UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS … · trabalho e por todos os recursos colocados...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA

TROPICAL

E SAÚDE PÚBLICA

LUMA CORREIA FERNANDES

PERFIL FENOTÍPICO E GENÉTICO DE ENTEROBACTÉRIAS

PRODUTORAS DE CARBAPENEMASE DO TIPO KPC EM UM

HOSPITAL DE GOIÂNIA

Goiânia

2017

iii

LUMA CORREIA FERNANDES

PERFIL FENOTÍPICO E GENÉTICO DE ENTEROBACTÉRIAS

PRODUTORAS DE CARBAPENEMASE DO TIPO KPC EM UM

HOSPITAL DE GOIÂNIA

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Medicina

Tropical e Saúde Pública da Universidade

Federal de Goiás para obtenção do Título de

Mestre em Medicina Tropical e Saúde

Pública. Orientador: Prof. Dr. André Kipnis

Co-orientadora: Profª. Drª. Adriana Oliveira

Guilarde

Goiânia

2017

vi

Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública

da Universidade Federal de Goiás

BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Aluno (a): Luma Correia Fernandes

Orientador (a): André Kipnis

Co-orientador (a): Adriana Oliveira Guilarde

Membros:

1. Dra. Marília Dalva Turchi

2. Dra. Maria Cláudia Dantas P. B. André (memória)

3. Dr. André Kipnis

Data: 17/03/2017

vii

À minha família

vii

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por iluminar o caminho da vida principalmente nos momentos

difíceis.

À minha família que me apoiou e incentivou a ir mais longe e sempre esteve ao

meu lado.

Ao meu marido, Douglas, que sempre esteve ao meu lado, me aguentou nos

momentos de tristeza e estresse e me acalmou nos momentos agitados.

À professora Adriana Oliveira Guilarde, minha co-orientadora e idealizadora desse

projeto, que desde o primeiro momento me acolheu e acreditou em mim.

Ao professor André Kipnis, por acreditar em mim, por todo o empenho e sabedoria,

pela liberdade e confiança na realização deste trabalho e principalmente pela compreensão

nos momentos difíceis.

À professora Maria Cláudia Dantas P. B. André por ter me ensinado e ajudado no

desenvolvimento da técnica PFGE, fornecendo materiais e analisando os resultados das

amostras, também por ter participado da minha banca de qualificação, expondo suas ideias

para melhorar a dissertação.

À professora Juliana Lamaro Cardoso por ter me ensinado e ajudado no

desenvolvimento da técnica PFGE, fornecendo materiais e analisando as amostras.

À professora Alessandra Marques Cardoso por ter participado da minha banca de

qualificação e contribuído com o seu conhecimento para melhorar a dissertação.

A todos os diretores do hospital de reabilitação que autorizaram a realização desse

trabalho e por todos os recursos colocados à disposição.

A todos os colegas dos laboratórios do hospital e IPTSP que me apoiaram e

ajudaram no desenvolvimento das técnicas e reações realizadas e especialmente a Carolina

Tremea que me auxiliou na dissertação e ao Fábio Muniz que me ensinou as técnicas de

biologia molecular.

Por fim, agradeço a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste

mestrado, um importante desafio da minha vida.

viii

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS .............................................................................................. vii

TABELAS, FIGURAS E ANEXOS ........................................................................... xi

SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS ........................................................... xiii

RESUMO ................................................................................................................... xv

ABSTRACT .............................................................................................................. xvi

1. INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA ............................................... 1

1.1. Família Enterobacteriaceae e Patogenicidade ......................................... 1

1.2. Antimicrobianos Beta-lactâmicos ............................................................ 2

1.2.1. Mecanismo de Ação dos Beta-lactâmicos ................................... 3

1.2.2. Resistência Bacteriana ................................................................. 4

1.2.2.1. Beta-lactamases ....................................................................... 5

1.2.2.1.1. Serino Beta-lactamases ...................................................... 7

1.2.2.2. Beta-lactamases de Espectro Estendido ................................. 7

1.2.2.3. Inibidores de Beta-lactamases ................................................ 7

1.3. Antimicrobianos Carbapenêmicos ........................................................... 8

1.3.1. Carbapenemases ........................................................................... 9

1.3.1.1. Carbapenemases de Classe A ................................................. 9

1.3.1.1.1. KPC ................................................................................. 10

1.3.1.1.2. Enzimas Cromossomais: IMI, NMC e SME ................... 11

1.3.1.1.3. GES .................................................................................. 11

1.3.1.2. Metalo-Beta-lactamase ......................................................... 11

1.3.1.2.1. IMP e VIM ...................................................................... 12

1.3.1.2.2. NDM ................................................................................ 13

1.4. Antimicrobiano Polimixina .................................................................... 13

1.4.1. Resistência à Polimixina ............................................................ 14

1.4.1.1. Resistência à Polimixina por Mutação Genética .................. 14

1.4.1.2. Resistência à Polimixina por Plasmídeo (MCR-1) ............... 15

1.5. Antimicrobiano Tigeciclina .................................................................... 15

1.6. Detecção Laboratorial das Carbapenemases .......................................... 15

1.6.1. Testes Fenotípicos ...................................................................... 16

1.6.1.1. Teste de Gradiente de Difusão ............................................. 16

1.6.1.2. Disco Difusão com Ácido Etilenodiamino Tetra-acético e com

Ácido Fenilborônico .................................................................................................. 17

1.6.1.2.1. EDTA .............................................................................. 18

ix

1.6.1.2.2. AFB ................................................................................. 18

1.6.1.3. Teste de Hodge modificado .................................................. 19

1.6.1.4. Teste de Inativação dos Carbapenêmicos ............................. 20

1.6.2. Testes Moleculares ..................................................................... 21

1.6.2.1. Reação em Cadeia da Polimerase ......................................... 21

1.6.2.2. Eletroforese em Gel em Campo Pulsado (PFGE) ................ 22

2. JUSTIFICATIVA ............................................................................................... 23

3. OBJETIVOS ....................................................................................................... 24

3.1. Objetivo Geral ........................................................................................ 24

3.2. Objetivos Específicos ............................................................................. 24

4. MÉTODOS ......................................................................................................... 25

4.1. Seleção das amostras e aspectos ético-legais ......................................... 25

4.2. Perfil Clínico do Hospital ....................................................................... 25

4.3. Critérios de Inclusão ............................................................................... 26

4.4. Critério de Exclusão ............................................................................... 26

4.5. Isolamento e Identificação Bacteriana ................................................... 26

4.5.1. Teste de Suscetibilidade aos Antimicrobianos .......................... 27

4.6. Testes Complementares .......................................................................... 27

4.6.1. Teste de Hodge Modificado ....................................................... 27

4.6.2. Teste com o Inibidor e Potenciador para Detecção de

Carbapenemase do Tipo NDM e KPC (ANVISA, 2013). ......................................... 27

4.6.3. Teste de Inativação do Carbapenêmico ..................................... 28

4.6.4. Teste de Gradiente de Difusão para Polimixina e Tigeciclina ... 29

4.7. Condições de Armazenamento ............................................................... 29

4.8. Extração de DNA Genômico Bacteriano ............................................... 29

4.9. Extração do DNA Plasmidial Bacteriano ............................................... 30

4.10. Condições de Amplificação do DNA ................................................... 30

4.10.1. Eletroforese em Gel de Agarose .............................................. 31

4.11. PFGE .................................................................................................... 32

4.12. Análises Estatísticas ................................................................................ 33

5. RESULTADOS .................................................................................................. 34

5.1. Seleção das amostras ....................................................................................... 34

5.2. Perfil das 167 Amostras dos Pacientes Infectados por Enterobactérias

Resistentes aos Carbapenemicos do Hospital de Reabilitação .................................. 35

5.3. Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos ....................................... 36

5.4. Determinação da concentração inibitória mínima .................................. 38

x

5.5. Testes Fenotípicos para Detecção de Carbapenemases .......................... 40

5.5.1. Resultado da Nota Técnica 01/2013 da ANVISA ..................... 40

5.5.2. Teste de Hodge Modificado ....................................................... 40

5.5.3 Teste de Inativação do Carbapenêmico ...................................... 41

5.6. Testes Moleculares ................................................................................. 41

5.6.1. Detecção dos Genes Codificadores das Carbapenemases KPC e

NDM.......................... ................................................................................................ 41

5.6.2. Detecção de Outros Gene Codificador de Resistência a

antimicrobianos .......................................................................................................... 42

5.7. Testes Fenotípicos e Genéticos Realizados com Resultados Positivos para

KPC........................ .................................................................................................... 43

5.8. Determinação do polimorfismo genético por eletroforese de campo pulsado

em gel de agarose (PFGE) ......................................................................................... 43

6. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 46

7. CONCLUSÕES .................................................................................................. 52

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 53

ANEXOS ................................................................................................................... 64

Anexo 1. Parecer do Comitê de Ética. .............................................................. 64

Anexo 2. Nº das Linhagens Bacterianas de Referência da FIOCRUZ – Fundação

Osvaldo Cruz. ............................................................................................................ 68

Anexo 3. Artigo a ser submetido para a revista Mémorias do Instituto Oswaldo

Cruz ......................... .................................................................................................. 69

xi

TABELAS, FIGURAS E ANEXOS

Tabela 1. Classificação segundo Bush, Jacoby, Medeiros e Ambler com as principais

enzimas de resistência. ........................................................................................................ 6

Tabela 2. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para realização dos PCR .................. 31

Tabela 3. Frequência das espécies bacterianas produtoras de carbapenemases isoladas

durante o período de estudo relacionadas ao material clínico. ......................................... 36


durante o período de estudo relacionadas a origem. ......................................................... 36

Tabela 5. Frequência de isolados resistentes aos diferentes antimicrobianos de acordo

com a espécie bacteriana estudada determinado pelo sistema automatizado Vitek II. ..... 38

Tabela 6. Teste com o Inibidor e Potenciador para Detecção de Carbapenemase do Tipo

NDM e KPC (ANVISA, 2013). ........................................................................................ 40

Tabela 7. Amostras positivas para os genes blaKPC, blaNDM e MCR-1 ....................... 41

Tabela 8. Percentual de amostras produtoras de blaKPC associadas aos testes fenotípicos.

.......................................................................................................................................... 43

Figura 1. Estrutura dos antimicrobianos beta-lactâmicos. .................................................. 3

Figura 2. Estrutura dos inibidores de BLA. ........................................................................ 8

Figura 3. Teste de sensibilidade através TGD de polimixina B . ..................................... 17

Figura 4. Teste da nota técnica 01/2013 da ANVISA com carbapenêmicos sem aditivo,

com 10 µL de AFB e 10 µL de EDTA para avaliar aumento dos halos de inibição dos

antimicrobianos (mm) ....................................................................................................... 18

Figura 5. Teste de Hodge modificado para avaliar a produção de KPC ........................... 19

Figura 6. Teste de inativação do carbapenêmico para avaliar a produção de

carbapenemase .................................................................................................................. 20

Figura 7 Frequência de isolados de enterobactérias produtores de carbapenemases (A) e

distribuição por espécie (B). ............................................................................................. 34

Figura 8 Número de amostras produtoras de carbapenemases isoladas, de acordo com as

espécies bacterianas e por mês de estudo ......................................................................... 35

Figura 9 Susceptibilidade aos antimicrobianos dos 167 isolados de enterobactérias

produtores de carbapenemases. ......................................................................................... 37

xii

Figura 10 Concentrações inibitórias mínimas (CIM) determinada para tigeciclina

realizados pelo método automatizado (Vitek II, barras pretas) e pelo TGD (barras cinzas)

com a interpretação segundo a ANVISA 01/2013. ........................................................... 39

Figura 11 Concentrações inibitórias mínimas (CIM) determinada para polimixina B

realizados pelo método automatizado (Vitek II, barras pretas) e pelo TGD (barras cinzas)

com a interpretação segundo a ANVISA 01/2013. ........................................................... 39

Figura 12. Eletroforese do produto do PCR para o gene blaKPC de 13 amostras da

espécie K. pneumoniae. .................................................................................................... 42

Figura 13. Eletroforese em gel de agarose dos produtos da PCR para o gene blaNDM de

9 amostras das espécies K. pneumoniae e E. coli ............................................................. 42

Figura 14. Eletroforese em gel de agarose da PCR para o gene MCR-1 para pesquisa de

resistência plasmidial à poliximina em 15 amostras. ........................................................ 43

Figura 15 Dendrograma representativo dos 13 perfis de fragmentação de DNA

cromossomal encontrado nas 52 amostras de K. pneumoniae produtoras de KPC .......... 45

Anexo 1. Parecer do Comitê de Ética. .............................................................................. 64

Anexo 2. Nº das Linhagens Bacterianas de Referência da FIOCRUZ – Fundação Osvaldo

Cruz. .................................................................................................................................. 68

Anexo 3. Artigo a ser submetido para a revista Mémorias do Instituto Oswaldo Cruz ... 69

xiii

SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS

AFB – Ácido Fenilborônico

BLA – Beta-lactamase

Ca – Cálcio

CESP – Citrobacter freundii, Enterobacter spp., Serratia spp., Providencia spp.,

Morganella morganii e Hafnia alvei

CIM – Concentração Inibitória Mínima

CLSI – Clinical Laboratory Standard Institute

DHP-1 – Dehidropeptidase-1

DNA – Ácido Desoxirribonucleico

dNTPs – Desoxirribonucleotídeos trifosfato

EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetra-acético

ESBL – Beta-lactamase de Espectro Estendido, do inglês: “Expanded Spectrum Beta

Lactamase”

FDA – U. S. Food and Drug Administration

Fe – Ferro

GIM – German Imipenemase

IMP – Imipenemase

ITU – Infecção do Trato Urinário

KPC – Klebsiella pneumoniae Carbapenemase

LPS – Lipopolissacarído

MBL – Metalo-beta-lactamase

Mg – Magnésio

MRSA – Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

NAG – Nacetilglucosamina

NAM – N-acetil Murâmico

NDM – New Delhi Metalo-beta-lactamase

PBP – Proteína ligadora à penicilina, do inglês: “Penicillin Binding Protein”

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase, do inglês: “Polymerase Chain Reaction”

PFGE – Eletroforese em gel de campo pulsado, do inglês: “Pulsed Field Gel

Eletrophoresis”

SCIH – Serviço de Controle de Infecção Hospitalar

xiv

SIM – Seoul Imipenemase

SPM – São Paulo Metalo-beta-lactamase

ST – Secreção Traqueal

SUS – Sistema Único de Saúde

TGD – Teste de Gradiente de Difusão

THM – Teste de Hodge Modificado

TIC – Teste de Inativação dos Carbapenens

TSA – Ágar de soja tríptico, do inglês: “Tryptic Soy Agar”

TSB – Caldo de soja tríptico, do inglês: “Tryptic Soy Broth”

UPGMA – do inglês: “Unweighted Pair-Groups Method with Arithmetic mean”

UPS – Úlcera de Pressão Sacral

UPTD – Úlcera de Pressão Trocantérica Direita

UTI – Unidade de Terapia Intensiva

VIM – Verona Imipenemase

xv

RESUMO

Nas últimas décadas, as bactérias da família Enterobacteriaceae têm adquirido um

papel cada vez mais importante nas infecções hospitalares devido à sua prevalência e altos

índices de resistência a antimicrobianos associados à mortalidade. Essa resistência devido

a produção de carbapenemases é reconhecida mundialmente como um grande problema

emergente para pacientes hospitalizados, devido à localização de genes em elementos

transferíveis, facilitando sua disseminação. O objetivo desse trabalho foi caracterizar

fenotípica e geneticamente enterobactérias produtoras de carbapenemases. Entre os anos

2012 a 2016 foram isoladas 167 amostras de enterobactérias de um hospital em Goiânia

que apresentaram resistência aos carbapenêmicos. Dos 167 isolados, 107 (64,1%) foram

de Klebsiella pneumoniae, 44 (26,3%) de Enterobacter aerogenes, 13 (7,8%) de

Escherichia coli e 3 (1,8%) de outras espécies. Dos 167 isolados, 94,0% apresentaram

resistência ao ertapenem, 73,6% ao meropenem, 80,8% ao imipenem, 9,0% à tigeciclina e

9,0% à polimixina B. Do total de isolados, 119 (71,2%) foram positivos no Teste de Hodge

Modificado (THM), 162 (97,0%) foram positivos no Teste Inativação do Carbapenêmico

(TIC) e 125 foram positivos para KPC e 1 para metalo-beta-lactamase no Teste da Nota

Técnica 01/2013. A técnica de PCR evidenciou que 80 (47,9%) isolados continham o gene

blaKPC e que nenhum continha os genes blaNDM e MCR-1. Para determinação do grau

de similaridade entre os isolados de K. pneumoniae KPC foi realizado o polimorfismo

genético por eletroforese de campo pulsado em gel de agarose (PFGE) evidenciando 8

clusters. Dentre as amostras não sensíveis a tigeciclina, 22 apresentaram blaKPC e

pertenciam a 13 tipos de clones diferentes. Dentre as amostras resistentes a polimixina B,

10 apresentaram blaKPC em 7 tipos de clusters, 9 (17,31%) isolados apresentaram

resistência tanto a tigeciclina quanto a polimixina B. Através deste estudo, pudemos

evidenciar que o gene blaKPC consegue disseminar de forma muito eficiente entre espécies

de enterobactérias. Além disso, pode estar sendo carreado com outros determinantes de

resistência, dificultando ainda mais o tratamento do ambiente hospitalar.

Palavras-chaves: Carbapenemases, enterobactérias, testes fenotípicos.

xvi

ABSTRACT

In the Enterobacteriaceae family, bacteria acquired an increasingly important role in

hospital infections due to their prevalence and high rates of antimicrobial resistance

associated with mortality. This image produced by carbapenemases is recognized

worldwide as a major emerging problem for hospitalized patients due to the localization of

genes in transferable elements, facilitating their dissemination. The objective of this work

was to characterize phenotypic and genetically enterobacteria of carbonapenemases.

Between 2012 and 2016, 167 samples of enterobacteria from a hospital in Goiânia were

isolated, which showed support for carbapenems. Of the 167 isolates, 107 (64.1%) were of

Klebsiella pneumoniae, 44 (26.3%) of Enterobacter aerogenes, 13 (7.8%) of Escherichia

coli and 3 (1.8%) of other species. Of the 167 isolates, 94.0% had resistance to ertapenem,

73.6% to meropenem, 80.8% to imipenem, 9.0% to tigecycline and 9.0% to polymyxin B.

Of the total isolates, 119 (71 , 2%) were positive in the Modified Hodge Test (THM), 162

(97.0%) were positive in the Carbapenem Inoculation Test (TIC) and 125 in the KPC and

1 in the metallo-beta-lactamase technique 01 / 2013. The PCR technique showed that 80

(47.9%) isolates contained the blaKPC gene and that none contained the blaNDM and

MCR-1 genes. To determine the degree of similarity between the isolates of K. pneumoniae

KPC, the genetic polymorphism was performed by agarose gel pulsed field electrophoresis

(PFGE), showing 13 clusters. Among the non-tigecycline sensitive samples, 22 presented

blaKPC and belonged to 8 different clone types. Among the samples resistant to polymyxin

B, 10 presented blaKPC in 7 types of clusters, 9 (17.31%) isolated showed resistance to

both tigecycline and polymyxin B. Through this study, we could show that the blaKPC

gene manages to disseminate very Efficient among species of enterobacteria. In addition,

it can be assembled with other resistance determinants, making it even more difficult to

treat the hospital environment.

Keywords: Carbapenemases, enterobacteria, phenotypic testes.

1

1. INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA

1.1. Família Enterobacteriaceae e Patogenicidade

As bactérias da família Enterobacteriaceae são anaeróbicas facultativas, compostas

por bacilos Gram negativos, não esporulados, fermentadores da glicose e redutores de

nitrato. Embora possam ser encontradas amplamente na natureza, a maioria habita os

intestinos do homem e dos animais, seja como membros da microbiota normal ou como

agentes de infecção (KONEMAN et al.,2001)

Nas últimas décadas, as bactérias da família Enterobacteriaceae têm adquirido um

papel cada vez mais importante nas infecções hospitalares, tornando-se um problema de

saúde pública devido à sua prevalência e altos índices de resistência aos antimicrobianos

associados à mortalidade. Estudos multicêntricos têm destacado as espécies Escherichia

coli e Klebsiella pneumoniae, seguidos pelo gênero Enterobacter, como as enterobactérias

mais prevalentes causadores de infecções em Unidades de Terapia Intensiva (UTI) na

América do Sul (FEDLER, BIEDENBACH & JONES, 2006, RHOMBERG & JONES,

2009, BANERJEE & HUMPHRIES, 2016).

Escherichia coli tem sido a segunda espécie mais prevalente em infecções

hospitalares no mundo, atrás apenas do Staphylococcus aureus. Na América Latina, E. coli

é a primeira da lista dos patógenos mais frequentes em infecções hospitalares e está

principalmente associada a infecções do trato urinário (ITU) (FEDLER, BIEDENBACH

& JONES, 2006, DE MAIO CARRILLHO, GAUDERETO, MARTINS et al., 2016). No

Brasil, este patógeno é responsável por 48% das ITU; 11,2% das infecções sanguíneas e

7,2% das infecções de tecido (SADER, GALES, PFALLER et al., 2001, SAMPAIO &

GALES, 2016).

Dentre as enterobactérias, K. pneumoniae é uma das principais bactérias causadoras

de infecção hospitalar associada à pneumonia decorrente da colonização dos pacientes

hospitalizados, e pode ser isolada nas mãos, nasofaringe e fezes. No Brasil, 16,9% das

infecções em UTI são causadas por K. pneumoniae e é a segunda enterobactéria mais

prevalente, atrás apenas da E. coli (KIFFER, HSIUNG, OPLUSTIL et al., 2005, DE MAIO

CARRILLHO, GAUDERETO, MARTINS et al., 2016).

O gênero Enterobacter é considerado emergente nas infecções hospitalares, e ocupa

o terceiro lugar na prevalência da família Enterobacteriaceae no mundo (KIFFER,

HSIUNG, OPLUSTIL et al., 2005). No Brasil, este gênero é responsável por 7,9% das

2

infecções hospitalares em pacientes das UTI (SADER, CASTANHEIRA, MENDES et al.,

2005).

As enterobactérias têm grande incidência relacionadas a infecções hospitalares,

com isso, a utilização dos antimicrobianos está cada vez mais frequente e necessária, e

apesar do desenvolvimento de antimicrobianos ser um dos mais significativos avanços na

medicina moderna, as infecções bacterianas continuam causando inúmeras mortes

(SAMAHA-KFOURY & ARAJ, 2003, ROSSI, GIRARDELLO, CURY et al., 2016).

Os antimicrobianos mais utilizados para as infecções por enterobactérias são beta-

lactâmicos, que atuam bloqueando a síntese da parede celular, estrutura bacteriana sem

homólogo em células eucarióticas. Porém o tratamento das infecções por estes agentes

representa um desafio crescente por ocorrer um aumento progressivo das taxas de

resistência antimicrobiana aos beta-lactâmicos (THADEN, POGUE & KAYE, 2016).

1.2. Antimicrobianos Beta-lactâmicos

Os beta-lactâmicos são um grupo de antimicrobianos definidos pela presença do

anel beta-lactâmico, sendo uma classe de elevada importância devido à sua excelente

eficácia terapêutica e baixa toxicidade. O anel beta-lactâmico determina o mecanismo de

ação, a baixa toxicidade no homem, visto que atuam na parede celular e esta não está

presente nas células eucarióticas e também é o alvo do principal mecanismo de resistência

por parte das bactérias, as betalactamases (SCHEFFERS & PINHO, 2005, SUAREZ &

GUDIOL, 2009).

O anel beta-lactâmico é constituído por três átomos de carbono e um de nitrogênio,

podendo conter diversos radicais substituintes que o tornam ativo. Esse anel pode estar

fundido com diversos anéis, criando os grupos, penicilinas, cefalosporinas,

carbapenêmicos e monobactâmicos que representam a classe dos beta-lactâmicos. Cada

representante tem uma estrutura singular. As penicilinas possuem um anel tiazolidina, as

cefalosporinas um anel dihidrotiazina e os carbapenêmicos um anel pirrólico, já os

monobactâmicos não possuem nenhum anel fundido ao anel principal (Figura 1)(BUSH,

JACOBY & MEDEIROS, 1995).

3

Figura 1. Estrutura dos antimicrobianos beta-lactâmicos. As penicilinas possuem o

anel beta-lactâmico associado a uma estrutura cíclica de 5 membros, enquanto as

cefalosporinas e os carbapenêmicos estão associados a estrutura cíclica de 6 membros. Os

monobactâmicos não possuem estrutura cíclica associada ao anel beta-lactâmico

(WILLIAMS, 1999).

1.2.1. Mecanismo de Ação dos Beta-lactâmicos

Para o tratamento de uma infeção, o ideal seria administrar um antimicrobiano que

exercesse apenas o seu efeito nas bactérias, não prejudicando as células eucarióticas. As

bactérias têm uma estrutura celular muito simples, não contendo membrana nuclear e não

possuem as organelas presentes nos eucariotos, porém possuem parede celular, que reveste

externamente a célula e contêm uma macromolécula denominada de peptideoglicano

(VOLLMER & BERTSCHE, 2008).

O peptideoglicano é um componente essencial da parede celular bacteriana e sua

principal função é preservar a integridade celular. Ele é constituído por cadeias lineares de

açúcares alternados, a N-acetilglucosamina (NAG) e o ácido N-acetilmurânico (NAM)

(VOLLMER, BLANOT & DE PEDRO, 2008).

A síntese do peptideoglicano ocorre em três fases. A primeira ocorre no citoplasma,

a síntese dos peptídeos NAG e NAM, os precursores da malha do peptideoglicano. A

segunda fase é o transporte desses peptídeos pela membrana plasmática para o exterior

celular associados a um transportador de membrana, o bactoprenol e a terceira fase ocorre

4

a ligação destes novos fragmentos à parede celular existente, formando as pontes

interpeptídicas mediadas por ação das transpeptidases da membrana celular bacteriana

(SCHEFFERS & PINHO, 2005).

Os antimicrobianos beta-lactâmicos têm ação na terceira fase da síntese do

peptideoglicano. Nesta fase ocorre a ação das lisinas bacterianas que rompem as ligações

covalentes existentes, para que ocorra a inserção dos novos peptídeos na parede celular.

Esses antimicrobianos conseguem inibir irreversivelmente as transpeptidases, conhecidas

como proteínas de ligação a penicilina (PBP´s, do inglês “penicillin-binding-proteins”),

impedindo assim a formação das ligações entre as cadeias peptídicas de peptideoglicano.

Isto acontece devido à similaridade existente entre o anel beta-lactâmico e a região dos

tetrapeptídeos recém-formados onde se ligariam as PBP´s (BOUHSS, TRUNKFIELD,

BUGG et al., 2008, OZTURK, OZKIRIMLI & OZGUR, 2015).

1.2.2. Resistência Bacteriana

Como resposta evolutiva ao contato das bactérias com os antimicrobianos, as

bactérias desenvolveram mecanismos variados de persistir na presença destes compostos.

A resistência aos antimicrobianos ocorre devido às características codificadas

geneticamente, podendo ser intrínseca ou adquirida. A resistência intrínseca é aquela que

ocorre naturalmente e é característica de cada espécie. Já a resistência adquirida, resulta da

mutação espontânea, que surge durante o crescimento bacteriano ou através de aquisição

do ácido desoxirribonucleico (DNA, do inglês “deoxyribonucleic acid”) exógeno, por

transferência de genes de resistência aos microrganismos sensíveis (RASMUSSEN &

BUSH, 1997, WALTHER-RASMUSSEN & HOIBY, 2007).

A dinâmica do surgimento e disseminação da resistência bacteriana envolve

diversos fatores de mobilização de genes que interagem e contribuem para a seleção

bacteriana. Dentre eles, a transmissão horizontal, que é a capacidade de mobilização dos

genes de resistência de uma célula bacteriana para outra por plasmídeos e transposons

conjugativos e a recombinação que ocorre no mesmo genoma, por transposons, cassetes

gênicos em integrons e sequências de inserção, que podem estar inseridos em plasmídeos

ou transposons e assim, transferidos para outras bactérias. Estes elementos genéticos

móveis possibilitam a mobilização de múltiplos genes permitindo às bactérias

sobreviverem sob pressão seletiva de antimicrobianos (HAWKEY, 2008, CARATTOLI,

2009).

5

Nos beta-lactâmicos, as bactérias conseguem adquirir resistência principalmente

devido a alteração do sítio de ligação, as PBP´s, alteração da permeabilidade da membrana

externa bacteriana e degradação da droga através da produção de beta-lactamases

(MASSOVA & MOBASHERY, 1998, FISHER, MEROUEH & MOBASHERY, 2005,

KONG, SCHNEPER & MATHEE, 2010).

1.2.2.1. Beta-lactamases

A utilização dos antimicrobianos beta-lactâmicos não é tão eficaz devido à

existência das beta-lactamases. A produção de beta-lactamases (BLA) é um dos

mecanismos de resistência adquiridos mais importantes, devido à sua alta prevalência e por

representar uma vantagem adaptativa garantindo a integridade da parede celular na

presença do antimicrobiano. Elas são responsáveis por uma alta taxa de falha terapêutica,

pois as BLA são enzimas que hidrolisam o anel beta-lactâmico. Os genes que codificam as

BLA podem ter localização cromossômica ou plasmidial e quando estão relacionadas com

plasmídeos são facilmente transferidos entre as enterobactérias (LIVERMORE, 1995,

WILKE, LOVERING & STRYNADKA, 2005, DRAWZ & BONOMO, 2010).

Na tentativa de classificar e agrupar estas enzimas para facilitar os estudos, várias

classificações foram criadas, porém as duas mais utilizadas são de Ambler e a de Bush,

Jacoby e Medeiros (Tabela 1) (AMBLER, 1980, BUSH, JACOBY & MEDEIROS, 1995).

A classificação de Ambler foi baseada na estrutura molecular das BLA, de acordo

com a sequência de aminoácidos que as codificam. Foram divididas em quatro classes: A-

Beta-lactamases de espectro estendido (ESBL, do inglês “extended-spectrum beta-

lactamases”), penicilinases e carbenicilinases; B- metalo-beta-lactamases (MBLs); C-

cefalosporinases cromossomais; e D- oxacilinases (AMBLER, 1980).

A classificação de Bush correlaciona as propriedades inibitórias e o substrato

preferencial com a estrutura molecular da enzima divididas em quatro grupos (1, 2, 3, 4) e

vários subgrupos. Em 1995, a classificação de Bush foi atualizada combinando

características funcionais e estruturais das BLA (BUSH, JACOBY et al., 1995).

Atualmente novas tabelas de classificação incluem os elementos genéticos (BUSH &

JACOBY, 2010, LEE, DAS, DAWSON et al., 2016)

6

Tabela 1. Classificação segundo Bush, Jacoby, Medeiros e Ambler com as principais enzimas de resistência.

Grupo de

Bush,

Jacoby e

Medeiros

Classe

Molecular

Ambler

Substratos

preferidos

Características do grupo funcional Algumas Enzimas representativas Grupo de

Bush,

Jacoby e

Medeiros 1 C Cefalosporinas Enzimas cromossômicas e plasmidiais e não são

inibidas pelo ácido clavulânico.

AmpC e MIR-1 1

2a A Penicilinas Penicilinases produzidas por Staphylococcus spp. e

Enterococcus spp.

TEM-1, TEM-2, SHV-2 a SHV-6 2a

2b A Penicilinas e

cefalosporinas.

Beta-lactamase de espectro estendido em bacilos

Gram negativos.

TEM-1, TEM-2 e SHV-1 2b

2be A Penicilinas,

cefalosporinas de

espectro

estendido e

monobactâmicos.

Confere resistência a todos os beta-lactâmicos. TEM-3 a TEM-26, SHV-2 a SHV-6 2be

2br A Penicilinas Beta-lactamases resistentes aos inibidores de beta-

lactamases.

TEM-30 a TEM-36 e TRC-1 2br

2c A Penicilinas e

carbenicila.

Enzimas de hidrolisam carbenicilina. PSE-1, PSE-3, PSE-4 2c

2d D Penicilina e

cloxacilina.

Enzimas que hidrolisam a oxacilina e são levemente


OXA-1 a OXA-11 e PSE-2 2d

2e A Cefalosporinas Cefalosporinases inibidas pelo ácido clavulânico. Cefalosporinases de Proteus vulgaris 2e

2f A Penicilina,

cefalosporinas e

carbapenêmicos.

Enzimas que hidrolisam os carbapenêmicos, são


KPC- 2 em Enterobactérias 2f

3 B Beta-lactâmicos,

carbapenêmicos.

Metalo-beta-lactamases, hidrolisam todos os beta-

lactâmicos exceto monobactâmico e não são inibidas

pelo ácido clavulânico.

L1 de Xanthomonas maltophilia e

CcrA de Bacterioides fragilis

3

4 Não

definido

Penicilina Penicilinases miscelâneas não categorizadas em

nenhum dos grupos.

Penicilinases de Pseudomonas cepacia 4

Adaptado de (BUSH, JACOBY & MEDEIROS, 1995, RASMUSSEN & BUSH, 1997).

7

1.2.2.1.1. Serino Beta-lactamases

As serino beta-lactamases são enzimas que possuem serina no seu centro ativo, e

pertencem aos grupos A, C e D na classificação de Ambler. Estas, acilam os betalactâmicos

e quebram a ligação amida do anel beta-lactâmico (AMBLER, 1980).

1.2.2.2. Beta-lactamases de Espectro Estendido

As ESBL pertencem ao grupo das serino beta-lactamases por conter serina no

centro ativo (PATERSON & BONOMO, 2005). As ESBLs são beta-lactamases da classe

molecular A ou D segundo a classificação de Ambler, ou das classes 2be ou 2d segundo a

classificação de Bush, elas conseguem inativar penicilinas, aztreonam, cefalosporinas de

terceira e quarta geração, porém não são capazes de hidrolisar cefamicinas ou

carbapenêmicos e a maioria é bloqueada por inibidores de BLA como o ácido clavulânico,

sulbactam ou tazobactam (LIVERMORE, 2008).

As enzimas ESBLs têm localização plasmidial, mas podem ter sido originadas nos

cromossomos, pois a maioria das enterobactérias contem enzimas cromossômicas

constitutivas produzidas em baixos níveis. Os plasmídeos que transportam os genes

codificadores das ESBLs podem também transportar determinantes de resistência à

tetraciclinas, aminoglicosídeos, trimetoprim, sulfonamidas e cloranfenicol (SAMAHA-

KFOURY & ARAJ, 2003).

1.2.2.3. Inibidores de Beta-lactamases

Uma maneira de contornar a ação das BLA produzidas por bactérias e

consequentemente evitar a resistência bacteriana é o uso de inibidores. Os inibidores de

BLA são semelhantes às penicilinas, retendo a propriedade de se ligar a porção amida do

grupo beta-lactâmico com uma cadeia lateral diferente, porém sem a atividade de inibir as

enzimas de síntese do peptideoglicano. Estas estruturas permitem aos inibidores ligar-se

irreversivelmente às BLA como substratos suicidas, mantendo-as inativas. Atualmente,

três inibidores de BLA são utilizados na clínica médica, ácido clavulânico, tazobactam e

sulbactam (Figura 2) (BUSH, JACOBY & MEDEIROS, 1995, SADER, TOSIN, SEJAS

et al., 2000). No entanto, novos inibidores de beta-lactamases, como o avibactam estão

sendo desenvolvidos com a capacidade de inibir além das beta-lactamases, as

8

carbapenemases do tipo Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) (PAPP-

WALLACE, BETHEL, DISTLER et al., 2010, KRISHNAN, NGUYEN, PAPP-

WALLACE et al., 2015, PAPP-WALLACE, WINKLER, TARACILA et al., 2015) e das

metalo-beta-lactamases (MBL) do tipo VIM-2 (XIAO, FANG, SHI et al., 2015).

Figura 2. Estrutura dos inibidores de BLA (WILLIAMS, 1999).

1.3. Antimicrobianos Carbapenêmicos

Devido ao surgimento das ESBLs que apresentavam resistência a maioria os beta-

lactâmicos já existentes, em 1990, as indústrias farmacêuticas disponibilizaram os

antimicrobianos carbapenêmicos que atualmente tem como representantes o meropenem,

imipenem, ertapenem e doripenem (LANDMAN, BRATU, KOCHAR et al., 2007)

O primeiro antimicrobiano da classe dos carbapenêmicos descoberto foi o

imipenem que apresenta uma estrutura de amidina derivada da tianomicina com

substituições do grupo metila para aumentar a ação bactericida e fornecer estabilidade

contra as enzimas BLA. Uma desvantagem desse antimicrobiano é a sua rápida degradação

pela enzima dehidropeptidase-1 (DHP-1) que está localizada nos túbulos renais,

necessitando uma administração combinada com um inibidor de DHP-1. Mais tarde, os

antimicrobianos ertapenem e meropenem demonstraram uma maior estabilidade para

DHP-1 (KATTAN, VILLEGAS & QUINN, 2008).

Os antimicrobianos carbapenêmicos imipenem e meropenem possuem um amplo

espectro de ação in vitro, com atividade contra as bactérias Gram positivas, Gram negativas

e anaeróbias, com exceção de Stenotrophomonas maltophilia, Staphylococcus meticilina

resistente (MRSA, do inglês “Methicillin-resistant Staphylococcus aureus”) e

Enterococcus faecium. Quanto ao ertapenem, este fármaco possui um espectro de ação

mais limitado, não conseguindo atuar contra os bacilos Gram negativos não fermentadores.

Já o doripenem, o mais novo antimicrobiano carbapenêmico, combina os espectros de ação

do imipenem e meropenem com uma atividade mais potente contra a Pseudomonas

aeruginosa (MOHR, 2008).

9

Os antimicrobianos do grupo dos carbapenêmicos têm sido considerados terapia de

escolha pelo seu amplo espectro de ação, pela sua estabilidade e por serem fármacos bem

tolerados pelos pacientes com pouco efeitos adversos. Na última década, porém,

aumentaram muito os índices de resistência, como uma resposta adaptativa das bactérias e

por consequência do uso indiscriminado desses antimicrobianos (NICOLAU, 2008).

1.3.1. Carbapenemases

Atualmente, o uso dos carbapenêmicos pode selecionar as bactérias que produzem

mecanismos de resistência. As carbapenemases são BLA com atividade hidrolítica contra

os carbapenêmicos, possuem um amplo espectro de atividade incluindo quase todos os

antimicrobianos beta-lactâmicos e algumas destas enzimas apresentam maior resistência

aos inibidores de BLA (LIVERMORE & WOODFORD, 2006, QUEENAN & BUSH,

2007).

As carbapenemases estão classificadas segundo Ambler na classe A, as MBLs na

classe B e as oxacilinases na classe D e nos grupos funcionais 2f e 3 de Bush.

1.3.1.1. Carbapenemases de Classe A

As serino-carbapenemases pertencem ao grupo funcional 2f de Bush, são

atualmente as carbapenemases mais reportadas em isolados clínicos desde sua primeira

descoberta há mais de 20 anos. Estas enzimas quando presentes nas bactérias podem

conferir alto grau de resistência aos carbapenêmicos ou permanecerem silenciosas nos

testes de antibiogramas apresentando concentrações inibitórias mínimas (CIMs) no

intervalo de sensibilidade. Estas BLA, portanto, podem não ser detectadas pelo teste de

antibiograma rotineiro (QUEENAN & BUSH, 2007).

As serino-carbapenemases são divididas em quatro grupos, sendo que três

pertencem à classe A e são enzimas NMC/IMI, SME e KPC caracterizadas por hidrolisar

uma variedade de antimicrobianos beta-lactâmicos, incluindo penicilinas, cefalosporinas,

aztreonam e carbapenêmicos, porém as enzimas NMC/IMI e SME podem ser inibidas

fracamente pelo ácido clavulânico e tazobactam (NORDMANN & POIREL, 2002). O

quarto grupo é composto pelas enzimas GES, que são originadas das ESBL, mas ao longo

do tempo, variantes com atividade hidrolítica ao imipenem foram descobertas (QUEENAN

& BUSH, 2007, WALTHER-RASMUSSEN & HOIBY, 2007).

10

O mecanismo hidrolítico destas carbapenemases ocorre quando a enzima se associa

de forma não covalente ao antimicrobiano. O anel beta-lactâmico é então bloqueado pelo

radical hidroxila livre que está no sítio ativo da BLA, formando uma ligação covalente acil-

éster. Ao ocorrer a hidrólise deste éster, o antimicrobiano beta-lactâmico é inativado

(LIVERMORE, 1995).

1.3.1.1.1. KPC

Dentre as serino-carbapenemases, a enzima KPC tem grande relevância pela alta

incidência nos ambientes hospitalares. A KPC foi descrita primeiramente em uma cepa de

K. pneumoniae identificada no ano de 1996, mas a publicação só ocorreu em 2001 nos

Estados Unidos e seu nome refere-se à espécie na qual a enzima KPC foi identificada. Este

isolado apresentava resistência a todos os antimicrobianos beta-lactâmicos, porém a CIM

aos carbapenêmicos diminuía quando adicionado ácido clavulânico (YIGIT, QUEENAN,

ANDERSON et al., 2001). Depois desta descoberta, surgiram outras variantes, totalizando

dez até o momento, sendo que duas delas foram encontradas em Pseudomonas aeruginosa

e Acinetobacter baumannii, o que mostra que dada a localização plasmidial do gene, ocorre

a disseminação de determinantes genéticos móveis entre gêneros bacterianos distintos

(WALSH, 2010, WIDMANN, PLEISS & OELSCHLAEGER, 2012)

As enzimas do tipo KPC por serem encontradas em plasmídeos transferíveis e

apresentarem um perfil hidrolítico mais amplo quando comparadas às enzimas

cromossomais, hidrolisam todos os antimicrobianos beta-lactâmicos incluindo penicilinas,

monobactâmicos, cefalosporinas e carbapenêmicos. Estando ausentes outros mecanismos

de resistência, as KPC não conferem resistência aos carbapenêmicos, apenas conferem uma

sensibilidade reduzida. Com isto, alguns testes fenotípicos não conseguem detectar a

produção de KPC por estas bactérias (CUZON, NAAS, TRUONG et al., 2010).

Ainda existe dificuldade em detectar laboratorialmente bactérias produtoras de

KPC, pois essas bactérias podem não demonstrar resistência aos carbapenêmicos in vitro,

pelos testes convencionais e, se a opção terapêutica for os carbapenêmicos, pode ocorrer

falha terapêutica e seleção das bactérias produtoras de KPC (PFEIFER, CULLIK &

WITTE, 2010).

O Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) em 2009 propôs utilizar o teste

de Hodge modificado (THM) como um teste complementar para a detecção da produção

de KPC, e em 2011 para aumentar a sensibilidade de detecção laboratorial dessa

11

carbapenemase, diminuíram os pontos de cortes dos antimicrobianos ertapenem,

meropenem e imipenem considerando dados epidemiológicos, genéticos e de avaliação da

farmacocinética e farmacodinâmica dos carbapenêmicos (CLSI, 2009, CLSI 2011).

1.3.1.1.2. Enzimas Cromossomais: IMI, NMC e SME

As carbapenemases IMI, NMC e SME são representantes das serino-

carbapenemases com atividade cromossomal e induzível. Essas enzimas possuem um perfil

hidrolítico forte frente as aminopenicilinas e aos carbapenêmicos e uma hidrólise fraca das

ureido-penicilinas e do azetreonam e não hidrolisa cefalosporinas de espectro estendido. O

perfil de antibiograma apresenta sensibilidade reduzida ou resistência aos carbapenêmicos

associado à sensibilidade às cefalosporinas de espectro estendido (NORDMANN &

POIREL, 2002).

Estas carbapenemases cromossomais podem ser induzidas em resposta ao uso de

imipenem e cefoxitina e por não apresentarem nenhuma associação com elementos móveis

possuem uma baixa prevalência. Estes mecanismos têm sido descritos em particularmente

duas espécies de enterobactérias, Serratia marcescens a enzima SME e em Enterobacter

cloacae as enzimas NMC e IMI (QUEENAN & BUSH, 2007).

1.3.1.1.3. GES

As últimas serino-carbapenemases da classe A relatadas são as enzimas do tipo

GES. Este grupo contém quinze enzimas, porém apenas quatro, GES-2, GES-4, GES-5, e

GES-6, têm atividade para os carbapenêmicos (QUEENAN & BUSH, 2007).

Existem poucos relatos de carbapenemases do tipo GES e a GES-5 é a enzima com

maior disseminação, tendo sido encontrada da África do Sul, Grécia e Japão. Estas enzimas

são relatadas associadas a frequências únicas de casos (QUEENAN & BUSH, 2007). No

Brasil apenas a GES-5 foi detectada em isolados de P. aeruginosa e K. pneumoniae em um

hospital em São Paulo (PICAO, POIREL, GALES et al., 2009, RIBEIRO, FALCI,

ROZALES et al., 2014).

1.3.1.2. Metalo-Beta-lactamase

A primeira MBL foi descrita em 1966 em isolados de Bacillus cereus, sendo

codificada cromossomicamente (DAVIES & ABRAHAM, 1974). Devido ao surgimento

12

das MBLs mediadas por plasmídeos em Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. e em

membros da família Enterobacteriaceae em vários países, este mecanismo de resistência

tem se tornado um sério problema, pois limita as opções terapêuticas para combater

infecções causadas por essas bactérias. Além disso, não são descritos inibidores efetivos

dessas enzimas (POIREL, MAGALHAES, LOPES et al., 2004). Atualmente apenas para

a enzima VIM-2 um inibidor possui ação efetiva, porém ainda em fase de teste (XIAO,

FANG, SHI et al., 2015).

As MBLs são BLA pertencentes a classe B de Ambler ou classe 3 de Bush, são

capazes de hidrolisar todos os beta-lactâmicos, exceto o aztreonam e são resistentes aos

inibidores de BLA e sensíveis à inibição por quelantes. Estas enzimas dependem dos íons

de zinco divalentes para hidrolisar os antimicrobianos. As MBLs cromossômicas são

produzidas intrinsecamente em Stenotrophomonas maltophila, Bacillus cereus, Legionella

gormaniie, Aeromonas spp. e Chryseobacterium meningosepticum. Já as MBLs

plasmidiais têm aumentado a disseminação nos últimos anos e está diretamente relacionada

a frequência da espécie (RICCIO, FRANCESCHINI, BOSCHI et al., 2000). As classes de

MBLs relatadas em isolados clínicos incluem Verona imipemenase (VIM), imipenemase

(IMP), Nova Delhi metalo-beta-lactamase (NDM), German imipenemase (GIM), São

Paulo metalo-beta-lactamase (SPM) e Seoul imipenemase (SIM) (WALSH, TOLEMAN,

POIREL et al., 2005).

1.3.1.2.1. IMP e VIM

A primeira enzima IMP foi descoberta em 1988 no Japão em uma cepa de P.

aeruginosa e durante muitos anos ficou restrita apenas neste país, porém, atualmente IMP-

1 tem sido encontrada em diversos países e em diferentes espécies bacterianas, como

Acinetobacter baumannii, P. aeruginosa e K. pneumoniae. Existem 26 variantes

pertencentes à sub-classe IMP descritas até o momento (OSANO, ARAKAWA,

WACHAROTAYANKUN et al., 1994, DANEL, HALL, DUKE et al., 1999, CARRER,

POIREL, YILMAZ et al., 2010).

A primeira enzima VIM foi descrita na Itália a partir de uma cepa de P. aeruginosa

isolada em 1997. O gene blaVIM-1 codifica uma proteína composta por 266 aminoácidos

e possui pouca semelhança com outras MBLs, entretanto, possuem atividades cinéticas

similares. Das vinte e três enzimas de VIM, três, VIM-12, VIM-19 e VIM-23 foram

13

descritas em enterobactérias e as demais em P. aeruginosa (YONG, TOLEMAN, GISKE

et al., 2009).

1.3.1.2.2. NDM

A primeira NDM foi descrita em 2008 em uma viajante sueca que esteve na Índia,

deste então blaNDM foi encontrada em todos os continentes (YONG, TOLEMAN, GISKE

et al., 2009). Em comparação com outras MBLs, a NDM tem características de propagação

alarmante, incluindo ampla distribuição em bactérias Gram negativas, sendo facilmente

adquiridas por E. coli e K. pneumoniae, que são espécies da microbiota intestinal e com

grande capacidade de sobreviver no ambiente inanimado. A NDM está presente de forma

endêmica no continente indiano, sudeste e leste da Ásia, que abriga uma grande proporção

da população mundial, tem grande transferência interespécies e pode ser transportado com

outros genes de resistência (RAHMAN, SHUKLA, PRASAD et al., 2014).

1.4. Antimicrobiano Polimixina

O surgimento de microrganismos pan-resistentes, os quais resistem a todas as

classes de antimicrobianos testados, são atualmente uma ameaça para a saúde humana que

pode ocasionar uma catástrofe iminente de uma era pós- antimicrobianos, em que infecções

comuns e ferimentos leves podem voltar a matar. A resistência aos antimicrobianos pode

colocar as conquistas da medicina moderna em risco. Sem antimicrobianos eficazes para a

prevenção e tratamento de infecções, transplantes de órgãos, quimioterapia e cirurgias

como cesarianas serão mais arriscadas e perigosas (NORDMANN & POIREL, 2014).

A polimixina é um polipeptídio catiônico produzido por Bacillus polymyxa,

descoberta em 1947, e os principais representantes são, polimixina A, B, C, D e E

(colistina), sendo utilizada clinicamente apenas Polimixina B e (LI, NATION, MILNE et

al., 2005). A utilização destes antimicrobianos por via intravenosa para combater infecções

causadas por bactérias Gram negativas foi diminuindo em 1980, devido à alta toxicidade,

principalmente lesão renal, e ao surgimento de outros antimicrobianos menos tóxicos. Com

isso, o uso endovenoso de colistina foi restringido durante duas décadas para o tratamento

de infecções pulmonares causadas por bactérias Gram negativas multirresistentes em

pacientes com fibrose cística (FALAGAS & KASIAKOU, 2005).

O surgimento de bactérias resistentes à maioria das classes de antimicrobianos e

a indústria farmacêutica não ter desenvolvido novos antimicrobianos os quais as bactérias

14

ainda não tenham mecanismo de resistência efetivos, as polimixinas foram novamente

introduzidas na prática clínica, em alguns casos, como última opção terapêutica disponível

(FALAGAS & KASIAKOU, 2005, LIU, ZHANG, LIU et al., 2015).

1.4.1. Resistência à Polimixina

Para graves infecções causadas por Enterobacteriaceae produtoras de

carbapenemase as opções de tratamento são restritas e normalmente contam com

tigeciclina e polimixina isoladamente ou em combinação com outros antimicrobianos

(LIU, ZHANG, LIU et al., 2015). Como a incidência de enterobactérias produtoras de

carbapenemases está cada vez maior, a utilização em grande escala da polimixina para

tratamento pode aumentar o risco de pan-resistência (FALAGAS, LOURIDA,

POULIKAKOS et al., 2014).

1.4.1.1. Resistência à Polimixina por Mutação Genética

As bactérias já desenvolveram mecanismos capazes de inativar a ação da

polimixina. Um deles é a resistência cromossômica mediada que tem como alvo impedir a

ação da polimixina na membrana celular da bactéria. A ligação inicial da polimixina com

a membrana ocorre através de interações eletrostáticas entre o polipeptídeo catiônico do

fármaco e o lipopolissacárideo (LPS) da membrana externa da bactéria Gram negativa. A

polimixina libera magnésio (Mg+2) e cálcio (Ca+2), que normalmente estabiliza as

moléculas de LPS, levando a uma perturbação na membrana externa, o que provoca um

aumento na permeabilidade da membrana, um vazamento do conteúdo citoplasmático, e,

consequentemente, a morte das células (MOORE, BATES & HANCOCK, 1986).

A resistência cromossômica adquirida ocorre devido à mutação genética em

espécies sensíveis a polimixina e é dependente da antibioticoterapia com polimixina. Além

disso, é um fenótipo reversível que na ausência da pressão seletiva estabelecida pelo

fármaco é eliminada, já a resistência natural é característica de determinadas espécies

bacterianas e independe da presença contínua do antimicrobiano (FALAGAS &

KASIAKOU, 2005, LIU, WANG, WALSH et al., 2016).

15

1.4.1.2. Resistência à Polimixina por Plasmídeo (MCR-1)

Até o momento a resistência às polimixinas eram desenvolvidas apenas por

mutação genética cromossômica, porém com a alta utilização deste antimicrobiano em

produção agrícola e para combater infecções graves por enterobactérias multirresistentes

nos hospitais, as bactérias desenvolveram um mecanismo de resistência por plasmídeo,

denominado MCR-1, contra os antimicrobianos polimixina B e colistina (LIU, WANG,

WALSH et al., 2016).

O gene MCR-1 foi encontrado em um plasmídeo conjugativo em E. coli e

desenvolve um novo tipo de resistência à polimixina através da produção de transferase

fosfoetanolamina que é transferível interespécies com alta frequência. Esse plasmídeo

transfere informações para desenvolvimento de resistente a polimixina.

A análise do plasmídeo revelou que ocasionalmente plasmídeos de estrutura

semelhante foram detectados em Salmonella typhimurium, K. pneumoniae, E. coli e alguns

plasmídeos portadores de MCR-1 também abrigam outros genes de resistência, incluindo

ESBL e carbapenemases (SCHWARZ & JOHNSON, 2016).

1.5. Antimicrobiano Tigeciclina

As enterobactérias já desenvolveram resistência a tigeciclina, apesar de ser um

antimicrobiano novo aprovado pelo U.S. Food and Drug Administration (FDA) em 2005.

Vários estudos começaram a demonstrar enterobactérias que inicialmente eram sensíveis,

adquiriram mecanismos de resistência à tigeciclina (ALEXOPOULOU, VASILIEVA,

AGIASOTELLI et al., 2016).

A tigeciclina é um antimicrobiano derivado de minociclina, sendo o único

representante do grupo das glicilciclinas. O seu mecanismo de ação consiste na inibição da

tradução proteica atuando na subunidade 30S do ribossomo, bloqueando a entrada do RNA

transportador. Este antimicrobiano exibe um largo espectro de atividade contra a maioria

das bactérias Gram positivas, Gram negativas, anaeróbios e bactérias atípicas (ZHONG,

XU, CHEN et al., 2014).

1.6. Detecção Laboratorial das Carbapenemases

Com o surgimento de novos mecanismos de resistência bacteriana que dificilmente

são detectados pelos métodos tradicionais de realização do antibiograma, os laboratórios

16

de microbiologia estão adotando testes complementares para triagem fenotípica. Os novos

perfis de resistência, principalmente nas enterobactérias, ocorreram após o aumento na

utilização dos antimicrobianos beta-lactâmicos (LEE & CHUNG, 2015).

A detecção de bactérias produtoras de mecanismos de resistência adquiridos como

as BLA, ESBL, carbapenemases e MCR-1 é uma questão importante para definição da

terapia apropriada e, principalmente, para a implementação de medidas de controle de

infecção. Entretanto a detecção dessas bactérias com genes de resistência só é realizada

quando estas já exibem resistência nos testes de sensibilidade ao antimicrobiano, pois os

testes fenotípicos são baseados nas resistências aos antimicrobianos e os testes moleculares

têm alto custo (HAMMOUDI, MOUBARECK & SARKIS, 2014).

1.6.1. Testes Fenotípicos

Os sistemas automatizados identificam bactérias e realizam testes de sensibilidade

através do sistema de detecção óptica. Os testes de sensibilidade são semi-quantitativos,

pois avaliam de duas a quatro diluições que representam os limites de sensibilidade e

resistência de cada antimicrobiano, sendo assim, não fornecem o resultado exato da CIM

da droga (HIRSCH, CHANG, ZUCCHI et al., 2014).

Os testes fenotípicos recomendados pelo CLSI 2016 para detectar resistências

atípicas nos laboratórios de rotina são utilizados para triar as principais resistências aos

carbapenêmicos, KPC e MBLs. O THM, para detecção da KPC e o teste com inibidor e

potenciador de crescimento bacteriano, para detecção das MBLs, principalmente NDM

(CLSI, 2016).

No Brasil, a ANVISA publicou a nota técnica Nº 01/2013 – “Medidas de prevenção

e controle de infecções por enterobactérias multirresistentes”-, recomendando a

determinação da resistência para os antimicrobianos carbapenêmicos, polimixina B,

colistina e tigeciclina através da CIM por métodos quantitativos para guiar o tratamento e

o teste complementar com inibidor e potenciador de crescimento bacteriano para definir a

carbapenemase KPC e MBL presente no isolado bacteriano.

1.6.1.1. Teste de Gradiente de Difusão

O teste de gradiente de difusão (TGD) é um método quantitativo, baseado nos

conceitos dos testes de difusão e diluição. Como os métodos de CIM, o TGD quantifica

diretamente a sensibilidade antimicrobiana e apesar de ser processado como teste de disco

17

convencional, difere do método pelo uso de um gradiente pré-formado e estável de

antimicrobiano com concentrações crescentes marcadas com uma escala para leitura da

elipse formado (Figura 3). O resultado é avaliado através do gradiente de concentração

exponencial pré-definido com uma faixa contínua que varia de 0,016 a 256 µg/mL ou 0,002

a 32 µg/mL dependendo do antimicrobiano. A interpretação do resultado é realizada

baseada nas CIM definidos pela Nota Técnica 01/2013 ANVISA (PEREZ, 2015).

Figura 3. Teste de sensibilidade através TGD de polimixina B CIM 64 µg/mL (Autoria

própria).

1.6.1.2. Disco Difusão com Ácido Etilenodiamino Tetra-acético e com Ácido

Fenilborônico

Um teste fenotípico para detectar as carbapenemases mais encontradas atualmente

em enterobactérias (MOELLERING, 2010) em laboratórios clínicos é baseado na

capacidade que o ácido fenilborônico (AFB) e o ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA,

do inglês “Ethylenediamine tetraacetic acid”) têm de potencializar a inibição das bactérias

(ANVISA, 2013).

O teste é realizado após a realização do antibiograma com resultado resistente a

qualquer antimicrobiano carbapenêmico, porém para as bactérias Citrobacter freundii,

Enterobacter spp., Serratia spp., Providencia spp., Morganella morganii e Hafnia alvei

(grupo CESP) deverão ser considerados apenas os resultados do meropenem e imipenem

(Figura 4) (ANVISA, 2013).

18

Figura 4. Teste da nota técnica 01/2013 da ANVISA com carbapenêmicos sem aditivo,

com 10 µL de AFB e 10 µL de EDTA para avaliar aumento dos halos de inibição dos

antimicrobianos (mm). Resultado: espécie avaliada K. pneumoniae, número 1 ertapenem

(5 mm), 2 meropenem (5 mm), 3 imipenem (14 mm). Com AFB, números 4 imipenem (18

mm) e 5 meropenem (12 mm). Com EDTA números 6 imipenem (20 mm) e 7 meropenem

(12 mm) (Autoria própria).

1.6.1.2.1. EDTA

O EDTA é um ácido aminopolicarboxílico incolor, solúvel em água que exerce um

efeito inibidor sobre o crescimento de microrganismos por sequestrar o ferro e outros íons

metálicos essenciais. Ele é frequentemente usado como um agente seletivo bacteriano e

sua utilidade surge devido ao seu papel como um ligante hexadentado e agente quelante ,

ou seja, sua capacidade de sequestrar os íons do metal tais como Ca2+ e ferro (Fe3+) . Depois

de ser ligado por EDTA, os íons de metais permanecem em solução, mas exibem

reatividade diminuída. EDTA também é conhecido por inibir uma variedade de

metalopeptidases, o método de inibição ocorre através da quelação do íons metálicos

necessários para a atividade catalítica (LEOPOLD & FRICKE, 1997, HATTORI,

KAWAMURA & ARAKAWA, 2013).

1.6.1.2.2. AFB

O AFB tem sido utilizado na detecção de BLA classe A mediada por plasmídeo.

Esse composto é um inibidor das enzimas do tipo KPC. A sinergia do AFB com os

antimicrobianos foi aplicada para a identificação fenotípica dos isolados produtores de

KPC. Os resultados positivos apresentam um efeito sinérgico entre os antimicrobianos

carbapenêmicos e o AFB, demonstrando uma interação com o sítio ativo das enzimas KPC

(PASTERAN, MENDEZ, RAPOPORT et al., 2010, POURNARAS, POULOU &

TSAKRIS, 2010).

19

1.6.1.3. Teste de Hodge modificado

O THM é baseado na inativação de um antimicrobiano carbapenêmico por uma

cepa resistente produtora de carbapenemase de modo que uma cepa sensível seja capaz de

crescer em uma região próxima do disco de carbapenêmico quando normalmente não

cresceria (Figura 5) (ABIDIN, SULONG, ALFIZAH et al., 2015).

A detecção laboratorial de carbapenemase é um desafio, especialmente para os

laboratórios sem recursos de diagnóstico molecular, então o THM é uma opção adicional

para triar as bactérias produtoras de carbapenemases. O CLSI, a partir de 2009, propôs a

detecção fenotípica de carbapenemases do tipo KPC pelo THM para cepas que apresentam

sensibilidade diminuída aos carbapenêmicos, porém apesar de ser de fácil execução, existe

divergência nos valores de especificidade (CARVALHAES, PICAO, NICOLETTI et al.,

2010).

Embora o THM apresente sensibilidade elevada, superior a 90% para KPC, a sua

interpretação é difícil e subjetiva, muitos estudos demonstraram resultados positivos na

presença de outras BLA como ESBL e AmpC acopladas com perda de porina

(POURNARAS, POULOU & TSAKRIS, 2010, RIBEIRO, LINHARES, ZAVASCKI et

al., 2014).

Figura 5. Teste de Hodge modificado para avaliar a produção de KPC (Autoria

própria). Notar o halo distorcido em duas semeaduras em traço, número 1 controle positivo

com a bactéria K. pneumoniae BAA1705 e número 2 com a bactéria a ser pesquisada, que

é indicativo de presença de carbapenemase do tipo KPC. Número 3, controle negativo com

a bactéria K. pneumoniae BAA1706 sem distorção do halo e número 4, E. coli ATCC

25922, cepa sensível aos carbapenêmicos.

20

1.6.1.4. Teste de Inativação dos Carbapenêmicos

O teste de inativação dos carbapenêmicos (TIC) é um ensaio fenotípico para

detectar cepas produtoras de carbapenemases através de hidrólise enzimática dos

antimicrobianos. Os genes que codificam carbapenemases estão na maioria das vezes

localizados em plasmídeos e são mais susceptíveis à transmissão entre as bactérias, então

a distinção entre resistência mediada por carbapenemases plasmidiais e resistência mediada

por outros mecanismos é importante para o controle de infecção (VAN DER ZWALUW,

DE HAAN, PLUISTER et al., 2015).

A vantagem do teste TIC é que ele pode detectar as carbapenemases

independentemente da sequência genética que a codifica, porém não identifica qual é a

carbapenemase que está presente. Este teste apresenta melhor sensibilidade do que o THM

e o teste da nota técnica 01/2013 para detectar as carbapenemases do tipo NDM e OXA-

48 (VAN DER ZWALUW, DE HAAN, PLUISTER et al., 2015).

O teste TIC é baseado no consumo do antimicrobiano presente nos discos

comerciais para realização do teste de suscetibilidade (Figura 6). A bactéria a ser

pesquisada é colocada em alta concentração em uma suspensão com o disco de meropenem

por um tempo determinado e ao retirar o disco dessa suspensão, o teste de suscetibilidade

com E.coli ATTC 25922 conhecidamente sensível aos carbapenêmicos é realizado. A

interpretação para o teste é baseada na formação do halo de inibição, se não forma o halo,

a bactéria que foi colocada na suspensão consumiu o antimicrobiano presente no disco e o

resultado é positivo para carbapenemase (VAN DER ZWALUW, DE HAAN, PLUISTER

et al., 2015).

Figura 6. Teste de inativação do carbapenêmico para avaliar a produção de

carbapenemase (Autoria própria). Os discos numerados de 1 a 10 tiveram o

antimicrobiano do disco consumido pela bactéria a ser pesquisada e o resultado é positivo

21

para a produção de carbapenemase e o disco N é o controle negativo do teste com o halo

de inibição.

1.6.2. Testes Moleculares

Os testes moleculares são confirmatórios para detectar a presença de genes de

resistência bacteriana. A caracterização molecular dos mecanismos de resistência permite

aos programas de vigilância identificar os genes de resistência circulantes e realizar estudos

epidemiológicos envolvendo cepas resistentes, inclusive as produtoras de ESBL,

carbapenemases e MCR-1 (BONOMO, 2011).

A disseminação de clones bacterianos com genes de resistência é uma ameaça para

o controle de infecção bacteriana e para a antibioticoterapia. Alguns estudos apontam

alguns clones como responsáveis pela disseminação de importantes genes de resistência

como a K. pneumoniae ST258 produtora de KPC-2 ou KPC-3 e disseminação de E. coli

ST131 produtora de ESBL CTX-M-15. Também, crescentes relatos da detecção da enzima

NDM, já preocupa, pois pode se disseminar globalmente por clones específicos e

plasmídeos epidêmicos (KITCHEL, RASHEED, PATEL et al., 2009, LEAVITT,

CARMELI, CHMELNITSKY et al., 2010, BONOMO, 2011).

1.6.2.1. Reação em Cadeia da Polimerase

A pesquisa dos genes de resistência blaKPC, blaNDM e MCR-1 pela técnica de

reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglês “polymerase chain reaction”) que através

da amplificação de DNA permite identificar e caracterizar estes genes em uma grande

quantidade de amostras simultaneamente, facilita os estudos epidemiológicos

(WOODFORD, TURTON & LIVERMORE, 2011).

Os métodos baseados em PCR têm sido amplamente utilizados, pois seu princípio

básico consiste em amplificar regiões específicas da molécula do DNA utilizando os

oligonucleotídeos e as DNA polimerases tornando possível estudar regiões específicas

(CHROMA & KOLAR, 2010).

A técnica de PCR permite obter, em apenas algumas horas, um elevado número de

cópias de um fragmento específico de DNA a partir de uma quantidade mínima de amostra.

Para realizar a PCR, além do fragmento de DNA, é necessário ter uma DNA polimerase

termoestável, os quatro desoxirribonucleosídeos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP e dTTP,

em conjunto, dNTPs), um par de oligonucleotídeo iniciador específico (Forward sentido

22

5’ – 3’, e Reverse sentido 3’ – 5’) e um tampão apropriado para a reação ser realizada. A

reação envolve a repetição cíclica (25-30 vezes) de três etapas que correspondem a simples

mudanças na temperatura de incubação: desnaturação do DNA, hibridização dos

oligonucleotídeos iniciadores e extensão. No final da reação, os produtos de PCR incluem

a molécula de DNA de cadeia dupla original e milhões de cópias do fragmento inicial

amplificado (BROWN, 2001).

1.6.2.2. Eletroforese em Gel em Campo Pulsado (PFGE)

Técnicas com capacidade discriminatória que permitam distinguir cepas de um

mesmo clone e mutações pontuais responsáveis pela resistência específica a

antimicrobianos, facilitam a implantação de medidas de barreira e podem orientar a

conduta da antibioticoterapia de forma mais eficiente e reduzir a prevalência de clones

resistentes (JOHNSON, URBAN, WEISSMAN et al., 2012).

A eletroforese em gel em campo pulsado (PFGE, do inglês “pulsed field gel

eletrophoresis”) é uma técnica de eletroforese apropriada para separar grandes fragmentos

de DNA, por meio da organização do DNA em gel pela ação de alternados campos

elétricos. A eletroforese em gel de agarose é a técnica mais utilizada para separação de

moléculas de DNA por tamanho. A matriz formada pela agarose, cuja porosidade é

inversamente proporcional à concentração do gel, atua como filtro molecular

(FANGMAN, 1978).

Durante a eletroforese, e a dificuldade de transpor a matriz de agarose em direção

ao polo positivo é inversamente proporcional ao tamanho de cada molécula, com isso

moléculas mais pesadas se difundem menos e as menores migram mais rapidamente

possibilitando a separação por tamanho ou peso molecular (SMITH & CANTOR, 1987).

Com o intuito de se discriminar linhagens bacterianas de uma mesma espécie, o

DNA bacteriano total é digerido com enzimas de restrição que clivam o cromossomo em

grandes fragmentos. Os fragmentos formados são então separados por PFGE (SLATER,

DESRUISSEAUX & HUBERT, 2001).

23

2. JUSTIFICATIVA

Nos últimos anos a literatura tem evidenciado um número expressivo de genes

bacterianos de resistência à diversas classes de antimicrobianos, configurando-se um

problema de saúde pública mundial. A dinâmica e disseminação da resistência bacteriana

aos antimicrobianos envolvem vários fatores, que interagem e contribuem para a seleção

das bactérias. No entanto, o principal fator é a capacidade que as bactérias têm em

mobilizar genes de resistência (CARATTOLI, 2009, BAJAJ, SINGH & VIRDI, 2016).

Na família Enterobacteriaceae, a resistência aos carbapenêmicos é um fenômeno

que tem importância epidemiológica e clínica (MUNOZ-PRICE, POIREL, BONOMO et

al., 2013), e no Brasil, não possui um sistema de informação efetivo em resistência

bacteriana capaz de unificar e definir as ações necessárias para cada local, com isso, utiliza

as informações de outros países por meio de documentos como CLSI (ANDRADE &

DARINI, 2015).

O hospital do estudo presta um serviço final ao paciente portador de necessidades

especiais, com o objetivo de ensinar a família e o paciente a viver com a deficiência

adquirida, com isso, quanto menor a quantidade de infecção adquirida, maior o tempo

disponível para as atividades de reabilitação, pois os pacientes com infecções não realizam

todas as atividades e retardam a alta hospitalar. Então investigar as principais

carbapenemases circulantes, ajudará na terapia empírica e na prevenção.

Um incentivo ainda maior foi através da Organização Mundial de Saúde que

elaborou a primeira lista de patógenos para incentivar pesquisas e buscar novos tratamentos

das infecções. A classificação foi de acordo com a capacidade que a bactéria tem em

adquirir resistência, e as enterobactérias foram citadas como prioridade crítica. Embora

seja relevante, poucos estudos têm relacionado a presença de carbapenemases no estado de

Goiás, e conhecer não só essas resistências, mas quais as mais relevantes vão ajudar na

definição de tratamento para infecções com esses patógenos.

24

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

Caracterização fenotípica e genética de enterobactérias produtoras de

carbapenemases em um hospital de Goiânia.

3.2. Objetivos Específicos

Identificar a presença de enterobactérias produtoras de carbapenemase do tipo KPC

e NDM no hospital do estudo.

Verificar a presença dos genes blaKPC, blaNDM e MCR-1 nas bactérias

investigadas.

Caracterizar a similaridade genética dos isolados clínicos por PFGE.

Identificar possíveis clusters responsáveis pela infecção por isolados de K.

pneumoniae KPC positivos.

25

4. MÉTODOS

4.1. Seleção das amostras e aspectos ético-legais

As amostras bacterianas foram obtidas de exame de cultura de secreções, urina,

ponta de cateter, hemoculturas entre outras, coletadas dos pacientes do hospital de

reabilitação entre os anos de 2012 e 2016 mediante necessidade de investigação de infecção

solicitada pelos médicos assistentes, ou quando solicitadas culturas de vigilância, conforme

protocolo padrão da instituição.

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFG número 961.813

(anexo 01).

4.2. Perfil Clínico do Hospital

O hospital do estudo realizado atende especialmente o grande incapacitado,

principalmente pacientes com doenças neuromusculares, lesão encefálica adquirida,

malformação congênita, lesão medular e paralisia cerebral. Possui 136 leitos divididos em

quatro alas de tratamento. Internação 1 com 14 leitos de cuidados semi-intensivos,

Internação 2 com 50 leitos cirúrgicos, Internação 3 com 52 leitos de reabilitação e uma

UTI com 20 leitos, também, possui o serviço de atendimento domiciliar com uma equipe

médica e assistencial que acompanha os pacientes até a sua total recuperação através do

serviço ambulatorial.

O atendimento oferecido está classificado nos níveis terciário e quaternário, de

acordo com os critérios do Sistema Único de Saúde (SUS), sem atendimento emergencial

(REIS & BRAZIL. SECRETARIA DE ASSISTENCIA A SAUDE. DEPARTAMENTO

DE CONTROLE E AVALIACAO DE SISTEMAS., 2001).

O hospital possui um Serviço de Controle de Infecção Hospitalar (SCIH), o qual é

responsável em analisar os antimicrobianos administrados e isolar os pacientes com

infecções por bactérias multirresistentes (PATERSON & DOI, 2007).

26

4.3. Critérios de Inclusão

As bactérias provenientes das culturas dos pacientes que apresentaram

sensibilidade reduzida a um ou mais carbapenêmicos pelo teste automatizado Vitek II

foram incluídas no estudo.

4.4. Critério de Exclusão

As bactérias provenientes das culturas dos pacientes que apresentaram perfil de

sensibilidade aos carbapenêmicos pelo teste automatizado Vitek II foram excluídas do

estudo.

4.5. Isolamento e Identificação Bacteriana

O isolamento primário foi de acordo com o sítio anatômico e as amostras de sangue

foram inoculadas no sistema de hemocultura do BactAlert (BioMérieux), as amostras de

secreções foram semeadas nos meios de crescimento ágar sangue (BioMérieux), ágar

chocolate (BioMérieux) e as amostras de urina foram semeadas em ágar cled (Himédia) e

todas as culturas positivas foram isoladas em meios específicos para bactérias Gram

negativas, ágar MacConkey (BioMérieux).

Após semeadura, as placas foram incubadas em estufa a 36ºC e após 24 horas, as

culturas positivas foram identificadas e o teste de sensibilidade foi realizado no aparelho

VITEK II® (bioMérieux, Basingstoke, Reino Unido). Este sistema automatizado utiliza

cartões com reagentes colorimétricos, que são inoculados com uma suspensão bacteriana.

Cada cartão possui 64 poços, cada um contendo um substrato de teste. Estes substratos

medem as atividades metabólicas da bactéria, como, alcalinização, hidrólise enzimática e

turbidez (BIOMERIEUX, 2014).

Para a identificação foi preparada uma diluição da bactéria isolada a 0,5 na escala

de Mac Farland em salina a 40% própria do sistema do aparelho VITEK II® e para testar

a suscetibilidade aos antimicrobianos, 125 µL desta diluição foi dispensada, segundo

especificação do fabricante, em 3 mL de salina a 40%.

O cartão utilizado para identificação de bactérias Gram negativas foi o GN ID

CARD e o cartão para o antibiograma foi o ATS-N239 com antimicrobianos de nível

hospitalar.

27

4.5.1. Teste de Suscetibilidade aos Antimicrobianos

Os painéis utilizados pelo sistema VITEK II® contêm os antimicrobianos com

pontos de cortes utilizados para determinar o perfil de sensibilidade de acordo com o CLSI

2016 e os seguintes antimicrobianos foram testados: amicacina, ampicilina,

ampicilina/sulbactam, cefuroxima, ciprofloxacina, colistina, gentamicina,

piperacilina/tazobactam, tigeciclina, ceftriaxone, cefepime, ceftazidima, cefoxitina,

imipenem, meropenem e ertapenem.

4.6. Testes Complementares

Todas as enterobactérias que apresentaram resistência aos carbapenêmicos foram

submetidas aos testes fenotípicos complementares para verificação da presença de

carbapenemases.

4.6.1. Teste de Hodge Modificado

Após preparar o inóculo de Escherichia coli ATCC 25922, sensível a todas as

classes de antimicrobianos, na escala 0,5 de Mac Farland, em uma placa de ágar Müeller-

Hinton (Newprov) esta bactéria foi semeada. Em seguida, foi colocado um disco de

meropenem (Cecon) no centro da placa e semeado no sentido extremidade até o disco um

traço de Klebsiela pneumoniae ATCC 1706 como controle negativo, um outro traço foi

feito com a cepa Klebsiela pneumoniae ATCC 1705 como controle positivo e finalmente

um traço com a bactéria a ser pesquisada. Após incubação por 18 horas a 36ºC a

carbapenemase foi detectada pela presença de um halo distorcido pela cultura bacteriana

inoculada radialmente que permitiu o crescimento da cepa E. coli ATCC 25922 nas

proximidades do disco de meropenem (CLSI, 2016).

4.6.2. Teste com o Inibidor e Potenciador para Detecção de Carbapenemase do

Tipo NDM e KPC (ANVISA, 2013).

A suspensão bacteriana a ser pesquisada teve a concentração ajustada equivalente

a 0,5 da escala de Mac Farland e um swab foi umedecido nesta suspensão e semeado em

uma placa de petri com o meio Müeller Hinton. Discos de meropenem (Cecon), imipenem

(Cecon) e ertapenem (Cecon) sem aditivos e outros dos mesmos antimicrobianos com 10

µL de EDTA foram colocados sobre o tapete bacteriano recém semeado para pesquisar as

28

bactérias produtoras de metalo-beta-lactamase. A placa foi incubada por 24 horas em estufa

a 36ºC.

Os isolados que obtiveram diferença maior que 5 mm entre o diâmetro do halo de

inibição com os discos dos antimicrobianos adicionados de EDTA comparados ao diâmetro

do halo de inibição do disco sem EDTA foram considerados potenciais produtores de

metalo-beta-lactamase que posteriormente foram confirmados por teste molecular.

Para o teste das bactérias produtoras de KPC, foram colocados discos de imipenem

e meropenem com AFB e os isolados que obtiveram uma diferença maior que 5mm entre

o diâmetro do halo de inibição comparados aos discos dos antimicrobianos sem aditivos

foram considerados potenciais produtores de KPC.

As cepas controles K. pneumoniae ATCC 1705 produtora de KPC foi utilizada

como controle positivo para o teste com AFB e como controle negativo foi utilizado a cepa

K. pneumoniae ATCC 1706. Para o teste com EDTA o controle positivo foi utilizado as

cepas K. pneumoniae de referência nº de linhagem CCBH15668 e Enterobacter cloacae de

referência nº de linhagem CCBH 10892 (anexo 2) e controle negativo E. coli ATCC 25902

e K. pneumoniae 700603.

4.6.3. Teste de Inativação do Carbapenêmico

Foi preparada uma suspensão bacteriana com a amostra a ser testada bem

concentrada em 400 µL de água estéril utilizando uma alça de 10 µL da colônia em um

tubo de 1,5 mL de polipropileno. Foi adicionado um disco de meropenem de 10 µg nesta

suspensão e então foi incubado a 36°C. Após 2 horas o disco foi retirado da suspensão e

colocado em uma placa de ágar Müeller-Hinton com E. coli ATCC 25922 semeada na

escala de 0,5 de Mac Farland. Em seguida, a placa foi incubada a 36°C por 24 horas (VAN

DER ZWALUW, DE HAAN, PLUISTER et al., 2015).

Os discos que produziram um halo de inibição mostram um resultado negativo para

produção de carbapenemase, pois a enzima não hidrolisou o antimicrobiano presente no

disco.

Os discos que não produziram um halo de inibição mostram um resultado positivo

para carbapenemase, pois a enzima hidrolisou o antimicrobiano, inativando o fármaco que

quando colocado com cepa sensível E. coli ATCC 25922 não apresentou atividade.

Para controle positivo do TIC foi utilizado a cepa K. pneumoniae ATCC 1705

produtora de KPC e controle negativo E. coli ATCC 25922.

29

4.6.4. Teste de Gradiente de Difusão para Polimixina e Tigeciclina

Os isolados que apresentaram resistência aos antimicrobianos polimixina e

tigeciclina pelo método automatizado Vitek II® foram testados pelo método TGD para

confirmação da resistência.

Após preparar uma suspensão bacteriana na escala 0,5 da escala de Mac Farland,

em uma placa de ágar Müeller Hinton (Newprov) a bactéria foi semeada. Em seguida, foi

colocado a tira Etest® de polimixina (bioMérieux) para as bactérias com resistência a

polimixina e uma tira Etest® de tigeciclina (bioMérieux) para as bactérias resistentes a

tigeciclina no centro da placa e após incubação por 24 horas a 36ºC foi analisada a elipse

de inibição bacteriano formado e a interpretação foi feita com base nos dados da Nota

Técnica 01/2013 (ANVISA, 2013).

4.7. Condições de Armazenamento

Os isolados bacterianos produtores de carbapenemases foram ressemeados em ágar

Müeller-Hinton e colocados em estufa a 36ºC por 24 horas. Após o crescimento toda a

massa bacteriana foi retirada com a alça descartável estéril e colocada em um tubo de

polipropileno de 1,5 mL com solução de caldo tripticaseina de soja (TSB, “do inglês

trypitic soy broth”) com 20% de glicerol e estocadas em freezer -20ºC para preservação da

mesma.

4.8. Extração de DNA Genômico Bacteriano

As amostras congeladas em caldo TSB a 20% de glicerol foram reativadas em 3

mL de caldo TSB e incubadas em estufa a 36ºC durante 24 horas para extração do DNA

genômico (VAN SOOLINGEN, DE HAAS, HAAGSMA et al., 1994).

Após crescimento, 1 mL da cultura foi transferida para tubos de 1,5 mL de

polipropileno, logo em seguida foram centrifugados a 5.000 g por 5 minutos. O

sobrenadante foi descartado e acrescentou-se 400 µL de tampão TE (10 mM Tris, 1 mM

EDTA, pH 8,0) contendo 3 µL de lisozima a 20 mg/mL e incubou-se a 37ºC por 1 hora e

30 minutos. Em seguida, 70 µL de SDS a 10% e 12 µL de proteinase K a 20 mg/mL foram

adicionados e incubou-se a 56ºC por 10 minutos. Após incubação, adicionou-se 100 µL de

NaCl a 5,0 M e 80 mL de solução a 10% CTAB e 0,73 M NaCl, agitou-se até atingir um

aspecto leitoso, e então incubou-se a 65ºC por 10 minutos. Em seguida acrescentou-se 650

30

µL de clorofil (clorofórmio: álcool isoamílico 24:1, v/v) e agitou-se por 30 segundos. O

material foi centrifugado a 12.000 g por 5 minutos e o sobrenadante foi transferido para

outro tubo, adicionando-se 400 µL de isopropanol gelado seguido de homogeneização.

Incubou-se a -20ºC por 24 horas e centrifugou-se a 18.000 g a 4ºC por 20 minutos,

descartou-se o sobrenadante e o sedimento foi lavado com 1 mL de álcool etílico à 70%

gelado. Deixou-se o sedimento secar e o mesmo foi suspendido em 50 µL de água miliQ.

4.9. Extração do DNA Plasmidial Bacteriano

As amostras congeladas em caldo TSB a 20% de glicerol foram reativadas em 3

mL de caldo TSB e incubadas em estufa a 36ºC durante 24 horas para extração do DNA

plasmidial (BIRNBOIM & DOLY, 1979).

Após crescimento bacteriano 1 mL da cultura foi transferida para tubo de 1,5 mL

de polipropileno, logo em seguida foram centrifugados a 5.000 g por 10 minutos. O

sobrenadante foi descartado e o sedimento foi suspendido com 210 µL de solução I

composta de 150 mM Tris HCl, 10 mM EDTA pH 8,0, acrescentou-se 10 µL de RNAse

em cada amostra e em seguida acrescentou-se 210 µL da solução alcalina II composta de

200mM NaOH, 1% de SDS, então as amostras foram homogeneizadas lentamente e

incubadas por 5 minutos a temperatura ambiente. Adicionou-se 280 µL da solução III

composta de acetato de sódio 3M, ácido acético 2M, pH 4,8-5,0, e misturou-se

imediatamente por inversão por 10 vezes e então foram centrifugadas por 10 minutos a

12000 g. Após esta etapa, o sobrenadante foi transferido para outro tubo de 1,5 mL de

polipropileno e adicionou-se 560 µL de isopropanol gelado. Logo em seguida, as amostras

foram homogeneizadas por inversão e incubadas por 10 minutos a temperatura ambiente.

Após esse tempo, centrifugou-as por 15 minutos a 12.000 g. O sobrenadante então foi

descartado e o sedimento foi lavado com 500 µL de etanol a 70% gelado, os tubos então

foram colocados para secar e logo em seguida suspendidos com 30 µL de água miliQ.

4.10. Condições de Amplificação do DNA

As amplificações foram realizadas para os seguintes genes: blaKPC, blaNDM e

MCR-1 com os oligonucleotídeos iniciadores para cada alvo (Tabela 2). O método de PCR

convencional foi o escolhido.

As condições para amplificação dos genes bla e MCR-1 foram, desnaturação

inicial a 94ºC por 3 minutos, seguidos de 30 ciclos de desnaturação a 95ºC por 30 segundos,

31

anelamento de acordo com o alvo descrito (Tabela 2) por 1 minuto e extensão a 72ºC por

1 minuto seguido de extensão final a 72ºC por 4 minutos.

Os reagentes do mix e derivados que foram utilizados foram, 9,3 µL de água mili

Q, 2,5 µL de oligonucleotídeos iniciadores forward, 2,5 µL de oligonucleotídeos

iniciadores reverse, 5 µL de tampão concentração: 5X (100 mM Tris-HCL (pH 8.0), 0.05

mM EDTA, 0,5 mM DTT, 25% (v/v) glicerol, 2,5 µL de dNTPs, 0,2 µL de enzima

Taqpolymerase Invitrogen® e 3 µL de DNA bacteriano.

Tabela 2. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para realização dos PCR

Oligonucleotídeos Gene alvo Sequência dos oligonucleotídeos

(sentido 5’- 3’)

Tamanho

dos

produtos

em pares de

bases

Temperatura

de

Anelamento

ºC

KPC Fw blaKPC

TGT CAC TGT ATC GCC GTC

1009bp 58 KPC Rv CTC AGT GCT CTA CAG AAA ACC

NDM Fw blaNDM

TGC CGA GCG ACT TGG CCT TG

379bp 62 NDM Rv ACC GAT GAC CAG ACC GCC CA

MCR-1 Fw MCR-1

CGG TCA GTC CGT TTG TTC 309bp 58

MCR-1 Rv CTT GGT CGG TCT GTA GGG

Fonte: gene blaKPC (TENOVER, KALSI, WILLIAMS et al., 2006), gene blaNDM

(GHAZAWI, SONNEVEND, BONNIN et al., 2012), gene MCR-1 (LIU, WANG, WALSH

et al., 2016).

As cepas controles utilizadas para as reações de PCR foram, K. pneumoniae ATCC

700603 como controle negativo para KPC, K. pneumoniae ATCC 1705 como controle

positivo para KPC. K. pneumoniae cepa de referência CCBH15668 e E. cloacae cepa de

referência CCBH10892 (anexo 2) como controle positivo para NDM e K. pneumoniae

ATCC 700603 como controle negativo para NDM. Para pesquisar o gene MCR-1 não

conseguimos adquirir cepa para controle positivo, então foi realizado apenas com o

controle negativo cepas K. pneumoniae ATCC 700603 e K. pneumoniae ATCC 1705.

4.10.1. Eletroforese em Gel de Agarose

Após a realização da reação de PCR foi realizada a eletroforese em gel de agarose

a 1,5%, contendo 0,5 µg/L de brometo de etídeo, durante 2 horas a 120 volts. No gel foi

32

aplicado um marcador de peso molecular de DNA 1KB Ladder plus (Invitrogen®) para ser

usado de padrão de comparação dos tamanhos esperados das amplificações. Em seguida o

gel foi fotografado no sistema Molecular Imager GelDoc XR(Bio-Rad) para análise.

4.11. Eletroforese em Gel em Campo Pulsado (PFGE)

A bactéria foi inoculada em placas com meio de cultura TSA (Tryptic Soy Agar)

durante 14-16 horas. Em seguida, com um swab umedecido com tampão de suspensão (100

mM Tris, 100 mM EDTA pH 8.0), as colônias foram transferidas para um tubo de ensaio

contendo 2 mL de tampão de suspensão.

A concentração das células foi ajustada para 1.3 – 1.4 em comprimento de onda de

610 nm em espectrofotômetro (RIBOT, FAIR, GAUTOM et al., 2006).

A suspensão das bactérias foi utilizada para confecção dos blocos de agarose. Os

blocos de agarose foram preparados com 200 µL de suspensão de bactérias, 10 µL de

proteinase K 20 mg/mL e 200 µL de agarose de corrida para PFGE 1,0% e 1% de SDS em

tampão TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0). Os blocos de agarose foram submetidos à

lise e desproteinização em 5 mL de tampão de lise (50 mM Tris, 50 mM EDTA pH 8.0;

1,0% sarcosil e 0,1 mg/mL de proteinase K), com incubação a 54ºC durante 2 horas em

banho maria com agitação ou shaker 10 g. Após a incubação, os blocos de agarose foram

lavados inicialmente com 10 mL de água tipo I esterilizada, em seguida, foram lavados

quatro vezes com 10 mL com tampão TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) esterilizado

e pré-aquecido a 50ºC. Após a última lavagem os blocos de agarose foram estocados em

tampão TE sob refrigeração.

O DNA contido nos blocos de agarose foi digerido com 20U de enzima de restrição

XbaI (Invitrogen®) a 37ºC durante 15 horas e a separação dos fragmentos de DNA foi feita

em gel de agarose 1,0% em 2 litros de tampão TBE 0,5X (Tris 50 mM, ácido bórico 45

mM e EDTA 2 mM), por eletroforese em gel em campo pulsado no sistema CHEF DRII

(Bio-RadLaboratories, CA EUA) nas seguintes condições: 20 h; 6,0 V-cm; 14ºC; switch –

5 – 55 s.

Em seguida, o gel foi corado com brometo de etídeo 0,5 mg/mL durante 30 minutos

para ser visualizado e fotografado em fotodocumentador sob iluminação ultravioleta com

o sistema Molecular Imager GelDoc XR (Bio-Rad). Foi utilizado como padrão de peso

molecular Lambda DNA ladder PFGE (Bio-Rad).

33

Os géis de PFGE foram utilizados como imagens branco e preto, invertidas de oito

bits e processados pelo programa BioNumerics® versão 5.1. O dendrograma construído

para avaliar a relação genética entre as cepas foi feito utilizando o coeficiente de

similaridade de Dice, baseado na posição e presença das bandas e no algoritmo de análise

filogenética UPGMA (Unweighted Pair-Groups Method with Arithmetic mean) através de

agrupamentos por médias não ponderadas. Os parâmetros de otimização e tolerância foram

utilizados com os respectivos valores, 0,9 e 2,0%. Cada cluster foi definido como um

agrupamento de perfis (n > 2) com 80 % ou mais de coeficiente de similaridade

(CARRICO, PINTO, SIMAS et al., 2005).

4.12. Análises Estatísticas

Para análise estatísticas dos dados referentes ao perfil de suscetibilidade, foi utilizado

o Teste Qui-Quadrado ou Teste Exato de Fisher, quando n<50 e mais de 20% das caselas

com valores esperados < 5.

Para todos os testes, foi considerado um nível de significância de 5% (p-valor <0,05).

Utilizou-se o programa de estatística de código aberto OpenEpi (DEAN et al., 2013).

34

5. RESULTADOS

5.1. Seleção das amostras

Durante o período de estudo, foram identificadas 1.056 bactérias da espécie

K.pneumoniae, 1.236 de E. coli e 261 de E. aerogenes. Neste período, um total de 180

isolados de enterobactérias resistentes ou com resistência intermediária aos

carbapenêmicos foram identificados pelo método automatizado Vitek II. Os isolados

recuperados para esse estudo foram 167 sendo 107 (64,1%) K. pneumoniae, 13 (7,8%) E.

coli, 44 (26,3%) E. aerogenes e 3 (1,8%) de outras espécies (Figura 7).

A B

9 2 .9 5 % N ã o P ro d u to r d e C a rb a p e n e m a s e

7 .0 5 % P ro d u to r d e C a rb a p e n e m a s e

T o ta l= 2 5 5 3 5 9 .4 4 % K p n e u m o n ia e

2 4 .4 4 % E . a e r o g e n e s

T o ta l= 1 8 0

7 .2 2 % E . c o l i

1 .6 7 % O u tr a s e s p é c ie s

7 .2 2 % N ã o r e c u p e ra d a s

P ro d u to ra s d e C a rb a p e n e m a se s

Figura 7 Frequência de isolados de enterobactérias produtores de carbapenemases

(A) e distribuição por espécie (B).

Em relação ao período de isolamento, foi observado que os isolados produtores de

carbapenemases foram identificados entre julho 2012 a abril 2016, havendo um maior

isolamento das espécies no ano de 2013 (58%, n=97) (Figura 8).

35

Figura 8 Número de amostras produtoras de carbapenemases isoladas, de acordo

com as espécies bacterianas e por mês de estudo. * Nestes meses foram isolados uma

amostra das seguintes espécies jan/2014, C. koseri, abril/2014, C. freundii e junho/2014

E. cloacae.

5.2. Perfil das 167 Amostras dos Pacientes Infectados por Enterobactérias

Resistentes aos Carbapenêmicos do Hospital de Reabilitação

As 167 amostras de enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos foram

adquiridas de infecções e colonizações dos pacientes internados em um hospital de

reabilitação. As amostras foram provenientes de 98 pacientes com idade entre 06 a 91 anos.

Analisando os dados clínicos, observa-se que 60 (61,22%) destas amostras foram obtidas

de pacientes do sexo masculino.

Os 167 isolados bacterianos produtores de carbapenemases foram recuperados de

amostras de urinas= 81, secreção traqueal= 33, sangue= 14, úlcera de pressão sacral

(UPS)= 12, ponta de cateter= 9 e outros sítios= 18 como: swabs de vigilância= 13,

fragmento de tecido= 2, líquido pleural= 2 e fragmento ósseo 1= (Tabela 3).

36


durante o período de estudo relacionadas ao material clínico.

Espécie

Material Clínico *

Urina Sec.

Traqueal

Sangue U.P.S P.C. Outros sítios

K. pneumoniae (n=107) 52 (64,2%) 19 (57,6%) 9 (64,3%) 8 (66,6%) 6 (66,7%) 13 (72,2%)

E. aerogenes (n=44) 18 (22,2%) 13 (39,4%) 5 (35,7%) 2 (16,7%) 2 (22,2%) 4 (22,2%)

E. coli (n=13) 11 (13,6%) - - 2 (16,7%) - -

C. freundii (n=1) - - - - 1 (11,1%) -

C. koseri (n=1) - 1 (3,0%) - - - -

E. cloacae (n=1) - - - - - 1 (5,6%)

Total (n=167) 81 (100%) 33 (100%) 14 (100%) 12 (100%) 9 (100%) 18 (100%)

* U.P.S = Úlcera de Pressão Sacral; P.C.= Ponta de Cateter; outros sítios = Swab de vigilância, fragmento

de tecido, fragmento ósseo, líquido pleural.

A maioria dos isolados de K. pneumoniae foi proveniente da ala de internação nº 2,

correspondendo a 95,1% (39/41) do total isolado neste local. A maioria dos isolados de E.

aerogenes foi proveniente da UTI, correspondendo a 72,1% (31/43) do total de isolados

neste local. Com relação a origem dos isolados, o serviço de internação 1 com 46 isolados,

foi o local que mais teve isolados resistentes aos carbapenêmicos, seguido da UTI com 43

e internação 2 com 41 (Tabela 4).


durante o período de estudo relacionadas a origem.

Espécies

Frequência

(%)

Origem*

Int 1

14 leitos

Int 2

50 leitos

Int 3

52 leitos

UTI

20 leitos

Amb

K. pneumoniae (n=107) 64,1 32 (69,5%) 39 (95,1%) 21 (77,8%) 11 (25,6%) 4 (40,0%)

E. aerogenes (n=44) 26,3 8 (17,4%) 2 (4,9%) 0 31 (72,1%) 3 (30,0%)

E. coli (n=13) 7,8 4 (8,7%) 0 5 (18,5%) 1 (2.3%) 3 (30,0%)

E. cloacae (n=1) 0,6 0 0 1 (3,7%) 0 0

C. freundii (n=1) 0,6 1 (2,2%) 0 0 0 0

C. koseri (n=1) 0,6 1 (2,2%) 0 0 0 0

Total (n=167) 100 46 (100%) 41 (100%) 27 (100%) 43 (100%) 10 (100%)

*Amb – Ambulatório, Int – Internação.

5.3. Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos

De acordo com os pontos de corte do CLSI 2016 e da nota técnica da ANVISA

01/2013, todas as amostras apresentaram um fenótipo resistente a múltiplas classes in vitro

37

pelo método do VITEK II, ou seja, se mostraram resistentes a três ou mais classes de

antimicrobianos testados (MAGIORAKOS, SRINIVASAN, CAREY et al., 2012).

Considerando os resultados intermediários como resistentes, foram encontrados altos

percentuais de resistência à maioria dos antimicrobianos testados. Em relação aos

carbapenêmicos, 94,0% das amostras apresentaram resistência ao ertapenem (95,5% não

sensíveis), 73,6% ao meropenem (76,3% não sensíveis), 80,8% ao imipenem (89,8% não

sensíveis). Em relação aos beta-lactâmicos, 89,8% foram resistentes à ceftazidima (98,8%

não sensíveis), 96,4% à cefotaxima (98,8% não sensíveis) e 88% ao cefepime (99,4% não

sensíveis). Em relação a piperacilina/tazobactam foi observado um percentual de 98,8% de

amostras resistentes e nenhuma com resistência intermediária (Figura 9).

Os isolados apresentaram um menor percentual de resistência aos antimicrobianos,

polimixina (9,0%), seguido da tigeciclina (9,0%). A classe aminoglicosídeos foi a que

apresentou maior sensibilidade, amicacina (3,0%) e gentamicina (54,5%) (Figura 9).

Figura 9 Susceptibilidade aos antimicrobianos dos 167 isolados de enterobactérias

produtores de carbapenemases. ERT= Ertapenem, MEM= Meropenem, IPM=

Imipenem, CAZ= Ceftazidima, CTX= Ceftriaxone, CEF= Cefepime, PIP/TAZ=

Piperacilina / Tazobactam, GEN= Gentamicina, AMI= Amicacina, TIG= Tigeciclina,

POL= Polimixina.

Analisando as espécies com maior número de amostras (K. pneumoniae, E.

aerogenes e E. coli), foi observado que, no geral, apresentaram uma resistência maior ao

ertapenem. Os isolados de K. pneumoniae (n= 107) tiveram uma diferença estatisticamente

significativa (p<0,05) de resistência para cefepime (95,3%), meropenem (93,5%) e

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

ERT MEM IPM CAZ CTX CEF PIP/TAZ GEN AMI TIG POL

Resistente Intermediário Sensível

38

imipenem (82,2%) em relação a E. aerogenes e E. coli. A resistência ao cefepime nos

isolados de E. coli foi significativamente menor do que nos isolados de E. aerogenes

(Tabela 5).

Tabela 5. Frequência de isolados resistentes aos diferentes antimicrobianos de acordo

com a espécie bacteriana estudada determinado pelo sistema automatizado Vitek II.

Espécie Antimicrobianos *

CEF MER IMI ERT TIG POL K. pneumoniae

N= 107 102 (95,3%)a 100 (93,5%)c 88 (82,2%)d 99 (92,5%)

15 (14,0%) 14 (13,1%)

E. aerogenes

N= 44 40 (90,9%)b 29 (65,9%) 23 (52,3%) 43 (97,7%) 0 1 (2,3%)

E. coli

N= 13

7 (53,8%) 12 (92,3%) 10 (76,9%) 13 (100%) 0 0

E. cloacae

N= 1

1 (100%) 1 (100%) 1 (100%) 1 (100%) 0 0

C. freundii

N= 1

1 (100%) 1 (100%) 1 (100%) 1 (100%) 0 0

C. koseri

N= 1

1 (100%) 0 0 1 (100%) 0 0

*CEF – Cefepime, MER – Meropenem, IMI – Imipenem, ERT – Ertapenem, TIG – Tigeciclina, POL –

Polimixina B.

ª Diferença estatisticamente significativa entre K. pneumoniae e E. coli (p= 0,0003).

ᵇ Diferença estatisticamente significativa entre E. aerogenes e E. coli (p= 0,0119).

ᶜ Diferença estatisticamente significativa entre K. pneumoniae e E. aerogenes (p= 0,00009).

ᵈ Diferença estatisticamente significativa entre K. pneumoniae e E. aerogenes (p= 0,0005).

5.4. Determinação da concentração inibitória mínima

De acordo com os critérios estabelecidos pela nota técnica de ANVISA nº 01/2013,

foi observado que 36 (21,5%) amostras apresentaram-se não sensíveis a tigeciclina

(resultados resistentes e intermediários), sendo que de todas as amostras, apenas uma era

de E. coli e uma de E. aerogenes, as outras 34 eram da espécie K. pneumoniae.

Com relação à polimixina B, foi encontrado um percentual de resistência de 9,0%,

sendo uma amostra de E. coli e as outras 14 de K. pneumoniae.

Para confirmar a resistência a estas drogas foi utilizado o TGD e todas as amostras

mostraram-se igualmente resistentes com pequenas variações no valor de CIM

determinado por cada teste, segundo a ANVISA, 2013 (Figuras 10 e 11).

39

3A

3G

5G

8G

1H

4H

6H

9H 2

I5I

3J

9J

1K

4K

5K

7K

10K

1L

1M

5M

5N

6N

7N

8N

3O

7O

2P

3P

4P

6P

7P

1Q

4Q

5Q

7Q

8Q

0

5

1 0

1 5

2 0

CIM

u

g/m

L

V ite k II TG D

Figura 10 Concentrações inibitórias mínimas (CIM) determinada para tigeciclina

realizados pelo método automatizado (Vitek II, barras pretas) e pelo TGD (barras

cinzas) com a interpretação segundo a ANVISA 01/2013. Sensível: CIM < 1 µg/mL,

intermediário: CIM = 2 µg/mL e resistente: CIM > 4 µg/mL.

Figura 11 Concentrações inibitórias mínimas (CIM) determinada para polimixina B

realizados pelo método automatizado (Vitek II, barras pretas) e pelo TGD (barras

cinzas) com a interpretação segundo a ANVISA 01/2013. Sensível: CIM < 2 µg/mL e

resistente: CIM > 4 µg/mL.

40

5.5. Testes Fenotípicos para Detecção de Carbapenemases

5.5.1. Resultado da Nota Técnica 01/2013 da ANVISA

Dos 167 isolados que obtiveram nos testes, com carbapenêmicos, sensibilidade

reduzida a qualquer um dos antimicrobianos dessa classe, foi realizado o teste segundo a

nota técnica 01/2013 (ANVISA, 2013) utilizando inibidores e potenciador para detecção

de carbapenemases. A interpretação dos resultados depende de cada espécie. Para as

espécies K. pneumoniae e E. coli segue a mesma interpretação utilizando o resultado de

imipenem, meropenem e ertapenem, já para as espécies E. aerogenes, E. cloacae e C.

freundii a interpretação é baseada nos resultados de imipenem e meropenem. No total,

foram identificadas 74,3% (n= 124) das amostras positivas para KPC, 0,6% (n= 01) para

MBL e 25,1% (n=42) o resultado foi inconclusivo, o halo de sensibilidade foi igual ou

superior a 5 mm para os dois inibidores (EDTA e AFB), não sendo possível caracterizar o

tipo de resistência. (Tabela 6).

Tabela 6. Teste com o Inibidor e Potenciador para Detecção de Carbapenemase do Tipo

NDM e KPC (ANVISA, 2013).

Espécies Potencial produtor de Inconclusivo

KPC e/ou MBL (%) KPC (%) MBL (%)

K. pneumoniae (n=107) 82 (76,6%) 0 25 (23,4%)

E. coli (n=13) 10 (76,9%) 1 (7,7%) 2 (15,4%)

E. aerogenes (n=44) 29 (65,9%) 0 15 (34,1%)

E. cloacae (n=1) 1 (100%) 0 0

C. freundii (n=1) 1 (100%) 0 0

C. koseri (n=1) 1 (100%) 0 0

Total (n=167) 124 (74,3%) 1 (0,6%) 42 (25,1%)

5.5.2. Teste de Hodge Modificado

O teste de Hodge modificado foi realizado para todas as amostras que tiveram a

sensibilidade reduzida aos carbapenêmicos. Das 167 amostras testadas, 119 (71,2%) foram

positivas para o teste.

41

5.5.3 Teste de Inativação do Carbapenêmico

Outro teste fenotípico realizado foi o teste TIC que é baseado na presença ou

ausência do antimicrobiano no disco de papel. Das 167 amostras, 162 (97,0%)

apresentaram resultado positivo para carbapenemase.

5.6. Testes Moleculares

5.6.1. Detecção dos Genes Codificadores das Carbapenemases KPC e NDM

A técnica de PCR evidenciou que 80 (47,9%) dos 167 isolados continham o gene

blaKPC, e o gene blaNDM não foi identificado em nenhum dos isolados. Todos os isolados

de E. cloacae, C. freundii e C. koseri; 48,6% dos isolados de K. pneumoniae; 46,2% de E.

coli e 43,2% de E. aerogenes foram positivos para o gene blaKPC (Tabela 7, Figura 12 e

13).

Tabela 7. Amostras positivas para os genes blaKPC, blaNDM e MCR-1

Espécie Gene blaKPC Gene blaNDM Gene MCR-1

Positivo Positivo Positivo

K. pneumoniae n=107 52 (48,6%) - -

E. coli n=13 6 (46,2%) - -

E. aerogenes n=44 19 (43,2%) - -

E. cloacae n=1 1 (100%) - -

C. freundii n=1 1 (100%) - -

C. koseri n=1 1 (100%) - -

Total n=167 80 (47,9%) 0 0

42

Figura 12. Eletroforese do produto do PCR para o gene blaKPC de 13 amostras da

espécie K. pneumoniae. CN: Controle negativo K. pneumoniae ATCC 700603, CP:

Controle Positivo K. pneumoniae ATCC 1705, M: marcador de peso molecular 1009 pb.

Figura 13. Eletroforese em gel de agarose dos produtos da PCR para o gene

blaNDM de 9 amostras das espécies K. pneumoniae e E. coli. CN: Controle negativo

K. pneumoniae ATCC 700603, CP: Controle Positivo K. pneumoniae cepa de referência

CCBH15668 NDM positivo, M: marcador de peso molecular

5.6.2. Detecção do Gene MCR-1

Nesse estudo, procuramos o gene de resistência MCR-1 em todos os isolados,

inclusive nos que apresentaram resistência à colistina pelo método automatizado Vitek II®

e pelo método de TGD, porém em nenhum isolado foi identificado o gene MCR-1. (Figura

14).

43

Figura 14. Eletroforese em gel de agarose da PCR para o gene MCR-1 para pesquisa

de resistência plasmidial à poliximina em 15 amostras. CN: Controle negativo K.

pneumoniae ATCC 700603, M: Marcador de peso molecular 309 pb.

5.7. Testes Fenotípicos e Genéticos Realizados com Resultados Positivos para KPC

Analisando todos os testes positivos, foi observado que os testes fenotípicos

apresentaram um maior número de isolados positivos quando comparado a técnica de PCR

para blaKPC. O teste TIC foi o que apresentou uma maior sensibilidade (100%) comparado

ao demais testes (TH 86% e teste da Nota Técnica 80,5%). O teste de Hodge e o teste da

Nota Técnica tiveram resultados semelhantes.

Tabela 8. Percentual de amostras produtoras de blaKPC associadas aos testes fenotípicos.

Espécie Total de

Isolados

PCR

blaKPC

(%)

Teste de Hodge

Positivo

(%)

Nota Técnica

para KPC

(%)

TIC

(%)

K. pneumoniae 107 52 (48,6) 79 (73,8) 82 (76,6) 103 (96,3)

E. aerogenes 44 19 (43,2) 27 (61,4) 29 (65,9) 43 (97,7)

E. coli 13 6 (46,2) 10 (76,9) 10 (76,9) 13 (100)

5.8. Determinação do polimorfismo genético por eletroforese de campo pulsado em

gel de agarose (PFGE)

Para a análise da clonalidade foram incluídas todas as amostras produtoras de KPC

da espécie K. pneumoniae.

Dentre as 52 amostras analisadas observamos grande diversidade genética entre

todas os isolados estudados, um total de 13 clusters, com prevalência do cluster A (23,1%;

n= 12) encontrado em amostras isoladas da UTI, Internação 1, 2 e 3 entre julho de 2012 a

abril de 2014, seguido do cluster C (19,23%; n= 10) encontrado em amostras da UTI,

Internação 1 e Ambulatório, isolados entre março de 2013 até outubro de 2013 e cluster I

44

(17,30%; n= 9) amostras da UTI, Internação 1, Internação 2 e Internação 3, isoladas

setembro de 2013 a janeiro de 2015 (Figura 15).

A maioria das amostras foram isoladas em infecções do trato urinário (48,1%

n=25), seguido de amostras de secreção traqueal (25,0% n=13). O ano que apresentou

maior número de isolados foi o de 2013 (55,8% n=29)

Dentre as amostras não sensíveis a tigeciclina (resultados intermediários e

resistentes), 22 apresentaram blaKPC e estiveram presentes em todos os clusters (Figura

15).

Dentre as amostras resistentes a polimixina B, 10 apresentaram blaKPC em 7 tipos

clonais diferentes (Figura 15).

Dos 52 isolados, 9 (17,31%) isolados apresentaram resistência tanto a tigeciclina

quanto a polimixina B (Figura 15).

45

Figura 15 Dendrograma representativo dos 13 perfis de fragmentação de DNA

cromossomal encontrado nas 52 amostras de K. pneumoniae produtoras de KPC. *Amostras resistentes à tigeciclina; # Amostras resistentes à polimixina B.

46

6. DISCUSSÃO

No presente estudo foram avaliadas 167 enterobactérias resistentes aos

carbapenêmicos isoladas de amostras de pacientes de um hospital de reabilitação entre

2012 e 2016. Muitos estudos evidenciaram que a frequência das espécies de enterobactérias

produtoras de carbapenemases está cada vez maior, principalmente em pacientes

hospitalizados. Este fato ocasiona maior tempo de internação e utilização de

antimicrobianos mais potentes e tóxicos como polimixina B e tigeciclina (MUNOZ-

PRICE, POIREL, BONOMO et al., 2013, RUPPE, WOERTHER & BARBIER, 2015).

Um estudo realizado com dados de 36 países da Europa, Ásia, África e América

Latina envolvendo 422 UTI’s analisaram infecções associadas a utilização de dispositivos

invasivos, como sondas e cateteres e mostrou que apesar de ser semelhante a quantidade

de utilização de dispositivos em países em desenvolvimento com os países da Europa, a

quantidade de infecção em pontas de cateteres, associada a ventilação mecânica e a

utilização de sondas urinárias foi muito maior em países em desenvolvimento

(ROSENTHAL, BIJIE, MAKI et al., 2012).

Como o hospital do estudo realizado atende principalmente pacientes com doenças

neuromusculares, lesão encefálica adquirida, malformação congênita, lesão medular e

paralisia cerebral, a utilização de dispositivos invasivos como sondas e cateteres é alta e

isso, aumenta a frequência de infecções no sistema urinário, respiratório e circulatório

(QUEENAN & BUSH, 2007, LAVIGNE, SOTTO, NICOLAS-CHANOINE et al., 2012,

BORAH, SAIKIA, CHANDRA et al., 2016).

No nosso estudo, 48,5% (n=81) das amostras foram obtidas de infecções no sistema

urinário, seguidos de amostras de secreção traqueal 33 (19,7%), sangue 14 (8,4%), úlcera

de pressão sacral (UPS) 12 (7,2%) e ponta de cateter 9 (5,4%). Com exceção da UPS que

ocorre devido a uma interrupção sanguínea em uma determinada área em virtude de

mudanças degenerativas da pele e tecido subcutâneo, todas essas amostras são adquiridas

de sítios anatômicos com dispositivos invasivos. O serviço que teve a maior incidência de

infecções por agentes multirresistentes foi a Internação 1 seguido do serviço da UTI.

Um estudo realizado na Alemanha entre os anos de 2001 a 2008 em 53 UTI’s

mostrou que a quantidade de utilização de antimicrobianos não aumentou durante estes

anos, porém a quantidade de ESBL nas espécies K. pneumoniae e E. coli aumentaram

drasticamente, o que duplicou a utilização de carbapenêmicos e consequentemente

47

aumentou a quantidade de bactérias resistentes a estes antimicrobianos (MEYER,

SCHWAB, SCHROEREN-BOERSCH et al., 2010). Em nosso estudo não pudemos avaliar

a evolução do uso de antimicrobianos pelo serviço de saúde, no entanto o uso de

carbapenêmicos vem aumentando significativamente.

Com o aumento da utilização de carbapenêmicos, aumentou também a resistência

das bactérias a estes antimicrobianos, então, em nosso estudo investigamos a presença de

carbapenemases por testes fenotípicos, teste da Nota Técnica e THM, que quando

comparados apresentaram dados semelhantes para as espécies K. pneumoniae, E.

aerogenes e E. coli, porém em comparação com o teste TIC, este apresentou um maior

número de isolados positivos, mostrando que este teste possui uma sensibilidade maior

para triar as enterobactérias produtoras de carbapenemases.

Dados da literatura mostram que os testes fenotípicos apresentam elevada

sensibilidade, porém verificou-se que utilizar apenas um teste não é recomendado para

confirmar a presença de carbapenemases, visto que quando utilizado dois ou mais testes

fenotípicos houve melhora da especificidade, apesar de não excluir a necessidade da

análise molecular (BAYRAMOGLU, ULUCAM, GENCOGLU OZGUR et al., 2016).

No nosso estudo, realizamos três testes fenotípicos, teste da Nota Técnica, teste de

Hodge e TIC para todas as enterobactérias que apresentaram resistência a pelo menos um

carbapenêmico pelo teste de sensibilidade automatizado Vitek II.

Analisando o teste da Nota Técnica que realiza a detecção fenotípica de

carbapenemases utilizando bloqueadores enzimáticos, em nosso estudo, apresentou um

resultado positivo para MBL em uma amostra de E. coli, e, apesar da resistência mais

frequente dessa classe ser a NDM, o resultado para a pesquisa do gene blaNDM foi

negativo, então este teste pode estar caracterizando a resistência IMP ou VIM, porém não

foram pesquisadas.

Para a pesquisa de KPC, o teste da Nota Técnica apresentou uma quantidade de

amostras positivas superior 74,3% (n= 124) quando comparado ao teste genético, 47,9%

(n=80). Em uma parte das amostras, 25,1% (n=42) o resultado apresentado foi

inconclusivo, não conseguindo definir o tipo de carbapenemase, pois os halos de inibição

foram > 5 mm tanto para meropenem e imipenem com AFB (identificar KPC) quanto para

meropenem e imipenem com EDTA (identificar MBL).

As bactérias resistentes aos carbapenêmicos em virtude da expressão de

mecanismos que não envolvam a produção de carbapenemases, como hiper expressão de

ESBL ou AmpC com perda de porina, também podem apresentar resultados falso-positivos

48

para a produção de carbapenemase quando testadas pelos testes fenotípicos THM e teste

da Nota Técnica (CARVALHAES, PICAO, NICOLETTI et al., 2010).

Comparando os resultados dos testes fenotípicos e genéticos, o teste TIC 97% (n=

162), apresentou o maior percentual de positividade para carbapenemase em comparação

aos outros testes fenotípicos, mostrando a capacidade de identificar as enterobactérias

produtoras de carbapenemases independentemente da base molecular. Este método de

rastreio de carbapenemase possui baixo custo e como não exige equipamentos

especializados para sua realização pode ser aplicado em todos os laboratórios clínicos.

Além disso, pode triar as carbapenemases que ainda não foram pesquisadas / identificada.

Um estudo realizado na Holanda mostrou que o TIC é capaz de triar as bactérias

Gram negativas produtoras de NDM, KPC, VIM, IMP, OXA-48 e OXA-23 permitindo a

distinção entre a resistência ao carbapenêmico devido a atividade de beta-lactamase e de

permeabilidade reduzida. Os resultados obtidos nesse estudo tiveram alta concordância

(100% para Enterobacteriaceae e 98,8% para os não fermentadores) entre os PCR’s que

detectaram o gene de resistência e a detecção da atividade da carbapenemase pelo TIC

(VAN DER ZWALUW, DE HAAN, PLUISTER et al., 2015).

A investigação de KPC por métodos fenotípicos e genéticos foi realizada para

identificar as mais frequentes carbapenemases circulantes para enterobactérias no mundo

(MUNOZ-PRICE, POIREL, BONOMO et al., 2013, ZMARLICKA, NAILOR &

NICOLAU, 2015) e verificar a presença dessas enterobactérias no ambiente hospitalar,

pois após o primeiro relato de KPC em 2006 no Brasil (MONTEIRO, SANTOS, ASENSI

et al., 2009), vários casos foram identificados em hospitais brasileiros (ANDRADE,

CURIAO, FERREIRA et al., 2011, D'ANDREA, AMISANO, GIANI et al., 2014, ROSSI

GONCALVES, FERREIRA, ARAUJO et al., 2016).

As enzimas do tipo KPC são encontradas em diferentes espécies de

Enterobacteriaceae, porém é predominantemente descrita em K. pneumoniae (CANTON,

AKOVA, CARMELI et al., 2012, ANDRADE, VITALI, GASPAR et al., 2014). Em nosso

estudo, encontramos o gene blaKPC em 5 espécies de Enterobacteriaceae: K.pneumoniae,

E. aerogenes, E. clocae, E.coli e C. freundii. Essas 80 amostras produtoras de KPC

representam 47,90% de um total de 167 amostras de Enterobacteriaceae, exibindo

susceptibilidade reduzida aos carbapenêmicos, identificadas durante o período de julho

2012 até abril 2016.

A investigação de NDM foi realizada, pois esta carbapenemase tem alto risco de

disseminação, tendo em vista que após o primeiro relato de NDM no mundo (YONG,

49

TOLEMAN, GISKE et al., 2009) vários casos foram identificados em diversos países

(BERRAZEG, DIENE, MEDJAHED et al., 2014). No Brasil após a identificação do

primeiro caso que ocorreu em Porto Alegre (CARVALHO-ASSEF, PEREIRA, ALBANO

et al., 2013), o número de identificação de NDM em bactérias Gram negativas está

aumentando (CARVALHO-ASSEF, PEREIRA, ALBANO et al., 2014, PILLONETTO,

AREND, VESPERO et al., 2014, ROZALES, RIBEIRO, MAGAGNIN et al., 2014,

PEREIRA, ALBANO, ASENSI et al., 2015) e esse sucessivo aumento de identificação em

várias espécies pode ocasionar a disseminação nacional de NDM.

Nos isolados analisados deste estudo em Goiânia, não foi encontrado nenhuma

enterobactéria produtoras de NDM, mas em Brasília, Faria e colaboradores (2016)

relataram sete isolados de enterobactérias produtoras de NDM (FARIA-JUNIOR, 2016).

Apesar de não ter encontrado nenhum isolado produtor de NDM, a pesquisa dessa

carbapenemase deve ser contínua para evitar surtos drásticos como aconteceu no

continente indiano (NORDMANN, POIREL, WALSH et al., 2011, NORDMANN &

POIREL, 2014).

Além das resistências aos carbapenêmicos, a resistência clínica à polimixina B em

isolados de bactérias da família Enterobacteriaceae principalmente em K. pneumoniae é

extremamente preocupante considerando que os antimicrobianos polimixina B e colistina

são os últimos recursos para o tratamento de infecções devido à resistência aos

carbapenêmicos (YAO, DOI, ZENG et al., 2016).

No estudo realizado, 9% dos isolados (n= 15) apresentaram resistência à polimixina

B tanto por métodos automatizados como pelo TGD e estes isolados foram submetidos ao

PCR para pesquisa do MCR-1, porém nenhum isolado possuía o plasmídeo contendo esse

gene. Com isso, a resistência apresentada para polimixina B por estas enterobactérias pode

ter ocorrido mediada pela alteração no LPS da membrana externa bacteriana com a adição

de moléculas de L-Ara4-N e PEtN (FALAGAS, RAFAILIDIS & MATTHAIOU, 2010).

Estas alterações são mediadas por mutações em vários genes envolvidos em modificações

lipídicas e mais comumente as mutações no gene mgrB. (PRAGASAM, SHANKAR,

VEERARAGHAVAN et al., 2016). Esse tipo de resistência induzível não é capaz de ser

transmitida para outras linhagens bacterianas e é reversível na ausência do antimicrobiano

polimixina B (HALABY, AL NAIEMI, KLUYTMANS et al., 2013, SAMPAIO &

GALES, 2016).

Com o surgimento do plasmídeo MCR-1 que confere resistência transferível à

polimixina, o tratamento com esse antimicrobiano se tornou mais delicado, pois além da

50

resistência induzível, existe a possibilidade de surtos com transferência plasmidial (HU,

LIU, LIN et al., 2016, ZHANG, HUANG, CHAN et al., 2016). Como a identificação dessa

resistência descoberta no final de 2015 só é possível até o momento por métodos

moleculares, a identificação das bactérias com plasmídeo MCR-1 pode estar subestimada.

Estudo retrospectivos estão sendo realizados em todo o mundo para verificar desde que

ano esse plasmídeo está circulando (IRRGANG, ROSCHANSKI, TENHAGEN et al.,

2016, SCHWARZ & JOHNSON, 2016). No Brasil, o primeiro relato do plasmídeo

contendo MCR-1 foi identificado em E. coli (FERNANDES, MCCULLOCH, VIANELLO

et al., 2016).

Independentemente do padrão de resistência, Enterobacteriaceae são capaz de

causar infecções hospitalares importantes, incluindo infecções urinárias e da circulação

sanguínea em pacientes com cateteres, pneumonia (VAN DUIN, KAYE, NEUNER et al.,

2013). Estudos mostram que pacientes idosos e com comorbidades além de ter infecções

graves, complicações no tratamento, a taxa de mortalidade pode variar de 30% em

pacientes com infecções sem bacteremia a 72% em pacientes com infecções sanguíneas

(NEUNER, YEH, HALL et al., 2011, TUMBARELLO, VIALE, VISCOLI et al., 2012).

A espécie K. pneumoniae tem liderado a dispersão mundial de genes blaKPC que

ocorre em grande parte impulsionada pela expansão de linhagens clonais (DORTET,

CUZON & NORDMANN, 2014). Diante da detecção de cepas produtoras de KPC, o perfil

de PFGE foi determinado com o intuito de verificar a existência de clones envolvidos na

dispersão desse gene entre os isolados. Para esta análise, foram incluídos todos os isolados

de K.pneumoniae positivos para blaKPC obtidos entre os anos de 2012 e 2016.

No presente estudo, através de PFGE da espécie K. pneumoniae KPC (n=52), foi

encontrada uma grande diversidade clonal, com prevalência de 13 clusters distintos. O

cluster com maior número foi o A com 23,07% (12 isolados), seguindo do grupo clonal C

com 19,23% (10 isolados) e do grupo clonal I com 17,30% (9 isolados). Estes achados

corroboram com o descrito por (AIRES, PEREIRA, DE ARAUJO et al., 2017), onde foi

observada grande diversidade clonal entre as amostras de K. pneumoniae KPC positivas

isoladas no Rio de Janeiro, Brasil.

Os demais grupos clonais não tiveram um número significativo de representantes,

assim, os resultados obtidos mostram que não houve a presença de surtos com

disseminação clonal nos serviços do hospital. Através da tipagem molecular por PFGE,

pudemos observar que a disseminação de KPC pelo hospital não ocorreu por um clone

prevalente. O ano com maior número de isolamento de K. pneumoniae KPC foi o de 2013

51

com 55,8% (n=29) das amostras. Esse fato pode estar relacionado com a abertura do

serviço de UTI que ocorreu no segundo semestre de 2012, ampliando o atendimento aos

pacientes mais graves e debilitados e consequentemente mais propícios a infecções

bacterianas.

A disseminação de microrganismos multirresistentes em nível mundial ocorre

devido a facilidade de movimentação que as pessoas têm hoje em dia, seja pela ocorrência

de guerra, turismo, trabalho, entre outros e estas viagens internacionais são fatores

importantes para aquisição e disseminação de enterobactérias multirresistentes,

principalmente quando as viagens ocorrem para locais endêmicos (VAN DER BIJ &

PITOUT, 2012). Portanto, é necessário implementar medidas de controle e entender

melhor de que forma está ocorrendo a dispersão de genes de resistência, para assim, poder

controlá-la.

Através deste estudo, pudemos evidenciar que o gene blaKPC consegue se

disseminar de forma muito eficiente entre espécies de enterobactérias, com sua presença

em plasmídeos e transposons, além disso, pode estar sendo carreado com outros

determinantes de resistência, dificultando ainda mais o tratamento do ambiente hospitalar.

Portanto dados epidemiológicos locais e regionais devem ser feitos para conhecer as

principais bactérias circulantes, principalmente pelo Brasil não possui um sistema de

informação efetivo em resistência bacteriana. Os hospitais não conseguem definir ações

coordenadas para estabelecer planos de contingência e controle, com isso, o risco dos

pacientes de adquirirem infecções por bactérias pan-resistêntes está cada vez mais

frequente.

52

7. CONCLUSÕES

Foram identificadas 80 bactérias produtoras de KPC e nenhuma produtora de NDM

pelos testes moleculares.

Não foi identificado nenhum isolado com os genes NDM e MCR-1.

O teste TIC apresentou maior sensibilidade em triar as bactérias produtoras de

carbapenemases.

Foram observados 13 grupos clonais entre as bactérias K. pneumoniae KPC

positivas.

53

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64

ANEXOS

Anexo 1. Parecer do Comitê de Ética.

68

Anexo 2. Nº das Linhagens Bacterianas de Referência da FIOCRUZ – Fundação

Osvaldo Cruz.

69

Anexo 3. Artigo a ser submetido para a revista Mémorias do Instituto Oswaldo

Cruz

Título em execução: Microbiologia

Título: Caracterização Genética e Fenotípica de Klebsiella pneumoniae Produtoras de

Carbapenemases Isoladas de Pacientes em um Hospital de Goiânia, Goiás.

Luma Correia Fernandes1;3, Adriana de Oliveira Guilarde2;3, Maria Cláudia Dantas P. B.

André3, André Kipnis3

Afiliações Institucionais:

1 Hospital de Urgências Governador Otávio Lage de Siqueira - HUGOL

2 Centro de Reabilitação e Readaptação Dr. Henrique Santillo

3 Departamento de Microbiologia, Imunologia, Parasitologia e Patologia, Instituto de

Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Brasil.

Resumo

Nas últimas décadas, as bactérias da família Enterobacteriaceae têm adquirido um papel

cada vez mais importante nas infecções hospitalares devido à sua prevalência e altos

índices de resistência a antimicrobianos associados à mortalidade. Essa resistência devido

a produção de carbapenemases é reconhecida mundialmente como um grande problema

emergente para pacientes hospitalizados, devido à localização de genes em elementos

transferíveis, facilitando sua disseminação. O objetivo desse estudo foi caracterizar

fenotípica e geneticamente isolados de Klebsiella pneumoniae produtores de

carbapenemases. Entre os anos 2012 a 2016, 107 isolados de K. pneumoniae em um

hospital em Goiânia apresentaram resistência aos carbapenêmicos. Dos 107 isolados,

92,5% apresentaram resistência ao ertapenem, 93,4% ao meropenem, 82,4% ao imipenem,

14,0% à tigeciclina e 13,0% à polimixina B. Do total de isolados, 82 (76,6%) foram

positivos no Teste de Hodge Modificado (THM), 102 (95,3%) foram positivos no Teste

Inativação do Carbapenêmico (TIC) e 86 foram positivos para KPC no Teste da Nota

Técnica 01/2013. A técnica de PCR evidenciou que 52 (48,6%) isolados continham o gene

blaKPC e que nenhum continha os genes blaNDM e MCR-1. Para determinação do grau

de similaridade entre os isolados de K. pneumoniae KPC foi realizado o polimorfismo

genético por eletroforese de campo pulsado em gel de agarose (PFGE) evidenciando 13

clusters. Dentre as amostras não sensíveis a tigeciclina, 22 apresentaram blaKPC e

70

pertenciam a 8 tipos de clones diferentes. Dentre as amostras resistentes a polimixina B,

10 apresentaram blaKPC em 7 tipos de clusters, 9 (17,31%) isolados apresentaram

resistência tanto a tigeciclina quanto a polimixina B. Através deste estudo, pudemos

evidenciar que o gene blaKPC consegue disseminar de forma muito eficiente entre os

isolados de K. pnemoniae. Além disso, pode estar sendo carreado com outros

determinantes de resistência, dificultando ainda mais o tratamento do ambiente hospitalar.

Palavras chaves: Carbapenemases, Klebsiella pneumoniae KPC, Testes fenotípicos.

Fonte de financiamento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq).

Abstrat

In the Enterobacteriaceae family, bacteria acquired an increasingly important role in

hospital infections due to their prevalence and high rates of antimicrobial resistance

associated with mortality. This image produced by carbapenemases is recognized

worldwide as a major emerging problem for hospitalized patients due to the localization of

genes in transferable elements, facilitating their dissemination. The aim of the study was

to characterize phenotypically and genetically isolated Klebsiella pneumoniae producing

carbapenemases. Between 2012 and 2016, 107 isolates of K. pneumoniae in a hospital in

Goiânia presented resistance to carbapenems. Of the 107 isolates, 92.5% had resistance to

ertapenem, 93.4% to meropenem, 82.4% to imipenem, 14.0% to tigecycline and 13.0% to

polymyxin B. Of the total isolates, 82 (76 , 6%) were positive in the Modified Hodge Test

(THM), 102 (95.3%) were non-test positive for Technical Note 01/2013. The PCR

technique showed that 52 (48.6%) isolates contained the blaKPC gene and that none

contained the blaNDM and MCR-1 genes. To determine the degree of similarity between

the isolates of K. pneumoniae KPC, the genetic polymorphism was performed by agarose

gel pulsed field electrophoresis (PFGE), showing 13 clusters. Among the non-tigecycline

sensitive samples, 22 presented blaKPC and belonged to 8 different clone types. Among

the samples resistant to polymyxin B, 10 presented blaKPC in 7 types of clusters, 9

(17.31%) isolated showed resistance to both tigecycline and polymyxin B. Through this

study, we could show that the blaKPC gene manages to disseminate very Among the

isolates of K. pnemoniae. In addition, it can be assembled with other resistance

determinants, making it even more difficult to treat the hospital environment.

Keywords: Carbapenemases, Klebsiella pneumoniae KPC, Phenotypic tests.

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