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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL
ANÁLISES MORFOLÓGICAS, GENÉTICAS E
CITOGENÉTICAS EM HÍBRIDOS INTERESPECÍFICOS DE
Passiflora coccinea e P. hatschbachii
VIVIANE DE OLIVEIRA SOUZA
ILHÉUS-BAHIA
FEVEREIRO DE 2018
ii
VIVIANE DE OLIVEIRA SOUZA
ANÁLISES MORFOLÓGICAS, GENÉTICAS E
CITOGENÉTICAS EM HÍBRIDOS INTERESPECÍFICOS DE
Passiflora coccinea e P. hatschbachii
ILHÉUS-BAHIA
FEVEREIRO DE 2018
Tese apresentada à Universidade Estadual de
Santa Cruz como parte das exigências para a
obtenção do título de doutora em Produção
Vegetal.
Linha de Pesquisa: Melhoramento Genético e Biotecnologia.
Orientadora:
Prof.a Dra. Margarete Magalhães de Souza
Co-orientador: Dr. Cláusio Antônio Ferreira
de Melo
iii
VIVIANE DE OLIVEIRA SOUZA
ANÁLISES MORFOLÓGICAS, GENÉTICAS E
CITOGENÉTICAS EM HÍBRIDOS INTERESPECÍFICOS DE
Passiflora coccinea e P. hatschbachii
_________________________________________________________
Profa. Dra. Margarete Magalhães de Souza
UESC/DCB
(Orientadora)
_________________________________________________________
Marcio Gilberto Cardoso Costa
UESC/DCB
__________________________________________________________
Gonçalo Santos da Silva
UESC/DCB
_________________________________________________________
Vanessa de Carvalho C. Pamponét
Instituto Federal Baiano-Uruçuca
_________________________________________________________
Jôsie Cloviane de Oliveira Freitas
Universidade Estadual de Goiás-Posse
iv
AGRADECIMENTOS
À Deus por ser luz em minha trajetória sempre, dando-me saúde e sabedoria.
À Universidade Estadual de Santa Cruz, em especial ao Programa de Pós
Graduação em Produção Vegetal pela oportunidade e a secretária do programa, Carol,
que sempre consegue solucionar os problemas e esclarecer nossas dúvidas.
À Coordenação do Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela
concessão da bolsa de estudos.
À Professora Dra. Margarete Magalhães de Souza, pela orientação,
ensinamentos transmitidos, aprendizado, dedicação e conselhos durante o
desenvolvimento deste trabalho.
Ao Dr. Cláusio Antônio Ferreira de Melo, pela coorientação, amizade,
colaboração, auxílio nas análises estatísticas e disponibilidade durante a realização
deste trabalho. Sempre encontrando soluções com suas ideias inovadoras. Muito
obrigada por tudo!
Á professora Ioná, pela acolhida na UFERSA, e a professora Simone (UFRB),
Helison e Ciro na tentativa de realizar as análises com eletroforese em gel de
poliacrilamida. Agradeço à amiga Elaine, pela estadia durante este período em sua
casa. Muito obrigada!
Á Jôsie, pela parceria, amizade, troca de experiência e auxílio nas análises
estatísticas e no cruzamento entre as espécies Passiflora coccinea e P. hatschbachii, foi
muito importante a obtenção da progênie híbrida.
Ao Paulo e Roberto pelo auxílio nas atividades de campo.
Aos amigos do Laboratório de Melhoramento de Plantas (LAMEP): Aline, que
embora tenha pouco tempo de convivência, já conquistou com seu jeito alegre e
prestativo. Obrigada pelo axílio na avaliação morfológica! Analu (Flor), dividimos
momentos de angústias e aprendizado a cada resultado com os geis de poliacrilamida.
Além disto, agradeço pela realização da análise meótica. Jonathan, agradeço pelo
auxílio na montagem do experimento, na tomada de dados morfológicos, com os géis de
poliacrilamida e por toda experiência científica e de amizade. Você é um guatemalteco
que é um pouquinho brasileiro-baiano. Lembrarei de você com muito carinho! Manu,
pelas experiências trocadas no laboratório, momentos difíceis e alegres e pela amizade
que construímos ao longo desses anos. Você é uma grande amiga! Artur, Matu e Ohana
que já fizeram parte do LAMEP, obrigada por dividir os conhecimentos e por
v
proporcionar momentos de descontração! Pedro, por todo auxílio e disponibilidade no
processo de autoclavagem do solo, além da ajuda na condução do experimento em
campo. Rita Sanchês, pela ajuda com a citogenética clássica (escolha de metáfases,
medições, cariogramas) e molecular, e por todas as dúvidas sanadas. Quero agradecer
também pela amizade, conselhos e conversas construtivas! Você é verdadeira seu
“Erro”. Isso é bom! Rita Moreira, pela amizade, ajuda na condução do experimento,
experiências trocadas no laboratório e por todos os momentos de alegria. Ritão você é
incrível! Vanessa, por toda auxílio no laboratório (na extração de DNA, preparo de
lâminas, aplicação da FISH), além da amizade construída e dos momentos alegres e
descontraídos. Agradeço ao amigo e Pós-doc do LAMEP, Gonçalo, que sempre esteve
presente auxiliando na melhor forma para obtenção dos resultados, sempre disposto a
ajudar. Agradeço ainda pela amizade, foram seis anos de muito aprendizado,
angústias, experiências trocadas, momentos de descontração e conselhos. Obrigada
por tudo! Sentirei falta de todos vocês e deste mundo científico que descobrir!!!
Aos colegas do PPGPV, Geovanna e Pedro, pela amizade adiquirida ao longo
desses anos.
À amiga Pati, pela amizade, conselhos e momentos de descontração.
À minha família, por todo apoio e confiança, sempre acreditando no meu
potencial.
Ao meu esposo e colega de doutorado, Joedson, pelo amor, amizade, e
companheirismo durante todo esse período, sempre me tranquilizando com suas
palavras sábias. Agradeço ainda pela ajuda na montagem do experimento e na coleta
de dados morfológicos. Simplesmente, você me completa. Te amo!
À todos que me apoiaram e participaram para a realização desse trabalho, cada
um teve e tem um papel importante em minha vida e contribuiu nesta minha jornada.
Eu agradeço imensamente!!!
Muito Obrigado!
vi
RESUMO
ANÁLISES MORFOLÓGICAS, GENÉTICAS E
CITOGENÉTICAS EM HÍBRIDOS INTERESPECÍFICOS DE
Passiflora coccinea e P. hatschbachii
Este estudo teve como objetivo principal a obtenção e caracterização de híbridos
interespecíficos de Passiflora, visando selecionar aqueles que apresentam características
interessantes ao mercado de plantas ornamentais. No capítulo 1 foram realizadas
hibridações interespecíficas em espécies de Passiflora para estudar a compatibilidade
entre elas e indicar os cruzamentos promissores para a produção de híbridos
ornamentais. Foram realizados 530 cruzamentos interespecíficos entre as espécies. Em
528 cruzamentos utilizou-se a espécie P. subrotunda como genitor femenino, e os
outros dois cruzamentos foram entre P. coccinea vs. P. hatschbachii. Dos 528
cruzamentos envolvendo P. subrotunda, 128 resultaram na fecundação da flor, porém,
apenas quatro cruzamentos utilizando esta espécie como receptora de pólen resultaram
em frutificação. Posteriormente foi possível a confirmação da fecundação cruzada
utilizando o marcador molecular SSR e a Hibridação Genômica In Situ (GISH). Dos
dois cruzamentos envolvendo P. coccinea vs. P. hatschbachii, um cruzamento produziu
fruto, resultando em 117 plantas híbridas. O cruzamento P. coccinea vs. P. hatschbachii
foi promissor, gerando uma progênie com potencial para sere utilizada em programas de
melhoramento de Passiflora para fins ornamentais. No capítulo 2 foi realizada a
descrição morfológica e citogenética dos híbridos F1 obtidos do cruzamento entre
Passiflora coccinea vs. P. hatschbachii, bem como a confirmação da hibridação
interespecífica com base em marcadores SSR e através da GISH. Foram observadas
diferenças qualitativa e quantitativa entre os híbridos em relação aos descritores
morfológicos florais e vegetativos avaliados. O descritor floral mais relevante para a
distinção dos híbridos foi o bandamento da corona, permitindo a separação das
progênies em drois grupos, originando os híbridos Passiflora ‘Vivis’ e Passiflora
‘Jhovi’, as quais tiveram o seu registro solicitado a Passiflora Society International. Foi
utilizada a coloração convencional com Giemsa 4% para observação do número
cromossômico, onde foi observada estabilidade numérica de 2n = 18 tanto nos genitores
como na progênie pertencentes aos dois grupos. O marcador molecular microssatélite
(SSR) Pa07 e a GISH confirmaram a fecundação cruzada nos grupos identificados. O
comportamento meiótico das amostras analisadas demonstrou que há regularidade
meiotica, indicando compatibilidade genética entre os genitores e possivelmente
híbridos com alta viabilidade meiótica. Considerando a beleza das flores de Passiflora,
P. ‘Vivis’ e P. ‘Jhovi’ são híbridos com potencial para o mercado ornamental, podendo
compor jardins, sobre pérgulas ou podendo ser cultivados em vasos na decoração de
diferentes ambientes. No capítulo 3 foram caracterizados genitores e híbridos F1 de
Passiflora, com base em descritores morfológicos, bem como foi estimados os
parâmetros genéticos da progênie híbrida visando o melhoramento destes híbridos para
uso ornamental. As avaliações morfológicas foram realizadas em dois períodos, com
intervalo de seis meses. Observou-se variabilidade para o formato e tamanho dos
descritores morfológicos na população híbrida. Através do agrupamento de Scott-Knott
verificou-se que a maioria das características apresentaram valores intermediários aos
dos genitores. Porém, houveram híbridos que obtiveram valores superiores aos genitores
para o tamanho dos primeiros filamentos da corona, largura de bráctea e diâmetro da
corona, evidenciando heterobeltiose. Em geral, as características florais apresentaram
vii
maiores valores de herdabilidade que as características vegetativas. Os maiores valores
de herdabilidade para as caraceristicas florais diâmetro da flor, largura de pétala,
comprimento e largura de sépala e tamanho da primeira série da corona possibilita
realizar a seleção de genótipos e se obter ganhos significativos, com base nos dois
períodos de avaliação. A variabilidade genética identificada nas progênies, estimada
com base em características morfológicas e parâmetros genéticos, evidencia o potencial
destes genótipos para serem utilizados em programas de melhoramento de passifloras
voltados a ornamentação. No capítulo 4 estimou-se a divergência genética dos híbridos
F1 HD25 e seus genitores pela análise multivariada Ward-MLM. Foram avaliados 22
descritores morfológicos, em dois períodos de avaliação. No primeiro período de
avaliação, os genótipos foram alocados em quatro grupos e no segundo período foram
distribuídos em seis grupos. Os grupos em que os genitores estavam incluídos foram os
grupos que apresentaram menos similaridade genética, independente do período de
avaliação. A soma das duas primeiras variáveis canônicas explicaram 98,11% e 89,00%
de toda a variação observada no primeiro e segundo período de avaliação,
respectivamente. Desta forma, foi observado que existe diversidade genética entre os
genótipos híbridos e as espécies genitoras, que pode ser explorada em programas de
melhoramento de Passiflora ornamental. No capítulo 5 foi realizada a caracterização
cariotípica e a confirmação da hibridação interespecífica em 16 híbridos F1, mediante
combinação de técnicas de citogenética clássica e molecular. Foi utilizada a coloração
convencional para analises cariotípicas. Realizou-se a técnica de bandamento
CMA3/DAPI para a identificação das regiões ricas em GC e AT. Foi aplicada a GISH
usando as sondas dos genitores, simultaneamente, para detecção dos genomas parentais
nos híbridos e utilizou-se a Hibridação In Situ Florescente (FISH) para localização de
sítios de DNA Sat e 5S como marcadores cromossômicos. A análise com o fluorocromo
CMA3 possibilitou a visualização de heterocromatina rica em GC, cuja região
corresponde aos satélites. A GISH permitiu a diferenciação do genoma de cada genitor
nos 16 híbridos. Os cromossomos marcadores foram identificados como sendo no
quinto e sexto par em P. coccinea, e em P. hatschbachii no terceiro e sétimo, os quais
correspondem os sítios DNA Sat e DNAr 5S, respectivamente. Foram observados em
todos os híbridos analisados estes marcadores cromossômicos, indentificando os
genomas dos genitores na progênie F1. A GISH e a FISH além de permitirem a
confirmação das hibridações, sugere estabilidade entre os genomas genitores nos
híbridos pela ausência de translocações entre genomas e a não visualização de
modificações genômicas de âmbito citológico.
Palavras-chave: Hibridação interespecífica, P. ‘Vivis’, P. ‘Jhovi”, parâmetros
genéticos, análise multivariada, GISH e FISH.
viii
ABSTRACT
MORPHOLOGICAL, GENETIC AND CYTOGENETIC ANALYSIS IN
INTERSPECIFIC HYBRIDS Passiflora coccinea and P. hatschbachii
The main objective of this study was to obtain and characterize interspecific hybrids of
Passiflora, in order to select those that present interesting characteristics to the market
of ornamental plants. In Chapter 1, interspecific hybridizations were carried out on
Passiflora species to study the potential for hybridization between them and indicate the
promising crosses for the production of ornamental hybrids. There were 530
interspecific crosses between species. In 528 crosses the species P. subrotunda was
used as maternal parent, and the other two crosses were between P. coccinea vs. P.
hatschbachii. Of the 528 crosses involving P. subrotunda, 128 resulted in the
fertilization of the flower, however, four crosses using this species as pollen recipient
resulted in fruiting. Subsequently it was possible to confirm cross-fertilization using the
molecular marker SSR and Genomic In Situ Hybridization (GISH). Of the two crosses
involving P. coccinea vs. P. hatschbachii, a cross produced fruit, resulting in 117
hybrid plants. The P. coccinea vs. P. hatschbachii was promising, generating a progeny
with potential to be used in programs of improvement of Passiflora for ornamental
purposes. In chapter 2 the morphological and cytogenetic description of the F1 hybrids
obtained from the cross between P. coccinea vs. P. hatschbachii, as well as the
confirmation of interspecific hybridization based on SSR markers and through Genomic
In Situ Hybridization. Qualitative and quantitative differences between hybrids were
observed in relation to the floral and vegetative morphological descriptors evaluated.
The most relevant floral descriptor for the hybrids distinction was the corona banding,
which was responsible for the separation of the progenies into the groups, giving rise to
the Passiflora 'Vivis' and Passiflora 'Jhovi' cultivars, which were registered with the
Passiflora Society International. Conventional staining with Giemsa 4% was used to
observe the chromosome number, where a numerical stability of 2n = 18 was observed
in both parents and progeny belonging to both groups. Microsatellite molecular marker
(SSR) Pa07 and GISH confirmed cross-fertilization in the identified groups. The
meiotic analysis was performed by the technique of crushing in acetic carmine for the
investigation of meiotic abnormalities and fertility in a sample of the progeny evaluated.
The meiotic behavior of the analyzed samples showed a meiotic regularity, indicating
high genetic compatibility between the parents and possibly hybrids with high meiotic
and disjunctional viability. Considering the beauty of Passiflora flowers, P. 'Vivis' and
P. 'Jhovi' are hybrids with potential for the ornamental market, being able to compose
gardens, pergolas or can be grown in pots in the decoration of different environments.
In chapter 3 we characterized the F1 parents and hybrids of Passiflora, based on
morphological descriptors, as well as estimating the genetic parameters of the hybrid
progeny aiming at the improvement of these hybrids for ornamental use. Morphological
evaluations were performed in two periods, with a six-month interval. In the first one
the genetic parameters were estimated in the parents and in 117 F1 hybrids. In the
second period the parents and 107 F1 hybrids were evaluated. Variability was observed
for the shape and size of the morphological descriptors in the hybrid population.
Through Scott-Knotts group it was verified that most of the characteristics presented
intermediate values to those of the parents. However, there were hybrids that obtained
values superior to the parents for the size of the first filaments of the crown, bract width
and diameter of the crown, evidencing the heterosis. In general, the floral characteristics
ix
had higher values of heritability than the vegetative characteristics. The highest values
of heritability for the floristic traits flower diameter, petal width, sepal width and width
and size of the first crown series makes it possible to perform genotype selection and
obtain significant gains, based on the two evaluation periods. The genetic variability
identified in the progenies, estimated on the basis of morphological characteristics and
genetic parameters, shows the potential of these genotypes to be used in programs to
improve passifloras for ornamentation. In Chapter 4 the genetic divergence of F1 HD25
hybrids and their parents was estimated by the Ward-MLM multivariate strategy, which
allows the joint analysis of qualitative and quantitative variables. 22 morphological
descriptors were evaluated in two evaluation periods, with a six-month interval between
them. In the first evaluation period, the genotypes were allocated into four groups and in
the second period were distributed into six groups. The groups in which the parents
were included were the groups that presented the least genetic similarity, regardless of
the evaluation period. The sum of the first two canonical variables explained 98.11%
and 89.00% of all variation observed in the first and second evaluation periods,
respectively. There is genetic diversity between the hybrid genotypes and the genitor
species, which can be explored in ornamental Passiflora breeding programs. In Chapter
5, the karyotypic characterization and the confirmation of the interspecific hybridization
in 16 F1 hybrids were performed by combining classical and molecular cytogenetic
techniques. Conventional staining was used for karyotypic analyzes. The CMA3
banding technique was used to identify the GC rich regions. Genomic In Situ
Hybridization was applied using the probes of the parents simultaneously for the
detection of parental genomes in the hybrids and the Fluorescent In Situ Hybridization
(FISH) was used to locate Sat and 5S DNA sites as chromosomal markers. The analysis
with the fluorochrome CMA3 enabled the visualization of heterochromatin rich in GC,
whose region corresponds to the satellites. GISH allowed the differentiation of the
genomes of each parent in the 16 hybrids. The marker chromosomes were identified as
being from the fifth to the sixth pair in P. coccinea, and in P. hatschbachii in the third
and seventh, which correspond to the sites Sat DNA and 5S rDNA, respectively. These
chromosomal markers were identified in all hybrids analyzed, identifying the genomes
of the parents in the F1 progeny. GISH and FISH, besides allowing the confirmation of
the hybridizations, suggests stability between the genomes in the genomes in the
hybrids by the absence of translocations between genomes and the non-visualization of
genomic modifications of cytological scope.
Keywords: Interspecific hybridization, P. 'Vivis' and P. 'Jhovi', genetic parameters,
multivariate analysis, GISH and FISH.
x
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..........................................................................................................1
2. REVISÃO DE LITERATURA ..................................................................................5
2.1 O gênero Passiflora L. ................................................................................................5
2.2 Potencial ornamental de Passiflora L. ........................................................................7
2.3 Hibridação artificial em Passiflora L. ........................................................................8
2.4 Confirmação de cruzamentos em Passiflora L.: marcadores moleculares e análises
citogenéticas......................................................................................................................9
2.5 Parâmetros genéticos.................................................................................................12
2.6 Análise de divergência genética: Método Ward-MLM.............................................14
CAPÍTULO I
3. Hybridization potential between Passiflora species for ornamental
use....................................................................................................................................16
Abstract............................................................................................................................16
3.1 Introduction...............................................................................................................17
3.2 Material and methods ...............................................................................................19
3.3 Results.......................................................................................................................25
3.4 Discussion..................................................................................................................27
3.5 Acknowledgment.......................................................................................................33
3.6 References.................................................................................................................33
CAPÍTULO II
4. Passiflora coccinea vs. Passiflora hatschbachii: NOVOS HÍBRIDOS
ORNAMENTAIS...........................................................................................................47
Resumo............................................................................................................................47
Abstract............................................................................................................................48
4.1 Introdução..................................................................................................................49
4.2 Material e Métodos....................................................................................................51
4.3 Resultados..................................................................................................................55
4.4 Discussão...................................................................................................................61
4.5 Conclusões.................................................................................................................64
4.6 Agradecimentos.........................................................................................................65
4.7 Referências Bibliográficas.........................................................................................65
xi
CAPÍTULO III
5. ESTIMATIVA DE PARÂMETROS GENÉTICOS EM HÍBRIDOS
INTERESPECÍFICOS F1 de Passiflora L. (P. coccinea vs. P. hatschbachii) PARA
ORNAMENTAÇÃO......................................................................................................70
Resumo............................................................................................................................70
Abstract............................................................................................................................71
5.1 Introdução..................................................................................................................72
5.2 Material e Métodos....................................................................................................73
5.3 Resultados..................................................................................................................77
5.4 Discussão...................................................................................................................95
5.5 Conclusões.................................................................................................................99
5.6 Agradecimentos.........................................................................................................99
5.7 Referências Bibliográficas.........................................................................................99
CAPÍTULO IV
6. ANÁLISE DE DIVERGÊNCIA GENÉTICA EM HÍBRIDOS
INTERESPECÍFICOS DE Passiflora L. PELO MÉTODO WARD-MLM...........104
Resumo..........................................................................................................................104
Abstract..........................................................................................................................105
6.1 Introdução................................................................................................................106
6.2 Material e Métodos..................................................................................................107
6.3 Resultados................................................................................................................110
6.4 Discussão.................................................................................................................121
6.5 Conclusões...............................................................................................................123
6.6 Referências Bibliográficas.......................................................................................124
CAPÍTULO V
7. CITOGENÉTICA COMPARATIVA E HIBRIDAÇÃO IN SITU PARA A
DETERMINAÇÃO DO CARÁTER HÍBRIDO DA PROGÊNIE
INTERESPECÍFICA F1 DE Passiflora L. (P. coccinea vs. P. hatschbachii)..........127
Resumo..........................................................................................................................127
Abstract..........................................................................................................................128
7.1 Introdução................................................................................................................129
7.2 Material e Métodos..................................................................................................131
7.3 Resultados................................................................................................................137
7.4 Discussão.................................................................................................................148
xii
7.5 Conclusões...............................................................................................................152
7.6 Agradecimentos.......................................................................................................152
7.7 Referências Bibliográficas.......................................................................................153
8. CONCLUSÕES GERAIS.......................................................................................156
9. REFERÊNCIAS COMPLEMENTARES.............................................................157
1
1. INTRODUÇÃO
O gênero Passiflora L. é composto de um grande número de espécies, onde mais
de 525 já foram descritas (CERVI; IMIG, 2013). O Brasil é considerado um dos
principais centros de diversidade do gênero, sendo reportados cerca de 137 espécies
(BERNACCI et al., 2013). No estado da Bahia, o gênero Passiflora consta de 32
espécies endêmicas, com grande distribuição nos biomas baianos, sendo a Floresta
Atlântica do Sul do Estado e a Chapada Diamantina consideradas os principais centros
de diversidade e distribuição (NUNES; QUEIROZ, 2006; BERNACCI; SOUZA 2012).
Estas espécies são apreciadas cada vez mais como plantas ornamentais devido
principalmente à originalidade de suas flores, as quais são bastante diversificadas com
relação à coloração, a presença da corona (estrutura peculiar da família Passifloraceae) e
variedade na forma das folhagens (SOUZA; PEREIRA, 2003).
Diante do crescente uso destas espécies na ornamentação é possível perceber um
aumento no número de estudos com as mesmas, especialmente estudos de
melhoramento genético para obter variantes genéticos que incremente o valor comercial
das passifloras. Sendo assim, a hibridação interespecífica é um método eficiente e
bastante utilizado em programas de melhoramento genético, uma vez que possibilita a
combinação da variabilidade em espécies muitas vezes contrastantes, permitindo a
obtenção de materiais geneticamente superiores e heterogêneos (SANTOS et al., 2012).
Nas espécies de Passiflora, a produção de híbridos normalmente visa à produção
de cultivares comerciais resistentes a doenças (JUNQUEIRA et al., 2005), geralmente
para a produção de frutos. Entretanto, a obtenção de híbridos para fins ornamentais está
sendo impulsionada, uma vez que vários híbridos vêm sendo produzidos para essa
finalidade (ABREU, 2008; BELO et al., 2018; MELO et al., 2015; SANTOS et al.,
2012). A realização dos cruzamentos interespecíficos com espécies de Passiflora tem
por finalidade a obtenção de flores com formato e cores intrínsecos, levando a sua
utilização na linha do agronegócio de plantas ornamentais (SANTOS et al., 2011).
Em programas de melhoramento de plantas ornamentais é importante a
identificação de genótipos promissores para produção de híbridos com heterose e a
partir daí determinar os métodos de melhoramento mais adequados (VIANA, et al.,
2007). Neste sentido, estudos de caracterização morfológica, diversidade genética e
estimativa de parâmetros genéticos em híbridos interespecíficos são importantes, uma
vez que é possível a identificação do componente genotípico em determinada
2
característica de interesse, permitindo traçar estratégias de melhoramento (CRUZ;
CARNEIRO, 2006).
No melhoramento de plantas a abordagem multivariada é um meio de
agrupamento eficaz na analise de divergência genética entre indivíduos, com grande
importância, principalmente, quando há um número grande de descritores (SANTOS,
2013). Essa análise possibilita o conhecimento da variabilidade genética entre o
germoplasma em análise. Existem métodos de análise multivariada que possibilita o uso
concomitante de variáveis quantitativas e qualitativas para a verificação da
variabilidade, como é o caso do método Ward-MLM (Ward-Modified Location Model
(FRANCO et al., 1998). Esta metodologia consiste primeiramente na formação de
grupos, os quais são definidos pelo método de agrupamento Ward (WARD, 1963)
utilizando a matriz de dissimilaridade de Gower (GOWER, 1971). Posteriormente, a
média do vetor da variável quantitativa para cada subpopulação, que independe dos
valores da variável qualitativa, é estimada pelo método MLM (SANTOS 2013).
A confirmação da hibridação em Passiflora pode ser realizada com base em
diversas técnicas, através de marcadores moleculares codominantes, técnicas de
citogenética molecular, como a Hibridação Genômica In Situ (GISH) e Hibridação In
Situ Fluorescente (FISH), as quais são eficientes neste processo. A confirmação
utilizando marcadores moleculares têm sido empregados em vários gêneros como,
Passiflora (BELO et al., 2018; CONCEIÇÃO et al., 2011b; MELO et al 2016;
SANTOS et al., 2012), Carica L. (MAGDALITA et al., 1997) e Theobroma L.
(FALEIRO et al., 2003).
Os marcadores microssatélites (SSR - Simple Sequence Repeats) revelam o
polimorfismo de forma codominante, com alto poder discriminante (AKKAYA et al.,
1992). É um dos marcadores mais utilizados devido a essas propriedades e ao alto
conteúdo informativo que este proporciona (OLIVEIRA et al., 2006). Os marcadores
SSR são constituídos por sequências repetidas em tandem, de um a seis nucleotídeos e
essas regiões são delimitadas por sequências conservadas de DNA, para as quais são
desenvolvidos primers específicos destas regiões flanqueadoras (LITT; LUTY, 1989;
SELKOE; TOONEN, 2006). Estudos com marcadores microssatélites abrangendo
espécies de Passiflora, tendo sido desenvolvidos apenas para P. edulis Sims. f.
flavicarpa O. Deg. (OLIVEIRA et al., 2005), P. alata (PÁDUA et al., 2005), Passiflora
contracta (CAZÉ, 2012), P. cincinnata (CERQUEIRA-SILVA et al., 2012) e P. setacea
D.C. (CERQUEIRA-SILVA et al., 2014).
3
Além do uso de marcadores moleculares outros estudos com a citogenética
clássica e molecular auxiliam no melhoramento genético. Neste sentido, a aplicação de
técnicas de citogenética clássica, como a coloração convencional, no estudo do número
e morfologia cromossômica, bem como a utilização de técnicas de bandamento através
de fluorocromos base-específicos tem auxiliado no estudo cariotípico de espécies e
híbridos de Passiflora (MELO et al., 2001). A análise de satélite (constrição secundária)
nos cariótipos de genitores e híbridos de Passiflora pode ser realizada com base em
fluorocromos CMA3 e DAPI, evidenciando diversidade na localização dos blocos
CMA3 e DAPI, servindo também como marcadores citológicos na confirmação do
status híbrido (MELO et al., 2001; MELO et al., 2014).
A citogenética molecular tem refinado estudos sobre a localização de genes ou de
sequencias de DNA repetitivo, por meio de Hibridação In Situ Fluorescente (FISH).
Além deste método, a GISH tem sido utilizada para a análise do parentesco e
confirmação de cruzamentos para a obtenção de híbridos (MELO et al., 2015a; MELO
et al., 2017). Ambas as técnicas têm contribuído bastante na localização de diferentes
sequencias de DNA e genomas completos em cromossomos meióticos ou mitóticos, em
fibras de cromatina estendidas e em núcleos interfásicos (FALEIRO et al., 2005;
WANG, et al., 2013). Entretanto, a caracterização citogenética molecular em híbridos
de Passiflora tem sido pouco relatada, embora a localização de sítios para DNA
ribossômico possa fornecer excelentes cromossomos marcadores para caracterização e
confirmação do caráter híbrido (HASTEROK et al., 2005; MELO et al., 2017;
MOREIRA, 2017; SILVA et al., 2017 in press).
O uso da técnica de FISH com sondas para DNAr 45S visando o mapeamento e
caracterização foi realizado inicialmente no híbrido somático de P. edulis f. flavicarpa
vs. P. amethystina J.C.Mikan (CUCO et al., 2005). Em híbridos obtidos de P. gardneri
Mast. vs. P. gibertii N.E.Br. foram utilizadas sondas para os sítios DNAr 5S e 45S para
a confirmação do cruzamento, evidenciando que essa técnica é eficiente na identificação
de híbridos em Passiflora (SILVA et al., 2017 in press). O uso de sondas de DNA Sat, o
qual colocaliza com sítios de DNAr 45S, foi realizado para o estudo comparativo entre
espécies de Passiflora visando o conhecimento evolutivo dessas sequências nos
genomas (PAMPONÉT, 2017).
A utilização de GISH na caracterização dos genomas pode ser útil para identificar
cromossomo ou fragmento cromossômico da espécie silvestre inserida na espécie
cultivada, e para a caracterização de novas cultivares. Em híbridos de P. gardneri vs. P.
4
gibertii a GISH permitiu a comprovação do caráter híbrido em todas as plantas F1
analisadas (SILVA et al., 2017 in press), bem como na caracterização cariotípica de
cultivares e híbridos de Citrus (MOREIRA, 2017). Além disso, a GISH pode ser
utilizada em estudos de recombinação entre híbridos retrocruzados (MELO et al., 2017).
Este estudo teve como objetivo a obtenção e caracterização de híbridos
interespecíficos de Passiflora, visando selecionar aqueles que apresentam características
de interesse ao mercado de plantas ornamentais. Como objetivos específicos: a) realizar
hibridações interespecíficas em espécies do gênero Passiflora para estudar a
compatibilidade entre elas e indicar os cruzamentos promissores para a produção de
híbridos ornamentais; b) realizar a descrição morfológica e citogenética dos híbridos F1
obtidos do cruzamento entre Passiflora coccinea vs. P. hatschbachii, bem como
confirmar a hibridação interespecífica com base em marcadores SSR e através da GISH;
c) caracterizar genitores e híbridos F1 de Passiflora, com base em descritores
morfológicos, bem como estimar parâmetros genéticos da progênie híbrida visando
selecionar híbridos para uso ornamental; d) estimar a divergência genética dos híbridos
F1 através de uma abordagem multivariada utilizando análise simultânea de variáveis
qualitativas e quantitativas pelo método Ward-MLM; e) utilizar técnicas de citogenética
clássica e molecular para caracterizar e cofirmar a fecundação cruzada de híbridos F1
resultantes do cruzamento entre P. coccinea vs. P. hatschbachii;
5
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 O gênero Passiflora L.
A família Passifloracea engloba 17 gêneros e aproximadamente 650 espécies
(BERNACCI et al., 2013a), das quais estão distribuídas nas regiões tropicais e
subtropicais no mundo. No entanto, o número de espécies tem aumentado com novas
descobertas, como P. cristalina Vanderpl. & Zappi (VANDERPLANK; ZAPPI, 2011)
P. cacao Bernacci & M. M. Souza (BERNACCI; SOUZA, 2012) e P. pottiae Cervi &
Imig (CERVI; IMIG, 2013). Grande parte das espécies têm seu centro de origem na
América do Sul, e o Brasil é considerado um dos principais centros de diversidade, com
relatos de três gêneros Dilkea Mast., Mitostemma Mast. e Passiflora L. (BERNACCI et
al., 2013b).
No início de século XX, Killip (1938) subdividiu o gênero Passiflora em 22
subgêneros. Porém, mais recentemente foi proposta uma nova classificação, com a
subdivisão do gênero em quatro subgêneros, Astrophea, Deidamioides, Decaloba, e
Passiflora (FEUILLET; MACDOUGAL, 2004), levando em consideração para o estudo
taxonômico, aspectos morfológicos. Posteriormente, a redução do número de
subgêneros proposto por Killip para os quatro subgêneros foi com base em estudos
filogenéticos e taxonômicos por meio de analise molecular e através de dados na
evolução do número cromossômico (HANSEN et al., 2006). Quanto ao ciclo de vida, as
espécies de Passiflora, são plantas semi-perenes ou perenes (PEREIRA et al., 2005),
trepadeiras, de hábito lenhoso ou herbáceo, podendo encontrar espécies arbóreas ou
arbustivas e com presença de gavinhas (NUNES; QUEIROZ, 2006).
O gênero contempla espécies com grande variabilidade morfológica. Suas folhas
são simples e alternas, elípticas ou orbiculares, inteiras ou lobadas, pecíolo com ou sem
glândulas. A margem foliar pode ser inteira, serreada, denteada ou pectinada, base
cordada, truncada, arredondada ou cuneada (MACDOUGAL; FEUILLET, 2004). As
flores normalmente são hermafroditas, de simetria radial com ampla variação na
coloração; flores brancas (Passiflora hatschbachii Cervi), flores vermelhas (Passiflora
coccinea Aubl.), flores roxas (Passiflora subrotunda Mast.). O cálice é composto por
cinco sépalas, sendo carnosas, ovais, lanceoladas, até amplamente oval-deltóides.
Normalmente, a corola é composta por cinco pétalas membranáceas, que se alternam
com as sépalas. A corona, conjunto de filamentos que envolve a base do ovário, é
6
característica mais marcante do gênero, fato que dar suporte para a taxonomia do grupo.
O androginóforo consiste em um longo tubo floral de órgãos sexuais femininos e
masculinos, soldados e elevados, que situam na parte superior, sempre em número de
cinco e unidos por sua base (CERVI, 1997; ULMER; MACDOUGAL, 2004). Possuem
ovário globoso, ovóide ou fusiforme, unilocular, 3-carpelar, muitos óvulos em
placentação parietal (NUNES; QUEIROZ, 2006). Os frutos geralmente são bagas,
indeiscentes ou cápsulas deiscentes, globosos ou ovoides, com ampla variação no
tamanho, forma e coloração, podendo encontrar frutos vermelhos, amarelos ou roxos
(NUNES; QUEIROZ, 2006; ULMER; MACDOUGAL, 2004; VANDERPLANK,
2000). As sementes são abundantes, comprimidas, com formato ovadas a abcordadas e
são cobertas por um arilo mucilaginoso (NUNES; QUEIROZ, 2006).
O gênero Passiflora é o mais representativo dentro da família Passifloracea, por
apresentar um grande número de espécies, mais de 525 já foram descritas (CERVI;
IMIG, 2013). No Brasil foram reportados aproximadamente 137 espécies, sendo um dos
principais centros de diversidade (BERNACCI et al., 2013b). No estado da Bahia, o
gênero Passiflora consta de 32 espécies, com grande distribuição nos biomas baianos,
sendo a Floresta Atlântica do Sul do Estado e a Chapada Diamantina consideradas os
principais centros de diversidade (NUNES; QUEIROZ, 2006; BERNACCI; SOUZA
2012). Foram encontradas três espécies consideradas endêmicas nos biomas do Estado,
P. saxicola Gontsch, encontrada nos municípios de Ilhéus e Mundo Novo, P. bahiensis
Klotzsch, nos municípios de Cruz das Almas e Itaju do Colônia e P. mucugeana T.S.
Nunes e L.P. de Queiroz, com ocorrência em uma pequena área próxima ao município
de Ibicoara e Mucugê (NUNES 2002).
O uso das espécies do gênero Passiflora é bastante diversificado, podendo ser
empregadas para fins medicinais (devido ao composto passiflorina, que é um ansiolítico
natural encontrado nas folhas e flores), produção de cosméticos (cremes, perfumes e
óleos) (PENHA, 2012), ornamentais e alimentares. Na alimentação humana o principal
uso dessas espécies é para o consumo in natura, na forma de sucos, sorvetes e doces. No
entanto, há um grande interesse para o mercado ornamental, em função da exuberância
de suas flores e folhas (ABREU et al., 2009).
7
2.2 Potencial ornamental de Passiflora L.
Embora a percepção de uma planta ornamental seja peculiar para cada indivíduo,
Mello Filho (1986), a definiu como sendo aquela que provoca estímulos a partir de
características como coloração, tamanho, textura, aspectos fenológicos, sombra
projetada. Dessa forma, as espécies de Passiflora são consideradas cada vez mais como
plantas ornamentais devido principalmente à exuberância de suas flores, as quais são
bastante diversificadas com relação à coloração, a presença da corona, estrutura peculiar
da família Passifloraceae, variedade na forma das folhagens (SOUZA e PEREIRA,
2003). Além disso, as flores possuem perfume marcante e florescimento abundante
(VANDERPLANK, 2000; ULMER; MACDOUGAL, 2004), com período longo de
florescimento para algumas espécies, como é o caso de P. subrotunda que permanece
com suas flores abertas por cerca de 12h (SOUZA 2014), P. bahiensis e P. eichleriana,
as quais possuem flores que permanecem abertas por mais de 24h, e P. cinnabarina e P.
herbertiana cujas flores ficam abertas por três dias consecutivos (ULMER;
MACDOUGAL, 2004).
O cultivo das espécies de Passiflora com objetivo de ornamentar ambientes é
antigo, sendo a Europa pioneira nessa atividade. Por volta de 1625 foram utilizadas as
espécies P. incarnata e P. caerulea (CERVI, 1997), ficando limitado por muito tempo
as essa espécies. Porém, esse fato mudou quando o pesquisador Thomas Milne produziu
o primeiro híbrido artificial, P. ‘Violacea’, oriundo do cruzamento entre P. racemosa x
P. caerulea (PEIXOTO, 2005). Após esse cruzamento, já foram produzido uma grande
quantidade de híbridos com finalidade ornamental (http://www.passiflorasociety.org). A
utilização dessas espécies como ornamental foi sendo consolidada na Europa e nos
Estados Unidos, com ampla comercialização na forma de sementes ou mudas
(RUSHING, 2003; ULMER; MACDOUGAL, 2004; VANDERPLANK, 2000).
Considerando a ampla variabilidade genética das passifloras e considerando que o
Brasil é o centro de diversidade do grupo, o cultivo dessas espécies com intuito
ornamental ainda é pouco explorada (SOUZA et al., 2003).
O fato das passifloras serem pouco utilizadas como ornamentais no Brasil está
relacionado a questão cultural (ABREU et al., 2009), uma vez que, as pessoas não têm o
hábito de cultiva-las exclusivamente para a ornamentação. Sendo assim, há a
necessidade de um trabalho de divulgação no país, para solucionar essa questão cultural
(PEIXOTO, 2005). São poucos os relatos referente ao uso de passifloras ornamentais no
8
Brasil. No Sudeste do país, são utilizadas as espécies P. alata Curtis e P. edulis em
pérgulas ou cercas vivas. Na região Norte e Nordeste são utilizadas as espécies P.
coccinea e P. cincinnata Mast., respectivamente (PEIXOTO, 2005). Dentre as espécies
citadas, P. alata vem sendo destacada em revistas de paisagismo e decoração de
ambientes internos e externos (DURANTE, 2013; CARINI, 2014).
Determinadas espécies de Passiflora se aclimatam a ambientes diversificados
favorecendo o uso na ornamentação de interiores e exteriores. Passiflora morifolia e P..
sublanceolata podem ser utilizadas em vasos para a ornamentação em ambientes
sombreados (PIRES et al., 2011). Por outo lado, P. suberosa litoralis, P. subrotunda
Mast. e P. mucronata Lam. condizem com o uso em jardins sob pleno sol, como
componente de cercas vivas ou pérgulas (PIRES et al., 2011; SOUZA, 2014; MELETTI
et al., 2011). No caso de P. racemosa Brot. e P. kermesina Link e Otto. podem ser
cultivadas em locais com meia sombra (PEIXOTO, 2005).
2.3 Hibridação artificial em Passiflora L.
O processo de hibridação é o resultado da combinação de dois ou mais genomas
de espécies distintas em um mesmo indivíduo (SCHUCK, 2012). Ocorre em indivíduos
que se reproduzem de forma sexuada através da polinização cruzada, produzindo uma
progênie resultante da segregação e recombinação (ALLARD, 1971). Sendo assim, o
cruzamento entre dois genitores originará uma população com variabilidade genética
(SCHUCK, 2012).
O fato das passifloras apresentarem flores grandes, florescimento abundante,
receptividade do estigma e viabilidade do grão de pólen no mesmo período, são
características que fazem com que estas espécies sejam utilizadas em cruzamentos
controlados, sendo que a hibridação pode ser considerada como um processo simples
em programas de melhoramento genético (BRUCKNER; OTONI, 1999).
A compatibilidade genética entre as espécies envolvidas nas hibridações
interespecíficas é um dos principais fatores que deve ser observado para que se obtenha
êxito neste processo, ou seja, as espécies envolvidas devem apresentar homologia
cromossômica para assegurar que os híbridos obtidos sejam viáveis (PEREIRA et al.,
2005). Outro importante fator, tem sido observado com estudos envolvendo viabilidade
do pólen, receptividade do estigma, compatibilidade genética, através de hibridações
9
controladas, têm levado a produção de híbridos promissores para serem utilizados em
programas de melhoramento de plantas (FALEIRO et al., 2008).
Geralmente as hibridações interespecíficas em Passiflora têm como finalidade a
produção de híbridos resistentes a doenças ou que apresentem alta produtividade.
(JUNQUEIRA et al., 2005). Porém, a obtenção de híbridos ornamentais está sendo
realizada no sentido de gerar genótipos que sejam atrativos para uso em paisagismo e
que atendam a diferentes interesses. O primeiro híbrido ornamental de Passiflora
chamado BRS Estrela do Serrado foi lançado no Brasil e envolveu as espécies P.
coccinea vs. P. setacea (FALEIRO et al., 2007). A partir de então já foram obtidos e
registrados híbridos ornamentais (BELO et al., 2018; MELO et al., 2016; SANTOS et
al., 2012). A fim de selecionar genótipos com caracteres de interesse ornamental,
cruzamentos entre sete espécies de Passiflora foram realizados para obtenção de
híbridos interespecíficos F1, os quais foram retrocruzados para verificar a
compatibilidade reprodutiva entre os genitores (CONCEIÇÃO et al., 2011a).
Híbridos interespecíficos de Passiflora são utilizados como ornamentais não
somente devido a beleza das flores produzidas, mas também em viturde da forma de
suas folhas (ABREU et al., 2009), como observado nos híbridos P. ‘Sarah Aimee’
Vanderplank (P. urbaniana Killip vs. P. foetida var. hirsutissima) e P. ‘Pink Jewel 1’
Vanderplank (P. palmeri Rose var. sublanceolta Killip vs. P. foetida var. hirsutissima
Killip), os quais apresentam folhas que chamam atenção para o paisagismo
(VANDERPLANK, 2002).
A existência de híbridos naturais em Passiflora também deve ser considerado,
uma vez que já foi contastada a origem de algumas espécies do gênero por meio da
hibridação como rota de especiação. A origem de P. edulis f. fiavicarpa não é
totalmente esclarecida, pois supõe-se que ela foi originada do cruzamento natural ou por
mutação entre entre P. edulis e P. ligularis Juss (POPE, 1935; VANDERPLANK,
2000).
2.4. Confirmação de cruzamentos em Passiflora L.: marcadores moleculares e
análises citogenéticas
A confirmação dos cruzamentos envolvendo espécies de Passiflora pode ser
baseado em métodos para a obtenção de marcadores moleculares, bem como através de
técnicas de citogenética de identificação cromossomica. Os marcadores moleculares
10
podem ser divididos em duas categorias: codominantes, os quais distinguem
heterozigotos, como o RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) e o SSR
(Simple Sequence Repeats); e os dominantes, os quais não distinguem heterozigotos,
como o ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) e o RAPD (Random Amplified
Polimorphic DNA) (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998; ZÁRATE et al., 2005).
Os marcadores microssatélites ou SSR (Single Sequence Repeats) são sequências
repetidas em tandem compostas de um a seis nucleotídeos (LITT; LUTY, 1989), cujas
sequencias flaqueantes são conservadas em muitas espécies. Utiliza-se destas
sequências para o desenvolvimento de primers e amplificação dos loci microssatélites,
visto que a verificação do polimorfismo ocorre pelo número de repetições monoméricas
no fragmento SSR (OLIVEIRA, 2006). Uma vez que as regiões flanqueadoras são
conservadas, os primers desenhados para uma determinada espécie podem ser utilizados
em espécies relacionadas, o qual é denominado de amplificação cruzada ou
transferibilidade de primers (VARSHNEY, 2005; BRAVO, 2006). A análise dos loci
SSR permite a confirmação de cruzamentos pela simples observação da segregação
mendeliana de herança na família.
O fato deste marcadores terem natureza codominante, faz com que sejam
empregados para diversos estudos. Porém, deve ser produzidos primers específicos para
loco SSR, com base em sequências previamente conhecidas (MELO 2014). Desta
forma, estudos envolvendo espécies de Passiflora ainda são escassos, devido a carência
destes marcadores específicos para estas espécies. Esses primers foi desenvolvidos
apenas para P. alata, P. edulis, P. contracta, P. cincinnata e P. setacea (CAZÉ et al.,
2012; CERQUEIRA-SILVA, 2012; CERQUEIRA-SILVA et al., 2014; OLIVEIRA,
2005; PÁDUA et al., 2005).
A utilização de marcadores microssatélites têm sido empregados de maneira
eficiente em estudos de confirmação de hibridações interespecíficas (BELO et al., 2018;
JUNQUEIRA et al., 2008; MELO et al., 2016; SANTOS et al., 2012). O primeiro relato
utilizando marcadores moleculares ocorreu para confirmação de 15hibridacões
interespecíficas de Passiflora (JUNQUEIRA et al., 2008). A obtenção dos híbridos P.
‘aninha’, P. ‘alva’ e P. ‘priscilla’, com finalidade ornamental, a partir do cruzamento
entre P. sublanceolata (ex P. palmeri var. sublanceolata) e P. foetida foram
confirmados com marcadores moleculares SSR e RAPD (SANTOS et al., 2012). A
partir do cruzamento P. gardneri vs. P. gibertti, também foi confirmado a paternidade
11
dos híbridos P. ‘Bella’ e P. ‘Gabriela’ com os marcadores citados anteriormente, sendo
que um par de primers conseguiu obter resultados eficientes (BELO et al., 2018).
Análises citogenéticas têm contribuído para diversas finalidades no estudo
biológico do gênero, como os estudos evolutivos e taxonômicos, bem como na
confirmação do sucesso de hibridações interespecíficas. (MELO et al., 2017, SILVA et
al., 2017 in press). A análise do cariotípico é importante no sentido que cada
cromossomo tem uma função no desenvolvimento de uma espécie (COELHO, 2015), o
número de cromossomos e cada variante que cada um demosntra contribui nestes
estudos (GUERRA, 1988).
As técnicas citogenéticas classicas têm grande importância para o entendimento
das diferenças entre os táxons e suas relações filogenéticas, porém, no estudo de
confirmação de cruzamentos, análises com base em coloração convencional, utilizando
Giemsa, não fornece respostas tão eficientes quanto análises moleculares, uma vez que,
por meio da coloração convencional é possível apenas a realização da contagem do
número cromossômico. Porém, a utilização de fluoroscromos base-específicos pode ser
utilizado no processo de confirmação, pois possibilita uma análise mais detalhada com
fluorocromos CMA3 (cromomicina A3) e DAPI (4‟-6‟diamidino-2-10-fenilindol) que
evidenciam regiões heterocromáticas ricas em bases GC e AT, respectivamente. As
regiões onde são observadas os satélites servem como marcadores cromossômicos na
confirmação dos cruzamentos nos híbridos interespecíficos (MELO et al., 2001). Em
híbridos de P. edulis vs. P. cincinnata foi possível a visualização de blocos CMA3, os
quais colocalizam com os sítios de DNAr 45S (COELHO et al., 2016).
Com o estabelecimento das técnicas de hibridação molecular in situ, pode
identificar sítios espécificos de DNA, como sequências centroméricas, teloméricas
genes ribossomais, sendo que a localização de sequências ribossomais são excelentes
marcadores para a confirmação de paternidade em híbridos, uma vez que estas
sequencias já foram utilizados para esta finalidade (HASTEROK et al., 2005). A FISH
basea-se na desnaturação e renaturação dos ácidos nucleicos, os quais são encarregados
pela construção de moléculas hibridas (MELO, 2014). Além disso, esta técnica utiliza
sondas para que ocorra a hibridação com o DNA alvo e possa haver a detecção por meio
de anticorpos conjugados com fluorocromoso, uma vez que estas têm compatibilidade
por moléculas pertencentes as sondas (SCHWARZACHER; HASLOP-HARRISON,
2002). A FISH, através de sondas 45S e 5S na confirmação de híbridos foi reportada
para o híbrido somático de P. edulis f. flavicarpa x P. amethistina (CUCO et al.,2005),
12
para os híbridos sexuais P. edulis Sims vs. P. cincinnata Mast. (COELHO et al., 2016),
P. gardneri MAST. vs. P. gibertii N.E. BROW (SILVA et al., 2017 in press) e em
híbridos retrocruzados de Passiflora (MELO et al., 2017).
A GISH é uma técnica proveniente de uma modificação da FISH, sendo bastante
eficiente na confirmação de paternidade em híbridos interespecíficos, permitindo a
distinção dos genomas dos genitores nos híbridos (SILVA; SOUZA 2013). No
procedimento da GISH é utilizado o DNA genômico total do genitor paterno como
sonda e o DNA total do genitor materno não marcado, em maior concentração, que atua
como DNA de bloqueio, porém, a concentração do DNA de bloqueio deve ser ajustada
para cada espécie, com base no grau de proximidade genética dos genitores envolvidos
nos cruzamentos (SILVA; SOUZA, 2013). Na identificação dos híbridos
interespecíficos obtidos do cruzamento entre P. gardneri vs. P. gibertii, foi utilizado o
DNA genômico paterno como sonda e o DNA genômico materno com DNA de
bloqueio, sendo que o DNA de bloqueio foi 100x mais concentrado que a sonda
(SILVA et al., 2017 in press). Em híbridos de P. edulis vs. P. cincinnata foi possível à
confirmação através da GISH (COELHO et al., 2016).
Na GISH também pode-se utilizar o DNA genômico total dos genitores como
sonda simultaneamente no mix de hibridação. O uso simultâneo de sondas de ambos os
genitores de híbridos F1 e retrocruzados de Passiflora permitiu a visualização de ambos
os genomas entre os híbridos analisados (MELO et al., 2015a). Em orquídeas, no
cruzamento entre Paphiopedilum delenatii vs. Paphiopedilum micranthum foi possível
através do uso da sonda concomitante dos genitores a visualização de cada lote
cromossômico dos genomas dos genitores nos híbridos (LEE et al., 2011).
2.5 Parâmetros genéticos
A estimativa de parâmetros genéticos permite decidir qual o melhor método a ser
empregado no melhoramento e seleção, pois permite a escolha dos carcateres nas
primeiras etapas e em situações mais avançadas em programas de melhoramente e, além
disso, possibilita inferir o valor conferido a cada caráter, sendo importantes para as
estratégias de melhoramento (ROSSMANN, 2001).
Em plantas perenes a estimativa dos parâmetros genéticos requer mais atenção,
pois estas plantas por apresentarem ciclo longo, os melhoristas devem tomar as decisões
mais certas possíveis. Aliado a isto, é importante o cuidado com os experimentos em
13
campo para que estes sejam delineados de forma correta para a obtenção de estimativas
confiáveis (BISON, 2004).
O coeficiente de variação experimental (CVe) é indicado para inferir sobre a
precisão do experimento. Sendo assim, caracteres que apresentam coeficiente de
variação experimental baixo confirma que os dados obtidos foram precisos. Porém,
características como área foliar, que é condicionado por muitos genes, sendo mais
influenciados pelo ambiente, apresentam coeficiente de variação experimental alto
(SANTOS et al., 2011).
O coeficiente de variação genotípica (CVg) possibilita estimar a variabilidade
genética, que expressa a magnitude da variação genética em função da média do caráter
(RESENDE, 1991). O coeficiente de variação genotípica é considerado alto quando é
superior a 7% (SEBBENN et al., 1998). O coeficiente de variação genotípica em
espécies nativas avalia a variabilidade genética e pode inferir sobre a forma de
cruzamentos entres as espécies, sendo importantes para estudos da variação genética
entre populações naturais para o conhecimento da estrutura das populações
(KAGEYAMA, 1990; RESENDE, 1999).
A partir dos valores do coeficiente experimental (CVe) e do coeficiente de
variação genotípica (CVg), pode-se estimar o índice de variação (IV), que é obtido
através da relação entre CVg/CVe. O índice de variação possibilita a indicação e seleção
de métodos de melhoramento mais apropriados para determinado caracter (SANTOS et
al., 2012). Neste sentido, o índice de variação quanto mais próximo da unidade (1,00)
maior a probabilidade de ganho com a seleção (VENCOVSKY, 1987).
A herdabilidade, que é representada pelo símbolo h2, possibilita a identificação
das diferenças não genéticas e genéticas entre indivíduos, sendo importante para a
predição de ganhos genéticos e na determinação dos métodos de seleção a serem
empregados (REIS, 2000). A variação fenotípica que pode ser herdada, quantifica o
valor fenotípico com base no valor genético, sendo este o valor que influenciará a
próxima geração (ROSSMANN, 2001). Desta forma, a herdabilidade tem grande
importância, pois é através dela que tem-se o conhecimento de quanto da variação
fenotípica é atribuída à variação genotípica (FALCONER; MACKAY, 1996).
A herdabilidade pode variar de zero a um, sendo que quando as diferenças
fenotípicas entre os indivíduos são causadas apenas por diferenças genéticas entre os
mesmos a herdabilidade é igual a um. Porém, quando a herdabilidade é igual a zero, a
14
variabilidade do caráter não tem origem genética. Sendo assim, não há correlação entre
valor genético e valor fenotípico da unidade de seleção (ALLARD, 1971).
Os programas de melhoramento genético visam que os caracteres desejados sejam
herdáveis (BORÉM; MIRANDA, 2009). Neste caso, os caracteres qualitativos
fundamentam-se nas variações fenotípicas, avaliadas nas descendências de cruzamentos.
Enquanto que, os caracteres quantitativos são mais complexos de serem herdados, uma
vez que são governados por muitos genes com efeitos específicos e são mais
influenciados pelo fator ambiental (ARAGÃO et al., 2002; CRUZ; REGAZZI, 2004).
Em híbridos ornamentais de Passiflora os caracteres florais tiveram herdabilidade
maior que os caracteres vegetativos, podendo realizar a seleção com base nos caracteres
florais de forma eficiente (BELO, 2010, MELO et al., 2016; SANTOS et al., 2011).
Altos coeficientes de variação genética e herdabilidade foram encontrados para todos os
caracteres estudados em Eucalyptus cloeziana, indicando grande controle genético na
herança destes caracteres com possíveis ganhos através do método seleção (BERTI,
2010).
2.6 Análise de divergência genética através do método Ward-MLM
Baseado em características morfoagronômicas, bioquímicas, fisiológicas e
polimorfismos de DNA, pode-se saber a distância genética entre indivíduos e estimar a
divergência genética (AMARAL JÚNIOR, et al., 2010). Estudos de divergência
genética possibilita a detecção de genitores favoráveis que possam ser utilizados em
cruzamentos para a produção de híbridos heteróticos (CRUZ, 2006). Neste sentido, a
análise multivariada é um ferramenta que possibilita a caracterização de genótipos por
meio de descritores morfológicos qualitativos e quantitativos a fim de diferenciá-los
(FERRÃO et al., 2011). Para isso, existem diversos métodos multivariados para o
estudo da diversidade genética, porém, devem ser utilizados de acordo com o objetivo
de estudo. Dentre estes métodos, têm-se o Ward-MLM (Ward-Modified Location
Model), proposto por Franco et al. (1998).
O método estatístico Ward-MLM é capaz de analisar simultaneamente caracteres
qualitativos e quantitativos, sendo utilizadas todas as informações disponíveis dos
genótipos para a sua caracterização (PAIVA et al., 2014). Para este tipo de análise foi
proposto o Location Model (LM), o qual agrupa n indivíduos, quando p variáveis
contínuas e q variáveis discretas são mensuradas em um ambiente (ORTIZ et al., 2008).
15
Desta forma há uma combinação dos níveis de todos q variáveis discretas em apenas
uma variável multinominal W, com níveis m (w= 1, 2,..., m) (CAMPOS, 2012). Além
disso, para determinar o número de grupos é utilizada a logarítmica da probabilidade
(Log-Likelihood), fundamentado em pseudo-F e pseudo-t², associando a descrição de
verossimilhança com a avaliação da razão da verossimilhança (SAS INSTITUTE,
2000).
O método Ward-MLM é composto por duas etapas. A primeira etapa consiste do
agrupamento Ward (WARD JUNIOR, 1963), através da matriz de dissimilaridade de
Gower (GOWER, 1971). A segunda etapa refere-se a utilização do procedimento MLM
a partir da média das variáveis quantitativas em cada população (AMARAL JÚNIOR, et
al., 2010). Além disso, esta técnica possibilita indicar o número ótimo de grupos com
base no cálculo da subdivisão precisa, sendo realizada a identificação da probabilidade
de cada acesso se alocar em grupos específicos (GONÇALVES et al., 2009).
A aplicação do procedimento Ward-MLM tem sido realizada no melhoramento de
diversas culturas para o estudo da divergência genética, como em tomateiro
(GONÇALVES et al., 2009), feijoeiro (CABRAL et al., 2010), bananeira (PEREIRA et
al., 2012), goiabeira (CAMPOS et al., 2013), mamoeiro (LUZ et al., 2014). Através do
método Ward-MLM foi possível identificar diversidade genética entre acessos de uma
mesma espécie de Capsicum, os quais apresentam potencial para serem utilizados
programas de melhoramento genético (BIANCHI, 2017). Este método tem sido
aplicado também para a seleção de plantas de Passiflora resistentes a virose visando
recuperar a qualidade do fruto após ter sido reduzida com o processo de hibridação
(SANTOS, 2013). Sendo utilizados também para avaliar a variação genética em
híbridos retrocruzados de Passiflora com valor ornamental (MELO et al., 2015b)
16
CAPÍTULO 1 Manuscrito nas normas da revista Brazilian Journal of Botany para publicação
Viviane de Oliveira Souza1*, Margarete Magalhães Souza1, Gonçalo Santos Silva1
Hybridization potential between Passiflora species for ornamental use
1 Department for Biological Sciences (DBS), State University of Santa Cruz, CEP 45662900 Ilhéus,
state of Bahia, Brazil.
*Corresponding author: e-mail: [email protected] (V.O. Souza); Phone/Fax.: +557336805055.
ORCID iD: 0000-0002-8801-0101; 0000-0003-0292-7988.
Abstract
Interspecific hybridization is a plant breeding method use for searching improvements of
specific trait of interest. The objective of this work was to carry out interspecific hybridizations in
species of the genus Passiflora for studying the hybridization potential between them, also to
identity the promising crosses to produce ornamental hybrids. 530 interspecific crosses were created
between the Passiflora species, of which 528 using the species P. subrotunda as donor and receptor
of pollen, and two crosses of P. coccinea vs. P. hatschbachii. Between the 528 crosses involving P.
subrotunda, 128 resulted in the fertilization of the flower. Four crosses produced fruits when using
P. subrotunda as receptor of pollen, this enabled the use of molecular markers for the confirmation
the cross-fertilization. Three crosses produced fruit when using P. subrotunda as a pollen donor.
However, the plants from these crosses did not reach the adult stage, not making it possible to
confirm the hybridization. Out of the two crosses involving P. coccinea vs. P. hatschbachii, only
one produced fruit. From the seeds of that fruit were obtain 117 hybrid plants. Microsatellites and
Genomic In Situ Hybridization (GISH) were used for hybridization confirmation. Crossbreeding
involving P. coccinea vs. P. hatschbachii showed potential to be used in ornamental Passiflora
breeding programs.
Keywords: Ornamental hybrids, interspecific crossing, microsatellite marker, GISH.
17
1 Introduction
Passiflora L. genus belongs to the Passifloraceae A.L. de Jussieu ex Kunth family, and is
considered of great importance due to the large number of species, around 525 (Cervi and Imig
2013) and to their intra- and interspecific variability (Bellon et al. 2009). These species present
lovely and well-diversified flowers in terms of shapes, sizes and colors, which potentiates their
ornamental use (Abreu et al. 2009). About 137 species have been recorded in Brazil (Bernacci et al.
2013).
Objective of this work was to obtain flowers with exotic color and shape, which allows
greater acceptance for use in ornamental plants (Santos et al. 2011). Interspecific hybridization is
important because it is a technique that allows the production of genetically superior materials, due
to the recombination of the existing variability (Santos 2008). The first hybrid of Passiflora, called
P. 'Violacea', was produced in England by Thomas Milne in 1819 from the cross between P.
caerulea L. and P. racemosa Brot. (Vanderplank 2000). Since then, several hybrids have already
been obtained and registered at the International Passiflora Society
(http://www.passiflorasociety.org).
In Brazil, the creation of hybrids for ornamental purposes is expanding, leading to the creation
of several hybrids for this purpose (Abreu 2008; Conceição et al. 2011a; Santos et al. 2012; Belo et
al. 2018), among which P. ‘Alva’ #120 (2008), P. ‘Aninha’ #121 (2008), P. ‘Priscilla’ #122 (2008)
(Santos et al. 2012), P. ‘Gabriela’ #170 (2010) and P. ‘Bella’ #171 (2010) (Belo et al. 2018). In
other countries, some hybrids are used in greenhouses and gardens, such as P. 'Lady Margareth' and
P. 'Sunburst', respectively from the crosses between P. coccinea Aubl. vs. P. incarnata L. and P.
gibertiana MacDougal vs. P. jorullensis Kunth (Ulmer and Macdougal 2004).
Obtaining progenies from the cross between two pure species usually presents an intermediate
phenotype sharing the characteristics of the parents (Ulmer and Macdougal 2004). For
accomplishing this, knowing how the genitors are genetically related may be the key for a
18
successful interspecific hybridization. If the species present chromosomal homology, this will
increase the chances for success in interspecific hybridization to obtain a viable hybrid (Pereira et
al. 2005).
Confirmation of interspecific hybridization is an important practice in plant breeding
programs. Several techniques can be used for this purpose, such as the use of molecular markers,
molecular cytogenetic techniques such as Genomic In Situ Hybridization (GISH). The
methodologies including molecular cytogenetics may be useful for the confirmation of interspecific
hybridizations. The use of GISH has already been reported for certain species (Silva and Souza
2013), including those of the genus Passiflora (Melo et al. 2017; Silva et al. 2017 in press). GISH is
based on the use of the genomic DNA of the parents, using the DNA of the female genitor and the
total genomic DNA of the male genitor as probe. This makes possible to distinguish the genome
from the donor species in the hybrid (Silva and Souza 2013).
Molecular markers are used to verify polymorphism and can be applied at any stage of plant
development (Faleiro 2005). SSR (Simple Sequence Repeats) markers are DNA regions composed
of repeated single sequences of one to six base pairs in tandem (Souza 2015). This type of marker
has codominant inheritance, being able to make the identification between homozygotes and
heterozygotes. These markers have been used in some genus such as Carica L. (Magdalita et al.
1997), Theobroma L. (Faleiro et al. 2003) as well as in Passiflora (Junqueira et al. 2008; Conceição
et al. 2011b; Santos et al. 2012). However, in Passiflora, there are still few studies with
microsatellite markers, having been reported for P. alata Curtis (Pádua et al. 2005), P. edulis Sims.
f. flavicarpa O. Deg. (Oliveira et al. 2005), P. setacea D.C. and P. cincinnata (Cerqueira-Silva et al.
2014), P. cacao Bernacci & M. M. Souza, P. gibertii N. E. Brown, P. glandulosa Cav., and P.
mucronata Lam. (Silva et al. 2014). The cross-fertilization in Passiflora is confirmed by using SSR
markers, as well as Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD) and Inter-Simple
19
Sequence Repeat (ISSR) (Junqueira et al. 2008; Conceição et al. 2011a; Melo et al. 2016; Santos et
al. 2012; Belo et al. 2018).
Considering the need for prior knowledge of the combinations of species of the genus
Passiflora for hybridizations to verify which can be used in future breeding programs, this work had
as objective to carry out interspecific hybridizations in Passiflora to study the potential of
hybridization between them and indicate the promising crosses for the production of ornamental
hybrids.
2 Material and Methods
2.1 Plant material and interspecific hybridizations
The interspecific hybridizations were carried out between May 2014 and June 2015 between
Passiflora species (Table 1; Fig. 1). maintained at the Germplasm Active Bank of the State
University of Santa Cruz, Ilhéus, state of Bahia, Brazil (longitude 39°10'W, latitude 14°39'S,
altitude 78m). The species were kept under protected cultivation conditions, in the espalier system,
in a semi-arch type greenhouse with a 100μm thick plastic covering, activated against UV rays.
Hybridizations were performed according to the flowering period of each species. The species
P. subrotunda participated as a donor and recipient of pollen grains in most interspecific crosses,
due to the presence of a small flower of intense coloration, which can be used in pots and compose
internal or external decorative environments, and present a long period of flower opening and
flowering all year round (Souza 2014), being these characteristics appreciated in the improvement
of ornamental passifloras. No crosses between P. subrotunda and the species P. hatschbachii and P.
coccinea have been observed, as there was no synchronization during flowering. The number of
pollinations for each crossing ranged from 1 to 130, and was performed according to the availability
of flowers in each species.
20
The flower buds were protected with paper bags one day before the anthesis, to prevent
contaminations of any kind. Before the opening of the flower, the anthers were removed and
manual pollinations were carried out by transferring the pollen into the stigma with the aid of a
forceps. Next, the buttons were again protected with paper bags, and checked after five days for
whether there was fertilization or abortion of the floral bud. The fruit resulting from the
hybridizations were protected with nylon screen until maturation. The number of days for fruit
maturation, number of fruits and number of seeds were all evaluated. The seeds were collected from
the fruits, washed and dried at room temperature and stored at 10ºC for later evaluation of the
germination capacity.
2.2 Seeds germination
Seeds coming from the crosses between P. subrotunda vs. P. racemosa, in both crossing
directions; P. vitifolia vs. P. subrotunda; P. malacophylla vs. P. subrotunda; P. subrotunda vs. P.
mucronata; P. subrotunda vs. P. elegans; P. coccinea vs. P. hatschbachii. The seed arils were
removed and sowing was carried out in plastic trays containing the soil substrate, kept in a
greenhouse. The number of seeds placed to germinate corresponded to the quantity of seeds
originating from the fruit obtained for each crossing. Seedling emergence was monitored and the
number of germinated seeds was verified, including the number of days until appearance of
cotyledons and true leaves. After emergence of the true leaves, the seedlings were transferred to
black polyethylene bags, with a capacity of 0.5L.
Due to the lack of synchrony in the flowering, and consequently too the period of the crosses
between the species, it was necessary to place the collected seeds soon to germinate, and it was not
possible to carry out an experimental design. Therefore, for statistical analysis, the chi square test χ2
(P <0.05) was adopted according to Conceição et al. (2011a).
21
2.3 Transferability of SSR primers and crosses confirmation with SSR
Confirmation of the hybridizations was performed using the molecular marker SSR. The
genomic DNA of the parents and of the assumed F1 hybrid plants was extracted from the leaf tissue
by the Doyle and Doyle method (1990) with modifications (Melo et al. 2015). Young leaves were
collected, macerated in liquid nitrogen and then placed in extraction buffer CTAB 2% (NaCl a 1.4
M; EDTA a 20 mM; Tris-HCl a 100 mM; PVP 2%; B-Mercaptoetanol 0.2%). Isolation of nucleic
acids was performed with chloroform: isoamyl alcohol solution (24:1) and resuspended DNA was
done with TE buffer (1mM EDTA; 10mM Tris). Quantification of genomic DNA was estimated by
comparison with 100ng/μL lambda DNA in 1% agarose gel stained with SYBR safe (Invitrogen®).
In order to obtain SSR markers, it was necessary to first carry out the transferability of SSR
primers into the material, due to the lack of SSR primers designed for the Passiflora species under
study. In order to verify the presence of polymorphic SSR loci between parents and subsequent
confirmation of the hybrids, 11 primers developed for P. edulis (Oliveira et al. 2005, 2008) and
three primers developed for P. alata (Table 2) (Pádua et al. 2005). For a final volume of 20μL, SSR
reactions were performed including 10x buffer; 2.5mM MgCl2; 2.5mM dNTP; 10pmol Primer; Taq-
polymerase at 5U µL-1 and 20ng genomic DNA at the following amplification conditions: initial
denaturation at 95°C for 5 minutes, 35 denaturation cycles at 95°C for 40 seconds, annealing at
56°C for 40 seconds, extension at 72ºC for 50 seconds and with a final extension at 72ºC for 7
minutes. The transferability of SSR primers and the existence of polymorphism were verified by
2% agarose gel electrophoresis stained with SYBR Safe and photo documented in Locus L-PIX
system (Locus biotechnology). The confirmation of the interspecific crosses is due to the presence
of different alleles in the genitor species, which segregate in the supposedly hybrid plants. Software
GelAnalyzer-version 2010a (Lazer software 2010) was employed to calculate the size of the
informative bands.
22
2.4 Slides preparation for GISH
GISH was carried out in plants from the crosses between P. coccinea vs. P. hatschbachii and
P. subrotunda vs. P. racemosa for the confirmation of interspecific hybridization. The radicles were
collected from cuttings obtained from matrix plants, pretreated with 8-hydroxyquinoline (8-HQ) at
0.002M for 1 hour at room temperature (RT) and 21 hours at ± 8 -10ºC. After washing twice in
distilled water and fixed in Carnoy (ethanol: glacial acetic acid [3:1], v/v; Johansen, 1940) for 3
hours at RT, the rootlets were maintained at -20°C until use. In order to prepare the slides, the root
apices were washed twice in distilled water and incubated with 20μl of the enzymatic solution 2%
cellulase and 20% (w/v) pectinase for 1 hour and 20 minutes at 37°C. Next, the radicles washed and
the meristematic ends were macerated in 6μl of 45% acetic acid, with a coverall laid over the plant
material. With the aid of needles and under a stereoscopic microscope, the roots were macerated
and covered with a cover slip. They were tapped with the tip of the forceps for disruption of the
cells. The coverslips were then pressed lightly between filter paper to spread the chromosomes,
frozen in liquid nitrogen for at least 5 minutes for later removal of the coverslip, and air dried. The
slides were selected under light microscopy with phase contrast and stored at -20°C until the
application of the GISH technique.
2.5 DNA extraction and probe preparation
For the GISH procedures, the genomic DNA of the parents was extracted using the protocol
proposed by Doyle and Doyle (1990), with modifications (Melo et al. 2015). At the intersection
between P. subrotuda vs. P. racemosa, the total genomic DNA of the paternal parent (P. racemosa)
was used as a probe and the total genomic DNA of the maternal parent (P. subrotunda) was used as
100x concentrated blocking DNA. At the intersection between P. coccinea vs. P. hatschbachii was
used the total genomic DNA for the preparation of the probes, with no blocking DNA being used.
In order to break the probe and the blocking DNA, about 20μg of genomic DNA in a final volume
23
of 200μL was cleaved using sonicator (Qsonica, Q125) with programming for amplitude 40%, 2
seconds on and 2 seconds off, with the total time scale of 5 minutes (Jauhar and Peterson 2006).
Verification of the size of the cleaved fragments was performed by 2% agarose gel electrophoresis
(Pronadisa) using the 100bp ladder marker (NEB) as a parameter. After cleavage of the genomic
DNA, purification of the DNA cleaved by precipitation was performed with 2% final volume of 3M
sodium acetate plus 200% of the final ethanol volume. The mixture was stored at -20°C overnight
and after this period, centrifuged for 10 minutes at 14,000rpm at 20°C for the elimination of the
supernatant and subsequent drying in RT for at least 1 hour. The pellet was resuspended with
ultrapure water. Probe labeling for the maternal genitor (P. subrotunda) and the paternal genitor (P.
hatschbachii) was performed by Nick translation with Biotin-16-dUTP (Roche Diagnostics®) and
the maternal parent (P. coccinea) a labeling of the probe was with Digoxigenin-11-dUTP (Roche
Diagnostics®), in the final concentration of 1μg of cleaved DNA, following the protocol proposed
by the manufacturer.
2.6 Genomic In Situ Hybridization (GISH)
The treatment of the slides followed the protocol for hybridization in situ fluorescence
proposed by Schwarzacher and Heslop-Harrison (2000) and Souza et al. (2010), with modifications
made by Melo et al (2015). Slides containing the mitotic metaphases were oven-dried at 37°C for
the minimum time of 1 hour. After application of 50μl of 1μg/ml RNase (Sigma) in 2xSSC buffer
(0.3M sodium chloride, Sigma, 0.03M sodium citrate, Sigma), the slides were incubated for 1 hour
at 37°C and then immersed in 2x SSC at RT twice for 5 minutes each time; the solution containing
50μl of 10mM HCl was added over the metaphases for 5 minutes, and after removal of the HCl,
50μl of pepsin (Sigma) [10mg/ml pepsin; 10mM HCl (1:100 v/v)] and the slides were incubated in
the wet chamber for 20 minutes at 37°C. The washing steps mentioned below were performed on a
shaker platform at 120rpm (Biomixer, Mos-1). The slides were washed in 2xSSC at RT twice for 5
24
minutes each time, immersed in 4% formaldehyde at RT for 10 minutes, and again washed in
2xSSC twice for 5 minutes each time. The cytological preparations were dehydrated in 70% ethanol
and 96% ethanol for 5 minutes.
After drying the slides at RT for 30 min, the hybridization mixture was added to the final
volume of 15 μl, being 50% formamide (Sigma), 10% dextran sulfate (Sigma), 2xSSC, 0.13% SDS
(Sodium dodecyl sulfate) (Bioagency). For the identification of the hybrids, 33ng of probe and
3.3μg of the blocking DNA in the hybridization mix, 100x more concentrated than the probe, were
used for the crossing between P. subrotunda vs. P. racemosa. For the identification of the hybrids
from the cross between P. coccinea vs. P. hatschbachii, 33ng of each probe was used in the
hybridization mix. The hybridization mixture was heated at 75°C for 10 minutes in thermal cycler
(Eppendorf, Mastercycler) and transferred to ice for at least 5 minutes. Slides containing the
hybridization mixture were denatured in a thermocycler containing a slide adapter (Techne, TC-
412) at 75°C for 10 minutes, and incubated overnight at 37°C in a humid chamber. After
hybridization, the slides were immersed in 2xSSC at RT for 5 minutes for removal of the coverslips.
Post-hybridization baths were performed in a Dubnoff bath (Quimis, 9226ML) at 42°C, consisting
of two immersions in 2xSSC for 5 minutes each time, two in 0.1xSSC for 5 minutes each time, and
two immersions in 2xSSC for 5 minutes each. The slides were immersed in 4xSSC/0.2% Tween 20
(Sigma) at RT for 5 minutes and treated with 50μl of 5% BSA (Bovine Serum Albumin ) (Sigma).
The biotin-labeled probe was detected with 0.7 μl avidin-FITC (Vector) plus 19.3 μl 5% BSA per
slide and the digoxigenin-labeled probe was detected with 0.7 μl anti-digoxigenin-rhodamine. The
slides containing the antibody for detection were incubated in the humid chamber for 1 hour at
37°C. Three baths were performed for 5 minutes each time for removal of the excess antibody with
4xSSC/0.2% Tween 20 at RT. The slides were rapidly immersed in 2xSSC and then mounted and
counter-coated with DAPI/Vectashield® (H-1200), stored at ± 8 - 10°C until analysis.
25
The metaphases were photo documented using the Olympus BX41 epifluorescence
microscope equipped with a 5M Olympus DP25 digital camera by the DP2-BSW software.
Hybridizations detected with avidin-FITC were visualized using the U-MWB filter (excitation 450-
480nm/dichroic cutoff 500nm/emission> 515nm) and the hybridizations detected with anti-
digoxigenin-rhodamine were visualized with the U-MWG filter excitation 510-550 nm/dichroic
cutoff 570nm/emission> 590nm). The FITC/rhodamine overlays and the boards were made using
the SC5 photoshop software.
3 Results
3.1 Interspecific crosses
There were 530 interspecific crosses between Passiflora species, of which 99.62% used the P.
subrotunda species as donor or receptor of pollen. On the other hand, 0.38% corresponded to the
two crosses involving P. coccinea vs. P. hatschbachii. Among the 528 crosses involving P.
subrotunda, 128 resulted in flower fertilization (Table 3). However, only four crosses using P.
subrotunda as a pollen recipient produced fruits, of which three crosses were obtained plants and it
was possible to perform cross fertilization confirmation (Table 3). When we used P. subrotunda as
a pollen donor, four crosses produced fruit. However, the plants from these crosses did not complete
the development stages, and were still in the germination stage (Fig. 2a) and died (Table 3), making
it impossible to confirm the hybridization. Of the two crosses involving P. coccinea vs. P.
hatschibachii, only in one there was fertilization and fruit production, and the native seedlings
presented green coloration and vigorous appearance (Fig. 2b).
Regardless of the confirmation of cross-fertilization, the characteristics mentioned in table 3
were evaluated for all crosses, since the confirmation of the hybrid was only carried out after the
development of the seedlings. Crosses involving P. subrotunda as paternal genitor resulted in a
26
higher number of fertilized flowers, number of fruits and number of seeds (Table 3). However, not
all reciprocal crosses led to fructification, as observed in P. subrotunda vs. P. cincinnata and in P.
subrotunda vs. P. malacophyla. Fruit formation was only verified for crosses involving P.
subrotunda vs. P. elegans and P. subrotunda vs. P. racemosa (Table 3).
After the fertilization of the flower, the greatest time (days) between the formation of the fruit
and its maturation occurred in the crosses in which P. subrotunda was the male parent. While in the
P. coccinea vs. P. hatschbachii cross the smaller time was observed (Table 3).
The highest percentage of fructification occurred in the crossings between P. malacophylla vs.
P. subrotunda, this value was higher than the expected used in the Qui Square test (Table 3). The
fructification values of the other interspecific crossings were lower than the expected (≤ 63.2%).
The crosses between P. racemosa vs. P. subrotunda and P. vitifolia vs. P. subrotunda, showed the
highest number of seeds per fruit. The P. coccinea vs. P. hatschbachii cross produced only one fruit
with 248 seeds (Table 3).
The seeds of the cross between P. coccinea vs. P. hatschbachii presented the highest
germination speed (days). In addition, this cross had the highest germination percentage reaching
the closest value to the expected one. This cross also showed the largest number of live plants
(Table 3). Not all the cotyledons nor the true leafs appear at the same time (days). The time for the
appearance of the true leaf presented greatest variation (Table 3).
3.2 Crosses confirmation with SSR
The SSR markers were used for the confirmation of the following crosses: P. subrotunda vs.
P. racemosa, P. subrotunda vs. P. elegans, P. subrotunda vs. P. mucronata and P. coccinea vs. P.
hatschbachii. The confirmation was made just for the crosses that reached the adult stage.
Only one SSR marker (Pa07) of 14, amplified a polymorphic heterozygous locus relevant for
the confirmation of the interspecific hybridization between P. coccinea (250bp fragment) and P.
27
hatschbachii (260bp fragment). Were assumed hybrids all the crosses that presented the two bands
in a range of 250bp (female) and 260bp (male) (Fig. 3a). The other crosses, P. subrotunda vs. P.
elegans, P. subrotunda vs. P. mucronata (data not shown), P. subrotunda vs. P. racemosa (Fig. 3b),
presented a monomorphic pattern using the SSR maker Pe90 confirming that there was no cross-
fertilization.
3.3 Crosses confirmation with GISH
The GISH technique was performed to ratify the results obtained through the SSR markers.
All genitors and F1 plants (P. subrotunda vs. P. racemosa and P. coccinea vs. P. hatschbachii) were
diploid, with 2n = 18 chromosomes. The chromosomal set from the genitors P. coccinea vs. P.
hatschbachii were distinguished using GISH (Fig. 3c), proving the hybrid state of the F1 plants. The
nine chromosomes of the paternal genitor (P. hatschbachii) detected with avidin-FITC were
strongly hybridized, marking green the entire chromosome. The other nine chromosomes of the
maternal parent (P. coccinea) detected with anti-digoxigenin-rhodamine were marked red (Fig. 3c).
For the crossing between P. subrotunda vs. P. racemosa, although the blocking DNA of the
maternal parent (P. subrotunda) was 100x concentrated, it was not possible to distinguish the
genomes of the parents in the plants, since every chromosome set was hybridized (Fig. 3d),
evidencing that these individuals did not present a hybrid state.
4 Discussion
The interspecific hybridization in Passiflora in this study reveals compatibility among some
species, which may be due to the phylogenetic relationships between them, and many crosses did
not produce fruit. The most promising combination was the cross between P. coccinea and P.
hatschbachii, since there was fertilization, higher seed yield per fruit, higher percentage of
28
germination and vigor. In light of this, the species involved in this cross show the potential to be
used in programs of improvement of Passiflora for ornamental use.
The combinations using P. subrotunda as pollen receptor were not successful, since the
individuals from these crosses did not present a hybrid character. On the other hand, some
combinations using P. subrotunda as a pollen donor produced fruits, from which were generated
seedlings that did not reach the adult stage, possibly due to post-fertilization barriers. Thus,
although it was not possible to confirm cross-fertilization, the plants could be hybrid. The fact that
P. subrotunda presents a small rate of self-compatibility (Souza 2014) may be a factor to be
considered in crosses involving this species, and it is mandatory to remove the stamen in the pre-
crossing procedures to produce interspecific hybrids. It is worth mentioning that this is a pioneer
study with P. subrotunda involving interspecific crosses and that this data of combination of species
of the genus in the production of hybrids are important to find strategies in the improvement of
ornamental passifloras.
In the present study, reciprocal crosses were not successful for all species. At the cross
between P. cincinnata vs. P. subrotunda and P. subrotunda vs. P. malacophylla have been verified
fruiting when P. cincinnata and P. subrotunda were used as the female parent. This is probably due
to unilateral incompatibility, i.e. a self-incompatible species when crossing a self-compatible
species does not produce fruit. The unilateral incompatibility has been reported for the genus
Passiflora (Bugallo et al. 2011; Conceição et al. 2011a) and can be explained by the formation and
growth of the pollen tube in only one of the crossing directions (Conceição et al. 2011a). Another
phenomenon that may influence the failure of a reciprocal crossing is the sporophytic incongruity,
in which the occurrence of fruiting in only one of the crossing paths is due to the sporophytic
incompatibility system (Bugallo et al. 2011; Ocampo et al. 2016).
Hybridizations that resulted in low fruiting may have occurred due to the pollen tube having
interrupted its growth still in the stylet, without fertilization (Bugallo et al. 2011) resulting in the
29
absence of fruits. Only the cross between P. malacophylla vs. P. subrotunda presented fruiting
higher than the expected value, used as reference value in the Qui Square test. In other interspecific
crosses involving the genus Passiflora, fruiting similar or greater than expected has been obtained
for most crosses (Conceição et al. 2011a).
Although the cross between P. malacophylla vs. P. subrotunda showed a percentage of
germination that was higher than expected, used as reference value in the Qui Square test, it did not
produce seedlings. In other crosses involving P. sublanceolata and hybrids (P. sublanceolata vs.
HD13-133 and HD13-133 vs. HD13-141), the percentage of seed germination was below the
expected value, although the crosses produced offspring (Conceição et al. 2011a). Higher
percentage of germination does not imply obtaining more seedlings or producing offspring. These
facts may be related to incongruence due to post-fertilization barriers such as embryo death from
endosperm degeneration (Freitas et al. 2015).
Other factors may also influence seed germination, such as embryo development error, seed
dormancy, embryo-endosperm compatibility (Lester and Kang 1998; Kinoshita 2007), and the
presence of aryl in the seed (Ferreira et al. 2005). The elimination of aryl implies the removal of
inhibitory substances from the germination, and this process positively influenced germination, as
occurred with P. alata seeds, once seed dormancy was broken (Ferreira et al. 2005). Failure to
develop endosperm and low seed germination were observed in different interspecific
hybridizations in Passiflora (Ocampo et al. 2016).
Synchrony was not observed in the germination of the seeds for all crosses, with variation
between 8 and 21 days. As previously reported, the lack of synchrony in seed germination in
Passiflora is frequent (Ulmer and Macdougal 2004), as well as in backcrosses using these species,
varying from 15 days to 60 days (Melo et al. 2016).
In breeding programs, interspecific hybridization has been a very important tool, since it has
sought to introduce genes that are of interest both for resistance to diseases and for improving
30
characters of ornamental interest (Santos 2008). Passiflora species involved in interspecific
hybridizations present characteristics of interest for ornamental purposes, and can be used as
breeders in breeding programs. These species present attractive flowers of intense color and of
varied size, continuous flowering and diversity in the foliage (Abreu et al. 2009). Therefore, several
hybrids have been produced and recorded for these purposes (Junqueira et al. 2008; Conceição et al.
2011a; Santos et al, 2011; Freitas et al. 2015; Ocampo et al. 2016). Nevertheless, there are factors
that can influence the attainment of F1 hybrids, such as genetic distance and chromosome number
(Yotoko et al. 2011). More distant species usually have different chromosome numbers and thus,
the cross between them can be difficult. This fact is reported in the present study for the cross
between P. subrotunda vs. P. sublanceolata, since there is a difference in the chromosome number
and in the taxonomic sections. The same was verified for other hybridizations involving P.
sublanceolata and P. cincinnata (Conceição et al. 2011a).
Confirmation of interspecific hybridization is necessary in plant breeding programs, since
even though the care for the procedure of the technique, such as the removal of the anther before the
open flower can not be ruled out, the possibility of self-pollination before this procedure can not be
ruled out. This may be justified by the fact that a self-compatible species, or even of
autoincompatibles species, but that present a small rate of self-compatibility, as is the case of P.
subrotunda (Souza 2014), when used as a female parent in a cross- fruits. However, not necessarily
the seeds are hybrid, because all seeds or part of them can come from self-pollination (Ocampo et
al. 2016).
Interspecific hybridizations in Passiflora have been confirmed using molecular markers
(Conceição et al. 2011b; Santos et al. 2012; Melo et al. 2016; Belo et al 2018;). We confirmed the
elimination of the self-fertilization hypothesis only for the cross between P. coccinea vs. P.
hatschbachii, and the heterozygous character of the hybrids for the SSR locus was shown by the
first SSR Pa07. For the other crosses (P. subrotunda vs. P. racemosa, P. subrotunda vs. P. elegans,
31
P. subrotunda vs. P. mucronata) we did not observe paternal alleles, confirming that the plants
from these crosses are not hybrids.
At the cross between P. gardneri vs. P. gibertii, the RAPD marker revealed informative
bands, and the first SSR Pe75 confirmed the occurrence of ten interspecific hybrids (Belo et al.
2018). Interspecific hybridization between P. sublanceolata and P. foetida var. foetide was
successful using both the RAPD and SSR marker (Santos et al. 2011). Using molecular markers, it
was possible to confirm among several crosses with Passiflora species, including P. setacea. P.
coccinea (Junqueira et al. 2008). These species were used in hybrids mainly due to their ornamental
value, besides presenting resistance to anthracnose in the fruits and branches and to the virus in the
leaves (Junqueira et al. 2005). In addition, SSR molecular markers enabled the confirmation of RC1
progeny (backcrossing) in plants within Passiflora progenies (Melo et al., 2016).
In this study, GISH proved to be an efficient technique in distinguishing the genomes of the
parents, confirming the hybrid status. This tool has been used for several species such as Brassica
(Yao at al. 2010), Cucumis (Chen et al. 2003), Citrus (Fu et al. 2004) and Passiflora in the
confirmation of interspecific hybrids (Melo et al. 2015, Silva et al. 2017 in press), such as in the
recombination study in backcrossed hybrids (Melo et al. 2017).
The proportion of the blocking DNA and the probe, and the post-hybridization stringency are
factors to be considered in the distinction between the genomic genomes using GISH (Schwarzcher
and Heslop-Harrison 2000), since they may hamper good results. The paternal genomic DNA was
used as probe to identify the hybrid character of the plants coming from the cross between P.
subrotunda vs. P. racemosa, and maternal genomic DNA used as blocking DNA 100x more
concentrated than the probe. The blocking DNA was used in this specific concentration because it
was already observed in other crosses involving Passiflora that the use of 100x blocking DNA was
more efficient in the distinction between the genomes of the parents (Melo et al. 2015; Silva et al.
2017 in press). It is worth mentioning that the function of the blocking DNA is to block the
32
repetitive DNA of the maternal genitor, causing the probe to mark the target genome (paternal
genitor DNA) and to differentiate the genomes.
The greater the distance between species the less the amount of replicate DNA shared. Thus,
genomes can be differentiated with low concentrations of blocking DNA (Tang et al. 2010). When
the species are very phylogenetically close, it is possible to use genomic probes of the parents
simultaneously, and it is necessary to adjust the technique for better results (Melo et al. 2015). The
concomitant use of the genomic probes of the parents P. coccinea and P. hatschbachii enabled the
distinction between the genomes of the genitors and the genome of the interspecific hybrids F1,
identifying the hybrid status of these plants. It was not possible to use the blocking DNA in the
identification of the cross-fertilization between P. coccinea and P. hatschbachii because they must
share many repetitive sequences as these species are phylogenetically closer, belonging to the same
subgenus and taxonomic section. In a cross involving two species of orchids, using probe and
blocking, there was no differentiation of the genomes of the parents in the artificial hybrid, because
the species are very phylogenetically close. Thus, it was necessary to use the probes of the parents
(Lee et al. 2011).
The ability to distinguish the genomes of the parent species in hybrids through GISH also
depends on the size of the chromosomes. In Brassica, the chromosomes are small with only the
pericentromeric regions showing predisposition for marking (Yao et al. 2010). In Citrus, the
chromosomes are small and morphologically indistinguishable and can limit the application of the
technique (Fu et al. 2004). On the other hand, the application of GISH in Passiflora species has not
been difficult, since the chromosomes present ideal size for application and efficiency of the
technique (Melo et al. 2015, 2017; Silva et al. 2017 in press), a fact also observed in this study.
The application of molecular markers and GISH confirmed interspecific hybridizations, and
self-fertilization, consisting of reliable tools to be used in plant breeding programs. The species P.
subrotunda used as maternal and paternal parent made possible the knowledge about the
33
reproduction mode of this species, being able to present self-incompatibility depending on the
species/hybridized genotype. In this way, a more detailed study on this phenomenon will be
important for a better strategy in Passiflora breeding programs when using this species in
interspecific hybridizations. Cross involving P. coccinea vs. P. hatschbachii are more promising to
be used in plant breeding programs for ornamental purposes, since from this crossing there were
fruit production with viable seeds, of which about 75% germinated and generated hybrid plants.
5 Authors' contributions
VOS performed the interspecific hybrids, taking and analyzes the data, analyze with
molecular markers, cytogenetic studies and writing the article. The MMS supervised the cytogenetic
studies, participated in the writing and revision of the final text. GSS contributed with cytogenetic
analyzes and molecular markers, besides participating in the final revision of the text.
6 Acknowledgement
The authors would like to thank UESC, CNPq (National Council for Scientific and
Technological Development) and FAPESB (Foundation for Support to Research of the State of
Bahia) for the financial support for research; CAPES (Coordination for Higher Level Personal
Improvement) for the scholarship granted to the first authors; CNPq for the scholarship awarded to
the second author; to Mauro Peixoto for providing certain images of the Passiflora species for
elaboration of Figure 1.
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41
Tables
Table 1 Passiflora species used in interspecific crosses. Classification according to Ulmer and MacDougal (2004) Subgenus Section Species Access Location Chromosome number (2n)
Passiflora
Granadillastrum P. cincinnata Mast. 504 - 2n = 18 (Heitz 1926, Bowden 1945, Beckett 1960)
Granadillastrum P. coccinea Aubl. 505 Pontes de Lacerda-MT 2n = 18 (Beal 1971, Mayeda 1997, Melo et al. 2001)
Granadillastrum P. elegans Mast. 491 EMBRAPA 2n = 18 (Melo et al. 2001)
Granadillastrum P. galbana Mast. 500 BAG/UESC 2n = 18 (Melo et al. 2001, Souza et al. 2003)
Granadillastrum P. hatschbachii Cervi 446
Leopoldina-MG/Instituto
Plantarum 2n = 18 (Melo et al. 2014)
Granadillastrum P. malacophyla Mast. 405 EMBRAPA Cerrado 2n = 18 (Souza et al. 2003)
Granadillastrum P. mucronata Lam. 509 Canavieiras-BA
2n = 18 (Guerra 1986, Melo et al. 2001, Souza et al.
2003)
Granadillastrum P. nitida Kunth 403
Serra Madureira/Instituto
Plantarum 2n = 18 (Passos 1999, Melo et al. 2001)
Calopathanthus P. racemosa Brot. 475 RJ 2n = 18 (Heitz 1926, Bowden 1945, Beckett 1960)
Calopathanthus P. serratodigitata L. 487 EMBRAPA Cerrado 2n = 18 (Soares-Scott et al. 1999)
Calopathanthus P. setacea DC. 506 - 2n = 18 (Soares-Scott et al. 1999)
Dysosmia P. sublanceolata
(Killip) J.M.
MacDougal
496 EMBRAPA Cerrado 2n = 22 (Santos, 2012)
Granadillastrum P. subrotunda Mast. 452 Fortaleza-CE/Instituto Plantarum 2n = 18 (Melo et al. 2014)
Granadillastrum P. trintae Sacco - Bahia 2n = 18 (Sousa 2014)
Granadillastrum P. vitifolia Kunth 481 Miranda-MG/Instituto Plantarum 2n = 18 (Storey 1950, Snow; McDougal 1993)
- Absence of location and access number.
42
Table 2 Sequence of 14 SSR primers used for the confirmation of the interspecific
hybridizations in Passiflora
Primers Oligonucleotide Sequence
Primer forward Primer reverse
Pe02 GGACGACAATCAAGTGAGG CCCAAACTATGCAACACCAA
Pe19 TTAACAGGACTTAGCACTTGA CTCATCCTTCTTCCATCTTTG
Pe27 TTGCTCATTGCACTCATCCT GCAGACATTTCCTGGAGCA
Pe28 GCCACTAACGTTAACTGTGCT CAAGCTCTTATTAGGCATCCA
Pe37 CAAAAGGATAGGCCTGATGTC TGCTTGGTCATCCACTGAAG
Pe42 GTCACTTCATTCTTCCTTTCC TTAGCCCACTCAAACACAA
Pe54 TGGTGTGTGTGGGTGATTAG CATTCTCCTGCCACCTGAGT
Pe59 GAACACTTCGCATGGCTAGA TTCCGAATCAAACCGTAACT
Pe64 ATCAATTACGCACCCCAAAC GGAACGTCAATCAAGTGAGGA
Pe75 CACAATCGGTGGGAAAGATA GTAGTTTTGGGCAGTTTGC
Pe90 TCAGGAAGATTGCATGTTAGT CTGGGTTTTGTTTATGTTGC
Pa02 AGAGTCGTCTAACCCTCTTGC TCTTGCTTACGCGTGGACTA
Pa04 GGGCGGAAGAAAAGAGAAG GAAACACACGATGCGAAAA
Pa07 CACATTTGCCGTCACTGG CGGCATACGATAAATCTCCTG
Pe: Passiflora edulis; Pa: Passiflora alata.
43
Table 3 Interspecific crosses in Passiflora species and characteristics evaluated in response to crosses
Crosses NC FF DRF NF F (%) χ2 F NS NSG GS G
(%) χ2 G DG DC DTL LP
CC
P. subrotunda vs. P. cincinnata 16 7 39 4 25 61.94 * 87 - - - - - - - - -
P. subrotunda vs. P. elegans 2 2 36 1 50 7.25 * 18 16 7 43.75 15.89 * 12 2 7 6 no
P. subrotunda vs. P. galbana 3 0 - - - - - - - - - - - - - -
P. subrotunda vs. P. malacophylla 22 0 - - - - - - - - - - - - - -
P. subrotunda vs. P. mucronata 33 7 37 5 15.15 97.23 * 112 20 9 45.00 13.89 * 15 1 4 6 no
P. subrotunda vs. P. nitida 4 0 - - - - - - - - - - - - - -
P. subrotunda vs. P. racemosa 64 19 28 16 25 61.94 * 234 85 27 31.74 41.92 * 20 1 4-5 23 no
P. subrotunda vs. P. serratodigitata 1 0 - - - - - - - - - - - - - -
P. subrotunda vs. P. setacea 4 0 - - - - - - - - - - - - - -
P. subrotunda vs. P. sublanceolata 3 0 - - - - - - - - - - - - - -
P. subrotunda vs. P. trintae 7 0 - - - - - - - - - - - - - -
P. subrotunda vs. P. vitifolia 107 2 - - - - - - - - - - - - - -
P. cincinnata vs. P. subrotunda 10 0 - - - - - - - - - - - - - -
P. elegans vs. P. subrotunda 10 4 88 4 40 22.69 * 92 - - - - - - - - -
P. malacophylla vs. P. subrotunda 39 35 113 35 89.73 30.73 * 143 143 92 64.33 0.07 ns 13-21 1-2 3-10 0 -
P. mucronata vs. P. subrotunda 10 2 - - - - - - - - - - - - - -
P. nitida vs. P. subrotunda 2 0 - - - - - - - - - - - - - -
P. racemosa vs. P. subrotunda 53 28 89 26 49.05 7.74 * 1954 756 126 16.66 92.12 * 19 1 4-6 0 -
P. serratodigitata vs. P. subrotunda 1 0 - - - - - - - - - - - - - -
P. setacea vs. P. subrotunda 1 0 - - - - - - - - - - - - - -
P. trintae vs. P. subrotunda 6 0 - - - - - - - - - - - - - -
P. vitifolia vs. P. subrotunda 130 22 58 18 13.84 105.62 * 1697 924 483 52.27 4.93 * 11 3 7-8 0 -
P. coccinea vs. P. hatschbachii 2 1 35 1 50 7.25 * 248 245 186 75.91 7.15 * 8 3 5 117 yes
*: Significance level P < 0.05; ns: not significant P > 0.05; set ≥ 63.2% (Aular et al. 2004); germination ≥ 83.2% (Ferreira et al. 2005). Number of crosses performed (NC), fertilized flowers (FF), days for fruit ripening
(DRF), number of fruits (NF), % fruiting (%F), number of seeds (NS) obtained from each cross, number of seeds to be germinated (NSG), number of germinated seeds (GS), germination (%G), number of days for
germination (DG), number of days for emergence of cotyledon (DC), number of days for emergence of true leaves (DTL), number of live plants (LP), confirmed crossing (CC).
44
Figures list
Fig. 1 Flowers of Passiflora species used in interspecific hybridizations: a) P. cincinnata; b) P.
coccinea; c) P. elegans; d) P. vitifolia; e) P. galbana; f) P. hatschbachii; g) P. malacophyla; h) P.
mucronata; i) P. nitida; j) P. racemosa; k) P. serratodigitata; l) P. setacea; m) P. sublanceolata; n)
P. subrotunda; o) P. trintae. Photos by Viviane de Oliveira Souza (a, b, d, f, g, h, j, k, l, m, n).
Powered by Mauro Peixoto, www.brazilplants.com (c, e, i and o).
45
Fig. 2 Interspecific crosses between Passiflora species: a) Germination of seedlings from the cross
between P. subrotunda vs. P. racemosa evidencing chlorosis; b) Germination of seedlings obtained
from the crossing of P. coccinea vs. P. hatschbachii, showing non-chlorotic leaves.
46
Fig. 3 Confirmation of interspecific hybridization in Passiflora by molecular markers and
molecular cytogenetics: a) Confirmation of the cross between P. coccinea vs. P. hatschbachii using
primer SSR Pa07 in six hybrids (samples representative of the confirmation). M: molecular weight
marker DNA Ladder (50pb); m: P. hatschbachii (male parent); f: P. coccinea (female parent).
DH25 135, DH25 136, DH25 25 138, DH25 139, DH25 140, HD25 141: interspecific hybrids; b)
Confirmation of uncrossed fertilization between P. subrotunda vs. P. racemosa using primer SSR
Pe90 in five plants. M: molecular weight marker DNA Ladder (100pb); f: P. subrotunda (female
parent); m: P. racemosa (male parent). c) Genomic in situ hybridization (GISH) in interspecific
hybrid mitotic metaphase HD25 244 obtained from the cross between P. coccinea vs. P.
hatschbachii using both probes from the parents. P. coccinea, probe marked with digoxigenin and
detected with anti-digoxigenin-rhodamine (red chromosomes) and P. hatschbachii, biotin-marked
probe detected with avidin-FITC (green chromosomes). d) Genomic in situ hybridization (GISH) in
mitotic metaphase evidencing that there was no cross-fertilization between P. subrotunda vs. P.
racemosa, using blocking DNA 100x more concentrated than the probe. Bar = 10 µm.
47
CAPÍTULO 2
Passiflora coccinea vs. Passiflora hatschbachii: NOVOS HÍBRIDOS
ORNAMENTAIS
RESUMO
Dois novos híbridos interespecíficos foram desenvolvidos para a ornamentação. Foi
realizada a descrição morfológica e citogenética dos híbridos F1 obtidos do cruzamento
entre Passiflora coccinea Aubl. vs. P. hatschbachii Cervi, bem como a confirmação da
hibridação interespecífica com base em marcadores moleculares microssatélites (SSR) e
através da Hibridação Genômica In Situ (GISH). Com base nos descritores
morfológicos florais e vegetativos, foi observada diferenças entre os híbridos em relação
à forma, tamanho e coloração. O bandamento da corona foi o descritor floral mais
relevante para a distinção dos híbridos em dois grupos que deram origem às cultivares
Passiflora ‘Vivis’ e Passiflora ‘Jhovi’, as quais serão registradas na Passiflora Society
International. Passiflora ‘Vivis’possui flores vermelhas, assim como suas pétalas e
sépalas, corona com a primeira série de filamentos (externo) de cor vermelho e branco,
de forma alternada (com bandamento na corona). Passiflora ‘Jhovi’ possui flores
vermelhas, bem como suas pétalas e sépalas, corona com os primeiros filamentos
(externo) de cor vermelho e branco (sem bandamento da corona). O primer SSR Pa07
possibilitou a visualização de dois alelos A (250pb) e B (260pb) na progênie híbrida F1,
as quais apresentaram-se heterozigotas, levando a confirmação da fecundação cruzada.
Foi utilizada a coloração convencional com Giemsa 4% para detecção do número
cromossômico, sendo verificado o número cromossômico diploide 2n = 18 nos
genitores e nos híbridos pertencentes aos grupos P. ‘Vivis’ e P. ‘Jhovi’. A partir da
GISH, foi possível a diferenciação genômica com a utilização simultânea das sondas
dos genitores na progênie híbrida F1. Tanto o marcador molecular SSR quanto a GISH
permitiram a confirmação do caracter híbrido das plantas, sendo duas ferramentas
moleculares confiáveis e seguras neste processo. Realizou-se a análise meiótica pela
técnica do esmagamento em carmim acético para estudo do comportamento meiótico
das plantas híbridas. O comportamento meiótico da progênie F1 foi regular, o que
sugere grande compatibilidade genética entre os genitores e possivelmente híbridos com
fertilidade. Considerando a beleza das flores de Passiflora, P. ‘Vivis’ e P. ‘Jhovi’ são
híbridos com potencial para o mercado ornamental, podendo compor jardins, sobre
pérgulas ou ser cultivados em vasos na decoração de diferentes ambientes.
Palavras-chave: Híbridos interespecíficos, P.‘Vivis’, P. ‘Jhovi’, SSR, GISH.
48
Passiflora coccinea vs. Passiflora hatschbachii: NEW ORNAMENTAL HYBRIDS
ABSTRACT
Two new interspecific hybrids were developed for ornamentation. The morphological
and cytogenetic description of hybrids F1 obtained from the cross between Passiflora
coccinea Aubl. vs. P. hatschbachii Cervi, as well as the confirmation of interspecific
hybridization based on microsatellite molecular markers (SSR) and through In Situ
Genomic Hybridization (GISH). Based on floral and vegetative morphological
descriptors, differences were observed among hybrids in relation to shape, size and
coloration. The corona banding was the most relevant floral descriptor for the
distinction of the hybrids in two groups that gave origin to the cultivars Passiflora
'Vivis' and Passiflora 'Jhovi', which will be registered in the Passiflora Society
International. Passiflora 'Vivis' has red flowers, as well as its petals and sepals, crown
with the first series of filaments (external) of color red and white, alternately (with
banding in the crown). Passiflora 'Jhovi' has red flowers, as well as its petals and sepals,
corona with the first filaments (external) of red and white color (without crown
banding). The primer SSR Pa07 allowed the visualization of two alleles A (250pb) and
B (260pb) in the hybrid F1 progeny, which were heterozygous, leading to confirmation
of cross-fertilization. The conventional staining with Giemsa 4% was used to detect the
chromosome number, and the diploid chromosome number 2n = 18 was verified in the
parents and in the hybrids belonging to the P. 'Vivis' and P. 'Jhovi' groups. From GISH,
genomic differentiation was possible with the simultaneous use of the probes of the
parents in the hybrid F1 progeny. Both the molecular marker SSR and GISH allowed the
confirmation of the hybrid character of the plants, being two molecular tools reliable
and reliable in this process. The meiotic analysis was performed by the crushing
technique in acetic carmine to study the meiotic behavior of the hybrid plants. The
meiotic behavior of the F1 progeny was regular, suggesting great genetic compatibility
between the parents and possibly hybrids with fertility. Considering the beauty of
Passiflora flowers, P. 'Vivis' and P. 'Jhovi' are hybrids with potential for the ornamental
market, being able to compose gardens, pergolas or can be grown in pots in the
decoration of different environments.
Keywords: Interspecific hybrids, P.'Vivis', P. 'Jhovi', SSR, GISH.
49
1 INTRODUÇÃO
O gênero Passiflora compreende espécies geralmente trepadeiras, com flores
hermafroditas e de coloração diversificada. Apresenta androginóforo e uma corona
composta de dois a três filamentos, com diferentes formas e cores, bem como variação
nas suas folhagens. A capacidade de produzir flores o ano inteiro e longo período de
abertura da flor, como são observados em algumas espécies (ULMER; MACDOUGAL
2004), fazem com que as passifloras sejam inseridas no mercado de plantas ornamentais
(VANDERPLANK, 2000).
Muitas espécies de Passiflora são utilizadas como plantas ornamentais, como P.
alata Dryand., P. cininnata Mast. e P. coccinea Aubl. No entanto, a produção de
híbridos tem se destacado e compondo uma parcela considerável no mercado de plantas
ornamentais na Europa e na América do Norte (ABREU et al., 2009). A produção de
híbridos por cruzamentos artificiais é um método considerado simples, principalmente
pelo fato de muitas espécies florescerem durante o ano todo e produzir flores
abundantes, além da compatibilidade entre as espécies. Nesse sentido o gênero
Passiflora tem sido foco de estudos para obtenção de híbridos com características
intermediarias a dos genitores, visando o melhoramento genético (ABREU et al., 2009).
Passiflora 'Violacea' T. Milne foi o primeiro híbrido obtido no século XIX. A
partir de então já foram produzidos e registrados vários híbridos (KING 2011). A
obtenção de híbridos artificiais no Brasil para ornamentação está crescendo, uma vez
que já foram registrados na Passiflora Society International diversos híbridos, como P.
‘Alva’ P. ‘Aninha’, P. ‘Priscilla’ (SANTOS, et al., 2012), P. ‘Gabriela’ e P. ‘Bella’
(BELO et al., 2018). Além dos híbridos obtidos do cruzamento entre P. gardneri vs. P.
alata, P. watsoniana vs. P. alata, P. watsoniana vs. P. gardneri e P. gardneri vs P.
gibertii (CONCEIÇÃO et al., 2011a) e híbridos retrocruzados produzidos a partir de
Passiflora sublanceolata vs. P. foetida (MELO et al., 2016).
A identificação de híbridos a partir de cruzamentos interespecíficos é um passo
essencial em programas de melhoramento genético, podendo ser realizada pela obtenção
de marcadores moleculares, bem como identificação genômica por meio de técnicas
citogenéticas. Os marcadores microssatélites (SSR - Simple Sequence Repeats)
demonstram potencial para detecar polimorfismo genético em progênies híbridas F1
(BELO et al., 2018; MCGREGOR et al., 2000; SANTOS et al., 2012). Embora esta
técnica necessite do conhecimento de sequências para a construção de primers
50
específicos, ela tem sido empregada de forma eficiente na confirmação da natureza
híbrida em progênies F1 e em híbridos retrocruzados de Passiflora, a partir da
transferibilidade de primers (BELO et al., 2018; MELO et al., 2016; SANTOS et al.,
2012). Além disso, os marcadores moleculares possibilitam a identificação da
paternidade de genótipos híbridos mesmo quando não se tem o conhecimento de um dos
genitores de um determinado cruzamento (BELO et al., 2018).
A citogenética molecular também é uma ferramenta bastante útil para a
confirmação da fecundação cruzada. A Hibridização Genômica In Situ (GISH), tem sido
amplamente utilizada para esta finalidade em diversos híbridos (SILVA; SOUZA,
2013). A GISH envolve o uso do DNA genômico total de uma espécie genitora como
sonda e o DNA genômico total da outra espécie genitora como DNA de bloqueio.
Alternativamente pode-se utilizar o DNA genômico total de ambos os genitores como
sondas (STACE; BAILEY, 1999), sendo ambas as formas eficientes na diferenciação
dos genomas dos genitores no germoplasma híbrido (SILVA; SOUZA, 2013).
A citogenética convencional, com base em análises cariotípicas e no
comportamento meiótico possibilita informações a cerca da confirmação do sucesso da
hibridação, através do número cromossômico e da fertilidade da planta,
respectivamente. No caso de espécies diplóides com diferenças no número de
cromossomos tendem a serem mais divergentes e com isso as chances de obter híbridos
interespecíficos são mais dificultados (LEVIN, 2002). Cruzamentos interespecíficos
envolvendo a espécie P. sublanceolata (2n = 22) e P. cincinnata (2n = 18) não foi bem
sucedido, possivelmente devido à diferença do número cromossômico (CONCEIÇÃO
et al., 2011b). Em híbridos só haverá fertilidade quando o mesmo apresentar meiose
regular e como resultado a formação de gametas viáveis (LAVINSCKY, et al., 2017).
Sendo assim, as analises meióticas fornecem informações a cerca de eventos
importantes que podem indicar homologia entre as espécies, como o pareamento correto
entre os cromossomos, a recombinação meiótica, as irregularidades e a viabilidade dos
gametas (SOUZA et al., 2003).
O objetivo deste trabalho foi realizar a descrição morfológica e citogenética dos
híbridos F1, P. ‘Vivis’ e P. ‘Jhovi’, obtidos do cruzamento entre Passiflora coccinea
Aubl. vs. P. hatschbachii Cervi, bem como confirmar a hibridação interespecífica com
base em marcadores SSR e através da GISH.
51
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Material vegetal e cruzamentos interespecíficos
As espécies Passiflora coccinea (Figura 1A e 1B) e P. hatschbachii (Figura 1C e
1D) foram utilizadas como genitores feminino e masculino, respectivamente, as quais
foram mantidas no Banco Ativo de Germoplasma (BAG-Passifloras) da Universidade
Estadual de Santa Cruz (UESC), Ilhéus, Bahia, Brasil (long 39 10‟W, lat 14 39‟ – S, alt
78m). Foram selecionadas estas espécies para produção de híbridos ornamentais, pois
possuem características que são apreciadas para a ornamentação. Passiflora
hatschbachii apresenta flores de coloração branca e antese noturna (aberturada flor por
volta das 2h00 da manhã). Passiflora coccinea produz flores ao longo do ano, flores de
coloração marcante e atrativa (vermelha) ao mercado ornamental e antese diurna. Em
adição, esta espécie apresenta resistência à virose nas folhas e antracnose nos frutos e
ramos (JUNQUEIRA et al., 2005). Sendo assim, deseja-se obter um híbrido com
potencial ornamental, cujo florescimento ocorra o ano inteiro, com flores que
permaneçam abertas por longo período de tempo e que apresente coloração intensa.
Os cruzamentos interespecíficos foram realizados nas primeiras horas da manhã.
No dia anterior os botões florais em pré-antese foram protegidos com sacos de papel
para não haver contaminação com polén exógeno. Posteriormente, com auxilio de uma
pinça, os grãos de pólen de P. hatschbachii foram depositados com cuidado sobre a
papila estigmática de P. coccinea, a qual já havia sido emasculada. As flores polinizadas
foram identificadas com etiquetas e logo protegidas com sacos de papel por cinco dias.
Após esse período, foi verificado se houve ou não abortamento do botão floral. Foi
realizada a proteção dos frutos produzidos dos cruzamentos contra queda até o seu
amadurecimento (BRUCKNER; OTONI 1999). Após o amadurecimento dos frutos, as
sementes foram retiradas, secas à temperatura ambiente, armazenadas em sacos de papel
e conservadas a 10°C.
2.2 Germinação das sementes e condições de cultivo
Os arilos das sementes foram retirados e a semeadura foi realizada em bandejas de
isopor contendo o substrato terra vegetal e mantidas em casa de vegetação. O número de
sementes colocadas para germinar correspondeu à quantidade de sementes oriundas do
52
fruto. Após o surgimento das folhas verdadeiras, as plântulas foram transferidas para
sacos de polietileno preto, com capacidade de 0.5 L. Depois de aproximadamente 3
meses, as plantas matrizes foram transferidas para vasos de 45 L contendo solo.
Os genitores e os genótipos híbridos foram propagados por estaquia através das
plantas matrizes, as quais foram retiradas da parte intermediária dos ramos, preparadas e
padronizadas com dois nós e duas folhas reduzidas à metade de sua área, secionadas em
bisel e imersas em auxina sintética (ácido indol-3 butírico – AIB). As estacas foram
colocadas em sacos preto de polietileno, com capacidade de 1,5 L, contendo areia
lavada para enraizamento, as quais foram irrigadas diariamente durante esse período.
Quando as plantas atingiram aproximadamente 1m de altura, foi realizado o
transplantio para vasos com capacidade de 25 L contendo solo, e transferidas para a área
experimental, em delineamento em blocos casualizados. As plantas híbridas foram
conduzidas em sistema de espaldeira vertical, com mourões de 2,5 m de altura e fio de
arame 1,8 m do solo. Utilizou-se o espaçamento de um metro entre plantas e dois
metros entre fileiras. Foi realizada poda mensalmente e a adubação a cada 15 dias, de
acordo com a análise do solo: 38,33 mg de fosfato Monoamónico (MAP) purificado,
45,18 mg de ureia e 55,6 mg de sulfato de manganês, durante 6 meses e após esse
período utilizou-se 38,33 mg de MAP purificado, 41,38 mg de cloreto de potássio,
99,53 mg de ureia e 111,1 mg de sulfato de manganês.
2.3 Descrição morfológica dos híbridos
A descrição morfofógica foi realizada com base em características incluídas nos
descritores oficiais de Passiflora ornamental (MAPA, 2008) e alguns com base no
manual prático da EMBRAPA (JESUS et al., 2015). As características morfológicas
avaliadas foram as seguintes: diâmetro da flor (DF), diâmetro da corona (DCO), largura
da pétala (LPE), comprimento da pétala (CPE), cor da pétala (CorP), largura da sépala
(LSE), comprimento da sépala (CSE), cor da sépala (CorS), largura da bráctea (LBR),
comprimento da bráctea (CBR), tamanho dos primeiros filamentos da corona (TF1), cor
dos TF1 (CorTF1), tamanho dos segundos filamentos da corona (TF2), cor dos TF2
(CorTF2), comprimento do pedúnculo floral (CPED), comprimento do androginóforo
(CA), cor da antera (CorA), cor do estame (CorE), cor do grão de pólen (CorGP), cor do
estilete (CorE), cor do estigma (CorEs), comprimento de folha (CF), largura de folha
(LF), área foliar (AF), divisão da lâmina foliar (DLF), consistência do limbo foliar
53
(CLB), forma do caule (FD), diâmetro do caule (DC), comprimento do entrenó do ramo
principal (CEN); profundidade do limbo foliar (PFL): 1) profunda, 2) média, 3) ausente;
antocianina no filete (AF): 1) forte, 2) média, 3) fraca, 4) ausente; antocianina no estilo
(AE): 1) forte, 2) média, 3) fraca; bandamento na corona (BAND): 1) presente, 2)
ausente.
A caracterização morfológica relacionada à coloração das folhas foi baseada na
carta de cores de Munsell para tecidos vegetais (MUNSELL, 1977), sendo a coloração
nomeada de acordo com códigos de letra e números.
2.4 Confirmação da hibridação via marcador molecular
O procedimento para extração de DNA e a transferibilidade de primers, para a
obtenção de marcadores moleculares SSR foi realizado da mesma forma como descrito
no capítulo 1. No entanto, a presença de polimorfismo foi verificada em gel
desnaturante de poliacrilamida a 6% seguindo o protocolo proposto por Crestes (2001).
A identificação de alelos diferentes nas espécies genitoras, que segregaram nas plantas
híbridas evidencia a ocorrência da fecundação cruzada. O software GelAnalyzer 2010
(versão 2010a) foi usado para calcular o tamanho das bandas informativas.
2.5 Análises citogenéticas e viabilidade do pólen
2.5.1 Citogenética convencional
A obtenção dos cromossomos metafásicos foi realizada para identificação do
número cromossômico das espécies genitoras e híbridos. Foram coletadas radículas a
partir de estacas, as quais foram pré-tratadas em 0,002 M 8-hidroxiquinolina (8HQ) por
uma hora a temperatura ambiente (TA) e posteriormente a 8°C por 23 horas. Após este
período, as raízes foram lavadas e fixadas em Carnoy (etanol-ácido acético glacial [3:1,
v/v]) (JOHANSEN, 1940) por 24 horas a temperatura ambiente (TA) e estocadas a -20
ºC até a preparação das lâminas. O protocolo proposto por Guerra (2002) foi usado para
o preparo das lâminas. As raízes foram lavadas, e digeridas na enzima celulase 2% e
pectinase 20% (w/v) a 37 °C por uma hora e 20 minutos. Logo após as radículas foram
lavadas e a região meristemática foi macerada em uma lâmina contendo ácido acético
45% e depositada uma lamínula. As lâminas foram colocadas em nitrogênio líquido
54
para a remoção da lamínula e adesão do material citológico na lâmina. As lâminas
foram observadas em microscópio optico e as que apresentaram boas preparações
citológicas foram armazenas a -20°C para posterior análise citogenética. A coloração
convencional foi realizada de acordo com o protocolo proposto por Guerra (2002) com
modificações, sendo utilizado Giemsa a 4% (Merck®) por cerca de 20 minutos. Após a
coloração as lâminas foram lavadas, secas ao ar e montadas com meio Neomount®
(Merck®).
Para a análise de comportamento meiótico foram realizadas coletas de botões
florais em diferentes estágios de desenvolvimento das plantas híbridas no período da
manhã. Os botões foram fixados em Carnoy, (3:1, v/v, de etanol e ácido acético) em
temperatura ambiente (JOHANSEN, 1940). A troca do fixador foi realizada após meia
hora e após três horas, os quais foram estocados e mantidos a -20 °C até o momento das
análises. Foram preparadas lâminas temporárias pela técnica de esmagamento e
coloração. Primeiramente, uma gota do ácido acético 60% foi depositada sob a antera
por 7 minutos, sendo o excesso retirado com papel de filtro. O material foi corado com
carmim acético 2% (Fluka, 22000), logo realizou-se o esmagamento e em seguida as
lâminas foram cobertas com lamínulas 20x20 mm (SOUZA; PEREIRA, 2011). As fases
meióticas foram observadas em microscópio óptico Olympus CX41.
A fotodocumentação foi feita com a utilização do microscópio de Olympus
BX41 equipado com câmera digital de 5M Olympus DP25 pelo software DP2-BSW.
2.5.2 Extração do DNA, preparo da sonda para GISH e aplicação da GISH
A extração do DNA genômico dos genitores, o preparo das sondas e a aplicação
da técnica de GISH segui o mesmo procedimento para o capítulo 1. Porém, vale
ressaltar que foi utilizado o DNA de ambos os genomas dos genitores no mix de
hibridação.
2.5.3. Viabilidade do pólen
Foram coletadas flores abertas no período da manhã e retirada uma antera para
aplicação do teste de viabilidade polínica. Os grãos de pólen (GP) foram depositados
cuidadosamente sobre uma gota da solução Alexander (ALEXANDER, 1969), a qual é
baseada em tripla coloração: laranja G (intensificador), fucsina básica (cora o
55
citoplasma de vermelho) e verde malaquita (cora de verde a parede do grão de pólen).
Este corante possibilita a reatividade da parede/citoplasma, sendo considerados viáveis
os GP corados e com citoplasma íntegro.
3. RESULTADOS
3.1 Cruzamentos interespecíficos e descrição morfológica dos híbridos
O cruzamento entre os genitores Passiflora coccinea vs. P. hatschbachii resultou
em apenas um fruto com 248 sementes, sendo 75.91% viáveis. Com base nos
descritores morfológicos florais e vegetativos, foram observadas diferenças entre os
híbridos em relação à forma, tamanho e coloração. O bandamento da corona foi o
descritor floral mais relevante para a distinção dos híbridos em dois grupos que deram
origem os híbridos Passiflora ‘Vivis’ (Figura 1 E, F) e Passiflora ‘Jhovi’ (Figura 1 G,
H), as quais serão registradas na Passiflora Society International
(www.passiflorasociety.org).
Passiflora ‘Vivis’ - as plantas pertencentes a este grupo apresentam as seguintes
características: caule cilíndrico de 1.10-2.22 cm de diâmetro; entrenó 2.50-5.50 cm de
comprimento; folha partida, trilobadas, membranácea, com 8.42-12.83 cm de
comprimento e 6.43-11.12 cm de largura, cor verde variando a tonalidade entre verde
escuro e claro (6/8 7.5GY – 3/4 7.5GY); pendúnculo de 5.55-12.90 cm de comprimento;
flores de coloração vermelha, com 8.80-10.40 cm de diâmetro; pétalas vermelhas de
3.79-4.66 cm de comprimento e 0.90-1.16 cm de largura; sépalas vermelhas de 4.02-
4.60 cm de comprimento e 0.95-1.22 cm de largura; corona com os primeiro filamentos
(externo) de coloração vermelha e branca em faixas alternada (bandamento na corona)
de 2.40-3.20 cm de comprimento; segundo filamentos (interno) de cor branco de 0.43-
0.65 cm de comprimento; anteras de coloração verde-claro; estames verde-claro; pólen
amarelo escuro; estilete verde-claro com pontuações vermelhas, com variações na
intensidade da coloração; estigma verde-claro. Apresenta florescimento contínuo com
maior produção de flores nos meses de outubro a dezembro.
Passiflora ‘Jhovi’ - as plantas pertencentes a este grupo apresentam as seguintes
características: caule cilíndrico de 0.81-1.97 cm de diâmetro; entrenó 2.67-5.50 cm de
comprimento; folha partida, trilobadas, membranácea, com 8.90-12.32 cm de
comprimento e 6.67-11.42 cm de largura, cor verde variando a tonalidade entre verde
56
escuro e claro (6/8 7.5GY – 3/4 7.5GY); pendúnculo de 5.85-12.58 cm de comprimento;
flores de coloração vermelha, com 8.67-10.90 cm de diâmetro; pétalas vermelhas de
3.73-4.92 cm de comprimento e 0.90-1.19 cm de largura; sépalas vermelhas de 3.70-
4.73 cm de comprimento e 0.95-1.53 cm de largura; corona com os primeiros
filamentos (externo) de cor vermelho e branco (sem bandamento na corona) de 2.47-
3.00 cm de comprimento; segundo filamentos (interno) de cor branco de 0.45-1.11 cm
de comprimento; anteras de coloração verde-claro; estames verde-claro; pólen amarelo
escuro; estilete verde-claro com pontuações vermelhas, com variações na intensidade da
coloração; estigma verde-claro. Apresenta florescimento contínuo com maior produção
de flores nos meses de outubro a dezembro.
57
Figura 1. Genitores e híbridos F1 obtidos do cruzamento entre Passiflora: (A, B)
Passiflora coccinea; (C, D) P. hatschbachii; (E, F) P. ‘Vivis’; (G, H) P. ‘Jhovi’.
3.2 Confirmação da hibridação via marcador molecular
O par de primer SSR Pa 07 desenvolvido para P. alata possibilitou a visualização
de dois alelos A (250pb) e B (260pb), levando a confirmação da fecundação cruzada
(Figura 2). Os genitores P. coccinea e P. hatschbachii, apresentaram-se homozigotos
AA e BB, respectivamente. Enquanto que a progênie híbrida F1 apresentou-se
58
heterozigotos (AB), com a presença de bandas de 250 e 260pb, o que corresponde ao
tamanho das bandas dos geniotes feminino e masculino, respectivamente (Figura 2).
Figura 2. Confirmação da hibridação entre Passiflora coccinea vs. P. hatschbachii
através do primer SSR Pa07. M: marcador molecular de 50 pb; f: P. coccinea (genitor
feminino); m: P. hatschbachii (genitor masculino); 1: P. ‘Vivis e 2: P. ‘Jhovi’.
3.3 Análise citogenética meiótica e viabilidade do pólen
3.3.1 Citogenética convencional
Foi utilizada a coloração convencional com Giemsa 4% para observação do
número cromossômico, sendo verificado o número cromossômico 2n = 18 nos genitores
(Figura 3 A, B) e nos híbridos pertencentes aos grupos P. ‘Vivis’ e P. ‘Jhovi’ (Figura 3
C, D).
59
Figura 3. Metáfases mitóticas de genitores e híbridos interespecíficos F1 de Passilora
(2n = 18). (A) Passiflora coccinea; (B) P. hatschbachii; (C) P. ‘Vivis e (D) P. ‘Jhovi’.
Barra 10µm.
A meiose mostrou-se regular nos híbridos analisados dos grupos P. ‘Vivis’ e P.
‘Jhovi’ (Figura 4). Nas metáfases I e II os cromossomos encontravam-se dispostos na
placa equatorial (Figura 4B e F). Observou-se segregação regular em anáfase I e II
(Figura 4C e G). A constituição de quatro núcleos haploides na telófase II,
respectivamente (Figura 4D e H). Consequentemente, como houve meiose regular, foi
observado na grande maioria das células tétrades, produto pós-meiótico normal (Figura
4 I).
A viabilidade do pólen, utilizando a solução de Alexander, demonstrou grãos de
pólen viáveis na progênie híbrida F1 (Figura 4J), acima de 75%.
60
Figura 4. Comportamento meiótico regular em híbridos interespecíficos F1 obtidos do
cruzamento entre Passilora coccinea vs. P. hatschbachii (2n = 18) corados com carmim
acético 2%. (A-D) Meiose I: (A) Paquíteno; (B) Metáfase I; (C) Final de anáfase I; (D)
Telófase I. (E-H) Meiose II: (E) Prófase II; (F) Metáfase II; (G) Início da anáfase II; (H)
Telófase II. (I) Produto pós-meiótico regular (Tétrade). (J) Grão de pólen viável, corado
com a solução de Alexander. Barra 10µm
3.3.2 Hibridação Genomica In Situ (GISH)
Foi realizada a GISH nos híbridos HD25-101 e HD25-244, pertencentes aos
gupos P. ‘Vivis’ e P. ‘Jhovi’, respectivamente, para identificação dos genomas dos
genitores na progênie híbrida F1. Foi possível a diferenciação genômica com a
utilização simultânea das sondas de ambos os genitores (Figura 4). Observaram-se nove
cromossomos com sinais de hibridação, de coloração vermelha correspondente ao
genoma de P. coccinea e os nove cromossomos hibridados correspondentes ao genoma
de P. hatschbachii, de coloração verde (Figura 4).
61
Figura 5. Hibridação Genômica In Situ (GISH) em metáfases mitóticas em híbridos
interespecíficos de Passilora (2n = 18). (A) Passiflora ‘Vivis; (B) P. ‘Jhovi’. Barra
10µm.
4 DISCUSSÃO
Através de cruzamentos artificiais foram desenvolvidos novos híbridos
interespecíficos de Passiflora: P. ‘Vivis’ e P. ‘Jhovi’, os quais apresentam
características relevantes para serem utilizados no mercado ornamental. Flor de
coloração vermelha intensa; flores com maior período de abertura, aproximadamente
14h de duração; floração contínua, com maior florescimento entre os meses de outubro
a dezembro e a presença ou não de bandamento na corona, característica
particularmente importante a qual possibilitou a classificação da progênie híbrida em
dois grupos.
As espécies envolvidas no cruzamento interespecífico, P. coccinea e P.
hatschbachii, pertencem ao mesmo subgênero Passiflora e secção taxonômica
Granadillastrum. Portanto, elas são próximas a nível infragenérico, e consequentemente
apresenta o mesmo número cromossômico, fato que contribuiu para o sucesso da
hibridação. Desta forma, as barreiras de incompatibilidade entre espécies de Passiflora
não são consistentes fazendo com que sejam obtidos híbridos interespecíficos
(MELLETI, 2005). No estudo realizado com espécies comerciais e silvestres de
Passiflora foi verificada alta compatibilidade de algumas combinações híbridas sendo
promissoras para programas de melhoramento (OCAMPO et al., 2016).
62
O seguimento normal da meiose possibilita que gametas sejam viáveis resultando
em células pós-meióticas normais e, portanto, na fertilidade da planta (PAGLIARINI,
2000). Desta forma, o estudo detalhado do comportamento meiótico pelo conhecimento
do pareamento cromossômico, irregularidades meióticas e vibilidade dos gametas,
auxilia em programas de melhoramento de plantas quando se deseja realizar hibridações
inter e intraespecíficas (KIIHL et al., 2011; SOUZA et al., 2003).
O pareamento cromossômico é um dos eventos mais importantes da meiose, não
apenas pelo fato da recombinação, mas também para a segregação cromossômica
correta (FACHINETTO; TEDESCO, 2009), onde os cromossomos permanecem unidos
pelos quiasmas (pontos de recombinação) até o momento da anáfase I. Por outro lado,
um erro no pareamento dos cromossomos, pode levar a segregação irregular, com
desequilíbrio no número cromossômico e consequentemente resultará em gametas
desbalanceados com redução no número de gametas viáveis ou com a formação de
plantas aneuploides (SOUZA et al., 2003).
O conhecimento do pareamento cromossômico permite selecionar espécies que
são próximas geneticamente podendo auxiliar em cruzamentos interespecíficos
(TECHIO; DAVIDE, 2007). No caso de híbridos interespecíficos F1, durante a meiose
há a possibilidade de não haver pareamento entre os genomas, já que no núcleo da
célula possui genomas diferentes (genitor feminino e masculino), influenciando na
fertilidade do híbrido (BELO et al., 2018). Embora não tenha sido observado
pareamento dos cromossomos durante a diacinese, com base na anáfase I e II, onde
houve segregação dos cromossomos para os pólos da célula de forma normal e
observação de quatro núcleos haploides na telófase II, pode-se inferir que a meiose nos
híbridos é regular, uma vez que, foi verificado na maioria das células produtos pós-
meiótico regulares (tétrades) e como resultado grãos de pólen viáveis.
Em híbridos interespecíficos F1 obtidos do cruzamento entre Passiflora
sublanceolata (Killip) J. M. MacDougal vs. P. foetida var. foetida L. foi observado
comportamento meiótico regular, sendo que mais de 90% das células foram observados
bivalentes em diplóteno e diacinese e mais de 87% das células em anáfase I e II
apresentaram segregação normal (SANTOS et al., 2012). Os híbridos P. ‘Gabriela’ e P.
‘Bella’, obtidas do cruzamento entre P. gibertii N. E. Brown e P. gardineri Mast.,
também apresentaram meiose regular, com segregação normal em anafase I e II e
formação de quatro núcleos haploides na telófase II (BELO et al., 2018).
63
Por meio de cruzamentos interespecíficos já foram obtidos diversos híbridos
promissores para programas de melhoramento genético. As combinações entre espécies
P. caerulea, P. coccinea, P.galbana, P. glandulosa, P. mucronata, P. setacea com P.
alata e com P. edulis resultaram em híbridos com grande potencial (FALEIRO et al.,
2008). Os híbridos BRS Estrela-do-Cerrado (P. coccinea x P. setacea; FALEIRO et al.,
2007a), BRS Roseflora ([P. coccinea x P. setacea] x P. setacea; JUNQUEIRA et al.,
2007), BRS Rubiflora ([P. coccinea x P. setacea] x P. coccinea; FALEIRO et al.,
2007b), P. 'Alva', P. 'Priscilla' e P. 'Aninha' (SANTOS et al., 2012), P. ‘Gabriel’a e P.
‘Bella’ (BELO et al., 2018) foram produzidos no Brasil com finalidade ornamental. Tais
híbridos apresentam características interessantes e podem ser utilizados no mercado de
plantas ornamentais.
O marcador molecular SSR é uma ferramenta bastante utilizada em programas de
melhoramento de plantas quando se deseja confirmar hibridações. Este tipo de marcador
pode ser feito no estagio inicial da planta (FALEIRO et al., 2008), com base em bandas
informativas, excluído a hipótese da autofecundação (BELO et al., 2018). No presente
estudo, as bandas de 250pb e 260pb verificadas nos genitores P. coccinea e P.
hatschbachii, respectivamente, e sua segregação na progênie híbrida F1 possibilita a
confirmação da fecundação cruzada.
Geralmente, a amplificação de apenas um par de primers que revelem
polimorfismo já é suficiente para confirmar cruzamentos (FALEIRO et al., 2003). Isto
pode ser observado em híbridos interespecíficos de Passiflora com finalidade
ornamental, obtidos do cruzamento entre P. sublanceolata vs. P. foetida (SANTOS et
al., 2012) e P. gardneri vs. P. gibertii (BELO et al., 2018), os quais utilizaram o
marcador SSR e RAPD. Utilizando o marcador RAPD também foi possível a
confirmação de outros cruzamentos interespecíficos de Passiflora ornamental
(CONCEIÇÃO et al., 2011), assim como para a confirmação da paternidade em
híbridos interespecíficos de Passiflora visando resistência a doenças (JUNQUEIRA et
al., 2008). O uso de marcadores ISSR também tem sido utilizado na confirmação de
paternidade tanto em híbridos interespecíficos (COELHO et al., 2016) quanto em
híbridos retrocruzados de Passiflora (MELO et al., 2016), sendo este um marcador
eficiente neste processo.
A citogenética molecular baseada na GISH tem sido uma ferramenta bastante
eficiente na confirmação da hibridação cruzada (SILVA e SOUZA 2013). Sendo assim,
utilizou-se a GISH para identificação dos genomas dos genitores na progênie híbrida F1.
64
Verificou-se o status híbrido destes indivíduos com base na visualização de nove
cromossomos de P. coccinea detectados de vermelho (anti-digoxigenina-rodamina) e
nove cromossomos de P. hatschbachii detectados de verde (avidina-FITC) no genoma
das plantas híbridas.
Embora a aplicação da GISH tenha sido recentemente aplicada no estudo e
identificação de híbridos interespecíficos de Passiflora, os trabalhos envolvendo estas
espécies evidenciam que esta técnica tem sido bastante eficiente e segura (SILVA;
SOUZA 2013; MELO et al., 2016). No cruzamento entre P. gardneri vs. P. gibertii, a
GISH permitiu a diferenciação do conjunto de cromossomos dos genitores no genoma
das plantas híbridas, confirmando o caráter híbrido em todas as plantas desta progênie
(SILVA et al., 2017 in press). Em espécies de Passiflora com potencial ornamental, a
GISH confirmou a natureza híbrida nas plantas retrocruzadas, além de permitir
visualizar recombinação na maior parte do germoplasma RC1 (MELO et al., 2016). A
GISH também tem sido uma ferramenta útil para identificação de híbridos
interespecíficos de P. edulis vs. P. cincinnata, confirmando a origem genética do
híbrido produzido (COELHO et al., 2016).
5 CONCLUSÕES
Considerando a beleza das flores de Passiflora ‘Vivis’ e P. ‘Jhovi’ produzidos a
partir do cruzamento entre P. coccinea vs. P. hatschbachii, esses híbridos possuem
potencial para o mercado ornamental, podendo compor jardins, sobre pérgulas ou serem
cultivados em vasos na decoração de diferentes ambientes.
Sendo a meiose um evento que está relacionado à fertilidade da planta, neste
estudo, o comportamento meiótico da progênie F1 é regular, o que aponta
compatibilidade genética entre os genitores e possivelmente híbridos férteis.
O marcador molecular SSR Pa07 e a GISH confirmaram a natureza híbrida das
plantas, sendo duas ferramentas moleculares confiáveis e seguras no processo de
identificação de híbridos interespecíficos de Passiflora, caracterizando-se como
ferramentas importante em programas de melhoramento genético.
65
6 AGRADECIMENTOS
Agradecemos à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) pela concessão da bolsa e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) e à Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC) pelo
apoio financeiro à pesquisa. À professora Dra. Ioná Santos Araújo, professora Dra.
Simone Alves, ao doutorando Helison e pela disponibilidade em nos auxiliar nas
análises de eletroforese com gel de poliacrilamida. Ao doutorando em Produção Vegetal
Joedson Pinto Barroso e aos mestrandos em Produção Vegetal e Genética, Aline Pinto e
Jonathan Morales, respectivamente pelo auxílio nas avaliações morfológicas das
plantas.
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70
CAPÍTULO 3
ESTIMATIVA DE PARÂMETROS GENÉTICOS EM HÍBRIDOS
INTERESPECÍFICOS F1 de Passiflora L. (P. coccinea vs. P. hatschbachii) PARA
ORNAMENTAÇÃO
RESUMO
A estimativa dos parâmetros genéticos em populações baseando-se em caracteres
fenotípicos são importantes para inferir sobre a variabilidade genética e o valor de
expressão fenotípica e seu potencial de melhoramento de espécies de Passiflora. O
objetivo deste estudo foi caracterizar genitores e híbridos F1 obtidos do cruzamento
entre Passiflora coccinea Aubl. (♀) vs. Passiflora hatschbachii Cervi (♂), com base em
descritores morfológicos, bem como estimar parâmetros genéticos da progênie híbrida
visando o uso ornamental. Em adição, foi realizado a confirmação da fecundação
cruzada utilizando marcadores microssatélites (SSR). A estimativa dos parâmetros
genéticos foi realizada nos genitores e em 117 híbridos F1 no primeiro período de
avaliação e 107 híbridos F1 no segundo período, com base em características
quantitativas florais e vegetativas. O marcador molecular microssatélite permitiu a
confirmação do status híbrido F1, utilizando apenas um par de primer Pa07. Observou-
se variabilidade para o formato e tamanho dos descritores morfológicos na população
híbrida. O agrupamento de Scott-Knott mostrou que a maioria das características dos
genótipos apresentaram valores médios intermediários aos dos genitores, no entanto,
alguns híbridos apresentaram valores superiores aos genitores para o tamanho dos
primeiros filamentos da corona, largura de bráctea e diâmetro da corona, evidenciando
heterobeltiose. De modo geral, as características florais apresentaram maiores valores de
herdabilidade que as características vegetativas. A variabilidade genética identificada
nas progênies, estimada com base em características morfológicas e parâmetros
genéticos, evidencia o potencial destes genótipos para serem utilizados na
ornamentação. Os maiores valores de herdabilidade para as caracerísticas florais
diâmetro da flor, largura de pétala, comprimento e largura de sépala e tamanho da
primeira série da corona possibilita a obtenção de ganhos e a seleção genótipos para uso
ornamental.
Palavras-chave: Caracterização morfológica, cruzamentos interespecíficos,
variabilidade genética, melhoramento de plantas ornamentais.
71
GENETIC PARAMETERS ESTIMATION IN INTERPROTECTED HYBRIDS
F1 by Passiflora L. (P. coccinea vs. P. hatschbachii) FOR ORNAMENTATION
ABSTRACT
The estimation of genetic parameters in populations based on phenotypic characters is
important to infer about the genetic variability and the value of phenotypic expression
and its potential for improvement of Passiflora species. The objective of this study was
to characterize F1 parents and hybrids obtained from the cross between Passiflora
coccinea Aubl. (♀) vs. Passiflora hatschbachii Cervi (♂), based on morphological
descriptors, as well as to estimate genetic parameters of the hybrid progeny aiming the
improvement for the ornamental use. In addition, cross-fertilization was confirmed
using microsatellite markers (SSR). The genetic parameters were estimated in the
parents and in 117 hybrids F1 in the first evaluation period and 107 hybrids F1 in the
second period, based on quantitative floristic and vegetative characteristics. The
microsatellite molecular marker allowed the confirmation of hybrid F1 status using only
a pair of first Pa07. Variability was observed for the shape and size of the
morphological descriptors in the hybrid population. Scott-Knott's group showed that
most of the characteristics of the genotypes presented average values intermediate to
those of the parents, however, some hybrids presented values superior to the parents for
the size of the first corona filaments, bract width and corona diameter, evidencing
heterobeltiois. In general, the floral characteristics showed higher values of heritability
than the vegetative characteristics. The genetic variability identified in the progenies,
estimated on the basis of morphological characteristics and genetic parameters, shows
the potential of these genotypes to be used in ornamentation. The highest values of
heritability for the floral characteristics flower diameter, petal width, length and width
of sepal and size of the first crown series makes it possible to obtain gains and to select
genotypes for ornamental use.
Keywords: Morphological characterization, interspecific crosses, genetic variability,
ornamental plant breeding.
72
1 INTRODUÇÃO
A família Passifloraceae apresenta ampla distribuição geográfica em regiões
tropicais e subtropicais, encontrada nas Américas, África e Ásia (ULMER;
MACDOUGAL, 2004), sendo o Brasil um importante centro de diversidade com o
registro de quatro gêneros: Ancistrothrysus Harms, Mitostemma Mast., Dilkea Mast. e
Passiflora L. (BERNACCI et al., 2013a). O gênero Passiflora é considerado o mais
representativo em número e diversidade de espécies (BERNACCI et al., 2013b) com
recurso genético aplicável a diversos fins, servindo também como fonte de
germoplasma para o melhoramento genético.
Às espécies de Passiflora é atribuído o valor ornamental devido à beleza peculiar
das suas flores em formas e cores, principalmente a presença da corona, característica
única ao gênero, além da produção de flores ao longo do ano e com variabilidade na
folhagem (ABREU et al., 2009). Desta forma, as espécies de Passiflora apresentam
características que a favorecem a ornamentação, direcionando espécies e híbridos a
programas de melhoramento de passifloras ornamentais. O fato das passifloras serem
alógamas torna-se viáveis métodos de melhoramento que envolvem cruzamentos
interespecíficos para obtenção de híbridos heteróticos (ABREU et al., 2009;
VANDERPLANK, 2000).
Em alguns países europeus que tem a cultura do uso ornamental das passifloras, a
aplicação das hibridações interespecíficas tem contribuído para melhorar caracteres de
interesse, expandindo desta forma o interesse de produtores no uso destes híbridos na
decoração de ambientes, seja em parque, jardins ou na decoração de interiores
(FEUILLET et al., 2000; PEIXOTO, 2005; VANDERPLANK et al., 2003). Entretanto,
no Brasil esta prática é quase inexistente, sendo necessários estudos envolvendo a
melhoria destes caracteres, principalmente relacionados ao porte da planta, coloração,
tamanho e formas foliares, além de períodos mais longos de abertura da flor.
Aliado a necessidade do conhecimento da influencia ambiental na expressão das
caracteristicas genéticas associadas a descritores florais e vegetativos, tem-se à
estimativa de parâmetros genéticos como uma análise importante que pode auxiliar na
indicação de métodos de melhoramento favoráveis para selecionar genótipos superiores
(CRUZ; CARNEIRO, 2006). Apesar dos parâmetros genéticos proporcionarem essa
informação, dando suporte aos melhoristas, estudos envolvendo o melhoramento de
passifloras ornamentais ainda são poucos relatados, requerendo esforços para a
73
ampliação deste tipo de pesquisa em nosso país. Em híbridos interespecíficos F1
ornamentais foram realizadas caracterizações morfológicas para a estimativa de
parâmetros genéticos, onde foi verificada na progênie híbrida o potencial de
variabilidade e expressão das caracteristicas adequadas aos programas de melhoramento
de passifloras ornamentais (SANTOS et al., 2011). A caracterização de progênies da
primeira geração de retrocruzamento foi estimada por parâmetros genéticos visando o
melhoramento de híbridos retrocruzados de passifloras para fins ornamentais (MELO et
al., 2016).
Uma etapa importante após a obtenção da progênie híbrida, é a confirmação da
fecundação cruzada, que pode ser realizada utilizando técnicas mais simples, como
características morfológicas (OLIVEIRA et al., 2005), bem como técnicas moleculares,
baseada em reação em cadeia da polimerase (PCR), que tem se mostrado bastante
eficiente na identificação de híbridos interespecíficos de Passiflora (BELO et al., 2018;
MELO et al., 2016; SANTOS et al., 2012), bem como em outras culturas (AHMED et
al., 2013; DIMITRIJEVIC et al., 2010). Os marcadores moleculares microssatélites SSR
(Simple Sequence Repeats) requerem conhecimento de sequências para a construção de
primers específicos. Em híbridos de Passiflora para o procedimento desta técnica é
necessário a transferibilidade de primers SSR, uma vez que não existe primers SSR
desenhados para todas as espécies de Passiflora. Já foram desenvolvidos primers para
algumas espécies de Passiflora, P. edulis Sims (OLIVEIRA et al., 2005; 2008), P.
setacea D.C. (CERQUEIRA-SILVA) e P. alata Curtis (PÁDUA et al. 2005).
Este trabalho objetivou a caracterização de genitores e seus híbridos F1 obtidos
pelo cruzamento entre P. coccinea Aubl. e P. hatschbachii Cervi, com base em
descritores morfológicos, bem como estimar parâmetros genéticos da progênie híbrida
visando o uso destes híbridos para ornamentação. Em adição objetivou-se a confirmação
da fecundação cruzada utilizando marcadores moleculares SSR.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Material vegetal e condução do experimento
Utilizou-se neste estudo híbridos interespecificos F1 denominados de HD25,
oriundas do cruzamento entre Passiflora coccinea (♀) vs. Passiflora hatschbachii (♂),
sendo realizados os cruzamentos em casa de vegetação localizada na Universidade
74
Estadual de Santa Cruz - UESC (long 39 10‟W, lat 14 39‟ – S, alt 78m). As espécies
genitoras Passiflora coccinea e P. hatschbachii foram selecionadas neste estudo pelo
fato de apresentarem características de interesse ornamental. P. coccinea apresenta
florescimento abundante ao longo do ano, flores de coloração marcante e atrativa
(vermelha) e possui antese diurna. Além destas características, esta espécie é resistente à
virose nas folhas e antracnose nos frutos e ramos (JUNQUEIRA et al., 2005),
favorecendo a sua utilização em programas de melhoramento de plantas. Enquanto que
P. hatschbachii possui flores de coloração branca e antese noturna. Desta forma,
pretende-se obter um híbrido com potencial ornamental, cujo florescimento ocorra o ano
inteiro, com flores de coloração intensa e atrativa e que permaneçam abertas por maior
período de tempo.
O experimento foi conduzido em blocos casualizados, com três repetições para as
plantas genitoras e cada um dos genótipos híbridos, em unidade experimental no
campus da UESC, sendo realizadas avaliações em dois períodos, com intervalo de seis
meses. Os dados da primeira avaliação foram obtidos durante três meses (novembro de
2016 a janeiro de 2017) e da segunda avaliação durante quatro meses (julho de 2017 a
outubro de 2017).
Propagou-se por estaquia os genitores e os genótipos híbridos a partir das plantas
matrizes, sendo retiradas da parte intermediária dos ramos, preparadas e padronizadas
com dois nós e duas folhas reduzidas à metade de sua área, seccionadas em bisel e
imersas em auxina sintética (ácido indol-3 butírico – AIB) em forma de pó inerte. As
estacas foram adicionadas em sacos preto de polietileno, com capacidade de 1,5 L,
contendo areia lavada para posterior enraizamento, as quais foram irrigadas diariamente
durante esse período. Após dois meses e meio, quando as plantas atingiram
aproximadamente 1m de altura, foram transplantadas para vasos plásticos com
capacidade de 25 L, contendo solo, e transferidas para a área experimental.
Os genótipos foram conduzidos em sistema de espaldeira vertical, com mourões
de 2,5 m de altura e fio de arame 1,8 m do solo. Utilizou-se o espaçamento de um metro
entre plantas e dois metros entre fileiras. A poda foi realizada mensalmente e a
adubação a cada 15 dias, de acordo com a análise do solo: 38,33 mg de MAP
purificado, 45,18 mg de ureia e 55,6 mg de sulfato de manganês, durante 6 meses e após
esse período utilizou-se 38,33 mg de MAP purificado, 41,38 mg de cloreto de potássio,
99,53 mg de ureia e 111,1 mg de sulfato de manganês.
75
2.2 Análise das características morfológicas quantitativas
Foram avaliadas 18 características quantitativas, as quais estão apresentadas na
tabela 1. Estas características foram incluídas nas análises de acordo com descritores
oficiais de Passiflora ornamental (MAPA, 2008) e alguns ausentes na lista, com base no
manual prático da EMBRAPA (JESUS et al., 2015). Os dados foram obtidos com
auxílio de paquímetro digital e régua graduada.
Tabela 1. Descritores morfológicos quantitativos avaliados em genitores e híbridos F1
de Passiflora. Características Quantitativas Sigla
Diâmetro da flor (DF)
Diâmetro da corona (DCO)
Largura da pétala (LPE)
Comprimento da pétala (CPE)
Largura da sépala (LSE)
Comprimento da sépala (CSE)
Largura da bráctea (LBR)
Comprimento da bráctea (CBR)
Tamanho dos primeiros filamentos da corona (TF1)
Tamanho dos segundos filamentos da corona (TF2)
Comprimento do pedúnculo floral (CPED)
Comprimento do androginóforo (CA)
Comprimento de folha (CF)
Largura de folha (LF)
Área foliar (AF)
Diâmetro do caule (DC)
Comprimento do entrenó do ramo principal (CEN)
Número de glândulas no pecíolo (NGP)
2.3 Extração de DNA e confirmação da hibridação via marcador molecular
Para a confirmação da fecundação cruzada, o procedimento realizado para
extração de DNA e obtenção dos marcadores moleculares SSR foi idêntico ao capítulo
2.
2.4 Análise estatística
Após a tomada de dados referente à morfologia das plantas, os dados foram
submetidos à análise de variância com o auxílio do programa Genes (CRUZ, 2006) e as
médias foram comparadas pelo teste de Scott-Knott (P<0,05). Os parâmetros genéticos
foram estimados com base no esquema de análise de variância seguindo o modelo
estatístico (Tabela 3): YiJ= μ + gi + Bj + eij, em que:
76
Үij: onde i é o i-ésimo genótipo da j - ésima repetição;
μ: média geral do ensaio;
gi: efeito do genótipo i (i = 1,2,... g), (NID, 0, σ2g );
bj: efeito do bloco j (j= 1, 2....r), (NID, 0, σ2b);
εij: erro experimental ou resíduo, (NID, 0, σ2) .
Tabela 3. Modelo genético-estatístico com as esperanças dos quadrados médios
utilizados na análise de variância das características morfológicas dos genitores e
híbridos F1. FV GL QM E(QM)
Bloco r - 1 QMB σ2 + gσ2b
Genótipo g - 1 QMG σ2 + bσ2g
Resíduo (g – 1) (b – 1) QMR σ2
Total gb - 1
Fonte de variação (FV), grau de liberdade (GL), quadrado médio (QM), esperança do quadrado médio
[E(QM)], número de repetições (blocos) (r), número de genótipos (g), componente da variabilidade
genotípica (σ2g), componente de variância residual (σ2)
Foram obtidas as estimativas de esperança do quadrado médio, a partir da análise
de variância de cada característica, sendo estimados os seguintes parâmetros:
1) Variância ambiental ( ):
2) Variância fenotípica ( ):
3) Variância genotípica ( ):
4) Coeficiente de variação genotípica ( ):
77
5) Coeficiente de variação experimental ( ):
6) Índice de variação ( ):
7) Herdabilidade ( ):
3 RESULTADOS
3.1 Obtenção da progênie híbrida
O cruzamento entre P. coccinea vs. P. hatshibachii foi bem sucedido, havendo
produção de fruto, os quais resultaram em sementes viáveis (248 sementes). Foram
obtidas 117 plantas híbridas com hábito de crescimento herbáceo, sendo trepadeiras de
médio porte. Os genótipos híbridos apresentaram variabilidade em formatos e tamanho
para as características morfológicas (Figura 1). Observou-se nas flores de alguns
híbridos bandamento no primeiro filamento da corona (Figura 1D) e variação no seu
tamanho (Figura 1 E-F). Os genótipos híbridos apresentaram antese diurna, com
abertura da flor às 8h00 e fechamento por volta das 22h00.
No primeiro período foram avaliados 119 genótipos, sendo um genótipo de P.
coccinea (genitor feminino), um genótipo de P. hatshibachii (genitor masculino) e 117
híbridos. No segundo período foram avaliados 109 genótipos, os genitores mais os 107
genótipos híbridos. O número de genótipos híbridos foi reduzido no segundo período,
pois 10 híbridos (HD25 122, HD25 135, HD25 136, HD25 139, HD25 142, HD25 143,
HD25 197, HD25 201, HD25 208, HD25 238) não floresceram, impossibilitando as
avaliações.
78
Figura 1. Flores dos genitores e híbridos HD25: (A) Passiflora coccinea; (B) P.
hatschbachii; (C - F) Flores dos híbridos. Folha dos genitores e híbridos HD25:
(G) P. coccinea; (H - K) Folhas dos híbridos; (L) P. hatschbachii.
3.2 Confirmação da hibridação via marcador molecular
O marcador molecular SSR foi eficiente na confirmação da fecundação cruzada,
permitindo a identificação dos 117 híbridos interespecíficos obtidas do cruzamento
entre P. coccinea vs. P. hatschbachii (Figura 2). Foi realizada a transferibilidade de
primers SSR já desenvolvidos para as espécies P. alata (PÁDUA et al., 2005) e P.
edulis f. flavicarpa Deg. (OLIVEIRA et al., 2005; OLIVEIRA, 2008). 14 primers foram
79
usados para verificar a segregação de alelos, dos quais 11 foram desenvolvidos para P.
edulis f. flavicarpa e três para P. alata. Contudo, apenas o primer Pa07 (R:
CGGCATACGATAAATCTCCTG; F: CACATTTGCCGTCACTGG), desenvolvido
para P. alata e transferidos para os genótipos em estudo, evidenciou locus polimórfico
para a confirmação do caráter híbrido, cuja banda informativa do genitor masculino foi
verificada em todos os híbridos (Figura 2). Vale ressaltar que apenas um par de primer
foi suficiente para a identificação do caráter heterozigoto nos híbridos F1.
Figura 2. Confirmação da fecundação cruzada em gel de poliacrilamida 6% corado com
prata referente aos produtos amplificados pelo primer SSR Pa07 nos genitores
Passiflora coccinea e P. hatschbachii; e nos 117 híbridos HD25 F1: (A) 33 híbridos, (B)
41 híbridos e (C) 43 híbridos.
3.3 Análises das características morfológicas quantitativas
Através da análise de variância, realizada para as características quantitativas nos
dois períodos de avaliação, foi observado diferença significativa (P<0,05) entre ambos
os períodos para todas as características morfológicas, exceto para comprimento de
sépala (CSE), a qual não apresentou significância pelo teste F (Tabela 4). Foi verificada
também diferença significativa (P<0,05) entre os genótipos para todas as características,
com exceção para comprimento de folha (CF) (Tabela 4).
A análise de variância foi realizada para as características morfológicas
separadamente para cada período de avaliação após a observação da existência de
diferença significativa entre os períodos de avaliação (Tabelas 7 e 8).
80
No primeiro período de avaliação, através do teste de comparação de médias
Scott-Knott (P<0,05) verificou-se diferença entre os genótipos para todas as
características, exceto para as características vegetativas, largura (LF) e comprimento de
folha (CF), área foliar (AF) e diâmetro do caule (DC), cujos genitores e genótipos
híbridos apresentaram-se todos no mesmo grupo (a) (Tabela 5). Para as demais
características foi observado variação na formação de grupos. As características
vegetativas, comprimento de entrenó (CEN) apresentou dois grupos de distribuição e
número de glândulas no pecíolo (NGP), três grupos. Com relação às características
florais, diâmetro da corona (DCO), tamanho dos segundos filamentos da corona (TF2) e
comprimento do androginóforo (CA) apresentaram três grupos; largura de bráctea
(LBR), tamanho dos primeiros filamentos da corona (TF1) e comprimento do
pedúnculo floral (CPED), quatro grupos; diâmetro da flor (DF), comprimento de pétala
e largura de sépala (CPE e CSE), cinco grupos; comprimento de sépala (CSE) e
comprimento de bráctea (CBR), seis grupos e largura de pétala (LPE), sete grupos
(Tabela 5). Desta forma, a maior formação de grupos foi verificada para as
características CSE, CBR e LSE, enquanto que o menor número de grupos formado foi
observado para DC, TF2 e CA (Tabela 5).
Os genótipos híbridos apresentaram valores intermediários entre as médias dos
genitores para a característica vegetativa NGP. Em relação ao CEN, a maior média foi
obtida para o genitor masculino, enquanto que a média do genitor feminino e dos
genótipos híbridos não apresentaram diferenças, sendo todos dispostos no mesmo grupo
(b) (Tabela 5).
Para as características florais, nove genótipos híbridos apresentaram valores
superiores aos genitores para LBR (HD25 111, HD25 169, HD25 171, HD25 191,
HD25 193, HD25 214, HD25 221, HD25 235 e HD25 246) e TF1 (HD25 112, HD25
143, HD25 193, HD25 197, HD25 203, HD25 212, HD25 218, HD25 235 e HD25 246),
evidenciando heterose (Tabela 5). Observou-se também híbridos que apresentaram
valores intermediários entre as médias dos genitores para as características DF e DCO,
LPE, CPE, LSE, CSE, CA (Tabela 5).
Através do teste de comparação de médias Scott-Knott (P<0,05), no segundo
período de avaliação, foram observadas as diferenças entre os genótipos para todas as
características, exceto para as características vegetativas CF, LF e AF e para a
característica floral LS, com formação de apenas um grupo (a) incluindo os genitores e
os híbridos (Tabela 6). Com relação às características vegetativas o CEN apresentou
81
dois grupos de distribuição, enquanto que DC e NGP apresentaram três grupos (Tabela
6).
As características florais DCO, LBR, TF1 aprsentaram dois grupos. Foi formado
três grupos paras DF, CSE, CBR, TF2, CPED e CA. Quatro e cinco grupos foram
formadas para as características LPE e CPE, respectivamente (Tabela 6). Nesse sentido,
constatou-se que a maior formação de grupos foi para CPE e menor número de grupos
formados para DCO, LBR e TF1.
O agrupamento revelou que as médias das características morfológicas NGP,
LPE, CPE, CBR e CPED possuem valores intermediários entre as médias dos genitores
(Tabela 6). Os híbridos apresentaram valores superiores que a média dos pais para as
características DCO, LBR e TF1, sendo estas duas últimas também observadas nos
híbidos no primeiro período de avaliação. Os maiores valores médios obtidos para as
características DC, CEN, NGP e CPED foram verificados no genitor masculino,
enquanto que as características DF, CSE e TF2 foram observados para o genitor
feminino.
82
Tabela 4. Características morfológicas florias e vegetativas de genitores e híbridos interespecíficos F1 de Passiflora avaliados em dois períodos.
FV GL
QM
DF DCO LPE CPE LSE CSE LBR CBR TF1 TF2 CPED CA CF LF AF DC CEN NGP
Período 1 2,93** 1,44* 0,40** 0,30* 0,07** 0,02NS 6,94** 10,59** 3,45** 0,33** 138,18** 3,59** 169,87** 700,97** 24927,28** 58,31** 77,71** 0,57**
Bloco 2 1,48NS 0,25NS 0,00NS 0,11NS 0,00NS 0,16NS 0,09NS 0,31NS 0,05NS 0,00NS 2,47 NS 0,00NS 33,65** 3,49 NS 1544,52** 0,83** 1,32 NS 0,34 NS
Genótipo 108 1,62** 0,85** 0,02** 0,38** 0,03** 0,38** 0,16** 0,52** 0,12** 0,04** 11,10** 0,11** 4,77 NS 5,79** 463,24** 0,35** 2,73** 0,42**
Resíduo 544 0,26 0,28 0,00 0,05 0,00 0,05 0,05 0,11 0,03 0,00 2,74 0,02 4,90 3,37 279,40 0,14 1,07 0,13
Total 656
CV (%) 5,33 12,79 6,14 5,37 8,55 5,40 14,07 11,22 7,40 13,85 19,02 8,89 19,44 18,36 28,21 35,28 28,50 17,25
Média 9,66 4,14 0,99 4,33 1,07 4,36 1,69 3,05 2,67 0,55 8,71 1,90 11,39 10,00 59,25 1,07 3,64 2,14
Fonte de variação (FV), grau de liberdade (GL), quadrado médio (QM), diâmetro da flor (DF), diâmetro da corona (DCO), largura da pétala (LPE), comprimento da pétala (CPE), largura da
sépala (LSE), comprimento da sépala (CSE), largura da bráctea (LBR), comprimento da bráctea (CBR), tamanho dos primeiros filamentos da corona (TF1), tamanho dos segundos filamentos
da corona (TF2), comprimento do pedúnculo floral (CPED), comprimento do androginóforo (CA), comprimento da folha (CF), largura da folha (LF), área foliar (AF), diâmetro do caule
(DC), comprimento entrenó (CEN), número de grânulos no pecíolo (NGP). ** Significativo a 1% pelo teste F *Significativo a 5% pelo teste F NS não significativo
83
Tabela 5. Análise das características vegetativas e florais com valores médio em cm, exceto AF (cm2), em genitores e híbridos de Passiflora avaliadas
no primeiro período. Genitor/Progênie CF LF AF DC CEN NGP DF DCO LPE CPE LSE CSE LBR CBR TF1 TF2 CPED CA
P. coccinea 1 11,09a 6,94a 78,70a 1,05a 4,30b 2,00c 13,33a 3,83b 1,27a 6,03a 1,47a 6,13a 1,43c 4,53a 2,13d 1,33a 3,80d 2,90a
P. hatschbachii 2 11,92a 13,74a 95,55a 1,53a 8,70a 4,00a 8,77d 4,77a 0,80f 3,73e 0,87e 3,80f 0,87d 1,90f 2,43c 0,33c 15,90a 2,30b
HD25 101 3 12,62a 12,93a 81,93a 0,70a 2,53b 2,00c 9,40c 4,00b 1,00d 4,30d 1,10d 4,30e 1,60b 2,90 2,30d 0,50c 7,10d 2,00c
HD25 102 4 12,18a 11,61a 62,09a 0,78a 2,87b 2,00c 9,70c 3,57c 0,93e 4,73c 1,17c 4,70d 1,73b 3,00d 2,80b 0,53c 7,93d 2,13b
HD25 103 5 12,38a 9,91a 60,34a 0,47a 2,57b 2,00c 9,67c 4,07b 0,83f 4,33d 1,03e 4,13f 1,70b 2,77c 2,77b 0,60b 7,23d 2,20b
HD25 104 6 12,28a 10,80a 76,48a 0,62a 3,13b 2,00c 10,00b 3,60c 1,00d 4,50c 1,10d 4,67d 1,57c 2,47d 2,27d 0,50c 9,30c 2,10b
HD25 105 7 11,87a 11,60a 69,94a 0,71a 2,43b 2,00c 9,60c 3,87b 1,00d 4,37d 1,17c 4,40e 1,30c 2,60e 2,57c 0,67b 7,20d 1,97c
HD25 106 8 12,07a 12,56a 72,52a 0,75a 2,73b 2,00c 9,50c 4,40a 1,00d 4,20d 1,20c 4,20f 1,70b 3,20d 2,70b 0,50c 9,10c 1,90c
HD25 107 9 10,53a 11,29a 54,65a 0,63a 3,20b 2,00c 10,40b 4,60a 1,00d 4,50c 1,10d 4,70d 1,50c 3,10c 2,60b 0,60b 8,50d 2,00c
HD25 109 10 12,39a 11,30a 47,46a 0,81a 3,37b 2,00c 9,30c 4,53a 1,00d 4,23d 1,00e 4,30e 1,80b 3,00c 2,43c 0,50c 8,93c 1,90c
HD25 110 11 11,83a 10,93a 65,60a 0,80a 4,33b 2,00c 9,53c 5,03a 0,87e 4,27d 1,07e 4,33e 1,67b 2,67c 2,73b 0,57b 8,20d 2,07b
HD25 111 12 11,53a 10,85a 53,43a 0,69a 2,60b 2,00c 9,50c 4,60a 1,00d 4,30d 1,10d 4,20f 2,10a 3,00d 2,70b 0,50c 7,60d 2,10b
HD25 112 13 11,26a 11,53a 66,51a 2,61a 3,53b 2,00c 9,67c 4,10b 0,93e 4,53c 1,03e 4,53d 1,73b 2,77c 2,93a 0,57b 7,97d 1,97c
HD25 114 14 10,68a 9,81a 46,49a 0,69a 2,73b 2,00c 9,63c 4,43a 1,00d 4,37d 1,03e 4,33e 1,60b 2,13d 2,70b 0,47c 9,23c 2,03b
HD25 115 15 12,03a 9,37a 78,76a 0,79a 2,27b 2,00c 9,57c 3,67b 0,87e 4,30d 1,00e 4,43e 1,73b 3,40f 2,17d 0,53c 8,57d 1,87d
HD25 116 16 11,20a 9,41a 68,36a 0,58a 3,07b 2,00c 9,87c 3,37c 0,90e 5,00b 1,07e 4,70d 1,60b 2,93c 2,70b 0,63b 9,13c 1,97c
HD25 117 17 11,51a 10,78a 50,79a 0,74a 3,37b 2,00c 9,50c 2,50c 0,70g 4,70c 1,00e 4,80c 1,00d 2,20d 2,60b 0,50c 6,00d 2,00c
HD25 118 18 11,58a 11,00a 67,66a 0,79a 2,70b 2,00c 10,00b 3,50c 0,90e 4,40d 1,10d 4,40e 1,70b 3,20f 2,50c 0,60b 14,20b 1,60d
HD25 119 19 12,38a 11,56a 61,86a 0,87a 2,57b 2,00c 9,73c 4,33a 0,97d 4,33d 1,07e 4,47e 1,63b 2,93c 2,43c 0,50c 7,97d 1,97c
HD25 120 20 10,68a 8,52a 62,37a 0,60a 2,37b 2,00c 9,80c 4,10b 1,00d 4,50c 1,10d 4,20f 1,90a 2,90d 2,60b 0,60b 10,10c 1,90c
HD25 122 21 10,94a 8,91a 65,33a 0,68a 3,80b 2,00c 9,00d 4,27a 1,03d 4,23d 1,17c 4,17f 1,63b 2,90d 2,53c 0,53c 7,13d 2,03b
HD25 124 22 10,58a 10,11a 47,72a 0,82a 3,13b 2,00c 9,33c 3,83b 1,03d 4,23d 1,07e 4,30e 1,70b 2,67d 2,47c 0,53c 7,67d 2,10b
HD25 125 23 11,81a 12,31a 55,83a 0,60a 2,60b 2,00c 10,30b 4,43a 1,03d 4,50c 1,13d 4,43e 1,60b 2,70d 2,40c 0,53c 8,60d 1,90c
HD25 126 24 13,14a 12,23a 69,91a 0,65a 7,20b 2,00c 9,07d 3,50c 1,07c 4,07e 1,00e 4,00f 1,57c 2,77d 2,47c 0,50c 7,27d 1,77d
HD25 127 25 10,13a 10,84a 56,13a 0,58a 3,83b 3,00b 9,00d 4,27a 0,97d 4,10e 1,10d 4,27e 1,00d 2,57d 2,80b 0,37c 10,17c 2,10b
HD25 128 26 11,09a 8,89a 56,26a 0,74a 3,47b 3,00b 9,50c 4,03b 1,00d 4,30d 1,00e 4,40e 1,70b 2,63d 2,70b 0,60b 6,10d 1,97c
HD25 129 27 11,72a 12,41a 66,38a 0,70a 2,90b 2,00c 9,47c 4,07b 1,00d 4,40d 1,00e 4,37e 1,67b 2,87d 2,57c 0,50c 8,37d 1,90c
HD25 130 28 13,19a 12,74a 67,14a 0,84a 2,87b 2,00c 9,00d 3,60c 0,93e 4,10e 1,03e 4,13f 1,40c 3,10c 2,53c 0,50c 6,57d 1,67d
HD25 131 29 12,60a 12,68a 85,84a 0,78a 3,20b 2,00c 10,03d 3,90b 1,00d 4,43d 1,10d 4,53d 1,80b 3,23c 2,57c 0,47c 7,47d 1,70d
HD25 132 30 25,06a 10,49a 63,33a 0,80a 3,67b 2,00c 9,63c 3,80b 0,90e 4,43d 1,10d 4,53d 1,50c 3,00c 2,60b 0,53c 7,30d 1,90c
HD25 133 31 11,84a 11,24a 65,39a 0,68a 3,67b 2,00c 10,70b 4,70a 1,00d 5,00b 1,10d 5,20b 1,50c 3,20c 2,80b 0,50c 10,00c 2,20b
HD25 135 32 12,23a 11,09a 68,59a 0,88a 3,47b 2,00c 9,77c 4,37a 0,93e 4,30d 1,00e 4,37e 1,50c 2,80d 2,63b 0,47c 8,53d 1,83d
84
Tabela 5. Continuação Progênie CF LF AF DC CEN NGP DF DCO LPE CPE LSE CSE LBR CBR TF1 TF2 CPED CA
HD25 136 33 12,53a 12,34a 77,28a 0,91a 2,30b 2,00c 10,50b 3,77b 0,97d 4,70c 1,00e 4,67d 1,50c 2,40e 2,50c 0,57c 10,00c 2,10b
HD25 138 34 11,77a 10,51a 78,10a 0,72a 2,50b 2,00c 10,60b 4,77a 0,97d 4,60c 1,10d 4,63d 1,43c 2,83d 2,77b 0,53b 10,40c 1,97c
HD25 139 35 12,12a 10,61a 59,43a 0,81a 3,67b 2,00c 9,10d 4,43a 0,90e 4,00e 1,00e 4,13f 1,33c 2,60d 2,63b 0,47c 7,90d 1,80d
HD25 140 36 10,66a 8,11a 60,26a 0,63a 2,67b 2,00c 10,17b 3,30c 0,97d 4,57c 1,00e 4,57d 1,77b 2,77d 2,47c 0,53c 8,83c 2,00c
HD25 141 37 12,76a 11,12a 75,09a 0,84a 3,30b 2,00c 9,77c 4,37a 1,00d 4,50c 1,00e 4,43e 1,50c 2,60d 2,50c 0,57b 8,60d 1,90c
HD25 142 38 11,29a 10,94a 70,31a 0,80a 3,07b 2,00c 10,10b 4,00b 0,90e 4,30d 1,00e 4,50d 1,40c 2,70d 2,70b 0,50c 8,40d 2,00c
HD25 143 39 11,08a 9,63a 59,79a 0,81a 2,27b 2,00b 9,30c 4,27a 0,90e 4,17e 1,07e 4,20f 1,47c 2,37e 2,90a 0,50c 6,67d 2,13b
HD25 144 40 12,48a 10,97a 58,13a 0,72a 3,77b 2,00c 9,23d 3,13c 0,90e 4,17e 1,07e 4,30e 1,30c 2,93d 2,47c 0,47c 8,40d 1,77d
HD25 146 41 12,16a 11,77a 67,18a 0,67a 3,47b 2,00c 10,23b 5,03a 1,03d 4,40d 1,13d 4,53d 1,80b 3,87b 2,60b 0,57b 8,83c 2,03b
HD25 147 42 12,14a 11,39a 90,85a 0,74a 2,07b 2,00c 8,90d 3,60c 1,10c 4,00e 1,10d 4,10f 1,40c 2,80d 2,50c 0,50c 13,50b 1,80d
HD25 148 43 12,58a 11,21a 71,77a 0,76a 3,27b 3,00c 8,67d 3,27c 0,87e 4,10e 0,90e 3,93f 1,20d 2,00f 2,50c 0,53c 6,70d 1,90c
HD25 150 44 11,53a 10,46a 64,40a 0,83a 2,97b 2,00c 9,83c 3,50c 1,00d 4,50c 1,00e 4,40e 1,57c 2,70d 2,53c 0,50c 6,83d 1,80d
HD25 151 45 13,69a 13,03a 74,63a 0,75a 3,17b 2,00c 9,53c 4,33a 1,03d 4,43d 1,23c 4,47e 1,57c 3,03c 2,70b 0,53c 7,60d 2,07b
HD25 152 46 12,16a 9,71a 60,56a 0,69a 3,37b 2,00c 9,73c 3,27c 0,97d 4,40d 1,10d 4,47e 1,70b 2,67d 2,67b 0,57b 8,03d 1,87d
HD25 153 47 12,47a 11,99a 80,87a 0,65a 3,40b 2,00c 9,40c 4,13a 0,93e 4,33d 1,07e 4,27e 1,53c 2,73d 2,60b 0,43c 8,17d 1,83d
HD25 154 48 11,82a 10,71a 70,37a 0,65a 2,07b 2,00c 9,67c 4,80a 1,00d 4,53c 1,07e 4,43e 1,77b 3,10c 2,63b 0,57b 6,70d 2,00c
HD25 156 49 11,11a 9,28a 65,87a 0,65a 3,00b 2,00c 9,77c 3,57c 1,00d 4,27d 1,10d 4,37e 1,47c 3,20c 2,40c 0,57b 7,60d 1,87d
HD25 157 50 12,71a 10,97a 68,29a 0,80a 3,03b 2,00c 9,70c 4,23a 0,97d 4,63c 1,00e 4,60d 1,67b 3,10c 2,63b 0,53c 7,33d 1,97c
HD25 158 51 13,22a 12,77a 74,46a 0,76a 3,73b 2,00c 9,97b 3,73b 0,97d 4,50c 1,07e 4,50d 1,40c 2,77d 2,70b 0,50c 9,70c 1,97c
HD25 159 52 12,09a 11,06a 67,53a 0,70a 3,33b 2,00c 9,60c 4,07b 0,97d 4,40d 1,00e 4,47e 1,57c 3,27c 2,60b 0,53c 7,30d 2,07b
HD25 160 53 12,34a 11,92a 65,37a 0,68a 3,57b 2,00c 9,37c 3,97b 0,97d 4,20d 1,03e 4,20f 1,70b 3,13c 2,47c 0,53c 8,37d 2,13b
HD25 161 54 11,28a 11,88a 68,79a 0,79a 3,17b 2,00c 9,77c 3,83b 1,03d 4,40d 1,10d 4,40e 1,43c 2,77d 2,70b 0,60b 8,33d 1,80d
HD25 162 55 11,39a 11,51a 57,54a 0,80a 3,23b 2,00c 9,57c 4,53a 1,00d 4,17e 1,10d 4,20f 1,57c 3,17c 2,67b 0,53c 7,63d 2,10b
HD25 163 56 12,70a 11,52a 79,39a 0,67a 3,30b 2,00c 10,23b 4,30a 0,97d 4,93b 1,10d 4,60d 1,43c 2,63d 2,53c 0,60b 7,60d 2,10b
HD25 165 57 12,10a 10,23a 56,45a 0,71a 3,87b 2,00c 9,37c 4,00b 0,93e 4,33d 1,00e 4,40e 1,57c 2,70d 2,70b 0,50c 7,00d 1,90c
HD25 166 58 12,27a 12,37a 78,55a 0,76a 3,57b 2,00c 10,50b 4,10b 1,10c 4,90b 1,20c 5,00b 1,50c 2,50e 2,80b 0,60b 8,90c 2,10b
HD25 167 59 11,16a 9,64a 68,23a 0,76a 3,80b 2,00c 9,80c 4,60a 0,90e 4,40d 1,00e 4,40e 1,50c 2,90d 2,60b 0,50c 9,60c 1,90c
HD25 168 60 11,23a 10,60a 64,22a 0,82a 3,40b 2,00c 9,33c 3,33c 1,03d 4,30d 1,03e 4,27e 1,50c 2,93d 2,60b 0,50c 9,00c 1,90c
HD25 169 61 12,36a 11,39a 96,92a 0,78a 3,00b 2,00c 9,67c 4,40a 1,00d 4,33d 1,10d 4,50d 1,90a 3,30c 2,53c 0,50c 9,47c 2,00c
HD25 170 62 10,40a 9,39a 51,79a 0,85a 4,17b 2,00c 9,50c 4,10b 0,87e 4,10e 1,00e 4,20f 1,50c 2,80d 2,40c 0,57b 7,97d 2,17b
HD25 171 63 12,17a 11,91a 77,89a 0,93a 3,23b 2,00c 8,87d 4,57a 0,93e 4,47d 1,13d 4,17f 1,93a 3,33d 2,63b 0,53c 11,70c 2,13b
HD25 172 64 11,83a 10,16a 66,35a 0,86a 3,63b 2,00c 9,03d 4,63a 0,87e 4,20d 1,00e 4,17f 1,67b 3,03c 2,60b 0,50c 8,87c 2,10b
85
Tabela 5. Continuação Progênie CF LF AF DC CEN NGP DF DCO LPE CPE LSE CSE LBR CBR TF1 TF2 CPED CA
HD25 173 65 12,01a 11,34a 67,89a 0,78a 4,33b 2,00c 9,53c 4,53a 0,97d 4,27d 1,03e 4,27e 1,67b 3,13c 2,37c 0,53c 6,77d 1,97c
HD25 176 66 13,02a 11,93a 66,42a 0,77a 3,57b 2,00c 10,30b 4,77a 1,00d 4,60c 1,27b 4,70d 1,70b 3,00c 2,60b 0,57b 8,70d 2,00c
HD25 178 67 10,58a 10,30a 53,15a 0,74a 3,90b 2,00c 9,40c 4,57a 0,93e 4,27d 1,00e 4,07f 1,57c 3,10c 2,63b 0,57b 8,40d 1,90c
HD25 180 68 11,12a 10,43a 56,42a 0,71a 3,57b 2,00c 8,00e 3,20c 1,00d 4,00e 1,20c 4,00f 1,50c 3,10c 2,40c 0,50c 7,20d 2,00c
HD25 182 69 11,04a 11,40a 76,09a 1,38a 4,47b 2,00c 9,70c 3,70b 0,90e 4,20d 1,10d 4,10f 1,60b 2,70d 2,50c 0,40c 7,30d 2,10b
HD25 185 70 12,38a 11,54a 80,29a 0,83a 2,93b 2,00c 9,63c 3,87b 0,97d 4,30d 1,13d 4,43e 1,67b 2,77d 2,47c 0,50c 9,87c 1,90c
HD25 186 71 12,67a 12,74a 72,93a 0,90a 2,80b 2,00c 9,60c 4,17a 1,00d 4,40d 1,17c 4,27e 1,67b 2,90d 2,50c 0,50c 8,30d 2,00c
HD25 187 72 12,21a 10,90a 63,89a 0,84a 3,07b 2,00c 10,27b 4,40a 0,90e 4,60c 1,03e 4,63d 1,47c 2,63d 2,43c 0,50c 7,33d 2,10b
HD25 188 73 11,72a 9,98a 52,28a 0,93a 2,83b 2,00c 9,63c 3,77b 0,87e 4,23d 0,97e 4,40e 1,57c 2,67d 2,50c 0,57b 6,77d 1,83d
HD25 189 74 9,48a 9,57a 36,89a 0,66a 2,97b 2,00c 9,00d 5,00a 1,00d 4,90b 1,00e 4,30e 1,80b 3,70b 2,30d 0,50c 9,20c 2,00c
HD25 191 75 12,42a 10,12a 57,54a 0,80a 3,67b 2,00c 9,80c 4,33a 0,90e 4,40d 1,00e 4,37e 1,83a 3,03c 2,70b 0,60b 7,17d 2,07b
HD25 192 76 10,01a 9,57a 50,53a 0,72a 3,23b 2,00c 10,00b 4,80a 0,80f 4,40d 1,00e 4,40e 1,70b 2,50e 2,80b 0,60b 11,30c 2,00c
HD25 193 77 11,24a 9,49a 64,68a 0,70a 2,70b 2,00c 10,37b 4,37a 1,00d 4,40b 1,37a 4,70d 1,87a 3,47c 3,10a 0,60b 7,80d 2,27b
HD25 195 78 12,74a 11,51a 66,74a 0,82a 4,33b 2,00c 9,83c 4,47a 1,07c 4,40d 1,20c 4,63d 1,63b 3,30c 2,50c 0,60b 8,40d 2,13b
HD25 197 79 12,04a 10,73a 54,96a 0,82a 3,60b 2,00c 8,00e 3,00c 0,90e 4,10e 1,00e 4,10f 1,70b 3,00c 3,00a 0,50c 6,00d 1,80d
HD25 198 80 10,71a 11,32a 63,16a 0,88a 2,73b 2,00c 9,47c 3,77b 0,83f 4,23d 0,97e 4,33e 1,50c 3,13c 2,50c 0,53c 7,73d 2,07b
HD25 199 81 13,06a 11,73a 64,27a 0,76a 3,73b 3,00b 9,60c 3,17c 1,03d 4,20d 1,17c 4,13f 1,77b 3,30c 2,33d 0,57c 6,40d 1,70d
HD25 200 82 11,91a 11,41a 61,30a 0,90a 3,73b 2,00c 9,60c 3,53c 1,03d 4,07e 1,00e 4,27e 1,73b 2,40e 2,60b 0,50c 7,77d 1,83d
HD25 201 83 11,28a 11,21a 53,73a 0,66a 3,43b 2,00c 10,27b 4,43a 0,93e 4,53c 1,17c 4,63d 1,60b 3,17c 2,70b 0,53c 7,13d 2,17b
HD25 202 84 11,73a 11,58a 73,21a 0,83a 3,37b 2,00c 9,17d 3,83b 0,97d 4,27d 1,13d 4,33e 1,60b 2,97c 2,70b 0,57b 7,97d 2,00c
HD25 203 85 11,33a 10,80a 63,25a 0,72a 2,43b 2,00c 9,67c 4,57a 1,07c 4,30d 1,17c 4,37e 1,67b 2,90d 2,87a 0,50c 8,93c 2,07b
HD25 204 86 11,24a 12,47a 64,44a 0,75a 2,77b 2,00c 9,73c 4,70a 1,10c 4,40d 1,03e 4,43e 1,63b 2,90d 2,63b 0,53c 7,80d 1,93c
HD25 208 87 11,62ª 11,51a 65,09a 0,72a 2,90b 2,00c 9,77c 4,03b 1,03d 4,33d 1,00e 4,47e 1,67b 2,97c 2,70b 0,60b 8,70d 1,97c
HD25 209 88 12,83a 13,62a 97,82a 0,68a 2,50b 3,00b 9,27d 4,20a 1,10c 4,40d 1,10d 4,40e 1,60b 3,10c 2,57c 0,50c 8,47d 1,87d
HD25 210 89 13,32a 10,69a 67,89a 0,78a 3,23b 2,00c 9,70c 3,90b 0,97d 4,40d 1,07e 4,40e 1,80b 2,97c 2,60b 0,47c 8,33d 2,00c
HD25 212 90 11,20a 10,76a 57,64a 0,72a 3,57b 2,00c 9,90b 5,00a 0,90e 4,60c 1,00e 4,60d 1,60b 3,10c 3,00a 0,50c 7,30d 2,00c
HD25 213 91 10,26a 11,52a 65,95a 0,76a 3,53b 2,00c 8,87d 3,57c 0,97d 4,23d 1,03e 4,20f 1,50c 3,07c 2,50c 0,60b 7,40d 2,13b
HD25 214 92 10,53a 10,85a 54,08a 0,82a 2,90b 2,00c 9,20d 4,53a 1,17b 4,17e 1,20c 4,10f 2,20a 3,37c 2,67b 0,53c 11,10c 1,97c
HD25 215 93 12,12a 10,49a 65,62a 0,63a 2,73b 2,00c 9,13d 4,00b 1,00d 4,20d 1,10d 4,33e 1,70b 3,13c 2,80b 0,60b 9,00c 2,07b
HD25 217 94 11,93a 10,94a 68,87a 0,63a 3,17b 2,00c 10,30b 4,00b 1,10c 4,67c 1,20c 4,80c 1,63b 3,40c 2,53c 0,53c 9,13c 1,90c
HD25 218 95 12,14a 11,43a 71,55a 0,63a 2,77b 2,00c 9,70c 5,10a 1,00d 4,30d 1,00e 4,40e 1,60b 3,10c 3,20a 0,60b 7,10d 2,00c
HD25 219 96 11,71a 11,94a 71,66a 0,83a 2,23b 3,00b 9,17d 4,03b 0,97d 4,10e 1,07e 4,10f 1,40c 2,87d 2,60b 0,50c 6,73d 1,80d
86
Tabela 5. Continuação Progênie CF LF AF DC CEN NGP DF DCO LPE CPE LSE CSE LBR CBR TF1 TF2 CPED CA
HD25 220 97 11,34a 11,52a 61,34a 0,76a 4,07b 3,00b 9,70c 4,10b 1,00d 4,33d 1,10d 4,33e 1,53c 2,90d 2,57c 0,50c 8,50d 1,90c
HD25 221 98 12,89a 12,61a 73,42a 0,76a 3,37b 2,00c 9,50c 3,80b 1,00d 4,40d 1,10d 4,30e 1,90a 3,30c 2,80b 0,50c 11,00c 2,00c
HD25 222 99 13,04a 12,39a 68,50a 0,75a 3,43b 2,00c 9,67c 4,30a 1,00d 4,33d 1,07e 4,20f 1,57c 2,67d 2,67b 0,60b 6,80d 1,93c
HD25 223 100 12,43a 12,99a 65,98a 0,73a 3,37b 2,00c 9,63c 4,73a 1,03d 4,50c 1,03e 4,43e 1,63b 2,60d 2,73b 0,60b 9,10c 2,10b
HD25 224 101 11,17a 11,43a 61,22a 0,77a 3,03b 2,00c 9,10d 3,73b 0,90e 4,07e 1,00e 4,23e 1,23d 2,67d 2,30d 0,50c 7,03d 1,90c
HD25 225 102 12,10a 11,77a 55,55a 0,81a 4,23b 2,00c 9,23d 4,20a 0,90e 4,07e 0,93e 4,17f 1,33c 2,20f 2,50c 0,57b 8,37d 1,93c
HD25 226 103 11,84a 11,04a 56,47a 0,79a 2,60b 2,00c 9,03d 4,33a 0,93e 4,07e 1,07e 4,10f 1,53c 2,73d 2,47c 0,50c 7,70d 2,00c
HD25 227 104 11,87a 9,78a 60,86a 0,71a 2,83b 2,00c 8,90d 4,20a 0,90e 4,00e 0,90e 3,90f 1,10d 2,40e 2,10d 0,50c 4,70d 2,00c
HD25 229 105 10,22a 8,44a 48,04a 0,74a 4,07b 2,00c 8,63d 3,83b 0,90e 4,07e 0,93e 3,90f 1,77b 2,63d 2,47c 0,53c 6,87d 2,13b
HD25 231 106 12,76a 12,88a 67,56a 0,77a 3,13b 2,00c 10,50b 4,10b 0,90e 4,60c 1,10d 4,70d 1,70b 3,50c 2,70b 0,50c 6,00d 2,00c
HD25 234 107 11,56a 11,78a 58,32a 0,80a 3,10b 2,00c 9,73c 4,87a 0,93e 4,30d 1,00e 4,10f 1,53c 2,67d 2,40c 0,53c 5,23d 2,00c
HD25 235 108 12,01a 11,86a 69,20a 0,89a 3,13b 2,00c 9,63c 4,30a 1,07c 4,27d 1,10d 4,43e 1,97a 3,80b 2,70b 0,60b 7,80d 1,97c
HD25 237 109 12,19a 12,19a 61,00a 0,67a 2,77b 2,00c 9,10d 4,50a 1,03d 4,00e 1,10d 4,10f 1,70 3,20c 2,77b 0,57b 9,40c 1,93c
HD25 238 110 10,94a 10,22a 51,43a 0,61a 2,37b 2,00c 9,50c 4,03b 1,00d 4,30d 1,07e 4,33e 1,67b 2,70d 2,00d 0,57b 7,80d 2,13b
HD25 239 111 13,23a 10,98a 63,84a 0,72a 3,23b 2,00c 10,07b 5,47a 1,10c 4,73c 1,20c 4,60d 1,80b 3,30c 2,60b 0,63b 7,60d 2,17b
HD25 240 112 10,43a 9,78a 52,05a 0,78a 2,83b 2,00c 9,20d 3,83b 0,97d 3,97e 1,00e 4,03f 1,53c 2,40e 2,50c 0,57b 7,57d 1,97c
HD25 241 113 11,03a 10,55a 52,96a 0,83a 2,30b 2,00c 10,87b 3,07c 1,07c 4,87b 1,20c 4,90c 1,40c 3,17c 2,80b 0,57b 9,97c 2,17b
HD25 242 114 12,87a 11,84a 61,53a 0,76a 3,93b 2,00c 8,27e 3,80b 0,97d 3,80e 0,93e 3,77f 1,53c 2,77d 2,23d 0,50c 9,03c 2,00c
HD25 244 115 9,93a 9,07a 36,67a 0,78a 2,43b 2,00c 9,10d 4,50a 1,00d 4,10e 1,10d 4,10f 1,50c 2,90d 2,70b 0,50c 8,00d 1,80d
HD25 245 116 10,82a 10,86a 68,94a 0,66a 4,40b 2,00c 9,90b 4,40a 1,03d 4,27d 1,10d 4,37e 1,63b 3,20c 2,63b 0,53c 7,57d 1,93c
HD25 246 117 9,88a 9,49a 66,41a 0,71a 2,73b 2,00c 9,67c 3,93b 1,03d 4,40d 1,10d 4,40e 2,10a 3,20c 2,47c 0,50c 7,53d 1,83d
HD25 247 118 13,39a 10,86a 67,40a 0,83a 3,83b 2,00c 9,50c 3,60c 0,90e 4,37d 1,03e 4,37e 1,67b 3,23c 2,50c 0,57b 9,50c 2,10b
HD25 248 119 11,31a 10,31a 58,16a 0,71a 3,63b 2,00c 9,10d 3,70b 0,90e 4,10e 1,00e 4,30e 1,50c 2,70d 2,60b 0,50c 8,70d 1,70d
Valores médios seguidos da mesma letra nas colunas não diferem estatisticamente pelo agrupamento de Scott-Knott a 5% de probabilidade. Comprimento da folha (CF), largura da
folha (LF), área foliar (AF), diâmetro do caule (DC), comprimento entrenó (CEN), número de grânulos no pecíolo (NGP), diâmetro da flor (DF), diâmetro da corona (DCO), largura
da pétala (LPE), comprimento da pétala (CPE), largura da sépala (LSE), comprimento da sépala (CSE), largura da bráctea (LBR), comprimento da bráctea (CBR), tamanho dos
primeiros filamentos da corona (TF1), tamanho dos segundos filamentos da corona (TF2), comprimento do pedúnculo floral (CPED), comprimento do androginóforo (CA).
87
Tabela 6. Análise das características vegetativas e florais com valores médio em cm, exceto AF (cm2), em genitores e híbridos de Passiflora avaliadas
no segundo período. Genitor/Progênie CF LF AF DC CEN NGP DF DCO LPE CPE LSE CSE LBR CBR TF1 TF2 CPED CA
P. coccinea 1 12,12a 7,54a 74,26a 1,03c 4,38a 2,00c 13,62a 3,12b 1,36a 6,23a 1,54a 6,26a 1,25b 3,85a 1,96b 1,32a 5,69c 2,71a
P. hatschbachii 2 12,10a 14,34a 81,71a 3,70a 8,00a 4,00a 8,87c 4,39a 0,81d 3,56e 0,91a 3,79c 1,37b 2,15c 2,15b 0,67c 17,84a 2,07b
HD25 101 3 11,44a 9,77a 65,38a 1,33c 4,76a 2,00c 10,06b 3,92b 1,12b 4,43b 1,16a 4,50b 1,81a 3,50a 2,61b 0,52c 10,05b 1,97b
HD25 102 4 11,03a 8,72a 49,95a 1,51c 4,44a 2,00c 9,52c 4,47a 1,01d 4,37c 1,10a 4,44b 1,65b 3,06b 2,66b 0,55c 8,17c 1,92b
HD25 103 5 11,25a 7,93a 50,68a 2,00b 4,66a 2,00c 10,13b 4,82a 0,94d 4,48b 1,11a 4,61b 1,56b 3,04b 2,83a 0,65c 8,69c 1,81c
HD25 104 6 10,76a 9,486a 60,11a 1,18c 3,33b 2,00c 8,95c 3,65b 0,95d 4,16c 1,03a 4,13c 1,68b 3,73a 2,76a 0,53c 9,41c 1,76c
HD25 105 7 9,55a 8,85a 47,89a 1,21c 3,41b 2,00c 9,35c 4,25a 1,00d 4,22c 1,00a 4,25c 2,12a 3,42a 2,65b 0,55c 9,82b 1,97b
HD25 106 8 10,69a 7,97a 53,29a 1,55c 3,50b 2,00c 9,15c 3,95b 0,97d 4,07d 1,00a 4,10c 2,10a 3,37a 2,85a 0,65c 12,90b 1,90b
HD25 107 9 10,62a 9,26a 53,88a 1,41c 3,94b 2,00c 10,55b 5,25a 1,00d 4,60b 1,12a 4,65b 2,35a 3,42a 2,87a 0,55c 11,97b 2,15b
HD25 109 10 12,20a 9,676a 62,43a 1,89b 4,00b 2,00c 9,42c 5,13a 1,01d 4,25c 1,12a 4,36c 1,78b 3,16a 2,62b 0,57c 9,15c 2,01b
HD25 110 11 12,05a 8,82a 63,90a 1,41c 5,27a 2,00c 9,68c 4,52a 0,98d 4,28c 1,05a 4,45b 1,73b 3,36a 2,81a 0,60c 9,01c 1,96b
HD25 111 12 11,48a 8,90a 58,13a 1,42c 3,50b 2,00c 9,51c 4,20a 0,99d 4,24c 1,14a 4,43b 2,06a 3,41a 2,81a 0,58c 11,07b 1,96b
HD25 112 13 10,93a 8,90a 54,60a 1,52c 3,66b 3,00b 9,75c 4,12b 1,05c 4,41b 1,11a 4,45b 1,75b 3,53a 2,46b 0,55c 12,31b 1,80c
HD25 114 14 9,42a 6,42a 35,57a 1,30c 3,77b 2,00c 9,50c 4,28a 1,05c 4,18c 1,10a 4,26c 1,85a 2,88b 2,70b 0,51c 7,90c 1,96b
HD25 115 15 10,33a 6,66a 49,01a 1,60b 3,72b 2,00c 9,70c 3,50b 0,95d 4,31c 1,10a 4,36b 1,65b 3,02b 2,36b 0,50c 9,76b 1,64c
HD25 116 16 10,57a 8,89a 50,64a 1,26c 4,11b 2,00c 9,33c 4,13b 0,95d 4,10d 1,05a 4,30c 1,95a 3,05b 2,85a 0,55c 11,62b 1,95b
HD25 117 17 11,23a 8,17a 55,50a 1,59b 4,22a 2,00c 10,20b 3,05b 1,05c 4,45b 1,05a 4,55b 1,95a 3,10b 2,85a 0,45c 10,50b 1,65c
HD25 118 18 10,90a 8,02a 55,09a 1,82b 3,25b 2,00c 10,02b 3,73b 0,98d 4,34c 1,02a 4,34c 1,71b 3,10b 2,64b 0,55c 8,49c 1,80c
HD25 119 19 10,94a 8,15a 56,78a 1,81b 3,75b 2,00c 9,45c 3,50b 0,90d 4,08d 1,01a 4,38b 1,51b 3,11b 2,48b 0,53c 7,38c 1,60c
HD25 120 20 10,09a 7,90a 39,16a 1,09c 3,72b 2,00c 9,97b 4,67a 1,00d 4,34c 1,09a 4,47b 1,74b 3,35a 2,71b 0,54c 9,06c 1,81c
HD25 124 21 11,11a 7,09a 55,18a 1,45c 4,72a 2,00c 9,19c 4,62a 1,09c 4,36c 1,17a 4,26c 2,01a 3,19a 2,69b 0,59c 8,42c 1,95b
HD25 125 22 10,48a 9,00a 60,13a 1,10c 3,46b 2,00c 10,11b 4,17b 1,13b 4,35c 1,21a 4,43b 1,88a 3,36a 2,73a 0,59c 11,83b 1,94b
HD25 126 23 12,18a 10,62a 65,25a 1,35c 3,61b 2,00c 9,84b 4,19a 1,16b 4,20c 1,12a 4,26c 1,89a 3,17a 2,82a 0,58c 10,27b 1,89b
HD25 127 24 10,85a 8,54a 53,42a 1,05c 3,66b 2,00c 10,15b 3,63b 1,05c 4,48b 1,18a 4,53b 2,18a 3,28a 2,58b 0,60c 11,65b 1,98b
HD25 128 25 10,47a 8,12a 42,21a 1,15c 3,10b 2,00c 9,65c 3,57b 1,03c 4,38c 1,11a 4,40b 2,06a 3,08b 2,70b 0,55c 9,53c 1,73c
HD25 129 26 10,96a 9,51a 49,09a 1,24c 4,39a 2,00c 9,88b 3,90b 0,95d 4,14c 1,07a 4,40b 1,62b 2,90b 2,67b 0,56c 7,37c 1,76c
HD25 130 27 10,87a 9,10a 50,15a 1,37c 3,83b 2,00c 10,15b 4,75a 1,05c 4,30c 1,10a 4,40b 1,80a 3,30a 3,20a 0,65c 7,35c 1,70c
HD25 131 28 11,24a 8,01a 59,16a 1,26c 5,44a 2,00c 10,70b 4,20a 1,05c 4,80b 1,12a 4,75b 1,67b 3,55a 3,02a 0,65c 10,55b 1,90b
HD25 132 29 10,01a 7,26a 46,23a 1,31c 4,35a 2,00c 8,80c 2,75b 0,95d 4,15c 0,95 4,20c 1,15b 2,45c 3,00a 0,50c 5,55c 1,65c
HD25 133 30 10,35a 7,92a 50,32a 1,50c 5,50a 2,00c 10,04b 3,84b 1,01d 4,52b 1,12a 4,66b 1,65b 3,40a 2,93a 0,53c 7,79c 1,93b
HD25 138 31 11,23a 8,90a 67,27a 1,39c 4,16b 2,00c 10,53b 4,34a 1,00d 4,56b 1,10a 4,59b 1,65b 3,11b 2,80a 0,61c 7,93c 1,97b
HD25 140 32 9,60a 7,93a 40,84a 1,31c 4,00b 2,00c 9,47c 3,83b 0,94d 4,34c 1,04a 4,19c 1,60a 2,84b 2,50b 0,47c 7,33c 1,82b
88
Tabela 6. Continuação Progênie CF LF AF DC CEN NGP DF DCO LPE CPE LSE CSE LBR CBR TF1 TF2 CPED CA
HD25 141 33 10,16a 8,05a 47,00a 1,40c 3,91b 2,00c 10,90b 4,43a 1,03c 4,91b 1,11a 4,83b 1,33b 2,36c 3,10a 0,63c 7,76c 1,30c
HD25 144 34 9,023a 6,77a 34,06a 1,46c 4,00b 2,00c 9,10b 3,80b 0,97d 4,10d 1,02a 4,20c 1,72b 2,97b 2,40b 0,42c 9,92b 1,57c
HD25 146 35 11,85a 8,72a 61,15a 1,18c 3,61b 2,00c 9,66b 4,23a 1,03c 4,20c 1,04a 4,53b 1,86a 3,36a 2,49b 0,54c 7,84c 1,85b
HD25 147 36 10,86a 10,00a 50,68a 1,50c 2,50b 2,00c 10,33b 4,63a 1,06c 4,51b 1,14a 4,52b 1,72b 3,16a 2,86a 0,61c 9,39c 1,71c
HD25 148 37 11,19a 9,39a 51,59a 1,39c 4,05b 2,00c 9,55c 4,25a 1,05c 4,28c 1,08a 4,28c 1,51b 2,80b 2,41b 0,51c 8,10c 1,63c
HD25 150 38 9,823a 8,52a 53,87a 1,39c 4,05b 2,00c 10,03b 4,08b 1,00d 4,63b 1,06a 4,38b 1,64b 3,01b 2,60b 0,61c 9,50c 1,58c
HD25 151 39 10,81a 9,17a 45,56a 1,39c 4,57a 2,00c 10,07b 4,62a 1,00d 4,53b 1,01a 4,48b 1,73b 2,76b 2,98a 0,55c 9,61b 1,75c
HD25 152 40 10,26a 8,65a 51,16a 0,96c 2,93b 2,00c 9,45c 3,80b 1,05c 4,20c 1,20a 4,40b 1,80a 3,65a 3,00a 0,50c 9,35c 1,80c
HD25 153 41 11,46a 8,64a 61,48a 1,17c 3,28b 2,00c 9,67c 4,25a 1,00d 4,31c 1,39a 4,04c 1,44b 2,62c 2,72a 0,57c 10,19b 1,56c
HD25 154 42 11,23a 9,01a 63,09a 1,39c 3,66b 2,00c 9,33c 4,67a 0,96d 4,10d 1,06a 4,10c 1,66b 2,91b 2,48b 0,55c 8,00c 1,70c
HD25 156 43 11,59a 9,77a 62,33a 0,98c 3,69b 2,00c 9,80c 3,36b 1,00d 4,20c 1,06a 4,21c 1,50b 2,60c 2,51b 0,53c 5,85c 1,71c
HD25 157 44 11,45a 9,16a 63,63a 1,18c 3,94b 2,00c 9,55c 3,88b 1,05c 4,42b 1,10a 4,20c 1,82a 3,12b 2,67b 0,52c 10,37b 1,92b
HD25 158 45 10,33a 8,72a 46,18a 1,23c 3,83b 2,00c 9,79c 4,44a 1,05c 4,35c 1,04a 4,32c 1,64b 3,14b 2,67b 0,55c 8,41c 1,45c
HD25 159 46 11,21a 9,15a 51,49a 1,32c 4,27a 2,00c 9,96b 4,03b 1,02c 4,47b 1,04a 4,46b 1,93a 3,31a 2,77a 0,55c 9,15c 1,94b
HD25 160 47 9,15a 8,99a 36,87a 1,70b 3,66b 2,00c 10,03b 4,38a 1,07c 4,22c 1,07a 4,32c 1,77b 3,37a 2,67b 0,57c 9,52c 1,37c
HD25 161 48 11,68a 11,05a 71,29a 1,59b 5,50a 2,00c 10,02b 5,90a 1,03c 4,55b 1,08a 4,51b 1,81a 3,00b 2,91a 0,61c 10,00b 1,56c
HD25 162 49 12,82a 11,12a 81,13a 1,57b 4,05b 2,00c 10,18b 4,42a 1,07c 4,53b 1,12a 4,60b 1,86a 3,15b 2,63b 0,57c 9,33c 2,21b
HD25 163 50 12,33a 11,07a 75,52a 0,94c 4,11b 2,00c 9,70c 4,33a 1,00d 4,30c 1,10a 4,16c 1,56b 3,53a 2,76a 0,56c 9,63b 2,06b
HD25 165 51 11,05a 8,98a 46,39a 0,86c 4,08b 2,00c 10,45b 4,25a 1,10c 4,50b 1,15a 4,60b 1,80a 3,30a 2,80a 0,50c 9,80b 1,75c
HD25 166 52 12,83a 10,47a 80,54a 1,46c 4,94a 2,00c 10,66b 4,13b 1,04c 4,66b 1,17a 4,71b 1,91a 2,39c 2,96a 0,56c 11,14b 1,96b
HD25 167 53 10,49a 8,91a 57,49a 1,11c 3,61b 2,00c 9,55c 4,52a 1,00d 4,25c 1,05a 4,28c 2,12a 3,38a 2,51b 0,59c 10,12b 1,83b
HD25 168 54 9,80a 7,79a 49,13a 1,24c 4,31a 2,00c 9,42c 4,70a 1,00d 4,05d 1,10a 4,10c 1,90a 3,30a 2,67b 0,57c 10,10b 1,80c
HD25 169 55 12,39a 11,1a 77,38a 1,30c 3,02b 2,00c 9,62c 4,17b 0,96d 3,79e 1,03a 4,47b 1,87a 3,36a 2,52b 0,51c 8,24c 1,59c
HD25 170 56 9,97a 8,92a 47,62a 1,60b 4,38a 2,00c 9,75c 4,43a 0,98d 4,45b 1,03a 4,38b 1,70b 3,23a 2,75a 0,56c 10,26b 1,81c
HD25 171 57 12,21a 8,52a 59,74a 1,65b 3,88b 2,00c 10,03b 4,04b 0,98d 4,35c 1,11a 4,56b 1,96a 3,21a 2,71b 0,56c 10,31b 1,83b
HD25 172 58 10,50a 9,01a 50,03a 1,89b 4,77a 2,00c 9,33c 4,02b 0,97d 4,21c 1,10a 4,29c 1,77b 2,91b 2,71b 0,51c 8,79c 1,97b
HD25 173 59 11,41a 8,24a 59,64a 1,97b 5,00a 2,00c 10,20b 3,80b 1,10c 4,80b 1,25a 4,85b 2,27a 3,32a 2,55b 0,52c 10,95b 1,75c
HD25 176 60 11,40a 8,43a 59,02a 1,96b 4,00b 2,00c 10,00b 4,14b 1,02c 4,36c 1,16a 4,40b 1,84a 3,17a 2,51b 0,79c 9,316c 1,77c
HD25 178 61 11,82a 10,52a 66,69a 1,26c 3,77b 2,00c 9,98b 4,78b 1,05c 4,50b 1,07a 4,52b 1,62b 3,45a 2,97a 0,57c 12,57b 1,75c
HD25 180 62 11,41a 9,46a 57,58a 1,48c 2,99b 2,00c 9,91b 4,29a 1,00d 4,51b 1,07a 4,56b 1,77b 3,04b 2,93a 0,54c 9,65b 1,96b
HD25 182 63 10,77a 8,10a 53,56a 2,07b 3,75b 2,00c 9,88b 3,86b 1,03c 4,49b 1,13a 4,45b 2,00a 3,40a 2,57b 0,54c 9,47c 1,84b
HD25 185 64 10,85a 8,74a 60,52a 2,22b 3,28b 2,00c 10,47b 4,54a 1,03c 4,65b 1,16a 4,63b 2,01a 2,92b 2,80a 0,49c 9,12c 1,91b
89
Tabela 6. Continuação Progênie CF LF AF DC CEN NGP DF DCO LPE CPE LSE CSE LBR CBR TF1 TF2 CPED CA
HD25 186 65 12,11a 9,90a 60,11a 1,51c 5,50a 2,00c 10,40b 4,92a 0,96d 4,62b 1,09a 4,52b 1,99a 3,05b 2,57b 0,49c 8,23c 1,95b
HD25 187 66 10,94a 9,66a 59,68a 1,68b 4,44a 2,00c 10,20b 4,50a 0,96d 4,28c 1,06a 4,73b 1,53b 3,58a 2,58b 0,53c 8,36c 2,02b
HD25 188 67 10,00a 6,39a 36,40a 1,46c 4,13b 2,00c 9,22c 3,55b 0,91d 4,10d 0,95a 4,11c 2,06a 3,11b 2,55b 0,55c 7,80c 1,76c
HD25 189 68 10,53a 9,08a 57,51a 1,02c 3,13b 2,00c 10,55b 4,48a 1,01 4,55b 1,25a 4,65b 2,13a 3,61a 2,83a 0,56c 8,85c 2,10b
HD25 191 69 11,33a 7,96a 51,04a 1,25c 5,46a 2,00c 10,10b 4,51a 0,99d 4,43b 1,06a 4,55b 2,03a 3,30a 2,82a 0,59c 9,20c 1,84b
HD25 192 70 10,42a 9,36a 50,12a 1,71b 4,55a 2,00c 9,57c 4,48a 1,03c 4,15c 1,03a 4,16c 1,82a 3,32a 2,59b 0,50c 9,24c 1,97b
HD25 193 71 11,76a 10,63a 60,32a 1,14c 3,55b 2,00c 9,18c 4,30a 1,00d 4,10d 1,12a 4,00c 2,15a 4,00a 2,55b 0,57c 10,67b 1,55c
HD25 195 72 11,04a 8,92a 55,41a 1,93b 3,11b 2,00c 9,98b 4,33a 0,98d 4,46b 1,09a 4,46b 1,85a 3,45a 2,62b 0,60c 8,90c 1,80c
HD25 198 73 10,24a 7,77a 45,78a 1,74b 4,27a 2,00c 9,72c 3,87b 0,93d 4,18c 1,03a 4,36b 1,70b 3,13b 2,81a 0,55c 7,25c 1,76c
HD25 199 74 11,60a 8,78a 50,26a 1,33c 3,88b 3,00b 9,78c 4,38a 1,02c 4,35c 1,15a 4,45b 2,10a 3,65a 2,60b 0,55c 9,65b 1,82b
HD25 200 75 11,41a 8,92a 51,72a 1,66b 4,70a 2,00c 10,10b 5,00a 1,01c 4,43b 1,03a 4,33c 1,97a 3,40a 2,73a 0,58c 8,65c 1,63c
HD25 202 76 10,48a 9,43a 50,39a 1,40c 4,88a 3,00b 9,55c 3,88b 0,97d 4,20c 1,02a 4,22c 1,82a 3,05b 2,67b 0,57c 9,97b 1,75c
HD25 203 77 10,56a 8,63a 48,61a 1,32c 4,38a 2,00c 9,25c 4,10b 0,96d 4,00d 0,96a 4,18c 1,76b 2,98b 2,93a 0,50c 9,21c 1,76c
HD25 204 78 8,42a 8,42a 32,04a 0,99c 4,67a 2,00c 10,25b 4,40a 1,00d 4,50b 1,00a 4,50b 1,45b 3,10b 2,95a 0,50c 6,70c 1,85b
HD25 209 79 12,31a 8,06a 57,90a 1,08c 2,66b 2,00c 9,33c 4,48a 0,96d 4,21c 1,03a 4,22c 1,93a 3,06b 2,81a 0,57c 8,14c 1,90b
HD25 210 80 8,85a 7,82a 38,10a 1,42c 3,36b 2,00c 9,68c 4,49a 1,03c 4,32c 1,05a 4,23c 1,82a 3,07b 2,75a 0,58c 8,74c 1,94b
HD25 212 81 11,60a 11,42a 62,22a 1,17c 3,61b 2,00c 9,20c 4,00b 1,03c 4,13c 1,16a 4,10c 1,86a 3,56a 2,70b 0,60c 9,30c 1,73c
HD25 213 82 11,06a 8,81a 47,38a 1,36c 3,27b 2,00c 9,28c 3,72b 1,11b 4,06d 1,11a 4,08c 1,75b 3,20a 2,55b 0,55c 6,25c 1,50c
HD25 214 83 10,21a 7,86a 41,07a 1,30c 4,77a 2,00c 9,57c 4,27a 1,19b 4,37c 1,19a 4,32c 1,87a 3,47a 2,57b 0,55c 7,92c 1,72c
HD25 215 84 11,83a 9,543a 50,24a 1,07c 4,94a 2,00c 9,42c 4,10b 1,11b 4,20c 1,08a 4,18c 1,96a 3,55a 2,77a 0,66c 9,36c 1,85b
HD25 217 85 9,243a 8,49a 37,73a 1,13c 4,55a 2,00c 9,40c 4,02b 1,10c 4,18c 1,11a 4,21c 1,81a 3,48a 2,7b 0,53c 7,90c 1,91b
HD25 218 86 11,55a 11,29a 60,35a 0,96c 2,94b 2,00c 9,63c 3,90b 1,07c 4,14c 1,09a 4,17c 2,07a 3,70a 2,81a 0,56c 9,36c 1,76c
HD25 219 87 11,71a 9,93a 52,15a 0,92c 3,69b 2,00c 8,84c 4,12b 1,06c 3,97d 1,07a 3,98c 1,83a 3,24a 2,78a 1,11b 7,11c 1,61c
HD25 220 88 11,80a 10,00a 51,97a 1,19c 4,83a 2,00c 9,60c 4,10b 1,05c 4,25c 1,10a 4,05c 1,70b 2,95b 2,50b 0,60c 8,60c 1,85b
HD25 221 89 10,21a 8,87a 46,10a 1,15c 3,64b 2,00c 9,61c 4,25a 0,96d 4,20c 1,04a 4,32c 1,69b 3,03b 2,62b 0,55c 7,88c 1,74c
HD25 222 90 10,68a 9,733a 46,17a 1,02c 3,16b 2,00c 9,53c 4,03b 0,98d 4,00d 1,11a 4,21c 1,51b 3,35a 2,78a 0,66c 8,98c 1,86b
HD25 223 91 10,29a 10,84a 51,79a 1,08c 5,07a 2,00c 9,87b 4,01b 1,04c 4,29c 1,09a 4,4b 1,82a 2,78b 2,88a 0,64c 9,52c 1,91b
HD25 224 92 11,53a 10,65a 55,70a 1,03c 3,66b 2,00c 8,93c 3,78b 0,92d 3,72e 0,97a 3,70c 1,40b 2,82b 2,67b 0,60c 9,15c 1,92b
HD25 225 93 10,75a 10,07a 47,64a 1,37c 4,36a 2,00c 9,20c 4,13b 0,96d 4,30c 1,05a 4,03c 1,53b 2,71b 2,91a 0,51c 6,61c 1,77c
HD25 226 94 11,66a 9,796a 59,20a 1,36c 4,16b 2,00c 9,13c 4,60a 0,93d 3,95d 1,00a 4,02c 1,64b 2,99b 2,56b 0,59c 8,41c 1,70c
HD25 227 95 10,19a 9,12a 43,78a 1,03c 2,77b 2,00c 8,93c 4,38a 0,99d 4,02d 1,00a 4,02c 1,71b 3,04b 2,84a 0,54c 9,04c 1,77c
HD25 229 96 11,10a 9,50a 55,72a 1,08c 2,83b 2,00c 8,83c 4,13b 0,90d 3,90e 1,02a 3,92c 1,60b 2,87b 2,60b 0,63c 7,67c 1,93b
90
Tabela 6. Continuação Progênie CF LF AF DC CEN NGP DF DCO LPE CPE LSE CSE LBR CBR TF1 TF2 CPED CA
HD25 231 97 10,65a 8,19a 48,59a 1,41c 2,75b 2,00c 9,15c 4,20a 0,95d 4,20c 1,00a 4,25c 1,80a 3,30a 2,80a 0,58c 7,83c 1,85b
HD25 234 98 10,20a 9,24a 42,14a 1,07c 3,79b 2,00c 9,53c 4,30a 0,99d 4,35c 1,01a 4,15c 1,55b 2,89b 2,86a 0,61c 6,59c 1,55c
HD25 235 99 10,26a 7,11a 38,51a 1,29c 3,50b 2,00c 9,51c 4,57a 1,01c 4,12c 1,03a 4,21c 2,14a 3,51a 2,88a 0,64c 7,81c 1,79c
HD25 237 100 11,58a 10,98a 56,92a 1,13c 3,66b 2,00c 8,67c 4,37a 1,05c 3,83e 1,06a 3,83c 1,65b 2,98b 3,00a 0,55c 8,68c 2,08b
HD25 239 101 11,98a 9,14a 50,88a 1,36c 3,16b 2,00c 10,30b 4,38a 1,10c 4,51b 1,10a 4,48b 1,88a 3,23a 2,86a 0,65c 8,86c 1,95b
HD25 240 102 9,83a 7,47a 36,79a 0,80c 3,20b 2,00c 9,62c 4,00b 1,04c 4,08d 1,03a 4,25c 1,97a 3,27a 2,76a 0,58c 10,08b 1,83b
HD25 241 103 11,52a 9,72a 54,66a 1,11c 3,53b 2,00c 9,00c 4,00b 1,05c 4,25c 1,15a 4,20c 2,20a 3,30a 2,65b 0,55c 10,7b 1,65c
HD25 242 104 10,21a 8,70a 38,46a 1,30c 3,78b 2,00c 9,57c 3,83b 0,97d 4,29c 1,11a 4,52b 1,86a 3,48a 2,65b 0,51c 10,63b 1,88b
HD25 244 105 8,89a 6,65a 30,37a 1,25c 3,97b 2,00c 10,03b 3,98b 1,00d 4,15c 1,13a 4,35c 2,05a 2,06c 2,80a 0,53c 7,71c 2,03b
HD25 245 106 10,17a 9,43a 54,31a 1,22c 3,57b 2,00c 9,38c 4,05b 0,95d 4,17c 1,05a 4,32c 1,55b 3,42a 2,87a 0,60c 10,10b 1,92b
HD25 246 107 11,15a 9,04a 46,95a 1,25c 3,27b 2,00c 8,87c 3,70b 1,15b 4,11d 1,03a 4,21c 1,88a 3,35a 2,71b 0,60c 11,81b 1,91b
HD25 247 108 8,85a 7,30a 32,04a 1,30c 4,27a 2,00c 10,27b 4,72a 0,95d 4,61b 1,15a 4,60b 1,68b 3,31a 3,23a 0,55c 9,03c 1,80c
HD25 248 109 10,71a 9,01a 48,10a 1,22c 3,89b 2,00c 9,80c 4,25a 1,03c 4,36c 1,13a 4,38b 2,01a 3,18a 2,65b 0,56c 9,06c 1,96b
Valores médios seguidos da mesma letra nas colunas não diferem estatisticamente pelo agrupamento de Scott-Knott a 5% de probabilidade. Comprimento da folha (CF), largura da
folha (LF), área foliar (AF), diâmetro do caule (DC), comprimento entrenó (CEN), número de grânulos no pecíolo (NGP), diâmetro da flor (DF), diâmetro da corona (DCO), largura
da pétala (LPE), comprimento da pétala (CPE), largura da sépala (LSE), comprimento da sépala (CSE), largura da bráctea (LBR), comprimento da bráctea (CBR), tamanho dos
primeiros filamentos da corona (TF1), tamanho dos segundos filamentos da corona (TF2), comprimento do pedúnculo floral (CPED), comprimento do androginóforo (CA).
91
3.4 Parâmetros genéticos
Foi realizada separadamente para cada período de avaliação a estimativa dos
parâmetros genéticos para os genótipos (Tabelas 7 e 8). Verificou-se pelo teste F
(P<0,05), em ambos os períodos de avaliação, variabilidade genética entre os genótipos
avaliados para todas as características florais e vegetativas, exceto para comprimento de
folha e diâmetro do caule, no primeiro período (Tabela 7), e para comprimento e largura
de folha e área foliar no segundo período (Tabela 8), sendo que essas características
foram influenciadas pelo ambiente, de forma que foi observada valor igual a zero para a
variância genética (Tabelas 7 e 8). O coeficiente de variação ambiental é um indicador
na precisão da obtenção dos dados. Nesse sentido, observou-se valores de baixa a média
magnitude para a maioria das características florais, variando de 4,14 a 14,74 (Tabela
7), no primeiro período e 4,68 a 17,19, no seundo período (Tabela 8). Por outro lado, o
coeficiente de variação ambiental para as características vegetativas foi considerado de
média a alta magnitude, para ambos os períodos de avaliação (Tabelas 7 e 8).
Os valores do coeficiente de variação genética variaram entre 5,81% (CPE) a 17,
93% (CPED) no primeiro período de avaliação e 3,97% (LF) a 19,86% (DC), no
segundo período.
O índice de variação (IV) é um indicador da existência de variabilidade genética
entre indivíduos, no qual essa variabilidade é verificada quando os valores são iguais ou
maiores que a unidade (1,0). Em ambos os períodos de avaliação, os valores de IV
observados para as características florais foram maiores em relação às características
vegetativas. As características florais apresentaram valores superiores à unidade (1,0),
exceto para o diâmetro da corona (Tabela 7). Por outro lado, todas as características
vegetativas apresentaram valores de índice de variação inferiores à unidade nos dois
períodos de avaliação (Tabela 7 e 8).
No primeiro período de avaliação as estimativas das herdabilidade foram
consideradas altas para todas as características florais, acima de 74%. Observou-se
maior e menor valor de herdabilidade para as características TF2 (88,08%) e DCO
(74,30%), respectivamente. (Tabela 7). No segundo período de avaliação, os valores de
herdabilidade foram inferores comparado com o primeiro período, sendo que foi
verificado maior e menor valor de herdabilidade para as características DF (80,81%) e
LSE (52,85%), respectivamente. (Tabela 8). Para as características vegetativas foram
verificados baixos valores da herdabilidade, para ambos os períodos (Tabelas 7 e 8).
92
Tabela 7. Análise de variância e estimativas dos parâmetros genéticos para as características florais e vegetativas de genitores e híbridos
interespecíficos de Passiflora avaliadas no primeiro período.
FV GL
QM
DF DCO LPE CPE LSE CSE LBR CBR TF1 TF2 CPED CA CF LF AF DC CEN NGP
Blocos 2 0,32 0,04 0,00 0,06 0,00 0,03 0,00 0,01 0,01 0,00 8,97 0,03 20,00 11,58 606,03 0,01 3,26 0,05
Genótipos 118 1,11** 0,77** 0,01** 0,23** 0,02** 0,24** 0,12** 0,41** 0,10** 0,024** 8,03** 0,07** 6,67NS 4,14** 337,79* 0,13NS 2,07** 0,26**
Resíduo 236 1,79 0,19 0,00 0,04 0,00 0,03 0,02 0,05 0,02 0,00 1,48 0,01 6,95 2,70 254,72 0,10 1,04 0,10
Total 356
Parâmetros Genéticos
σ2f
σ2e
σ2g
h2
CVg
CVe
IV
DF DCO LPE CPE LSE CSE LBR CBR TF1 TF2 CPED CA CF LF AF DC CEN NGP
0,37 0,25 0,005 0,07 0,007 0,08 0,04 0,13 0,03 0,008 2,67 0,02 2,22 1,38 112,59 0,04 0,69 0,08
0,05 0,06 0,007 0,01 0,001 0,01 0,009 0,01 0,008 0,001 0,49 0,00 2,31 0,90 84,90 0,03 0,34 0,03
0,31 0,19 0,005 0,06 0,005 0,07 0,31 0,11 0,02 0,007 2,18 0,01 0,00 0,48 27,68 0,00 0,34 0,05
84,00 74,30 84,53 82,60 77,99 86,63 77,15 86,22 77,04 88,08 81,53 77,37 - 34,80 24,59 21,18 49,43 61,16
5,82 10,70 7,30 5,81 7,23 6,09 11,12 11,77 6,33 15,62 17,93 6,80 - 6,29 8,07 12,34 17,82 11,05
4,40 10,90 5,41 4,62 6,65 4,14 10,48 8,14 5,99 9,95 14,74 6,36 22,17 14,91 24,49 41,23 31,22 15,25
1,32 0,98 1,34 1,25 1,08 1,46 1,06 1,44 1,05 1,56 1,21 1,06 - 0,42 0,32 0,29 0,57 0,72
Fonte de variação (FV), grau de liberdade (GL), quadrado médio (QM), diâmetro da flor (DF), diâmetro da corona (DCO), largura da pétala (LPE), comprimento da pétala (CPE),
largura da sépala (LSE), comprimento da sépala (CSE), largura da bráctea (LBR), comprimento da bráctea (CBR), tamanho dos primeiros filamentos da corona (TF1), tamanho
dos segundos filamentos da corona (TF2), comprimento do pedúnculo floral (CPED), comprimento do androginóforo (CA), comprimento da folha (CF), largura da folha (LF),
área foliar (AF), diâmetro do caule (DC), comprimento entrenó (CEN), número de grânulos no pecíolo (NGP). Variância fenotípica (σ2f), variância experimental (σ2
e), variância
genotípica ((σ2g), herdabilidade (h2), coeficiente de variação genotípica (CVg), coeficiente de variação experimental (CVe), índice de variação (IV).
** Significativo a 1% pelo teste F *Significativo a 5% pelo teste F NS não significativo
93
Tabela 8. Análise de variância e estimativas dos parâmetros genéticos para as características florais e vegetativas de genitores e híbridos
interespecíficos de Passiflora avaliadas no segundo período.
FV GL
QM
DF DCO LPE CPE LSE CSE LBR CBR TF1 TF2 CPED CA CF LF AF DC CEN NGP
Blocos 2 1,93 0,54 0,00 0,08 0,00 0,21 0,13 0,46 0,08 0,00 2,16 0,00 13,33 24,66 1774,10 1,84 1,91 0,29
Genótipos 108 1,08** 0,58** 0,01** 0,25** 0,20** 0,24** 0,14** 0,31** 0,10** 0,03** 8,35** 0,09** 2,39 NS 4,37 NS 325,11 NS 0,38** 1,80** 0,28**
Resíduo 216 0,20 0,23 0,00 0,41 0,00 0,04 0,06 0,12 0,03 0,00 2,48 0,03 2,52 3,99 327,40 0,15 0,99 0,17
Total 326
Parâmetros Genéticos
DF DCO LPE CPE LSE CSE LBR CBR TF1 TF2 CPED CA CF LF AF DC CEN NGP
σ2f 0,36 0,19 0,004 0,08 0,006 0,80 0,04 0,10 0,03 0,01 2,78 0,03 0,79 1,45 108,37 0,12 0,60 0,09
σ2e 0,06 0,07 0,001 0,01 0,003 0,01 0,02 0,04 0,01 0,002 0,82 0,01 0,84 1,33 109,13 0,05 0,33 0,05
σ2g 0,29 0,11 0,003 0,07 0,003 0,06 0,02 0,06 0,02 0,008 1,95 0,02 0 0,12 0 0,07 0,27 0,03
h2 80,81 60,52 77,50 83,49 52,85 80,58 57,80 60,48 64,46 78,34 70,21 69,10 - 8,70 - 58,52 44,83 40,88
CVg 5,50 8,17 5,86 6,14 5,45 5,86 9,26 7,91 5,59 15,68 15,24 8,24 - 3,97 - 19,86 13,03 9,12
CVe 4,68 11,43 5,47 4,73 8,92 4,98 13,71 11,15 7,20 14,28 17,19 9,54 14,59 22,27 34,09 28,97 25,09 18,99
IV 1,18 0,71 1,07 1,29 0,61 1,17 0,67 0,71 0,77 1,09 0,88 0,86 - 0,17 - 0,68 0,52 0,48
Fonte de variação (FV), grau de liberdade (GL), quadrado médio (QM), diâmetro da flor (DF), diâmetro da corona (DCO), largura da pétala (LPE), comprimento da pétala (CPE),
largura da sépala (LSE), comprimento da sépala (CSE), largura da bráctea (LBR), comprimento da bráctea (CBR), tamanho dos primeiros filamentos da corona (TF1), tamanho dos
segundos filamentos da corona (TF2), comprimento do pedúnculo floral (CPED), comprimento do androginóforo (CA), comprimento da folha (CF), largura da folha (LF), área foliar
(AF), diâmetro do caule (DC), comprimento entrenó (CEN), número de grânulos no pecíolo (NGP). Variância fenotípica (σ2f), variância experimental (σ2
e), variância genotípica
((σ2g), herdabilidade (h2), coeficiente de variação genotípica (CVg), coeficiente de variação experimental (CVe), índice de variação (IV).
** Significativo a 1% pelo teste F *Significativo a 5% pelo teste F NS não significativo
94
No primeiro período de avaliação, a divergência genética entre os genótipos foi
atribuída à característica tamanho do segundo filamento da corona (TF2) (12,09%),
sendo essa a característica que mais contribuiu, seguida do comprimento de bráctea,
comprimento do pedúnculo floral. Enquanto no segundo período de avaliação a
característica que mais contribuiu também foi TF2 (9,13%), seguida pelo comprimento
e largura de pétala. Por outro lado, as características que menos contribuíram foram
comprimento de folha, área foliar e largura de folha, em ambos os períodos de avaliação
(Tabela 9).
Tabela 9. Contribuição relativa das características para a divergência entre os genótipos
nos dois períodos de avaliação.
Primeiro período Segundo período
Características %Relativa %Acumulada Características % Relativa % Acumulada
TF2 12,0930 12,0930 TF2 9,1353 9,1353
CBR 11,0603 23,1503 CPE 9,0743 18,2096
CPED 9,5831 32,7334 LPE 8,4991 26,7087
CSE 8,4522 41,1856 CPED 8,3333 35,042
LPE 7,4924 48,6780 CA 7,3600 42,402
TF1 6,9486 55,6266 TF1 6,3420 48,7444
CA 6,9215 62,5481 CBR 6,1159 54,8603
DCO 6,0132 68,5613 DF 6,0650 60,9253
DF 5,2190 73,7803 DCO 5,9376 66,8629
LBR 5,1469 78,9272 CSE 5,7326 72,5955
CPE 4,4052 83,3324 DC 5,1465 77,742
LSE 4,0746 87,4070 LBR 4,9643 82,7063
NGP 3,1118 90,5188 NGP 3,6250 86,3313
CEN 2,5359 93,0547 CEN 3,5697 89,901
DC 1,9643 95,0190 LSE 3,1405 93,0415
LF 1,9257 96,9447 LF 2,6164 95,6579
AF 1,7030 98,6477 AF 2,3273 97,9852
CF 1,3493 100,00 CF 2,0151 100,0003 Comprimento da folha (CF), largura da folha (LF), área foliar (AF), diâmetro do caule (DC), comprimento
entrenó (CEN), número de grânulos no pecíolo (NGP), diâmetro da flor (DF), diâmetro da corona (DCO),
largura da pétala (LPE), comprimento da pétala (CPE), largura da sépala (LSE), comprimento da sépala
(CSE), largura da bráctea (LBR), comprimento da bráctea (CBR), tamanho dos primeiros filamentos da
corona (TF1), tamanho dos segundos filamentos da corona (TF2), comprimento do pedúnculo floral (CPED),
comprimento do androginóforo (CA).
95
4 DISCUSSÃO
Os híbridos F1 resultantes do cruzamento entre Passiflora coccinea vs. P.
hatschbachii apresentam flores com pétalas e sépalas vermelhas, característica do
genitor feminino, P. coccinea. A maioria dos genótipos híbridos apresentaram corona
com filamentos branco e vermelho (sem bandamento), característica de P. coccinea. A
planta na sua grande maioria possui folhas trilobadas, característica de P. hatschbachii e
parte apresenta folhas simples, característica de P. coccinea. Os híbridos apresentam
flores com antese diurna, permanecendo abertas por cerca de 14h00, pois a abertura
floral ocorre às 8h00 da manhã e fecha por volta da 22h00. Em adição, os genótipos
híbridos são vigorosos e não apresentam nenhum sintoma de doenças, como antracnose
ou virose (JUNQUEIRA et al., 2005). São, portanto híbridos promissores para o
mercado de plantas ornamentais, podendo compor jardins sobre pérgulas ou muros,
visto que, são trepadeiras de médio porte.
O fato das espécies P. coccinea e P. hatschbachii pertencerem à mesma secção
taxonômica, Granadillastrum (FEUILLET; MACDOUGAL, 2004) e ambas
apresentarem 2n = 18 (MELO et al., 2014), são fatores importantes para a obtenção dos
híbridos interespecíficos HD25. Na maioria das vezes, os cruzamentos envolvendo
espécies mais próximas, normalmente espécies com mesmo número cromossômico são
bem sucedidos, fato observado nesse estudo e em outros cruzamentos envolvendo
espécies de Passiflora (JUNQUEIRA et al., 2008; MELO et al., 2016; SANTOS et al.,
2012).
Em programas de melhoramento a confirmação das hibridações por meio de
marcadores moleculares consiste em um procedimento importante. Pode-se inferir que
tal procedimento seja mais seguro que procedimentos com base em características
morfológicas, pois estes sofrem influência ambiental, epistasia (processo em que um
gene influencia a ação de outro, inibindo-o) e segregação genética (SANTOS 2008). A
utilização do marcador microssatélite apresenta algumas vantagens, pois permite a
confirmação de hibridações interespecíficas realizadas em estágios iniciais de
desenvolvimento das plantas híbridas e de forma confiável, cuja análise é baseada no
DNA, a qual não deixa dúvidas ao melhorista (FALEIRO et al., 2003).
A confirmação da fecundação cruzada nos híbridos HD25 foi realizada mediante a
análise da segregação de alelos SSR, a partir da análise de bandas informativas, cujas
bandas atuam como uma sequencia marcadora (BORÉM, 1998), sendo um
96
procedimento eficiente na confirmação da fecundação cruzada. A presença de apenas
um loco exclusivo em cada genitor nos híbridos é o suficiente para a exclusão da
hipótese da autofecundação (FALEIRO et al., 2003). Tal procedimento tem sido
relatado com êxito em cruzamentos envolvendo espécies de Passiflora (BELO et al.,
2018; CONCEIÇÃO et al., 2011; JUNQUEIRA et al., 2008; MELO et al., 2016;
SANTOS et al, 2012). A utilização do primer Pa07 na revelação do caráter híbrido já
havia sido reportado na confirmação de cruzamentos interespecíficos F1 (SANTOS et
al., 2012) e na confirmação de híbridos retrocruzados de Passiflora (MELO et al.,
2016).
As diferenças significativas entre os genitores e híbridos para a maioria das
características em estudo, bem como a estimativa das variâncias genotípicas, fenotípicas
e experimentais revelam a existência de ampla variabilidade genética entre elas, sendo
uma condição importante no melhoramento de plantas, pois permite a obtenção e
seleção de genótipos promissores (ALLARD, 1971). Em estudos visando à seleção de
genótipos superiores, a estimativa dos parâmetros genéticos, é um método relevante,
cujos componentes de variância possibilitam o conhecimento genético, a partir do
fenótipo, da característica e a capacidade para seleção (SANTOS et al., 2011).
Os coeficientes de variação experimental (CVe) indicam a precisão do
experimento e, quando são encontrados CVe inferiores a 10%, são considerados de
baixa magnitude, CVe variando de 10 % a 20 %, são de média a alta magnitude, de 20
% a 30 %, são altos e acima de 30 %, são considerados muito altos (PIMENTEL
GOMES, 2000). Os CVe encontrados neste estudo para as características florais são
considerados de baixa a média magnitude indicando precisão experimental. Porém, a
maioria das características vegetativas apresentaram CVe alto, revelando grande
influência do ambiente na manifestação destas características. De modo geral as
características vegetativas apresentam valores altos de CVe, como foi reportado para
área foliar em estudo anteriores em híbridos de Passiflora (BELO, 2010; MELO et al.,
2016; SANTOS et al., 2011).
O coeficiente de variação genotípica (CVg) pode inferir sobre amplitude de
variação genética de um caráter, sendo um parâmetro importante em programas de
melhoramento genético (VALOIS et al., 1980). De acordo com os critérios de
classificação de Sebbenn et al. (1998), CVg acima de 7% são considerados de alta
magnitude. Seguindo este critério, podemos inferir que há variabilidade genotípica entre
os indivíduos em estudo, visto que a maioria das características avaliadas apresentam
97
valores superiores a 7%. Os menores valores verificados para o CVg foram para as
características DF, LPE, LSE, CSE e TF1. Os híbridos interespecíficos obtidos do
cruzamento entre P. mucronata Lam. e P. edulis apresentam menores valores para
comprimento de pétala e sépala (FREITAS et al., 2015), sendo que estes descritores
apresentam variabilidade genética baixa. O CVg em híbridos retrocruzados de
Passiflora foi reduzido com apenas uma geração de retrocruzamento evidenciando
redução na variabilidade genética, em comparação com a F1, entre as progênies
retrocruzadas para todas a características nos dois períodos avaliados (MELO et al.,
2016).
Os nossos resultados evidenciam que as características florais são as que mais
contribuem para a divergência entre os genótipos. Neste sentido, a alta herdabilidade
para estas características possibilita a seleção de genótipos promissores, pois estas são
herdadas e expressas com menor influência dos fatores ambientais (FREITAS et al.,
2015), mostrando situação favorável para a seleção de genótipos visando a
ornamentação. Ao contrário as características vegetativas que apresentam baixos valores
de herdabilidade, revelando pouca variabilidade genética e influência ambiente na
expressão fenotípica, não sendo recomendados estes caracteres para a seleção (BELO,
2010; MELO, et al., 2016; SANTOS et al., 2011).
Em híbridos interespecíficos de Passiflora, foram encontrados altos valores de
herdabilidade para as características florais, sendo este um parâmetro que reflete
expectativa de ganhos genéticos, permitindo a escolha de métodos de seleção de forma
mais eficaz (BELO, 2010; FREITAS et al., 2015 SANTOS et al., 2011). De modo geral
as características florais apresentaram maiores valores de herdabilidade que as
características vegetativas. Porém, no segundo período de avaliação os valores de
herdabilidade foram de baixa a média magnitude comparada ao primeiro período de
avaliação para algumas características florais, como, DCO, LSE, LBR, CBR e TF1,
indicando que estas caracteristicas sofrem influência do ambiente e que para a seleção
de genótipos com base nestes caracteres precisará de métodos de melhoramento mais
elaborados.
A razão entre CVg/CVe é denominada de índice de variação (IV,), que é um
indicador utilizado para inferir sobre a obtenção de ganhos genéticos quando a situação
é favorável para a seleção, isto quando os valores são maiores que a unidade (1,0)
(VENCOVSKY, 1987). Neste estudo, o IV apresenta valores próximos ou acima da
unidade para a maioria das características florais. Neste sentido, podemos inferir que a
98
situação é favorável ao melhoramento destas características, principalmente para a
característica DF e CPE, que além de apresentar alto IV, apresentam alta herdabilidade
nos dois períodos de avaliação. Desta forma, esta situação mostra-se ser favorável ao
melhoramento de Passiflora ornamental, através de métodos de melhoramento simples,
como seleção massal (VIANA, et al., 2004). Baixos valores de IV foram verificados
paras as características vegetativas, também observados em outros estudos (FREITAS et
al., 2015; MELO et al., 2016; SANTOS et al., 2011). Neste caso, para os caracteres
vegetativos outros métodos de melhoramento devem ser aplicados, sobretudo por que
estas características apresentaram altos e baixos valores de CV e herdabilidade,
respectivamente.
Levando em consideração os dois períodos de avaliação, as caracteristicas DF,
LPE, CPE, CSE e TF2 permitem maior ganho por seleção, pois apresentam maiores
valores de herdabilidade e IV superior a unidade.
Através do método de agrupamento de Scott-Knott a 5% de probabilidade
podemos inferir que a grande maioria dos genótipos híbridos apresentam características
morfológicas intermediárias aos genitores. No entanto, alguns híbridos apresentam
valores superiores aos genitores para as características tamanho dos primeiros
filamentos da corona, largura de bráctea e diâmetro da corona, evidenciando híbridos
heteróticos, os quais podem ser selecionados para programas de melhoramento de
passifloras ornamentais, já que eles são potencialmente superiores. Alguns híbridos
apresentaram comprimento do androginóforo inferior aos genitores. Neste caso, estes
híbridos podem ser selecionados com base nesta característica, pois busca-se genótipos
com menor androginóforo, uma vez que facilita a polinização do maracujá por insetos
menores, o que influenciará consequentemente na produção (SIQUEIRA et al., 2009).
As características florais são importantes no processo de distinção infragenérica
de espécies de Passiflora, as quais podem ser agrupadas com base na similaridade
apenas do caráter tamanho de flor (TANGARIFE et al., 2009). Neste estudo, as
características florais foram capazes de discriminar os genótipos híbridos, uma vez que,
estas características contribuem com 87,40% da variância total observada no primeiro
período e 82,70% no segundo período de avaliação. Em progênies híbridas de P.
mucronata vs. P. edulis, as características da flor influenciaram na divergência genética
entre os genótipos (FREITAS et al., 2015), evidenciando que a análise destas
características são importantes em programas de melhoramento de passifloras
ornamentais.
99
5 CONCLUSÕES
A variabilidade genética identificada nos híbridos HD25, estimada com base em
características morfológicas e parâmetros genéticos, evidencia o potencial destes
genótipos para serem utilizados na ornamentação. Os maiores valores de herdabilidade
para as caracteristicas florais diâmetro da flor, largura de pétala, comprimento e largura
de sépala e tamanho da primeira série da corona possibilita a obtenção de ganhos e
realizar a seleção de genótipos.
A maioria dos genótipos híbridos apresentam características morfológicas
intermediárias aos genitores. Identificaram-se também híbridos que apresentam valores
superiores aos genitores para as características diâmetro da corona, tamanho dos
primeiros filamentos da corona e largura de bráctea evidenciando heterobeltiose.
6 AGRADECIMENTOS
À Professora Dra. Jôsie Cloviane de Oliveira Freitas da Universidade Estadual de
Goiás pela colaboração com as análises estatísticas. À professora Dra. Ioná Santos
Araújo, professora Dra. Simone Alves, ao doutorando Helison e pela disponibilidade
em nos auxiliar nas análises de eletroforese com gel de poliacrilamida. Ao doutorando
em Produção Vegetal Joedson Pinto Barroso e aos mestrandos em Produção Vegetal e
Genética, Aline Pinto e Jonathan Morales, respectivamente pelo auxílio nas avaliações
morfológicas das plantas. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES) pela concessão da bolsa e ao Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Universidade Estadual de Santa
Cruz (UESC) pelo apoio financeiro à pesquisa.
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104
CAPÍTULO 4
ANÁLISE DE DIVERGÊNCIA GENÉTICA EM HÍBRIDOS
INTERESPECÍFICOS DE Passiflora L. PELO MÉTODO WARD-MLM
RESUMO
O objetivo deste estudo foi estimar a divergência genética dos híbridos F1 obtidos do
cruzamento entre P. coccinea vs. P. hatschbachii e seus respectivos genitores através de
uma abordagem multivariada utilizando análise simultânea de variáveis qualitativas e
quantitativas pelo método Ward-MLM. Para isto, foram avaliados 22 descritores
morfológicos, sendo 18 quantitativos e quatro qualitativos, em dois períodos de
avaliação (verão e inverno). No primeiro período de avaliação, através do procedimento
da função da verossimilhança, os genótipos foram reunidos em quatro grupos e no
segundo período foram formados seis grupos. Em ambos os períodos de avaliação, os
grupos em que os genitores estavam incluídos, foram os grupos que apresentaram maior
dissimilaridade, primeiro período (grupo I e IV) e segundo período (grupo I e VI). As
duas primeiras variáveis canônicas explicaram 98,11% e 89,00% de toda a variação
observada no primeiro e segundo período de avaliação, respectivamente. Esse valor
revela que a utilização do gráfico bidimensional foi eficaz na representação da
divergência entre os grupos. Os resultados podem direcionar futuros cruzamentos entre
indíviduos do grupo I e IV, em ambos os períodos de avaliação, uma vez que estes
grupos apresentam os maiores valores para a grande maioria das características
quantitativas, principalmente as características relacionadas a flor. Com base nas
características florais, pode-se selecionar genótipos promissores, os quais propiciarão
ganhos de forma mais vantajosa. Para isto, os genótipos superiores do grupo I poderão
ser retrocruzados com o genitor feminino, que está incluído no grupo VI, com intuito de
obter plantas com potencial para a criação de novas variedades ornamentais.
Palavras-chave: Diversidade genética, melhoramento de plantas, análise multivariada,
modelo de locação modificado.
105
GENETIC DIVERGENCE ANALYSIS IN INTERESTPECIFIC HYBRIDS OF
Passiflora L. BY WARD-MLM METHOD
ABSTRACT
The objective of this study was to estimate the genetic divergence of the hybrids F1
obtained from the cross between P. coccinea vs. P. hatschbachii and their respective
parents through a multivariate approach using simultaneous analysis of qualitative and
quantitative variables by the Ward-MLM method. For this, 22 morphological
descriptors were evaluated, being 18 quantitative and 4 qualitative, in two evaluation
periods (summer and winter). In the first evaluation period, through the procedure of the
likelihood function, the genotypes were grouped into four groups and in the second
period six groups were formed. In both evaluation periods, the groups in which the
parents were included were the groups that presented the greatest dissimilarity, first
period (groups I and IV) and second period (groups I and VI). The first two canonical
variables explained 98.11% and 89.00% of all variation observed in the first and second
evaluation periods, respectively. This value reveals that the use of the two-dimensional
graph was effective in representing the divergence between the groups. The results may
direct future crosses between group I and IV subjects in both evaluation periods, since
these groups present the highest values for the great majority of the quantitative
characteristics, especially the flower-related characteristics. Based on the floral
characteristics, one can select promising genotypes, which will favor gains in a more
advantageous way. For this, the superior genotypes of group I may be backcrossed with
the maternal parent, which is included in group VI, in order to obtain plants with
potential for the creation of new ornamental varieties.
Keywords: Genetic diversity, plant breeding, multivariate analysis, modified lease
model.
106
1 INTRODUÇÃO
Muitas espécies da família Passifloraceae tem origem da Améria Tropical e o
Brasil é considerado um dos mais importantes centros de diversidade genética
(BERNACCI et al., 2013). As espécies de Passiflora são utilizadas principalmente na
alimentação, na indústria farmacêutica e cosmética e como planta ornamental, devido a
flores exuberantes que a grande maioria das espécies produzem.
Pelo fato do Brasil ser um dos maiores centros de diversidade de Passiflora, o
conhecimento da variabilidade genética e de populações segregantes por meio de
constituições alélicas distintas são de grande relevância para identificação de genótipos
promissores para iniciar programas de melhoramento genético (SILVA, 2015).
No melhoramento das espécies de Passiflora voltado para o mercado de plantas
ornamentais, a identificação de genótipos superiores é realizada com base em caracteres
de interesse ornamental (SANTOS et al., 2011), uma vez que grande parte das espécies
produzem flores belíssimas, de coloração e formas atrativas e folhagens bastante
diversificadas (ABREU et al., 2009). Esta variabilidade genética pode ser estimada com
base em descritores morfológicos, fisiológicos, bioquímicos e moleculares (AMARAL
JUNIOR et al., 2010), através de análises multivariadas que permitem identificar
diferenças entre os genótipos (SILVA, 2015).
Existe diversos métodos de análises multivariadas que têm sido empregados em
estudos de diversidade genética. Dentre estes métodos, tem-se o Ward-MLM (Ward-
Modified Location Model), proposto por Franco et al. (1998). Conhecido como método
da “Mínima Variância” (MINGOTI, 2005), este utiliza variáveis quantitativas e
qualitativas concomitantemente. O método de Ward possibilita a formação do número
ótimo de grupos através da homogeinidade presente nestes grupos (GONÇALVES et
al., 2009), sendo gerado um dendrograma o qual permite melhor visualização da
definição de grupos (ROSEMBURG, 1984).
O Ward-MLM tem sido utilizado em programas de melhoramento de algumas
culturas de interesse econômico, como em feijoeiro (BARBÉ et al., 2010; CABRAL et
al., 2010), tomateiro (GONÇALVES et al., 2008), bananeira (PEREIRA et al., 2012),
mamoeiro (LUZ et al., 2014), maracujazeiro (SANTOS, 2013) e em híbridos
retrocruzados de Passiflora, com o objetivo de verificar a variabilidade e a distância
genética entre os genitores e os híbridos RC1 (MELO et al., 2015).
107
Este trabalho objetivou estimar a divergência genética dos híbridos F1 obtidos do
cruzamento entre P. coccinea vs. P. hatschbachii e seus respectivos genitores através de
uma abordagem multivariada utilizando análise simultânea de variáveis qualitativas e
quantitativas pelo método Ward-MLM.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Material vegetal, condições de cultivo e condução do experimento
Por meio da análise multivariada foram avaliados 119 genótipos no primeiro
período de avaliação, sendo um genótipo de P. coccinea (genitor feminino), um
genótipo de P. hatshibachii (genitor masculino) e 117 híbridos obtidos do cruzamento
entre as espécies mencionadas. No segundo período foram avaliados 109 genótipos, os
genitores mais 107 genótipos híbridos, pois 10 híbridos não floresceram,
impossibilitando as avaliações.
As espécies utilizadas no cruzamento foram obtidas do Banco Ativo de
Germoplasma da UESC (BAG-Passifloras), localizado no campus da Universidade
Estadual de Santa Cruz (UESC), Ilhéus, Bahia. O experimento foi conduzido em
unidade experimental no campus da UESC (long 39 10‟W, lat 14 39‟ – S, alt 78m), no
delineamento em blocos casualizados (três blocos), sendo obtidos os dados da primeira
avaliação durante três meses (novembro de 2016 a janeiro de 2015) e o da segunda
avaliação durante quatro meses (julho de 2017 a outubo de 2017). Os genótipos foram
plantados em vasos de 25 L contendo solo, conduzidos em sistema deespaldeira
vertical, com mourões de 2,5 m de altura e fio de arame 1,8 m do solo. Foi adotado o
espaçamento de um metro entre plantas e dois metros entre fileiras. A poda foi realizada
mensalmente e a adubação a cada 15 dias, de acordo com a análise do solo: 38,33mg de
MAP purificado, 45,18 mg de ureia e 55,6 mg de sulfato de manganês, durante 6 meses
e após esse período utilizou-se 38,33 mg de MAP purificado, 41,38 mg de cloreto de
potássio, 99,53 mg de ureia e 111,1 mg de sulfato de manganês.
2.2 Descritores morfológicos
A caracterização morfológica dos genótipos foi realizada mediante descritores
morfológicos (Tabela 1), sendo 18 quantitativos e quatro qualitativos, totalizando 22
108
caracteres. Foram incluídos nas análises de acordo com descritores oficiais de
Passiflora ornamental (MAPA, 2008) e alguns ausentes na lista, com base no manual
prático da EMBRAPA (JESUS et. al., 2015). Os dados quantitativos foram obtidos com
auxílio de paquímetro digital e régua graduada.
Tabela 1. Descritores morfológicos quantitativos e qualitativos avaliados em genótipos híbridos e genitores
de Passiflora. Características Quantitativas Sigla
Diâmetro da flor DF
Diâmetro da corona DCO
Largura da pétala LPE
Comprimento da pétala CPE
Largura da sépala LSE
Comprimento da sépala CSE
Largura da bráctea LBR
Comprimento da bráctea CBR
Tamanho dos primeiros filamentos da corona TF1
Tamanho dos segundos filamentos da corona TF2
Comprimento do pedúnculo floral CPED
Comprimento do androginóforo CA
Comprimento de folha CF
Largura de folha LF
Área foliar AF
Diâmetro do caule DC
Comprimento do entrenó do ramo principal CEN
Número de glândulas no pecíolo NGP
Características Qualitativas
Profundidade do limbo foliar
1) Profunda
2) Média
3) Ausente
PFL
Antocianina no filete
1) Forte
2) Média
3) Fraca
4) Ausente
AF
Antocianina no estilete
1) Forte
2) Média
3) Fraca
AE
Bandamento na corona
1) Presente
2) Ausente
BAND
2.3 Análise estatística
A avaliação das características quantitativas foi com base em três repetições por
genótipo, sendo utilizados posteriormente para análise multivariada os valores médios.
Os valores referentes às características qualitativas utilizadas com base no Manual
109
Prático da EMBRAPA foram substituídos por números, sendo designados como dado
qualitativo no programa SAS.
A análise multivariada pelo método Ward-MLM foi utilizada para verificação da
divergência genética com base nas características quantitativas e qualitativas
concomitante com o auxílio do software SAS (SAS INSTITUTE, 2000). A função
logarítima de Gower (GOWER, 1971) foi utilizada para gerar a matriz de distância. A
melhor determinação de grupos foi obtida a partir dos critérios pseudo-F e pseudo-t2
combinados com o perfil da verossimilhança associado com o teste da razão da
verossimilhança (SAS INSTITUTE, 2000), sendo que o uso de dados quantitativos e
qualitativos pelo índice de Gower (1971) para a obtenção do índice de dissimilaridade
variante de 0 a 1 foi dada por:
Onde i e j correspondemaos indivíduos a serem comparados e k as
características; p = número total de características, e Sij = contribuição da característica
k para a distância total. No caso da característica sendo qualitativa, Sijk assume o valor
1, quando a concordância é positiva ou negativa para a característica k entre os
indivíduos i e j. No caso de característica quantitativa:
Onde Rk = amplitude de variação da variável K, tendo valores 0 e 1. O valor de
Wijk foi utilizado para definir as contribuições dos indivíduos Sijk. Assim, quando o
valor da variável k está ausente em um ou ambos os indivíduos Wijk = 0 ou no caso de
presença o valor é igual a 1.
110
3 RESULTADOS
3.1 Descrição morfológica
Os genitores e os híbridos F1 são classificados como trepadeiras, com hábito de
crescimento herbáceo e caule cilíndrico. Possuem folhas de coloração verde e sem
pilosidade. As variações observadas nas características quantitativas e qualitativas entre
os genitores (P. hatschbachii e P. coccinea) e alguns genótipos híbridos são
evidenciadas nas figuras 1 e 2.
Passiflora coccinea, genitor feminino, apresentou forma do limbo foliar
oblonga, divisão do limbo foliar inteira e ausência de sinus no limbo foliar. Enquanto P.
hatschbachii, genitor masculino, e os genótipos híbridos apresentaram forma do limbo
foliar partida, divisão do limbo foliar partido e sinus no limbo foliar, exceto HD25 190,
cujo híbrido apresentou-se igual ao genitor feminino (Figura 1G). Com relação à
profundidade do limbo foliar, foi verificada variação entre os genitores e genótipos
híbridos (média a profunda), exceto para P. coccinea (Figura 1 e Tabela 9). Os
genótipos híbridos apresentaram antese diurna, com abertura da flor às 8h00 e
fechamento por volta das 22h00, enquanto o genitor feminino, P. coccinea, possue
antese diurna e o genitor masculino, P. hatschbachii, antese noturna.
No estudo das características qualitativas em relação à flor, foi observada
coloração branca nas peças florais (pétalas e sépalas) para P. hatschbachii (Figura 2A) e
coloração vermelha para P. coccinea (Figura 2B) e para os genótipos híbridos (Figura
2B-J). Passiflora hatschbachii apresentou coloração branca para os primeiros
filamentos da corona (Figura 2A), enquanto que todos os híbridos apresentaram
coloração branca e vermelha (Figura 2C-J) característica de P. coccinea (Figura 2B).
Foi obsevada antocianina no androginóforo apenas no genitor feminino. Por outro lado,
verificou-se antocianina no filete e estilete no genitor feminino e nos híbridos, com
variação forte, fraca e média (Figura 2B-J). Não foi observado nos genitores
bandamento na corona, ao passo que, em alguns híbridos essa característica estava
presente (Figura 2I e J).
111
Figura 1. Diferença foliar entre genitores e genótipos híbridos. P. coccinea (A), P.
hatschbachii (B), HD25 138 (C), HD25 101 (D), HD25 244 (E), HD25 130 (F) e HD25
190 (G).
112
Figura 2. Flores dos genitores P. coccinea (A), P. hatschbachii (B) e dos genótipos
híbridos (C-J). Antocianina no estilete (C-E): HD25 118 - forte presença de antocianina
no estilete (seta) (C), HD25 102 - média presença de antocianina no estilete (seta) (D)
HD25 109 - fraca presença de antocianina no estilete (seta) (E). Antocianina no filete
(F-H): HD25 122 - forte presença de antocianina no filete (seta) (F), HD25 130 - média
presença de antocianina no filete (seta) (G), HD25 127 - fraca presença de antocianina
no filete (seta) (H); Bandamento na corona (I e J): HD25 238 - presença de bandamento
na corona (seta) (I) HD25 237 - ausência de bandamento na corona (seta) (J).
113
3.2 Análise multivariada
No primeiro período de avaliação, o método Ward-MLM foi eficaz para distinção
dos genótipos, por meio dos critérios pseudo-F e pseudo-t2, sendo possível a definição
de quatro grupos (Figura 3A) e no segundo período de avaliação foi estabelecido seis
grupos (Figura 3B). A formação dos grupos no primeiro período ocorreu devido ao
maior aumento da função de verossimilhança presente no grupo IV, com incremento de
177,96 (Tabela 2) e com incremento de 118,76 para o grupo VI no segundo período
(Tabela 3).
Figura 3. Função logarítmica da probabilidade (Log-likelihood) mostrando o número de
grupos formado pelo método Ward MLM em genitores e genótipos híbridos de
Passiflora no primeiro (A) e segundo (B) período de avaliação.
Tabela 2. Número de grupos formados com base na função logarítmica da probabilidade
(Log-Likelihood) e seu incremento para variáveis quantitativas em progênies híbridas de
Passiflora caracterizadas no primeiro período de avaliação. Número de grupos Log-Likelihood Incremento
1 -823.71 0.00
2 -764.79 58.91
3 -749.49 74.21
4 -571.53 252.17*
5 -534.25 289.45
6 -427.80 395.90
7 -464.85 358.85
8 0.00 823.71
9 0.00 823.71
* Maior incremento para a formação de quatro grupos pela função logarítmica.
114
Tabela 3. Número de grupos formados com base na função logarítmica da probabilidade
(Log-Likelihood) e seu incremento para variáveis quantitativas em progênies híbridas de
Passiflora caracterizadas no segundo período de avaliação. Número de grupos Log-Likelihood Incremento
1 -717.16 0.00
2 -705.73 11.42
3 -654.22 62.93
4 -664.89 52.27
5 -622.38 94.78
6 -503.61 213.54*
7 -494.06 223.09
8 -428.04 289.11
9 -420.67 296.49
10 -373.57 343.58
11 -353.85 363.30
* Maior incremento para a formação de seis grupos pela função logarítmica.
No primeiro período de avaliação, a análise dos dados morfológicos utilizando o
modelo Ward-MLM possibilitou a formação de quatro grupos homogêneos, o qual
separou os genótipos com base em suas semelhanças. O grupo I foi constituído por 11
genótipos híbridos mais o genitor masculino (P. hatschbachii), o grupo II, por 32
genótipos híbridos, o grupo III, por 44 genótipos híbridos, o grupo IV, por 30 genótipos
híbridos mais o genitor feminino (P. coccinea) (Tabelas 4 e 5). O grupo I conteve
genótipos com maiores valores para as características vegetativas, com exceção para CF
e AF (Tabela 4). O grupo II inclui genótipos com os maiores valores para DCO e TF1
(Tabela 4). Os genótipos pertencentes ao grupo III apresentam maior LBR, CBR, CA e
CF (Tabela 4). Enquanto o grupo IV apresentou os maiores valores para a maioria das
características florais (Tabela 4). Vale ressaltar que os maiores valores encontrados nos
grupos I e IV para as características vegetativas e florais, estão presentes os genitores
masculino e feminino, respectivamente (Tabelas 4 e 5).
115
Tabela 4. Médias das dezoito variáveis quantitativas para cada um dos quatro grupos
formados pelo método Ward-MLM e as duas primeiras variáveis canônicas (CAN) para
o primeiro período de avaliação em progênies híbridas F1 de Passiflora.
Grupos CAN
Variáveis I (12) II (32) III (44) IV (31) CAN1 CAN2
DF (cm) 9.34 9.42 9.54 9.96 -0.153692 -0.388494
DCO (cm) 4.10 4.23 4.20 3.78 0.015065 0.429337
LPE (cm) 0.95 0.94 0.96 0.98 -0.049720 -0.194215
CPE (cm) 4.19 4.29 4.32 4.50 -0.192504 -0.343101
LSE (cm) 1.02 1.04 1.07 1.08 -0.146040 -0.134709
CSE (cm) 4.22 4.31 4.34 4.51 -0.175506 -0.321304
LBR (cm) 1.45 1.58 1.63 1.58 -0.231421 0.084487
CBR (cm) 2.73 2.83 3.01 2.90 -0.159118 0.035077
TF1 (cm) 2.57 2.62 2.56 2.54 -0.000329 0.141507
TF2 (cm) 0.48 0.53 0.53 0.54 -0.188651 -0.081863
CPED (cm) 8.28 7.88 7.93 8.99 0.004366 -0.335544
CA (cm) 1.89 1.98 2.00 1.95 -0.172736 0.143297
CF (cm) 11.95 11.43 12.28 11.77 0.013885 0.035973
LF (cm) 11.54 10.64 11.40 10.67 0.153484 0.154096
AF (cm2) 71.58 58.33 63.71 71.74 0.194853 -0.508486
DC(cm) 0.81 0.80 0.75 0.77 0.056436 0.009133
CEN (cm) 3.68 3.24 3.29 3.12 0.167486 0.084211
NGP 3.00 2.00 2.00 2.00 0.979456 -0.028214
Diâmetro da flor(DF), diâmetro da corona(DCO), largura da pétala(LPE), comprimento da pétala(CPE),
largura da sépala(LSE), comprimento da sépala(CSE), largura da bráctea (LBR), comprimento da
bráctea(CBR), tamanho dos primeiros filamentos da corona(TF1), tamanho dos segundos filamentos da
corona(TF2), comprimento do pedúnculo floral(CPED), comprimento androginóforo (CA), comprimento
da folha(CF), largura da folha(LF), área foliar(AF), diâmetro do caule(DC), comprimento entrenó(CEN) e
número de glândulas no pecíolo (NGP).
116
Tabela 5. Grupos formados pelos métodos Ward-MLM para as dezoito variáveis
caracterizadas no primeiro período de avaliação em progênies híbridas F1 de Passiflora.
No segundo período de avaliação, a análise dos dados morfológicos possibilitou a
formação de seis grupos, o qual separou os genótipos com base em suas semelhanças. O
grupo I foi constituído por oito genótipos híbridos mais o genitor masculino (P.
hatschbachii), o grupo II, por 48 genótipos híbridos, o grupo III, por 16 genótipos
híbridos, o grupo IV, por 11 genótipos híbridos, o grupo V, por 24 genótipos híbridos e
o grupo seis composto apenas pelo genitor feminino (P. coccinea) (Tabelas 6 e 7). O
grupo I, o qual está presente o genitor masculino, apresentou os maiores valores para as
características CPED, LF, DC e CEN (Tabela 6). Em ambos os períodos de avaliação, o
menor CA foi observado nos genótipos contidos no grupo I (Tabelas 4 e 6). Os
genótipos do grupo II e IV não apresentaram nenhuma característica com valores
superiores aos demais grupos. O grupo III contém genótipos com maior LBR e NGP
(Tabela 6). O grupo V inclui genótipos com maior TF1 (Tabela 6). O grupo VI
apresentou os maiores valores médios para grande maioria das características florais,
exceto para DCO, LBR, TF1 e CPED (Tabela 6).
Grupos Genitores e genótipos F1
I HD25 131, HD25 148, HD25 127, HD25 128, HD25 135, HD25 139, HD25 199, HD25
209, HD25 219, HD25 154, HD25 220, P. hatschbachii.
II HD25 117, HD25 165, HD25 159, HD25 170, HD25 224, HD25 225, HD25 248, HD25
107, HD25 109, HD25 110, HD25 112, HD25 122, HD25 129, HD25 143, HD25 176,
HD25 188, HD25 189, HD25 192, HD25 193, HD25 197, HD25 198, HD25 203, HD25
214, HD25 215, HD25 218, HD25 222, HD25 223, HD25 227, HD25 229, HD25239,
HD25 240, HD25 244.
III HD25 146, HD25 125, HD25 157, HD25 242, HD25 162, HD25 186, HD25 151, HD25
101, HD25 103, HD25 105, HD25 114, HD25 119, HD25 124, HD25 126, HD25 130,
HD25 132, HD25 201, HD25 204, HD25 210, HD25 245, HD25 111, HD25 133, HD25
160, HD25 171, HD25 172, HD25 173, HD25 178, HD25 180, HD25 187, HD25 191,
HD25 195, HD25 202, HD25 208, HD25 212, HD25 231, HD25 234, HD25 237, HD25
102, HD25 106, HD25 213, HD25 226, HD25 235, HD25 238, HD25 247.
IV HD25 144, HD25 147, HD25 150, HD25 118, HD25 120, HD25 168, HD25 169, HD25
241, HD25 136, HD25 156, HD25 166, HD25 217, HD25 221, HD25 158, HD25 167,
HD25 182, HD25 185, HD25 104, HD25 141, HD25 161, HD25 163, HD25 200, HD25
246, HD25 152, HD25 138, HD25 153, HD25 140, HD25 115, HD25 116, HD25 142, P.
coccinea.
117
Tabela 6. Médias das dezoito variáveis quantitativas para cada um dos seis grupos
formados pelo método Ward-MLM e as duas primeiras variáveis canônicas (CAN) para
o segundo período de avaliação em progênies híbridas F1 de Passiflora.
Variáveis Grupos CAN
I (9) II (48) III (16) IV (11) V(24) VI(1) CAN1 CAN2
DF (cm) 9.94 9.69 9.59 9.96 9.52 13.62 0.374829 -0.577791
DCO (cm) 4.64 4.22 4.00 4.23 4.11 3.12 -0.422419 -0.035429
LPE (cm) 1.00 1.01 1.02 1.01 1.00 1.37 0.427679 -0.351350
CPE (cm) 4.40 4.30 4.28 4.33 4.22 6.23 0.397685 -0.583247
LSE (cm) 1.04 1.08 1.13 1.10 1.06 1.54 0.589864 -0.248413
CSE (cm) 4.38 4.35 4.35 4.43 4.24 6.27 0.455684 -0.551369
LBR (cm) 1.65 1.76 2.01 1.73 1.82 1.26 0.135577 0.485561
CBR (cm) 3.01 3.20 3.38 2.94 3.13 3.86 0.287562 -0.046711
TF1 (cm) 2.73 2.72 2.72 2.66 2.76 1.97 -0.286178 0.309602
TF2 (cm) 0.60 0.56 0.59 0.53 0.57 1.32 0.534995 -0.524133
CPED (cm) 10.50 8.84 9.99 8.63 9.10 5.69 -0.131187 0.209407
CA (cm) 1.61 1.83 1.81 1.79 1.90 2.71 0.490888 -0.245185
CF (cm) 10.71 10.56 11.02 11.60 11.10 12.12 0.277687 0.088560
LF (cm) 9.78 8.46 9.44 9.64 9.06 7.54 0.019400 0.235720
AF (cm2) 55.88 51.04 53.33 60.24 51.90 74.27 0.175809 -0.112781
DC(cm) 1.72 1.46 1.20 1.27 1.20 1.03 -0.385318 -0.240751
CEN (cm) 4.64 4.00 3.77 4.07 3.77 4.38 -0.150843 -0.208364
NGP 2.00 2.00 3.00 2.00 2.00 2.00 0.102621 0.140464
Diâmetro da flor(DF), diâmetro da corona(DCO), largura da pétala(LPE), comprimento da pétala(CPE),
largura da sépala(LSE), comprimento da sépala(CSE), largura da bráctea(LBR), comprimento da
bráctea(CBR), tamanho dos primeiros filamentos da corona(TF1), tamanho dos segundos filamentos da
corona(TF2), comprimento do pedúnculo floral(CPED), comprimento androginóforo (CA), comprimento da
folha(CF), largura da folha(LF), área foliar(AF), diâmetro do caule(DC), comprimento entrenó(CEN) e
número de glândulas no pecíolo (NGP).
Tabela 7. Grupos formados pelos métodos Ward-MLM para as dezoito variáveis
caracterizadas no segundo período de avaliação em progênies híbridas F1 de Passiflora. Grupos Genitores e genótipos F1
I HD25 150, HD25 158, HD25 141, HD25 161, HD25 170, HD25 200, HD25 160, HD25
178, P. hatschbachii.
II HD25 115, HD25 144, HD25 147, HD25 118, HD25 120, HD25 168, HD25 217, HD25
125, HD25 157, HD25 167, HD25 182, HD25 185, HD25 138, HD25 101, HD25 103,
HD25 105, HD25 114, HD25 119, HD25 124, HD25 126, HD25 130, HD25 132, HD25
204, HD25 210, HD25 245, HD25 131, HD25 133, HD25 172, HD25 187, HD25 195,
HD25 203, HD25 231, HD25 234, HD25 138, HD25 102, HD25 106, HD25 213, HD25
226, HD25 235, HD25 247, HD25 109, HD25 110, HD25 112, HD25 154, HD25 176,
HD25 192, HD25 198, HD25 214.
III HD25 241, HD25 242, HD25 152, HD25 111, HD25 127, HD25 128, HD25 173, HD25
199, HD25 202, HD25 212, HD25 219, HD25 116, HD25 189, HD25 193, HD25 218,
HD25 223.
IV HD25 129, HD25 148, HD25 146, HD25 169, HD25 156, HD25 165, HD25 166, HD25
221, HD 162, HD 186,
HD25 151, HD25 153.
V HD25 104, HD25 159, HD25 163, HD25 224, HD25 225, HD25 246, HD25 248, HD25
171, HD25 180, HD25 191, HD25 209, HD25 237, HD25 107, HD25 117, HD25 188,
HD25 215, HD 220, HD 222, HD 227, HD25 229, HD25 239, HD25 240, HD25 244.
IV P. coccinea
118
No primeiro período de avaliação, com base nas características qualitativas,
observou-se que os grupos I, III, IV apresentaram maior variação em relação à presença
de antocianina do estilete e filete, bem como bandamento na corona (Tabela 8). A
maioria dos genótipos avaliados apresentaram profundidade média do limbo foliar.
Apenas dois genótipos apresentaram profundidade do limbo foliar profunda e apenas
um genótipo apresentou ausência de limbo foliar, o genitor feminino (Tabela 8).
Verificou-se no grupo III maior porcentagem de genótipos com quantidade média de
antocianina no filete (75,00%), enquanto o grupo IV apresentou genótipos com
quantidades altas de antocianina no filete (74,41%) (Tabela 8). A maioria dos grupos
apresentaram quantidades fracas de antocianina no estilete, exceto o grupo IV, que
41,93% e 16,12% dos genótipos apresentaram quantidade média e forte de antocianina
no estilete, respectivamente (Tabela 8). 68,98% dos genótipos contidos nos grupos não
apresentaram bandamento na corona (Tabela 8). Apenas o grupo III apresentou 56,81%
dos genótipos com bandamento na corona (Tabela 8).
Tabela 8. Frequência absoluta das quatro características qualitativas em cada um dos
quatro grupos formados pelo modelo Ward-MLM para o primeiro período de avaliação
em progênies híbridas F1 de Passiflora. Grupos
Características I(12) II(32) III(44) IV(31)
Profundidade do limbo foliar: - - - -
Profunda 1 1 - -
Média 11 31 44 30
Ausente - - - 1
Antocianina no filete:
Forte 1 6 4 24
Média 8 - 33 3
Fraca 2 26 7 4
Ausente 1 - - -
Antocianina no estilete:
Forte 1 - 1 5
Média - 1 3 13
Fraca 11 31 40 13
Bandamento na corona:
Presente 1 - 25 11
Ausente 11 32 19 20
No segundo período de avaliação, verificou-se que os grupos I, II, III, IV e V
apresentaram maior variação em relação à presença de antocianina do estilete e filete e
bandamento na corona (Tabela 9). 100% dos genótipos contidos nos grupos III, V e VI
apresentaram média profundidade do limbo foliar. Os grupos I, IV e VI a maioria dos
genótipos apresentaram forte quantidade de antocianina no filete, enquanto que os
grupos II e V apresentaram genótipos com média quantidade de antocianina no filete
119
(Tabela 9). Observou-se que os genótipos apresentaram quantidade fraca de antocianina
no estilete para os grupos I, II e III (Tabela 9). Por outro lado, o grupo V apresentou
95,83% dos genótipos com quantidade média de antocianina no estilete (Tabela 9). A
maioria dos genótipos apresentaram ausência de bandamento na corona, com exceção
para o grupo II, o qual 58,33% apresentaram bandamento na corona (Tabela 9).
Tabela 9. Frequência absoluta das quatro características qualitativas em cada um dos
seis grupos formados pelo modelo Ward-MLM para o segundo período de avaliação em
progênies híbridas F1 de Passiflora. Grupos
Características I(9) II(48) III(16) IV(11) V(24) VI(1)
Profundidade do limbo foliar:
Profunda
Média
Ausente
-
9
-
1
47
-
-
16
-
1
10
-
-
24
-
-
-
1
Antocianina no filete:
Forte
Média
Fraca
Ausente
6
2
-
1
11
21
16
-
2
9
4
-
7
4
1
-
7
5
12
-
1
-
-
-
Antocianina no estilete:
Forte
Média
Fraca
1
-
8
2
7
39
-
2
13
2
9
1
1
23
-
1
-
-
Bandamento na corona:
Presente
Ausente
1
8
28
20
3
13
3
9
-
24
-
1
Na figura 4 é apresentado o gráfico referente as duas varáveis canônicas obtidas
utilizando a metodologia Ward-MLM, que juntas explicaram 98,11% (Figura 4A) e
89,00% (Figura 4B) de toda a variação observada no primeiro e segundo período de
avaliação, respectivamente. Esse valor revela que a utilização do gráfico bidimensional
foi eficaz na representação da divergência entre os grupos (Figura 4). De acordo com a
visualização gráfica foi possível observar os grupos de genótipos mais divergentes e os
mais similares. Para o primeiro período de avaliação, com base na primeira variável
canônica, verificamos que as características NGP (0,97) e LB (0,25) foram as que mais
contribuíram para a dissimilaridade entre os grupos (Tabela 5). De acordo com a
primeira variável canônica, a LS (0,58) e TF2 (0,53) foram às características que mais
contribuíram para a dissimilaridade entre os grupos no segundo período de avaliação
(Tabela 6).
120
Figura 4. Variáveis canônicas em genótipos de Passiflora: a) As duas primeiras
variáveis canônicas (CAN) para os quatro grupos formados pelo métodoWard-MLM
para variáveis quantitativas caracterizadas no primeiro período de avaliação em
genótipos híbridos de Passiflora; b) As duas primeiras variáveis canônicas para os seis
grupos formados pelo métodoWard-MLM para variáveis quantitativas caracterizadas no
segundo período de avaliação em genótipos híbridos F1 de Passiflora.
Através da análise das variáveis canônicas, no primeiro período de avaliação
observou-se a maior distância entre o grupo I e IV (376,82), os quais encontravam-se os
genitores masculino e feminino, respectivamente (Tabela 10). Dessa forma, os
genótipos híbridos apresentaram maior similaridade em relação aos genitores feminino e
masculino. Por outro lado, a menor distância foi observada entre os grupos II e III
(1,94) (Tabela 10).
Tabela 10. Distância entre os grupos formados pelo método Ward-MLM para variáveis
quantitativas avaliadas no primeiro período em progênies híbridas F1 de Passiflora.
Grupos I II III IV
I 0 357.97 361.31 376.82
II 0 1.94 15.69
III 0 13.83
No segundo período de avaliação, a análise gráfica das variáveis canônicas
revelaram maior dissimilaridade genética entre o grupo I e VI (621,08), os quais estão
incluídos os genitores masculino e feminino, e os demais grupos formados com base nas
características (Tabela 11). Menor distância foi verificada entre os grupos IV e V (8,04)
(Tabela 11).
121
Tabela 11. Distância entre os grupos formados pelo método Ward-MLMpara variáveis
quantitativas avaliadas no segundo período em progênies híbridas F1 de Passiflora.
Grupos I II III IV V VI
I 0 19.05 71.30 37.66 41.08 621.08
II 0 33.38 14.88 9.06 555.16
III 0 18.95 16.78 550.48
IV 0 8.04 549.09
V 0 562.84
4 DISCUSSÃO
Estudos de divergência genética têm grande importância para o melhoramento
genético em espécies de Passiflora, pois revela a diferenciação de genótipos, que está
relacionada com a variabilidade genética (SANTOS et al., 2011). Neste estudo, a
utilização de características morfológicas quantitativas e qualitativas,
concomitantemente através da abordagem Ward-MLM permitiu a definição de quatro e
seis grupos. A dissimilaridade observada no primeiro e segundo período de avaliação,
respectivamente, indica que estas características são eficazes para a diferenciação de
genitores e híbridos.
A formação do número de grupos pode está relacionada ao número de acessos,
espécies, genótipos, as características avaliadas, como tipo e quantidade (GONÇALVES
et al., 2009), ou o período de avaliação, como neste estudo onde a avaliação
morfológica foi realizada em dois períodos diferentes (verão e inverno). O método
Ward-MLM tem sido utilizado em algumas culturas de importância econômica, como
em maracujazeiro, (SANTOS 2013), tomateiro (GONÇALVES et al., 2009) e
mamoneira (OLIVEIRA, 2013).
Nesse estudo, em ambos os períodos de avaliação o grupo o qual o genitor
feminino está presente foi o que obteve os maiores valores para a maioria das
características florais, incluindo o DF, LP, CS, LS e CS, característica estas que são de
interesse ornamental. Desta forma, pode-se selecionar genótipos do grupo IV obtidos no
primeiro período de avaliação, uma vez que a seleção de genótipos pode ser com base
em caracteres quantitativos e qualitativos. Com o objetivo de estudar a diversidade
genética entre 11 espécies de Passiflora, Paiva et al. (2014), observaram que o grupo o
qual a espécie P. coccinea estava incluída, apresentou maiores médias para o diâmetro
122
da flor, comprimento da pétala, sépala, bráctea e androginóforo, fato também verificado
em ambos os períodos de avaliação.
No grupo I está contido genótipos que além de apresentarem maior DF, LP, CS,
LS e CS, também contem genótipos com bandamento na corona. Estas características
que agregam valor ornamental, possibilitando a seleção de genótipos voltados para o
melhoramento de plantas ornamentais (MELO et al., 2015). Em híbridos F1
retrocruzados (RC1) de Passiflora, a seleção de plantas também foi baseada nos
descritores quantitativos e qualitativos de forma conjunta, sendo que muitos genótipos
retrocruzados apresentaram potencial para uso ornamental e que também poderiam ser
utilizados no desenvolvimento de novas variedades (MELO et al., 2015).
Nas espécies de Passiflora, o comprimeno do androginóforo é considerada uma
característica relevante nas avaliações, pois está relacionada à polinização, e
consequentemente à produção (SANTOS, 2013). Neste estudo, em ambos os períodos
de avaliação, o comprimento do androginóforo foi menor nos genótipos incluídos no
grupo I. O androginóforo menor facilita a polinização, principalmente por insetos
menores, uma vez que a distância entre o estigma e a corona é minimizada (SIQUEIRA
et al., 2009).
Em ambos os períodos de avaliação, verificou-se menor similaridade entre os
grupos em que os genitores estão inseridos, indicando que os descritores utilizados na
análise são eficientes para o estudo da divergência genética nos genótipos híbridos e
genitores. Por outro lado, a maioria dos genótipos híbridos encontra-se nos grupos em
que os genitores não estão presentes, indicando que estes genótipos apresentam
características mais distantes dos genitores. No primeiro período de avaliação, há várias
diferenças encontradas entre o grupo I e IV que favoreceu para menor similaridade entre
esses grupos. Dentre elas, o diâmetro da flor, tamanho do segundo filamento da corona
e bandamento na corona, em que os genótipos contidos no grupo I possuem flores
menores, com menor comprimento do segundo filamento da corona e genótipos com
bandamento da corona ausente. Enquanto o grupo IV caracterizou-se por apresentar
flores grandes, com maior comprimento do segundo filamento da corona e genótipos
com bandamento da corona. No segundo período de avaliação, as diferenças
encontradas entre o grupo I e VI que favoreceu para menor similaridade foram
basicamente às mesmas para o primeiro período.
Em programas de melhoramento, o conhecimento das distâncias entre os grupos é
importante, pois auxilia na seleção de genitores adequados à obtenção de híbridos com
123
maior efeito heteróticos, além de poder recuperar segregantes em gerações avançadas
(CRUZ, 2006). A partir de descritores morfológicos, foi realizada análise de diversidade
genética, em híbridos interespecíficos com potencial ornamental, para identificar a
variabilidade genética e a distância entre os genótipos híbridos e seus genitores. Neste
estudo foi observado maior similaridade entre o genitor masculino e a progênie híbrida
(SANTOS et al., 2011). Em híbridos RC1 de Passiflora, a menor similaridade ocorreu
entre o genitore recorrente e os genótipos RC1 em ambos os períodos de avaliação
(MELO et al., 2015).
Com base na elevada porcentagem das duas primeiras variáveis canônicas foi
escolhido o gráfico bidimensional. Estas duas primeiras variáveis canônicas explicam
98,11% e 89,00% da variação, no primeiro e segundo período de avaliação,
respectivamente, evidenciando que este tipo de gráfico é mais indicado para a explicar
as relações entre os grupos e entre os genótipos dentro dos grupos (CABRAL et al.,
2010). Este fato também foi observardo em outras espécies de Passiflora, no qual as
duas primeiras variáveis canônicas explicaram 91,65% da variação total em genótipos
híbridos obtidos do cruazamento entre Passiflora edulis vs. P. setacea obtidas pelo
método Ward-MLM (SANTOS, 2013). As duas primeiras variáveis canônicas por meio
da metodologia Ward-MLM explicaram 95% da variação total em Ricinus communis L.
(OLIVEIRA et al., 2013). Quando as duas primeiras variáveis canônicas encontram-se
acima de 80% da variação total, a interpretação da variabilidade entre os genótipos é
satisfatória (CRUZ; CARNEIRO, 2006), assim como ocorreu neste estudo. Por outro
lado, as variáveis canônicas podem ser representadas em gráfico tridimensional. Isto
ocorre, quando as duas primeiras variáveis canônicas não explicam a variabilidade total,
sendo necessária inserir a terceira variável. Este fato, foi obeservado em Psidium
guajava L., no qual as duas primeiras variáveis foram responsáveis por 61,79%, sendo a
primeira responsável por 39,12% e a segunda por 22,68%. Porém, com a introdução da
terceira variável canônica (19,50%), obteve-se 81,30% da variação total, o que explicam
grande porcentagem da variação (CAMPOS et al., 2013).
5 CONCLUSÕES
De acordo com as características morfológicas existe diversidade genética entre os
genótipos híbridos e as espécies genitoras, que pode ser explorada em programas de
melhoramento de Passiflora ornamental.
124
Estes resultados podem direcionar futuros cruzamentos entre indíviduos do grupo
I e IV, em ambos os períodos de avaliação, uma vez que estes grupos apresentam os
maiores valores para algumas características quantitativas, principalmente as
características relacionadas a flor.
A partir das características florais, pode-se selecionar genótipos promissores, os
quais propiciarão ganhos de forma mais vantajosa com base em sua seleção. Para isto,
os genótipos superiores do grupo I poderão ser retrocruzados com o genitor feminino,
que está incluído no grupo VI, com intuito de obter plantas ainda mais promissoras.
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127
CAPÍTULO 5
CITOGENÉTICA COMPARATIVA E HIBRIDAÇÃO IN SITU PARA A
DETERMINAÇÃO DO CARÁTER HÍBRIDO DE PROGÊNIE
INTERESPECÍFICA F1 DE Passiflora (P. coccinea vs. P. hatschbachii)
RESUMO
Este estudo teve como objetivo caracterizar o cariótipo e confirmar a hibridação
interespecífica em 16 híbridos oriundos do cruzamento entre P. coccinea Aubl. vs. P.
hatschbachii Cervi, mediante combinação de técnicas de citogenética clássica e
molecular. Para isto foi utilizado a coloração convencional para analises cariotípicas; foi
realizado a técnica de bandamento CMA3/DAPI para identificação das regiões ricas em
GC e AT, foi aplicado a Hibridação Genômica In Situ (GISH) usando as sondas de
ambos os genitores, sem adição do DNA de bloqueio, para detecção dos genomas
parentais nos híbridos e foi utilizado a Hibridação In Situ Florescente (FISH) para
localização de sítios de DNA Sat e 5S para confirmação de paternidade. Os híbridos
apresentaram o mesmo número cromossômico que as espécies genitoras, 2n = 18. A
análise com os fluorocromos CMA3/DAPI possibilitou a visualização de
heterocromatina rica em GC, cuja região corresponde aos satélites (constrição
secundária), os quais não foram visualizadas através da coloração convencional
utilizando Giemsa 4%. A GISH permitiu a distinção dos genomas de cada genitor nos
16 híbridos. Em P. coccinea, através da FISH os cromossomos marcadores foram
identificados no quinto e sexto par, e no terceiro e sétimo par em P. hatschbachii, os
quais correspondem os sítios DNA Sat e DNAr 5S, respectivamente. Estes marcadores
cromossômicos foram observados em todos os híbridos analisados, indentificando os
genomas do genitores na progênie híbrida F1. A aplicação das sondas de DNA
genômico e ribossômico possibilitou a diferenciação dos cromossomos das espécies
genitoras no genoma dos híbridos interespecíficos F1, demonstrando que o uso
simultâneo é ainda mais efetivo na confirmação da fecundação cruzada e estas técnicas
podem ser adotadas em programas de melhoramento de Passiflora. A GISH e a FISH
além de permitirem a confirmação das hibridações, permite a visualização de
estabilidade entre os genomas genitores nos híbridos pela ausência de translocações
entre genomas e a não visualização de modificações genômicas de âmbito citológico.
Palavras–chave: Hibridação interespecífica, citogenética clássica, citogenética
molecular, GISH, FISH.
128
COMPARATIVE CYTOGENETICS AND IN SITU HYBRIDIZATION FOR
THE DETERMINATION OF THE INTERPRETED PROGENETIC HYBRID
CHARACTER F1 OF Passiflora (P. coccinea vs. P. hatschbachii)
ABSTRACT
This study aimed to characterize the karyotype and to confirm interspecific
hybridization in 16 hybrids from the cross between P. coccinea Aubl. vs. P.
hatschbachii Cervi, by combining classical and molecular cytogenetic techniques. For
this, conventional staining was used for karyotypic analyzes; the CMA3/DAPI banding
technique was used to identify the regions rich in GC and AT, the Genomic In Situ
Hybridization (GISH) was applied using the probes of both parents, without addition of
the blocking DNA, to detect the parental genomes in the hybrids and Flourescent In Situ
Hybridization (FISH) was used to locate DNA Sat and rDNA 5S sites for confirmation
of paternity. The hybrids presented the same chromosomal number as the genitor
species, 2n = 18. The analysis with the fluorochromes CMA3/DAPI allowed the
visualization of heterochromatin rich in GC, whose region corresponds to the satellites
(secondary constriction) which was not possible through coloration using Giemsa 4%.
GISH allowed the genome distinction of each parent in the 16 hybrids. In P. coccinea,
the marker chromosomes were identified in the fifth and sixth pair, and in the third and
seventh pair in P. hatschbachii, which correspond to the DNA Sat and rDNA 5S sites,
respectively. These chromosomal markers were observed in all hybrids analyzed,
identifying the genomes of the parents in hybrid F1. The application of the genomic and
ribosomal DNA probes allows the differentiation of the chromosomes of the genitor
species in the genome of interspecific hybrids F1, demonstrating that the simultaneous
use is even more effective in the confirmation of cross fertilization and these techniques
can be adopted in Passiflora breeding programs. GISH and FISH, besides allowing the
confirmation of the hybridizations, allows the visualization of stability between the
genomes of the genomes in the hybrids by the absence of translocations between
genomes and the non-visualization of genomic modifications of cytological scope.
Keywords: Interspecific hybridization, classical cytogenetics, molecular cytogenetics,
GISH, FISH.
129
1 INTRODUÇÃO
O gênero Passiflora L. é considerado o maior e mais importante dentro da família
Passifloraceae, por apresentar um grande número de espécies (CERVI; IMIG, 2013), as
quais produzem flores de beleza única, com características (formas, tamanhos, cores e
presença da corona) que confere potencial ornamental (ABREU 2009). As espécies
deste gênero para uso ornamental têm sido exploradas de forma mais significativa nos
Estados Unidos, Japão e em alguns países da Europa (BERNACCI et al., 2013). No
Brasil, o interesse destas espécies para ornamentação está sendo aos poucos ampliado,
com o desenvolvimento de híbridos ornamentais com flores peculiares que atendam a
diferentes ambientes (BELO, 2010; CONCEIÇÃO et al. 2011; SANTOS et al., 2012,
ULMER; MACDOUGAL, 2004).
A hibridação interespecífica entre espécies silvestres de Passiflora é uma
estratégia relevante nos programas de melhoramento de plantas não apenas para
transferência de genes de uma espécie resistente para uma suscetível, como também na
produção de híbridos ornamentais, cuja estratégia visa plantas com características
únicas e com vigor híbrido (SANTOS, 2008).
A identificação de híbridos pode ser realizada através de diversas técnicas, desde
as mais simples, com base em características morfológicas (OLIVEIRA et al., 2005) até
as mais sofisticadas, envolvendo marcadores moleculares, análises citogenéticas
clássica e molecular. Do ponto de vista da análise de citogenética molecular, a
Hibridação Genômica In Situ (GISH) é eficiente na distinção de genomas e possibilita a
identificação de híbridos naturais e artificiais (SILVA; SOUZA, 2013). Esta técnica
consiste no uso do DNA genômico total de uma espécie como sonda e na aplicação de
DNA de bloqueio da outra espécie, possibilitando a distinção de ambos os genomas das
espécies genitoras no híbrido (SILVA; SOUZA, 2013). Na aplicação da GISH para
identificação de híbridos, também pode ser utilizado simultâneamente duas sondas,
sendo as sondas de ambos os genitores (MELO et al., 2015), a qual é chamada de GISH
multicolor (LI et al., 2001; XIONG et al., 2006).
Outra técnica citogenética molecular útil para a confirmação de híbridos é a
Hibridação In Situ Fluorescente (FISH), a qual localiza sequências específicas no
genoma, como sítios de DNA ribossômicos 45S e 5S e sítios teloméricos (MELO;
GUERRA, 2003; MELO et al., 2011; MELO et al., 2017; SILVA et al., 2017 in press).
130
Esses sítios servem como marcadores cromossômicos específicos para distinção dos
genomas das espécies genitoras em plantas híbridas (SILVA; SOUZA, 2013).
O uso das técnicas citogenéticas moleculares no estudo de hibridações em
espécies de Passiflora é considerado recente, sendo o primeiro relato em 2015 apenas
da FISH, utilizando a sonda de DNAr 45S e 5S (MELO et al., 2015). Porém, estão
sendo desenvolvidos estudos com o gênero na aplicação da FISH e GISH na
confirmação de paternidade de híbridos (COELHO et al 2016; MELO et al., 2017;
SILVA et al., 2017 in press). Do ponto de vista do melhoramento de plantas, as análises
citogenéticas são muito importantes para caracterização de germoplasma, pois o
melhoristas pode selecionar genótipos estáveis cariotipicamente e sem variações
meióticas, já que estes fatores podem afetar a reprodução e a produção (GUERRA et al.,
2013).
O uso da citogenética clássica, através da coloração com Giemsa, possibilita o
conhecimento do cariótipo, como tamanho, número e morfologia de cromossomos além
de permitir a identificação da localização de satélites, em determinadas situações
(MELO, et al., 2011). Os fluorocromos CMA3 (cromomicina A3) e DAPI (4 ', 6-
diamidino-2-fenilindole) são bastante úteis para a identificação de heterocromatina rica
em GC e AT. Em Passiflora as regiões ricas em GC são restritas a Região Organizadora
de Nucléolo (RON) (MELO et al., 2014). Desta forma, auxilia na identificação dos
satélites que podem ser utilizados na identificação de híbridos (ORTOLONI et al.,
2007; COELHO et al 2016).
Este estudo teve como objetivo caracterizar o cariótipo e confirmar a hibridação
interespecífica em híbridos oriundos do cruzamento entre P. coccinea vs. P.
hatschbachii, mediante citogenética clássica e molecular. Para isto foi aplicado a GISH
usando as sondas dos genitores para detecção dos genomas parentais nos híbridos e foi
utilizado a FISH para localização de sítios de DNA Sat e DNAr 5S como marcadores
cromossômicos.
131
2 MATERIAL E METODOS
2.1 Material vegetal
Foram realizadas análises citogenéticas nos genitores P. coccinea e P.
hatschbachii e em 16 híbridos interespecíficos, cuja progênie foi denominada de HD25
(HD25 101, HD25 106, HD25 109, HD25 125, HD25 133, HD25 140, HD25 143,
HD25 156, HD25 187, HD25 190, HD25 218, HD25 224, HD25 237, HD25 238, HD25
244, HD25 245). Foram escolhidos estes híbridos para análise pelo fato deles
apresentarem algumas diferenças na morfologia floral (flores com mancha nas sépalas,
cor da flor mais intensa, bandamento na corona) e diferenças no aspecto da planta
(Figura 1). As espécies genitoras e os híbridos foram mantidos em condições de campo,
localizado no Campus da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), no município
de Ilhéus, Bahia (long 39 10‟W, lat 14 39‟ – S, alt 78m).
132
Figura 1. Amostra representativa de híbridos interespecíficos F1 obtida do cruzamento
entre Passiflora coccinea (A) (genitor materno) vs. P. hatschbachii (B) (genitor
paterno), evidenciando diferenças na morfologia floral: (C) HD25 140 - flor com
aspecto normal, (D) HD25 143 - manchas nas sépalas (seta), (E) HD25 238 -
bandamento nos primeiros filamentos da corona (seta), (F) HD25 245 - flor
apresentando coloração mais intensa. (G) Aspecto da planta do híbrido HD25 143, (H-J)
Diferença na morfologia foliar: (H) Folha de P. coccinea, (I) Folha do híbrido HD25
244, (J) Folha de P. hatschbachii.
133
2.2 Preparo de lâminas
As radículas foram coletadas com aproximadamente um centímetro de
comprimento, proveniente de estacas mantidas em sacos plásticos de polietileno
contendo areia lavada. O material foi pré-tratado com 8-hidroxiquinolina (8-HQ) a
0,002 M por uma hora em temperatura ambiente (TA) e mais 21 h a ± 8-10 ºC, lavadas
duas vezes em água destilada e fixadas em Carnoy (etanol:ácido acético glacial [3:1],
v/v; JOHANSEN, 1940) por 3 h em TA, depois foram mantidas a -20 °C até sua
utilização. O preparo citológico das lâminas seguiu o protocolo proposto por Guerra e
Souza (2002), no qual foram feitas duas lavagens em água destilada nos ápices de raízes
e em seguida digeridas com o uso da solução enzimática de 2% celulase e 20%
pectinase (w/v) incubadas em estufa a 37º C por uma hora e 20 minutos. Após esse
período as raízes foram lavadas novamente com água destilada para retirada da enzima
e em seguida maceradas em 6 μl de ácido acético 45% com auxílio de agulhas. Foi
depositado sobre o material lamínula 18 x 18 e com a ajuda da pinça e papel de filtro foi
feito o espalhamento do material biológico. Utilizando o papel de filtro foi feito uma
pressão com o dedo de forma delicada sob a lamínula para espalhamento dos
cromossomos. Posteriormente, as lâminas foram mantidas em nitrogênio líquido por no
mínimo 5 minutos e então foi retirada a lamínula com auxílio de um bisturi e logo secas
ao ar. As lâminas analisadas e que apresentaram boas metáfases foram mantidas a -20
°C até a aplicação das técnicas.
2.3 Coloração convencional e análise com fluorocromos CMA3 e DAPI
Foi realizada a coloração convencional seguindo o protocolo proposto por Guerra
e Souza (2002) para o estabelecimento do número cromossômico, com modificações,
em que o material foi corado com Giemsa 4% (Merck®) por 20 minutos, com posterior
lavagem em água destilada e seca ao ar. Após esse período foi realizado a montagem
com lamínula em meio Neomount (Merck®).
Foram usados os fluorocromos CMA3 e DAPI para identificação da
heterocromatina rica em GC e AT, respectivamente. O procedimento da dupla coloração
CMA3/DAPI seguiu o protocolo proposto por Guerra e Souza (2002), com modificação
na concentração do CMA3, que consistiu na aplicação de 15 μl desse fluorocromo
(0,125 mg/ml) sobre as lâminas por uma hora, lavadas com água destilada e secas. Em
134
seguida em cada lâmina foi aplicado 15 μl de DAPI (0,5 mg/ml) por meia hora, lavadas
e secas. Posteriormente as lâminas foram montadas com 15 μl do meio de montagem
glicerol/Macllvaine (1:1 v/v) usando uma lamínula de 20 x 20 mm e envelhecidas por
três dias para posterior análise.
As metáfases foram fotodocumentadas com a utilização do microscópio de
epifluorescência Olympus BX41 equipado com câmera digital de 5M Olympus DP25
pelo software DP2-BSW. O CMA3 foi detectado com filtro U-MWV (450-480nm de
exitação) e o DAPI foi detectado com filtro U-MWU (330-385nm de excitação).
2.4 Extração do DNA e produção das sondas para GISH e FISH
Para o procedimento da GISH, foi realizada a extração do DNA genômico dos
genitores de acordo com o protocolo proposto por Doyle e Doyle (1990), com algumas
modificações (MELO et al., 2015), sendo coletadas folhas jovens em duplicata,
maceradas em nitrogênio líquido, colocadas em tampão de extração CTAB 2% [NaCl a
1,5 M; EDTA a 20 mM; Tris-HCl a 100 mM; B-Mercaptoetanol a 0,2%]. Os ácidos
nucleicos foram isolados com solução (24:1) clorofórmio: álcool isoamílico e a
ressuspensão do DNA foi realizada em tampão TE [Tris a 10 mM; EDTA a 1 mM]. A
concentração do DNA genômico extraído foi inferido com base na comparação com 100
ng de DNA lambda em eletroforese em gel de agarose 1% (Pronadisa), corado com
SYBR safe (Invitrogen®).
Aproximadamente 20 μg de DNA genômico dos genitores em um volume final
de 200 μL foi fragmentado com o auxílio de um sonicador (Qsonica, Q125), com a
programação para a amplitude 40%, 2 segundos ligado e 2 segundos deligado, com o
tempo total de 5 minutos (JAUHAR; PETERSON, 2006). O tamanho dos fragmentos
foi detectado em gel de agarose 2% (Pronadisa) utilizando como parâmetro o marcador
ladder 100 pb (NEB, new england biolabs). Posteriormente foi realizada a purificação
do DNA fragmentado com 2% do volume final de acetato de sódio a 3 M mais 200% do
volume final de etanol P.A. O material foi colocado a -20 ºC overnight e, no dia
seguinte, centrifugado por 10 min a 14.000 rmp a 20ºC para a eliminação do
sobrenadante e posterior secagem em TA por no mínimo 1 hora. A ressuspensão do
pellet foi realizado com água ultrapura com o volume necessário para concentração final
de 1,1 μg/μL de DNA clivado. A marcação da sonda do genitor materno (P. coccinea)
foi realizada por Nick translation com Digoxigenina-11-dUTP (Roche Diagnostics®) e
135
do genitor paterno (P. hatschbachii) com Biotina-16-dUTP, na concentração final de 1
μg de DNA clivado, seguindo o protocolo proposto pelo fabricante.
Para a FISH a sonda construída para o DNA satélite (CL69 PeSat_2) que
colocalizam com os sítios de DNAr 45S, foi obtida por amplificação via PCR com o par
de primers (L-TGAGCAGTTCCACCGTGTATAG; R-
ATGCACTCTGCGTACTAAACCA) (PAMPONÉT, 2017). A sonda 5S foi obtida com
os pares de primers 5'-GTGCGATCATACCAG C(AG)(CT)TAATGCACCGG-3' e 5'-
GAGGTGCAACACGAGGACTTCCCAGGA GG-3' para DNAr 5S. A sequência de
DNAr 5S foi desenvolvida para Glicine max L. (GOTTLOB-MCHUGH et al., 1990) e
utilizado em Passiflora (MELO; GUERRA, 2003). A sonda CL69 PeSat_2 foi marcada
com Biotina-16-dUTP (Roche Diagnostics®) e a sonda 5S foi maracada com a
Digoxigenina-11-dUTP (Roche Diagnostics). As sondas foram marcadas por Nick
tranlation, com concentração final de 1 μg de DNA clivado, seguindo o protocolo
proposto pelo fabricante.
2.5 Aplicação de FISH e GISH
O tratamento das lâminas seguiu o protocolo para FISH proposto por
Schwarzacher e Heslop-Harrison (2000) e Souza et al. (2010), com modificações
realizadas por Melo et al (2015). As lâminas contendo as metáfases mitóticas foram
colocadas em estufa a 37 °C por 1 h e após esse período foi aplicado de 50 μl de RNase
(Sigma) a 1 μg/mL em tampão 2xSSC (cloreto de sódio a 0,3 M, Sigma; citrato de sódio
a 0,03 M, Sigma), as quais foram incubadas em câmara úmida por 1 h a 37°C. As
lâminas foram imersas em 2xSSC em temperatura ambiente (TA) duas vezes por 5 min
cada; 50 μL de HCl a 10 mM foi adicionado sobre as metáfases por 5 min e após
retirada do HCl, foi adicionado 50 μL de pepsina (Sigma) [pepsina a 10 mg/mL; HCl a
10 mM (1:100 v/v)] e incubadas em câmara úmida por 20 min a 37°C. As lâminas
foram lavadas em 2xSSC em TA duas vezes por 5 min cada em plataforma agitadora a
120 rpm (Biomixer, Mos-1), imersas em paraformaldeido a 4% em TA por 10 min, e
novamente lavadas em 2xSSC duas vezes por 5 min cada. O material citológico foi
desidratado em etanol 70% e etanol 96% por 5 min cada, para aplicação da mistura de
hibridação.
Após a secagem das lâminas em TA por 30 min, foi adicionada a mistura de
hibridação com o volume final de 15μl, sendo formamida 50% (Sigma), dextran sulfato
136
10% (Sigma), 2xSSC, SDS 0,13% (Dodecil sulfato de sódio) (Bioagency). No
procedimeno da GISH, para a identificação dos híbridos, foram utilizados 33 ng de cada
sonda no mix de hibridação. Para a FISH, foram utilizados 50 ng das sondas. A mistura
de hibridação foi aquecida a 75 °C por 10 min em termociclador (Eppendorf,
Mastercycler) e transferida para gelo por no mínimo de 5 min. As lâminas contendo a
mistura de hibridação foram desnaturadas em termociclador contendo um adaptador
para lâminas (Techne, TC-412) a 75 °C por 10 min e incubadas overnight a 37 °C em
câmara úmida. Após a hibridação, as lâminas foram imersas em 2xSSC em TA por 5
min para a remoção das lamínulas. Os banhos pós-hibridação foram realizados em
banho Dubnoff (Quimis, 9226ML), a 42 ºC, consistindo em duas imersões em 2xSSC
por 5 min cada, duas em 0,1xSSC por 5 min cada, e mais duas imersões em 2xSSC por
5 min cada. As lâminas foram imersas em 4xSSC/Tween 20 a 0,2% (Sigma) em TA por
5 min e tratadas com 50μl de BSA (Sigma) a 5%. As sondas marcadas com biotina
foram detectadas com 0,7 μl de avidina-FITC (Vector) e as sondas marcadas com
digoxinenina foram detectadas com 0,7 μl anti-digoxigenina-rodamina (Roche®) mais
18,6 μL BSA 5% por lâmina. As lâminas contendo o anticorpo para a detecção foram
incubadas em câmara úmida por 1 h a 37 °C. Foram realizados três banhos por 5 min
cada para a retirada do excesso de anticorpo com 4xSSC/Tween 20 a 0,2% em TA. As
lâminas foram rapidamente imersas em 2xSSC e logo foram montadas e contracoradas
com Vectashield ® Antifade Mounting Medium DAPI (H-1200), estocadas a ± 8 - 10 °C
até análise.
Com a utilização do microscópio de epifluorescência Olympus BX41 equipado
com câmera digital de 5M Olympus DP25 pelo software DP2-BSW as metáfases foram
fotodocumentadas. As hibridações detectadas com avidina-FITC foram visualizadas
com o uso do filtro U-MWB (excitação 450-480nm/dichroic cutoff 500nm/emissão >
515nm). As hibridações detectadas com anti-digoxigenina-rodamina foram visualizadas
com o filtro U-MWG (excitação 510-550 nm /dichroic cutoff 570nm/emissão >
590nm). O DAPI foi detectado através do filtro U-MWU (excitação 330-
385nm/dichroic cutoff 400nm/emissão > 420nm). A confecção das pranchas e
sobreposições FITC/rodamina foi realizada com o uso do software photoshop SC5. Os
ideogramas foram elaborados utilizando o software Corel Draw® X7 (Corel
Corporation, Canada).
137
3 RESULTADOS
3.1 Coloração convencional
O número cromossômico diploide 2n = 18 foi verificado nas espécies genitoras, P.
coccinea e P. hatschbachii e nos 16 híbridos interespecíficos HD25 (Figura 2). Através
da coloração convencional não possível realizar a identificação dos pares
cromossômicos homeólogos, pois a identificação precisa de satélites ou distinção na
posição de centrômeros entre pares foi impossibilitada, sendo possível a verificação em
poucas metáfases. Desta forma as medições foram realizadas em todo o cromossomo,
incluindo braço curto, braço longo e satélite (comprimento total) e a partir destas
medições foram produzidos os ideogramas (Figuras 8 e 9), com base na média do
comprimento total dos cromossomos das cinco metáfases dos 18 cromossomos para os
híbridos e com base nas medidas do comprimento total dos pares cromossômicos para
os genitores.
138
Figura 2. Metáfases mitóticas em genitores e híbridos interespecíficos F1 de Passiflora
(2n = 18). (A) P. coccinea, (B) P. hatschbachii, (C) HD25 101, (D) HD25 106, (E)
HD25 109, (F) HD25 125, (G) HD25 133, (H) HD25 140, (I) HD25 143, (J) HD25 156,
(K) HD25 187, (L) HD25 190, (M) HD25 218, (N) HD25 224, (O) HD25 237, (P)
HD25 238, (Q) HD25 244, (R) HD25 245. Barra 10 μm.
139
3.2 Bandamento CMA3 e DAPI
A análise com os fluorocromos CMA3/DAPI possibilitou a visualização de
heterocromatina rica em GC, cuja região corresponde aos satélites (constrição
secundária). Os genitores, P. coccinea e P. hatschbachii, apresentaram dois pares de
cromossomos com blocos CMA3+/DAPI-
(Figuras 3 A e B). Em todos os híbridos F1 foi
possível a observação de blocos CMA3+, confirmando o número de satélites igual aos
dos genitores (Figura 3, 4, 8 e 9; Tabela 1).
Os cariogramas dos genitores foram elaborados levando em consideração o
tamanho cromossômico, seguindo a ordem decrescente. A elaboração dos cariogramas
dos híbridos foi com base nos cromossomos homeólogos e não no tamanho
cromossômico, sendo que a disposição dos cromossomos não seguiu a ordem
decrescente. Foi realizada a identificação dos cromossomos no cariótipo dos genitores a
partir de letras e números. Para o genitor materno, P. coccinea, foi designado para os
pares cromossômicos de 1 a 9, os cromossomos de 1A a 9I (Figura 4A). Para o genitor
paterno, P. hatschbachii, foi denominado de 1a a 9i para os pares cromossômicos de 1 a
9 (Figura 4B). Para os genótipos híbridos a denominação no cariótipo foi com base nos
cromossomos marcadores dos genitores, com a presença dos blocos CMA3+ com
segregação nos híbridos. Os pares cromossômicos 5E e 8H do genitor P. coccinea
apresentaram os blocos CMA3+
(Figura 4A) e os pares cromossômicos 3c e 8h do
genitor P. hatschbachii apresentaram os blocos CMA3+
(Figura 4B).
Os 16 híbridos analisados foram numerados e nomeados apresentando os blocos
CMA3+ como marcadores para a identificação. Foi escolhido como marcador o
cromossomo 5E e 3c dos genitores P. coccinea e P. hatschbachii, respectivamente,
ambos nos braços longos, uma vez que esses cromossomos apresentaram marcas
exclusivas para cada genitor na confirmação do status híbrido dos genótipos. Neste
sentido, em todas as plantas híbridas foram identificados os cromossomos com blocos
CMA3+ em regiões específicas para cada genitor doador (Figura 4C - R).
140
Figura 3. Coloração com fluorocromos utilizando CMA3 e DAPI para localização de
heterocromatina em genitores e híbridos interespecíficos F1 de Passiflora (2n = 18). (A)
P. coccinea, (B) P. hatschbachii, (C) HD25 101, (D) HD25 106, (E) HD25 109, (F)
HD25 125, (G) HD25 133, (H) HD25 140, (I) HD25 143, (J) HD25 156, (K) HD25 187,
(L) HD25 190, (M) HD25 218, (N) HD25 224, (O) HD25 237, (P) HD25 238, (Q)
HD25 244, (R) HD25 245. As setas indicam blocos CMA3+. Barra 10 μm.
141
Figura 4. Cariogramas das metáfases mitóticas com bandamento CMA3/DAPI em
genitores e híbridos interespecíficos F1 de Passiflora (2n = 18). (A) P. coccinea, (B) P.
hatschbachii, (C) HD25 101, (D) HD25 106, (E) HD25 109, (F) HD25 125, (G) HD25
133, (H) HD25 140, (I) HD25 143, (J) HD25 156, (K) HD25 187, (L) HD25 190, (M)
HD25 218, (N) HD25 224, (O) HD25 237, (P) HD25 238, (Q) HD25 244, (R) HD25
245. As letras e números nos genitores indicam os pares cromossômicos. As letras e
números nos híbridos indicam os cromossomos com os blocos CMA3+. Barra 10 μm.
3.3 GISH
A GISH utilizando as sondas dos genitores concomitantemente e sem o uso de
DNA de bloqueio na mistura de hibridação permitiu a distinção dos genomas de cada
genitor nos 16 híbridos (Figura 5), comprovando o caráter híbrido das plantas F1 em
estudo. Em cada híbrido foi visualizado nove cromossomos hibridados uniformemente
com a sonda do genitor paterno, detectados com avidina-FITC (verde) e os nove
cromossomos hibridados com a sonda do genitor materno, detectados com
antidigoxigenina-rodamina (vermelho).
142
Figura 5. Hibridização Genômica In Situ (GISH) em metáfases mitóticas dos híbridos
interespecíficos obtidos do cruzamento entre P. coccinea (cromossomos vermelhos) e P.
hatschbachii (cromossomos verdes). (A) HD25 101, (B) HD25 106, (C) HD25 109, (D)
HD25 125, (E) HD25 133, (F) HD25 140, (G) HD25 143, (H) HD25 156, (I) HD25
187, (J) HD25 190, (K) HD25 218, (L) HD25 224, (M) HD25 237, (N) HD25 238, (O)
HD25 244, (P) HD25 245. Barra 10 μm.
3.4 FISH
Foram mapeados os cromossomos dos genitores e os híbridos refrentes aos sítios
de DNA Sat (colocalizado com sítios de DNAr 45S) e DNAr 5S (Figuras 6 - 9). Através
da FISH utilizando a sonda de DNA Sat foi possível identificar os satélites (constrição
secundária) não visualizados na coloração convencional. Foram observados quatro sítios
de DNA Sat e dois sítios de DNAr 5S em ambos os genitores que segregaram nos
genótipos híbridos (Tabela 1 e Figuras 6 - 9).
143
Os cariogramas dos genitores e híbridos com os sítios de hibridação de DNA Sat e
DNAr 5S foram elaborados seguindo o procedimento para a elaboração dos cariogramas
refente aos blocos CMA3+, sendo identificado os cromossomos no cariótipo dos
genitores a partir de letras e números. A identificação nos genótipos híbridos foi
realizada com base nos cromossomos marcadores dos genitores, com sítos de hibridação
de DNA Sat e DNAr 5S, os quais ocorrem nos híbridos. Portanto, os sítos de DNA Sat
em P. coccinea, foram observados nos pares cromossômicos 5E e 8H e os sítios de
DNAr 5S localizados no par 6F (Figura 7A). Em P. hatschbachii os pares
cromossômicos 3c e 8h apresetaram sítios de DNA Sat e o par 7g apresentou sítios de
DNAr 5S (Figura 7B).
Os híbridos interespecíficos F1 apresentaram dois pares cromossômicos com sítios
de hibridação de DNA Sat e um par com sítios de DNAr 5S, característica de cada
genitor (Figuras 6 - 9; Tabela 1) confirmando que todos os genótipos analisados são
híbridos.
Como objetivo de facilitar a identificação dos cromossomos marcadores, os
cariogramas dos híbridos foram numerados e nomeados unicamente com os
cromossomos marcadores, os quais revelaram os sítios de DNA Sat e DNAr 5S, (Figura
7C-R). Na espécie P. coccinea, o cromossomo 5E e 6F foram escolhidos como
marcadores, uma vez que foram exclusivos para a espécie (Figura 7A). O par 3c, em P.
hatschbachii, também confere como bom marcador cromossômico, na confirmação da
paternidade dos híbridos analisados, já que este marcador é exclusivo para a espécie,
assim como o par cromossômico 7g (Figura 8B).
Quanto aos outros cromossomos com sítios de DNA Sat não foram utilizados
como marcadores, pelo fato desses sítios estarem presentes no braço longo em ambos os
genitores. Além disso esses cromossomos são morfologicamente semelhantes, o que
impede a sua utilização de maneira confiável para a confirmação.
144
Figura 6. Hibridação In Situ Fluorescente (FISH) com as sondas para sítios de DNAr 5S
(vermelho, indicado pelas setas) e DNA Satélite (sonda CL69 PeSat_2) (verde, indicado
pelas setas) em genitores e híbridos interespecíficos F1 de Passiflora (2n = 18). (A) P.
coccinea, (B) P. hatschbachii, (C) HD25 101, (D) HD25 106, (E) HD25 109, (F) HD25
125, (G) HD25 133, (H) HD25 140, (I) HD25 143, (J) HD25 156, (K) HD25 187, (L)
HD25 190, (M) HD25 218, (N) HD25 224, (O) HD25 237, (P) HD25 238, (Q) HD25
244, (R) HD25 245. Barra 10 μm.
145
Figura 7. Cariogramas com sondas para sítios de DNAr 5S (vermelho) e DNA Satélite
(sonda CL69 PeSat_2) (verde) em genitores e híbridos interespecíficos F1 de Passiflora
(2n = 18). (A) P. coccinea, (B) P. hatschbachii, (C) HD25 101, (D) HD25 106, (E)
HD25 109, (F) HD25 125, (G) HD25 133, (H) HD25 140, (I) HD25 143, (J) HD25 156,
(K) HD25 187, (L) HD25 190, (M) HD25 218, (N) HD25 224, (O) HD25 237, (P)
HD25 238, (Q) HD25 244, (R) HD25 245. As letras e números nos genitores indicam os
pares cromossômicos. As letras e números nos híbridos indicam os cromossomos com
os sítios de DNAr 5S e DNA Satélite. Barra 10 μm.
146
Figura 8. Ideogramas evidenciando o bandamento CMA3 e sítios de DNAr 5S e DNA
Sat (colocalizado com DNAr 45S) em genitores e híbridos interespecíficos F1 de
Passiflora (2n = 18): (A) P. coccinea, (B) P. hatschbachii, (C) HD25 101, (D) HD25
106, (E) HD25 109, (F) HD25 125, (G) HD25 133, (H) HD25 140, (I) HD25 143, (J)
HD25 156.
147
Figura 9. Ideogramas evidenciando o bandamento CMA3 e sítios de DNAr 5S e DNA
Sat (colocalizado com DNAr 45S) em genitores e híbridos interespecíficos F1 de
Passiflora (2n = 18): (K) HD25 187, (L) HD25 190, (M) HD25 218, (N) HD25 224, (O)
HD25 237, (P) HD25 238, (Q) HD25 244, (R) HD25 245.
148
Tabela 1. Dados de bandamento CMA3, DNA Sat, DNAr 5S dos genitores Passiflora
coccinea e P. hatschbachii e híbridos interespecíficos F1 (2n = 18).
Genótipos CMA3+
DNA Sat (colocalizado
com DNAr 45S) DNAr 5S
P. coccinea 4 4 2
P. hatschbachii 4 4 2
HD25 101 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)
HD25 106 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)
HD25 109 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)
HD25 125 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)
HD25 133 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)
HD25 140 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)
HD25 143 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)
HD25 156 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)
HD25 187 4 4 (2M; 2P) 2(1M; 1P)
HD25 190 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)
HD25 218 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)
HD25 224 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)
HD25 237 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)
HD25 238 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)
HD25 244 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)
HD25 245 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)
Número de blocos CMA3 (CMA3+); número de sítios de DNA Sat (DNA Sat); número
de sítios 5S (DNAr 5S); sítio originado do genitor materno (M); sítio originado do
genitor paterno (P).
4 DISCUSSÃO
Muitas espécies de Passiflora tendem a apresentar cariótipo semelhante, com a
maioria dos cromossomos metacêntricos e com tamanhos similares (SOUZA et al.,
2008). Sendo assim, híbridos F1 apresentam semelhanças cariotípicas, levando a
dificuldades no pareamento de cromossomos homeólogos. Nesse sentido, a
caracterização cariotípica das plantas híbridas se torna uma tarefa difícil quando se
deseja comparar com o cariótipo dos genitores, ficando limitada apenas na contagem do
número cromossômico (SOARES-SCOTT et al., 2005). Em híbridos interespecíficos de
Passiflora, obtidos do cruzamento entre P. gardneri Mast. vs. P. gibertii N.E. BROW,
foi observado cariótipo similar tanto para as espécies genitoras quanto para os híbridos,
dificultando a distinção baseado no tamanho cromossômico (SILVA, 2014).
Neste estudo, através da coloração convencional não foi possivel identificar a
localização e o número de satélites (constrição secundária) nos genitores e híbridos,
uma vez que era visualizados em poucas metáfases mitóticas e de maneira imprecisa.
No entanto, através do bandamento CMA3, foi possível a identificação dos satélites de
149
forma segura. Em trabalhos anteriores através da coloração convencional, foi observado
a presença de dois pares com constrição secundária em P. coccinea e P. hatschbachii
(MELO et al., 2014; OLIVEIRA, 2017).
A identificação de blocos CMA3+
nos genitores constitui-se em uma ferramenta
que proporciona resultados informativos e precisos, permitindo a confirmação de
híbridos (SILVA et al., 2017, in press). Em Passiflora, blocos heterocromáticos ricos
em GC visualizados pelo fluorocromo CMA3 colocalizam em regiões de DNAr 45S
(MELO et al., 2014; BELO et al., 2015; SILVA et al., 2017 in press). Mais uma vez a
utilização do fluorocromo CMA3 mostra-se confiável quanto à localização de satélites
sendo importantes marcadores citológicos para identificação de híbridos
interespecíficos.
A GISH é bastante eficiente na discriminação de genomas das espécies genitoras
nos híbridos, tendo como base sondas genômicas (SILVA; SOUZA 2013; SILVA et al.,
2017 in press). Além disso, possibilita a identificação de recombinações cromossômicas
de híbridos retrocruzados (MELO et al., 2015), na investigação das relações genômicas
entre espécies (SILVA 2014) e no estudo da origem de genomas parentais de
poliploides (LIU; GU et al., 2011). Neste estudo foi usada a sonda de ambos os
genitores para confirmação da fecundação cruzada sendo observado a presença dos
genomas de P. coccinea e P. hatschbachii na composição genômica das plantas
híbridas.
Pelo fato das espécies genitoras pertencerem ao mesmo subgênero e secção, sendo
próximas filogeneticamente e compartilhando muitas sequencias repetitivas, foi
utilizada as sondas de ambos os genitores, visto que já foram observados resultados
positivos em híbridos F1 e retrocruzados de Passiflora (MELO et al., 2015). No
cruzamento artificial entre duas espécies de orquídeas (Paphiopedilum delenatii vs.
Paphiopedilum micranthum) também só foi possível à distinção dos genomas dos
genitores nos híbridos com a utilização das sondas de ambos os genitores, uma vez o
genomas desses indivíduos apresentam relações filogenéticas próximas (LEE et al.,
2011).
Para obtenção de resultados satisfatórios e confiáveis, muitas vezes é preciso o
ajuste da técnica de GISH, como, a utilização de sondas genômicas dos genitores,
modificações na concentração de DNA de bloqueio e sondas, bem como na melhor
definição do tamanho dos fragmentos de DNA usados no preparo de DNA de bloqueio
e sonda (SCHWARZACHER; HESLOP-HARRISON, 2000; MELO et al., 2015). O uso
150
de DNA de bloqueio 100x ou até 1000x mais concentrado que a sonda tem sido
empregada na distinção do genoma dos genitores devido ao grau de homologia que elas
podem apresentar (TANG et al., 2010; FRIENSEN; KLAAS, 1998), em função das
muitas sequências repetitivas compartilhadas (SILVA et al., 2017 in press). Em híbridos
interespecíficos resultantes do cruzamento entre P. gardneri vs. P. gibertii foi testado o
DNA de bloqueio do genitor materno 20x, 40x, 60x e 100x mais concentrado que o
DNA do genitor paterno. Nesse estudo foi verificado que o DNA de bloqueio 100x mais
concentrado que a sonda foi eficiente na distinção dos genomas dos genitores nos
híbridos, evitando a hibridação cruzada (SILVA et al., 2017 in press).
A fluorescência amarela opaca visualizada nos cromossomos hibridados
utilizando a sonda detectada pela anti-digoxigenina-rodamina (Figura 5) observada com
o uso do mesmo filtro Olympus U-MWB (específico para a detecção FITC), foi devido
a mistura de sinais FITC (verde) - TRITC (vermelho), pois os locais de hibridação
fortes do TRITC são visualizados em uma mistura com os locais de hibridação FITC e a
fluorescência TRITC transforma -se em amarela (MELO et al., 2015).
Outro fator a ser considerado na eficiência da aplicação da GISH, está relacionado
com o tamanho cromossômico. Em algumas espécies como Brassica rapa L., B. napus
L. (YAO et al., 2010) e em espécies do gênero Citrus (FU et al., 2004), já foi reportado
que cromossomos pequenos podem limitar a aplicação da técnica, sendo que em
Brassica apenas as regiões pericentroméricas podem ser hibridadas (YAO et al., 2010).
Contudo, em híbridos retrocruzados de Passiflora, a aplicação da GISH evidencia
resultados eficientes em cromossomos pequenos, não sendo impecilho na aplicação
desta técnica (MELO et al., 2015).
O DNA Satélite (DNA Sat) colocalizam com o DNAr 45S, pois ele está
localizado nas regiões espaçadoras do DNAr 45S que é repetido em tandem. Neste
sentido, o número e a sua localização funcionam como marcadores cromossômicos que
auxiliam no processo de identificação cromossômica (SILVA, 2014) sendo importantes
na confirmação de hibridações interespecíficas.
A localização e o número de sítios observados na progênie híbrida foram
correspondentes aos sítios das espécies genitoras. Os cromossomos marcadores foram
identificados nos pares 5 e 6 para P. coccinea, e nos pares 3 e 7 para P. hatschbachii, o
qual corresponde os sítios DNA Sat e DNAr 5S, respectivamente. A variação do
número de sítios não observada nos híbridos HD25 sugere que os cromossomos
homeólogos são semelhantes, fato que pode ter contribuído para a estabilidade dos
151
cromossomos na progênie híbrida F1. Em híbridos interespecíficos de Passiflora obtidos
do cruzamento entre P. gardneri vs. P. gibertii, a quantidade de sítios DNAr 45S
variou, onde foi observado híbridos com 5 e 6 sítios, umas vez que P. gibertii (genitor
paterno) apresentou 5 sítios e P. gardneri (genitor materno) 6 sítios. Ainda neste estudo,
os autores observaram que apenas o uso da sonda de rDNA 5S já seria capaz na
confirmação da fecundação cruzada (SILVA et al., 2017 in press).
Neste trabalho foi utilizada a sonda CL69 Sat_2, a qual apresenta sítios de
hibridação que colocalizam com a região DNAr 45S (PAMPONÉT, 2017), com padrão
de marcação confiáveis na identificação da paternidade dos híbridos HD25,
confirmados também pela presença dos blocos CMA3+, o qual colocalizou com DNA
Sat. Assim como a sonda para DNA Sat foi eficiente, a sonda DNAr 5S também
utilizada como marcador permitiu a confirmação de paternidade. Na célula, estes tipos
de marcadores revelam informações que são observadas de forma clara, sendo eficiente
na confirmação de cruzamentos interespecíficos. Este procedimento pode ser realizado
em qualquer fase de desenvolvimento da planta, conferindo uma boa alternativa para
programas de melhoramento que compreende o método de hibridações interespecíficas
(SILVA, 2014).
A localização, assim como o polimorfismo de sítios ribossomais são importantes
para o estudo de relações evolutivas (PAMPONÉT, 2017). Em três espéceis de
Passiflora (P. edulis, P. serratodigitata e P. alata), por exemplo, foi possível observar
marcações cromossômicas para DNA Sat possibilitando diferenças na quantidade e
localização dos sítios de hibridação, sendo marcadores relevantes para caracterização de
espécies (PAMPONÉT, 2017). Neste estudo não foi observado a existência de
polimorfismo para os sítios de DNAr 5s e DNA Sat nas espécies genitoras e nos
genótipos híbridos. Por outro lado, em híbridos retrocruzados (RC1) de Passiflora foi
verificado polimorfismo no tamanho do sinal de hibridação para os sítios ribossomais
45S e 5S, devido a alterações/variações decorrentes dos cruzamentos entre espécies
diferentes (MELO et al., 2017).
Não foi observado diferenças na quantidade e número de sítios de hibridação dos
genótipos híbridos. Existem alguns fatores que podem justificar este fato. Os híbridos F1
não terem passado por recombinação meiótica, pois não tem recombinação com os
cromossomos das espécies genitoras no genoma do híbrido F1, sendo possível isto em
uma segunda geração de cruzamentos (F2). Alem disso, muitas das variações
encontradas citogenômicamente em plantas pode ocorrer devido a irregularidades na
152
segregação cromossômica (KIIHL et al., 2011), bem como por meio de alterações
cromossômicas estruturais, como translocação (MELO et al., 2017).
As sondas DNAr 5S e 45S também foram utilizadas no híbrido obtido do
cruzamento entre P. edulis Sims vs. P. cincinnata Mast. para a confirmação do caráter
híbrido, sendo identificados na progênie híbrida os sítios de cada genoma doador
(COELHO et al., 2016). O uso destas sondas possibilitou a identificação de variação no
número e localização de sítios de DNAr em híbridos retrocruzados de Passiflora,
revelando recombinação meiótica nestes híbridos (MELO et al., 2017). Em outros
gêneros como, Beta L. (DESEL et al., 2002), Brassica (HASTEROK et al., 2005),
Lilium L. (MARASEK et al., 2004) e Oryza L. (XIONG et al., 2006) a aplicação da
FISH também foi utilizados na determinação do status híbrido, utilizando estes tipos de
marcadores.
5 CONCLUSÕES
A aplicação das sondas de DNA genômico e ribossômico possibilita a
diferenciação dos cromossomos das espécies genitoras no genoma dos híbridos
interespecíficos F1, demonstrando que o uso simultâneo é ainda mais efetivo na
confirmação da fecundação cruzada e que estas técnicas podem ser adotadas em
programas de melhoramento de Passiflora.
A GISH e a FISH além de permitirem a confirmação das hibridações, permite a
visualização de estabilidade entre os genomas genitores nos híbridos pela ausência de
translocações entre genomas e a não visualização de modificações genômicas de âmbito
citológico.
6 AGRADECIMENTOS
Ao pós-doc Gonçalo Santos da Silva e ao coorientador Cláusio Antônio Ferreira
de Melo da Universidade Estadual de Santa Cruz no auxílio com as análises
citogenéticas. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) pela concessão da bolsa. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) e à Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC) pelo
apoio financeiro à pesquisa.
153
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156
8 CONCLUSÕES GERAIS
A realizações das hibridações interespecíficas permitiu o conhecimento da
compatibilidade entre as espécies de Passiflora, sendo importante para encontrar
estratégias em programas de melhoramento de passifloras.
A hibridação interespecífica é um método de melhoramento eficiente para
obtenção de novos materiais, sendo identificados dois híbridos Passiflora ‘Vivis’ e P.
‘Jhovi’ com potencial para o mercado ornamental, podendo compor jardins, sobre
pérgulas ou serem cultivados em vasos na decoração de diferentes ambientes. Estes
híbridos apresentaram comportamento meiótico regular, podendo ser considerados
híbridos férteis.
A seleção de genótipos híbridos pode ser realizada com base em características
florais, pois estas apresentaram pouca influência ambiental (alta herdabilidade) e altos
valores de índice de variação.
A GISH e a FISH confirmaram a natureza híbrida das plantas, através da distinção
dos cromossomos das espécies genitoras no genoma dos híbridos F1, evidenciando que a
utilização de ambas as sondas dos genitores proporcionaram resultados ainda mais
efetivos na exclusão da hipótese de autofecundação.
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