvolvimento do pseudomicelio, importante fator de

patogenicidade para estas leveduras, resultado semelhante ao que se

observou com a nistatina, antifúngico padrão usado como controle positivo.

Assim, este óleo essencial de M. spicata representa uma nova

possibilidade entre os produtos com atividade antifúngica contra C.

guilliermondii, entretanto, são necessários testes in vivo para uma possível

avaliação clínica.

O presente estudo ressalta a importância da equipe multiprofissional,

formada por farmacêuticos, médicos, auxiliares de laboratório e de serviços

gerais do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, do Laboratório

de Micologia do Hospital Giselda Trigueiro (HGT - UFRN), do Laboratório de

Microbiologia do Hospital Pediátrico Maria Alice Fernandes, no Laboratório de

Micologia do Departamento de Ciências Farmacêuticas (DCF-UFPB),

estudantes e professores do Programa de Pós-Graduação em Produtos

Naturais e Sintéticos Bioativos da Universidade Federal da Paraíba,

farmacêuticos e químicos do Laboratório Unificado de Desenvolvimento e

Ensaios de Medicamentos (LUDEM), do Centro de Ciências da Saúde (CCS),

da Universidade Federal da Paraíba (UFPB), em consonância com o objetivo

principal do programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, que consiste

na relação recíproca entre as múltiplas intervenções técnicas e na interação

dos agentes de diferentes áreas profissionais.

Cumprimos com o cronograma, de acordo as metas estabelecidas para

a coleta de dados, disciplinas e a escrita de quatro artigos e um trabalho

apresentado no Congresso Brasileiro de Micologia.

As dificuldades com as quais nos deparamos foram relacionadas à

parte metodológica, pois muitos dos ensaios realizados não estão disponíveis

em nosso departamento, de modo que tivemos que recorrer à UFPB. Além

disso, o projeto não teve financiamento, dessa forma, foram utilizados recursos

próprios.

A doutoranda é professora adjunta III do Departamento de Análises

Clínicas e Toxicológicas da UFRN e pretende continuar na pesquisa de

produtos naturais, implantando as metodologias utilizadas nesse estudo e

formando parceria com o Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e

Sintéticos Bioativos da Universidade Federal da Paraíba.

109

7 REFERÊNCIAS

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ANEXO 1: Laudo técnico do óleo essencial de Mentha spicata

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ANEXO 2: Parecer da aprovação do projeto

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