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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONASINSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICAPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

ESTUDO FITOQUÍMICO DE Onychopetalum amazonicum

R.E. Fr. (Annonaceae)

BRUNA RIBEIRO DE LIMA

MANAUS2015






MANAUS2015






MANAUS2015

II



BRUNA RIBEIRO DE LIMA*

ESTUDO FITOQUÍMICO DE Onychopetalum amazonicumR.E. Fr. (Annonaceae)

Orientadora: Profª. Drª. Maria Lúcia Belém Pinheiro

Colaborador: MSc. Felipe Moura Araújo da Silva

*Bolsista CNPq

MANAUS2015

Dissertação apresentada aoPrograma de Pós-Graduação emQuímica da Universidade Federal doAmazonas, como requisito parcial paraobtenção do título de Mestre emQuímica, área de concentração QuímicaOrgânica.

II







*Bolsista CNPq

MANAUS2015


II







*Bolsista CNPq

MANAUS2015


V

Aos meus pais Francinete Ribeiro e

Raimundo Lima, pelo amor, incentivo e

apoio nas minhas escolhas e decisões ao

longo desses anos.

A eles eu dedico.

VI

AGRADECIMENTOS

A Deus, pelo dom da vida, por sempre ter me dado força e coragem para

enfrentar os desafios.

À minha família, em especial aos meus pais, Francinete Ribeiro e Raimundo

Lima, pela educação, carinho e amor durante todos esses anos. A distância que nos

separa só aumenta o amor que sinto por vocês. De uma forma especial agradeço aos

meus tios, Agostinho Nunes e Marinalva Raiol, por terem me acolhido em sua casa

durante a minha vida acadêmica na UFAM.

Ao meu namorado Thiago Kunast, por todo amor, paciência e acima de tudo

pelo grande apoio durante o mestrado.

Um agradecimento a Professora Dra. Maria Lúcia Belém Pinheiro pela

orientação, carinho, confiança e conhecimento transmitido durante esses dois anos.

Ao professor Dr. Afonso Duarte Leão de Souza por ter acreditado no meu

potencial e pela oportunidade de trabalhar no Laboratório de Espectrometria de Massas.

Ao colaborador desse trabalho MSc. Felipe Moura Araújo da Silva, pela

idealização desse projeto, por todo apoio e oportunidade de crescimento profissional.

Ao doutorando Raimundo Junior pelas análises de CG-EM e CG-DIC no

Centro de Biotecnologia da Amazônia.

Ao Dr. Marcos Salvador da Universidade Estadual de Campinas, pelas análises

biológicas dos óleos essenciais.

Ao Dr. Anderson Barison da Universidade Federal do Paraná, pelas análises de

Ressonância Magnética Nuclear.

Ao CNPq pelo apoio financeiro durante o período do mestrado.

Aos professores Maria da Paz Lima e Sérgio Nunomura pelas contribuições no

exame de conhecimento.

VII

À Central Analítica pelo espaço e apoio para realização desse trabalho.

Aos meus grandes amigos Richardson Almeida e Elzalina Soares pela amizade,

paciência e companheirismo, sempre com uma palavra amiga e me encorajando a seguir

em frente.

Aos meus amigos do Laboratório de Espectrometria de Massas pela

oportunidade de aprendizado e por proporcionarem um ótimo ambiente de trabalho.

Aos amigos que conquistei durante a minha carreira acadêmica, em especial

Paula Paz, Noam Gadelha, Magaly Martins, Adriana Cavalcante, Adriana Spirotto,

Francinaldo Araújo, Orlando Amazonas, Jésika Maria, Renan Feitosa, Sidney Azevedo,

Fabiana Almeida, Mayane Pereira, Fátima Almeida e Daniele Alencar.

Por fim agradeço a todos que contribuíram direta e indiretamente para realização deste

trabalho.

VIII

“Que minha coragem seja maior

que meu medo e minha força seja

tão grande quanto minha fé.”

(Marisa Pereira)

IX

RESUMO

O gênero Onychopetalum (Annonaceae) tem sua distribuição na Região

Amazônica sendo constituído por duas espécies: Onychopetalum amazonicum (R.E. Fr)

e Onychopetalum periquino (Rusby). O presente trabalho descreve o estudo fitoquímico

desta espécie. O material vegetal (folhas, galhos e cascas), coletado na Reserva Florestal

Adolpho Ducke (RFAD), foi submetido à hidrodestilação para obtenção de óleos

essenciais e tratamento ácido-base para obtenção de frações alcaloídicas. A análise de

CG-EM dos óleos essenciais possibilitou identificar 41 constituintes, destacando-se

como os majoritários nas folhas, o (E) cariofileno (17,0%), enquanto nas cascas e

galhos observou-se (epi)-α-cadinol (24,1 e 14,0 %, respectivamente). A análise do perfil

espectrométrico por APCI-IT-MSn em escala analítica possibilitou escolher a fração

alcaloídica das folhas para isolamento de alcaloides ainda não descritos no gênero

Onychopetalum. A análise por CLAE, em escala preparativa, da fração alcaloídica das

folhas de O. amazonicum, levou ao isolamento dos alcaloides nornuciferina, anonaína,

asimilobina e O-metilisopilina (aporfínicos); isocoripalmina e estefolidina

(tetraidroprotoberberínicos) e norjuzifina (benziltetraidroisoquinolínico), cujas

estruturas foram caracterizadas por técnicas de EM e RMN (1D e 2D), aliadas à

comparação com dados da literatura. Estes alcaloides são relatados pela primeira vez no

gênero Onychopetalumm. Adicionalmente, ensaios antimicrobianos realizados pela

primeira vez nos óleos essenciais revelaram atividade moderada para o óleo essencial

das cascas o qual inibiu o crescimento das bactérias Staphylococcus epidermidis,

Escherichia coli e Kocuria rhizophila,observando-se para as três linhagens, CIM =

62,5.

Palavras-Chave: Annonaceae, Onychopetalum amazonicum, alcaloides, óleos

essenciais.

X

ABSTRACT

The Onychopetalum genus (Annonaceae) has restricted distribution to the

Amazon region, being constituted of two species: Onychopetalum amazonicum (RE Fr.)

and Onychopetalum periquino (Rusby). The present work describes the phytochemical

study of this species. The plant material (leaves, twigs and bark), collected in the

Adolpho Ducke Forest Reserve (RFAD), from previously marked individual was

submitted to hydrodistillation to obtain essential oils and acid-base treatment to obtain

alkaloid fractions. The GC-MS analysis of the essential oils enabled the identification of

41 constituents, highlighting as majority in the leaves, the (E) caryophyllene (17.0%),

while in the bark and twigs was observed (epi)-α-cadinol (24.1 and 14.0%,

respectively). The analysis of the spectrometric profile for APCI-IT-MSn of the

fractions obtained from analytical scale make possible choose the leaf alkaloidal

fraction for the isolation of alkaloids not yet described in Onychopetalum genus. The

analysis by HPLC, in preparative scale, of the leaf alkaloidal fraction of O.

amazonicum, led to the isolation of the alkaloids nornuciferine, anonaine, asimilobine

and O-methylisopiline (aporphine); isocorypalmine and stepholidine

(tetrahydrodroprotoberberíne) and norjuzifine (benzyl-tetrahydroisoquinolíne), whose

structures were characterized by MS and NMR (1D and 2D) techniques, together with

the comparison with literature data. This is the first report of these alkaloids in

Onychopetalum genus. In addition, antimicrobial tests performed for the first time with

the essential oils showed mild activity for the essential oil from the bark which inhibited

the growth of Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli and Kocuria rhizophila,

being observed a MIC =62,5 for the three strains.

Keywords: Annonaceae, Onychopetalum amazonicum, alkaloids, essential oil.

XI

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

δ ---------------------------------------------------------------------------Deslocamento químico.

APCI---------------------------------------------Atmospheric Pressure Chemical Ionization.

CG -------------------------------------------------------------------------Cromatografia Gasosa.

CIM-----------------------------------------------------------Concentração Inibitória Mínima.

CLAE-----------------------------------------------Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.

Da--------------------------------------------------------------------------------------------Dalton.

DAD-----------------------------------------------------------------------Diode Array Detector.

DCM--------------------------------------------------------------------------------Diclorometano.

DIC-------------------------------------------------------------Detector de Ionização de Chama.

EM ---------------------------------------------------------------------Espectrometria de Massa.

HMBC-----------------------------------------------Heteronuclear Multiple Bond Correlation.

HSQC---------------------------------------------Heteronuclear Single Quantum Coherence.

Hz----------------------------------------------------------------------------------------------Hertz.

IT--------------------------------------------------------------------------------------------Ion Trap.

J------------------------------------------------------------------------Constante de acoplamento.

LC-----------------------------------------------------------------------Liquid Chromatography.

m/z---------------------------------------------------------------------------Relação massa/carga.

OaF--------------------------------------------------------Onychopetalum amazonicum Folhas.

PFOa--------------------------------Precipitado das Folhas de Onychopetalum amazonicum.

RMN------------------------------------------------------------Ressonância Magnética Nuclear.

TFA--------------------------------------------------------------------------Trifluoroacetic Acid.

TSQ---------------------------------------------------------------------Triple Stage Quadrupolo.

XII

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Estruturas de fármacos obtidos de plantas medicinais.................................... 18Figura 2: Distribuição geográfica da família Annonaceae. ............................................ 19Figura 3: Espécies da família Annonaceae: (A) A. squamosa; (B) A. muricata; (C) X.Aromatica; (D) X. frutescens. ......................................................................................... 21Figura 4: Representação estrutural de acetogenina de anonáceas. ................................. 22Figura 5: Acetogeninas isoladas de espécies da família Annonaceae. ........................... 23Figura 6: Principais alcaloides e seus precursores. ........................................................ 24Figura 7: Exemplos de alcaloides encontrados em Annonaceae .................................... 25Figura 8: Estrutura básica de alcaloides aporfínicos. ..................................................... 25Figura 9: Rota biossintética dos alcaloides aporfínicos.................................................. 27Figura 10: Unidades de isopreno precursoras. ............................................................... 28Figura 11: Exemplos de terpenos encontrados em óleos essenciais na famíliaAnnonaceae. ................................................................................................................... 29Figura 12: Distribuição geográfica do gênero Onychopetalum...................................... 31Figura 13: Alcaloides aporfínicos e derivados encontrados no gênero Unonopsis. ....... 32Figura 14: Alcaloide onichina. ....................................................................................... 33Figura 15: Espécie de O. amazonicum coletada na Reserva Florestal Adolpho Ducke. 38Figura 16: Extração dos óleos essenciais de O. amazonicum em um aparelho tipoClevenger modificado..................................................................................................... 39Figura 17: Constituintes majoritários nos óleos essenciais das folhas de O. amazonicum......................................................................................................................................... 47Figura 18: Constituintes majoritários no óleo essencial das cascas de O. amazonicum. 48Figura 19: Constituintes majoritários no óleo essencial dos galhos de O. amazonicum.49Figura 20: Espectro de massas das frações alcaloidicas das folhas, cascas e galhos de O.amazonicum. ................................................................................................................... 52Figura 21: Espectro de íons totais (full scan) da fração alcaloídica das folhas em escalaanalítica de O. amazonicum............................................................................................ 52Figura 22: Espectro de massas em MS2 para os íons de m/z 328 e 342 ([M+H]+)......... 53Figura 23: Espectro de massas em MS2 do íon de m/z 330 ([M+H]+)............................ 54Figura 24: Proposta de fragmentação para alcaloides benziltetraidroisoquinolínicos. .. 54Figura 25: Espectro de massas em MSn íon de m/z 312 ([M+H]+)................................ 55Figura 26: Espectro de massas MSn do íon de m/z 298 ([M+H]+).................................. 56Figura 27: Estrutura do alcalóide estefarina. .................................................................. 56Figura 28: Espectro de massas em MSn do íon de m/z 282 ([M+H]+)............................ 57Figura 29: Estrutura do alcaloide nornuciferina. ............................................................ 57Figura 30: Espectro de massas em MSn do íon de m/z 266 ([M+H]+)............................ 58Figura 31: Estrutura do alcaloide Anonaína. .................................................................. 58Figura 32: Cromatogramas de LC-DAD (1) e LC-APCI-MS (2) da fração alcaloídicadas folhas em escala analítica. ........................................................................................ 59Figura 33: Espectro de massa da amostra OaF4............................................................. 61Figura 34: Espectro de MS2 para o íon m/z 328 [M+H]+ ............................................... 61Figura 35: Espectro de RMN 1H (600 MHZ, CD3OD) da amostra OaF4. ..................... 63Figura 36: Mapa de contorno HSQC (600 MHz, CD3OD) da amostra OaF4 ................ 65Figura 37: Mapa de contorno HMBC (600 MHz, CD3OD) da amostra OaF4............... 66Figura 38: Estrutura do alcaloide estefolidina................................................................ 67Figura 39: Principais correlações observadas para a amostra OaF4 .............................. 67Figura 40: Espectro de massa da amostra OaF8............................................................ 69

XIII

Figura 41: Espectro de MS2 para o íon m/z 342 [M+H]+ ............................................... 69Figura 42: Espectro de RMN 1H (600 MHz, CD3OD) da amostra OaF8....................... 71Figura 44: Mapa de contorno HSQC (600 MHz, CD3OD) da substância OaF8. ........... 72Figura 45: Mapa de contorno HMBC (600 MHz, CD3OD) da substância OaF8. .......... 73Figura 45: Estrutura do alcaloide isocoripalmina........................................................... 74Figura 46: Principais correlações observadas para amostra OaF8. ................................ 74Figura 47: Espectros de massas da amostra OaF9.......................................................... 76Figura 48: Espectro de MS2 para o íon m/z 286 [M+H]+ ............................................... 76Figura 49: Espectro de RMN de 1H (600 MHz, CD3COCD3) de OaF9......................... 78Figura 50: Mapa de contorno HSQC (600 MHz, CD3COCD3) da amostra OaF9. ........ 79Figura 51: Mapa de contorno HMBC (600 MHz, CD3COCD3) da amostra OaF9. ....... 80Figura 53: Estrutura do alcaloide norjuzifina. ................................................................ 81Figura 54: Principais correlações observadas para amostra OaF9. ................................ 82Figura 55: Espectro de massa da amostra OaF11........................................................... 83Figura 56: Espectro de MSn para o íon m/z 268 [M+H]+ ............................................... 84Figura 56: Espectro de RMN 1H (600 MHz, CD3COCD3) amostra OaF11................... 85Figura 58: Estrutura do alcaloide asimilobina................................................................ 86Figura 58: Espectro de massa da amostra OaF13........................................................... 87Figura 59: Espectro de MSn para o íon m/z 282 [M+H]+ ............................................... 88Figura 60: Espectro de RMN 1H (600 MHz, CDCl3) da amostra OaF13....................... 89Figura 61: Mapa de contorno HSQC (600 MHz, CDCl3) da amostra OaF13. ............... 90Figura 62: Mapa de contorno HMBC (600 MHz, CDCl3) da substância OaF13........... 91Figura 64: Estrutura do alcaloide nornucuferina. ........................................................... 92Figura 65: Principais correlações observadas para a amostra OaF13. ........................... 92Figura 65: Espectro de massa da amostra OaF15........................................................... 94Figura 66: Espectro de MSn para o íon m/z 266 [M+H]+ ............................................... 94Figura 68: Espectro de RMN 1H (600 MHz, CDCl3) da amostra OaF15....................... 96Figura 69: Mapa de contorno HSQC (600 MHz, CDCl3) da amostra OaF15. ............... 97Figura 70: Mapa de contorno HMBC (600 MHz, CDCl3) da amostra OaF15............... 98Figura 71: Estrutura do alcaloide anonaína. ................................................................... 99Figura 72: Principais correlações observadas para amostra OaF15. ............................ 100Figura 73: Espectro de massa da amostra OaF17......................................................... 101Figura 74: Espectro de MSn para o íon m/z 312[M+H]+ .............................................. 102Figura 75: Espectro de RMN 1H (600 MHz, CDCl3) da amostra OaF17..................... 103Figura 76: Mapa de contorno HMBC (600 MHz, CDCl3) da amostra OaF17............. 104Figura 77: Estrutura do alcaloide O-metilisopilina. ..................................................... 105Figura 78: Principais correlações observadas para amostra OaF17. ............................ 105Figura 78: Cromatograma de LC-DAD e LC-APCI-MS, para o PFOa. ...................... 107Figura 79: Espectro de íons totais do PFOa. ................................................................ 107Figura 80: Espectros de MS/MS dos íons de m/z 328 e 342. ....................................... 108

XIV

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Rendimentos dos óleos essenciais obtidos de O. amazonicum. ..................... 45Tabela 2: Constituintes dos óleos essenciais das folhas, cascas e galhos de O.amazonicum. ................................................................................................................... 45Tabela 3: Atividade antimicrobiana in vitro dos óleos essenciais de O. amazonicum comos respectivos valores de CIM (µg/mL-1)....................................................................... 51Tabela 4: Frações obtidas pela analise em CLAE em escala preparativa da folhas. ...... 60Tabela 5: Dados de RMN 1H, HSQC e HMBC da amostra OaF4 ................................. 68Tabela 6: Dados de RMN 1H, HSQC e HMBC da amostra OaF8. ................................ 75Tabela 7: Dados de RMN 1H, HSQC e HMBC da amostra OaF9. ................................ 82Tabela 8: Dados de RMN 1H da amostra OaF11............................................................ 86Tabela 9: Dados de RMN 1H, HSQC e HMBC da amostra OaF13 ............................... 93Tabela 10: Dados de RMN 1H, HSQC e HMBC da amostra OaF15. .......................... 100Tabela 11: Dados de RMN 1H, HSQC e HMBC da amostra OaF17. .......................... 106

XV

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1: Extração alcaloídica em escala analítica..................................................... 41Esquema 2: Extração de alcaloides em escala preparativa............................................. 42

XVI

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 17

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................ 19

2.1 A Família Annonaceae ........................................................................................... 192.1.1 Etnobotânica da Família Annonaceae ............................................................... 20

2.2 Fitoquímica da Família Annonaceae .................................................................... 212.2.1 Acetogeninas de Annonaceae............................................................................ 222.2.2 Alcaloides .......................................................................................................... 23

2.3 Óleos Essenciais de Annonaceae e atividade antimicrobiana............................. 27

2.4 O gênero Onychopetalum ....................................................................................... 31

2.5 A espécie Onychopetalum amazonicum. ................................................................ 33

3. OBJETIVOS ............................................................................................................. 34

3.1 Geral ........................................................................................................................ 34

3.2 Específicos ............................................................................................................... 34

4. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................... 35

4.1 Análises cromatográficas ....................................................................................... 354.1.2 Cromatografia líquida de alta eficiência analítica-CLAE ................................. 354.1.3 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ) preparativa.......................... 354.1.4 Cromatografia Gasosa ....................................................................................... 35

4.2 Solventes e reagentes reveladores ......................................................................... 364.2.1 Solventes............................................................................................................ 364.2.2 Reagentes reveladores ....................................................................................... 36

4.3 Métodos espectroscópicos/espectrométricos ........................................................ 36

4.4 Outros equipamentos ............................................................................................. 37

4.5 Coleta e identificação do material botânico ......................................................... 38

4.6 Obtenção dos óleos essenciais ................................................................................ 38

4.7 Análises por CG-DIC e CG-EM............................................................................ 39

4.8 Avaliação da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais. ............................. 40

4.9 Marcha química para obtenção de alcaloides. ..................................................... 41

XVII

4.10 Análises por APCI-IT-MSn e LC-DAD-APCI-MS das frações alcaloídicas deO. amazonicum obtidas em escala analítica................................................................ 43

4.11 Fracionamento por CLAE da fração alcaloídica das folhas em escalapreparativa. ................................................................................................................... 43

4.11.1 Análise de precipitado por APCI-IT-MS e LC-DAD-APCI-MS. ................... 44

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 45

5.1 Extração dos óleos essenciais de O. amazonicum. ................................................ 45

5.2 Identificação dos constituintes voláteis presentes no óleo essencial das folhas deO. amazonicum .............................................................................................................. 45

5.3 Identificação dos constituintes voláteis presentes no óleo essencial das cascas deO. amazonicum .............................................................................................................. 47

5.4 Identificação dos constituintes voláteis presentes no óleo essencial dos galhos deO.amazonicum. .............................................................................................................. 49

5.5 Atividade antimicrobiana dos óleos essenciais de O. amazonicum..................... 50

5.6 Análises por APCI-IT-MSn das frações alcaloídicas obtidas em escala analítica........................................................................................................................................ 51

5.6.1 Análise espectrométrica da fração alcaloídica das folhas, cascas e galhos de O.amazonicum. ............................................................................................................... 515.6.2 Análise espectrométrica da fração alcaloídica das folhas de O. amazonicum... 52

5.7 Resultado do fracionamento por CLAE da fração alcaloídica das folhas,realizado em escala preparativa.................................................................................. 59

5.8 Determinação estrutural das substâncias isoladas da fração alcaloídica dasfolhas obtidas em escala preparativa de O. amazonicum. ......................................... 61

5.8.1 Determinação estrutural da amostra OaF4 ........................................................ 615.8.2 Determinação estrutural da amostra OaF8 ........................................................ 695.8.3 Determinação estrutural da amostra OaF9 ........................................................ 765.8.4 Determinação estrutural da amostra OaF11 ...................................................... 835.8.5 Determinação estrutural da amostra OaF13. ..................................................... 875.8.6 Determinação estrutural da amostra OaF15 ...................................................... 945.8.7 Determinação estrutural da amostra OaF17. ................................................... 101

5.9 Análise por LC-DAD-APCI-MS do precipitado................................................ 107

6. CONCLUSÕES....................................................................................................... 109

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 110

17

1. INTRODUÇÃO

Ao longo dos anos diversas plantas têm sido utilizadas pela humanidade para fins

medicinais, visando o tratamento das mais diversas doenças, sendo os princípios ativos

e seus modos de ação desconhecidos, na maioria dos casos (CRAGG & NEWMAN,

2013). A exploração adequada destes conhecimentos etnobotânicos, transmitidos com o

passar dos anos e o avanço das técnicas de abordagens fitoquímicas culminaram com a

descoberta de poderosos fármacos (YUNES & CECHINEL-FILHO, 2001). Como

exemplo, pode ser citado o uso medicinal por 4000 anos da espécie Papaver

somniferum L. (papoula do ópio), da qual foram isolados, no inicio do século XIX, os

alcaloides morfina e codeína, os quais são usados até hoje, respectivamente, como

analgésico e antitussígeno. As cascas de Cinchona sp, plantas medicinais sul-

americanas conhecidas desde o século XVII como febrífugas, forneceram,

posteriormente, o alcaloide antimalárico quinina, cuja estrutura inspirou uma série de

medicamentos usados há algumas décadas para combater a malária (Figura 1)

(VIEGAS-JR et al., 2006; HOSTETTMANN et al., 2003; DEWICK, 2009).

Estima-se que na Região Amazônica existam pelo menos 80.000 espécies vegetais,

muitas das quais são comercializadas como plantas medicinais, demonstrando a

importância que esta floresta possui como maior reservatório natural da diversidade

vegetal do planeta (FONSECA, 2005; MACIEL et al., 2002 ). Em meio a esta grande

diversidade, várias espécies pertencentes à família Annonaceae destacam-se por serem

empregadas na medicina popular. Suas propriedades farmacológicas vêm sendo

confirmadas cientificamente e atribuídas à presença de compostos bioativos, como

alcaloides, acetogeninas de anonáceas entre outros (LEBOEUF et al., 1982a; COSTA et

al., 2013; ALALI et al., 1999). Apesar dos diversos estudos referentes ao isolamento de

18

compostos bioativos na família Annonaceae, ainda existem gêneros com pouco ou

nenhum estudo fitoquímico, como é o caso do gênero Onychopetalum, que até o

presente momento apresenta dois trabalhos na literatura (ALMEIDA et al., 1976;

SILVA et al., 2015a).

Figura 1: Estruturas de fármacos obtidos de plantas medicinais.

Visando contribuir para o conhecimento químico do gênero Onychopetalum, o

presente trabalho teve como objetivo, realizar o estudo fitoquímico dos óleos essenciais

e frações alcaloídicas das folhas, galhos e cascas de O. amazonicum. Em adição, o

potencial antimicrobiano dos óleos essenciais foi avaliado frente a diversas linhagens de

micro-organismos.

N

O

HO

H

HO

CH3 NCH3

H

H3CO

O

HO

N

H3CO

N

H

H

HO H

morfina codeína

quinina

19

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 A Família Annonaceae

Annonaceae é uma família que tem sua distribuição pantropical (Figura 2)

constituída atualmente por cerca de 109 gêneros e 2440 espécies (CHATROU et al.,

2012). No Brasil, registram-se 392 espécies (29 gêneros), com cerca 287 espécies

distribuídas Região Amazônica (MAAS et al., 2015).

Esta família pode ocorrer como árvores, arvoretas e lianas, sendo a maioria das

espécies plantas lenhosa. Suas folhas são alternadas, inteiras e dísticas. As flores podem

ser axilares ou não axilares, raramente terminais com seus frutos principalmente

apocárpicos. Nas cascas observa-se a presença de fibras longas e resistentes. Seus

troncos apresentam no corte transversal marcas de chamas e quando cortados exalam

um forte odor (RIBEIRO et al., 1999; MAAS et al., 2007a)

Figura 2: Distribuição geográfica da família Annonaceae.

Fonte: http://www.thecompositaehut.com/www_tch/images/webcurso_spv/mapas/annonaceae.jpg

20

2.1.1 Etnobotânica da Família Annonaceae

Além de fornecer frutos comestíveis tais como graviola (Annona muricata L.),

fruta-do-conde (Annona squamosa L.), cherimóia (Annona cherimola Mill.) e a atemoia

(híbrido de A. cherimola x A. squamosa) (Figura 3), algumas espécies desta família, são

utilizadas na medicina popular com diversas finalidades (PBMH, 2013; DI STASI &

HIRUMA-LIMA, 2002). O chá das cascas da espécie Rollinia leptopetala R. E. Fries

(recentemente incorporada ao gênero Annona) tem sido usado popularmente como

digestivo e para tratar tumores (AGRA et al., 2007). As folhas de algumas espécies do

gênero Unonopsis são utilizadas por povos indígenas na Amazônia para o tratamento de

demência e dificuldades na fala (ADAMS et al., 2007a).

A espécie Annona squamosa é considerada em algumas comunidades da Índia

uma fruta sagrada, devido a resultados significativos da sua utilização para tratamento

contra a diabetes (GAJALAKSHMI et al., 2011). As sementes de Xylopia frutescens

Aubl. (Figura 3) (conhecida popularmente como embira) são empregadas como

estimulantes para bexiga e no combate a doenças intestinais (AGRA et al., 2007). O chá

das folhas da espécie Xylopia aromatica (Lam.) (Figura 3) tem sido usado por índios da

Região Amazônica como diurético e para tratamento de edemas na pele (DI STASI &

HIRUMA-LIMA, 2002).

21

Figura 3: Espécies da família Annonaceae: (A) A. squamosa; (B) A. muricata; (C) X.Aromatica; (D) X. frutescens.

Fontes:http://biogeodb.stri.si.edu/bioinformatics/dfm/metas/view/18154;http://www.botanicalgarden.ubc.ca/potd/2007/04/annona_muricata.php;http://fest2012.greennation.com.br/pt/obra/297/Evando-Ferreira-Lopes/Pimenta-de-macaco-Xylopia-aromatica.

2.2 Fitoquímica da Família Annonaceae

A família Annonaceae é rica em muitas classes de metabolitos secundários,

sendo os alcaloides derivados do esqueleto isoquinolínico os constituintes mais

recorrentes (LEBOEUF et al., 1982a).

Dentre os constituintes não alcaloídicos, são encontrados compostos aromáticos,

acetogeninas de anonáceas, terpenoides, entre outros (ALALI et al., 1999;

ANKISETTY et al., 2006; ALITONOU et al., 2013). Na classe dos terpenoides,

destacam-se os monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, triterpenos e esteróides,

sendo o triterpeno policarpol considerado um marcador taxonômico da família

(TAVARES et al., 2006; PALAZZO et al., 2009; SILVA et al., 2015a). Também são

22

marcadores na família as acetogeninas de anonáceas, classe de produtos naturais isolada

exclusivamente das espécies de Annonaceae (RUPPRECHT et al., 1990).

2.2.1 Acetogeninas de Annonaceae

As acetogeninas de anonáceas são identificadas como derivados de ácidos

graxos de cadeia alifática, contendo em sua estrutura 35 a 37 átomos de carbono. São

caracterizadas por possuírem uma γ-lactona terminal, contendo de 1 a 3 anéis

tetrahidrofurano (THF) e diversas funções oxigenadas ao longo da cadeia (Figura 4).

Existem também acetogeninas que ao invés de apresentar anel THF, apresentam anel

tetrahidropirânico (THP). (ALALI et al., 1999; LI et al., 2008; KOJIMA & TANAKA,

2009). Estes compostos são conhecidos por exibirem uma ampla atividade biológica tais

como: anticâncer, antiparasitário, inseticida e efeitos imunossupressores (LIAW et al.,

2010).

Figura 4: Representação estrutural de acetogenina de anonáceas.

Em estudos realizados por Sun e colaboradores (2014) com o fruto da espécie

Annona muricata, foram isoladas três acetogeninas, que apresentaram significativas

atividades inibidoras contra células cancerosas da próstata. A acetogenina esquamocina,

isolada da espécie Annona squamosa, apresentou potencial controle contra Aedes

aegypti (Figura 5) (COSTA et al., 2014). Das sementes de Annona cornifolia, foi

isolada a acetogenina cornifolina, sendo esta ativa contra linhagens tumorais,

principalmente sobre glioma de ratos (Figura 5)(LIMA et al., 2012).

nOR´

OH

R

OH OH

O

CH3

O

23

Figura 5: Acetogeninas isoladas de espécies da família Annonaceae.

2.2.2 Alcaloides

Os alcaloides são compostos nitrogenados de baixo peso molecular amplamente

distribuído no reino vegetal, especialmente entre as angiospermas. Estes metabólitos

secundários são conhecidos por possuírem uma basicidade típica, no entanto, o nível de

basicidade varia bastante, dependendo da estrutura da molécula e da presença de outros

grupos funcionais. São classificados de acordo com a natureza do átomo de nitrogênio

contido em sua estrutura e pela sua rota biossintética. Dentre os aminoácidos envolvidos

na biossíntese dos alcaloides os principais são: L-ornitina, L-lisina, L-tirosina e o L-

triptofano, estes são respectivamente precursores de alcaloides do tipo tropânicos,

piperidínicos, isoquinolínicos, indólicos (Figura 6), entre outros (DEWICK, 2009).

O

O O (CH2)9(CH2)4CH3

OHOH OH

O

CH3H

H HH

O

(CH2)3

O

(CH2)10

OHOH

OO(CH2)6

OH

esquamocina

cornifolina

24

Figura 6: Principais alcaloides e seus precursores.

Como descrito anteriormente, alcaloides derivados do esqueleto isoquinolínicos

são recorrentes nesta família (LEBOEUF et al., 1982a). Na figura 7 estão reportados

alguns exemplos destes alcaloides. Das folhas de Annona sericea foram isolados

alcaloides dos tipos aporfínicos (nornuciferina) e benziltetraidroisoquinolínico (3-hidro-

xinornuciferina) (CAMPOS et al., 2008). Alcaloides do tipo bisbenzilisoquinolínicos

tais como filogalina foram isolados das cascas de Guatteria boliviana (MAHIOU et al.,

2000). Estudos realizados por Granell e colaboradores (2004) com a espécie Xylopia

colombiana reportam o isolamento de alcaloides bisbenziltetraidroisoquinolínicos como

a medelina e antioquina. Os alcaloides palmatina e jatrorrhizina do tipo

NH2CO2H

NH2

MeN CO2Me

O

O

O

O

O

NNH2 CO2H

NH2

CO2H

NH2OH

NH

MeO

OH

MeO

OHH

NH

CO2H

NH2

NHMeO

N

CH3

L-Ornitina Tropânico

L-Lisina

Piperidínico

L-Tirosina

Isoquinolínico

L-Triptofano Indólico

25

protoberberínicos, foram isolados da espécie Annickia kummeriae (MALEBO et al.,

2013).

Figura 7: Exemplos de alcaloides encontrados em Annonaceae

Alcaloides aporfínicos e derivados são bastante encontrados em diferentes

espécies da família Annonaceae (SILVA et al., 2007; DUTRA et al., 2012; SILVA et

al., 2014). Quimicamente estes alcalóides são caracterizados como bases tetracíclicas

formadas pelo acoplamento oxidativo direto entre anéis aromático A e D de núcleos

típicos benzilisoquinolínicos (Figura 8) (STÉVIGNY et al., 2004).

Figura 8: Estrutura básica de alcaloides aporfínicos.

N H

H

HH

H

OCH3

OCH3

N

OH

NO

OH

H3CO

H3COOCH3

OOH

OH

MeOOMe

N N CH3CH3

O CH3

N+

OCH3

OCH3

H3CO

H3COCl

-

nornuciferina filogalina

antioquinapalmatina

N R3b

7a

6a

3a

1a

11a11

10

9

8

7

6

5

43

2

1

26

A rota biossintética para os alcaloides aporfínicos (Figura 9) inicia-se a partir do

aminoácido L-tirosina. Duas moléculas de L-tirosina paralelamente sofrem reação, uma

é descarboxilada para formar a dopamina e a outra sofre uma reação de transaminação

dando origem ao ácido 4-hidroxifenilpirúvico. Posteriormente, os produtos das duas

reações sofrem condensação através da reação de Mannich, formando (S)-

Norcoclaurina. Reações seguintes de metilação e oxidação levam a formação de (S)-

Reticulina. Sendo a (S)-Reticulina precursora dos alcaloides aporfínicos, formados

posteriormente em acoplamento oxidativo (DEWICK, 2009). Diversas atividades

biológicas são descritas na literatura para estes tipos de alcaloides e derivados, tais

como: citotóxica, antimicrobiana e antiprotozoários (PAULO et al., 1992; SILVA et al.,

2007; SILVA et al ., 2012a; COSTA et al., 2013).

27

Figura 9: Rota biossintética dos alcaloides aporfínicos.

Fonte: DEWICK, 2009

2.3 Óleos Essenciais de Annonaceae e atividade antimicrobiana

Óleos essenciais são misturas complexas constituídas por terpenoides (mono e

sesquiterpenos) e fenilpropanoides, sendo estes metabólitos responsáveis por suas

características organolépticas. Podem ser obtidos a partir de folhas, cascas, caule, flores,

frutos e sementes (BIZZO et al., 2009; BAKKALI et al., 2008).

Os terpenoides formam uma grande e diversificada família de produtos naturais,

constituídos de unidades de isopreno C5, envolvendo diretamente na sua formação as

unidades biologicamente ativas: Dimetilalil difosfato (DMAPP) e Isopentenil difosfato

(IPP) (Figura 10). Sua origem pode ser a partir de duas vias biossintéticas: via do

NMe

MeO

OHH

MeO

OH

O

-CO2

OH

O

NH2

L-Tirosina

OHNH2

Tiramina

OHNH2

OH

Dopamina

O

OH

CO2H

Ácido 4-hidroxifenil-pirúvico

CHO

OH4-hidroxifenil-acetaldeído

reação do tipo Mannich

NH

OH

OHH

OH(S)- Norcoclaurina

SAMSAM

NH

MeO

OHH

OH

(S)- Coclaurina

NMe

MeO

OHH

OH(S)-N-metilcoclaurina

NMe

MeO

OHH

OH

OH

(S)-3´ - hidroxi- N-metilcoclaurina (S)- Reticulina

SAMN

R

Alcalóides Aporfínicos

Acoplamentooxidativo

O2

28

mevalonato e a via desoxi-xilulose fosfato. São classificados de acordo com o número

de unidades de isopreno: hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15),

diterpenos (C20), sesterterpenos (C25), triterpenos (C30) e tetraterpenos (C40) (DEWICK,

2009).

Figura 10: Unidades de isopreno precursoras.

Os óleos essenciais da família Annonaceae são constituídos por mono e

sesquiterpenos, observando-se que os monoterpenos são comumente encontrados em

frutos e sementes e sesquiterpenos em folhas, cascas e raízes (FOURNIER et al., 1999).

De acordo com Fontes e colaboradores (2013) os óleos essenciais da espécie

Guatteria pogonopus tem como constituintes majoritários γ-patchouleno, (E)-

cariofileno e β-pineno. Estudos realizados por Costa e colaboradores (2011a), com as

espécies Annona salzmannii e A. pickelii, constatou-se que os óleos de ambas espécies

eram constituídos predominantemente de sesquiterpenos e que os compostos

majoritários eram o biciclogermacreno e (E)-cariofileno. O óleo essencial da espécie

Xylopia frutescens tem como principais constituintes (E)-cariofileno, biciclogerma-

creno, germacreno D e α-copaeno (FERRAZ et al., 2013). Para a espécie Annona

foetida, o biciclogermacreno (35,12%), (E)-cariofileno (14,19%) e α-copaeno (8,19%)

foram identificados como os compostos majoritários (COSTA et al., 2009). A espécie

Bocageopsis pleiosperma Maas apresentou na composição dos óleos essenciais o

sesquiterpeno β-bisaboleno como constituinte majoritário. (SOARES et al., 2015a).

Trabalho de Silva e colaboradores (2015b) sobre óleo essencial de espécies Unonopsis

Dimetilalil disfosfato(DMAPP ) (C5 )

Isopentenil difosfato(IPP) (C5 )

OPP OPP

29

guatterioides, U. stipitata, U. floribunda, U. rufescens e U. duckei, revelou como

constituintes majoritários os sequiterpenos óxido de cariofileno e espatulenol com

exceção de U. guatterioides e U.stipitata (Figura 11).

Figura 11: Exemplos de terpenos encontrados em óleos essenciais na família Annonaceae.

A resistência de micro-organismos contra os medicamentos disponíveis no

mercado constitui-se em um sério problema de saúde pública, gerando a necessidade de

busca de novos compostos bioativos para o combate às graves enfermidades por eles

produzidas. Os óleos essenciais tem chamado atenção como fontes naturais seguras,

cujos estudos têm revelado inúmeras atividades medicinais, como anti-oxidante, anti-

inflamatória, anti-vira, anticarcinogênica e antimicrobiana (SHAABAN et al., 2012).

Várias espécies de Annonaceae da Amazônia têm revelado atividade

antimicrobiana como pode ser constatado em alguns relatos citados a seguir. A espécie

Guatteriopsis blepharophylla teve óxido de cariofileno como composto majoritário,

sendo relatada uma potente atividade contra a bactéria Rhodococcus equi exibindo um

H

H

(E)- cariofileno

O

H

H

β-elemeno

biciclogermacreno

H

β-selineno

óxido de cariofileno

30

CIM de 50µg mL-1 (COSTA et al., 2008). A espécie B. pleiosperma Maas apresentou na

composição dos óleos essenciais o sesquiterpeno β-bisaboleno como constituinte

majoritário, sendo a ele atribuída a moderada atividade contra Staphylococcus

epidermidis. Os óleos de Duguetia lanceolata, constituídos principalmente de β-

elemeno, óxido de cariofileno o β-selineno apresentaram significativa atividade contra

Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli e Candida albicans

(SOUSA et al., 2012).

31

2.4 O gênero Onychopetalum

O gênero Onychopetalum tem sua distribuição restrita a Região Amazônica,

sendo as espécies encontradas frequentemente em florestas não inundadas. Este gênero

é constituído por 2 espécies: O. amazonicum (R.E. Fr) e O. periquino (Rusby) (Figura

12), tendo sido incorporado desde 1959 ao informal “Grupo-Unonopsis”, que inclui os

gêneros Bocageopsis e Unonopsis (MAAS et al., 2007b; CHATROU et al., 2012).

Neste grupo informal “Grupo-Unonopsis”, o gênero Onychopetalum apresenta

apenas dois estudos fitoquímicos referentes à espécie O. amazonicum (ALMEIDA et

al., 1976; SILVA et al., 2015a). Já no gênero Bocageopsis poucos relatos fitoquímicos

são descritos na literatura. A espécie B. pleiosperma Maas apresentou na composição

dos óleos essenciais o sesquiterpeno β-bisaboleno como constituinte majoritário,

enquanto que das folhas foram isolados alcaloides dos tipos: aporfínicos, oxoaporfínico,

benziltetraidroisoquinilínico e β-carbolínico (SOARES et al., 2015a; 2015b).

Figura 12: Distribuição geográfica do gênero Onychopetalum.

Fonte: MAAS et al., 2007b

O.amazonicum

O. periquino

32

O gênero Unonopsis é de longe o mais estudado, principalmente com relação à

prospecção de alcaloides, destacando-se os do tipo aporfinico e derivados (Figura 13)

(SILVA et al., 2014; YOSHIDA et al., 2013; SIQUEIRA et al., 1998). Estudos

realizados por Waechter e colaboradores (1999) com U. buchtienii identificaram

alcaloides oxoaporfínicos, tais como liriodenina, enquanto que de U. guatterioides

foram reportados alcaloides aporfínicos, oxoaporfínicos e azafluorenona (SILVA et al.,

2012b). Das cascas do caule de U. lindimani foi isolado o alcaloide do tipo

oxoaporfínico lisicamina (SILVA et al., 2007).

Figura 13: Alcaloides aporfínicos e derivados encontrados no gênero Unonopsis.

Aporfínicos

Anonaina

NH

H

O

O NH

H

HO

H3CO

Oxoaporfínicos

Azafluorenona

NO

OCH3H3CO

HO

H3C

asimilobina

liriodenina lisicamina

5,8-dimetoxi-7-hidroxi-1-metil-4-azafluore-9-ona

N

O

O

O

N

O

H3CO

H3CO

33

2.5 A espécie Onychopetalum amazonicum.

A espécie O. amazonicum, conhecida popularmente como envira preta e envira

caju, tem sua distribuição na Região Amazônica brasileira (Amazonas, Mato Grosso,

Pará e Rondônia) e na Venezuela (Amazonas). Suas arvores tem cerca de 10 a 30

metros de altura, chegando a 90 cm de diâmetro. Frequentemente são encontradas em

florestas não inundadas, com um período de frutificação de setembro a janeiro e o de

floração em janeiro, junho e setembro (MAAS et al., 2007b).

Na literatura há apenas dois relatos de estudo químico. No primeiro trabalho

foram reportados nas cascas do tronco os esteróides, sitosterol e estigmasterol, além do

alcaloide onichina (Figura 14) (ALMEIDA et al., 1976). O segundo trabalho envolve a

extração de policarpol das cascas (SILVA et al., 2015a).

Figura 14: Alcaloide onichina.

N

O

34

3. OBJETIVOS

3.1 Geral

Contribuir para o conhecimento químico e biológico do gênero Onychopetalum

(Annonaceae) por meio de estudos fitoquímicos e pela investigação do potencial

antimicrobiano dos óleos essenciais da espécie O. amazonicum.

3.2 Específicos

Avaliar as frações alcaloídicas das folhas, cascas e galhos utilizando técnicas

APCI-IT-MSn e LC-DAD-APCI-MS, a fim de selecionar as mais promissoras

para estudo fitoquímico;

Isolar constituintes das frações alcaloídicas e caracterizá-los através de técnicas

de RMN 1D/2D e EM;

Caracterizar os compostos presentes nos óleos essenciais das folhas, cascas e

galhos de O. amazonicum, através de análises cromatográficas por CG-EM e

CG-DIC;

Avaliar a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais das folhas, cascas e

galhos de O. amazonicum.

35

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Análises cromatográficas

4.1.1 Cromatografia em camada delgada – CCD

As análises foram realizadas em cromatoplacas pré-fabricadas de sílica gel TLC

de 0,2 mm de espessura e indicador de fluorescência F254 da Sorbent Techonologies.

Para detecção dos compostos usou-se irradiação com lâmpada ultravioleta (UV) (264 e

365 nm) e revelação com reagente Dragendorff.

4.1.2 Cromatografia líquida de alta eficiência analítica-CLAE

Utilizou-se um cromatógrafo Acella® (Thermo Scientific), operando

simultaneamente com um detector PDA e um detector de espectrometria de massas

(TSQ Quantum Acess). Foi utilizada uma coluna Luna C18 (5µm, 150 x 4,60 mm)

Phenomenex. As fases móveis utilizadas foram metanol e água acidificada (0,01%

TFA).

4.1.3 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ) preparativa

O isolamento em escala preparativa foi realizado em um cromatógrafo modelo

Shimadzu®, CBM-20A, equipado com detector de UV SPD-20A, desgaseificador DGU-

20A e sistema binário de solventes LC-6AD. Utilizou-se uma coluna Luna C18 (5µm,

250 x 15.00 mm) Phenomenex. As fases móveis utilizadas foram metanol e água

acidificada (0,01% TFA).

4.1.4 Cromatografia Gasosa

Os óleos essenciais foram analisados em um cromatógrafo gasoso acoplado aos

detectores de ionização de chama (DIC) e espectrometria de massas (EM), modelo

CG2010/ QP2010 Plus (Shimadzu©). As análises foram realizadas no Centro de

36

Biotecnologia da Amazônia (CBA), sob responsabilidade do MSc. Raimundo Carlos

Pereira Junior.

4.2 Solventes e reagentes reveladores

4.2.1 Solventes

Para o preparo dos extratos foram utilizados solventes grau PA (Nuclear®).

Utilizaram-se solventes grau HPLC para as análises cromatográficas analítica e

preparativa, bem como para as análises por espectrometria de massas. Os espectros de

RMN foram obtidos em solventes deuterados.

4.2.2 Reagentes reveladores

Reagente de Dragendorff (modificação de Munier) (MUNIER, 1953 apud

Merck, 1971): Solução A: 1,7 g de nitrato de bismutto III e 20,0 g de ácido tartárico

dissolvidos em 80 mL de água destilada. Solução B: 16,0 g de iodeto de potássio

dissolvidos em 40 mL de água destilada. A mistura de partes iguais destas soluções

constitui a solução estoque. Para borrifação das cromatoplacas, adicionou-se 10,0 g de

ácido tartárico, dissolvidos em 50 mL de água destilada. Após borrifação das placas

cromatográficas os spots das substâncias alcaloídicas apresentaram coloração laranja.

4.3 Métodos espectroscópicos/espectrométricos

Os espectros de massas foram registrados em espectrômetro do tipo Íon-trap,

modelo LCQ Fleet (Thermo scientific), operando com fonte de ionização química à

pressão atmosférica (APCI); e espectrômetro do tipo triplo-quadrupolo, modelo TSQ

Quantum Acess, operando com fonte de ionização química à pressão atmosférica

(APCI). As análises de espectrometria de massas foram realizadas no laboratório de

espectrometria de massas da Universidade Federal do Amazonas - UFAM.

37

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1H e 2D foram

obtidos em equipamento modelo Bruker Avance 600 (600 MHz), do Departamento de

Química da Universidade Federal do Paraná-UFPR, sob responsabilidade do professor

Dr. Anderson Barison. As amostras foram solubilizadas em clorofórmio, acetona e

metanol deuterados (CDCl3, CD3COCD3 e CD3OD). Tetrametilsilano (TMS) foi

utilizado como padrão de referência interna. Os deslocamentos químicos foram

expressos em ppm (δ) e as constantes de acoplamento (J) foram registradas em Hertz

(Hz).

4.4 Outros equipamentos

Liquidificador Indústrial: Modelo JBM35 - Motor: 1/2 CV - 50/60 Hz;

Balança analítica: MARK classe 1 (máx. 220 g – mín.10 mg);

Pipeta automática: Gilson ®, P 1000 e P 200 ;

Ultrasson: Unique, modelo USC-2800;

Evaporador rotatório: Heidolph, tipo Heizbad OB.

38

4.5 Coleta e identificação do material botânico

As folhas, galhos e cascas de O. amazonicum foram coletadas na Reserva

Florestal Adolpho Ducke, no dia 11 de março de 2014 (Figura 15), de indivíduo

previamente marcado (nº 163). Sua exsicata encontra-se depositada no herbário do

Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) sob o N º218341.

Após a coleta, as diferentes partes da planta foram separadas, limpas e secas a

temperatura ambiente por 20 dias. Posteriormente o material foi triturado

separadamente e pesado.

Figura 15: Espécie de O. amazonicum coletada na Reserva Florestal Adolpho Ducke.

Fonte: Lima, 2014

4.6 Obtenção dos óleos essenciais

Aproximadamente 100 g das folhas, cascas e galhos foram submetidas à

extração dos óleos essenciais pelo processo de hidrodestilação em aparelho tipo

Clevenger modificado (Figura 16). Utilizou-se 2L de água destilada durante 4 horas de

extração. Os óleos essenciais foram coletados em um frasco pequeno de vidro, sendo

adicionado sulfato de sódio anidro (Na2SO4) para retirar a água do meio. Seu

rendimento foi calculado dividindo-se a massa do óleo pela massa do material inicial e o

resultado multiplicado por 100. Os óleos obtidos foram acondicionados em frascos

âmbar, fechados e armazenados na temperatura de -15°C até as análises.

39

Figura 16: Extração dos óleos essenciais de O. amazonicum em um aparelho tipo Clevengermodificado.

Fonte: Lima, 2014

4.7 Análises por CG-DIC e CG-EM

As amostras foram diluídas em diclorometano (1mg/mL) e analisadas por CG-

DIC e CG-EM. Para a análise em CG-DIC foi utilizada uma coluna DB-5 (30m x

0,25mm x 0,25 µm) temperatura programada de 60 a 240 ºC com um gradiente

3°C/min. Hélio foi utilizado como gás de arraste com fluxo de 0,80 mL / min. O modo

de injeção foi split com razão 1:50, com o injetor a 250°C e o volume de injeção 1µL.

Na análise por CG-EM os espectros de massas foram obtidos em uma faixa de

detecção de m/z 40-600, as condições da análise foram as mesmas utilizadas para CG-

DIC. Para obtenção do índice de retenção foi injetada uma série homóloga de

hidrocarbonetos (C8-C30). Os índices de retenção foram calculados utilizando a

equação de Van der Dool-Kratz (Dool & Kratz, 1963). Os constituintes foram

identificados com base na comparação dos espectros obtidos com aqueles armazenados

39


Fonte: Lima, 2014













39


Fonte: Lima, 2014













40

na biblioteca Wiley, 7ª edição do equipamento e comparação dos índices de retenção

calculados com os da literatura (ADAMS, 2007).

4.8 Avaliação da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais.

Os experimentos para a avaliação da atividade antimicrobiana dos óleos

essenciais das cascas do tronco, folhas e galhos de O. amazonicum foram realizados no

Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas-UNICAMP, sob

responsabilidade do Dr. Marcos José Salvador.

Os óleos essenciais foram avaliados quanto à atividade antimicrobiana,

utilizando o método de micro diluição em caldo (placas de 96 poços), como descrito

anteriormente (SALVADOR et al., 2002; COSTA et al., 2010). Vinte microlitros de

soluções de amostra-teste e de soluções-controle (positivo e negativo) foram aplicadas

em poços de 5 mm de diâmetro para dar uma concentração entre 10 a 500 µg/ml. As

soluções foram preparadas em DMSO, em concentração de 5000 µg/mL. Como

controles positivos foram utilizados discos de cloranfenicol (100 µg/mL) e cetoconazol

(100 µg/mL) e como controle negativo foi usada uma solução de dimetilsulfóxido

(DMSO)-esterilizado e água destilada (5:95, v / v). A concentração inibitória mínima

(CIM) foi calculada como a concentração mais baixa que mostra completa inibição de

uma estirpe testada (SALVADOR et al., 2002). Cada teste de sensibilidade foi realizado

em duplicata para cada micro-organismo avaliado e repetido três vezes. As estirpes de

micro-organismos utilizados foram Kocuria rhizophila (ATCC 9341), Staphylococcus

aureus (ATCC14458), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Escherichia coli

(ATCC 10538), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Candida albicans(ATCC

10231), Candida parapsilosis (ATCC 22019), Candida tropicalis (ATCC 157),

Candida glabrata (ATCC 30070) e Candida dubliniensis (ATCC 778157).

41

4.9 Marcha química para obtenção de alcaloides.

O material vegetal triturado (folhas, cascas e galhos) foi submetido à extração

alcaloídica em escala analítica e preparativa, de acordo com metodologia adaptada

descrita previamente na literatura (SOARES et al., 2015b).

As frações alcaloídicas em escala analítica (Esquema 1) foram obtidas conforme

descrita a seguir: 500 mg de material vegetal (folhas, galhos e cascas) foram

transferidos para um recipiente de vidro, adicionando-se 5 mL de hidróxido de amônio a

10% (NH4OH) e 5 mL de diclorometano (DCM), agitando-se em seguida. Após

extração, a fase DCM foi transferida para um funil de separação, acrescentando-se 5 mL

de ácido acético a 10%. A fração aquosa ácida, foi tratada com hidróxido de amônio

concentrado, até alcançar o pH 10, acrescentando-se em seguida 5 mL de DCM. Após a

extração, a fase orgânica foi separada e seca sob uma corrente de nitrogênio.

Esquema 1: Extração alcaloídica em escala analítica.

500 mg (cascas,galhos e folhas)

5mL NH4OH (10%) e5mL CH2Cl2

Fase DCM : adiçãode 5 mL ácidoacético 10%

Fase aq. ácida: adiçãoNH4OH conc. (até pH

10)+

5mL DCM

Fase DCM(Fração alcaloídica)

Secas em N2 (g)

Extração eseparação


42

Quanto à extração em escala preparativa (Esquema 2), cerca 300 g de folhas

trituradas foram maceradas com 2L de NH4OH 10% e 2L de CH2Cl2 por 72h. Em

seguida a fase orgânica foi transferida para um funil de separação e extraída com

solução de ácido acético 10% (2x 500mL). Posteriormente, a camada aquosa ácida

obtida foi ajustada com NH4OH (concentrado) até pH 10 e extraída com 600 mL de

DCM. Durante a etapa final de extração, observou-se a formação de um precipitado,

com teste positivo para alcaloides ao reagente de Dragendorff, sendo separado, seco sob

uma corrente de nitrogênio, pesado (421,8 mg) e codificado como PFOa. A fase DCM

final, contendo a fração alcaloídica, foi concentrada em um evaporador rotativo, seca

em um dessecador e pesada (1,16 g).

Esquema 2: Extração de alcaloides em escala preparativa

300g (Folhas)2L NH4OH (10%) 2L

DCM

Decantação 72 h

Fase DCM : adição ácidoacético 10%( 2 x 500mL)

Fase aq. ácida: adiçãoNH4OH conc. (até pH

10)+

600mL DCM

Fase DCM (Fraçãoalcaloídica)

Fração alcaloídica1,16 g

Precipitado

Precipitado421,8 mg



43

4.10 Análises por APCI-IT-MSn e LC-DAD-APCI-MS das frações alcaloídicas de

O. amazonicum obtidas em escala analítica.

As frações alcaloídicas obtidas em escala analítica (casca, galhos e folhas) foram

diluídas a concentração de 10 ppm em metanol grau HPLC, sendo os espectros de full

scan obtidos por inserção direta em espectrômetro de massas do tipo ion trap (LCQ

Fleet), equipado com fonte de APCI e operando em modo positivo de aquisição. Os

espectros de MSn foram obtidos por inserção direta em espectrômetro de massas do tipo

ion trap (LCQ Fleet) equipado com fonte de APCI (modo positivo - energias de colisão

entre 15 e 20 %). A faixa de massa analisada foi de m/z 100-1000.

Para a análise de LC-DAD-APCI-MS da fração alcaloídica das folhas utilizou-se

um sistema UHPLC, modelo Acella® (Thermo Scientific), acoplado a um

espectrômetro de massas do tipo triplo-quadrupolo, modelo TSQ Quantum Acess

(Thermo scientific), dotado de uma fonte de APCI (modo positivo) e monitorando a

faixa de m/z 100-1000. Utilizou-se uma coluna Luna C18 (5µm, 150 x 4,60 mm)

Phenomenex com fluxo de 1 mL/min. As fases móveis utilizadas foram metanol (B) e

água acidificada (A) (0,01% TFA), com gradiente B de 20-80% durante 14 minutos,

seguido de 80% por 10 min. O detector DAD foi ajustado para o monitoramento entre

200-600 nm.

4.11 Fracionamento por CLAE da fração alcaloídica das folhas em escala

preparativa.

Após escalonamento adequado do método utilizado em escala analítica, cerca de

100 mg da fração alcaloídica das folhas foram solubilizados em 500µL de metanol/

diclorometano (1:1) e submetidos a fracionamento em escala preparativa em

cromatógrafo modelo Shimadzu® (CBM-20A), equipado com detector de UV (SPD-

20A), desgaseificador (DGU-20A), sistema binário de solventes (LC-6AD) e looping de

44

500µL. Foi utilizada uma coluna Luna C18 (5µm, 250 x 15.00mm) Phenomenex com

fluxo de 8 mL/min. As fases móveis utilizadas foram metanol (B) e água acidificada (A)

(0,01% TFA), com gradiente de B de 20-80% durante 14 minutos, seguido de 80% por

10 min, o que resultou em 17 frações. As frações foram analisadas por espectrometria

de massas, sendo posteriormente encaminhadas as mais promissoras para análises de

RMN 1D e 2D.

4.11.1 Análise de precipitado por APCI-IT-MS e LC-DAD-APCI-MS.

O precipitado codificada como PFOa, obtido na marcha alcaloídica em escala

preparativa, foi analisado por APCI-IT-MS e LC-DAD-APCI-MS, nas mesmas

condições utilizadas para a fração alcaloídica das folhas.

45

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Extração dos óleos essenciais de O. amazonicum.

As amostras obtidas de óleos essenciais de O. amazonicum apresentaram uma

coloração amarelo claro e rendimentos que variaram de 0,16 a 0,34% (Tabela 1).

Observou-se o elevado rendimento das cascas em relação às demais partes da planta

analisada. Os rendimentos obtidos são coerentes com aqueles existentes na literatura

para outras espécies da família Annonaceae (FOURNIER et al., 1999; ALITONOU et

al., 2013; KARIOTI et al., 2004).

Tabela 1: Rendimentos dos óleos essenciais obtidos de O. amazonicum.

Amostra Rendimento %Folhas 0,18Cascas 0,34Galhos 0,16

5.2 Identificação dos constituintes voláteis presentes no óleo essencial das folhas de

O. amazonicum.

Através da análise de CG-EM e CG-DIC dos óleos essenciais obtidos das folhas

de O. amazonicum foi possível caracterizar 87,8% da composição química (Tabela 2).

Os principais compostos identificados nas folhas foram (E)-cariofileno (17,0%), óxido

de cariofileno (11,9%), espatulenol (10,4%) α-copaeno (8,4%) e biciclogermacreno

(5,8%) (Figura 17).

Tabela 2: Constituintes dos óleos essenciais das folhas, cascas e galhos de O. amazonicum.

Compostos Folhas Cascas Galhos I.Ra I.Rb,f I.Rb,c I.Rb,g

δ-Elemeno 0,7 - - 1335 1338 - -α-Cubebeno 0,7 1,3 - 1348 1350 1350 -α-Copaeno 8,4 3,4 0,2 1374 1377 1377 1374β-Bourboneno 0,6 - - 1387 1386 - -β-Elemeno 2,7 2,9 4,2 1389 1393 1393 1393α-Gurjuneno 3,6 14,9 10,6 1409 1406 1406 1406(E)-Cariofileno 17,0 3,7 - 1417 1421 1421 -Aromadendreno 1,6 - - 1439 1440 - -α-Humuleno 3,1 0,9 - 1452 1455 1455 -allo-Aromadendreno - 21,2 2,4 1458 - 1463 1462γ-Gurjuneno - 1.3 - 1475 - 1476 -

46

γ-Muroleno 2,9 - - 1478 1478 - -Germacreno D 1,7 - - 1480 1482 - -β-Selineno 0,7 0,7 1,4 1489 1487 1487 1487Biciclogermacreno 5,8 - - 1500 1497 - -α-Murolene 1,2 0,7 - 1500 1501 1501 -(E,E)-α-Farneseno - - 0,4 1505 - - 1500γ-Cadineno - 1,9 1,8 1513 - 1515 1515(E)-Calameno - - 1,9 1521 - - 1528δ-Cadineno 5.4 3,9 2,4 1522 1524 1524 1524α-Calacoreno 2,7 - 1,3 1544 1544 - 1543Elemol - - 2,5 1548 - - 1550Germacreno B 1,0 - - 1559 1558 - -β-Calacoreno 0,8 - - 1564 1564 - -(E)-Hidrato sesquisabineno - - 0,5 1577 - - 1578Espatulenol 10,4 - - 1577 1579 - -Óxido de cariofileno 11,9 3,8 4,9 1582 1584 1584 1584Viridiflorol 0,7 0,9 1,4 1592 1593 1592 1593Guaiol 1,1 - - 1600 1598 - -Sesquituriferol - - 0,7 1604 - - 1604Epóxido humuleno II 1,1 - 3,4 1608 1610 - 16081,10-di-epi-Cubenol - - 3,2 1618 - - 1615Isolongifolan-7-alfa-ol - - 2,4 1618 - - 16211-epi-Cubenol - 3,2 2,8 1627 - 1629 1629epi-(α)-Cadinol - 24,1 14,0 1638 - 1643 1642Cubenol 1,4 0,8 - 1645 1642 1647 -α-Cadinol 0,5 1,3 0,7 1652 1655 1655 1651Cadeleno - - 0,9 1675 - - 1675Mustakona - - 1,1 1676 - - 1678Eudesma-4(15),7-dien-1β-ol - - 1,8 1687 - - 1687Ciperotundona - 1,3 8,1 1695 - 1695 1695

Sesquiterpenos não oxigenados (%) 60,7 56,9 27,5Sesquiterpenos oxigenados (%) 27,1 35,3 47,5Total identificados (%) 87,8 92,2 75,0

a Índice de retenção de acordo com Adams (2007); b Índice de retenção calculado de acordo com Van derDool-Kratz (1963) para os componentes da folhas f, cascas c e galhos g.

Estes compostos majoritários foram anteriormente observados em espécies da

família Annonaceae. O óleo essencial da espécie Xylopia frutescens tem como

principais compostos (E)-cariofileno (31,48%), biciclogermacreno (15,13%),

germacreno D (9,66%) e α-copaeno (4.55%) (FERRAZ et al., 2013). Segundo Maia e

colaboradores (2005), o espatulenol e óxido de cariofileno foram identificados como

constituintes principais nas espécies Guatteria juruensis (77,5%) e Guatteria

microcalyx (44,2%), respectivamente. Para a espécie Annona foetida, o

biciclogermacreno (35,12%), (E)-cariofileno (14,19%) e α-copaeno (8,19%) foram

identificados como os compostos majoritários (COSTA et al., 2009).

47

Figura 17: Constituintes majoritários nos óleos essenciais das folhas de O. amazonicum.

Em estudos realizados por Owolabi e colaboradores (2013) com óleo essencial

de Annona muricata, o (E) cariofileno (38.9%) foi identificado como composto

majoritário, demostrando uma notável atividade citotóxica. O óleo essencial da espécie

Guatteria pogonopus apresentou significativa atividade antitumoral, estando presente

(E)-cariofileno (11,36%) como um dos principais constituintes (FONTES et al., 2013).

5.3 Identificação dos constituintes voláteis presentes no óleo essencial das cascas de

O. amazonicum

Através dos dados de CG-EM e CG-DIC do óleo essencial das cascas obtido de

O.amazonicum foi possível caracterizar 92,2% dos constituintes do óleo (Tabela 2). Foi

observada a predominância dos compostos (epi) α-cadinol (24,1%), allo-aromadendreno

(21,2%), α-gurjuneno (14,9%,), δ-cadineno (3,9%) e óxido de cariofileno (3,8%)

(Figura 18), sendo estes compostos já identificados em espécies da família Annonaceae,

como as espécies Annona muricata, Polyalthia longifolia, Duguetia lanceolata,

H

H

H

HOH

H

(E)-cariofileno

espatulenol

α-copaeno

O

H

H


biciclogermacreno

48

Artabotrys pallens (KOSSOUOH et al., 2007; OGUNBINU et al., 2007; SOUSA et al.,

2012; THANG et al., 2013).

Para o composto (epi) α-cadinol, tem sido relatado na literatura sua atividade

antimicrobiana. O óleo essencial de Piper amalago, constituído por 12,70% de (epi) α-

cadinol, apresentou atividade antifúngica satisfatória contra Candida albicans, Candida

parapsilosis e Candida tropicalis (CARRARA et al., 2010). Em um estudo realizado

com a espécie Ocimum basilicum L., o composto (epi) α-cadinol foi um dos

constituintes principais (11,4%, 12,4%, 8,6% e 10%, respectivamente, no verão, outono,

inverno e primavera), onde foi observada atividade antimicrobiana contra bactérias

gram-positivas e gram-negativas (HUSSAIN et al., 2008).

Figura 18: Constituintes majoritários no óleo essencial das cascas de O. amazonicum.

H

HOH

H

H

H

(epi)α-cadinol allo- aromadendreno

α -gurjunenoδ -cadineno

O

H

H


H

49

5.4 Identificação dos constituintes voláteis presentes no óleo essencial dos galhos de

O.amazonicum.

Através dos dados de CG-EM e CG-DIC do óleo essencial dos galhos obtido de

O.amazonicum foi possível caracterizar 75,0% da sua composição química (Tabela 2),

tendo como constituintes majoritários (epi)α-cadinol (14,0%), α-gurjuneno (10,6%),

ciperotundona (8,1%), óxido de cariofileno (4,9%) e β-elemeno (4,2 %) (Figura 19).

Figura 19: Constituintes majoritários no óleo essencial dos galhos de O. amazonicum.

Com relação aos compostos majoritários encontrados nos galhos pôde-se

observar uma semelhança com os presentes nas cascas, principalmente pelo alto teor de

(epi) α-cadinol.

Quando comparados os constituintes principais presentes nas folhas, cascas e

galhos de O. amazonicum, o composto óxido de cariofileno foi o único que esteve

presente em todas as amostras com teores 11,9, 3,8 e 4,9% respectivamente. A espécie

Guatteriopsis blepharophylla teve óxido de cariofileno (69,25%) como composto

H

HOH

O

H

O

H

H

(epi)α- cadinol

ciperotundona

α -gurjuneno


β - elemeno

50

majoritário, sendo relatada uma potente atividade contra a bactéria Rhodococcus equi

exibindo um CIM de 50µg mL-1 (COSTA et al., 2008).

No total, 41 constituintes foram identificados nos óleos essenciais de O.

amazonicum, destacando-se a presença de sesquiterpenos e a ausência de monoterpenos,

o que está em acordo com estudos anteriores com espécies de Annonaceae, onde é

comumente observado monoterpenos em frutos e sementes e sesquiterpenos em folhas,

cascas e raízes (FOURNIER et al., 1998).

5.5 Atividade antimicrobiana dos óleos essenciais de O. amazonicum.

O óleo essencial das cascas de O. amazonicum (CIM 62,5 µg/ml ) demonstrou

atividade contra as bactérias gram-positivas K. rhizophila ATCC 9341 e S. epidermidis

ATTC 12228, e a bactéria gram-negativa E. coli ATCC 10538 (Tabela 3). Nenhum

efeito contra S. aureus ATCC 14458, P. aeruginosa ATCC 27853, C. albicans ATCC

10231, C. parapsilosis ATCC 22019, C. tropicalis ATCC 157, C. glabrata ATCC

30070 e C. dubliniensis ATCC 778157 foi observado para os três óleos essenciais.

Esta atividade pode estar associada à presença do composto de um dos

compostos majoritários allo-aromadendreno (21, 1%), uma vez que (epi) α-cadinol (24,

1%) e α-gurjuneno (14, 9%) são os principais compostos no óleo essencial dos galhos,

parte da planta que não exibiu qualquer atividade. Estudos realizados por Parmena e

colaboradores (2012) com a espécie Monanthotaxis discolor (Annonaceae)

demonstraram atividade antimicrobiana associada à presença do composto allo-

aromadendreno (11,7 – 12,8%).

51

Tabela 3: Atividade antimicrobiana in vitro dos óleos essenciais de O. amazonicum com osrespectivos valores de CIM (µg/mL-1)

aCIM– Concentração inibitória mínima em µg/mL-1; bControle positivo: cloranfenicol para as estirpes debactérias e cetoconazol para cepas de leveduras; c cepa padrão; d(-)não apresentou inibição. As amostrasavaliadas na gama de 12,5 e 500 µg/mL-1.

5.6 Análises por APCI-IT-MSn das frações alcaloídicas obtidas em escala analítica

5.6.1 Análise espectrométrica da fração alcaloídica das folhas, cascas e galhos de O.

amazonicum.

Nos espectros de íons totais da fração alcaloídica de O. amazonicum (Figura 20),

para as cascas e galhos foram observados perfis complexos com diversos sinais sendo

registrados na região de m/z 100-800 a ausência de sinais majoritários de m/z par,

apontando para menor abundância de alcaloides se comparado ao perfil alcaloídico das

folhas. Tendo em vista a complexidade observada, as amostras de cascas e de galhos

foram reservadas para estudos posteriores.

Microrganismo Folhas Cascas Galhos ControlePositivob

CIMa CIM CIM CIMStaphylococcus aureus (ATCC 14458)c -d - - 25Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228)c - 62,5 - 50Escherichia coli (ATCC 10538)c - 62,5 - 50Kocuria rhizophila (ATCC 9341)c - 62,5 - 50Candida albicans(ATCC 10231)c - - - 12,5Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) - - - >500Candida parapsilosis (ATCC 22019)c - - - 12,5Candida tropicalis (ATCC 157)c - - - 12,5Candida glabrata (ATCC 30070)c - - - 12,5Candida dubliniensis (ATCC 778157)c - - - 12,5

52

Figura 20: Espectro de massas das frações alcaloidicas das folhas, cascas e galhos de O.amazonicum.

5.6.2 Análise espectrométrica da fração alcaloídica das folhas de O. amazonicum.

No espectro de íons totais da fração alcaloídica das folhas (Figura 21) foram

observados diversos picos de m/z par, indicando possíveis alcaloides, destacando-se os

de m/z 342, 330, 328, 312, 298, 282, e 266 ([M+H]+). Estes foram submetidos ao

processo de fragmentação em sequência (tandem ou MSn).

Figura 21: Espectro de íons totais (full scan) da fração alcaloídica das folhas em escala analíticade O. amazonicum

No espectro de MS2 dos íons de m/z 342 e 328, observaram-se perdas de elevada

massa, resultando no pico base de m/z 178 (Figura 22). Perdas de elevada massa são

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000m/z

0

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

0

20

40

60

80

100328,16

342,08282,06178,15 266,12108,06 369,24 397,04 662,88577,35549,35446,61 769,79694,94

423,39 697,15

349,07

328,29681,14439,28219,16 317,15 397,38 665,10 710,97266,24 559,24473,12203,27149,10 642,61 725,18 858,35773,83 972,55894,78

235,23 314,24663,26

251,23 338,35203,22 397,28267,17175,16

455,32161,23 579,37485,20 607,48369,14749,21668,53

836,81 884,77 935,68 979,97

NL:9,38E3

NL:2,27E4

NL:3,16E3

folhas

cascas

galhos

brunas_PE_Folhas #41 RT: 0,84 AV: 1 SB: 9 1,52-1,70 NL: 2,28E3T: ITMS + c APCI corona Full ms [100,00-800,00]

220 240 260 280 300 320 340 360 380 400m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

328,15

282,05

342,10

329,14

266,12 330,14283,07 298,12 343,12312,10 326,16286,20 338,20280,07262,21 369,22300,13234,25 250,14 390,89344,25 356,01219,17202,28 383,23 397,27

53

incomuns em esqueletos aporfínicos, porém são comumente observados em esqueletos

do tipo benziltetraidroisoquinolínicos (SCHIMIDT et al., 2005) e

tetraidroprotoberberínicos (JEONG et al., 2012). O pico base de m/z 178 foi

previamente descrito como um fragmento chave para tetraidroprotoberberínicos

contendo grupos metoxila e hidroxila ligados ao anel A (SOARES et al., 2015b).

Embora seja possível predizer o padrão de substituição destes compostos, não é possível

garantir a exata posição de substituição, uma vez que substituições em diferentes

posições irão fornecer os mesmos fragmentos de massa.

Figura 22: Espectro de massas em MS2 para os íons de m/z 328 e 342 ([M+H]+).

Analisando o espectro MS2 do íon de m/z 330 (Figura 23) foi observada uma

perda de 138 Da, resultando em um íon fragmento m/z 192. Em estudo de fragmentação

realizado com alcaloides benziltetraidroisoquinolínicos foi sugerido um conjunto de

fragmentações chave (a-e) (Figura 24), através das quais é possível determinar o sítio de

substituição em duas partes essenciais do esqueleto benziltetraidroisoquinolínico, a

parte tetraidroisoquinolínica e a parte benzílica. O íon observado de m/z 192 tem sido

descrito como fragmento chave do tipo b, observado em isoquinolínicos contendo N-

metila e metoxila adjacente à hidroxila, conforme observado para alcaloides N-metil-3-

hidroxicoclaurina, reticulina e N-metilcoclaurina (SCHMIDT et al., 2005).

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340m/z

0

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

178,08

313,13151,10

279,12163,07 296,16 328,16251,14119,07 146,12 190,14137,08 267,1395,07 219,14 235,17204,08178,09

192,10 342,18163,09151,11 327,14294,16 310,13190,15 204,06119,03 265,16135,09 281,15107,09 255,14237,24218,19

NL:1,57E4

NL:1,39E4

54

Figura 23: Espectro de massas em MS2 do íon de m/z 330 ([M+H]+).

Figura 24: Proposta de fragmentação para alcaloides benziltetraidroisoquinolínicos.

Fonte: SCHIMIDT et al., 2005.

brunas_PE_folhas_msms #1180 RT: 7,64 AV: 1 NL: 9,46E2F: ITMS + c APCI corona Full ms2 330,00@cid25,00 [90,00-331,00]

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

192,09

179,11

180,13

315,11299,09152,00 281,13 330,33313,12298,06176,35 267,07143,15 165,20119,98 235,04190,38 253,15111,10

-138 Da

N

OR2

HOR1

b

NH RHO

OR2

R3

OR4

1

OR4

R3

e

IT MS2

R3

OR4

O

HO

R2IT MS3 IT MS3

O

H2O

R2

c

a

O

d

IT MS2IT MS2

R1NH2

([M+H-R1NH2]+)

b

e

55

Nos espectros MSn do íon de m/z 312 (Figura 25), foram observadas perdas

sequenciais de 17, 15 e 15 Da. Segundo as fragmentações chave propostas por Stévigny

e colaboradores (2004), esta sequência está de acordo com um esqueleto aporfínico. A

perda inicial sugere ausência de N-metilação, enquanto as perdas sucessivas sugerem a

presença de metoxilas adjacentes na estrutura.

Figura 25: Espectro de massas em MSn íon de m/z 312 ([M+H]+).

Analisando o espectro de MSn do íon de m/z 298 (Figura 26), observa-se

também uma perda inicial de 17 Da. As perdas competitivas de 15 e 31 Da são também

consideradas como chave para caracterizar metoxilas adjacentes. De acordo com

estudos de fragmentações realizados por Soares e colaboradores (2015b) o íon de m/z

298 com perdas de 17, 15 e 31 Da foi descrito como sendo o alcaloide proaporfínico

estefarina (Figura 27).

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300m/z

0

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

0

20

40

60

80

100295,19

312,01281,04266,19189,23

280,02

264,18

221,10 235,19 266,12251,39 295,28265,16

280,26

NL:1,81E2

NL:4,35E2

NL:1,13E2

-15 Da

-15Da

N H

CH3O

CH3O

-17Da

MS2

MS3

MS4

56

Figura 26: Espectro de massas MSn do íon de m/z 298 ([M+H]+).

Figura 27: Estrutura do alcalóide estefarina.

Analisando o espectro de MSn do íon de m/z 282 (Figura 28) foi observada

perda inicial 17 Da, seguido de perdas sequenciais de 15 e 15 Da, sugerindo a presença

de metoxilas adjacentes no anel A e ausência de N-metilação. Esta mesma sequência de

fragmentação foi anteriormente descrita para o alcaloide aporfínico nornuciferina

(Figura 29) (SILVA et al., 2012b).

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280m/z

0

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100R

elat

ive

Abu

ndan

ce

281,04

267,21298,27192,17

252,92219,23207,02 269,43 282,79178,39160,02 237,98266,12250,20

281,25252,98221,15193,08 203,30

NL:9,42E2

NL:1,55E2

CH3O

CH3O

N H

-17Da

-15Da

-31Da

MS2

MS3

NH

H3CO

H3CO

O

1

23 4

5

6

7a

3b

3a

1a

8

9

10

11

126a

7

57

Figura 28: Espectro de massas em MSn do íon de m/z 282 ([M+H]+).

Figura 29: Estrutura do alcaloide nornuciferina.

A análise do espectro MSn do íon de m/z 266 (Figura 30) também evidenciou

um perfil de fragmentação típico de alcaloides aporfínicos, com perdas sequenciais de

17, 30 e 28 Da (STÉVIGNY et al., 2004). Estas perdas são coerentes com o alcalóide

anonaína (Figura 31), já descrito em diversas espécies da família Annonaceae

(VENDRAMIN et al., 2013;YOSHIDA et al., 2013; TELES et al., 2015; RABÊLO et

al., 2015).

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280m/z

0

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

0

20

40

60

80

100265,15

250,97 282,21267,12218,87250,16

233,83

220,92236,27 265,11

235,16

250,29

NL:4,15E3

NL:3,94E1

NL:1,50E1

-15 Da

-15Da

-17DaMS2

MS3

MS4

NH

H3CO

H3CO

58

Figura 30: Espectro de massas em MSn do íon de m/z 266 ([M+H]+).

Figura 31: Estrutura do alcaloide Anonaína.

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260m/z

0

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

0

20

40

60

80

100249,04

251,08235,18 266,19206,07177,10 219,12191,25219,05

191,29221,12206,24 232,22 249,29203,19

191,18

219,35

NL:1,70E3

NL:6,81E1

NL:2,20E1

O

OA

N H

-17Da

-28Da

-30Da

MS2

MS3

MS4

N

O

OH1

2

3

3a

3b

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

59

5.7 Resultado do fracionamento por CLAE da fração alcaloídica das folhas,

realizado em escala preparativa.

No cromatograma obtido através de LC-APCI-MS (Figura 32) foi possível

observar a presença de diversos alcaloides, sendo os majoritários os de m/z 342, 328 e

282, e os minoritários os de m/z 296, 326, 312, 280 e 266. Através do perfil de DAD

(Figura 32) foi possível confirmar a similaridade estrutural entre os dois principais

compostos majoritários (m/z 342, 328), sendo o perfil observado característico de

esqueleto tetraidroprotoberberínico.

Figura 32: Cromatogramas de LC-DAD (1) e LC-APCI-MS (2) da fração alcaloídica das folhasem escala analítica.

A análise dos cromatogramas (Figura 32) permitiu ainda observar nítida

separação entre os alcaloides de natureza distinta tetrahidroprotoberberínicos (A) e

aporfínicos (B), sendo o método cromatográfico utilizado em escala analítica, ajustado

para escala preparativa. O fracionamento resultou em 17 frações, cujas codificações são

apresentadas na tabela 4. Após analisadas por CCD e espectrometria de massas, as

RT: 2.40 - 14.19 SM: 15B

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Time (min)

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

uAU

7.79

10.72

6.28

10.31

11.51

11.9611.059.297.33

7.97

10.926.45

10.51 11.71 12.167.50 8.53 12.356.82 8.96 12.879.075.92 13.565.43 9.775.022.86 3.50 3.72 4.26

NL:3.81E5Total ScanPDAlcdadmsFAFpequenaescala

NL:4.44E6TIC MSlcdadmsFAFpequenaescala

200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400wavelength (nm)

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bsor

banc

e

228.00

283.00

379.00 393.00231.00

282.00

378.00 390.00361.00

NL:4.16E5lcdadmsFAFpequenaescala#1816-1913RT: 6.05-6.37AV: 98

NL:8.18E5lcdadmsFAFpequenaescala#2308-2392RT: 7.69-7.97AV: 85

m/z 328

m/z 342

m/z 296

m/z 280

m/z 312

m/z 326

m/z 266

m/z 282

(A) (B)

1

2

60

frações codificadas como OaF4 (32,2 mg), OaF8 (15,4 mg), OaF9 (1,0 mg), OaF11(0,5

mg), OaF13(2,2 mg), OaF15 (2,9 mg) e OaF17 (2,7 mg) foram submetidas a análises de

MSn e RMN 1D e 2D para determinação estrutural.

Tabela 4: Frações obtidas pela analise em CLAE em escala preparativa da folhas.

Amostra Massa (mg)OaF1 0,3OaF2 0,4OaF3 0,9OaF4 32,2OaF5 19,8OaF6 0,8OaF7 3,5OaF8 15,4OaF9 1,0OaF10 0,2OaF11 0,5OaF12 0,7OaF13 2,2OaF14 1,2OaF15 2,9OaF16 0,1OaF17 2,7Total 84,8

61

5.8 Determinação estrutural das substâncias isoladas da fração alcaloídica das

folhas obtidas em escala preparativa de O. amazonicum.

5.8.1 Determinação estrutural da amostra OaF4

A amostra codificada como OaF4 (32,2 mg) apresentou-se como um sólido

amorfo. A análise de massas de OaF4 (Figura 33) evidenciou a presença de uma íon

base em m/z 328 [M+H]+. Este íon foi submetido à análise de MSn (Figura 34), onde foi

observado uma elevada perda de massa (150 Da) resultando no pico de m/z 178. Como

descrito anteriormente este tipo de fragmentação chave tem sido observada em

estruturas tetraidroprotoberberínicas contendo metoxila e hidroxila no anel A.

Figura 33: Espectro de massa da amostra OaF4.

Figura 34: Espectro de MS2 para o íon m/z 328 [M+H]+

220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

328,31

298,23212,04 226,03 250,05 326,17264,01 286,13 342,18 378,20356,21 444,25388,21 408,22 494,37424,18 478,41464,29

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

178,08

313,13151,10

279,12163,07 296,16 328,16311,15251,14119,07 146,12 190,14137,09 161,09 285,15267,1395,07 219,14164,15107,92 235,17204,08

-150 Da

62

O íon base em m/z 328 [M+H]+, correspondendo à molécula protonada, indicou

a fórmula molecular C19H21NO4 para o composto. Na região aromática do espectro de

RMN de 1H foi possível observar quatro sinais, constituindo dois grupos distintos: o

primeiro, com dois hidrogênios em δ 6,84 (1H, s) e 6,81 (1H, s), caracterizando um anel

aromático 1, 2, 4, 5, tetrassubstituído, contendo hidrogênios com relação para; e o

segundo, com dois dubletos em δ 6,87 (1H, d, J=8,4 Hz) e 6,92 (1H, d, J=8,4 Hz),

sugerindo a presença de um anel benzênico 1, 2, 3, 4, tetrasssubstituído, estando os dois

hidrogênios orto acoplados (Figura 35).

Na região alifática do espectro de RMN de 1H, observou-se um par de dubletos

em δ 4,73 (1 H, d, J=15,9 Hz) e 4,43 (1 H, d, J=15,9 Hz) correlacionado, em

experimento HSQC, a um carbono em δ 53,4, evidenciando a presença de um grupo

metileno desprotegido, compatível com o C-8 da ponte berberínica de alcaloides

protoberberínicos (BLANCHFIELD et al., 2003). No espectro de RMN de 1H foram

observados dois singletos em δ 3,87 (3H, s) e 3,88 (3H, s), com deslocamentos

característicos de metoxilas. No mapa de contorno HSQC observou-se que os sinais em

δ 3,87 (3H, s) e 3,88 (3H, s) estavam correlacionados, respectivamente, a sinais de

carbono em δ 56,6 e δ 60,7, confirmando a presença das metoxilas. Tais hidrogênios

correlacionam-se no mapa de contorno HMBC com os carbonos em δ 148,5 e 144,2

(Figura 35, 36 e 37). O espectro RMN de 1H revelou também a presença de um metino

em 4,67 (1H, dd; 11,7 e 4,2 Hz), que pela desblindagem foi associado ao átomo C-14

ligado ao N.

63

Figura 35: Espectro de RMN 1H (600 MHZ, CD3OD) da amostra OaF4.

Bruna_OAF4.013 integração.esp

7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0Chemical Shift (ppm)

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Norm

alize

d In

tens

ity

2.241.101.160.923.483.410.971.101.041.030.941.051.06

TMS

Methanol

2.99

653.

0168

3.02

523.

0447

3.24

453.

5110

3.52

363.

5312

3.54

353.

8662

3.88

364.

4191

4.44

524.

6569

4.66

464.

6768

4.68

454.

7184

4.74

49

6.81

016.

8356

6.86

706.

8810

6.91

346.

9274

Bruna_OAF4.013 integração.esp

6.95 6.90 6.85 6.80 6.75Chemical Shift (ppm)

0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

Norm

alize

d In

tens

ity

1.030.941.051.066.

8101

6.83

56

6.86

70

6.88

10

6.91

34

6.92

74

Bruna_OAF4.013 h.esp


0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Norm

alize

d In

tens

ity

2.241.101.160.923.483.410.971.101.04

Methanol

2.99

653.

0168

3.02

523.

0447

3.06

883.

2159

3.22

503.

2358

3.24

453.

2529

3.26

443.

2731

3.50

333.

5110

3.52

363.

5312

3.54

353.

5512

3.65

703.

6584

3.67

133.

6842

3.68

983.

8662

3.88

36

4.41

914.

4452

4.65

694.

6646

4.67

684.

6845

4.71

844.

7449

64

Na região alifática foram observados sinais de três metilenos, um dos quais com

hidrogênios em δ 3,03 (1H, m) e 3,24 (1H,ddd 17,0;12,0; 5,2), correlacionados no

HSQC com o carbono em δ 26,9, compatível com o átomo de carbono C-5. Outro

metileno apresentou hidrogênios em δ 3,53 (1H, td 12(x2); 4,6) e 3,84 (1H, m)

correlacionados a um carbono desprotegido em δ 52,2, foi atribuído ao C-6 ligado ao

nitrogênio. Estes dados são compatíveis com o segmento C-5-C-6-N, do anel B. O

metileno remanescente foi atribuído C-13, pelas correlações (J1) entre os sinais em δ

3,03(1H, m) e 3,67 (1H, m) / δ 33,8 (Figura 36 e 37).

Através dos dados de HSQC e HMBC foi possível definir as posições dos

hidrogênios aromáticos (Figura 36 e 37). Aos sinais δ 6,84 e 6,81 ligados aos carbonos

δ 113,0 e 112,5, respectivamente, foram atribuídos as posições H-1 e H-4 do anel A.

Essa atribuição foi confirmada pelas correlações a longa distância existentes entre o

hidrogênio em δ 6,84 (H-1) com o sinal do carbono em δ 60,9 (C-14), e do hidrogênio

em δ 6,81 (H-4) com o sinal do carbono em δ 26,9 (C-5). Aos hidrogênios em δ 6,87 e

6,92 ligados aos carbonos em δ 118,4 e 125,5, respectivamente, foram atribuídos as

posições H-11 e H-12. Pelo mapa de HMBC ainda foi possível determinar as posições

das metoxilas (Figura 37). O hidrogênio em δ 6,84 (H-1) apresentou correlação a longa

distancia com o carbono em δ 148,5, estabelecendo a posição C-3 para uma das

metoxila, enquanto o sinal em δ 6,87 (H-11) apresentou uma forte correlação com o

carbono em δ 144,2, evidenciando o segundo grupo metoxila na posição C-9. O sinal

em δ 6,81 (H-4) apresentou uma forte correlação com um carbono oxigenado em δ

146,5, justificando a localização de um grupo hidroxila na posição C-2, confirmando

assim, a presença de uma metoxila e uma hidroxila no anel A. Do mesmo modo o sinal

em δ 6,92 (H-12) apresentou correlação com o carbono oxigenado em δ 148,9,

indicando a existência do segundo grupo hidroxila na posição C-10.

65

Figura 36: Mapa de contorno HSQC (600 MHz, CD3OD) da amostra OaF4

7 6 5 4 3 2 1 0F2 Chemical Shift (ppm)

0

50

100

F1 C

hem

ical S

hift (

ppm

)

3.95 3.90 3.85F2 Chemical Shift (ppm)

55

60

F1 C

hem

ical

Shi

ft (p

pm)

δ 3,87

δ 56,6

δ 3,88

δ 60,7

6.95 6.90 6.85 6.80F2 Chemical Shift (ppm)

112

120

128 F1 C

hemi

cal S

hift (p

pm)

δ 6,84δ 6,92

δ 6,87

δ 6,81

δ 118,4δ 125,5

δ 113,0

δ 112,5

4.75 4.70 4.65 4.60 4.55 4.50 4.45 4.40 4.35F2 Chemical Shift (ppm)

47.5

50.0

52.5

55.0

F1 C

hem

ical

Shi

ft (p

pm)

δ 4,43

δ 53,4

δ 4,733.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 3.0

F2 Chemical Shift (ppm)

25

30

35

F1 C

hem

ical

Shi

ft (p

pm)

δ 33,8

δ 3,03

δ 3,67

δ 3,24

δ 26,9

3.95 3.90 3.85 3.80 3.75 3.70 3.65 3.60 3.55 3.50 3.45F2 Chemical Shift (ppm)

40

45

50

F1 C

hem

ical S

hift (

ppm

)

δ 3,84 δ 3,53

δ 52,2

66

Figura 37: Mapa de contorno HMBC (600 MHz, CD3OD) da amostra OaF4.

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0F2 Chemical Shift (ppm)

0

50

100

150

200

F1

Ch

em

ica

l S

hift (p

pm

)

3.95 3.90 3.85 3.80F2 Chemical Shift (ppm)

140

145

150

F1

Ch

em

ical S

hift (p

pm

)

δ 3,88

δ 144,2

δ 3,87

δ 148,5

6.95 6.90 6.85 6.80 6.75 6.70F2 Chemical Shift (ppm)

135

140

145

150

F1

Ch

em

ical S

hift (p

pm

)δ 6,81δ 6,84δ 6,87δ 6,92

δ 146,5

δ 148,5δ 148,9

δ 144,2

6.900 6.895 6.890 6.885 6.880 6.875 6.870 6.865 6.860 6.855F2 Chemical Shift (ppm)

118

120

122

124

F1

Ch

em

ical S

hift (p

pm

)

δ 6,87

δ 122,8

6.95 6.90 6.85 6.80 6.75F2 Chemical Shift (ppm)

30

40

50

60

F1

Ch

em

ical S

hift (p

pm

)

δ 6,81

δ 6,84δ 6,92

δ 26,9δ 33,8

δ 60,9

67

Na tabela 5 são apresentados os dados completos de RMN1H e dos mapas de

contorno HSQC e HMBC. A partir da comparação dos dados obtidos, com os existentes

na literatura (COSTA et al., 2015) foi possível identificar a amostra OaF4 como sendo o

alcaloide tetraidroprotoberberínico estefolidina (Figura 38). Este alcalóide já foi

anteriormente descrito em espécies da família Annonaceae como Annona cherimolia,

Fusaea longifolia e Alphonsea sclerocarpa (VILLAR et al., 1984; TADIC et al., 1987;

TAVARES et al., 2005).

Figura 38: Estrutura do alcaloide estefolidina

Figura 39: Principais correlações observadas para a amostra OaF4

N

CH3O

HO

OCH3

OH

1

2

43

5

6

78

9

1011

12

14

13

14a

4a

8a12a

N

CH2O

HO

OH

OCH2H

H HH

H

H H

H

6,81

112,5

148,5

146,5

3,87

56,6

3,03

3,24

26,9

124,6

3,88

60,7144,2

N

CH2O

HO

OH

OCH2H

H

H

H HH

H

6,84

113,0

148,5

146,5

52,2122,3

60,9

144,24,67

60,9

33,8

122,3

H

4,43

4,7353,4

122,8

6,87

6,92

121,5

148,9

68

Tabela 5: Dados de RMN 1H, HSQC e HMBC da amostra OaF4

OAF4 (Estefolidina)

Posição 1H δ (mult., J emHz)a

1H δ (mult., J emHz)b

HSQC (1H-13C)c

HSQC (1H-13C)b

HMBC (1H-13C)

1 6,84 (1H, s) 6,77 (1H, s) 113,0 112,0 60,9; 122,3; 148,5

2 - - 146, 5 144,6 -

3 - - 148,5 146,3 -

4 6,81 (1H, s) 6,61(1H, s) 112, 5 111,4 26,9; 124, 6; 146, 5

4a - - 122,3 125,5 -

5 3,03 (1H, m) 2,69 (1H, m) 26,9 28,7 -

5 3,24 (1H, ddd, 17; 12;5,2)

3,11 (1H, m) 26,9 28,7 122,3; 124,6

6 3,53 (1H, dt, 12(x2);4,2)

2,67 (1H, m) 52,2 52,0 -

6 3,84 (1H, m) 3,21 (1H, m) 52,2 52,0 -

8 4,43 (1H, d, 15,9) 3,55 (1H, d, 15,6) 53,4 54,1 122,8; 144,2

8 4,73 (1H, d, 15,9) 4,20 (1H, d, 15,6) 53,4 54,1 122,8; 144,2

8a - - 121,5 127,9 -

9 - - 144,2 143,8 -

10 - - 148,9 147,5 -

11 6,87 (1H, d, 8,4) 6,76 (1H, d, 8,3) 118,4 115,4 122, 8; 144,2

12 6,92 (1H, d, 8,4) 6,80 (1H, d, 8,3) 125,5 124,7 33, 8; 121, 5; 148, 9

12a - - 122,8 126,4 -

13 3,03 (1H, m) 2,78(1H,dd,16,0;11,4)

33,8 35,8 60,9; 124,6

13 3,67 (1H, m) 3,28 (1H, dd, 16,0;3,9)

33,8 35,8 -

14 4,67 (1H, dd, 11,7;4,2)

3,57(1H, dd, 11,4;3,9)

60,9 59,6 33,8; 124,6

14a - - 124, 6 129,9 -

3-OCH3 3,87 (3H, s) 3,86 (3H, s) 56,6 56,0 148,5

9-OCH3 3,88 (3H, s) 3,83(3H, s) 60,7 60,2 144,2

a O experimento foi realizado a 600MHz para 1H em CD3OD, utilizando o TMS como padrão interno.b Dados da literatura de acordo com Costa et al., 2015 (1H em CDCl3 + gotas de CD3OD 400 MHz)c Para os carbonos protonados foram usados os dados de HSQC e carbonos quaternários foram usadosdados de HMBC.

69


A fração codificada como OaF8 (15,4 mg) apresentou-se como um sólido

amorfo. A análise de massas de OaF8 (Figura 40) evidenciou a presença do íon base em

m/z 342 [M+H]+, correspondendo à molécula protonada, indicando a fórmula

molecular C20H23NO4 para o composto. O íon base foi submetido à análise de MS2

(Figura 41), sendo observada uma elevada perda de massa (164 Da), resultando no pico

de m/z 178. Esse mesmo padrão foi anteriormente observado para o alcaloide

estefolidina (OAF4; Figura 38). Foi possível propor, pela diferença de massa observada

entre estas substâncias, a presença de duas metoxilas no anel D, para a amostra de m/z

342.



200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

342,34

198,03 226,02 408,24340,18250,09 284,07 352,16264,02 312,13 366,21 388,28 422,17 494,24453,49 478,43436,25

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

178,09

192,10342,18

163,09151,11 325,12294,16 310,13161,11 190,15 204,06119,04 265,16135,08 281,15107,07 255,15237,24 340,10218,1997,92

70

No espectro RMN de 1H na região dos aromáticos (Figura 42) observou-se

quatro sinais em δ 6,84 (1H, s), 6,81 (1H, s), 7,05 (1H, d, 8,6 Hz) e 7,07 (1H, d, 8,6 Hz),

reforçando a similaridade com o alcaloide anteriormente determinado (OAF4). Através

dos espectros de RMN de 1H, HSQC e HMBC foi constatado que as três metoxilas, em

δ 3,86 (3H, s), 3,89 (3H, s) e 3,87 (3H, s) se ligavam (J1) aos carbonos em δ 56,7, 60,4 e

56,7, e acoplavam a longa distância com os carbonos em δ 147,6, 145,6 e 151,8,

respectivamente (Figura 42, 43 e 44).

O mapa de contorno HMBC permitiu a determinação da posição de tais grupos.

O hidrogênio em δ 6,84 (H-1) correlacionado a longa distância com o carbono em δ

147,6, localizou uma metoxila em C-3. Do mesmo modo, os hidrogênios em δ 7,05 (H-

11) e 7,07 (H-12) correlacionados a longa distância com os carbonos em δ145,6 e 151,8

indicaram, respectivamente, as posições das duas outras metoxilas, em C-9 e C-10, no

anel D. A correlação do sinal em δ 6,81 (H-4) com o carbono em δ 146,7 definiu a

posição da hidroxila na posição C-2, adjacente à metoxila, no anel A (Figura 44).

Como na estrutura anterior (OaF4) foi observado na região alifática do espectro

de RMN de 1H, um par de dubletos em δ 4,73 (1 H, d, 15,8 Hz) e 4,39 (1 H, d, 15,8 Hz)

correlacionado, em experimento HSQC, a um carbono em δ 53,2, evidenciando a

presença de um grupo metileno desprotegido, compatível com o C-8 da ponte

berberínica de alcaloides protoberberínicos (BLANCHFIELD et al., 2003) (Figura 42 e

43). Os demais grupamentos alifáticos (metino e metilenos) revelaram deslocamentos

químicos similares ao estefolidina (OaF4).

71

Figura 42: Espectro de RMN 1H (600 MHz, CD3OD) da amostra OaF8.

Bruna_OAF8.013_h.esp

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0Chemical Shift (ppm)

0

0.25

0.50

0.75

1.00

No

rma

lize

d In

ten

sity

2.531.281.450.983.023.322.831.001.071.161.340.980.931.16

TMS

METHANOL-d4

TMS

Methanol

Methanol

3.0

17

33

.037

23

.045

63

.065

53

.242

23

.482

13

.494

73

.502

43

.515

03

.870

53

.873

43

.897

74

.378

44

.404

74

.625

64

.631

94

.715

94

.742

2

6.8

11

96

.844

57

.044

87

.059

47

.063

77

.078

0


7.05 7.00 6.95 6.90 6.85 6.80Chemical Shift (ppm)

0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

No

rma

lize

d In

ten

sity

1.340.980.931.16

6.8

11

9

6.8

44

5

7.0

44

8

7.0

59

47

.063

7

7.0

78

0


4.5 4.0 3.5 3.0Chemical Shift (ppm)

0

0.05

0.10

No

rma

lize

d In

ten

sity

2.531.281.450.983.023.322.831.001.071.16

METHANOL-d4

Methanol

2.9

987

3.0

173

3.0

372

3.0

456

3.0

655

3.2

140

3.2

233

3.2

339

3.2

422

3.2

522

3.2

632

3.2

711

3.4

741

3.4

821

3.4

947

3.5

024

3.5

150

3.5

216

3.5

412

3.6

891

3.6

980

3.7

070

3.7

173

3.7

279

3.8

705

3.8

734

3.8

977

4.3

784

4.4

047

4.6

256

4.6

319

4.6

452

4.6

522

4.7

159

4.7

422

72

Figura 43: Mapa de contorno HSQC (600 MHz, CD3OD) da substância OaF8.


0

50

100

150

F1

Ch

em

ica

l Sh

ift (

ppm

)

3.90 3.85 3.80F2 Chemical Shift (ppm)

55

60

65

F1

Ch

em

ical S

hift (.

..

δ 3,89

δ 3,87 δ 3,86

δ 60,4

δ 56,7

4.75 4.70 4.65 4.60 4.55 4.50 4.45 4.40 4.35F2 Chemical Shift (ppm)

47.5

50.0

52.5

55.0

F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)

δ 4,39δ 4,73

δ 53,2

73

Figura 44: Mapa de contorno HMBC (600 MHz, CD3OD) da substância OaF8.

3.91 3.90 3.89 3.88 3.87 3.86 3.85 3.84 3.83 3.82 3.81 3.80 3.79 3.78F2 Chemical Shift (ppm)

136

144

152

F1 C

hem

ical

Shi

ft (..

.

δ 3,89δ 3,87

δ 3,86

δ 147,6

δ 151,8

δ 145,6


0

50

100

150

200

F1 C

hem

ical

Shi

ft (p

pm)

7.05 7.00 6.95 6.90 6.85 6.80 6.75F2 Chemical Shift (ppm)

144

152

160

F1 C

hem

ical

Shi

ft (..

.

δ 7,07 δ 7,05δ 6,84 δ 6,81

δ 145,6

δ 151,8

δ 146,7

δ 147,6

74

Na tabela 6 são apresentados os dados completos RMN 1H e dos mapas de

contorno HSQC e HMBC. A partir da comparação dos dados obtidos, com os existentes

na literatura (PARK et al., 2011) foi possível identificar a amostra OaF8 como o

alcaloide tetraidroprotoberberínico isocoripalmina (Figura 45). O alcaloide

isocoripalmina, também denominado tetraidrocolumbamina (JEONG et al., 2012), já foi

anteriormente descrito em espécies da família Annonaceae (LEBOEUF et al., 1982a;

LÓPEZ et al., 2002).

Figura 45: Estrutura do alcaloide isocoripalmina.

Figura 46: Principais correlações observadas para amostra OaF8.

N

CH3O

HO

OCH3

OCH3

1

2

34

4a5

6

7

8

8a

9

1011

12

12a13

14

14a

N

CH2O

HO

OCH2

OCH2H

H HH

H

H H

H

H

6,81

112,5

147,6

146,7

3,86

56,7

3,02

3,24

27,0

124,8

3,89

60,4145,6

N

CH2O

HO

OCH2

OCH2H

H

H

H HH

H H

6,84

113,5

147,6

146,7

52,1122,5

60,9

145,64,64 34,1

122,5

H

4,39

4,7353,2

124,4

7,05

7,07

123,7

151,8

3,87

151,856,7

114,3125,3

75

Tabela 6: Dados de RMN 1H, HSQC e HMBC da amostra OaF8.

OAF8 (Isocoripalmina)

Posição 1H δ (mult., J emHz)a

1H δ (mult., J emHz)b

HSQC (1H-13C)c

HSQC (1H-13C)b

HMBC (1H-13C)

1 6,84 (1H, s) 7,24 (1H, s) 113, 5 113,8 60,9; 122,5; 147,6

2 - - 146,7 146,4

3 - - 147,6 147,1

4 6,81(1H, s) 6,75 (1H, s) 112, 5 112,2 27,0; 124,8; 146,7

4a - - 122,5 125,5

5 3,02 (1H, m) 2,58 (1H, m) 27,0 29,5 124,8

5 3,24 (1H, m) 3,18 (1H, m) 27,0 29,5 124,8

6 3,50 (1H, m) 2,58 (1H, m) 52,1 52,1 -

6 3,84 (1H, m) 3,11 (1H, m) 52,1 52,1 -

8 4,73 (1H, d, 15,8) 4,40 (1H, d, 16,0) 53,2 54,6 60,9; 124,4; 145,6

8 4,39 (1H, d,15,8) 3,47 (1H, m) 53,2 54,6 -

8a - - 123,7 128,6 -

9 - - 145,5 145,5 -

10 - - 151,8 150,6 -

11 7,05 (1H, d, 8,6) 6,84 (1H, d, 8,4) 114, 3 111,5 124,4; 145,6

12 7,07 (1H, d, 8,6) 6,90 (1H, d, 8,4) 125, 3 124,2 34,1; 123,7; 151,8

12a - - 124,4 129,3 -

13 3,70 (1H, m) 3,52 (1H, m) 34,1 37,0 -

13 3,02 (1H, m) 2,96 (1H,dd,15,6;11,12)

34,1 37,0 -

14 4,64 (1H, dd 12,2 e4,2)

3,34 (1H, dd,15,6:3,2)

60, 9 59,7 124,8

14ª - - 124,8 131,1 -

3-OCH3 3,86 (3H, s) 3,74 (3H, s) 56, 7 55,9 147,6

9-OCH3 3,89 (3H, s) 3,86 (3H, s) 60, 4 60,0 145,6

10-OCH3 3,87 (3H, s) 3,71 (3H, s) 56, 7 55,9 151,8

a O experimento foi realizado a 600MHz para 1H em CD3OD utilizando o TMS como padrão interno.b Dados da literatura de acordo com Park et al., 2011 (1H em CDCl3; 400 MHz)c Para os carbonos protonados foram usados os dados de HSQC e carbonos quaternários foram usadosdados de HMBC.

76


A fração codificada como OaF9 (1,0 mg) apresentou-se como um sólido amorfo

amarelado. No espectro de íons totais observou-se a presença de um pico base de m/z

286 (Figura 47), correspondendo à molécula protonada, indicando a fórmula molecular

C17H19NO3 para o composto. Através do espectro de MS2 foi possível observar perda

inicial de 17 Da (-NH3) (Figura 48), anteriormente descrita em estruturas com ausência

de N-metila, além do íon em m/z 107 que indica elevada perda de massa, sugerindo

tratar-se de uma estrutura benziltetraidroisoquinolínica.

Figura 47: Espectros de massas da amostra OaF9.


220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

286,24

287,45

282,32 288,32269,10222,92 248,05 255,57229,47 342,17 356,04313,94300,39 392,24326,45 386,24372,67360,89

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

269,09

107,03

143,06 178,12137,09 286,12237,14145,07254,08 271,07151,11 258,06163,07 209,13192,18121,01 250,91226,21127,13 285,1394,07

77

No espectro de RMN de 1H (Figura 49) foram observados 6 sinais de

hidrogênios aromáticos, constituindo dois sistemas de spins, situado em anéis

benzênicos diferentes. O primeiro evidenciou a presença de dois dubletos distorcidos,

típicos de sistemas AA’BB’, apresentando dois pares de hidrogênios quimicamente

equivalentes, mas não magneticamente equivalentes, em δ 7,20 (2H, m) e 6,79 (2H, m),

caracterizando um anel benzênico para-dissubstituído; e o segundo apresentou um

sistema AB, exibindo dois dupletos orto-acoplados em δ 6,95 (1H, d, 8,2 Hz), e 6,71

(1H, d, 8,2 Hz).

O sinal de um duplo dupleto de um hidrogênio metínico em δ 5,00 (1H, dd, 10 e

3,2), indicou a presença do segmento H2C-α-C-1-N, característico de alcaloides

benziltetraidroisoquinolínicos. Estes dados aliados à presença do íon m/z 107

evidenciado no espectro de massas, confirmaram a existência de um grupo benzílico

substituído com uma hidroxila no anel aromático. Verificou-se ainda, o sinal em δ 3,87

(3H) típico de metoxila, enquanto os hidrogênios metilênicos concentraram-se na região

δ 3,57-2,96.

No mapa de contorno HSQC (Figura 50) observou-se as correlações dos

hidrogênios em δ 6,95 e 6,71, com os carbonos em δ 112,1, e 119,7, respectivamente.

Foi também observada a correlação de hidrogênios metilênicos em δ 3,10 (1H) e 2,96

(1H) com o sinal carbono δ 25,7; e em 3,42 (1H) 3,55 (1H), com o sinal do carbono em

δ 38,5. Tais metilenos são compatíveis, respectivamente, com o segmento C-4-C-3-N,

do anel B.

78

Figura 49: Espectro de RMN de 1H (600 MHz, CD3COCD3) de OaF9.

Afonso_286_9.011.esp


0

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

Nor

mal

ized

Inte

nsity

1.351.491.161.301.291.353.471.12

M06(s) M08(m)

M07(m)

M05(dd) M10(m)M09(m)

M12(m)

M11(m)

3.07

723.

0946

3.10

443.

1285

3.13

693.

1533

3.54

553.

5508

3.55

703.

5703

3.57

593.

5864

3.59

44

3.87

07

4.98

764.

9928

5.00

405.

0096


7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0Chemical Shift (ppm)

0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Nor

mal

ized

Inte

nsity

1.351.491.161.301.291.353.471.121.142.001.062.27

ACETONE-d6

TMS

M06(s)M04(m)

M02(d)

M01(d)

M03(m)

M07(m)

M05(dd) M10(m)

M09(m)

M12(m)

M11(m)

2.05

00

3.09

463.

1044

3.12

853.

1369

3.15

333.

5455

3.55

083.

5570

3.57

033.

5759

3.58

64

3.87

07

4.98

764.

9928

5.00

405.

0096

6.70

006.

7136

6.78

286.

7971

6.94

276.

9563

7.19

567.

2096


7.25 7.20 7.15 7.10 7.05 7.00 6.95 6.90 6.85 6.80 6.75 6.70 6.65 6.60 6.55 6.50 6.45Chemical Shift (ppm)

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

Nor

mal

ized

Inte

nsity

1.142.001.062.27

M04(m)M02(d) M01(d)M03(m)

6.70

006.

7136

6.78

286.

7863

6.79

366.

7971

6.94

276.

9563

7.19

107.

1956

7.20

967.

2144

79

Figura 50: Mapa de contorno HSQC (600 MHz, CD3COCD3) da amostra OaF9.


0

50

100

F1 C

hem

ical S

hift (

ppm

)

7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5F2 Chemical Shift (ppm)

100

120

F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)

δ 6,79

δ 6,71δ 6,95δ 7,20

δ 116,5δ 131,6

δ 119,7

δ 112,1

3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 3.0 2.9 2.8F2 Chemical Shift (ppm)

16

24

32

40

F1 C

hem

ical

Shi

ft (p

pm)

δ 2,96

δ 25,7

δ 38,5

δ 3,10δ 3,42δ 3,55

80

Figura 51: Mapa de contorno HMBC (600 MHz, CD3COCD3) da amostra OaF9.


0

50

100

150

F1 C

hem

ical

Shi

ft (p

pm)


142.5

145.0

147.5

150.0

F1 C

hem

ical

Shi

ft (p

pm)

δ 146,6

δ 3,87

3.4 3.3 3.2 3.1 3.0 2.9 2.8F2 Chemical Shift (ppm)

118

119

120

F1 C

hemi

cal S

hift (p

pm)

δ 2,96δ 3,10

δ 119,7


100

120

140

160

F1 C

hemi

cal S

hift (p

pm)

δ 6,79

δ 6,71δ 6,95δ 7,20

δ 146,6

δ 120,3

δ 143,6δ 126,0

δ 157,6

δ 116,5

δ 131,6

81

Através do mapa de contorno HMBC (Figura 51) foi observada a correlação a

longa distância dos hidrogênios metilenicos em δ 3,10 (1H, m) e 2,96 (1H, m) com o

carbono em δ 119,7, atribuído ao C-5. No mesmo mapa, as correlações do hidrogênio

em δ 6,95 e o carbono não hidrogenado em δ 126,0 foram compatíveis com o H-6 e o C-

4a, respectivamente. Em adição, as correlações dos hidrogênios metoxílicos em δ 3.87

(3H) e o hidrogênio aromático em δ 6,71 (H-5) com o carbono em δ 146,6, definiram a

posição da metoxila no carbono C-7 do anel A. A correlação entre o hidrogênio H-6 e o

sinal do carbono oxigenado em δ 143,3, posicionaram uma das hidroxilas em C-8.

Na tabela 7 são apresentados os dados completos de RMN. No mapa de HSQC

foram observadas correlações entre os hidrogênios aromáticos em δ7,20 (2H) e 6,79

(2H) e os carbonos em δ 131,6 e 116,5, respectivamente, confirmando tratar-se de um

sistema simétrico, correspondendo aos carbonos C-2’, C-6’, C-5’ e C-3’

respectivamente. Ainda no mapa de HMBC foi possível observar correlação destes

hidrogênios com o carbono oxigenado em δ 157,6 (Tabela 7), atribuído ao C-4’,

confirmando a presença do grupo para-hidroxibenzil na molécula.

A partir destas observações foi possível caracterizar a amostra codificada como

OaF9 como o alcaloide benziltetraidroisoquinolínico norjuzifina (Figura 52), sendo este

alcaloide anteriormente isolado de Porcelia macrocarpa (Annonaceae) (CHAVES et

al., 2001).

Figura 52: Estrutura do alcaloide norjuzifina.

NH

HO

H3CO

H

H

OH

87

6

5 4

3

21

4a

4b

1'

2'

3'4'

5'6'

82



a O experimento foi realizado a 600MHz para 1H em CD3COD3, utilizando o TMS como padrão interno.b Dados da literatura de acordo com Chen et al., 2001 ( CD3OD, 400 MHz)c Para os carbonos protonados foram usados os dados de HSQC e carbonos quaternários foram usadosdados de HMBC

NH

HO

HOH3CO

H H H

H

H

H

H

2,963,106,71

119,725,7

38,5126,0

NH

HO

HOH3CO

H

H H

H

H

H

H

H

6,71

119,725,7

38,5126,0

3,55

3,42146,6

56,7

3,87

6,95

112,1

143,6

146,6

3,13

3,57

37,2

53,8

127,8

131,6

120,3

6,79

116,5

6,79116,5

127,8

157,67,20

7,20

131,6

131,637,2131,6

7,20

6,79

116,5

116,5

OaF9 (Norjuzifina)

Posição 1H δ (mult., J em Hz)a 1H δ (mult., J em Hz)b 13Cc HMBCc

1 5,00 (1H, dd, 10 e 3,2) - 53,8 -

3 3,42 (1H, dt, 12,4; 5,2(x2)) 2,94 (1H, m) 38,5 25, 7, 53,8 e126,0

3 3,55 (1H, m) 3,28 (1H, m) 38,5

4 2,96 (1H, dt, 16,7; 4,6 (x2)) 2,71 (1H, m) 25,7 38,5, 120,3;119,7 e 126,0

4 3,10 (1H, m) 2,86 (1H, m) 25,7

4a - - 126,0 -

4b - - 120,3 -

5 6,71 (1H, d, 8,2) 6,61 (1H, d, 8,2) 119,7 25,7, 120,3 e146,6

6 6,95 (1H, d, 8,2) 6,83 (1H, d, 8,2) 112,1 126,0, 143,6 e146,6

7-OCH3 3,87 (3H, s) 3,85 (3H, s) 56,7 146,6

8 - - 143,6

Α 3,13 (1H, dd, 14,9 e 9,9) 2,82 (1H, dd, 14.2 e 10.2) 37,253,8, 127,8 e

131,6α’ 3,57 (1H, m) 3,28 (1H, dd, 14,8 e 3) 37,2

1’ - - 127,8 -

2’ 7,20 (1H, m) 7,13 (1H, dd, 8,4 e 2,8) 131,6 37,2, 131,6 e157,6

3’ 6,79(1H, m) 6,77 (1H, dd, 8,4 e 2,8) 116,5 116,5, 127,8 e157,6

4’ - - 157,6

5’ 6,79(1H, m) 6,77 (1H, dd, 8,4 e 2,8) 116,5 116,5, 127,8 e157,6

6’ 7,20 (1H, m) 7,13 (1H, dd, 8,4 e 2,8) 131,6 37,2, 131,6 e157,6

83

5.8.4 Determinação estrutural da amostra OaF11.

A fração codificada como OaF11 (0,5 mg) apresentou-se como um sólido

amorfo. A análise de massas revelou a presença do pico base de m/z 268 (Figura 54),

correspondente à molécula protonada, indicando a fórmula molecular C17H17NO2 para

o composto. Através da fragmentação em MSn (Figura 55), o mesmo apresentou uma

perda inicial de 17 Da seguida de perdas sequencias de 32 e 28 Da. De acordo com

Stévigny e colaboradores (2004) em alcaloides aporfínicos perda 32 Da seguida de 28

Da é referente ao grupo CH3O e OH nas posições vicinais, podendo-se sugerir a

presença de um alcaloide aporfínico sem metilação no nitrogênio e com metoxila e

hidroxila adjacente no anel A, não apresentando substituição no anel D.


200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

268.10

269.11

251.19223.19 292.16266.25235.19 282.17197.20 209.19 312.17 340.23328.18297.13 391.02356.16 372.15 399.21

84

Figura 55: Espectro de MSn para o íon m/z 268 [M+H]+

No espectro de RMN de 1H foi possível observar na região de aromáticos

(Figura 56) sinais em δ 7,35 (2H, m), 7,29 (1H, m) e 8,36 (1H, d, 7,5), característicos do

anel D de esqueletos aporfínicos não substituídos, além da presença de um singleto em

δ 6,79 (1H, s) característico de H-3 do anel A, dissubstituído. A presença de sinais de

dois hidrogênios em δ 3,01 (m) e 3,21 (dd, 13,8 e 4,3 Hz), atribuídos aos hidrogênios do

C-7, ratificaram a natureza aporfínica do composto.

No espectro de RMN de 1H (Figura 56) ainda foi observado um sinal em 3,61

(3H, s) sinal característico de metoxila, confirmando as informações obtidas pela

investigação de fragmentação (Figura 55) do espectro de massas, que ainda indicou a

presença de uma hidroxila adjacente à mencionada metoxila. A estrutura foi confirmada

através da comparação dos dados de RMN de 1H com os dados existentes na literatura,

permitindo identificar a amostra OaF11 como o alcaloide asimilobina (Figura 57). Os

sinais completos de RMN da molécula são apresentados na tabela 8.

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260m/z

0

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

0

20

40

60

80

100251,06

268,14219,10 240,12 253,10211,98 225,08194,03136,12 165,16144,21 179,0292,07 130,10111,11219,08

251,14191,13 221,13 236,11205,15177,23167,22191,14

219,11

201,16 218,02189,05

NL:2,76E2

NL:4,75E1

NL:7,41-28 Da

-32 Da

-17 DaMS2

MS3

MS4

85

Figura 56: Espectro de RMN 1H (600 MHz, CD3COCD3) amostra OaF11.

Bruna_OAF11.011.esp

8 7 6 5 4 3 2 1 0Chemical Shift (ppm)

0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Nor

mal

ized

Inte

nsity

1.141.171.090.840.883.501.191.111.001.152.421.07

ACETONE-d6M02(s)

TMS

M05(s)M01(d) M04(m)

M11(m)M03(m)

M06(m) M12(m)

M07(m)

M09(m)

M10(m)

2.05

00

2.94

352.

9498

3.01

323.

0366

3.19

383.

2011

3.21

663.

2239

3.35

503.

6122

3.73

043.

7393

4.28

054.

2858

4.30

174.

3102

6.78

517.

2738

7.28

607.

2963

7.29

837.

3395

7.35

647.

3686

8.35

698.

3694

Bruna_OAF11.011.esp

8.0 7.5 7.0 6.5Chemical Shift (ppm)

0

0.005

0.010

0.015

Nor

mal

ized

Inte

nsity

1.001.152.421.07

M02(s)M01(d) M04(m)

M03(m)

6.78

51

7.27

387.

2860

7.29

637.

2983

7.33

957.

3564

7.36

86

8.35

698.

3694

Bruna_OAF11.011.esp


0

0.005

0.010

0.015

Nor

mal

ized

Inte

nsity

1.141.171.090.840.883.501.191.11

ACETONE-d6M05(s) M08(dd)

M11(m)

M06(m) M12(m)

M07(m)M09(m)

M10(m)

2.05

00

2.92

172.

9435

2.94

622.

9498

2.99

013.

0132

3.03

663.

1938

3.20

113.

2166

3.22

393.

2817

3.32

763.

3342

3.34

743.

3550

3.36

82

3.61

22

3.73

043.

7363

3.73

933.

7502

3.75

98

4.28

054.

2858

4.30

174.

3056

4.31

02

86

O alcaloide asimilobina é frequentemente encontrado em gêneros da família

Annoncaeae, como Annona, Unonopsis e Xylopia (LEBOEUF et al., 1982b; DA CRUZ

et al., 2011; YOSHIDA et al., 2013; RABÊLO et al., 2015). Estudos realizados por

Costa e colaboradores (2013; 2015), com as espécies Annona salzmannii e Annona

pickelii, evidenciaram resultados satisfatórios, relacionado à atividade antioxidante para

o alcaloide asimilobina.

Figura 57: Estrutura do alcaloide asimilobina

Tabela 8: Dados de RMN 1H da amostra OaF11.

OAF11 (Asimilobina)

Posição 1H δ (mult., Jem Hz)a

1H δ (mult., Jem Hz)b

1 -1a -2 -3 6,79 (1H, s) 6,73 (1H, s)3a -3b -4

2,93 (1H, m) 2,75 (1H, m)4 3,28 (1H, m) 3,04 (1H, m)5 3,35 (1H, m) 3,04 (1H, m)5 3,74 (1H, m) 3,49 (1H, m)6a 4,30 (1H, m) 3,93 (1H, m)7 3,01 (1H, m) 2,85 (1H, m)7 3,21 (1H, dd,

13,8 e 4,3)2,97 (1H, dd,13,8 e 4,4)

7a - -8 7,35 (1H, m) 7,28 (1H, m)9 7,29 (1H, m) 7,25 (1H, m)10 7,35 (1H, m) 7,33 (1H, m)11 8,36 (1H, d,

7,5)8,29 (1H, 7,4)

11a -1-OCH3 3,61 (3H, s) 3,59 (3H, s)

a O experimento foi realizado a 600MHz para 1H em CD3COCD3, utilizando o TMS como padrão interno.b Dados da literatura de acordo com Soares et al., 2015b (1H em CDCl3; 6000 MHz).

NH

HO

CH 3O 1

23 4

5

6

7

8

3a3b

6a

910

11

11a1a

7a

87



amorfo de coloração marrom. O espectro de íons totais desta amostra (Figura 58)

evidenciou um pico base de m/z 282 [M+H]+, correspondente à molécula protonada,

indicando a fórmula molecular C18H19NO2 para o composto. No espectro de MSn

(Figura 59) foi possível observar uma perda inicial de 17 Da, seguida de perdas

sequenciais de 15 Da. A perda inicial de 17 Da sugere a presença de hidrogênio ligado

ao nitrogênio no anel B do esqueleto aporfínico, enquanto que as perdas sequenciais de

15 Da indicam a presença de metoxilas adjacentes no anel A (STÉVIGNY et al., 2004).

Estas evidências apontam para uma estrutura aporfínica sem N-metilação, com

metoxilas adjacentes e sem substituição no anel D.


200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

282.10

265.19 340.11235.22207.16 251.19 312.14219.23 296.17 328.23191.11 390.93356.01 422.27372.23 398.20

88


O espectro de RMN de 1H apresentou-se muito similar ao de OaF11, exceto pela

presença de mais uma metoxila, sugerida pelos espectros de massas. Foram observados

sinais referentes aos hidrogênios aromáticos (Figura 60) em δ 7,23 (2H, m), 7,35 (1H,

m) e 8,40 (1H, d, J=7,8 Hz), característicos do anel D de esqueletos aporfínicos não

substituídos. O singleto em δ 6,68 (1H, s) possui deslocamento característico da posição

H-3 do esqueleto aporfínico com duas substituições no anel A. A presença de sinais de

dois hidrogênios em δ 3,13 (m) e 3,18 (m), atribuídos aos hidrogênios do C-7,

ratificaram a natureza aporfínica do composto. No espectro de RMN de 1H são ainda

observados dois singletos (Figura 60) em δ 3,68 (3H, s) e 3,91(3H, s) cada um

integrando para três hidrogênios, sinal característico de metoxilas.

Nos mapas de contorno de HSQC e HMBC (Figura 61 e 62) verifica-se que o

hidrogênio em δ 6,68 ligado ao carbono em δ111,7 (C-3), se correlaciona com os

carbonos em δ 145,8, 153,7 e 25,6, confirmando a existência de uma dissubstituição no

anel A. Este fato é também ratificado nos mapas de contorno de HSQC e HMBC

(Figura 61 e 62), onde os sinais das metoxilas em δ 3,68 e 3,91, ligadas aos carbonos

em δ 60,2 e 55,9 (HSQC), apresentam correlações J3 com os carbonos em δ 145,8 (C-1)

e 153,7 (C-2) respectivamente. Outras correlações para a amostra OaF13 estão descritas

na tabela 9.

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280m/z

0

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

0

20

40

60

80

100265,09

282,18

251,19235,89

250,14

234,11

236,02233,09222,13 265,07205,11189,99235,09

250,18218,09207,12193,19179,16 232,14165,32

NL:1,19E2

NL:7,59E2

NL:2,82E2

-17 Da

-15Da

-15 Da

MS2

MS3

MS4

89

Figura 60: Espectro de RMN 1H (600 MHz, CDCl3) da amostra OaF13.

Bruna_OAF13.011.esp


0

0.25

0.50

0.75

1.00

Nor

mal

ized

Inte

nsity

1.141.491.441.371.213.211.183.251.241.002.201.181.04

TMSM01(s) M08(s)

M06(s)

M02(d) M03(m)

M04(m)

M13(m)

M09(m)

M12(m)M07(m)

M05(m)

M10(m)

M11(m)

0.00

00

2.92

322.

9288

2.95

162.

9567

3.12

793.

1506

3.17

503.

4057

3.68

433.

7707

3.78

433.

9074

4.25

564.

2668

4.27

56

6.67

63

7.23

607.

2492

7.25

837.

2611

7.33

877.

3415

7.35

237.

3635

8.39

778.

4109

Bruna_OAF13.011.esp

8.0 7.5 7.0Chemical Shift (ppm)

0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

Nor

mal

ized

Inte

nsity

1.002.201.181.04

M01(s)M02(d) M03(m) M04(m)

6.67

63

7.20

647.

2188

7.23

607.

2492

7.25

837.

2611

7.33

877.

3415

7.35

237.

3635

8.39

778.

4109

Bruna_OAF13.011.esp


0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Nor

mal

ized

Inte

nsity

1.141.491.441.371.213.211.183.251.24

M08(s)M06(s) M13(m) M09(m)

M12(m)M07(m)

M05(m) M10(m)

M11(m)

2.92

322.

9288

2.95

162.

9567

3.10

633.

1167

3.12

793.

1382

3.15

063.

1750

3.18

943.

2358

3.25

743.

2686

3.28

103.

4057

3.42

69

3.68

433.

7707

3.78

433.

8023

3.90

74

4.25

564.

2668

4.27

56

90

Figura 61: Mapa de contorno HSQC (600 MHz, CDCl3) da amostra OaF13.

12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0F2 Chemical Shift (ppm)

0

50

100

150

F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)


105

110

115

F1

Ch

em

ical S

hift (pp

m)

δ 6,68 / H-3

δ 111,7 / C-3


55

60

65

70

F1

Ch

em

ical S

hift (p

pm

)

δ 3,91 δ 3,68

δ 55,9

δ 60,2

91

Figura 62: Mapa de contorno HMBC (600 MHz, CDCl3) da substância OaF13.

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0F2 Chemical Shift (ppm)

0

50

100

150

F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)

6.80 6.75 6.70 6.65 6.60 6.55 6.50 6.45F2 Chemical Shift (ppm)

50

100

150

F1

Ch

em

ical S

hift

(pp

m)

δ 6,68

δ 25,6

δ 153, 7δ 145,8

δ 121, 6


140

145

150

155

F1

Ch

em

ical

Sh

ift (

ppm

)

δ 3,91 δ 3,68

δ 153,7δ 145,8

92

A partir da análise dos dados espectrométricos e espectroscópicos, foi possível

propor que esta substância se trata do alcaloide aporfínico nornuciferina (Figura 63),

sendo a estrutura confirmada por comparação com os dados existentes em literatura

(DUTRA et al., 2012) (Tabela 9).

O alcaloide nornuciferina é amplamente encontrado em várias espécies da

família Annonaceae, tais como Annona glabra, Annona pickelii, Guatteria

blepharophylla, Unonopsis duckei e Duguetia flagellaris (CHANG et al., 2000;

DUTRAet al., 2012; COSTA et al., 2011b; SILVA et al., 2014; FECHINE et al., 2002).

Na literatura foi relatado o efeito antidepressivo deste alcaloide presente em Annona

cherimolia,devido a sua ação agonista no receptor 5HT1A (MARTÍNEZ-VÁSQUEZ et

al., 2012).

Figura 63: Estrutura do alcaloide nornucuferina.

Figura 64: Principais correlações observadas para a amostra OaF13.

NH

CH3O

CH3O 1

23 4

5

6

7

8

3a3b

6a

910

11

11a1a

7a

NH

H

H3CO

H3CO

H

H

H

H

145,8121,6

6,68

111,725,6

153,7

NH

H3CO

H3CO

H H

H

153,7

145,8

3,13

128,2

53,4

133,2 131,58,40

7,35

3,18

3,91

3,68

34,1

128,4

127,9

7,23

7,23

128,2

34,1

128,2

25,6

93

Tabela 9: Dados de RMN 1H, HSQC e HMBC da amostra OaF13

OAF13 (Nornuciferina)Posição 1H δ (mult., J em

Hz)a

1H δ (mult., J em Hz)b HSQC (1H-13C)c HSQC (1H-13C)b

HMBC (1H-13C)

1 - - 145, 8 145,5 -1a - - - 126,7 -2 - - 153, 7 152,5 -3 6,68 (1H, s) 6,65 (1H, s) 111, 7 111,7 25,6; 121, 6; 145,8;

153, 73a - - - 128,1 -3b - - 121, 6 127,0 -4 2,94 (1H,dd, 16,9 e

3,1)2,76 (1H, dd,15,8 e 2,6) 25, 6 28,3 -

4 3,43 (1H, m) 3,12 (1H, m) 25, 6 28,3 -5 3,26 (1H, m) 3,06 (1H, dd, 12,0 e 2,6) 41, 5 42,6 -5 3,79 (1H, m) 3,49 (1H, dd, 12,0 e 5,0) 41, 5 42,6 -6a 4,27 (1H, m) 3,93 (1H, dd, 13,7 e 4,8) 53, 4 53,4 -7 3,13 (1H, m) 2,86 (1H, t, 13,7) 34, 1 36, 7 53, 4; 121,6; 133,27 3,18 (1H, m) 2,97 (1H, dd, 13,7 e 4,8) 34, 1 36, 7 -7a - - 133, 2 135, 4 -8 7,23 (1H, m) 7,23 (1H, m) 128,2 127, 9 34, 1; 127,9; 131, 59 7,23 (1H, m) 7,23 (1H, m) 128,2 127, 5 -10 7,35 (1H, m) 7,31 (1H, m) 127, 9 127, 2 128, 2; 131, 511 8,40 (1H, d, 7,8) 8,39 (1H, d, 7,7) 128, 4 128, 4 128, 2; 133, 211ª - - 131, 5 132,0 -1-OCH3 3,68 (3H, s) 3,66 (3H, s) 60, 2 60, 2 145,82-OCH3 3,91 (3H, s) 3,89 (3H, s) 55,9 55, 9 153, 7

a O experimento foi realizado a 600MHz para 1H em CDCl3, utilizando o TMS como padrão interno.b Dados da literatura de acordo com Dutra et al., 2012 (1H em CDCl3;400 MHz)c Para os carbonos protonados foram usados os dados de HSQC e carbonos quaternários foram usadosdados de HMBC.

94


A fração amostra como OaF15 (2,9 mg) apresentou-se como um sólido amorfo.

A análise de massas de OaF15 (Figura 65) evidenciou a presença do pico base de m/z

266 [M+H]+. Este íon foi submetido à análise de MSn (Figura 66) onde foi observado

perdas sequencias de 17, 30 e 28 Da, característico de alcaloides aporfínicos com a

ausência de N-metila e contendo uma ponte metilenodioxi (STÉVIGNY et al., 2004).



200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

266.05

267.06

264.16276.07249.23 282.13

366.02294.08235.25 310.10251.21 321.18210.15 219.19 337.07 352.37199.82 378.15 398.15391.77

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260m/z

0

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

0

20

40

60

80

100249,04

251,08235,18 266,19206,07177,10 219,12191,25219,05

191,29221,12206,24 232,22 249,29203,19

191,18

219,35

NL:1,70E3

NL:6,81E1

NL:2,20E1

-17 Da

-30Da

-28Da

MS2

MS3

MS4

95


ausência das duas metoxilas, substituídas por um grupo metilenodioxi, como sugerido

pelo espectro de massas.

Na análise de RMN de 1H na região aromática, foram observados deslocamentos

em δ 8,09 (1H, d, 7,8), 7,36 (1H, m) e 7,24 (2H, m), atribuídos às posições H-11, H-10,

H-9 e H-8 respectivamente, sinais característicos do anel D do sistema aporfínico não

substituído (Figura 67). Os sinais de dois hidrogênios em δ 3,18 (dd, 13,9; 13,9) e 3,26

(dd, 13,9; 4,7), atribuídos aos hidrogênios do C-7, ratificaram a natureza aporfínica do

composto.

Nos espectros de RMN de 1H e HSQC verificou-se que hidrogênios em δ 6,15

(1H, d, 1,5) e 6,00 (1H, d, 1,5), se correlacionavam com o carbono em δ 101,4.

Adicionalmente, no mapa de contorno HMBC, verificou-se que estes hidrogênios se

correlacionavam com os carbonos em δ 143,7 e 148,6, caracterizando a presença de

uma ponte metilenodioxi, e evidenciando a não planaridade da molécula (Figura 68 e

69). A localização da ponte metilenodioxi pôde ser confirmada pela correlação do

hidrogênio δ 6,61 (1H, s), ligado ao carbono em δ 107,9 (C-3), com os carbonos

aromáticos em δ 143,7 (C-1), 148,6 (C-2) e 121,2(C-3b) e ao carbono metilênico em δ

25,9 (C-4) confirmando a estrutura do anel A (Figura 68 e 69).

96




0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Nor

mal

ized

Inte

nsity

1.311.421.341.291.441.391.241.101.111.021.861.311.09

TMS

CHLOROFORM-dTMS

2.90

642.

9135

3.18

243.

2058

3.24

683.

2548

3.26

603.

2698

3.27

783.

7403

3.74

783.

7587

3.76

87

4.38

894.

4052

4.41

19

6.00

146.

1524

6.15

496.

6145

7.22

177.

2338

7.24

477.

2468

7.25

857.

3413

7.35

557.

3651

8.08

658.

0995



0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Nor

mal

ized

Inte

nsity

1.101.111.021.861.311.09

CHLOROFORM-d

6.00

146.

0039

6.15

246.

1549

6.61

45

7.22

177.

2267

7.23

387.

2447

7.24

687.

2585

7.34

137.

3555

7.36

517.

3689

8.08

658.

0995



0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Nor

mal

ized

Inte

nsity

1.311.421.341.291.441.391.24

2.87

842.

8851

2.89

472.

9064

2.91

35

3.15

94

3.18

243.

2058

3.24

683.

2548

3.26

603.

2698

3.27

783.

2870

3.29

073.

3568

3.36

643.

3861

3.41

62

3.73

823.

7403

3.74

783.

7587

3.76

87

4.38

224.

3889

4.40

524.

4119

97

Figura 68: Mapa de contorno HSQC (600 MHz, CDCl3) da amostra OaF15.


0

50

100

150 F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)


97.5

100.0

102.5

F1

Ch

em

ical S

hift

(...

δ 6,15

δ 101,4

δ 6,00

δ 101,46.66 6.65 6.64 6.63 6.62 6.61 6.60 6.59 6.58 6.57F2 Chemical Shift (ppm)

100.0

102.5

105.0

107.5

F1

Ch

em

ical

Sh

ift (

...

δ 6,61

δ 107,9

98

Figura 69: Mapa de contorno HMBC (600 MHz, CDCl3) da amostra OaF15.


0

50

100

150

F1 C

hem

ical

Shi

ft (p

pm)


140

145

150

F1

Che

mic

al S

hift

(...

δ 6,15 δ 6,00

δ 143,7 δ 143,7

δ 148,6 δ 148,6


50

100

F1 C

hem

ical

Shi

ft (..

.

δ 6,61δ 25,9

δ 121,2δ 143,7

δ 148,6

99

Através das análises dos dados de RMN e por comparação com a literatura, foi

possível confirmar a substância OaF15 como o alcaloide anonaína (Figura 70),

comumente encontrado em espécies da família Annonaceae (ORTIZ et al., 2007;

COSTA et al., 2010; VENDRAMIN et al., 2013; TELES et al., 2015; COSTA et al.,

2015 ). Os demais dados de RMN de 1H e dos mapas de contorno HSQC e HMBC

encontrados para a substância anonaína estão na tabela 10.

O efeito antimicrobiano deste alcaloide foi evidenciado por Paulo e

colaboradores (1992), demonstrando atividade contra as bactérias Bacillus cereus,

Escherichia coli, Staphylococcus aureus e S. epidermidis. Estudos realizados por Chen

e colaboradores (2011) com este alcaloide, demonstraram o efeito antiprolifetarivo e

antimigratório em células de câncer de pulmão humano (H1299).

Figura 70: Estrutura do alcaloide anonaína.

NH

O

O 1

23

3a

3b

45

6

7

89

6a

10

1111a

7a

1a

100



OaF15( Anonaína )Posição 1H δ (mult., J

em Hz)a

1H δ (mult., Jem Hz)b

HSQC (1H-13C)c HSQC(1H-13C)b

HMBC (1H-13C)

1 - - 143, 7 142,5 -1a - - 116, 3 116,1 -2 - 148, 6 146,8 -3 6,61 (1H, s) 6,57 (1H, s) 107,9 107,9 25,9; 121, 2; 143, 7; 148,63a - - 124,0 126,4 -3b - - 121, 2 128,1 -4

2,90 (1H, m) 2,67 (1H, m)25,9 29,0 107,9; 121, 2

4 3,39 (1H, m) 3,01 (1H, m) 25,9 29,0 -5 3,28 (1H, m) 3,02 (1H, m) 42, 1 43,1 25, 9; 53,35 3,76

(1H,ddd12,1;5,7; 1,2)

3,41 (1H, m) 42, 1 43,1 25,9; 53, 3; 124,0

6a 4,40 (1H, dd,13,8; 4,0)

3,99 (1H,dd,14,2; 4,9)

53, 3 53,3 -

7 3,18 (1H,dd,13,9; 13,9)

2,83 (1H,dd,14,2; 14,2)

34, 0 36,8 53,3; 121,2; 128,6; 130,5; 132,2

7 3,26(1H,dd,13,9;

4,7)

2,96 (1H,dd,14,2; 4,9)

34, 0 36,8 121,2; 128,6; 130,5; 132,2

7a - 132, 2 134,9 -8 7,24 (1H, m) 7,25 (1H, m) 128,6 128,1 34,0; 130,59 7,24 (1H, m) 7,22 (1H, m) 128, 6 127,5 132,210 7,36 (1H, m) 7,31 (1H, m) 128, 2 127,0 128, 6; 130, 511 8,09 (1H, d,

7,8)8,07 (1H, d,

7,7)127, 5 127,0 116, 3; 128, 6; 132, 2

11a - - 130, 5 131,1 -O-CH2-O 6,15 (1H, d,

1,5)6,09 (1H, d,

1,4)101, 4 100,6 143, 7; 148, 6

6,00 (1H, d,1,5)

5,94 (1H, d,1,4)

101, 4 100,6 143, 7; 148, 6

a O experimento foi realizado a 600MHz para 1H em CDCl3, utilizando o TMS como padrão interno.b Dados da literatura de acordo com Costa et al., 2015 (1H em CDCl3; 400 MHz).

NH

H

H

H

O

O

HH

H H

H

H

H

143,7 121,2

6,61

107,925,9

148,6

NH

H H

H

H

H

H

O

O

H

3,18

128,6

53,3

132,2

7,36

3,26

34,0

128,2

7,24

128,6

128,6

25,9

101,4

6,15

6,0

3,392,90

124,0

130,5

3,28

3,76

42,1

6,61

107,9

124,0

121,2143,7

148,6

53,3

34,0

7,24

8,09127,5

130,5

116,3

132,2

7,24

128,6

8,09

7,36

128,2

127,5

116,3

101

c Para os carbonos protonados foram usados os dados de HSQC e carbonos quaternários foram usadosdados de HMBC.



amorfo. A análise de massas de OaF17 (Figura 72) evidenciou a presença do pico base

de m/z 312 [M+H]+, correspondente à molécula protonada, indicando a fórmula

molecular C19H21NO3 para o composto. Na análise de MSn (Figura 73) foi notada uma

perda inicial de 17 Da, seguida de perdas sequenciais de 15 Da, sendo observado o

mesmo padrão de fragmentação descrito anteriormente para o alcaloide nornuciferina

(Figura 63). Através da diferença de massas entres essas substâncias, foi possível propor

a existência de um terceiro grupo metoxila para o alcaloide de m/z 312.


200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

312.09

313.13

235.17219.18 310.26 314.14295.28255.25 279.02233.19 326.22267.15217.33 249.18201.30 342.12 390.86365.53 385.09351.11301.17 406.30

102

Figura 73: Espectro de MSn para o íon m/z 312[M+H]+


presença de mais uma metoxila, evidenciada no espectro de massas. Foram observados

sinais referentes a hidrogênios aromáticos (Figura 74) em δ 7,24 (2H, m), 7,34 (1H, m)

e 8,30 (1H, d, 7,9), característicos do anel D de esqueletos aporfínicos não substituídos.

Outros sinais de hidrogênios aromáticos não foram encontrados, sugerindo que o

carbono C-3 do anel A esteja substituído. A presença de sinais de hidrogênios em δ 3,12

(m) e 3,17 (m), atribuídos aos hidrogênios do C-7, confirmaram a natureza aporfínica do

composto.

No espectro de RMN de 1H são ainda observados três singletos em δ 3,76 (3H,

s), 3,96 (3H, s) e 3,94 (3H, s), sinais característicos de metoxilas, confirmando a

existência de três metoxilas na estrutura (Figura 74). No mapa de contorno HMBC

(Figura 75) verifica-se que estas se correlacionam com os carbonos em δ 151,5, 146,7 e

150,8 respectivamente. A posição da terceira metoxila pode ser observada através do

mapa HMBC do sinal de hidrogênio em δ 3,08 (H-4) (Figura 75), que se correlaciona

com o carbono em δ 150, 8, atribuido à presença da metoxila na posição C-3.

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300m/z

0

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

0

20

40

60

80

100295,10

281,12 312,14

297,13284,14269,16252,09176,08162,10 189,06 206,13 310,16149,06 234,15137,01123,13 212,98104,8691,43

280,10

264,16

248,16221,13 232,22207,13 295,21179,01265,06

221,12 248,06236,95 280,09205,34

NL:3,60E2

NL:3,79E1

NL:9,51E1

-17 Da

-15 Da

-15 Da

MS2

MS3

MS4

103


Bruna_OAF17.011_H.esp


0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Nor

mal

ized

Inte

nsity

1.110.842.220.942.961.072.892.771.052.091.120.96

CHLOROFORM-dM04(s)

TMS

M03(s)

M01(s)

M10(m)

M07(m)

M08(d)

M11(m)

M09(s)

M02(m)

M05(dd)

M12(m)M06(m)

3.09

453.

1162

3.13

963.

1567

3.16

133.

1694

3.18

393.

7598

3.79

133.

7930

3.94

333.

9582

4.21

954.

2268

4.25

02

7.23

327.

2395

7.24

477.

2587

7.32

517.

3315

7.33

877.

3455

8.29

228.

3054


8.3 8.2 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2Chemical Shift (ppm)

0

0.05

0.10

Nor

mal

ized

Inte

nsity

2.091.120.96

CHLOROFORM-d

M07(m)

M08(d)

M06(m)

7.23

327.

2395

7.24

477.

2587

7.31

837.

3251

7.33

157.

3387

7.34

557.

3532

7.35

96

8.29

228.

3054



0

0.05

0.10

Nor

mal

ized

Inte

nsity

1.110.842.220.942.961.072.892.771.05

M04(s)

M03(s)

M01(s) M10(m)

M11(m)

M09(s)

M02(m)

M05(dd)

M12(m)

3.07

493.

0945

3.11

623.

1396

3.14

903.

1567

3.16

133.

1694

3.17

883.

1839

3.19

16

3.75

983.

7849

3.79

133.

7930

3.80

113.

8079

3.81

133.

8156

3.81

983.

9433

3.95

82

4.21

954.

2268

4.24

254.

2502

104

.

Figura 75: Mapa de contorno HMBC (600 MHz, CDCl3) da amostra OaF17.


0

50

100

F1

Ch

em

ical

Sh

ift (

ppm

)


148

150

152

F1

Ch

em

ical S

hift (p

...

δ 3,08

δ 150,8


145

150

F1

Ch

em

ical S

hift (p

...

δ 3,96

δ 150,8

δ 3,94 δ 3,76

δ 151,5

δ 146,7

105

As demais correlações são apresentadas na tabela 11. A partir desses dados

pode-se concluir que a substância de m/z 312 trata-se do alcaloide aporfínico O-

metilisopilina (Figura 76). Este alcaloide já foi relatado em espécies da família

Annonaceae como em Duguetia flagellaris, Guatteria scandens e Guatteria pogonopus

(HOCQUEMILLER et al., 1983; NAVARRO et al., 2001; FECHINE et al., 2002;

SANTOS et al., 2015).

Figura 76: Estrutura do alcaloide O-metilisopilina.


NH

CH3O

CH3O

OCH3

1

24

5

6

7

8

3a3b

6a

10

11

11a1a

7a

3

151,5 124,8

20,5146,7

3,12

128,0

53,3

132,5

3,17

33,7

3,173,08

132,0

7,24

128,0

127,8

128,2

NH

H

H

H H

H

H

H

CH3O

CH3O

OCH3

H

122,6

120,1

60,8

3,94150,8

7,24

151,5 124,8

20,5146,7

3,12

128,0

53,3

132,5

3,17

33,7

3,173,08

132,0

7,24

128,0

8,30

7,34

127,8

128,2

NH

H

H

H H

H

H

H

CH3O

CH3O

OCH3

H

H

H

122,6

120,160,8

60,8

3,96

3,76

60,8

3,94150,8

7,24

41,2

106


OAF17(O-metilisopilina)Posição 1H δ (mult., J em Hz)a 1H δ (mult., J em Hz)b HSQC (1H-13C)c HSQC (1H-

13C)bHMBC (1H-13C)

1 - - 151,5 150,8 -1ª - - 122,6 122,2 -2 - - 146,7 144,5 -3 - - 150,8 150,8 -3ª - - 120,1 124,4 -3b - - 124,8 131,2 -4 3,08 (1H, m) - 20,5 23,7 120,1; 150,84 3,17 (1H, m) - 20,5 23,7 120,15 3,18 (1H, m) - 41,2 42,8 53,35 3,80 (1H, m) - 41,2 42,8 53,3; 120,16ª 4,23 (1H, dd, 13,8; 4,2) - 53,3 53,4 -7 3,12 (1H, m) - 33,7 36,8 53,3; 124,8;

128,0; 132,07 3,17 (1H, m) - 33,7 36,8 132,07ª - - 132,5 -8 7,24 (1H, m) 7,18 128,0 127,8 -9 7,24 (1H, m) 7,18 128,0 127,8 128,2; 132,510 7,34 (1H, m) 7,18 127,8 126,7 128,011 8,30 (1H, d, 7,9) 8,22 128,2 126,7 122,6; 128,0;

132,511a - - 132,0 132,0 -1-OCH3 3,76 (3H, s) 3,73 60,8 60,2 151,52-OCH3 3,96 (3H, s) 3,94 60,8 60,6 146,73-OCH3 3,94 (3H, s) 3,90 60,8 61,2 150,8

a O experimento foi realizado a 600MHz para 1H em CDCl3, utilizando o TMS como padrão interno.b Dados da literatura de acordo com Navarro et al., 2001 (1H em CDCl3; 200 MHz )c Para carbonos protonados foram usados os dados de HSQC e carbonos quaternários foram usados dadosde HMBC.

107

5.9 Análise por LC-DAD-APCI-MS do precipitado

O precipitado codificada como PFOa apresentou-se como um sólido amarelo

claro. Quando analisada por LC-DAD-APCI-MS (Figura 78) revelou um pico

majoritário, correspondendo a aproximadamente 87% da amostra e um minoritário,

correspondendo a aproximadamente 13% da amostra.

Figura 78: Cromatograma de LC-DAD e LC-APCI-MS, para o PFOa.

No espectro de massas em full scan (Figura 79) foi possível observar um sinal

intenso de m/z 328, além de um sinal discreto de m/z 342, coerente com o perfil

observado por LC-DAD-APCI-MS.

Figura 79: Espectro de íons totais do PFOa.

RT: 0,86 - 14,04 SM: 7B

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Time (min)

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

uAU

6,18

6,08

7,76

1,801,22 2,37

6,24

7,83

7,33 8,22 10,718,84 9,20 12,021,30 9,921,90 11,012,43 2,91 3,32 13,7812,665,663,76 13,034,18 4,79

NL:3,56E5Total ScanPDAprecipitado_folhas_largaescala

NL:6,36E7TIC MSprecipitado_folhas_largaescala

bruna_precipitados #26 RT: 0,19 AV: 1 NL: 2,73E7F: + c APCI Q1MS [100,000-1000,000]

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

328,34

342,35

177,90145,93 256,26 313,32 352,20 446,29 485,62 517,40 987,68867,89832,94 921,61580,64 766,26733,34670,90634,95

m/z 342

m/z 328

108

Quando submetidos a experimentos de MS/MS, ambos apresentaram elevadas

perdas de massa, resultando no íon base de m/z 178, mesmo perfil observado para as

substâncias majoritárias estefolidina e isocoripalmina, sugerindo que o precipitado é

uma mistura de ambas as substâncias.

Figura 80: Espectros de MS/MS dos íons de m/z 328 e 342.

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

178.08

313.13151.10

279.12163.07 296.16 328.16251.14119.07 146.12 190.14 267.1395.07 219.14 235.17204.08178.09

192.10 342.17163.09151.11 327.15294.16 310.12204.06119.04 265.16135.08 281.15107.07 255.15237.24218.19

NL:1.30E4

NL:7.29E3

N

OH

OH

CH3O

CH3

O

A B.

C.

D.

N

OH

CH3O

CH3

O

A B.

C.

D.

CH3

O

109

6. CONCLUSÕES

A análise do perfil alcaloídico por APCI-IT-MSn das frações obtidas em escala

analítica possibilitou escolher a fração alcaloídica das folhas para o isolamento de

alcaloides ainda não descritos no gênero Onychopetalum. O fracionamento da fração

alcaloídica das folhas por intermédio de cromatografia preparativa levou ao isolamento

dos alcaloides aporfínicos, nornuciferina, anonaína, asimilobina e O-metilisopilina, dos

alcaloides tetraidroprotoberberínicos isocoripalmina e estefolidina, e do alcaloide

benziltetraidroisoquinolínico norjuzifina, sendo todos relatados pela primeira vez no

gênero Onychopetalum. Tais resultados evidenciam que a espécie Onychopetalum

amazonicum é uma fonte promissora de alcaloides isoquinolínicos, apresentando

diversidade de estruturas, que incluem alcaloides precursores, como do tipo

tetraidrobenzilisoquinolínico e derivados, como os aporfínicos e tetra-

idroprotoberberínicos

Através das análises por CG-EM e CG-DIC foram caracterizados 41 compostos

nos óleos essenciais de O. amazonicum, com predominância de sesquiterpenos, sendo

identificados os sesquiterpenos (E) cariofileno e (epi)-α-cadinol como constituintes

majoritários nas folhas, cascas e galhos, respectivamente.

A análise antimicrobiana dos óleos essenciais apontou atividade moderada no

óleo essencial das cascas, inibindo o crescimento das bactérias Staphylococcus

epidermidis, Escherichia coli e Kocuria rhizophila, atribuída a presença do

sesquiterpeno allo- aromadendreno, para o qual há relato anterior de atividade

antimicrobiana. Esta conclusão é baseada no fato de que é um dos principais compostos

da parte ativa (casca) da espécie, estando ausente ou minoritário nas demais partes

analisadas, as quais foram inativas. Ambas as análises, químicas e biológicas, com óleos

essenciais ainda não foram descritas para espécies do gênero Onychopetalum.

110

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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related brain disorders-a survey of ethnobotanical literature. Journal of Ethnopharma-

cology, v.113, p. 363-381, 2007.

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