UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO

CENTRO DE CIÊNCIAS HUMANAS E NATURAIS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA VEGETAL

FLÁVIA CAROLINA SANTOS PORTELA

INFLUÊNCIA DA LUMINOSIDADE NA FISIOLOGIA E MORFOANATOMIA DE

JEQUITIBÁ-BRANCO (Cariniana estrellensis (Raddi.) Kuntze) E JEQUITIBÁ-ROSA

(Cariniana legalis (Mart.) Kuntze)

VITÓRIA

2012

FLÁVIA CAROLINA SANTOS PORTELA

INFLUÊNCIA DA LUMINOSIDADE NA FISIOLOGIA E MORFOANATOMIA DE

JEQUITIBÁ-BRANCO (Cariniana estrellensis (Raddi.) Kuntze) E JEQUITIBÁ-ROSA

(Cariniana legalis (Mart.) Kuntze)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biologia Vegetal do Centro de

Ciências Humanas e Naturais da Universidade

Federal do Espírito Santo, como parte dos

requisitos para obtenção do título de Mestre em

Biologia Vegetal, Área de Concentração:

Fisiologia Vegetal.

Orientador: Prof. Geraldo Rogério Faustini

Cuzzuol

Co-Orientador: Profª Camilla R. D. Milanez

Vitória - ES

2012

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO........................................................................................................12

2 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................18

2.1 Experimento 1..........................................................................................18

2.1.1 Análise de Crescimento..........................................................................19

2.1.2 Quantificação de Pigmentos Fotossintéticos..........................................19

2.1.3 Análise de Fotossíntese.........................................................................20

2.1.4 Fluorescência da Clorofila a...................................................................20

2.1.5 Extração e Quantificação de Carboidratos Solúveis..............................21

2.1.6 Anatomia Foliar e Caulinar e Testes Histoquímicos...............................23

2.1.7 Análise de Plasticidade Fenotípica.........................................................24

2.2 Experimento 2..........................................................................................25

2.2.1 Quantificação de Pigmentos Fotossintéticos..........................................25

2.2.2 Determinação da Atividade de Enzimas Antioxidantes..........................26

2.2.2.1 Obtenção do Extrato Enzimático Bruto................................................26

2.2.2.2 Determinação da Atividade da Catalase (CAT, E.C. 1.11.1.6)............27

2.2.2.3 Determinação da Atividade da Peroxidase do Ascorbato (APX, E.C.

1.11.1.11).........................................................................................................27

2.2.2.4 Determinação de Proteínas Totais......................................................27

3 REFERÊNCIAS.......................................................................................................29

4 RESULTADOS........................................................................................................40

ARTIGO I: Biochemical, physiological and morphoanatomical responses of

Cariniana estrellensis (Raddi.) Kuntze (jequitibá-branco) young plants in a

irradiance gradient……..………………………………………………..………….41

ABSTRACT.....................................................................................................41

INTRODUÇÃO.................................................................................................42

MATERIAL E MÉTODOS................................................................................44

Material vegetal e instalação do experimento.................................................44

Análise de crescimento....................................................................................44

Quantificação de pigmentos fotossintéticos....................................................45

Análise de fotossíntese...................................................................................45

Fluorescência da clorofila a.............................................................................45

Extração e quantificação de carboidratos solúveis..........................................46

Anatomia foliar e caulinar................................................................................46

Análise de plasticidade fenotípica...................................................................47

RESULTADOS................................................................................................47

DISCUSSÃO....................................................................................................50

REFERÊNCIAS...............................................................................................57

TABELAS........................................................................................................63

LEGENDAS DAS FIGURAS...........................................................................66

FIGURAS.........................................................................................................68

ARTIGO II: Relação dos pigmentos fotossintetizantes com a atividade de

enzimas do estresse oxidativo em plantas de Cariniana estrellensis e C.

legalis sob intensa irradiância..........................................................................74

RESUMO.........................................................................................................74

ABSTRACT.....................................................................................................75

INTRODUÇÃO.................................................................................................76

MATERIAL E MÉTODOS................................................................................77

Material vegetal e instalação do experimento.................................................77

Quantificação de pigmentos fotossintéticos....................................................78

Determinação da atividade de enzimas antioxidantes....................................78

Determinação da atividade da CAT.................................................................78

Determinação da atividade da APX.................................................................79

Determinação de proteínas totais....................................................................79

Análise estatística............................................................................................79

RESULTADOS................................................................................................79

DISCUSSÃO....................................................................................................80

CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................................83

REFERÊNCIAS...............................................................................................84

FIGURAS.........................................................................................................89

AGRADECIMENTOS

A Deus, por me conceder mais uma conquista;

Aos meus pais, Iamara Portela e Sérgio Portela, por serem meus maiores exemplos

e por sempre batalharem muito para tornarem todos os meus sonhos possíveis.

Essa conquista é, sem dúvida, tão minha quanto deles;

Aos meus irmãos, Ludmila Portela e Diego Portela, por serem meus melhores

amigos;

Ao meu noivo, Maurício da Fonte, pela paciência e por ter sido um dos maiores

colaboradores dessa pesquisa, participando desde as atividades de laboratório até a

elaboração da dissertação;

A amiga Manuela Gonoring, por ter sido a maior colaboradora desse projeto. Sem

ela, o resultado final não teria sido tão gratificante;

Aos meus orientadores, Geraldo Cuzzuol e Camilla Milanez, por acreditarem em

mim e por contribuírem com o meu trabalho;

As colegas do mestrado, turma 2010, e aos funcionários Ricardo e Elizabete,

pelo companheirismo e por estarem sempre dispostos a ajudar;

A Reserva Natural da Vale, pelo fornecimento de mudas utilizadas na execução do

projeto;

Ao Núcleo de Estudos da Fotossíntese (NEF) e ao laboratório de Anatomia Vegetal

(LABAV), pelo empréstimo de equipamentos e pela concessão do espaço;

A Universidade Federal do Espírito Santo;

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela

concessão da bolsa de pós-graduação.

RESUMO

Cariniana estrellensis (Raddi.) Kuntze e C. legalis (Mart.) Kuntze são arbóreas

nativas do Brasil que, além de possuírem alto poder econômico, são objeto de

interesse em programas de recuperação de áreas degradadas e em plantios

comerciais. A escassez de informações relacionadas ao desempenho ecofisiológico

dessas espécies em condições ambientais estressantes dificultam o manejo e

conservação das mesmas. Dessa forma, o presente estudo objetivou avaliar a

ecofisiologia das espécies em um gradiente de irradiância, por meio de dois

experimentos. No experimento 1, plantas de C. estrellensis com 12 meses de idade

foram submetidas a quatro tratamentos: 40%, 50%, 70% e 100% de irradiância,

durante 104 dias. Ao final desse período foram feitas análises de crescimento, do

conteúdo de pigmentos fotossintéticos, de trocas gasosas, da fluorescência da

clorofila a, do conteúdo foliar de carboidratos solúveis, das características

anatômicas foliares e caulinares e da plasticidade fenotípica da espécie. No

experimento 2, plantas de C. estrellensis e C. legalis com 14 meses de idade foram

submetidas a dois tratamentos: 30% e 100% de irradiância (sombra e sol,

respectivamente), durante 30 dias. Ao final desse período foram feitas análises do

estresse oxidativo das espécies, por meio da quantificação da atividade das enzimas

catalase e peroxidase do ascorbato e por meio da quantificação do conteúdo foliar

de pigmentos fotossintéticos. No experimento 1, em 70% de irradiância, as plantas

apresentaram melhor crescimento em altura e diâmetro, maior massa seca de folhas

(MSF), de caule (MSC) e de raiz (MSR). Em 70% e 100% de irradiância, as plantas

apresentaram folhas menores (AFU) e mais espessas (AFE e MFE) resultando em

menor área foliar total (AFT). Nesses tratamentos as plantas também apresentaram

menor conteúdo foliar de clorofila a (Chl a) e b (Chl b), porém, maior razão Chl a/b e

maior conteúdo de carotenóides, o que implicou em menor razão Chl a/Carot. Taxas

fotossintéticas maiores foram encontradas nas plantas em 70% e inibidas em 40% e

50%, em função da baixa irradiância solar, e em 100%, possivelmente pela

ocorrência de fotoinibição, como mostraram os parâmetros do fluxo de energia do

fotossistema II. De acordo com a análise da fluorescência da clorofila a, em pleno

sol, as plantas apresentaram menor densidade de centros de reação ativos

(RC/ABS) e maior dissipação de energia (DI0/ABS), culminando com menor

desempenho do fotossistema II (PIabs) e desempenho total (PITotal). O conteúdo foliar

de carboidratos solúveis foi maior nas plantas em 70%, seguido das plantas em

100% de irradiância, com exceção da glicose, que não variou entre os tratamentos.

A maior espessura encontrada nas folhas sob 100% de irradiância foi em função da

maior espessura das epidermes adaxial e abaxial e dos parênquimas paliçádico e

esponjoso. E o maior diâmetro do caule em 70% de irradiância se deu pela maior

espessura do xilema e floema secundários. No experimento 2, as plantas em pleno

sol de ambas as espécies também apresentaram menor conteúdo foliar de clorofila a

(Chl a) e b (Chl b) e maior razão Chl a/b. No entanto, o conteúdo de carotenóides foi

maior, o que implicou em menores razões Chl a/Carot. A atividade da catalase (CAT)

variou em função do tempo e da espécie, apresentando uma queda em C.

estrellensis aos 16 dias, possivelmente em função de fotoinativação, e um aumento

em C. legalis aos 30 dias. Já a atividade da peroxidase do ascorbato (APX) não

variou em função do tempo, da espécie ou dos tratamentos. O estudo da

plasticidade fenotípica mostrou que C. estrellensis é uma espécie plástica,

principalmente em função das variáveis de fotossíntese e trocas gasosas, sendo

capaz de sobreviver no gradiente de irradiância testado, o que viabiliza o seu uso

em projetos de recuperação de áreas degradadas. E, uma vez que as análises

ecofisiológicas mostraram que C. estrellensis e C. legalis apresentaram melhor

desempenho em luminosidade moderada, sugere-se que ambas comportaram-se

como espécies intermediárias no processo de sucessão florestal. No entanto, uma

vez que a concentração de pigmentos foliares e a produção de enzimas

antioxidantes inferiram maior susceptibilidade de C. estrellensis à fotoinibição em

alta irradiância, sugere-se maior viabilidade do uso de C. legalis em projetos de

recuperação de áreas degradas.

Palavras-chave: jequitibá, sucessão florestal, estresse, morfofisiologia, anatomia,

bioquímica, plasticidade fenotípica.

ABSTRACT

Cariniana estrellenis (Raddi). Kuntze and C. legalis (Mart.) Kuntze are native

Brazilian trees which have powerful economic value and are also objects of interest

in recovering programs of degraded areas and in commercial plantations. The

scarcity of information about their ecophysiological performance under stress

conditions complicates their management and conservation. Under these

circumstances, this study aimed to evaluate the ecophysiology of this species in a

irradiance gradient, through a couple of experiments. In experiment 1, C. estrellensis

plants with 12 months old were subjected to four treatments: 40%, 50%, 70%

and 100% of irradiance during 104 days. At the end of this period, the following

analyses were made: growth, photosynthetic pigment content, gas exchange,

chlorophyll a fluorescence, leaf content of soluble carbohydrates, the stem and leaf

anatomical characteristics and phenotypic plasticity of the species. In experiment 2,

C. estrellensis and C. legalis plants with 14 months old were subjected to two

treatments: 30% and 100% of irradiance (shade and sun, respectively) for 30 days.

At the end of this period were analyzed the oxidative stress of the species, by

quantifying the activity of catalase and ascorbate peroxidase enzymes and by

quantifying the photosynthetic pigments leaf content. In experiment 1, plants

submitted to 70% of irradiance showed better growth in height and diameter, higher

leaf, stem and root dry mass. In 70% and 100% of irradiance, plants showed smallest

and thicker leaves resulting in lower leaf total area. In these treatments, plants

showed lower chlorophyll a (Chl a) and b (Chl b) content, higher Chl a/b rate, higher

carotenoids (Carot) content and lower Chl a/Carot rate. Higher photosynthetic rates

were found in plants in 70% and inhibited in 40%, 50%, due to low solar irradiation,

and in 100%, possibly due the occurrence of photoinhibition, as showed by flow

energy parameters of photosystem II. According to the analysis of chlorophyll a

fluorescence, in full sun exposition, plants had lower density of active reaction

centers (RC/ABS) and higher energy dissipation (DI0/ABS), which resulted in

decreased performance of photosystem II (PIabs ) and total performance (PITotal). The

leaf content of soluble carbohydrates was higher in plants in 70%, followed by plants

in 100% of irraciance, with the exception of glucose, which did not vary between

treatments. The highest leaf thickness in 100% of irradiance was due to the highest

thickness of adaxial and abaxial epidermis and of palisade and spongy

parenchymas. And the highest stem diameter in 70% of irradiance occurred because

of the highest secondary xylem and phloem thickness. In experiment 2, the plants in

full sun of both species also showed lower chlorophyll a (Chl a) and chlorophyll b

(Chl b) content and higher Chl a/b ratio. Although the carotenoids (Carot) content

were higher, what implied in lower Chl a/Carot ratios. Catalase (CAT) activity varied

with the time and the species, showing a decrease in C. estrellensis at 16 days,

possibly due to photoinactivation, and an increase in C. legalis at 30 days. The

ascorbato peroxidase (APX) did not vary according the time, the species or the

treatments. The study of phenotipic plasticity showed that C. estrellensis is a plastic

species, mainly due to variables of photosynthesis and gas exchange, being able to

survive in the irradiance gradient tested, which allows its uses in restoration projects

of degraded areas. And, since the ecophysiological analysis showed that C.

estrellensis e C. legalis had better performace in moderate irradiance it is suggested

that both behaved as intermediate species in the florestal succession process.

However, since that photosynthetic pigments concentration and the antioxidants

enzymes production inferred higher susceptibility of C. estrellensis to photoinhibition

in high irradiance, it is suggested higher viability os the use of C. legalis in restoration

projects of degraded areas.

Key words: jequitibá, forest succession, stress, morphophysiological,

anatomy, biochemistry, phenotypic plasticity.

12

1. INTRODUÇÃO

A floresta tropical é o bioma com maior biodiversidade do mundo, servindo de

habitat para quase dois terços de todas as espécies vegetais (GENTRY, 1992). A

enorme biomassa lenhosa das florestas tropicais pode ser manejada para a

produção de madeira, de matéria-prima e para a geração de serviços e benefícios

diretos e indiretos (MACIEL et al., 2003). Dada a sua importância ecológica e

econômica, estudos relacionados com a dinâmica das florestas tropicais têm

aumentado nas últimas décadas (MACIEL et al., 2003; FERRAZ et al., 2004; SILVA,

2010).

O comportamento das arbóreas tropicais durante os estágios de sucessão florestal é

utilizado por vários autores para classificar as espécies em grupos ecológicos

distintos. Budowski (1965) sugeriu que as arbóreas tropicais fossem agrupadas em

quatro grupos sucessionais: pioneiras, secundárias iniciais, secundárias tardias e

clímax. Já Hartshorn (1980) propôs a classificação das espécies apenas como

tolerantes ou intolerantes à sombra. Posteriormente, Swaine e Whitmore (1988)

também sugeriram uma divisão baseada em dois grupos ecológicos, dividindo as

espécies em pioneiras ou tardias. Essa variedade de classificações baseadas nas

estratégias de regeneração das espécies mostra a dificuldade de definição dos

grupos ecológicos. Ainda, segundo Paula et al., (2004), essa dificuldade de

organização dos grupos também está relacionada com a plasticidade das espécies

vegetais em função do ambiente, que faz com que, muitas vezes, uma única espécie

possa ser incluída em mais de um grupo ecológico.

Segundo Maciel et al. (2003), as classificações ecológicas adotadas pelos diversos

autores representam uma grande simplificação diante da variedade de respostas

adaptativas das espécies tropicais em função de alterações no ambiente e, portanto,

não devem ser adotadas como padrão. Diante dessas dificuldades de organização

dos grupos ecológicos, estudos do comportamento das arbóreas na dinâmica

florestal são extremamente importantes na manutenção da riqueza vegetal e na

promoção de manejos florestais sustentáveis (MACIEL et al., 2003). Isso porque,

além da exploração desordenada das florestas tropicais colocar em risco de extinção

várias espécies nativas (LORENZI, 2002; BORÉM e OLIVEIRA-FILHO, 2002), há

13

necessidade de estudos relacionados ao potencial de regeneração das espécies

vegetais frente aos impactos antrópicos (OLIVEIRA et al., 2011b).

Estudos com nativas têm sido realizados para avaliação do comportamento das

espécies quando submetidas a condições ambientais diversas, a fim de gerarem

propostas para execução de programas de recuperação de áreas degradadas

(ALMEIDA et al., 2005; MENGARDA et al., 2009; LIMA et al., 2010). Fatores como

luz, temperatura, disponibilidade hídrica, salinidade e condições edáficas têm grande

influência no crescimento dos vegetais (MACHADO et al., 2005; GONÇALVES et al.,

2007; SILVA et al., 2007). Dentre as espécies tropicais empregadas em projetos de

manejo florestal sustentável, Cariniana estrellensis se apresenta como uma das

arbóreas de grande interesse em pesquisas de sucessão florestal.

Conhecida como jequitibá-branco, Cariniana estrellensis (Raddi.) Kuntze é uma

espécie pertencente à família Lecythidaceae, cujas árvores podem atingir de 35 a 45

m de altura e diâmetro do tronco de 90 a 120 cm. Esta espécie nativa do Brasil tem

grande ocorrência na Floresta Ombrófila Densa. Distribui-se geograficamente no

Acre, no Brasil Central e do sul da Bahia até o Rio Grande do Sul, podendo também

ser encontrada no leste do Paraguai e no sul da Bolívia (LORENZI, 2002). O

jequitibá é semicaducifólio no inverno, possui tronco reto e cilíndrico e uma copa

ampla e globosa, podendo ser considerado uma das maiores árvores brasileiras

(CARVALHO, 2003). Fornece uma madeira de grande importância econômica,

sendo utilizada como fonte de matéria-prima para construção civil, confecção de

móveis, saltos de calçados, celulose e papel, artesanato, etc. (IPEF, 2011).

O jequitibá-rosa, Cariniana legalis (Mart.) Kuntze, por sua vez, também é uma

espécie pertencente à família Lecythidaceae, cujas árvores atingem, normalmente,

de 30 a 50 m de altura e diâmetro do tronco de 70 a 100 cm. Apresenta grande

ocorrência no estrato superior da Floresta Ombrófila Densa e é característica de

floresta secundária tardia (SILVA et al., 2003). Distribui-se geograficamente no sul

da região nordeste e sudeste do país (RÊGO e POSSAMAI, 2006), podendo ser

encontrada nos estados do Espírito Santo, Rio de Janeiro, São Paulo, Santa

Catarina, Minas Gerais, Mato Grosso, Bahia, Alagoas e Pernambuco (CARVALHO,

2005).

14

Além de possuírem benefícios econômicos, as árvores de jequitibá são objeto de

interesse em programas de recuperação de áreas degradadas e em projetos de

arborização (LORENZI, 2002). No entanto, a maior dificuldade para o uso de

espécies florestais nativas, como C. estrellensis e C. legalis, em tais atividades, está

na escassez de informações sobre o comportamento ecofisiológico dessas arbóreas

em condições ambientais estressantes.

O recurso principal na determinação do comportamento ecofisiológico das espécies

na dinâmica de sucessão está na intensidade de irradiância solar (MACIEL et al.,

2003). Muitas características de crescimento e desenvolvimento vegetal são

influenciadas por mudanças na exposição da planta à intensidade de irradiância

(CANNELL et al., 1987; GONÇALVES et al., 2007). Modificações na luminosidade

promovem desde alterações foliares, associadas a características morfofisiológicas,

até alterações na estrutura de toda a planta, principalmente em relação à arquitetura

da parte aérea e aos padrões de alocação da biomassa (LIMA et al., 2011;

OLIVEIRA et al., 2011a). Geralmente, os padrões de crescimento são utilizados para

classificar uma espécie quanto ao grau de tolerância à elevada irradiância (SCALON

et al., 2002) e, por isso, são comumente aplicados na tentativa de agrupar as

espécies nos grupos ecológicos.

As folhas são órgãos vegetais com grande plasticidade fenotípica, em função das

alterações impostas pelo ambiente (DANQUAH, 2010). Dessa forma, plantas

submetidas a diferentes condições de irradiância apresentam folhas com

características estruturais distintas. Sob elevada irradiância, as folhas são

comumente mais espessas, possuem menor área foliar, maior razão entre as

clorofilas a e b e maior densidade estomática (BOEGER at al., 2009; MATOS et al.,

2009). Essas variações otimizam a sobrevivência dos vegetais em ambientes mais

iluminados, por resultarem em melhor uso da radiação disponível (ALVARENGA et

al., 2003; CARVALHO et al., 2006).

As folhas não são os únicos órgãos que passam por alterações estruturais de

adaptação. Estudos indicam que a estrutura de caules com o ápice ainda em

crescimento podem sofrer modificações morfofisiológicas, em função das pressões

ambientais como: alagamento, umidade ou seca (LUCHI, 2004; BALLESTEROS et

al., 2010), alta salinidade do solo (CAVUSOGLU et al., 2008), condições edáficas

15

diversas (MÖRLING 2002; ANGÉLICO, 2010), condições atmosféricas

(concentração de CO2 e poluição), latitude e altitude (DICKISON, 2000). Os estudos

relacionados aos efeitos da luminosidade na estrutura de caules ainda são escassos

e, portanto, a relação entre a anatomia de caules com as estratégias adaptativas é

pouco conhecida. No entanto, sabe-se que diferentes intensidades de luz podem

promover alterações anatômicas caulinares (ANGÉLICO, 2010). Células maiores

(elementos de vaso, fibras, células parenquimáticas), maior porcentagem de xilema

e área vascular são características de caules de plantas crescendo sob maior

irradiância de luz (ARNOLD e MAUSETH, 1999).

Além das variações nas estruturas foliares e caulinares, o desempenho

fotossintético das plantas está, também, associado à eficiência na partição dos

fotoassimilados (MENGARDA et al., 2009; OLIVEIRA et al., 2011a). A maior parte do

carbono fixado durante a fotossíntese é utilizada na síntese de carboidratos que,

além de regular o crescimento vegetal, pode induzir modificações metabólicas (TAIZ

e ZEIGER, 2009). As relações fonte dreno, entre a produção dos fotoassimilados e a

exportação para as demais partes do corpo vegetal, não são estáticas (ROITSCH et

al., 2003) e podem sofrer alterações em decorrência da iluminosidade. Neste

sentido, sob elevada irradiância há uma maior tendência de alocação de biomassa

para as raízes (ALVARENGA et al., 2003; CARVALHO et al., 2006; OLIVEIRA, et al.,

2011a) em detrimento da parte aérea.

A aclimatação das espécies pode ocorrer, também, através de ajustes no aparato

fotossintético, que controlem a utilização da luz disponível no ambiente. Os teores

de clorofila foliar e de carotenóides, assim como a proporção entre as clorofilas a e

b, podem variar significativamente, em função das condições de irradiância.

(CARVALHO et al., 2006; BOEGER et al., 2009). Isso porque, enquanto as

moléculas de clorofila controlam as taxas fotossintéticas através da absorção de

energia luminosa, os carotenóides são capazes de dissipar o excesso de energia

(BOARDMAN, 1977; DEMMIG-ADAMS et al., 1996). Assim, plantas de sol ou de

sombra apresentam alterações na coloração de suas folhas, como resultado de

mudanças na composição dos pigmentos fotossintetizantes que as permitam

expressar sua capacidade fotossintética (MARENCO e LOPES, 2009).

16

Os efeitos da irradiância sobre o aparato fotossintético podem ser verificados por

meio de análises de trocas gasosas, que geram informações a respeito dos

processos de assimilação de CO2, de transpiração e de condutância estomática

(DIAS e MARENCO, 2006; MENGARDA et al., 2009). Alterações na anatomia foliar,

como mudanças na espessura das epidermes adaxial e abaxial, dos tecidos

paliçádico e esponjoso, assim como a quantidade e a estrutura dos estômatos,

contribuem para a otimização da absorção de energia luminosa e captação de

moléculas de CO2, evitando a perda excessiva de água por transpiração (LIMA

JÚNIOR et al., 2006; GOMES et al., 2008; VOLTOLINI e SANTOS, 2011).

Os carboidratos, que são produtos da fotossíntese, têm as suas concentrações

reguladas pela taxas fotossintéticas (MARENCO et al., 2001) e/ou pelas condições

ambientais (MARTINAZZO et al., 2007; CUZZUOL e CLIPEL, 2009). Esses

compostos, que podem ser utilizados com fins de reserva e de geração de energia,

participam intensamente do metabolismo celular (FARRAR et al., 2000; SOUZA et

al., 2005). Açúcares solúveis, como a frutose, a sacarose e a glicose podem, ainda,

atuar como sinalizadores de estresse ambiental, inclusive por excesso de

irradiância. Sob tais condições, esses açúcares são capazes de atuar com função

antioxidante (PRICE et al., 2004; NISHIKAWA et al., 2005; COUÉE et al., 2006).

A irradiância influencia, não apenas o processo fotossintético, como também o

respiratório. Um dos produtos dessas vias metabólicas são as espécies reativas de

oxigênio (ERO), que são formas reduzidas do oxigênio molecular capazes de

promover danos celulares oxidativos como o peróxido de hidrogênio (H2O2), o

oxigênio singleto (1O2), o radical hidroxila (OH-) e o ânion superóxido (O2-) (GILL e

TUTEJA, 2010). Sob condições adequadas de desenvolvimento, a produção destas

moléculas é baixa e elas são continuamente removidas do espaço celular (HIDEG et

al., 2002; MITTLER, 2002).

Perturbações ambientais, no entanto, podem intensificar a produção das ERO

resultando em estresse oxidativo (GILL e TUTEJA, 2010). Essas moléculas são

altamente reativas e podem promover sérios danos ao metabolismo celular por

estimularem a oxidação de lipídios, proteínas e ácidos nucléicos (ROUT e SHAW,

2001). As plantas desenvolveram, então, um sistema complexo de destruição das

ERO, que envolve agentes antioxidantes não enzimáticos e enzimáticos (ROVER

17

JÚNIOR et al., 2001). Dentre os agentes enzimáticos, a catalase atua nos

peroxissomos e é capaz de converter rapidamente H2O2 em água e oxigênio

molecular. No entanto, devido a sua ausência nos cloroplastos, uma alternativa para

a destruição de H2O2 está na a via das peroxidases, que converte o peróxido de

hidrogênio em água, com o auxílio de um redutor. Nas células vegetais, a

peroxidase mais importante que age no combate do H2O2 é a peroxidase do

ascorbato (NOCTOR e FOYER, 1998).

Para tolerarem exposições a níveis elevados de irradiância, as plantas são capazes,

então, de elevar a produção das enzimas antioxidantes (MITTLER, 2002; ASADA,

2006), como a catalase e a peroxidase do ascorbato. Dessa forma, os efeitos de

toxicidade das ERO são reduzidos e as conseqüências do estresse são

minimizadas.

Nas florestas tropicais, a qualidade e a quantidade de luz influenciam as estratégias

de adaptação dos indivíduos nos diferentes grupos ecológicos. Sendo assim, as

espécies capazes de desenvolver maior plasticidade fenotípica em relação ao

gradiente de luz, estarão mais aptas a colonizar uma maior variedade de ambientes

(BAZZAZ e PICKETT, 1980). Em geral, as alterações sofridas pelos vegetais em

diferentes condições de irradiância visam manter um balanço entre o ganho de

carbono pela fotossíntese e a perda de água por transpiração (GIVNISH, 1988).

Para tanto, podem ocorrer, então, ajustes morfofisiológicos foliares e caulinares,

ajustes bioquímicos foliares ou alterações no padrão de alocação de biomassa entre

os órgãos vegetais (ALVARENGA et al., 2003; CARVALHO et al., 2006; OLIVEIRA,

et al., 2011a). São essas alterações que permitem a sobrevivência dos vegetais em

condições ambientais adversas, visando à retomada do metabolismo normal das

plantas, mesmo em situações de estresse (ATROCH et al., 2001; SOARES et al.,

2007).

O presente estudo propôs-se, então, avaliar as características fisiológicas,

morfoanatômicas e bioquímicas de C. estrellensis e C. legalis, em relação a um

gradiente de irradiância, buscando averiguar a classificação dessas espécies na

sucessão florestal, através da análise da plasticidade fenotípica e da tolerância ao

estresse oxidativo.

18

2. MATERIAL E MÉTODOS

Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Ecofisiologia Vegetal e em

casa de vegetação, do departamento de Ciências Biológicas da Universidade

Federal do Espírito Santo (UFES), Vitória (20º16’51’’S e 40º18’14’’W), durante o

período de setembro/2010 a outubro/2011.

2.1 Experimento 1

Para a realização deste estudo foram utilizadas plantas de jequitibá-branco

(Cariniana estrellensis) fornecidas pela Reserva Natural da Vale do Rio Doce,

localizada no município de Linhares-ES (19º06’-19º18’S e 39º45’-40º19’W). O

experimento foi conduzido entre setembro e dezembro de 2010, período marcado

pela estação da primavera, com precipitação e temperatura médias de 113,5 mm e

24ºC, respectivamente (INMET, 2010).

Plantas com aproximadamente 12 meses de idade foram envasadas em recipientes

de polietileno, com capacidade de 8 litros, contendo como substrato mistura de terra

vegetal, areia e argila (1:1:1) sem adubação. As plantas foram mantidas em casa de

vegetação, por aproximadamente dois meses, em sombreamento artificial de 90%

(162 μmol m-1s-1), temperatura e fotoperíodo naturais. Após este período, as plantas

foram submetidas a diferentes intensidades de irradiância: 40%, 50%, 70% e 100%

de irradiância (pleno sol). As plantas foram regadas de forma a evitar a ocorrência

restrição hídrica.

A radiação fotossinteticamente ativa (PAR) nas diferentes condições de

luminosidade foi determinada em um dia ensolarado, às 12 horas, utilizando-se um

espectroradiômetro (Sky Instruments Ltda, Richmond, Canadá). Os valores médios

da PAR para cada tratamento foram de aproximadamente: 645 μmol m-2s-1; (40% de

irradiância); 808 μmol m-2s-1 (50% de irradiância); 1131 μmol m-2s-1 (70% de

irradiância) e 1615 μmol m-2s-1 (100% de irradiância).

O experimento teve duração de 104 dias e foi estabelecido em delineamento

inteiramente casualizado (DIC), com 13 plantas por tratamento de irradiância. Com

exceção dos dados de fluorescência da clorofila a, os demais dados foram

19

submetidos à regressão polinomial e as médias foram comparadas pelas barras do

erro padrão.

2.1.1 Análise de Crescimento

No início e ao final do experimento (0 e 104 dias, respectivamente) foram realizadas

as seguintes medidas de crescimento: altura das plantas, diâmetro do caule,

número de folhas, massas fresca e seca da raiz, do caule e das folhas e área foliar.

A altura das plantas foi medida da base (região logo acima do substrato) até a gema

apical, utilizando-se uma trena; o diâmetro do caule foi medido na região caulinar a

aproximadamente 1 cm do substrato, utilizando-se um um paquímetro; o número de

folhas foi obtido por meio de contagem manual; a massa seca foi determinada por

meio do acondicionamento do material vegetal em estufa, a 60ºC, até a obtenção de

massa constante; e a área foliar foi calculada utilizando-se um scanner de geração

de imagens (Area Meter, LI-COR 3100, Nebrasca, EUA).

A partir dos dados obtidos foram determinadas: área foliar específica (AFE= área

foliar total/massa seca das folhas), área foliar unitária (AFU= área foliar total/número

de folhas), taxa assimilatória líquida (TAL= (LnA2 – LnA1/ A2 – A1) x (M2 – M1/t2 – t1)),

taxa de crescimento relativo (TCR=(LnM2-LnM1)/(t2-t1)), razão de área foliar

(RAF=AF/MST), razão raiz:parte aérea (R:PA), massa foliar específica

(MFE=MF/AF), razão de massa foliar (RMF=MF/MST), razão de massa caulinar

(RMC=MC/MST) e razão de massa radicular (RMR=MR/MST), segundo Hunt (1982),

onde, M1=massa inicial; M2=massa final; t1=tempo inicial; t2=tempo final; Ln=Log

natural; MF=massa foliar, MC=massa caulinar, MR=massa radicular, AF=área foliar;

MST=massa seca total.

2.1.2 Quantificação de Pigmentos Fotossintéticos

Os teores de clorofila total, clorofila a, clorofila b, carotenóides e as razões clorofila

a/b e clorofila total/carotenóides foram determinados após extração com

dimetilsulfóxido (DMSO), segundo Shoaf e Lium, (1976), com modificações.

Amostras de 20 mg de massa fresca de folhas do terceiro nó completamente

expandidas foram transferidas para tubos de ensaio envoltos por papel alumínio.

Após a adição de 10 mL de DMSO e saturação com CaCO3, os tubos foram

tampados e aquecidos em banho maria por 4 horas, a 60ºC. As leituras da

20

densidade ótica foram feitas em espectrofotômetro (Femto 700Plus, Femto Ind. e

Com. de Instrumentos Ltda., São Paulo, Brasil), a 480 (carotenóides), 645 e 663 nm

(carotenóides, clorofilas a e b). As determinações das concentrações de clorofila e

carotenóides foram realizadas aplicando-se as equações de Hendry & Price (1993):

Clorofila a = ((12,7.A663 - 2,69.A645 )/(1000.MF)).V (mg.g-1 MF)

Clorofila b = ((22,9.A645 - 4,68.A663)/(1000.MF)).V (mg.g-1 MF)

Clorofila total = ((8,02.A663 + 20,2.A645)/(1000.MF)).V (mg.g-1 MF)

Carotenóides = (((A480 + 0,114.A663 - 0,638. A645).V)/(112,5MF))/1000PM (mg.g-1 MF)

Onde:

A480 = absorbância a 480 nm; A645 = absorbância a 645 nm; A663 = absorbância a

663 nm; V = volume da amostra (mL); PM = peso molecular médio dos carotenóides

(545 g/mol); MF = massa fresca da amostra (g).

2.1.3 Análise de Fotossíntese

As análises de trocas gasosas foram realizadas em sistema fechado com analisador

de gases infravermelho portátil – IRGA (LI-6200, LI-COR Inc., Lincoln, EUA) as 8:00

horas, utilizando-se concentração atmosférica de CO2 (em aproximadamente 370

ppm) e temperatura ambiente de 25ºC. Foi utilizada fonte de luz artificial com

intensidade aproximada de 1.500 μmol m-2s-1. Avaliou-se a assimilação fotossintética

de carbono (A, µmol m-2 s-1), condutância estomática (gs, mol m-2 s-1), transpiração

(E, µmol m-2 s-1) e teor de carbono interno (Ci, µmol mol-1). Também foram

calculadas as razões: eficiência do uso de água (A/E, µmol mmol-1), eficiência

intrínseca do uso de água (A/gs, μmol mmol-1) e eficiência aparente de carboxilação

(A/Ci, µmol m-2 s-1 Pa-1).

As análises de fotossíntese foram feitas em folhas do terceiro nó completamente

expandidas. Para isso, foram utilizadas cinco folhas por tratamento, sendo uma folha

por planta, nas quais realizaram-se duas medições de trocas gasosas por folha,

totalizando-se doze medições por tratamento.

2.1.4 Fluorescência da Clorofila a

21

A cinética da emissão da fluorescência da clorofila a foi mensurada por meio de um

fluorômetro portátil - Handy PEA (Plant Efficiency Analyzer, Hansatech, King’s Lynn,

UK). As medidas foram realizadas as 8:00 horas, com a adaptação da área foliar ao

escuro por 30 minutos. Imediatamente após a adaptação ao escuro, as folhas foram

expostas a um pulso saturante de luz vermelha de cerca de 3000 mol m-2 s-

1 fornecido por um conjunto de três LED’s (pico de 650 nm), aplicado sobre a

superfície da folha para proporcionar iluminação homogênea sobre a área exposta

(4 mm de diâmetro). Os resultados da cinética da fluorescência transiente foram

transferidos para o aplicativo PEA Plus dando início ao tratamento dos dados

coletados.

A partir daí, a fluorescência transiente da clorofila a foi analisada de acordo com o

teste JIP (STRASSER e STRASSER, 1995), com o software Biolyzer (Laboratório de

Bioenergética, Universidade de Genebra, Suíça). A análise dos parâmetros básicos

conduziu ao cálculo e derivação de uma variedade de parâmetros específicos da

fluorescência, que forneceram informações estruturais e funcionais dos

fotossistemas. Dentre tais parâmetros, de acordo com Jiang et al. (2008) e Yusuf et

al. (2010), foram selecionados os referentes à quantidade de centros de reação

ativos (RC/ABS); à dissipação de energia por centro de reação (DI0/RC); o índice de

desempenho do fotossistema II (PIabs) e o índice de desempenho total (PITotal).

As análises de fluorescência foram feitas em folhas do terceiro nó completamente

expandidas. Para isso, foram utilizadas doze folhas por tratamento, sendo duas

folhas por planta, nas quais realizou-se uma medição de fluorescência por folha,

totalizando-se doze medições por tratamento.

2.1.5 Extração e Quantificação de Carboidratos Solúveis

Para a determinação do conteúdo de glicose, frutose, sacarose e açúcares totais

solúveis, seguiu-se o método de Carvalho et al. (1998), com algumas modificações,

como se segue. Amostras de 1 grama de massa fresca de folhas do terceiro nó

completamente expandidas foram fervidas em 10 mL de etanol 80%, durante 3

minutos, para inativação enzimática. Posteriormente, as amostras foram maceradas

no gral com pistilo e submetidas à extração de carboidratos solúveis em banho

maria, a 80ºC por 15 minutos. O extrato obtido foi centrifugado a 4500 g por 15

22

minutos, separando o sobrenadante. Essa ultima operação foi repetida mais duas

vezes. O homogeneizado foi transferido para um balão volumétrico conectado a um

evaporador rotatório (QUIMIS®, Q344B1, Diadema, Brasil), a 30 rpm e 40ºC, para

concentração das amostras até completa secagem. Ao término do procedimento de

secagem, acrescentou-se água deionizada em cada amostra, para obtenção de um

volume final de 10 mL.

A quantificação dos carboidratos solúveis foi realizada através de reações

colorimétricas. Para isso, inicialmente foram preparadas soluções padrão de D-

glucose, na concentração de 600 µg mL-1 e de D-frutose e D-sacarose, na

concentração de 200 µg mL-1.

A quantificação de açúcares totais solúveis seguiu o método fenol-sulfúrico conforme

Dubois et al. (1956). Para isso, utilizou-se uma alíquota de 50 µL do extrato diluído

em uma proporção de 1:1, acrescentou-se 450 µL de água deionizada, 0,5 mL de

fenol 5% e 2,5 mL de ácido sulfúrico PA. Todas as soluções foram preparadas em

triplicatas e as leituras de absorbância foram realizadas em espectrofotômetro

(Genesys 10S UV-Vis, Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA), a 490 nm.

O teor de frutose livre e combinada presente nos extratos foi estimado pela reação

de antrona, modificada para cetoses (Jermyn, 1956). Para isso, utilizou-se uma

alíquota de 50 µL do extrato, acrescentou-se 450 µL de água deionizada e 2,5 mL de

solução de antrona. Todas as soluções foram preparadas em duplicatas e

encubadas em banho maria a 37ºC por 45 minutos. As leituras de absorbância foram

realizadas em espectrofotômetro (Genesys 10S UV-Vis, Thermo Fisher Scientific,

Waltham, EUA), a 620 nm.

Para a dosagem do teor de sacarose foi utilizado o método de antrona, porém,

degradando-se os carboidratos redutores mediante a ação do hidróxido de potássio,

como descrito por Riazi et al. (1985). Para isso, utilizou-se uma alíquota de 50 µL do

extrato diluído em uma proporção de 1:1, acrescentou-se 200 µL de água

deionizada, 100 µL de solução de KOH 5,4 N e 3,0 mL de solução de antrona. Todas

as soluções foram preparadas em duplicatas e fervidas por 10 minutos, após o

acréscimo da solução de KOH e, posteriormente, fervidas por mais 5 minutos, após

adição da solução de antrona. As leituras de absorbância foram realizadas em

23

espectrofotômetro (Genesys 10S UV-Vis, Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA),

a 620 nm.

A quantificação de glicose foi determinada utilizando-se o kit de glicose enzimática

líquida (Doles®, Goiânia, Goiás). Para isso, primeiramente fez-se a identificação do

tubo de ensaio branco, dos tubos de ensaio das amostras e dos três tubos de ensaio

padrão. Em todos eles adicionou-se 2 mL de reagente de cor (fornecido pelo kit),

sendo que nos tubos das amostra acrescentou-se 20 µL de amostra e nos tubos

padrão, 20 µL de solução padrão (também fornecida pelo kit). Os tubos foram

agitados e incubados em banho maria a 37ºC, por 5 minutos. As leituras de

absorbância foram realizadas em espectrofotômetro (Genesys 10S UV-Vis, Thermo

Fisher Scientific, Waltham, EUA), a 510 nm. Como a reação corada seguiu

estritamente a lei de Beer, para a quantificação de glicose determinou-se o fator (F)

(=100/média das absorbâncias padrão). O produto do fator (F) pelas absorbâncias

das amostras correspondia a concentração de glicose em mg/dL. Os resultados

foram, então, convertidos para mg.g-1 MS.

2.1.6 Anatomia Foliar e Caulinar e Testes Histoquímicos

As análises de anatomia foliar e caulinar e histoquímica foliar foram realizadas no

Laboratório de Anatomia Vegetal do Departamento de Ciências Biológicas da UFES.

Caules e folhas novas do quarto nó completamente expandidas foram coletados

para a realização de análises anatômicas quantitativas e/ou qualitativas, sendo

fixadas em FAA 70 (Formaldeído, Ácido acético e Etanol 70% (v/v) por 48 horas

(JOHANSEN, 1940) e armazenadas em álcool 70% (v/v). Amostras da região basal

do caule (aproximadamente 1 cm da zona de inserção de raízes) e amostras do

terço mediano do limbo, nas regiões internevural e da nervura central das folhas,

foram cortadas à mão livre, utilizando-se lâminas de aço. Os cortes foram corados

com Safrablau (BUKATSCH,1972, modificado) e as lâminas histológicas montadas

com água glicerinada (3:1) e vedadas com esmalte incolor. Para a quantificação

estomática fez-se a impressão da epiderme foliar em lâmina de vidro, com cola

instantânea (Super Bonder). As observações e a documentação fotográfica foram

realizadas em fotomicroscópio (Nikon, Eclipse E200, Tókio, Japão).

24

Para a análise dos elementos dissociados do xilema secundário utilizou-se o

método de maceração. Primeiramente, foram recolhidos fragmentos da região basal

do caule, tomando cuidado para retirar o material na mesma orientação das células.

Os fragmentos foram, então, colocados em tubos de ensaio contendo solução de

ácido acético glacial e peróxido de hidrogênio (1:1). Os tubos foram vedados com

bastante esparadrapo e, em seguida, colocados em estufa a 60°C durante três dias.

Após esse período, os tubos foram abertos e o conteúdo foi filtrado diversas vezes,

utilizando-se meia-fina. Ao conteúdo recolhido adicionou-se de três a quatro gotas

de Safranina 1% (p/v) em etanol 70% (v/v) e, utilizando-se um estilete, espalhou-se

pequenos pedaços do macerado sobre lâminas histológicas, montadas com água

para observação microscópica (KRAUS e ARDUIN, 1997).

Os testes histoquímicos foram realizados utilizando-se as mesmas folhas

anteriormente fixadas em FAA 70 e armazenadas em álcool 70% (v/v), sendo

obtidos cortes do terço mediano do limbo. Utilizaram-se como reagentes: cloreto

férrico (JOHANSEN, 1940), para detecção de compostos fenólicos; vermelho de

rutênio (JENSEN, 1962), para detecção de polissacarídeos; e Sudan IV, para a

detecção de substâncias lipídicas (JOHANSEN, 1940).

2.1.7 Análise de Plasticidade Fenotípica

A plasticidade foi definida através da variação fenotípica total apresentada pela

espécie, de acordo com a intensidade de irradiância em que as plantas foram

submetidas (VALLADARES et al. 2000a; 2002). O índice de plasticidade fenotípica

(IP) com variação de 0 a 1 foi calculado para cada variável estudada, como sendo a

diferença entre o maior e o menor valor médio, em cada tratamento, dividido pelo

maior valor médio (VALLADARES et al. 2000b):

IP = (valor máximo médio – valor mínimo médio) / valor máximo médio

Esse índice de plasticidade fenotípica, que já foi usado por outros autores

(BALAGUER et al., 2001; NIINEMETS et al., 2003; VALLADARES et al., 2000a;

2002; VALLADARES et al., 2005), é vantajoso pois permite comparar variáveis

expressas em diferentes unidades e com intervalos de variação contrastantes

(VALLADARES et al., 2005).

25

2.2 Experimento 2

Para a realização deste estudo foram utilizadas plantas de jequitibá-branco

(Cariniana estrellensis) adquiridas no viveiro Fazenda Terra Nova, localizado no

município de Domingos Martins - ES (20º19’35”S e 40º48’53”W). O experimento foi

conduzido de setembro a outubro de 2011, período marcado pela estação da

primavera, quando a precipitação e a temperatira médias foram de 86,4 mm e 24ºC,

respectivamente (INMET, 2011).

Plantas com aproximadamente 14 meses de idade foram envasadas em recipientes

de polietileno com capacidade de 8 litros, contendo como substrato uma mistura de

terra vegetal, areia e argila (1:1:1) sem adubação. As plantas, que já estavam em

processo de aclimatação no viveiro por aproximadamente 5 meses, foram mantidas

em casa de vegetação por 20 dias, acondicionadas em sombreamento artificial de

90% (120 μmol m-1s-1), temperatura e fotoperíodo naturais. Após este período, as

plantas foram submetidas a duas diferentes condições de irradiância, sendo

divididas em dois tratamentos: 30 e 100% de irradiância (pleno sol). As plantas

foram regadas diariamente, quando necessário, de forma a evitar a ocorrência

restrição hídrica.

A radiação fotossinteticamente ativa (PAR) nas diferentes condições de irradiância

foi determinada em um dia ensolarado, às 12 horas, utilizando-se um

espectroradiômetro (Sky Instruments Ltda, Richmond, Canadá). Os valores médios

da PAR para os dois tratamentos foram de aproximadamente: 360 μmol m-2s-1; (30%

de irradiância) e 1200 μmol m-2s-1 (100% de irradiância).

O experimento teve duração de 30 dias e foi estabelecido em delineamento

inteiramente casualizado (DIC), com 30 plantas por tratamento de irradiância. Os

dados foram submetidos à regressão polinomial e às médias foram comparadas

pelas barras do erro padrão.

2.2.1 Quantificação de Pigmentos Fotossintéticos

Os teores de clorofila total, clorofila a, clorofila b, carotenóides e as razões clorofila

a/b e clorofila total/carotenóides foram determinados após extração com acetona

80% (v/v), segundo Arnon (1949). Para isso, 20 mg de massa fresca de folhas do

26

terceiro nó completamente expandidas foram macerados em câmara escura.

Adicionou-se 25 mL de acetona 80% ao macerado e o extrato obtido foi filtrado em

papel filtro, utilizando-se balões volumétricos de 25 mL como coletores. Após o

processo de filtragem adicionou-se acetona 80%, gradativamente, até a obtenção de

um volume final de 25 mL de extrato. Os balões volumétricos, cobertos com papel

alumínio e mantidos refrigerados em caixas de isopor com gelo, foram

encaminhados ao laboratório. As leituras da densidade ótica foram feitas em

espectrofotômetro (Genesys 10S UV-Vis, Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA) a

480 (carotenóides), 645 e 663 nm (carotenóides, clorofilas a e b). As determinações

das concentrações de clorofila e carotenóides foram realizadas aplicando-se as

equações de Hendry & Price (1993):

Clorofila a = ((12,7.A663 - 2,69.A645 )/(1000.MF)).V (mg.g-1 MF)

Clorofila b = ((22,9.A645 - 4,68.A663)/(1000.MF)).V (mg.g-1 MF)

Clorofila total = ((8,02.A663 + 20,2.A645)/(1000.MF)).V (mg.g-1 MF)

Carotenóides = (((A480 + 0,114.A663 - 0,638. A645).V)/(112,5MF))/1000PM (mg.g-1 MF)

Onde:

A480 = absorbância a 480 nm; A645 = absorbância a 645 nm; A663 = absorbância a

663 nm; V = volume da amostra (mL); PM = peso molecular médio dos carotenóides

(545 g/mol); MF = massa fresca da amostra (g).

2.2.2 Determinação da Atividade de Enzimas Antioxidantes

2.2.2.1 Obtenção do extrato enzimático bruto

Para obtenção do extrato enzimático, 20 mg de massa fresca de folhas do terceiro

nó completamente expandidas foram macerados em nitrogênio líquido, com

polivinilpolipirolidona (PVPP) 1% (p/v), e homogeneizados em 1,5 mL de meio de

extração, constituído de: 750 µl de tampão fosfato de potássio 200 mM (pH 9,0); 15

µl de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 10 mM; 150 µl de ácido ascórbico 100

mM e 585 µl de água ultrapura. O extrato obtido foi centrifugado a 13000g, por 12

minutos, a 4ºC (PEIXOTO et al., 1999) e o sobrenadante coletado e utilizado na

27

determinação das atividades da catalase (CAT, E.C. 1.11.1.6) e peroxidase do

ascorbato (APX, E.C. 1.11.1.11) e na quantificação das proteínas totais.

2.2.2.2 Determinação da atividade da catalase (CAT, E.C. 1.11.1.6)

A atividade da catalase foi determinada pela adição de 25 µl do extrato enzimático

bruto e 200 µl de H2O2 250 mM, a 3,775 mL de meio de reação constituído de 2 mL

de tampão fosfato de potássio 200 mM (pH 9,0) e 1,775 mL de água ultrapura,

previamente incubado a 28ºC, por no mínimo 10 minuto (HAVIR e McHALE, 1989).

As leituras de absorbância das amostras foram feitas a cada 15 segundos, durante

um período de 1,5 minutos, em espectrofotômetro (Genesys 10S UV-Vis, Thermo

Fisher Scientific, Waltham, EUA), a 240 nm. A atividade enzimática foi expressa em

µmol H2O2.min-1.mg-1 proteína e o coeficiente de extinção molar H2O2 considerado

foi de 36 mM-1 cm-1 (NAKANO e ASADA, 1981).

2.2.2.3 Determinação da atividade da peroxidase do ascorbato (APX, E.C. 1.11.1.11)

A atividade da peroxidase do ascorbato foi determinada pela adição de 50 µl do

extrato enzimático bruto e 200 µl de H2O2 2 mM, a 3,750 mL de meio de reação

constituído de 2 mL de tampão fostato de potássio 200 mM (pH 9,0), 1,550 mL de

água ultrapura e 200 µl de ácido ascórbico 10 mM, previamente incubados a 28ºC,

por no mínimo 10 minutos (NAKANO e ASADA, 1981, modificado por KOSHIBA,

1993). As leituras de absorbância das amostras foram feitas a cada 15 segundos,

durante um período de 1,5 minutos, em espectrofotômetro (Genesys 10S UV-Vis,

Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA), a 290 nm. A atividade enzimática foi

expressa em µmol H2O2.min-1.mg-1 proteína e o coeficiente de extinção molar H2O2

considerado foi de 2,8 mM-1 cm-1 (NAKANO & ASADA, 1981).

2.2.2.4 Determinação de proteínas totais

O conteúdo protéico do extrato bruto foi determinado pelo método fotocolorimétrico

de acordo com Bradford (1976), utilizando-se como padrão, soro albumina bovina (1

mg mL-1). Para o preparo de cada 100 mL de reagente de cor, 10 mg de Comassie

Brilliant Blue G250 foram dissolvidos em 4,7 mM de etanol absoluto e, após

dissolução completa, adicionou-se 10 mL de ácido fosfórico 85% (p/v), completando-

se o volume para 100 mL com água deionizada. A solução obtida foi filtrada em

28

papel de filtro, sendo acondicionada em frasco e ambiente escuros. É importante

ressaltar que o reagente de cor sempre deve ser filtrado antes do seu uso.

A curva padrão foi obtida adicionando-se 5 mL do reagente de Bradford em seis

tubos de ensaio, onde foram acrescentados 100 µL, 80 µL, 60 µL, 40 µL, 20 µL e 0

µL de água deionizada e 0 µL, 20 µL, 40 µL, 60 µL, 80 µL, 100 µL de solução de

Bovine Serum Albumine (BSA), na concentração de 1mg/L, respectivamente. As

amostras foram preparadas em duplicata e lidas em espectrofotômetro (Genesys

10S UV-Vis, Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA) a 595 nm, sendo que o tubo

de ensaio contendo 5 mL de reagente de cor + 100 µL + 0 µL de BSA foi utilizado

como branco.

29

3. REFERÊNCIAS

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40

4. RESULTADOS

Os resultados obtidos com este trabalho foram organizados de forma a elaborar dois

artigos científicos. O artigo I segue a formatação das normas de publicação exigidas

pelo periódico Brazilian Journal of Plant Physiology e o artigo II segue as normas de

publicação exigidas pela Revista Árvore.

41

4.1 ARTIGO I

Biochemical, physiological and morphoanatomical responses of

Cariniana estrellensis (Raddi.) Kuntze (jequitibá-branco) young

plants in a irradiance gradient

Flávia Carolina Santos Portela¹, Manuela Gonoring Soares¹, Geraldo Rogério Faustini

Cuzzuol²*

¹Programa de Pós-graduação em Biologia Vegetal (PPGBV) da Universidade Federal do

Espírito Santo (UFES). Av. Fernando Ferrari 514, Campus Universitário Alaor Queiroz de

Araújo, CEP 29075-910, Vitória ES. E-mail: flaviacsportela@yahoo.com.br

²Professor do Departamento de Ciências Biológicas/CCHN/UFES. Av. Fernando Ferrari

514, Campus Universitário Alaor Queiroz de Araújo, CEP 29075-910, Vitória ES. E-mail:

gcuzzuol@gmail.com.

Abstract – Due to the difficulty of organizing ecological successional trees in groups, the

ecophysiological behavior of Cariniana estrellensis was studied in a gradient of irradiance.

Plants with 12 months old were submitted in four treatments: 40%, 50%, 70% e 100% of solar

radiation, during 104 days. After this time were made analyses of growth, photosynthetic

pigments content, gas exchange, chlorophyll a fluorescence, leaf content of soluble

carbohydrates, stem and leaf anatomy and phenotypic plastic. In 70% of irradiation, plants

showed better growth in height and diameter, besides highest leaf, stem and root biomass. In

70% and 100% of irradiance plants showed smallest and thicker leaves - resulting in lower

total leaf area and specific leaf area – and with lower chlorophyll a and b content, higher

42

chlorophyll a/b ratio, higher carotenoids content and lower total chlorophyll/carotenoids ratio.

Higher photosynthetic rates were found in plants in 70% and inhibited in 40%, 50% e 100%

of irradiance. Except for glucose – with did not vary between treatments - the soluble

carbohydrates content was higher in plants in 70%, and 100%. The highest leaf thickness in

100% was due to the highest thickness of adaxial and abaxial epidermis and of palisade and

spongy parenchymas. And the highest stem diameter in 70% occurred because of the highest

thickness of secondary xylem and phloem. The ecophysiological analyses indicated that C.

estrellensis behaved as an intermediate species, able to survive in the gradient of irradiance

tested.

Key words: anatomy, gas exchange, growth, phenotipic plasticity, photosynthetic pigments,

soluble carbohydrates.

INTRODUÇÃO

A recuperação da cobertura florestal tropical, através do reflorestamento com nativas, é uma

atividade de grande interesse ecológico (Hall et al., 2012), uma vez que a exploração

desordenada das florestas tropicais coloca em risco de extinção várias arbóreas nativas

(Lorenzi, 2002). No entanto, tais atividades tornam-se, muitas vezes, inviáveis devido à

escassez de informações sobre a ecofisiologia das espécies e sobre os aspectos da sucessão

florestal.

Comumente, espécies classificadas como pioneiras são empregadas na execução dos projetos

de reflorestamento tropical. Por serem iniciais da sucessão, expõem-se diretamente à luz solar,

possuindo maior predisposição para adaptação a altas intensidades de luz (Favaretto et al.,

2011; Goodale et al., 2012). Estas espécies apresentam, então, aspectos adaptativos que as

permitam sobreviver em tais condições, como crescimento rápido, maior acúmulo de

43

biomassa, menor teor de pigmentos, maiores taxas fotossintéticas e maior tolerância à

fotoinibição, em relação às espécies intermediárias da sucessão (Favaretto et al., 2011).

Estudos atuais indicam, porém, que arbóreas ditas pioneiras podem sofrer danos quando

expostas a alta irradiância, principalmente nos casos em que a intensa exposição solar ocorre

de maneira abrupta, como durante a formação das clareiras nas florestas, que alteram os

padrões de quantidade e qualidade de luz (Gonçalves et al., 2007; Mengarda et al., 2009). A

sobrevivência das arbóreas em um gradiente de luz está relacionada à plasticidade fenotípica,

que é a capacidade de um determinado genótipo modular diferentes respostas de adaptação

em função das condições ambientais. E o que muitos trabalhos têm evidenciado é que as

espécies pioneiras nem sempre possuem maior plasticidade fenotípica, em relação às

intermediárias (Favaretto et al., 2011).

A intensidade da irradiância é um dos fatores abióticos que tem maior influência sobre as

características de crescimento e desenvolvimento vegetal (Gonçalves et al., 2007). Em geral,

as alterações sofridas pelas arbóreas em diferentes condições de luminosidade visam manter

um balanço entre o ganho de carbono pela fotossíntese e a perda de água por transpiração

(Givnish, 1988). Para tanto, podem ocorrer ajustes morfofisiológicos foliares e/ou caulinares,

ajustes bioquímicos foliares ou alterações no padrão de alocação de biomassa entre os órgãos

vegetais (Oliveira, et al., 2011). Essas alterações visam retomar o metabolismo normal das

plantas, quando estas se deparam com situações de estresse.

Dentre as espécies tropicais com potencial para uso em projetos de reflorestamento,

Cariniana estrellensis (Raddi.) Kuntze é uma arbórea de grande interesse em pesquisas de

sucessão florestal. Conhecida como jequitibá-branco, esta espécie nativa do Brasil pertencente

à família Lecythidaceae, é objeto de interesse em programas de recuperação de áreas

degradadas e em plantios comerciais (Lorenzi, 2002). No entanto, a escassez de informações

sobre o seu desempenho ecofisiológico, além de dificultar o seu manejo e conservação, torna

44

questionável a sua classificação como uma espécie secundária da sucessão florestal (Lorenzi,

2002).

O presente estudo se propõe, então, a avaliar as características fisiológicas e morfoanatômicas

de C. estrellensis, em relação a um gradiente de irradiância, buscando certificar a sua posição

na sucessão florestal baseada nos três grupos ecológicos, através da análise da sua

plasticidade fenotípica.

MATERIAL E MÉTODOS

Material vegetal e desenho experimental: plantas de Cariniana estrellensis (Raddi.) Kuntze

com 14 meses de idade cultivadas em vasos de polietileno 8L contendo mistura de terra

vegetal, areia e argila (1:1:1) foram acondicionadas em 10% de irradiância sob telado

sombrite, temperatura média de 28±2 oC, umidade relativa 75±8 % e fotoperíodo natural de

11:00±1 hora, de junho a agosto de 2010. Após esse período de aclimatação, as plantas foram

submetidas a 40, 50, 70 e 100 % de irradiância (pleno sol) sob caixas de telado de sombrite

nas mesmas condições ambientais anteriormente descritas, durante os meses de agosto a

dezembro de 2010. As plantas foram regadas semanalmente em ponto de saturação para evitar

a restrição hídrica.

O experimento foi estabelecido em delineamento inteiramente casualizado (DIC), com treze

repetições por tratamento. Com exceção dos dados de fluorescência da clorofila a, os demais

dados foram submetidos à regressão polinomial.

Análise de crescimento: Aos 0 e 104 dias de tratamento, foram realizadas medidas a altura das

plantas, diâmetro do colo do caule e massa seca da raiz, caule e folhas em estufa 60ºC até

obtenção da massa seca constante. A área foliar foi medida utilizando-se um scanner de

geração de imagens (Area Meter da LI-COR 3100, Nebrasca, USA). Com esses dados foram

45

calculados a área foliar específica (SLA = área foliar total/massa seca das folhas), taxa de

crescimento relativo (TCR = (LnM2-LnM1)/(t2-t1)), razão de área foliar (LAR = área foliar

total/massa seca total), razão raiz: parte aérea (R:S) segundo Hunt (1982), onde, M1 = massa

inicial; M2 = massa final; t1 = tempo inicial; t2 = tempo final; Ln = Log natural; MSF = massa

seca foliar, MSC=massa seca caulinar, MSR=massa seca radicular, MST = massa seca total e

AF = área foliar.

Quantificação dos pigmentos fotossintéticos: As clorofilas a e b e os carotenóides foram

extraídos em 10 mL de dimetilsulfóxido (DMSO), utilizando-se 20 mg de massa fresca de

folhas do 3º nó completamente expandidas transferidos para tubos de ensaio com tampa,

envoltos por papel alumínio e aquecidos em banho maria por 4 horas à 60ºC. As leituras da

densidade ótica foram feitas em espectrofotômetro (Genesys 10S UV-Vis, Thermo Fisher

Scientific, Waltham, EUA) em 480, 645 e 663 nm. As concentrações das clorofilas a e b e dos

carotenóides foram calculadas pelas equações de Hendry e Price (1993).

Análise de fotossíntese: As análises de trocas gasosas foram realizadas nas mesmas folhas e

tempo para a extração dos pigmentos fotossintéticos, em sistema fechado, com analisador de

gases infravermelho portátil - IRGA (LI-6200, LI-COR Inc., Lincoln, EUA) as 8:00 horas,

utilizando-se a concentração de CO2 atmosférica e temperatura ambiente de 25 ºC. Foi

utilizada fonte de luz artificial com intensidade aproximada de 1.500 μmol m-2

s-1

. Avaliou-se

a assimilação fotossintética de carbono (A, µmol m-2

s-1

), condutância estomática (gs, mol m-2

s-1

), transpiração (E, µmol m-2

s-1

) e teor de carbono interno (Ci, µmol mol-1

). Foram

calculadas a eficiência do uso de água (A/E, µmol mmol-1

) e eficiência aparente de

carboxilação (A/Ci, µmol m-2

s-1

Pa-1

).

Fluorescência da clorofila a: a cinética da emissão da fluorescência da clorofila a foi

analisada em um fluorômetro portátil - Handy PEA (Plant Efficiency Analyzer, Hansatech,

King’s Lynn, UK). As medidas foram realizadas as 8:00 horas, com a adequação da área

46

foliar ao escuro por 30 minutos. Imediatamente após a adaptação ao escuro, as folhas foram

expostas a um pulso saturante de luz vermelha de cerca de 3.000 µmol m-2

s-1

. Os dados

foram tabulados pelo programa do Handy PEA (PEA Plus).

Extração e quantificação de carboidratos solúveis: amostras de 1 grama de massa fresca de

folha foram fervidas em 10 mL de etanol 80%, durante 3 minutos, para inativação enzimática.

Posteriormente, as amostras foram maceradas e submetidas à extração de carboidratos

solúveis em banho maria 80 ºC por 15 minutos (Carvalho et al. 1998). O extrato obtido foi

centrifugado a 4.500 g por 15 minutos, separando o sobrenadante. Essa ultima operação foi

repetida mais duas vezes. O homogeneizado foi transferido para um balão volumétrico

conectado a um evaporador rotatório (QUIMIS®, Q344B1, Diadema, Brasil), 30 rpm e 40 ºC

para concentração das amostras. A quantificação dos teores de açúcares totais solúveis foram

realizadas segundo Dubois et al. (1956), a quantificação de frutose segundo Jermyn (1956), a

quantificação de sacarose segundo Riazi et al. (1985) e a determinação de glicose foi realizada

utilizando-se o kit de Glicose Enzimática Líquida (Doles®, Goiânia, Goiás). Os resultados

foram expressos em miligrama de açúcar por grama de massa seca.

Anatomia foliar e caulinar: Segmentos do caule, a partir da base, com aproximadamente 40

cm e folhas novas do quarto nó completamente expandidas foram fixadas em FAA 70

(Formaldeído, Ácido acético e Etanol 70%) por 48 horas (Johansen, 1940) e armazenadas em

álcool 70%. Amostras do coleu do caule, amostras do terço mediano do limbo

compreendendo as regiões internevural e da nervura central das folhas foram cortadas à mão

livre em seções transversais utilizando-se lâminas de aço. Os cortes foram corados com

Safrablau (Bukatsch, 1972, modificado) e as lâminas histológicas montadas com água

glicerinada (3:1) e vedadas com esmalte incolor. Para a quantificação estomática fez-se a

impressão da epiderme foliar em lâmina de vidro, com éster de cianocrilato (Super Bonder®).

47

As observações e a documentação fotográfica foram realizadas em fotomicroscópio (Nikon,

Eclipse E200, Tókio, Japão).

Para a análise dos elementos dissociados do xilema secundário foi utilizada uma solução de

peróxido de hidrogênio 30% (v/v) e ácido acético glacial (1:1). O material foi mantido na

solução em tubos de ensaio lacrados por três dias em estufa a 60°C. O material foi lavado e

submetido à coloração com safranina 1% (p/v) em etanol 70% (v/v) conforme Kraus e Arduin

(1997).

Análise de plasticidade fenotípica: a plasticidade representa a variação do fenótipo da espécie,

de acordo com as respostas adaptativas encontradas nas diferentes intensidades de irradiâncias

em que as plantas foram submetidas. O índice de plasticidade fenotípica, com variação de 0 a

1, foi calculado para cada variável estudada, como sendo a diferença entre o maior e o menor

valor médio em cada tratamento (pleno sol e 40% de irradiância), dividido pelo maior valor

médio (Valladares et al., 2000; 2005). Quanto maior o valor do IP, ou seja, quanto mais

próximo de 1, mais plástica é a variável (Valladares et al., 2005).

RESULTADOS

Análise de crescimento: As medidas, razões e taxas de crescimento mostraram regressões

polinomiais diferenciadas quanto ao aumento da irradiância (Figura 1). A altura e diâmetro

do caule aumentaram progressivamente ao aumento da irradiância até 70%, com queda em

100%, igualado-se a 50% de irradiância. A área foliar, razão de área foliar e área foliar

específica diminuíram com o aumento da intensidade da irradiância, sem diferença dessas

medidas em 70 e 100%. A razão R: PA aumentou em resposta à intensidade da irradiância,

sem diferenças entre as duas intensidades mais baixas e as duas mais elevadas. A TCR

48

aumentou com a intensidade da irradiância até 70% seguido de queda em 100% que,

diferentemente da altura e do diâmetro, não se igualou aos valores de 50%.

Quantificação de pigmentos fotossintéticos: Enquanto os teores de Chltotal diminuíram com o

aumento da intensidade da irradiância, o contrário ocorreu com os Carotenóides (Figura 2).

Análise de fotossíntese: As medidas fotossintéticas mostraram relação quadrática positiva

(Figura 3) em que a taxa fotossintética (A) e condutância estomática (gs) aumentaram com o

aumento da irradiância alcançando valores máximos em 70% de irradiância. Em 100% de

irradiância houve decréscimo dessas variáveis que se igualaram às irradiâncias mais baixas. A

concentração de carbono interno (Ci) e a transpiração (E) também seguiram a mesma

tendência de regressão polinomial sendo que em 100% de irradiância o valor de Ci foi o

menor encontrado, enquanto o valor de E foi maior nas irradiâncias mais elevadas. O uso

eficiente da água (A/E) decresceu com o aumento da irradiância alcançando os mais baixos

valores em 100%. Diferentemente, a eficiência aparente de carboxilação (A/Ci) aumentou

com a intensidade da irradiância, alcançando maiores valores em 100%.

Fluorescência da Clorofila a: nas folhas novas de C. estrellensis, enquanto a densidade de

centros de reação ativos (RC/ABS) diminuiu progressivamente com o aumento da intensidade

da irradiância (Figura 4A), a dissipação do excesso de energia (Di0/ABS) aumentou (Figura

4B), culminando com menores índice de desempenho do fotossistema II (PIabs) e índice de

desempenho total (PITotal) em 100% de irradiância.

Carboidratos solúveis: As concentrações dos açúcares totais solúveis, frutose e sacarose foliar

mostraram tendência de regressão polinomial quadrática, com maiores concentrações em 70%

de irradiância, seguido de 100% que, apesar de ter apresentado um decréscimo na

concentração dos açúcares, manteve valores mais altos do que nas irradiâncias mais baixas. A

glicose apresentou a mesma tendência, porém, sem diferença significativa entre as

irradiâncias devido à elevada variabilidade (erro padrão).

49

Anatomia foliar e caulinar: a folha de C. estrellensis é hipoestomática, com estômatos do tipo

paracítico. A densidade de estômatos foi maior em 100% de irradiância, assim como a

espessura total do limbo, das epidermes adaxial e abaxial e dos parênquimas paliçádico e

esponjoso (Tabela 1). No caule de C. estrellensis, o xilema secundário apresenta elementos de

vaso com distribuição difusa e maior proporção de vasos solitários, seguido de vasos

múltiplos de 2 (Tabela 3, Figura 6). A espessura do xilema secundário e o diâmetro dos

elementos de vaso foram maiores em 70% de irradiância, não apresentando variação entre as

irradiâncias mais baixas e a mais alta. De maneira oposta, a densidade de vasos foi menor em

70%, mas também não diferiu entre as demais irradiâncias. O comprimento dos elementos de

vasos não apresentou variações em nenhuma das irradiâncias testadas (Tabelas 2, 3). O

floema secundário apresenta faixas tangenciais de fibras intercaladas com elementos de tubo

crivado e células parenquimáticas (Figura 6). A espessura do floema secundário e a espessura

da faixa cambial forem maiores em 70% de irradiância, não variando entre as irradiâncias

mais baixas e a mais alta (Tabela 2, Figura 6). A espessura da periderme aumentou com o

aumento da irradiância, não variando entre as intensidades mais baixas e entre as intensidades

mais altas (Tabela 2).

Análise de plasticidade fenotípica: as variáveis morfológicas, bioquímicas e de fotossíntese e

trocas gasosas estudadas apresentaram diferentes índices de plasticidade fenotípica (IP)

(Tabela 4). Dentre as variáveis mensuradas, enquanto a MST, a TCR, a TAL, a E, a gs, o Ci e

a A/E apresentaram maior plasticidade fenotípica no gradiente de irradiância testado, a

espessura da epiderme abaxial e o diâmetro dos elementos de vaso apresentaram menor

capacidade de variação (Tabela 4). Para os três grupos de variáveis analisadas as variáveis de

fotossíntese e trocas gasosas apresentaram maior plasticidade, seguido das variáveis

morfológicas e bioquímicas, que não variaram entre si (Tabela 5).

50

DISCUSSÃO

O gradiente de irradiância induziu expressivas modificações no crescimento e no metabolismo

celular de C. estrellensis, confirmando observações anteriores de que irradiâncias extremas

provocam inibição do crescimento (Lima et al., 2008; Kwak et al., 2011). As plantas de C.

estrellensis em 40%, 50% e 100% de irradiância apresentaram menor altura e diâmetro do

caule, sendo que o maior crescimento em 70% parece estar associado à maior A.

As irradiâncias testadas promoveram alterações no padrão de alocação de biomassa da espécie

em estudo. Sob maiores irradiâncias, espécies arbóreas tendem a alocar mais biomassa para as

raízes, em detrimento da parte aérea (Lima et al., 2008; Oliveira, et al., 2011), visto que a

menor produção de área foliar , nessa condição, é uma estratégia que contribui para a redução

da perda excessiva de água por transpiração (Duz et al., 2004). De maneira oposta, o maior

investimento em área foliar sob condições de baixa irradiância, como observado em 40% e

50%, é vantajoso, pois aumenta a superfície de interceptação luminosa (Oliveira et al., 2011).

Além do menor investimento em área foliar, as plantas em pleno sol desenvolveram folhas

mais espessas, indicando elevado grau de esclerofilia como parte de suas estratégias

adaptativas (Lima et al., 2008; Mengarda et al., 2009; Kwak et al., 2011). A menor SLA

aumenta a resistência da perda de água por transpiração e evita danos foto-oxidativos (Duz et

al., 2004).

O aumento da RGR e a diminuição da LAR, nas plantas sob maiores intensidades de

irradiância, indicam que em sombreamento intenso a espécie em estudo tem o seu

crescimento limitado. E o maior crescimento das plantas em 70% de irradiância sugerem que

C. estrellensis possui características de espécie intermediária da sucessão florestal, uma vez

que plantas nessa categoria sucessional expressam sua maior capacidade de crescimento em

condições de irradiância moderada.

51

As alterações nos padrões de crescimento foram acompanhadas por variações nas

concentrações dos pigmentos fotossintéticos. O maior teor foliar de clorofila total em

condições de maior sombreamento é bastante documentado para diversas espécies (Marchese

et al, 2008; Lima et al., 2011). Enquanto a menor concentração de clorofilas em pleno sol

sugere menor necessidade de investimento em captação de luz, a maior concentração em

condições de sombreamento, otimiza a captação de energia luminosa (Laisk et al., 2005).

Os carotenóides são moléculas fotoprotetoras, cujo acúmulo pode evitar a ocorrência de

fotoinibição, através da dissipação do excesso de energia (Demmig-Adams et al., 1996).

Dessa forma, algumas arbóreas nativas, como C. estrellensis, apresentam maior concentração

desse pigmento em condições de maior irradiância (Mengarda, et al., 2009; Silva et al., 2010).

As análises de trocas gasosas mostraram que o maior valor de A nas plantas em 70% de

irradiância refletiu na maior produção de biomassa e foi acompanhado por maiores valores de

gs, E e Ci, indicando que nessa intensidade de irradiância ocorreu grande estímulo à abertura

estomática e, consequentemente, maior absorção de moléculas de CO2 e níveis mais elevados

de perda de água por transpiração (Marchese et al., 2008).

Embora algumas arbóreas possam apresentar maior A em resposta ao aumento da irradiância

(Costa e Marenco, 2007), em algumas situações o excesso de luminosidade pode ser

prejudicial à fotossíntese (Mengarda et at., 2009). Quando as folhas são expostas a maior

irradiância do que necessitam ocorre fechamento dos estômatos, com consequente redução na

concentração interna de CO2 (Favaretto et al., 2011) e o aparato fotossintético pode sofrer

danos (Thach et al., 2007). A queda de A nas plantas de C. estrellensis em 100% de

irradiância pode indicar a ocorrência de fotoinibição da fotossíntese, como evidenciado pelas

análises de fluorescência da clorofila a.

A diminuição de RC/ABS em pleno sol indica, segundo Li et al. (2007), que parte dos centros

de reação do fotossistema II está inativa, havendo sobrecarga de absorção de energia luminosa

52

por centro de reação. Com isso, uma estratégia para evitar a ocorrência de danos irreversíveis

no aparato fotossintético é a dissipação do excesso de energia luminosa na forma de calor,

como foi observado pelo alto valor de DI0/RC em pleno sol.

A variação nos parâmetros do fluxo de energia avaliados possivelmente refletiram no menor

índice de desempenho do fotossistema II (PIabs) nas plantas sob 100% de irradiância. Esse

índice tem sido considerado o parâmetro mais eficiente para detecção de estresse em plantas,

pois relaciona a eficiência de absorção, de captura e de transferência de energia de excitação

pelo FSII (Gonçalves e Santos Jr, 2005). Assim, o baixo PIabs pode ser indicativo de perda de

eficiência fotoquímica (Thach et al., 2007), sugerindo a maior dissipação de energia luminosa

nas plantas em pleno sol não foi capaz de evitar a ocorrência de fotoinibição.

O baixo PITotal nas plantas de C. estrellensis submetidas a 100% de irradiância indica que o

fluxo de energia do fotossistema I não foi capaz de recuperar o estresse causado pelo excesso

de irradiância no fotossistema II e, dessa forma, também tenha sofrido com excesso de luz.

A maior E nas plantas de C. estrellensis em pleno sol não era esperada, devido a baixa gs

nessa condição. No entanto, em alguns casos, altas irradiâncias promovem o aumento da

temperatura foliar e, com isso, podem intensificar a evapotranspiração, ao mesmo tempo em

que estimulam o fechamento estomático (Marchese et al., 2008).

O aumento de E reduz o uso eficiente da água (A/E) como constatado em estudos com

arbóreas da floresta tropical brasileira (Gonçalves et al., 2005; 2007; Mengarda et al., 2009),

sendo que arbóreas pioneiras crescendo em ambientes altamente iluminados apresentam

maior A/E do que as arbóreas intermediárias (Silva et al., 2010).

Segundo Gonçalves et al. (2007) , as espécies desenvolvidas sob plena exposição solar

(pioneiras) apresentam melhor desempenho fotoquímico com o aumento da intensidade

luminosa e possuem maior capacidade de dissipação do excesso de energia. Baseado nos

diagnósticos propostos pelos autores e em concordância com os dados fisiológicos de

53

crescimento, pode-se sugerir que C. estrellensis é uma espécie intermediária no processo da

sucessão florestal.

As plantas de C. estrellensis submetidas a 40%, 50% e 100% de irradiância apresentaram

baixa A. No entanto, em pleno sol, a produção de biomassa foi maior do que nas menores

irradiâncias (40% e 50%). Esse resultado pode ser explicado pela maior eficiência aparente de

carboxilação (A/Ci) encontrada em pleno sol, conforme relatado por Silvestrini et al. (2007).

Alterações em A podem refletir em mudanças no conteúdo de açúcares solúveis, que estão

diretamente ligados ao crescimento vegetal. Assim, plantas submetidas a diferentes

intensidades de irradiância tendem a apresentar alterações nas concentrações de açúcares

totais solúveis, principalmente em decorrência dos teores de frutose, sacarose e glicose

(Marenco et al., 2001).

Os maiores teores de açúcares foliares encontrados nas plantas de C. estrellensis em 70% e

100% de irradiância são, provavelmente, reflexos do aumento radiação. De acordo com Couée

et al. (2006), o acúmulo de carboidratos solúveis pode ser uma resposta adaptativa à condição

de estresse luminoso, uma vez que altas concentrações de açúcares podem atuar na defesa

vegetal contra danos oxidativos. Em concordância, estudos com arbóreas tropicais sugerem

que açúcares como frutose e sacarose atuam, não apenas como componentes de reserva, mas

como importantes sinalizadores de estresse (Cuzzuol e Clipel, 2009).

O papel dos carboidratos solúveis pode, também, estar relacionado à osmorregulação. O

acúmulo foliar dessas substâncias nas plantas em 70% e 100% de irradiância pode atuar na

redução do potencial hídrico celular, beneficiando a abertura estomática em condições de

déficit hídrico causadas, indiretamente, por alta radiação solar (Cuzzuol e Milanez, 2012).

A anatomia foliar de C. estrellensis também sofreu grandes modificações em função dos

regimes de luminosidade. A maior espessura total do limbo nas folhas em pleno sol se deu

pelas maiores espessuras das epidermes adaxial e abaxial e dos parênquimas paliçádico e

54

esponjoso. Essas alterações na estrutura interna da folha melhoram a captura de luz através da

lamina foliar (Boeger et al., 2009; Rossatto e Kolb, 2010; Kwak et al., 2011). Segundo

Vogelmann et al. (1996), enquanto o formato colunar das células em paliçada contribui para a

chegada de luz até os cloroplastos, o parênquima esponjoso redireciona e dispersa os feixes

luminosos dentro do mesofilo.

A razão entre parênquima esponjoso/parênquima paliçádico (SP/PP) é um indicativo da

qualidade de captura da luz, uma vez que as células esponjosas são mais eficientes na

captação de luz difusa, típica de ambientes sombreados. Isso explica a maior razão SP/PP

encontrada nas plantas de C. estrellensis sob 40% de irradiância.

A maior espessura da epiderme nas folhas de C. estrellensis em pleno sol está de acordo com

estudos de luminosidade (Rossatto e Kolb, 2010; Voltolini e Santos, 2011). Tudo indica que

uma camada epidérmica adaxial mais espessa pode auxiliar na reflexão de parte da

irradiância, mantendo uma temperatura foliar interna ótima (Chazdon e Kaufmann, 1993),

enquanto a maior espessura da epiderme abaxial pode conferir melhor aproveitamento dos

feixes luminosos que penetram no mesofilo (Lin e Ehleringer, 1983).

Diversos estudos afirmam que o número de estômatos por área é maior com aumento da

intensidade luminosa, pois permite às folhas de sol elevar as taxas fotossintéticas através da

maior captação de moléculas de CO2 (Boeger et al., 2009; Voltolini e Santos, 2011). Apesar

da densidade estomática ter sido maior nas folhas de C. estrellensis em 100% de irradiância, o

controle do fechamento estomático, evidenciado pela baixa gs, e a suscetibilidade à

fotoinibição nesse tratamento, limitaram o aumento de A.

O maior diâmetro do caule nas plantas de C. estrellensis em 70% de irradiância se deu pela

maior espessura do xilema e floema secundários, provavelmente em resposta à maior

atividade da faixa cambial, que, segundo Gartner (1995), é altamente responsiva às condições

de luminosidade.

55

O xilema secundário é constituído por elementos condutores, células parenquimáticas e fibras,

além de outros tipos celulares, estando organizado nos sistemas axial e radial. As células

radiais, assim como as axiais, são responsáveis pelo armazenamento e translocação de água e

solutos a curta distância, principalmente no sentido lateral (Costa et al., 2006). Segundo Prata

e Mendonça (2009), essas células respondem adaptativamente às condições em que as taxas

fotossintéticas são altas. Sendo assim, as maiores A e E encontradas em C. estrellensis em

70% de irradiância, implicam em maior necessidade de transporte de água e solutos

inorgânicos, tanto para a produção de fotoassimilados, quanto para reposição da água perdida

por transpiração.

O floema secundário, responsável pela translocação dos produtos da fotossíntese da fonte para

o dreno, também é composto por células parenquimáticas radiais e axiais que permitem a

ocorrência de translocação lateral (Machado e Carmello-Guerreiro, 2006). Dessa forma, com

a maior produção de fotoassimilados em C. estrellensis sob 70% de irradiância em função da

maior A, presume-se que o aumento do tecido floemático pode constituir uma adaptação que

beneficie a condução dos produtos da fotossíntese.

A formação da periderme também pode ser influenciada pelas condições ambientais,

incluindo exposição à luz solar direta. Esse tecido protege as plantas contra irradiância

intensa, evitando o superaquecimento das estruturas internas. Dessa forma, quanto maior a sua

espessura, maior será a eficiência de isolamento térmico (Mazzoni-Viveiros e Costa, 2006),

como observado nas plantas de C. estrellensis sob maiores intensidades de irradiância.

Segundo Zimmermann (1982) vasos com maior diâmetro e em menor número garantem às

plantas maior eficiência de condução. Sendo assim, a menor densidade de vasos, porém, de

maior diâmetro, encontrada nas plantas de C. estrellensis em 70% de irradiância sugerem

maior capacidade de condutividade hídrica. Essa estratégia é extremamente vantajosa, pois

com o aumento de A nesse tratamento há maior necessidade de transporte de água e solutos.

56

O arranjo dos elementos de vaso também é bastante estudado na avaliação da eficiência do

transporte de seiva. Segundo Lindorf (1994), o agrupamento dos vasos em condições de

déficit hídrico é uma estratégia de segurança de condução, já que estimula o número de vias

alternativas de transporte de seiva em caso de ocorrência de cavitação. Em C. estrellensis foi

encontrada maior proporção de vasos solitários, seguido de vasos múltiplos de 2 (M2), em

todos os tratamentos, indicando que, possivelmente, as plantas não sofreram restrição hídrica

e a irradiância não influenciou o arranjo dos elementos de vaso.

A plasticidade fenotípica representa a capacidade de um genótipo expressar diferentes

fenótipos, de acordo com as variações ambientais (Valladares et al., 2005). Assim,

independentemente dos grupos sucessionais, as espécies são capazes de sobreviver em

ambientes diversos, exibindo respostas de modulação a condição ambiental em que se

encontram (Lima et al., 2010; Favaretto et al., 2011)

Apesar de pesquisas evidenciarem que as espécies pioneiras apresentam alto potencial de

aclimatação (Valladares et al., 2000), já foi relatado que as espécies intermediárias também

podem sofrer modificações morfofisiológicas que as permitam sobrevivem em diferentes

gradientes de luz (Lima et al., 2010).

C. estrellensis mostrou-se plástica em função da luminosidade, sendo capaz de modular

respostas de adaptação morfológicas e bioquímicas, mas, principalmente, de fotossíntese e

trocas gasosas, confirmando que a capacidade de ajuste do aparato fotossintético não está

restrita às espécies pioneiras.

Em geral, o que se observa é que apesar de muitos estudos encontrarem relação entre

plasticidade fenotípica e os estágios sucessionais, os ajustes morfisiológicos nem sempre

estão diretamente relacionados ao status sucessional das espécies (Rosendaal et al., 2006). No

presente estudo, C. estrellensis apresentou melhor desenvolvimento em irradiância moderada,

confirmando a sua classificação como uma espécie intermediária. No entanto, essa espécie

57

mostrou-se capaz de sobreviver na faixa de irradiância testada (40% a 100%), o que confirma

a necessidade de estudos do comportamento ecofisiológico das espécies, independentemente

das classificações sucessionais, visando facilitar o manejo em programas de recuperação de

áreas degradadas.

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63

TABELAS

Table 1. Anatomical quantitative data of leaves of C. estrellensis submitted to 40% and 100%

of solar irradiation, at 104 days. Mean values and standard error of thickness of adaxial and

abaxial epidermis, of palisade and spongy parenchymas, of blade, ratio between the thickness

of palisade and spongy parenchyma (SP/PP) and stomatal density (stomata/mm²) (n=4).

Irradiation

(%)

Thickness (µm) SP/PP

Stomata

(mm²) Adaxial

Epidermis

Palisade

parenchyma

Spongy

parenchyma

Abaxial

epidermis Blade

40 6,7 ± 0,16 32 ± 0,74 46 ± 1,08 5,5 ± 0,14 90 ± 1,2 1,5 ±

0,05

98 ±

6,6 100 8,7 ± 0,21 52 ± 0,88 68 ± 1,48 6,2 ± 0,18 135 ± 1,5 1,3 ±

0,04

152 ±

7,6

Table 2. Anatomical qualitative data of stems of C. estrellensis submitted to 40%, 50%, 70%

and 100% of solar irradiation, at 104 days. Mean values and standard error of thickness of

secondary and primary xylem, of cambia, of secondary phloem and of peridem (n=4).

Irradiation Thickness (µm)

Primary

xylem

Secondary

xylem

Cambial

zone

Secundary

phloem Periderm

40% 184 ± 11 2382 ± 70 31,3 ± 1,1 414 ± 17 36 ± 1,3

50% 164 ± 10 2469 ± 66 29,9 ± 1,1 436 ± 11 37 ± 1,4

70% 157 ± 14 3793 ± 115 49,8 ± 1,5 674 ± 22 69 ± 1,4

100% 147 ± 10 2468 ± 63 32,8 ± 1,2 446 ± 12 73 ± 4,0

Table 3. Anatomical quantitative data of secondary xylem vessel elements, in stem of C.

estrellensis submitted to 40%, 50%, 70% and 100% of solar irradiation, at 104 days. Mean

values and standard error of diameter, of length and of vessel density (nº/mm²) and percentage

of solitary vessels (S), multiples of 2 (M2), multiples of 3 (M3), multiples of 4 (M4) and

multiple of 6 (M6) (n=4).

64

Irradiation

Vessel elements

Diameter

(µm)

Lenght

(µm)

Density

(nº/mm²)

Grouping (%)

S M2 M3 M4 M6

40% 44 ± 1,1 377± 13,0 36 ± 4,3 50,2 32,2 14,4 0,0 3,2

50% 44 ± 1,5 375 ± 11,0 38 ± 1,4 56,2 24,9 11,9 4,0 3,0

70% 51 ± 1,7 383 ± 12,6 28 ± 1,9 60,5 24,5 12,2 2,7 0,0

100% 46 ± 1,5 409 ± 12,6 36 ± 2,1 55,6 32,1 8,0 4,3 0,0

Table 4: Plasticity índex (PI = (maximum – minimum)/maximum), after Valladares et al.

2000) of morphological, biochemical and photosynthesis and gas exchange variables, in C.

estrellensis submitted to 40%, 50%, 70% and 100% of solar irradiation, at 104 days. All

variables analyzed showed significative difference due to luminosity variations.

Plasticity

índex Variable Type of Variable

0,37 Height Morfological

0,40 Diameter Morfological

0,40 Leaf area Morfological

0,38 Specific leaf area (SLA) Morfological

0,58 Leaf area ratio (LAR) Morfological

0,36 Root:shoot rate (R:S) Morfological

0,61 Relative growth rate (RGR) Morfological

0,65 Net assimilation rate (NAR) Morfological

0,31 Total chlorophyll concentration Biochimical

0,33 Carotenoids concentration Biochimical

0,54 Photosynthetic rate (A) Photosynthesis and gas exchange

0,65 Transpiration (E) Photosynthesis and gas exchange

0,73 Stomatal condutance (gs) Photosynthesis and gas exchange

0,65 Internal carbon concentration (Ci) Photosynthesis and gas exchange

0,72 Water use efficiency (A/E) Photosynthesis and gas exchange

0,46 Apparent carboxylation efficiency (A/Ci) Photosynthesis and gas exchange

0,56 Foliar total soluble sugar Biochimical

0,32 Foliar sucrose Biochimical

0,45 Foliar fructose Biochimical

0,23 Adaxial epidermis Morfological

65

0,39 Palisade parenchyma Morfological

0,32 Spongy parenchyma Morfological

0,11 Abaxial epidermis Morfological

0,33 Total blade thickness Morfological

0,35 Stomatal density Morfological

0,37 Secundary xylem Morfological

0,29 Cambial zone Morfological

0,39 Secundary phloem Morfological

0,50 Periderm Morfological

0,14 Vessel element diameter Morfological

0,28 Vessel element density Morfological

Table 5: Mean values and standard error of the plasticity index (PI), in response to

environmental variations of solar irradiation for the different groups of variables (grouped

according to table 4).

PI Type of variable

0,37 ± 0,03 Morfological

0,39 ± 0,05 Biochimical

0,63 ± 0,04 Photosynthesis and gas exchange

66

LEGENDA DAS FIGURAS

Figure 1. Growth data in C. estrellensis plants submitted to 40%, 50%, 70% e 100% of solar

irradiation, after 104 days. A - Height; B - Diameter; C - Leaf area; D - Specific leaf area

(SLA); E - Root:shoot ratio (R:S); F - Leaf area rate (LAR); G - Relative growth rate (RGR);

H – Net assimilation rate (NAR). The vertical bars represent the standard error of mean (n=6).

Figure 2. Photosynthetic pigments concentration in C. estrellensis plants submitted to 40%,

50%, 70% e 100% of solar irradiation, after 104 days. A - Chlorophyll a concentration (Chl

a); B - Chlorophyll b concentration (Chl b); C - Total chlorophyll concentration (Total Chl);

D - Carotenoids concentration (Carot); E - Chlorophyll a/b ratio (Chl a/b); F - Total

chlorophyll e carotenoids ratio (Total Chl/Carot). The vertical bars represent the standard

error of mean (n=6).

Figure 3. Gas exchange analyses in C. estrellensis plants submitted to 40%, 50%, 70% e

100% of solar irradiation, after 104 days. A - Photosynthetic rate (A); B - stomatatic

conductance (gs); E - Transpiration (E); D - Internal carbon concentration (Ci); E - Water use

efficiency (A/E); F - Apparent carboxylation efficiency (A/Ci). The vertical bars represent the

standard error of mean (n=6).

Figure 4. Emission parameter of chlorophyll fluorescence in C. estrellensis plants submitted

to 40%, 50%, 70% e 100% of solar irradiation, after 104 days. A - Active reaction center

(RC/ABS); B - Dissipation of energy per reaction center (DI0/RC); C - Performance index of

PSII (PIabs); D - Total performance index (PITotal) (n=6).

67

Figure 5. Leaf concentration of soluble carbohydrates in C. estrellensis plants submitted to

40%, 50%, 70% e 100% of solar irradiation, after 101 days. A - Total soluble sugars

concentration; B - Fructose concentration; C – Sucrose concentration; D - Glucose

concentration. The vertical bars represent the standard error of mean (n=6).

Figure 6. Cross section of C. estrellensis stem under different irradiance conditions. A, E e G

- 40% of solar irradiance. B - 50% of solar irradiance. C, F e H - 70% of solar irradiance. D -

100% of irradiance. (VD = vessel element in differentiation; E = xylem vessel element; CZ

cambial zone; FF = secondary phloem fibers in differentiation; SF = secondary phloem; XF =

secondary xylem fibers in differentiation; PE = periderm; SX = secondary xylem). Barr =

100µm (A, B, C, D); 20µm (E, F); 50µm (G, H).

68

FIGURAS

y = -0,025x2 + 3,6228x - 60,997

R2 = 0,9342

35

45

55

65

75

30 40 50 60 70 80 90 100

He

igh

t (c

m)

y = -0,0032x2 + 0,4842x - 8,8714

R2 = 0,8565

5

6

7

8

9

10

30 40 50 60 70 80 90 100

Dia

me

ter

(mm

)

y = 0,1186x2 - 30,497x + 3056,1

R2 = 0,9914

800

1200

1600

2000

2400

30 40 50 60 70 80 90 100

Le

af A

rea

(cm

²)

y = 0,0795x2 - 12,916x + 655,91

R2 = 0,9805

100

150

200

250

300

30 40 50 60 70 80 90 100

SL

A (

cm

²/g

)

y = 0,0063x + 0,3634

R2 = 0,965

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

30 40 50 60 70 80 90 100

R:S

y = 0,0328x2 - 5,69x + 286,71

R2 = 0,9993

25

50

75

100

125

30 40 50 60 70 80 90 100

LA

R (

cm

²/g

)

y = -0,0069x2 + 1,0628x - 26,862

R2 = 0,8421

2

4

6

8

10

12

14

16

30 40 50 60 70 80 90 100

RG

R (

mg

g-1

dia

-1)

y = -0,0001x2 + 0,0208x - 0,5806

R2 = 0,8748

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

30 40 50 60 70 80 90 100

NA

R (

mg

cm

-2 d

ia-1

)

Figura 1

A

C

E

B

D

F

Irradiation (%) Irradiation (%)

A

C

E

G

D

F

H

69

y = -0,0002x2 + 0,022x + 1,9072

R2 = 0,9996

2,0

2,2

2,4

2,6

30 40 50 60 70 80 90 100

Ch

l a (

mg

g-1

MF

)

y = -0,0003x2 + 0,0246x + 1,6653

R2 = 0,964

0,9

1,2

1,5

1,8

2,1

2,4

30 40 50 60 70 80 90 100

Ch

l b(m

g g

-1M

F)

y = -0,0005x2 + 0,0466x + 3,5713

R2 = 0,978

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

30 40 50 60 70 80 90 100

To

tal C

hl (m

g g

-1M

F)

y = -0,0002x2 + 0,0293x - 0,2484

R2 = 0,7984

0,5

0,7

0,9

1,1

30 40 50 60 70 80 90 100

Ca

rot (m

g g

-1M

F)

y = 0,0003x2 - 0,0263x + 1,7638

R2 = 0,9642

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

30 40 50 60 70 80 90 100

Ch

l a/ b

y = 0,0007x2 - 0,1599x + 12,736

R2 = 0,9582

2,0

4,0

6,0

8,0

30 40 50 60 70 80 90 100

To

tal C

hl / C

aro

t

Figura 2

A

C

E

B

D

F

Irradiation (%) Irradiation (%)

70

y = -0,0035x2 + 0,4869x - 10,734

R2 = 0,8111

2

4

6

8

30 40 50 60 70 80 90 100

A (

µm

ol m

-2 s

-1)

y = -5E-05x2 + 0,0073x - 0,1924

R2 = 0,8017

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

30 40 50 60 70 80 90 100

gs (

mo

l m

-2 s

-1)

y = -0,001x2 + 0,1649x - 4,5223

R2 = 0,934

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

30 40 50 60 70 80 90 100

E (

mm

ol m

-2 s

-1)

y = -0,0878x2 + 12,07x - 241,66

R2 = 0,8521

50

75

100

125

150

175

200

30 40 50 60 70 80 90 100

Ci

(µm

ol m

ol-1

)

y = 0,0014x2 - 0,2655x + 14,752

R2 = 0,9556

0

2

4

6

8

30 40 50 60 70 80 90 100

A/E

(µ

mo

l m

mo

l-1)

y = 1E-05x2 - 0,0014x + 0,0695

R2 = 0,9993

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

30 40 50 60 70 80 90 100

A/C

i (µ

mo

l m

-2 s

-1 P

a-1

)

Figura 3

Irradiation (%) Irradiation (%)

A B

C

E

D

F

71

y = -4E-05x2 + 0,0032x + 0,3026

R2 = 0,8549

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

30 40 50 60 70 80 90 100

RC

/AB

Sy = 0,0007x

2 - 0,0682x + 2,3182

R2 = 0,9714

0,4

1,2

2,0

2,8

30 40 50 60 70 80 90 100

DI 0

/RC

y = 8E-05x2 - 0,0278x + 2,4895

R2 = 0,8172

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

30 40 50 60 70 80 90 100

PI a

bs

y = -0,0002x2 + 0,0218x - 0,1095

R2 = 0,8329

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

30 40 50 60 70 80 90 100

PI T

ota

l

Figura 4

Irradiation (%) Irradiation (%)

A B

C D

72

y = -0,0456x2 + 7,3217x - 169,98

R2 = 0,9755

40

60

80

100

120

140

30 40 50 60 70 80 90 100

To

tal so

lub

le s

ug

ars

(m

g g

-¹ M

S)

y = -0,0035x2 + 0,5601x - 10,978

R2 = 0,9022

5

7

9

11

13

30 40 50 60 70 80 90 100

Fru

cto

se

(m

g g

-¹ M

S)

y = -0,007x2 + 1,1074x - 12,815

R2 = 0,8953

16

21

26

31

36

30 40 50 60 70 80 90 100

Su

cro

se

(m

g g

-¹ M

S)

y = -0,0001x2 + 0,0227x + 0,9881

R2 = 0,9271

1,5

1,7

1,9

2,1

30 40 50 60 70 80 90 100

Glu

co

se

(m

g g

-¹ M

S)

Figura 5

Irradiation (%) Irradiation (%)

A B

C D

73

Figura 6

A B C D

E F

G

H

VD

CZ

CZ

CZ CZ

CZ

CZ

SF SF SF

XF XF

PE PE

SX SX

SX

SX

E

E

FF

FF

PE

74

4.2 ARTIGO II

Relação dos pigmentos fotossintetizantes com a atividade de enzimas do

estresse oxidativo em plantas de Cariniana estrellensis e C. legalis sob

intensa irradiância

RESUMO

Foram estudadas as características fisiológicas e bioquímicas relacionados ao estresse

oxidativo em C. estrellensis e C. legalis, em duas condições de luminosidade. Plantas com 14

meses de idade foram submetidas a dois tratamentos: 30% e 100% de irradiância (sombra e

sol, respectivamente), durante 30 dias. Ao final desse período foram feitas análises do

conteúdo foliar de pigmentos fotossintéticos e aos 4, 16 e 30 dias foram feitas análises da

atividade das enzimas antioxidantes, catalase (CAT) e peroxidase do ascorbato (APX). As

folhas de sol apresentaram menor concentração de clorofila a, clorofila b e carotenóides, além

de maior razão clorofila a/b e menor razão clorofila a/carotenóides. A atividade da CAT

variou apenas em C. estrellensis e em função do tempo de exposição solar, apresentando uma

queda aos 16 dias. A atividade da APX, porém, não variou nem em função da espécie, nem do

tempo, nem das condições de irradiância. As análises do estresse oxidativo indicaram que C.

estrellensis e C. legalis comportaram-se como espécies intermediárias no processo de

sucessão florestal, no entanto, C. estrellensis mostrou-se mais suscetível a fotoinibição em

condições de alta irradiância.

Palavras-chave: catalase, clorofila, peroxidase do ascorbato.

75

Relationship of photosynthetic pigments with the activity of oxidative stress

enzymes in C. estrellensis and C. legalis plants under intense irradiance

ABSTRACT

Were studied physiological and biochemical characteristics relative to the oxidative stress in

C. estrellensis e C. legalis, in two luminosity conditions. Plants with 14 months old were

submitted to two treatments: 30% and 100% of irradiance (shade and sun, respectively),

during 30 days. At the end of this period were made analysis of the content of leaf

photosynthetic pigments and in 4, 16 and 30 days were made analysis of antioxidative

enzymes activity, catalase (CAT) and ascorbato peroxidase (APX). The sun leaves showed

lowest content of chlorophyll a, chlorophyll b and carotenoids, besides higher chlorophyll a/b

ratio and lowest chlorophyll a/carotenoids ratio. The CAT activity varied only in C.

estrellensis in function of the time of solar exposition, showing a decline at 16 days. APX

activity, however, did not varied neither due to species, or time, or irradiance. The analysis of

oxidative stress indicated that C. estrellensis and C. legalis behaved as intermediate species in

the process of forest succession, although, C. estrellensis proved to be a little more

susceptible to photoinhibition in high irradiance conditions.

Key words: catalase, chlorophyll, ascorbate peroxidase.

76

1. INTRODUÇÃO

Nas florestas tropicais, a intensidade de luz influencia as estratégias adaptativas dos

indivíduos pertencentes aos diferentes grupos ecológicos. As espécies pioneiras, por se

desenvolverem sob maior luminosidade, normalmente apresentam maior plasticidade em

função da irradiância (BAZZAZ e PICKETT 1980). Em contrapartida, as espécies

intermediárias iniciais ou tardias são mais suscetíveis à fotodanos e comumente não toleram

exposições prolongadas a intensa radiação (DIAS e MARENCO, 2006).

As arbóreas possuem uma variedade de mecanismos que visam manter a

funcionalidade do aparato fotossintético, através da regulação da utilização dos feixes

luminosos (FRANCO et al., 2007). Os teores de clorofila foliar e de carotenóides podem

variar significativamente em função das condições de irradiância (CARVALHO et al., 2006;

BOEGER et al., 2009), uma vez que, enquanto as moléculas de clorofila controlam as taxas

fotossintéticas através da absorção de energia luminosa, os carotenóides são capazes de

dissipar o excesso de energia (BOARDMAN, 1977; DEMMIG-ADAMS et al., 1996).

O desempenho fotossintético das plantas está, também, associado à eficiência do

controle do estresse oxidativo. Um dos produtos dessa via metabólica são as espécies reativas

de oxigênio (ERO), que são formas reduzidas do oxigênio molecular capazes de promover

danos celulares oxidativos (GILL e TUTEJA, 2010). Sob condições adequadas de

desenvolvimento, a produção destas moléculas é baixa e elas são continuamente removidas do

espaço celular (HIDEG et al., 2002; MITTLER, 2002).

No entanto, sob elevada irradiância a produção das ERO pode se intensificar como

resultado do estresse oxidativo (GILL e TUTEJA, 2010). As plantas desenvolveram, então,

um sistema complexo de destruição das ERO, que envolve agentes antioxidantes não

enzimáticos e enzimáticos (ROVER JÚNIOR et al., 2001). Dentre os agentes enzimáticos, a

catalase atua nos peroxissomos, convertendo rapidamente H2O2 em água e oxigênio

molecular, enquanto a peroxidase do ascorbato atua nos cloroplastos, convertendo o peróxido

de hidrogênio em água (NOCTOR e FOYER, 1998).

A interação da intensidade de irradiância com as proporções dos pigmentos

fotossintetizantes e do metabolismo do estresse oxidativo, pode ser bastante útil na

classificação ecológica das espécies florestais em suas diferentes categorias sucessionais

(FAVARETTO et al., 2011). Sendo assim, plantas de sol (pioneiras) ou de sombra

(intermediárias) podem ser identificadas mediante análise das relações de clorofila a e b e dos

produtos do estresse oxidativo (SOUZA e VÁLIO, 2003).

77

No entanto, nem sempre os ajustes fisiológicos estão diretamente relacionados ao

status sucessional das espécies (ROZENDAAL et al. 2006). Apesar de muitas pesquisas

evidenciarem que as pioneiras apresentam maior potencial de aclimatação sob alta irradiância

(BAZZAZ E PICKETT, 1980; VALLADARES et al., 2000b), já foi relatado que espécies

sucessionais tardias também podem sofrer alterações morfofisiológicas que as permitam

sobreviver em diferentes gradientes de luz (CORRÊA, 2003; LIMA et al., 2010).

A ausência de padrões de respostas bem definidas pode ser atribuída à falta de um

amplo conhecimento da ecofisiologia das espécies escolhidas para as análises morfológicas,

fisiológicas e bioquímicas. Para algumas arbóreas tropicais brasileiras, os padrões de

crescimento são contraditórios à sua classificação sucessional proposta na literatura baseada

em observações em campo (CUZZUOL e MILANEZ, 2011). Dentre essas espécies, aparecem

C. estrellensis e C. legalis, conhecidas como jequitibá-branco e jequitibá-rosa,

respectivamente, que são comumente empregadas em programas de recuperação de áreas

degradas (LORENZI, 2002; SILVA et al., 2003). Segundo a literatura, ambas são

classificadas como espécies intermediárias tardias no processo de sucessão florestal

apresentando melhor desempenho em sombreamento (CARVALHO, 2003; 2005).

O presente estudo buscou relacionar os padrões do estresse oxidativo de C. estrellensis

e C. legalis com os padrões do estresse oxidativo das espécies pioneiras e intermediárias da

sucessão florestal. Com isso, pretendeu-se certificar a classificação sucessional de ambas as

espécies e verificar se as concentrações de pigmentos fotossintetizantes e a atividade de

enzimas antioxidantes poderiam ser utilizadas como importantes e confiáveis caracterizadores

das espécies nas diferentes categorias sucessionais.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Material vegetal e instalação do experimento

Plantas de jequitibá-branco (Cariniana estrellensis (Raddi.) Kuntze) - fornecidas pela

reserva florestal da empresa Vale do Rio Doce, localizada no município de Linhares (ES)

(19º06’-19º18’S e 39º45’-40º19’W) - e plantas de jequitibá-rosa (Cariniana legalis (Mart.)

Kuntze - adquiridas no viveiro Fazenda Terra Nova, Domingos Martins (ES) (20º19’35”S e

40º48’53”W) - com aproximadamente 14 meses de idade, foram envasadas em recipientes de

polietileno com capacidade de 8 litros, contendo como substrato mistura de terra vegetal, areia

e argila (1:1:1) sem adubação. As plantas, que já estavam em processo de aclimatação por

aproximadamente 5 meses, foram mantidas em casa de vegetação, na Universidade Federal do

78

Espírito Santo, Vitória (20º18’52’’S e 40º19’06’’W), por 20 dias, sendo acondicionadas em

sombreamento artificial de 90%, temperatura e fotoperíodo naturais. Após este período, as

plantas de ambas as espécies foram submetidas a duas diferentes condições de luminosidade:

30% e 100% de irradiância (sombra e sol, respectivamente) e foram regadas de forma a evitar

a ocorrência restrição hídrica.

2.2 Quantificação de pigmentos fotossintéticos

Os teores de clorofila total, clorofila a, clorofila b, carotenóides e as razões clorofila

a/b e clorofila a/carotenóides foram determinados após extração com acetona 80% (v/v),

segundo Arnon (1949). As leituras da densidade ótica foram feitas em espectrofotômetro

(Genesys 10S UV-Vis, Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA) a 480, 645 e 663 nm. As

determinações das concentrações de clorofila e carotenóides foram realizadas aplicando-se as

equações de Hendry & Price (1993).

2.3 Determinação da atividade de enzimas antioxidantes

2.3.1 Obtenção do extrato enzimático bruto: os extratos enzimáticos brutos para

determinação das atividades da catalase (CAT, EC 1.11.1.6) e da peroxidase do ascorbato

(APX, EC 1.11.1.11) foram obtidos pela homogeneização de 0,2 g de massa fresca de folhas

em nitrogênio líquido, seguida de adição de 1,5 mL de meio de extração e de centrifugação a

13000g, por 12 min, a temperatura de 4ºC (PEIXOTO et al, 1999). O sobrenadante obtido foi

utilizado como extrato bruto na determinação das atividades enzimáticas e na quantificação de

proteínas totais. Todas as etapas necessárias ao processo de extração foram executadas na

temperatura de 4ºC.

O meio de extração para catalase e peroxidase do ascorbato foi: 750 µl de tampão

fosfato de potássio 200 mM (pH 9,0); 15 µl de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 10

mM; polivinilpirrolidona (PVPP) 1% (p/v); 150 µl de ácido ascórbico 100 mM e 585 µl de

água ultrapura.

2.3.2 Determinação da atividade da CAT: a atividade da catalase foi determinada pela

adição de 25 µl do extrato enzimático bruto e 200 µl de H2O2 250 mM, a 3,775 mL de meio

de reação constituído de 2 mL de tampão fosfato de potássio 200 mM (pH 9,0) e 1,775 mL de

água ultrapura, previamente incubado a 28ºC, por no mínimo 10 minuto (HAVIR e McHALE,

1989). As leituras de absorbância das amostras foram feitas a cada 15 segundos, durante um

período de 1,5 minutos, em espectrofotômetro (Genesys 10S UV-Vis, Thermo Fisher

Scientific, Waltham, EUA), a 240 nm. A atividade enzimática foi expressa em µmol

79

H2O2.min-1.mg

-1 proteína e o coeficiente de extinção molar H2O2 considerado foi de 36 mM

-1

cm-1

(NAKANO & ASADA, 1981).

2.3.3 Determinação da atividade da APX: a atividade da peroxidase do ascorbato foi

determinada pela adição de 50 µl do extrato enzimático bruto e 200 µl de H2O2 2 mM, a 3,750

mL de meio de reação constituído de 2 mL de tampão fostato de potássio 200 mM (pH 9,0),

1,550 mL de água ultrapura e 200 µl de ácido ascórbico 10 mM, previamente incubados a

28ºC, por no mínimo 10 minutos (NAKANO e ASADA, 1981, modificado por KOSHIBA,

1993). As leituras de absorbância das amostras foram feitas a cada 15 segundos, durante um

período de 1,5 minutos, em espectrofotômetro (Genesys 10S UV-Vis, Thermo Fisher

Scientific, Waltham, EUA), a 290 nm. A atividade enzimática foi expressa em µmol

H2O2.min-1.mg

-1 proteína e o coeficiente de extinção molar H2O2 considerado foi de 2,8 mM

-1

cm-1

(NAKANO & ASADA, 1981).

2.3.4 Determinação de proteínas totais: o conteúdo protéico do extrato bruto foi

determinado pelo método fotocolorimétrico de acordo com Bradford (1976), utilizando-se

como padrão, soro albumina bovina (1 mg mL-1

).

2.4 Análise estatística

O experimento teve duração de 30 dias e foi estabelecido em delineamento

inteiramente casualizado (DIC), com 6 plantas por tratamento. Os dados foram submetidos à

regressão polinomial e as médias foram comparadas pelas barras do erro padrão.

3. RESULTADOS

Quantificação de pigmentos fotossintéticos: em ambas as espécies, as folhas de sol

apresentaram menor concentração foliar de clorofila a (Chl a), clorofila b (Chl b), clorofila

total (Chlt), carotenóides (Carot), além de maior razão entre Chl a/b e menor razão Chlt/Carot

(Figura 1). Em relação ao comportamento das espécies observou-se que as concentrações

foliares de pigmentos fotossintéticos foram maiores em C. estrellensis, em ambos os

tratamentos (Figura 1A–D). No entanto, a razão Chl a/b não variou entre as espécies e a razão

Chlt/Carot variou apenas no sombreamento, sendo também maior em C. estrellensis.

Determinação da atividade de enzimas antioxidantes: a atividade da CAT variou

apenas em função do tempo e da espécie, não apresentando alteração em função das

condições de sol ou sombra. Dos 4 aos 16 dias, houve uma queda na atividade da CAT em C.

estrellensis, que se permaneceu baixa até os 30 dias. De maneira oposta, em C. legalis houve

um aumento na atividade dessa enzima dos 16 aos 30 dias, tanto nas folhas de sol, como nas

80

folhas de sombra (Figura 2A). Já a atividade da APX não apresentou variações em função do

tempo, da espécie ou da condição de irradiância (Figura 2B).

4. DISCUSSÃO

As condições contrastantes de irradiância promoveram diferentes respostas em ambas

as espécies estudadas. Comumente é observado na literatura que arbóreas nativas tendem a

apresentar variações do conteúdo de pigmentos fotossintético, em função da intensidade

luminosa. Sendo assim, as maiores concentrações de Chl a, Chl b e Chlt encontradas nas

folhas de sombra de C. estrellensis e de C. legalis estão de acordo com os resultados obtidos

em outros estudos ecofosiológicos (MENGARDA et al., 2009; FAVARETTO et al., 2011;

NERY et al., 2011) e também corroboram com o que foi verificado por Rego e Possamai

(2006), que estudando o comportamento de C. legalis em diferentes intensidades de luz,

observaram que em maior sombreamento as folhas apresentaram maiores teores de clorofila.

Segundo Laisk et al. (2005), a redução no teor de clorofila em condições de

luminosidade intensa previne a absorção de energia luminosa em excesso, que pode provocar

danos ao aparato fotossintético. Henry e Aarssen (1997) afirmam, ainda, que maiores

concentrações de clorofila em condições de luminosidade mais baixa, aumentam a capacidade

de absorção de luz, otimizando as taxas fotossintéticas. Além disso, a maior proporção de Chl

b encontrada em muitas espécies tropicais permite maior absorção de luz em comprimentos de

onda não absorvidos pela clorofila Chl a (BOARDMAN, 1977). Dessa forma, a maior razão

Chl a/b encontrada em folhas sob alta irradiância dá-se, principalmente, por redução nos

teores de Chl b, do que por aumento da concentração de Chl a, como foi observado em ambas

as espécies em estudo, em que a razão Chl a/b foi maior na sombra.

A concentração de carotenóides também é altamente responsiva às intensidades de luz.

Essas moléculas participam do processo fotossintético, tanto direcionando energia luminosa

para as clorofilas, quanto auxiliando na dissipação do excesso de luz (BARTLEY e

SCOLNIK, 1995; DEMMIG-ADAMS et al., 1996). Gonçalves et al. (2001) estudando a

composição de pigmentos em duas arbóreas observou que a concentração de carotenóides, por

unidade de massa, foi superior nas folhas de sol em Swietenia macrophylla e nas folhas de

sombra em Dipteryx odorata. De acordo com esses autores, tais resultados indicam que as

duas espécies possuem diferentes estratégias de adaptação às variações de irradiância. Sendo

assim, em S. macrophylla, o acúmulo de carotenóides constitui um importante mecanismo de

atenuação do estresse causado pela alta radiação, enquanto em D. odorata, devido à baixa

81

concentração de carotenóides nas folhas de sol, outros mecanismos atuariam mais

intensamente na prevenção do estresse luminoso. Esses resultados permitem sugerir que como

C. estrellensis e C. legalis apresentaram maior concentração de carotenóides na sombra, essas

moléculas estejam atuando mais evidentemente no aumento da captação de energia luminosa.

No entanto, como a razão Chlt/Carot foi menor em pleno sol deve-se, também, considerar a

participação dessas moléculas na prevenção ao estresse por excesso de irradiância.

Silvestrini et al. (2007), estudando o comportamento de uma espécie pioneira (Trema

micrantha) e uma clímax (Hymenaea courbaril), observaram que sob baixa irradiância, o

conteúdo de clorofilas e carotenóides foi maior na espécie clímax, provavelmente, devido à

necessidade de incrementar a capacidade de absorção de luz, em locais onde ela está menos

disponível. Em contraste, a espécie pioneira apresentou maior conteúdo de carotenóides no

sol, indicando que em ambas as arbóreas o pool de carotenóides atue de maneira diferente e

sugerindo que na pioneira essas moléculas estejam mais relacionadas à fotoproteção.

Levando-se em consideração esses resultados pode-se sugerir que apesar de ambas as

espécies desse estudo terem apresentado maior concentração de clorofila e carotenóides na

sombra, o fato de C. estrellensis ter apresentado maior concentração de pigmentos, em relação

a C. legalis, nas duas condições de luminosidade, pode indicar que em condições mais

intensas de sombreamento ela seria capaz de apresentar melhor crescimento, em função da

maior capacidade de absorção de luz, enquanto que, em condições de alta irradiância, ela

estaria mais suscetível a fotoinibição. Comparando-se as folhas de sol e de sombra de ambas

as espécies observa-se que em C. estrellensis os efeitos da alta irradiância foram mais intensos

devido ao amarelecimento mais evidente nas folhas de sol (Figura 3).

De acordo com os estudos de Favaretto et al. (2011), o decréscimo da razão Chlt/Carot

nas espécies pioneiras, em alta radiação, ocorre tanto por diminuição no conteúdo de clorofila

total, quanto por aumento na concentração de carotenóides. No entanto, nesse estudo, a menor

razão Chlt/Carot encontrada nas folhas de sol de ambas as espécie deu-se tanto por redução no

conteúdo de clorofila total, quanto no conteúdo de carotenóides, o que sugere que C.

estrellensis e C. legalis sejam espécies intermediárias na sucessão florestal.

As conseqüências da alta irradiância podem, também, ser avaliadas através da

produção das enzimas antioxidantes. Para tolerarem exposições a níveis elevados de luz e

reduzirem os efeitos de toxicidade promovidos pelo aumento da intensidade luminosa, em

alguns casos as plantas são capazes de elevar a produção de enzimas do estresse oxidativo,

como a catalase e a peroxidase do ascorbato (MITTLER, 2002; ASADA, 2006).

82

A aclimatação das plantas às condições de alta irradiância envolve a otimização da

capacidade fotossintética e, portanto, a prevenção aos efeitos oxidativos das ERO

(WALTERS, 2005). Assim, poderia-se prever que, como as espécies sucessionais tardias

então mais sujeitas aos efeitos de fotodano por necessitarem de menor quantidade de energia

luminosa para as reações fotoquímicas, a produção de enzimas antioxidantes deveria ser mais

evidente nessas espécies, em relação as pioneiras (HANSEN et al., 2002). No entanto, estudos

relacionados à prevenção ao estresse oxidativo em espécies de diferentes grupos na sucessão

florestal revelam que nas pioneiras o potencial antioxidativo é maior do que nas sucessionais

tardias confirmando que as pioneiras são, de fato, mais tolerantes a níveis elevados de luz e,

portanto, menos suscetíveis aos fotodanos (GUO et al. 2004; FAVARETTO et al. 2011).

No presente estudo, a atividade da CAT variou de acordo com a espécie e com o

período de análise. Dos 4 aos 16 dias, a queda na atividade dessa enzima, em C. estrellensis,

que se manteve baixa até os 30 dias, pode ser explicada pelo maior tempo de sua exposição

solar. Segundo Hertwig et al. (1992) e Peltzer et al. (2002), a atividade da CAT é altamente

responsiva às condições de luminosidade e de temperatura, devido à sua alta sensibilidade à

luz e, portanto, suscetibilidade à fotoinativação. Assim como observado em C. estrellensis, a

queda na atividade da CAT, em função da irradiância, já foi anteriormente relatada por vários

autores (BURRIT e MACKENZIE 2003; MARCHESE et al. 2008; FAVARETTO et al.

2011).

De maneira oposta, em C. legalis, foi verificado um aumento na atividade da CAT,

dos 16 aos 30 dias. Segundo Feierabend et al. (1992), a fotoinativação da catalase geralmente

ocorre em paralelo à fotoinibição e, portanto, a sua inativação pode ser mediada por eventos

fotooxidativos iniciados com a absorção de luz pela clorofila. Dessa forma, a queda na

atividade da CAT, em C. estrellensis, sugere que essa espécie seja mais suscetível à

fotoinibibição, enquanto que, o aumento na atividade dessa enzima, em C. legalis, indica

maior tolerância dessa espécie à alta irradiância.

Em contrapartida, a redução na atividade da catalase em C. estrelensis, poderia não

sugerir que essa espécie seja mais suscetível à fotoinibibição, e sim, que ela apresente outros

mecanismos de defesa, enzimáticos ou não enzimáticos, contra o estresse oxidativo. Segundo

Favaretto et al. (2011) é comum observar, por exemplo, um aumento acentuado na atividade

da enzima superóxido dismutase em arbóreas pioneiras, em relação à arbóreas intermediárias,

sob alta intensidade de radiação solar. No entanto, neste estudo, a maior concentração foliar

de pigmentos fotossintetizantes em C. estrellensis – que contribui para maior absorção de

energia luminosa - a provável função dos carotenóides, nessa espécie, mais voltada para a

83

absorção de luz, do que para dissipação do excesso de energia, além do amarelecimento

precoce das folhas, corroboram com a sugestão de que C. estrellensis seja, de fato, mais

suscetível a fotoinição do que C. legalis. Assim, os efeitos do excesso de luz nessa arbórea

são provocados por radiações solares ainda não estressantes para C. legalis.

Pesquisas indicam que o aumento na atividade de enzimas antioxidantes, como a CAT,

ocorre concomitantemente ao aumento da APX, uma vez que o combate ao estresse oxidativo

ocorreria de maneira integrada (YANG et al. 2008). No entanto, nesse estudo, a queda e o

aumento na atividade da CAT não foram acompanhados por alterações na atividade da APX,

visto que a atividade dessa enzima não variou em função da luz, da espécie ou do período de

análise. Esses resultados estão de acordo com os de Chaves et al. (2008), que estudando a

variação sazonal associada às condições de sol e sombra, observaram que apenas as estações

do ano foram responsáveis pelas alterações na atividade da APX, em folhas de Coffea

arabica. Da mesma forma, Melgar et al. (2009), estudando os efeitos da salinidade e da

radiação solar sobre a bioquímica foliar de Olea europaea, observaram que a atividade da

APX foi afetada apenas pela salinidade.

Segundo Favaretto et al. (2011), que analisou os efeitos do estresse oxidativo em

arbóreas de diferentes grupos sucessionais, as espécies podem apresentar diferentes graus de

plasticidade fenotípica e, portanto, diferentes respostas às condições de luminosidade,

incluindo a produção das ERO. Isso se aplica à C. estrellensis e C. legalis, que apesar de

serem classificadas como espécies intermediárias, elas apresentaram variações na atividade

enzimática da CAT.

As análises da concentração de pigmentos foliares e da produção de enzimas

antioxidantes confirmam que C. estrellensis e C. legalis comportam-se como espécies

intermediárias na sucessão florestal. Além disso, baseado nas análises foliares fenotípicas, que

inferem maior susceptibilidade de C. estrellensis à fotoinibição em alta irradiância, pode-se

hipotetizar que C. legalis e C. estrellensis comportam-se como espécies intermediárias inicial

e tardia, respectivamente. Sendo assim, a concentração de pigmentos fotossintéticos associada

ao metabolismo do estresse oxidativo mostrou-se uma ferramenta capaz de elucidar o

comportamento de arbóreas tropicais na sucessão florestal, contribuindo para a definição mais

segura da categoria sucessional de arbóreas tropicais.

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS

84

Os resultados desse trabalho sugerem que C. legalis é uma arbórea com maior

tolerância à alta irradiância, em relação a C. estrellensis. Além disso, nesse estudo, também

foi verificada a importância da quantificação de pigmentos fotossintéticos, associada ao

metabolismo do estresse oxidativo, como uma ferramenta capaz de elucidar a tolerância das

espécies às condições de irradiância. Sendo assim, pesquisas envolvendo a aplicação dessa

ferramenta utilizando espécies de diferentes grupos ecológicos podem confirmar a sua

utilidade na classificação das arbóreas tropicais, assim como podem auxiliar na avaliação das

espécies tropicais úteis em projetos ambientais de reflorestamento.

REFERÊNCIAS

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89

FIGURAS

Figura 1: Concentrações de clorofila a (Chl a) (A), clorofila b (Chl b) (B), clorofila total

(Chlt) (C), carotenóides (Carot) (D) e relações entre clorofila a e b (Chl a/b) (E) e clorofila

total e carotenóides (Chlt/Carot) (F), em plantas de C. estrellensis e C. legalis submetidas a

30% e 100% de irradiância, aos 30 dias. As barras verticais representam o erro padrão da

média (n=6).

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

Sombra Sol Sombra Sol

Ch

l a (

mg

g-1

MF

)

C.estrellensis C.legalis

A

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Sombra Sol Sombra Sol

Ch

l b(m

g g

-1M

F)

C.estrellensis C.legalis

B

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

2,4

Sombra Sol Sombra Sol

Ch

lt (

mg

g-1

MF

)

C.estrellensis C.legalis

C

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Sombra Sol Sombra Sol

Ca

rot. (

mg

g-1

MF

)

C.estrellensis C.legalis

D

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Sombra Sol Sombra Sol

Ch

l a/ b

(m

g g

-1M

F)

C.estrellensis C.legalis

E

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

Sombra Sol Sombra Sol

Ch

lt / C

aro

t. (

mg

g-1

MF

)

C.estrellensis C.legalis

F

90

Figure 1: Chlorophyll a (Chl a) (A), chlorophyll b (Chl b) (B), total chlorophyll (Chlt) (D),

carotenoids (Carot) (D) concentrations and chlorophyll a and b (Chl a/b) (E) and total

chlorophyll and carotenois (F) ratios, in C. estrellensis and C. legalis plants submitted to

30% and 100% of irradiation, at 30 days. The vertical bars represent the standard error of

mean (n=6).

Figura 2: Atividade específica da catalase (CAT) (A) e da peroxidase do ascorbato (APX) (B),

em folhas de C. estrellensis e C. legalis, submetidas a 30% (SM) e 100% (SL) de irradiação

solar, aos 4, 16 e 30 dias. As barras verticais representam o erro padrão da média (n=5).

Figure 2: Specific activity of catalase (CAT) (A) and ascorbate peroxidase (APX) (B), in C.

estrellensis and C. legalis leaves, submitted to 30% (SM) and 100% (SL) of solar irradiation,

at 4, 16 and 30 days. The vertical bars represent the standard error of mean (n=5).

0,10

0,20

0,30

0,40

4 16 30

Ati

vid

ad

e A

PX

µm

ol H

2O

2 m

in-1

mg-1

pro

teín

a

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

4 16 30

Ati

vid

ad

e d

a C

AT

µm

ol H

2O

2 m

in-1

mg-1

pro

teín

a

C. estrellensis - SL

C. estrellensis - SM

C. legalis - SL

C. legalis - SM

A

B

Dias

91

Figura 3: Folhas de sombra e de sol de C. estrellensis (A) e C. legalis (B), submetidas a 30%

e 100% de irradiância, respectivamente, após 30 dias.

Figure 3: Shade and sun leaves of C. estrellensis (A) and C. legalis (B) submitted to 30% and

100% of irradiation, respectively, after 30 days.

A B

Sol Sombra Sol Sombra