UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS (CSIC)

Desbloqueo de la diferenciación en células eritroleucémicas resistentes a

los agentes inductores

Memoria presentada por María José Fernández de Nestosa para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas por la

Universidad Complutense de MadridMadrid, Septiembre de 2007

La presente tesis doctoral titulada “Desbloqueo de la diferenciación

en células eritroleucémicas resistentes a los agentes inductores”, ha sido

realizada por la licenciada María José Fernández de Nestosa, bajo la

dirección de la Dra. Dora B. Krimer Smunis, en el Departamento de Biología

Celular y del Desarrollo del Centro de Investigaciones Biológicas (C.I.B.) del

Consejo Superior de Investigaciones Científicas (C.S.I.C.).

Lic. María José Fernández de Nestosapara optar al título de Doctor

VºBº del Director de Tesis VºBº del Tutor de Tesis

Dra. Dora B. Krimer Smunis Dr. Álvaro Martínez del Pozo

Septiembre de 2007

A mi madre,

que le da el toque irreponsable a mi vida

Nothing shocks me.

I´m a scientist.

Harrison Ford (1942 - ), como Indiana Jones

Agradecimientos:

En primer lugar quiero agradecer a la Dra. Débora Krimer la oportunidad que

me ha brindado de realizar la tesis doctoral en su laboratorio. Especialmente quisiera

agradecerle la dedicación y el tiempo que me ha ofrecido a lo largo de estos años.

También quiero agradecer a los Doctores Pablo Hernández y Bernardo Schvartzman

por sus consejos y su interés por mi trabajo de tesis.

En segundo lugar quiero expresar mi más profunda gratitud a Marisa y a Pili

por todo lo que me han enseñado tanto dentro como fuera del laboratorio. Gracias por

los consejos y por darme ánimos en los momentos más difíciles.

Ahora llegó el momento de agradecer a todos los que han pasado por el laboratorio

a lo largo de estos siete años, gracias por todo lo que me han enseñado y porque han

hecho que me sienta como en casa, nunca necesité ni tan siquiera pedir ayuda porque

siempre estuvieron ahí para darme una mano. Sin ustedes jamás habría llegado hasta

aquí y dudo mucho que en la vida vuelva a encontrar gente tan especial. Nunca

voy a olvidar los momentos que pasamos juntos. Alberto, mi compañero de escritorio,

gracias por enseñarme lo que es la eficiencia en el laboratorio. Ali-Oli, aparte de ser

la madre de Inés, sos la madre de casi todos los que pasamos por el U3B. Gracias a

vos estoy en Madrid, empezaste a enseñarme en Paraguay y no te quedó otra que

continuar aquí, gracias por la paciencia y por seguir “aguantándome” fuera del labo.

Leti’O, mi amiga del alma, sé que estás ahí cuando más te necesito y lo más lindo es

que siempre vas a estar ahí, me siento tan a gusto contigo que hasta JC me empieza a

parecer un tipo agradable. Raúl, siempre dispuesto a ayudar y dar consejos, gracias

por tenerme tanta paciencia. Ana, gracias por introducirme al “mundo de las células

MEL”, admiro tu fuerza de voluntad y tu valentía. No quiero olvidarme de Agur, mi

compañera de traversuras y risas en el labo. Leo y Marta, para mí, mis dos hermanas

españolas, gracias por ser tan generosas conmigo, por el aguante y por estar siempre

pendientes de mí (no sé si merezco unas hernamas tan buenas). Lolailo, me caíste bien

desde el principio y no me equivoqué, gracias por tus consejos y tus ánimos, por ser

tan espontánea y por hacerme reír hasta en los momentos más difíciles. Eva, gracias

por ser tan dulce y por preocuparte siempre por mí. María, víctima de mi afán de

ocupación territorial, es un placer saber que te tengo ahí detrás, no sé cómo hacés pero

estás siempre animada y dispuesta a ayudar al que necesita, vas a llegar muy lejos

(siempre y cuando no te coma la boa). Y por último, y no por ello la menos importante,

Zaira, fuiste todo un descubrimiento, trajiste aires nuevos al laboratorio, sos una

especie de angel de la guarda, te quiero llevar conmigo a mi siguiente laboratorio.

Después de tantos años y tantas cosas compartidas también tengo que agradecer

a las familias de mis compañeros de laboratorio, especialmente a Ana María, por

todos sus cuidados y por el cariño que siempre ha brindado, y a Chuca, por sus consejos

y su “comida de madre”.

También quiero a agradecer muy especialmente a “los Patricios”. Carlos,

Donna y Yoli, ustedes son para mí parte de mi grupo de trabajo. Me han ayudado en

incontables ocasiones, sus consejos y su ayuda han sido decisivos para el desarrollo de

esta tesis.

No quisiera olvidarme de gente del CIB que ha contribuido directa o

indirectamente a esta tesis: Javi, Fran, Patricia, María Paz, “las Vidalitas”, Gaizka y

Gisella. Gracias por animarme y por darle una chsipa de alegría a mis días.

En estos años de trabajo he encontrado muchos amigos incondicionales que

han estado conmigo en los buenos y en los malos momentos: Nicolás, Sofía, Lourdes,

Guillermo, Sonia, Loles y Mike.

Por último, ellos, lo más lindo que tengo en la vida, mi familia. Mamá, sólo vos

y yo sabemos cuán increíble es que yo esté hoy acá, me enseñaste todo lo que no se

aprende en los libros ni en la escuela, contigo aprendí a tomarme muy pocas cosas en

serio, gracias por tu sabiduría de vida y porque sin vos hace mucho que me habría

ahogado en una vaso de agua. Papá, a lo mejor sea como dice Rodrigo que contigo

aprendimos lo que no hay que hacer en la vida, sos la persona más inteligente que

conozco y me enseñaste que me puedo caer y volver a levantar todas las veces que haga

falta. Carmen Cancio, la que nos va enterrar a todos, vos sí que no te hacés problema

por nada, sabés disfrutar de la vida como nadie, sos mi ídola. Herminia de Brix, un

ejemplo de entrega a los demás, lástima que hoy no puedas estar acá. Tío Luis, gracias

por darme ánimos y apoyarme en los primeros pasos de mi carrera y, por cierto,

gracias también por traerme al mundo. Mis tías (o mis otras mamás): Carmiña, Mecha

y Marica, ustedes me enseñaron el valor de una familia. Mis hermanos: Rodrigo,

Paloma y Waldo, gracias por haberme aguantado tanto, estoy orgullosa de tener unos

hermanos como ustedes. A mis primas, muy especialmente a Andrea, Belén y Ana,

gracias por hacerme sentir que siempre las tengo muy cerca. Podría continuar más

porque tengo la suerte de tener una familia enorme y muy unida, sólo quiero decir

gracias a todos.

Abreviaturas

Abreviaturas

5-Aza-2-dC 5-Aza-2’-deoxicitidinaBFU-E Unidades Formadoras de brotes eritroidesBSA Albúmina de suero bovinoB+ Benzidina positivoCBP CREB-Binding ProteincDNA DNA complementarioCFU-E Unidades formadoras de colonias eritroidescpm Cuentas por minutoC-terminal Carboxi-terminaldCTP Trifosfato de desoxicitosinaDEPC DietilpirocarbonatoDMEM Medio Eagle modificado por DulbecoDMSO DimetilsulfóxidoEDTA Ácido etilendiamino tetra-acéticoEPO EritropoyetinaEPO-R Receptor de eritropoyetinaF-MCF Friend Mink Cell Focus-formingF-MuLV Friend Murine Leukemia VirusGFP Green Fluorescent ProteinHDAC Deacetilasa de histonasHMBA N,N’-Hexametilen-bis-acetamidaKb KilobasesKDa KilodaltonMCF Mink Cell Focus-forming virusMEL Murine erythroleukemiaMEL-R Murine erythroleukemia resistenteN-terminal Amino-terminalPAGE Electroforesis en geles de poliacrilamidapb Pares de basesPBS Tampón fosfato alcalinoPCR Reacción en cadena de la polimerasaPVDF Polivinilideno difluoradorpm Revoluciones por minutoRT-PCR Retrotranscripción acoplada a PCRSDS Dodecil sulfato sódicoSFFV Spleen Focus Forming VirusSfpi-1 SFFV proviral integration site-1STAT Signal Transducers and Activators of TranscriptionSTK Stem-cell kinase receptorTBE Tris-Borato-EDTATBST Tampón tris salino Tween-20TPA 12-o-tetradecanoil-forbol-13-acetato (PMA)

Índice

ÍNDICE

Abreviaturas

1.INTRODUCCIÓN

1.1. Hematopoyesis 21.2. Eritropoyesis 31.3. Las células MEL como modelo de diferenciación in vitro 4

1.3.1. Establecimiento de las células MEL 41.3.2. El complejo Friend 41.3.3. Etapas de la diferenciación inducida de las células MEL 8

1.4. Inducción de la diferenciación: respuesta al HMBA 101.5. Desbloqueo de la diferenciación de células MEL: cambios a nivel molecular 11

1.5.1. Parada de la proliferación celular 11 1.5.2. La red Myc-Max-Mad y la regulación de la proliferación y la diferenciación celular 13 1.5.2.1. La Familia Myc 13 1.5.2.2. La Familia Mad 15 1.5.3. Regulación transcripcional de la eritropoyesis 16

1.5.4. GATA-1, un gen maestro? 18 1.6. PU.1 y el bloqueo de la diferenciación eritroide 20 1.7. Fli-1 y el bloqueo de la diferenciación eritroide 24 1.8. Lecciones del SFFV y del modelo in vitro de células MEL 26

2.OBJETIVOS 29

Índice

3.MATERIALESYMÉTODOS

3.1. Cultivos celulares 313.1.1. Líneas celulares 313.1.2. Transfectantes derivados de MEL-R 313.1.3. Condiciones de cultivo 323.1.4. Ensayos de diferenciación 32 3.1.4.1. Tratamiento con HMBA 32 3.1.4.2. Tratamiento con otros agentes inductores de la diferenciación eritroide 33 3.1.4.3. Tratamiento con TPA 33 3.1.4.4. Tratamiento con 5-Aza-2-dC 33 3.1.4.5. Tratamiento con TSA 343.1.5. Ensayo de benzidina 343.1.6. Tinción con azul de toluidina y May Grünwald-Giemsa 343.1.7. Tratamiento con Fibronectina 353.1.8. Cinética de crecimiento y viabilidad celular 353.1.9. Distribución en las distintas fases del ciclo celular.Determinación del tamaño celular 36

3.2. Transfecciones con vectores de expresión 363.2.1. Construcción de plásmidos 363.2.2. Transfecciones estables con cationes lipídicos 383.2.3. Selección de transfectantes 38

3.3. Preparación y análisis de DNA 393.3.1. Extracción y purificación de DNA plasmídico 393.3.2. Extracción y purificación de DNA genómico 39

3.3.3. Transferencia, marcaje e hibridación del DNA separado en geles de agarosa (Southern) 40 3.3.3.1. Transferencia a soportes sólidos 40 3.3.3.2. Marcaje radiactivo de sondas 40 3.3.3.3. Hibridación de DNA 40 3.3.4. Secuenciación de DNA 413.4. Preparación y análisis de RNA 41

3.4.1. Extracción y purificación de RNA 413.4.2. Transferencia, marcaje e hibridación de RNA separado engeles de agarosa (Northern) 41

Índice

3.4.2.1. Electroforesis y transferencia a soportes sólidos 413.4.2.2. Hibridación de RNA 42

3.5. RT-PCR 423.6. Preparación y análisis de proteínas 44

3.6.1.Purificación de proteínas 44 3.6.1.1. Obtención de extractos proteicos totales 44 3.6.1.2. Obtención de extractos proteicos nucleares 44

3.6.2. Separación electrofóretica de proteínas e inmunodetección(Western) 45

3.6.3. Coinmunoprecipitación de proteínas endógenas 45 3.6.4. Inmunomarcaje 46

4.RESULTADOS

4.1. Caracterización de líneas celulares eritroleucémicas resistentesa la acción de agentes inductores de la diferenciación 49

4.1.1. Establecimiento de líneas celulares eritroleucémicas resistentes (MEL-R) a agentes inductores de la diferenciación 494.1.2. Expresión de marcadores de la diferenciación eritropoyética 544.1.3. Viabilidad celular, cinética de crecimiento y distribución de las distintas fases del ciclo celular de cultivos MEL-R 554.1.4. Incremento del tamaño celular: Es c-myc el responsable? 584.1.5. Potencial de MEL-R para la diferenciación hacia el linajemegacariocítico 614.1.6. Expresión de genes involucrados en la transición proliferacióndiferenciación 63

4.2. Causas de la inactivación de PU.1 en MEL-R 664.2.1. Expresión de la glicoproteína gp55 del SFFV en MEL-R 66

4.2.2. Análisis de la integración del SFFV en el locus Sfpi-1/PU.1 68 4.2.3. Cambios epigenéticos en el locus Sfpi-1/PU.1 69 4.2.4. Es PU.1 necesario para una respuesta al HMBA? 71 4.2.5. La inactivación de PU.1 en MEL-R no influye en la actividad de STAT1 73

4.3. Desbloqueo de la diferenciación hacia el linaje eritroide 74

Índice

4.3.1. Efecto de la expresión ectópica de Mad1 sobre la diferenciación de células MEL-R 75 4.3.2. Efecto de la inhibición de c-Myc sobre la diferenciación de células MEL-R 78 4.3.3. Diferenciación espontánea en respuesta a la sobreexpresión de GATA-1 80 4.4. Fli-1, antagonista de GATA-1 en ausencia de PU.1 83 4.4.1. Análisis de la expresión de genes que codifican para proteínas que regulan la actividad de GATA-1 84 4.4.2. PU.1, Fli-1 y el bloqueo de la actividad de GATA-1 86

5.DISCUSIÓN

5.1. Desbloqueo de la diferenciación de células eritroleucémicas 895.2. MEL-R y la resistencia al HMBA 905.3. Es PU.1 indispensable para el bloqueo de la diferenciación delas células Friend? 945.4. La inhibición de la proliferación celular y la reactivación de larespuesta al HMBA 975.5. GATA-1 y el desbloqueo de la diferenciación de las célulasMEL-R 995.6. Antagonismo entre GATA-1 y PU.1 1005.7. Causas del bloqueo de la actividad de GATA-1 en las células MEL-R 101

6.CONCLUSIONES 107

7.BIBLIOGRAFÍA 109

8.ANEXO 123

1. INTRODUCCIÓN

Introducción

�

Los procesos de proliferación, diferenciación y muerte celular se

encuentran altamente coordinados en las células de los diferentes tejidos

que componen un organismo vivo. En las células tumorales se produce un

desequilibrio entre estos procesos dando como resultado una proliferación

celular descontrolada, un bloqueo de la diferenciación y una pérdida de

regulación de la muerte celular. Tradicionalmente, la investigación en el

área del cáncer se ha centrado en la identificación y caracterización de

genes involucrados en la regulación de la proliferación y la muerte celular.

Sin embargo, sabemos poco acerca de los mecanismos implicados en el

bloqueo de la diferenciación celular (Tenen, 2003). En la mayoría de los

casos, el grado de diferenciación es inversamente proporcional al potencial

proliferativo de las células, existiendo siempre un acoplamiento severo

entre proliferación y diferenciación. Se ha demostrado, por otra parte, que

la pérdida del potencial de diferenciación no es irreversible y, de hecho,

se conocen agentes químicos capaces de inducir la diferenciación de

células tumorales transformadas. A lo largo de los años, se han establecido

diversas líneas celulares leucémicas capaces de reiniciar el programa de

diferenciación, que han facilitado el estudio del mecanismo de acción de

algunos agentes inductores de la diferenciación celular y, a su vez, han

permitido desarrollar nuevos tratamientos para el cáncer basados en lo

que se ha denominado terapiasdediferenciación.

Uno de los objetivos del laboratorio donde se ha desarrollado la

presente tesis es la identificación y caracterización de factores involucrados

en el desbloqueo de la diferenciación en células eritroleucémicas. Como

principal modelo de estudio se util izan líneas celulares eritroleucémicas, en

este caso células MEL (Murine Erythroleukemia cell l ine), que constituyen

uno de los sistemas mejor caracterizados de reprogramación de células

tumorales hacia una diferenciación y división celular terminal (Marks y

col., 1978). Partiendo del sistema de diferenciación in vitro de las células

MEL en el presente trabajo se describe el establecimiento y análisis de

líneas resistentes a la acción de agentes inductores de la diferenciación

celular con el fin de identificar factores involucrados en el bloqueo de la

diferenciación de las líneas tumorales.

Introducción

�

1.1.Hematopoyesis

La hematopoyesis es un proceso altamente controlado que da lugar a

la formación de las células necesarias para el funcionamiento del sistema

inmune, el transporte de oxígeno y la hemostasis. Todas las células del

sistema hematopoyético se originan a partir de un progenitor pluripotente

común, las células madres hematopoyéticas (HSCs) (Morrison y col.,

1995). Las HSCs tienen la doble capacidad de autorenovarse y diferenciarse

para dar lugar a los diferentes linajes del sistema hematopoyético. esto

tiene lugar a través de una división celular asimétrica, donde a partir de una

HSC se produce una célula madre y una célula progenitora multipotente

que está determinada a diferenciarse para producir los distintos tipos

celulares del sistema hematopoyético (Knoblich, 2001). Las HSCs pueden

dar lugar a un progenitor l infoide (CLP) o a un progenitor mieloide (CMP).

Los CLPs dan lugar a los linfocitos -B y -T, mientras que los CMPs están

determinados a diferenciarse para dar lugar a un progenitor común

para granulocitos y macrófagos (GMP) o un progenitor común para los

linajes megacariocítico y eritroide (MEP). Cuando han completado la

maduración, las células diferenciadas abandonan la médula ósea y migran

al torrente sanguíneo y a los distintos tejidos para ejecutar su función. Se

ha estimado que se producen aproximadamente 3 billones de células al día

para mantener la homeostasis del sistema hematopoyético. Este proceso

está regulado por una combinación de factores extrínsecos e intrínsecos.

Entre los factores externos se encuentran las citoquinas y las hormonas así

como las interacciones con las células del estroma y la matriz extracelular

(Ogawa, 1993). Entre los factores internos se encuentran los factores de

transcripción que activan o inhiben la expresión de genes involucrados en

el programa de diferenciación. La alta tasa de productividad junto con el

estricto control de los diferentes procesos de maduración hacen que este

sistema sea vulnerable a los cambios que afectan el delicado balance entre

proliferación, diferenciación y muerte celular. En las leucemias se produce

un bloqueo de la producción de células diferenciadas que provoca una

acumulación anormal de células indiferenciadas a expensas de células

maduras y funcionales.

Introducción

�

1.2.Eritropoyesis

La eritropoyesis es el proceso de formación de los eritrocitos que tanto

en humanos como en ratones ocurre en la médula ósea del esternón, de los

huesos largos y de las costil las. El eritrocito maduro deriva de un progenitor

multipotencial que, mediante procesos no bien conocidos, se diferencia

en células formadoras de colonias eritroides, las BFU-E (formadoras de

colonias eritroides grandes y abundantes) y las CFU-E (formadoras de

colonias pequeñas y escasas) y seguidamente a proeritroblastos, las

primeras células de la serie roja identificables morfológicamente. Los

proeritroblastos maduran a normoblastos basófilos y luego a normoblastos

policromáticos en los que se inicia la síntesis de hemoglobina. Al final

del proceso, los normoblastos policromáticos maduran a normoblastos

ortocromáticos que al perder el núcleo evolucionan a reticulocitos.

Finalmente, los reticulocitos desarrollan en 2-4 días los eritrocitos maduros

que permanecen en la sangre durante 120 días. Los diferentes estadios

morfológicos de la diferenciación eritroide se representan en la Figura

1. La principal citoquina implicada en la mitogénesis, diferenciación y

superviviencia de la células eritroides es la eritropoyetina(Epo), la cual

se sintetiza en el riñón en respuesta a la demanda de oxígeno y la cantidad

de eritrocitos en sangre. La diferenciación mediada por la Epo depende

de la expresión del receptor de eritropoyetina (Epo-R), que comienza

en el estadio más temprano, el BFU-E, aunque el receptor es necesario

recién a partir del estadio de CFU-E.

Figura1.Estadiosdeladiferenciacióneritropoyética.Representación de los diferentes estadios morfológicos de la eritropoyesis. Se muestran fotos de células teñidas con May Grünwald-Giemsa que corresponden a cada estadio.

Proeritroblasto Normoblastobasofílico

Normoblastopolicromatofílico

Normoblastoortocromatofílico

Reticulocito Eritrocito

Introducción

�

1.3. Las células MEL como modelo de diferenciación in vitro

1.3.1.EstablecimientodelascélulasMEL

En el año 1966, Charlotte Friend y colaboradores establecieron

cultivos celulares derivados de tumores subcutáneos del bazo de

ratones infectados con un complejo vírico denominado complejo Friend

(Friend y col., 1966). Cuando se cultivaron las células MEL en un medio

semisólido se observaron eritroblastos en diferenciación, lo que sugería

la potencialidad inherente de las células MEL hacia la diferenciación

ertitroblástica. Posteriormente, estos datos fueron confirmados por varios

laboratorios (Marks y col., 1978; Singer y col., 1974). En el año 1971,

intentando transfectar células MEL, Friend observó que el DMSO era

capaz de inducir la reactivación del programa de diferenciación eritroide

(Friend y col., 1971). Este hallazgo fue crucial y supuso el reconocimiento

del sistema de diferenciación in vitro de las células MEL, conocidas

también como célulasFriend en honor a su descubridora, como modelo

de estudio de la diferenciación. A partir de ese momento un gran número

de compuestos polares han sido util izados para inducir la diferenciación de

las células MEL, entre los que destacan el HMBA y el DMSO. Algunos de

estos agentes como el ácido retinoico, el HMBA y los ácidos hidroxámicos

han sido util izados en pacientes que padecían determinados tipos de

leucemias (Leszczyniecka y col., 2001; Marks, 2007).

1.3.2.ElcomplejoFriend

El complejo Friend está formado por el SFFV (Spleen Focus

Forming Virus), un virus deficiente en replicación, responsable de la

transformación de los progenitores eritroides (Wolff y Ruscetti, 1985) y por

el F-MuLV (Friend Murine Leukemia Virus), que contiene los componentes

necesarios para la replicación del SFFV (Spiro y col., 1988). Existen

dos variantes del SFFV, el SFFV-P y el SFFV-A, que causan policitemia

y anemia, respectivamente (Mirand y col., 1968; Sassa y col., 1968;

Steinheider y col., 1979). A diferencia de otros retrovirus oncogénicos,

Introducción

�

el SFFV no expresa una forma mutante y constitutivamente activa de un

gen del huésped. En su lugar, codifica para una glicoproteína, la gp55,

que es capaz de unirse al receptor de eritropoyetina (Epo-R) y activarlo

de manera constitutiva (Figura 2). La gp55, codificada por el gen env,

es una glicoproteína quimérica con una región N-terminal homóloga a la

glicoproteína codificada por el gen env del MCF (Mink Cell Focus-Forming

Virus) y una región C-terminal que deriva de la glicoproteína gp70 del F-

MuLV (Lee y col., 2003). La dimerización del receptordeeritropoyetina(Epo-R) debido a la interacción con un homodímero de la gp55 produce

una activación de las mismas rutas de señalización activadas por Epo,

incluyendo la vías Jak2-Stat, Ras/Raf-1/MAPK y PI3K (Muszynski y col.,

1998; Nishigaki y col., 2000; Ohashi y col., 1995). Sin embargo, a diferencia

de la respuesta a Epo, la infección con el SFFV provoca una activación

constitutiva de estas vías de señalización.

Epo

Epo-R

gp55

Epo-R

a bEritroblasto normal Eritroblasto infectado conel complejo Friend

Membranaplasmática

Figura2.Activacióndel receptordeeritropoyetina (Epo-R)mediadapor lagp55.a) Activación del receptor de eritropoyetina (Epo-R) mediada por Epo en proeritroblastos normales. b) Activación constitutiva del receptor de eritropoyetina (Epo-R) por la glicoproteína gp55 del SFFV en proeritroblastos infectados con el complejo Friend.

El proceso de transformación de los progenitores eritroides infectados

con el complejoFriend puede dividirse en dos fases que se resumen en

el esquema de la Figura 3 (Ben-David y Bernstein, 1991). La etapa inicial,

conocida como fase pre-leucémica, se produce en las primeras horas

después de la infección y se caracteriza por la activación constitutiva del

Introducción

�

receptordeeritropoyetina(Epo-R) debido a la unión de la glicoproteína

gp55 del SFFV (Figura 2) (Ben-David y col., 1990; D’Andrea, 1992). Se

ha demostrado que la gp55 necesita interaccionar además con una forma

truncada del receptor STK (stem-cell kinase receptor) conocida como sf-STK (Zhang y col., 2006). Como consecuencia de la activación del receptor

de eritropoyetina (Epo-R) y de sf-STK se produce una expansión policlonal

de progenitores eritroides, principalmente de los compartimentos BFU-E y

CFU-E, lo que resulta en una esplenomegalia e hiperplasia masiva (Liao y

Axelrad, 1975; Peschle y col., 1980).

Friend Complex(SFFV + F-MuLV)

Charlotte Friend

FasePreleucémica

-proliferación policlonal de progenitores eritroides-hiperplasia masiva, esplenomegalia-proceso rápido (horas) en gran # de células-activación constitutiva del EpoR

Infección Eritroblastos

FaseLeucémica

-expansión clonal de células malignas (bazo, MO, hígado)-proceso lento (semanas), evento raro-capacidad de renovación ilimitada (inmortalización)-ausencia de respuesta a Epo-PU.1 y/o Fli-1 ; p53

Integración Locus PU.1

Figura 3. Transformación de progenitores eritroides infectados con el complejo Friend.Representación esquemática de las fases de la eritroleucemia inducida por el SFFV en ratones infectados con el complejo Friend formado por el Spleen Focus Forming Virus (SFFV) y el Friend Murine Leukemia Virus (F-MuLV).

Introducción

�

La segunda etapa, conocida como fase leucémica, es un proceso

lento, ocurre al cabo de 6-12 semanas después de la infección y se

caracteriza por la aparición de algunos clones de células malignas

que, a diferencia de los progenitores de la primera fase, han perdido la

capacidad de diferenciarse en respuesta a Epo (Tambourin y col., 1979).

Se ha demostrado que en el 95% de las eritroleucemias inducidas por el

complejo vírico Friend el SFFV se integra en el locus del gen Sfpi-1/PU.1

(SFFV Proviral Integration site-1/ Purine Rich) que codifica para la proteína

PU.1, un factor de transcripción específico del sistema hematopoyético

perteneciente a la familia Ets. El provirus se integra generalmente en

dirección contraria a la orientación transcripcional del gen, dentro de una

región de alrededor de 3 kb que se localiza a 10 kb corriente arriba del

primer exón del gen (Figura 4), y provoca la activación constitutiva del gen

Sfpi-1/PU.1 a través del LTR del SFFV (Moreau-Gachelin, 1994; Moreau-

Gachelin y col., 1990; Moreau-Gachelin y col., 1988; Paul y col., 1989).

SFFV-P

PU.1

1 2 3 4 5

Locus Sfpi-1

LTR LTR

gp55

Figura4.IntegracióndelSFFVenellocusSfpi-1delosprogenitoreseritroidesinfectadosconelcomplejoFriend. Esquema del locus Sfpi-1 donde se indican las probables zonas de integración del SFFV (flechas rojas), los exones que codifican para la proteína PU.1 (1-5, segmentos en verde) y la orientación transcripcional del SFFV y el gen Sfpi-1/PU.1 (flechas en morado). Se muestra la estructura del provirus indicando la glicoproteína gp55 codificada por el gen env y los LTRs (Long Terminal Repeat).

En la mayoría de los clones leucémicos se produce además una

inactivación de p53, ya sea debido a un silenciamiento del gen que codifica

para el supresor tumoral o a la expresión de una proteína mutada (Mowat y

col., 1985; Munroe y col., 1990). Las líneas celulares eritroleucémicas

presentan características propias del estadio de proeritoblasto y pueden

proliferar indefinidamente in vitro. Sin embargo, bajo la acción de agentes

Introducción

�

inductores de la diferenciación, las células MEL son capaces de diferenciarse

hasta un estadio equivalente al de normoblasto ortocromatofíl ico en

ausencia de Epo (Harrison, 1976; Housman y col., 1980; Marks y Rifkind,

1978; Rifkind, 1986; Tsiftsoglou y Robinson, 1985).

Se ha sugerido en diversas ocasiones que la activación de PU.1,

provocada por la integración del SFFV, es responsable del bloqueo de

la diferenciación de las células de la eritroleucemia murina (Rekhtman y

col., 1999; Zhang y col., 2000). Esta hipótesis se ha visto reforzada

al comprobar que la sobreexpresión de PU.1 induce eritroleucemia en

ratones transgénicos (Barnache y col., 1998). El análisis de los ratones

util izados en ese estudio reveló que PU.1 está directamente implicado en

el bloqueo de la diferenciación de los proeritroblastos. Todos estos datos

sugieren que PU.1 se comporta como un oncogen cuando se expresa en

progenitores eritroides.

La infección sólo con el F-MuLV, el retrovirus que complementa al

SFFV en el complejo Friend, también es capaz de inducir una eritroleucemia

caracterizada por anemia y esplenomegalia, aunque en estos casos la

infección sólo es efectiva en ratones recién nacidos (Silver y Kozak, 1986).

La transformación de ratones adultos requiere un tratamiento previo con

fenil-hidrazina (PHZ) para estimular la producción de progenitores eritroides

(Lee y col., 2003). A diferencia de la transformación inducida por el SFFV,

la eritroleucemia inducida por el F-MuLV no presenta una fase policlonal

pre-leucémica debido a que el F-MuLV carece de la glicoproteína gp55. Sí

en cambio en el 75% de los casos se produce una activación constitutiva

de otro miembro de la familia Ets, Fli-1 (Friend Leukemia Insertion site-

1), como consecuencia de la integración del F-MuLV en el locus del gen

fl i-1 (Ben-David y col., 1990).

1.3.3.EtapasdeladiferenciacióninducidadelascélulasMEL

Cuando se trata un cultivo de células MEL con un agente inductor

se producen una serie de cambios complejos que conducen a las células

de manera irreversible a la diferenciación hacia el l inaje eritroide (Figura

5). Inicialmente, las células tratadas con HMBA atraviesan un período

de latencia (12-24 horas) denominado pre-determinación, caracterizado

Introducción

�

por una represión general de la expresión génica en donde, eliminando

el agente inductor, las células vuelven al estado inicial. A partir de ese

momento, comienza la etapa de determinación en donde la células

adquieren la capacidad irreversible de cesar la división celular y expresar

las características del estado diferenciado, aún en ausencia del agente

inductor. A partir de las 72 horas de tratamiento se observa un porcentaje

importante de células que expresan marcadores eritropoyéticos y a las 96

horas más del 90% de las células están ya diferenciadas (Marks y Rifkind,

1978; Reuben y col., 1976; Vanegas y col., 2003).

Horas en HMBA

12-24 24-48 >72

Pre-determinaciónMEL Determinación Diferenciación

Figura 5. Representación esquemática del programa de diferenciación de las células MELinducido por el HMBA. Cuando las células MEL son tratadas con el agente inductor (HMBA) se produce la reactivación del programa de diferenciación eritroide. Durante las primeras 12-24 horas de tratamiento, las células se encuentran en una etapa reversible denominada pre-determinación. A las 24 horas de tratamiento, las células entran en el período de determinación, iniciándose la expresión de las características del estadio diferenciado. Finalmente a las 72 horas con HMBA, la mayoría de las células expresan marcadores propios del linaje eritroide, como las α y β globinas y se observan cambios morfológicos similares a los propios de eritrocitos adultos.

La inducción de la diferenciación de las células MEL va acompañada

de numerosos cambios que también son característicos de la diferenciación

de células eritroides en su entorno natural. Entre ellos se destacan

la inducción de la expresión de marcadores eritroides como las α y β

globinas, los grupos heme, la anhidrina carbónica, los receptores de la

espectrina y de la transferina, entre otros. Se producen también cambios

morfológicos característicos de la diferenciación eritroide: la relación de

volumen entre citoplasma y núcleo decrece, la cromatina se condensa y el

tamaño celular disminuye. Aunque en condiciones normales de cultivo las

células no llegan a perder el núcleo, se ha demostrado que en presencia

de fibronectina las células pueden eliminar el núcleo alcanzando la etapa

de reticulocitos (Patel y Lodish, 1987). La diferenciación culmina con el

Introducción

�0

cese de la división celular y la pérdida de la tumorigenicidad (Tsiftsoglou y

col., 2003a; Tsiftsoglou y col., 2003b; Volloch y Housman, 1982).

1.4.Induccióndeladiferenciación:respuestaalHMBA

Aunque han transcurrido casi cuarenta años desde el descubrimiento

del sistema de diferenciación inducida de las células Friend, se desconoce

aún el mecanismo util izado por los distintos agentes inductores para

reactivar el programa de diferenciación. Una de las hipótesis más

aceptadas es que los inductores activan diversas rutas de señalización

de forma similar a como ocurre en la eritropoyesis. Se sabe que en la

hematopoyesis normal los distintos factores de crecimiento interactúan

con los receptores de membranas de las células precursoras activando

rutas de señalización que provocan una activación/represión selectiva de

genes que controlan a su vez los procesos de proliferación, diferenciación

y apoptosis celular (Nicola, 1989).

La diferenciación de las células MEL en respuesta al tratamiento

con HMBA se desarrolla en varias fases. En etapas tempranas, previas

a la determinación celular, el inductor provoca una serie de cambios

metabólicos entre los que se incluyen una alteración en la permeabilidad

de la membrana plasmática debida a cambios en el flujo de Ca2+, Na+ y K+

(Bridges y col., 1981; Mager y Bernstein, 1978), un aumento transitorio

en la concentración celular de AMP cíclico, una rápida translocación de

PKC σ y ε del citosol a la membrana y la aparición de una forma de

PKC independiente de los niveles de Ca2+ y fosfolípidos (Gazitt y col.,

1978; Marks y col., 1996). Dado que no se han indentificado receptores

celulares para el HMBA u otros compuestos polares, se ha postulado que

los cambios en el potencial de la membrana plasmática serían la vía para

activar directa o indirectamente una o más rutas de señalización (Marks y

col., 1994).

Dentro de las vías de señalización específicas se ha observado que el

HMBA, al igual que Epo, activa la fosforilación de JAK2 y STAT5 en células

Friend. La activación de la fosforilación se inicia a partir de las 12 horas

de tratamiento con el inductor, alcanzando un pico a las 24 horas, que se

Introducción

��

mantiene hasta las 96 horas. De manera consistente, se comprobó que la

estimulación con HMBA resulta en un incremento de la unión de STAT5 al

DNA (Rane y Reddy, 2002). Otros agentes inductores de la diferenciación,

como el DMSO y el butirato de sodio, también activan la ruta JAK2/STAT5.

Se ha demostrado que la sobreexpresión de un dominante negativo de

STAT5 en la línea celular T3CI-2, transformada con el complejo Friend,

inhibe la capacidad del HMBA para inducir diferenciación (Yamashita y

col., 1998). Este dato podría estar en conjunción con un trabajo reciente

de Nishigaki y colaboradores en donde se demuestra que el bloqueo de

otro miembro de la familia STAT, STAT1, juega un papel clave en el proceso

de transformación de las células MEL (Nishigaki y col., 2006).

Finalmente, las vías de señalización activadas por el HMBA se

transmiten al núcleo donde se traducen en cambios selectivos de la

expresión génica. Existen evidencias de que otros eventos mediados

por el inductor, como las roturas de simple cadena o los cambios en la

configuración de la estructura de la cromatina, también podrían estar

involucrados en la inducción de la diferenciación de las células MEL

(Fibach y col., 1977; Friend y col., 1966; Friend y col., 1971).

1.5.DesbloqueodeladiferenciaciónencélulasMEL:cambiosanivelmolecular

1.5.1.Paradadelaproliferacióncelular

Durante el desarrollo normal de las células hematopoyéticas existe

una correlación inversa entre la proliferación y la diferenciación celular. El

hecho de que en la mayoría de los células tumorales se observe una pérdida

de los controles de la proliferación junto con la aparición de características

propias de células inmaduras refuerza la existencia de una relación inversa

entre ambos procesos. Después del tratamiento con un agente inductor de

la diferenciación como el HMBA, las células MEL se dividen un máximo de

4-5 veces más, dejan de proliferar y se acumulan en la fase G1/G0 del ciclo

celular (Rifkind y col., 1996). Aparentemente, el inicio de la diferenciación

se produce en la interfase G1/S del ciclo celular (Friedman y Schildkraut,

Introducción

��

1977; Geller y col., 1978). Estudios previos han puesto de manifiesto

que la diferenciación de las células MEL va acompañada de cambios

específicos en la expresión de factores relacionados con la regulación

de la proliferación celular. Entre los reguladores positivos de la división

celular, cuyos niveles de expresión descienden en respuesta a los agentes

inductores, se encuentran los protoncogenes c-myc, c-myb y c-jun y las

ciclinas dependientes de quinasas (cdks), específicamente cdk6 y cdk4

(Dmitrovsky y col., 1986; Lachman y Skoultchi, 1984; Matushansky y

col., 2000; Smith y Prochownik, 1992). Paralelamente, se produce una

activación de la expresión de genes que codifican para inhibidores del

ciclo celular como p21CIP1/WAF1, p27 KIP y mad1 (Hsieh y col., 2000; Larsson y

col., 1994).

Un hecho mayormente aceptado es que el cese de la división celular y

la activación de marcadores específicos del estadio diferenciado constituyen

dos eventos independientes (Tsiftsoglou y col., 2003a). Sin embargo, en

ocasiones se ha puesto de manifiesto la existencia de reguladores duales

capaces de controlar tanto la proliferación como la diferenciación celular

(Zhu y Skoultchi, 2001). En este sentido, Rylski y colaboradores demostraron

que el factor de transcripción GATA-1 es capaz de inhibir la proliferación

celular reprimiendo directamente la expresión de c-myc (Rylski y col., 2003).

Esto no impide que lleve a cabo su tradicional función como activador de

la expresión de genes marcadores de estadios diferenciados. Asimismo,

se ha comprobado que algunos factores involucrados en la regulación del

ciclo celular como p21CIP1/WAF1, p27KIP y Mad1 son capaces de inducir un

desbloqueo de la diferenciación celular (Cultraro y col., 1997a; Ohnuma y

col., 1999). Matushansky y colaboradores demostraron que la expresión de

Cdk6, cuyos niveles disminuyen rápidamente en respuesta a los agentes

inductores de la diferenciación, es capaz de inhibir la diferenciación de

células eritroleucémicas (Matushansky y col., 2003). Todos estos resultados

apoyan la teoría sobre la existencia de una coordinación exquisita entre

proliferación y diferenciación celular.

Introducción

��

1.5.2.La redMyc-Max-Mady la regulaciónde laproliferaciónyladiferenciacióncelular

1.5.2.1.LaFamiliaMyc

Las proteínas de la familia Myc, en particular c-, N- y L-Myc, están

involucradas en proliferación, crecimento celular, apoptosis e inhibición

de la diferenciación celular. Estas oncoproteínas están activadas directa o

indirectamente en más del 70% de los tumores humanos y su sobreexpresión

provoca la desregulación de la proliferación celular (Grandori y col.,

2000; Nilsson y Cleveland, 2003). En condiciones fisiológicas normales

la expresión de c-myc es necesaria y suficiente para la entrada en la

fase S del ciclo celular (Evan y Littlewood, 1993; Hanson y col., 1994).

Experimentos en una línea celular de fibroblastos heterocigota para el

protoncogen demostraron que la reducción en los niveles de c-Myc resulta

en un retraso de la transición entre las fases G0 y S del ciclo celular.

Este retraso estaría relacionado principalmente con la reducción en los

niveles de ciclina E (Evan y Littlewood, 1993; Hanson y col., 1994). Por el

contrario, la inhibición de c-myc induce la salida del ciclo celular y acelera

la diferenciación de células MEL tratadas con DMSO (Prochownik y col.,

1988).

c-Myc, así como el resto de los miembros de la familia, pertenecen

al grupo de factores de transcripción que contienen un dominio bHLHZip

(basic/helix-loop-helix/leucine zipper) (Figura 6). El dominio característico

bHLHZip se localiza en el extremo C-terminal y consta de una región básica

de unión a DNA y una región HLHZip que regula la interacción proteína-

proteína. En el extremo N-terminal se encuentra el dominio transactivador

(TAD) con dos regiones altamente conservadas, la caja Myc 1 (MB1) y

la caja Myc 2 (MB2), importantes en la regulación de la estabilidad de c-

Myc. La proteína contiene además una señal de localización nuclear (NLS)

y un dominio central acídico que contiene varios sitios de fosforilación

que podrían ser importantes para la función de c-Myc. En condiciones

normales, la vida media de la proteína es muy corta, ya que es rápidamente

ubiquitinizada y degradada por la maquinaria del proteasoma. En las

células tumorales, sin embargo, el mecanismo de control que regula la

Introducción

��

expresión de c-Myc se ha perdido, lo que resulta en niveles anormalmente

altos de la proteína (Alitalo y col., 1987; Henriksson y Luscher, 1996).

En ese sentido, se ha observado una alta frecuencia de mutaciones

puntuales en la secuencia codificante de c-myc en linfomas de Burkitt,

l infomas asociados a la infección con HIV y en cierto tipo de leucemias

linfoblásticas agudas (Marcu y col., 1992). Estas mutaciones se localizan

principalmente en el dominio de transactivación dentro o cerca de la cajaMyc1(MB1), siendo el residuo treonina 58 el más frecuentemente mutado

(Hoang y col., 1995). Como resultado se produce una inhibición de la

fosforilación de la treonina 58, involucrada en la degradación de c-Myc,

dando lugar a una estabilización anormal de la proteína (Bahram y col.,

2000).

Figura6.DominiosestructuralesdelosmiembrosdelasfamiliasMyc,Mad,Max,MntyMga.Esquema representativo de las estructuras de los factores bHLHZip de la red Myc-Max-Mad. a) Los miembros de la familia Myc (c-Myc, N-Myc y L-Myc). MB1 (Myc Box 1) y MB2 (Myc Box 2) son dominios altamente conservados, presentes en todos los miembros de la familia, indispensables para las funciones activadoras y/o represoras de la transcripción. TAD, dominio transactivador de c-Myc. b) Las isoformas de Max. Max puede formar homodímeros o heterodímeros con todos los miembros de la red a través del dominio bHLHZip, la región básica (b) confiere especificidad de unión a la secuencia CACGTG. c) Los miembros de la familia Mad. SID, dominio tipo alfa hélice N-terminal que les permite interaccionar con los co-represores transcripcionales Sin3a y Sin3b. NLS, señal de localización nuclear.

Para poder actuar, ya sea como activador o represor transcripcional,

c-Myc requiere la formación de un heterodímero con la proteína Max, a

través de sus respectivos dominios bHLHZip (Blackwood y Eisenman,

1991; Blackwood y col., 1992). El complejo Myc:Max se une a las cajas E

a

b

MB1 TAD MB2 NLS b HLHZipc-Myc

1 439

MB1 MB2 b HLHZipN-Myc

1 462

MB1 MB2 b HLHZipL-Myc

1 364

MaxL MaxSNLSb HLHZip

1601

NLSb HLHZip

1511

NLSSID b HLHZipMad1 Mxi1

1 220

Mad3 Mad4SID b HLHZip

1 206

SID b HLHZip

1 209SID b HLHZip

1 220

c

Introducción

��

(CACGTG o CATGTG), elementos reguladores presentes en los promotores

de muchos genes, y activa la transcripción de los genes diana de c-Myc

para estimular la proliferación, la transformación o la apoptosis celular. La

actividad transactivadora de c-Myc depende además del reclutamiento de

proteínas capaces de modificar la estructura de la cromatina como SWI/

SNF y la acetiltransferasa de histonas TRAPP/hGCN5 (Figura 7) (Dugan y

col., 2002; McMahon y col., 1998; Park y col., 2001; Park y col., 2002).

c-Myc

GCN5

TRRAP

Max

CACGTG

HDAC-1,-2

MaxMad1

Ski/SnoSin3A/B

N-COR

CACGTG

Figura7.RegulacióntranscripcionalatravésdelaredMyc-Max-Mad.Los complejos Myc:Max se unen a los elementos CACGTG (también CACATG) y activan la transcripción de sus genes diana. La capacidad de Myc para activar la transcripción depende de la asociación con su co-activador TRAPP el cual, a su vez, recluta a la acetiltransferasa de histonas GCN5. Por el contrario, los complejos Mad:Max se unen a los mismos sitios reprimiendo la expresión de los genes diana. Esta actividad represora de la transcripción está mediada por los co-represores Sin3a y Sin3b, N-CoR y Ski y las desacetilasas de histonas 1 y 2 (HDAC-1,-2).

1.5.2.2.LafamiliaMad

La proteína Max es capaz de formar homodímeros y heterodímeros

con otros factores de transcripción que contienen el dominio bHLHZip

(Figura 6). Entre estos factores se encuentran, además de c-Myc, los

miembros de la familia Mad (Mad1, Mxi, Mad3 y Mad4) y las proteínas Mnt

(Rox) y Mga. Se ha demostrado que estas 6 proteínas funcionan como

antagonistas de Myc, capaces de competir con c-Myc por la dimerización

con Max para luego unirse a las cajas E y reprimir la expresión de los

genes diana de c-Myc (revisado en (Baudino y Cleveland, 2001)). De

entre estos antagonistas de c-Myc, sólo Mad1 y Mad4 son característicos

de estadios diferenciados (Queva y col., 1998). Las familias Mad,MaxyMyc constituyen, por lo tanto, una red compleja que regula la transición

proliferación/no proliferación o proliferación/diferenciación (Figura 7).

Introducción

��

Debido a que Max se expresa de manera constitutiva, son los niveles

de Myc y Mad los que determinan que se produzca una activación o una

inhibición de la proliferación celular, respectivamente. Se ha demostrado

que el represor transcripcional Mad1 es capaz de antagonizar la capacidad

de c-Myc para inducir proliferación y apoptosis (Gehring y col., 2000). La

represión transcripcional mediada por Mad1 se produce a través de un

complejo que incluye los co-represores N-Co-R y Sin3a/Sin3b, las HDACs

1 y 2 y las proteínas Ski y Sno (Figura 7) (Baudino y Cleveland, 2001).

Estudios previos de Cultraro y colaboradores demostraron que la expresión

ectópica de Mad1 es capaz de inducir un desbloqueo de la diferenciación

de células MEL (Cultraro y col., 1997a).

1.5.3.Regulacióntranscripcionaldelaeritropoyesis

Los factores de transcripción específicos del sistema hematopoyético

juegan un papel clave en la diferenciación de los precursores celulares

hacia los distintos linajes (revisado en (Cantor y Orkin, 2001; Cantor y

Orkin, 2002; Shivdasani y Orkin, 1996)). El hecho de que muchos de estos

factores se vean implicados en translocaciones cromosómicas o inserciones

virales que pueden ser causa de distintos tipos de leucemias en humanos

y ratones resalta la importancia de estos reguladores en la diferenciación

hematopoyética. Tal es el caso de las proteínas de fusión AML1/ETO y PML/

RARα que se producen como resultado de translocasiones cromosómicas

en un 25% de los casos de leucemia aguda mieloide (AML) y en un 95%

de los casos de leucemia aguda promielocítica (APL), respectivamente.

En el caso de inserciones virales en ratones, los casos mejor estudiados

son PU.1 y Fli-1, dos factores de transcripción de la familia Ets que

se activan como consecuencia de la integración del SFFV y el F-MuLV,

respectivamente.

Durante la última década los esfuerzos por comprender las bases

moleculares de la diferenciación eritropoyética llevaron a la identificación

de varios factores de transcripción linaje-específicos que incluyen a GATA-1, SCL/TAL-1, EKLF, LMO2/RBTN2, p45 NF-E2, entre otros (revisado en

(Cantor y Orkin, 2002; Perry y Soreq, 2002)). El factor de transcripciónGATA-1 es un mediador central de la diferenciacióneritroide que regula,

Introducción

��

además de su propia transcripción, la expresión de las globinas, las enzimas

involucradas en la síntesis de los grupos heme (ALAS-S, ALA-D, PBG-

D), el inhibidor de apoptosis Bcl-XL, GATA-2, NF-E2 y algunos factores

involucrados en proliferación celular, como c-Myc, c-Myb y Cdk6 (Ferreira y

col., 2005). Los experimentos realizados con células madres demostraron

que aquéllas que no expresan GATA-1 son capaces de diferenciarse y dar

lugar a los diferentes tejidos de ratón a excepción de los eritrocitos (Pevny y

col., 1991). Un análisis más detallado util izando ratones quiméricos reveló

que los precursores eritroides que carecen de GATA-1 son incapaces

de diferenciarse más allá del estadio de proeritroblasto (Pevny y col.,

1995). Estos resultados corroboran que GATA-1 es indispensable para la

diferenciación de los progenitores eritroides.

La proteína GATA-1 se une a la secuencia (T/A)GATA(A/G) presente

en la mayoría de los promotores y potenciadores de genes relacionados

con el estadio eritropoyético y megacariocítico diferenciado (Orkin, 1992;

Weiss y Orkin, 1995). GATA-1 contiene dos dominios “dedos de zinc”

localizados en los extremos N- y C- terminal. Ambos son necesarios para

la unión al DNA y para la interacción con otras proteínas como FOG-1,

LMO2, EKLF, CBP y PU.1 (Figura 8) (Ferreira y col., 2005).

FOG-1

COOHNH2

CBP/p300EKLFSP-1Fli-1

PU.1

Figura8.Interaccionesproteína-proteínadeGATA-1.Representación esquemática de la proteína GATA-1. Los sitios de unión de las proteínas que interaccionan con GATA-1 están indicados mediante barras negras horizontales. Los segmentos negros representan los dos dominios “dedos de zinc”.

Se conoce además que la acetiltransferasa CBP (CREB-Binding

Protein) acetila a GATA-1 en dos motivos ricos en lisinas altamente

conservados, y que se localizan cerca de los dominios “dedo de zinc“

(Boyes y col., 1998; Hung y col., 1999). Se ha comprobado que la

acetilación de GATA-1 resulta en un incremento en la eficiencia de unión

Introducción

��

a DNA (Boyes y col., 1998). La mutación de estos sitios o el bloqueo de

la acetilación, como ocurre con la proteína de fusión AML1/ETO, inhiben

la capacidad de GATA-1 para inducir la diferenciación de progenitores

eritroides, lo cual demuestra que la acetilación de GATA-1 juega un papel

clave en la regulación de su función transactivadora (Boyes y col., 1998;

Choi y col., 2006). Se ha comprobado que la sobreexpresión de GATA-1

induce la diferenciación espontánea de las células MEL y que la acetilación

de GATA-1, a través de CBP, juega un papel fundamental en este proceso

(Choe y col., 2003; Hong y col., 2002).

1.5.4.GATA-1,ungenmaestro?

A finales de los años 80 el grupo de Harold Weintraub, del Fred

Hutchinson Cancer Research Center (USA), aisló e identificó Myo-D

como un gen regulador de la diferenciación del músculo esquelético. Más

allá de regular la activación de genes del l inaje muscular, el grupo de

Weintraub demostró que Myo-D era capaz de convertir en mioblastos a

células de diferentes orígenes como fibroblastos, condriocitos, neuronas

y otras (Weintraub y col., 1991). Esto originó la idea de la existencia de

“genes maestros” de los distintos linajes celulares, capaces de orquestar

el programa de diferenciación. La hipótesis de la existencia de un “gen

maestro” que regula la determinación hacia un linaje específico no ha

encontrado una correspondencia plena en el l inaje eritroide. Uno de

los factores que se asemeja a Myo-D en su modo de acción es GATA-1, capaz de activar genes marcadores de eritropoyesis y provocar la

determinación hacia el l inaje eritroide. Sin embargo, GATA-1 también se

expresa en células pertenecientes a otros linajes, como por ejemplo en

células de Sertoli, megacariocitos y eosinófilos, y juega un papel crítico

en la diferenciación de los dos últimos (Ito y col., 1993; Martin y col.,

1990; Romeo y col., 1990; Vyas y col., 1999; Yomogida y col., 1994; Yu y

col., 2002; Zon y col., 1993). Por último, su capacidad para disparar la

determinación en otros sistemas es reducida (Layon y col., 2007). Todos

estos datos hacen dudar de la capacidad de GATA-1 para actuar como

“gen maestro” del l inaje eritroide. Actualmente, se reconoce que la

eritropoyesis es un proceso altamente complejo regulado, más que por

Introducción

��

un único “gen maestro”, por una combinación de factores de transcripción

que forman complejos multiproteicos cuya composición varía a lo largo

de la diferenciación (Perry y Soreq, 2002). En esta complicada red de

interacciones la activación directa de factores específicos se completa con

efectos inhibidores de factores característicos de programas alternativos

(i.e. interacción GATA-1/PU.1), distintas combinaciones de un número

variable de factores (i.e. GATA-1/FOG, GATA-1/Gfi-1B, etc), la variabilidad

cuantitativa de los distintos factores, etc (Rodriguez y col., 2005; Starck y

col., 2003; Stopka y col., 2005).

En los últimos años se ha añadido un nivel de complicación

adicional condicionado por la acumulación de datos relativos a la

estructura de la cromatina. Los cambios epigenéticos juegan un papel

clave en el silenciamiento y la activación de genes específicos durante

la diferenciación celular. Estudios previos han puesto de manifiesto

la implicación de los cambios en la metilación del DNA en el proceso

de transformación oncogénica (Jones y Laird, 1999). La metilación del

DNA de supresores tumorales es un mecanismo frecuente de represión

transcripcional en procesos oncogénicos (Baylin y col., 2000; Bird y Wolffe,

1999; Jones y Laird, 1999). Tal es el caso de la proteína de fusión PML/

RARα que bloquea la diferenciación mieloide mediante el reclutamiento

de complejos represores que contienen DNA metiltransferasas y HDACs

que inhiben la transcripción de genes diana del ácido retinoico (Di Croce y

col., 2002). El tratamiento con drogas antitumorales resulta, en muchos

casos, en una demetilacióndelDNA con la consecuente reactivación de

la expresión génica y la reversión del fenotipo transformado (Di Croce y

col., 2002). Asimismo, el uso de inhibidores de las DNA metiltransferasas

y las HDACs provoca una aceleración de la reactivación del programa de

diferenciación. En este sentido, se ha demostrado que el tratamiento con

5-aza-2’-deoxicitidina(5-Aza-2’-dC) potencia la diferenciación de células

mieloides leucémicas inducida por el ácido retinoico y los análogos de

la vitamina D3, incluso en el caso de células que no responden a estos

inductores (Lotem y Sachs, 2002).

Introducción

�0

1.6.PU.1yelbloqueodeladiferenciacióneritroide

PU.1 es un miembro de la familiaEts de factores de transcripción,

que se caracteriza por el alto grado de homología de todos los miembros

en el dominio de unión a DNA, localizado generalmente en el extremo C-

terminal (Figura 9). Este dominio, conocido como dominioEts, reconoce

una secuencia consenso rica en purinas, GGA(A/T), con secuencias

adyacentes que dan la especificidad a cada miembro. Dos componentes de

la familia, PU.1 y Fli-1, inicialmente identificados como transactivadores,

están involucrados en hematopoyesis.

El gen Sfpi-1/PU.1 que codifica para el factor de transcripción PU.1

fue inicialmente identificado como el gen diana del SFFV, causante de la

Dominio Ets

Ets IDIDAD HLHETS (Ets-1, Ets-2)

Ets ADAD HLHFli-1 (Erg,FEV)

EtsADPU.1 (SPI, Spi-1, Spi-B, etc)

EtsHLHGAPBß binding

ELG (GABPα)

Ets IDIDADPEA3 (ER71, ER81, ERM, etc)

EtsADELF (Elf-1, Elf-2, ESX/ESE-1, etc)

Ets ID IDAD (RD)SRF binding

TCF (Elk-1, Sap-1, Net, Netb)

ERF (PE1/METS, PE2/ERF) Ets RD

HLH RDmSin3A N-CoR binding

TEL (TEL/ETV6, TEL2) Ets

Figura9.EstructuradelosmiembrosdelafamiliadeproteínasEts.Dominio ets de unión a DNA (Ets); región hélice-loop-hélice (HLH), dominio activador (AD), dominio auto-inhibidor (ID) y dominio represor (RD).

Introducción

��

transformación de precursores eritroides (Moreau-Gachelin y col., 1988).

Experimentos posteriores demostraron que la infección de cultivos de

médula ósea de ratón con un retrovirus que expresa PU.1 provoca un

bloqueo de la diferenciación eritroide (Schuetze y col., 1993). Asimismo,

la sobreexpresión de PU.1 induce eritroleucemia en ratones transgénicos,

confirmando que PU.1 es un regulador negativo de la eritropoyesis

(Barnache y col., 1998). Sin embargo, PU.1 es un factor indispensable

para la diferenciación granulocítica y monocítica del sistema mieloide,

así como para la diferenciación de los linfocitos B (Figura 10) (Kastner y

Chan, 2007). Esto coloca a PU.1 como un factor que actúa positivamente

en el caso del sistema mieloide o linfoide, pero que se comporta como un

oncogen cuando se activa en el sistema eritroide.

HSCs

PU.1

PU.1

PU.1

CLPs

CMPs

MEPs

GMPs

Pro-T Pre-T

Pro-B Pre-B

Linfocito T

Linfocito B

Monocito

Granulocito

Eritrocito

Megacariocito

Figura10.PapeldePU.1en la regulaciónde ladiferenciaciónhematopoyética.Las células madres hematopoyéticas (HSCs) dan lugar a dos tipos de progenitores. Los progenitores linfoides (CLPs) se diferencian para producir linfocitos T y B, mientras que los progenitores mieloides (CMPs) dan lugar a progenitores comunes para granulocitos y eosinófilos (GMPs) y progenitores comunes para megacariocitos y eritrocitos (MEPs). La activación de PU.1 es esencial para la transición de HSC a CLP y la diferenciación de los GMPs hacia monocitos. Por el contrario, la inactivación de PU.1 es esencial para la transición de CMPs a MEPs.

Introducción

��

Se ha sugerido que el mecanismo principal mediante el cual PU.1

inhibe la eritropoyesis se basa en su capacidad para antagonizar con

GATA-1 (Figura 11) (Rekhtman y col., 1999; Zhang y col., 2000). Existen

evidencias que indican que ambos factores de transcripción interaccionan

a través de sus respectivos dominios de unión a DNA (Liew y col., 2006;

Zhang y col., 1999).

Figura11.AntagonismoGATA-1/PU.1duranteladiferenciaciónhematopoyética.Ambas proteínas inhiben sus respectivas funciones mediante mecanismos distintos. GATA-1 inhibe la función de PU.1 bloqueando la interacción con su co-factor c-Jun mientras que PU.1 se une a GATA-1 y recluta un complejo represor que inhibe la transcripción de sus genes diana. Ambos factores de transcripción autorregulan su expresión (líneas punteadas). Según este modelo, GATA-1 y PU.1 inhiben la capacidad del otro para activar la transcripción del receptor del factor activador de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF-R) y del receptor de eritropoyetina (EPO-R), respectivamente, inhibiendo la diferenciación hacia los linajes mieloide y eritroide.

GATA-1 inhibe a PU.1 bloqueando la interacción con su cofactor

c-Jun en mieloblastos (Zhang y col., 1999) mientras que PU.1 se une y

bloquea a GATA-1 en células eritroides (Rekhtman y col., 2003; Rekhtman

y col., 1999). El grupo de Skoultchi, del Albert Einstein College of Medicine

(USA), demostró en células MEL que PU.1 se une a GATA-1 cuando este

último está unido al promotor de sus genes diana. En el mismo trabajo se

sugiere que PU.1, en cooperación con la proteína del retinoblastoma (Rb),

c-JUN

Célula Madre

GATA

Precursormieloide

Precursoreritroide

GM-CSF-RExpresión del

EPO-RExpresión del

PU.1

Señalactivadora

Introducción

��

recluta un complejo represor que incluye a la HP1α y a la metiltransferasa

de histonas Suv39h, provocando el silenciamiento de la cromatina (Figura

12) (Stopka y col., 2005).

gata

Rb Suv39HHP1a

H3K9Me H3 (H3.3)K9Ac

gata

GATA-1

CBP

GATA-1

PU.1a b

Represión de la expresión de las dianas de GATA-1

Activación de la expresión de las dianas de GATA-1

Figura12.ModelodelaregulacióndeactividadtranscripcionaldeGATA-1mediadaporPU.1encélulasMEL.Se muestran las proteínas y las modificaciones de las histonas presentes cerca de los sitios de unión de GATA-1 a la cromatina cuando los niveles de PU.1 son lo suficientemente altos para reprimir la expresión de los genes diana de GATA-1 (a) y cuando los niveles de PU.1 se reducen produciéndose una reactivación de la expresión de los mismos (b). Se indica la unión de la proteína del retinoblastoma (Rb), la HP1a unida a H3K9Me (flecha con dos puntas) y la Suv39H y la CBP que causan metilación y acetilación (flechas), respectivamente.

Nishigaki y colaboradores han sugerido un mecanismo diferente para

explicar el bloqueo de la diferenciación de las células eritroleucémicas

mediado por PU.1 (Nishigaki y col., 2006). Esta teoría no excluye sin

embargo, la derivada del clásico antagonismo GATA-1/PU.1. Este

mecanismo estaría relacionado con la regulación de las proteínas STAT1/3

(Signal Transducers and Activators of Transcription 1/3), cuya

activación está bloqueada en células MEL. En condiciones normales, la

asociación de Epo a su receptor resulta en la fosforilación de las proteínas

STAT1/3 que luego de dimerizar se translocan al núcleo y se unen al DNA

de sus genes diana (Figura 13) (Ohashi y col., 1995; Penta y Sawyer,

1995). Esta fosforilación está bloqueada en las células eritroleucémicas

debido la sobreexpresión de la fosfatasa Shp-1 que a su vez está inducida

por PU.1. En la presente tesis se analiza la activación de la fosforilación

de STAT1 en una línea eritroleucémica derivada de MEL-DS19 en donde

el gen Sfpi-1/PU.1 está silenciado (MEL-R).

Introducción

��

Epo

JAK2

P

P

P

P

P

PSTAT

DímeroSTAT

Núcleo

Citoplasma

Activación de la expresión de las dianas de STAT

Epo-R

Figura13.ActivacióndelasproteínasSTATmediadaporlaactivacióndelreceptordeeritropoyetina(Epo-R).La activación del receptor de eritropoyetina (Epo-R) debido a la unión de Epo resulta en la fosforilación de las proteínas STAT a través de JAK2. Las proteínas STAT fosforiladas forman dímeros que se translocan al núcleo para activar la expresión de sus genes diana.

1.7.Fli-1yelbloqueodeladiferenciacióneritroide

Fli-1 (Friend leukemia insertion site-1) es otro miembro de la familiaEts que fue identificado por el grupo de Ben-David como el sitio de

integración preferido del F-MuLV en precursores eritroides (Ben-David y

col., 1991). Al igual que PU.1, Fli-1 posee una zona altamente conservada

de unión a DNA responsable de la asociación a una secuencia consenso

rica en purinas, GGA(A/T), de una gran variedad de regiones reguladoras

de la transcripción, virales y celulares (Figura 9) (Macleod y col., 1992;

May y col., 1993).

Introducción

��

Cuando el F-MuLV actúa en solitario, sin formar parte del complejo

Friend, es capaz de producir eritroleucemias sólo en líneas susceptibles

de ratones recién nacidos (Ben-David y Bernstein, 1991). Como ya se

mencionó previamente (Sección 1.3.2.), las eritroleucemias inducidas por

el F-MuLV no exhiben una fase pre-leucémica típica, caracterizada por la

expansión de eritroblastos. La primera alteración genética que se detecta

en células infectadas por el F-MuLV es la integración del provirus en el

locus del gen Fli-1, evento que ocurre en el 75% de los casos y que afecta

a la autoregeneración de las células progenitoras (Ben-David y col., 1990;

Howard y col., 1993). La inmortalización de las células requiere además

la pérdida de p53 y la activación de Bcl-2, procesos que le confieren

una ventaja selectiva de crecimiento (Howard y col., 1996; Howard y col.,

2001; Pereira y col., 1999; Tamir y col., 1999).

La activación de Fli-1 a causa de la integración de un provirus se

ha descrito además en leucemias distintas del tipo B o distintas del tipo

T inducidas por el Cas-Br-E y en leucemias granulocíticas inducidas por

el Gaffy MuLV (Bergeron y col., 1991; Denicourt y col., 1999). Fli-1 se

activa también en células del sarcoma de Ewing como resultado de una

translocación cromosómica. Esto da lugar a la formación de una proteína

quimérica en donde se fusionan el dominio de unión a DNA de Fli-1 con una

proteína de unión a RNA (EWS) del cromosoma 22 de humanos (Delattre y

col., 1992). En conjunto, todos estos datos que describen la expresión

aberrante del gen, en el tiempo o en la forma, sugieren que Fli-1 posee un

gran potencial oncogénico.

El modo de acción de Fli-1 recuerda sin duda al de PU.1. Actúa

como un regulador positivo y necesario durante el desarrollo de un linaje

celular determinado, en este caso el megacariocítico, pero tiene actividadoncogénica en precursores eritroides. En este trabajo, se analiza

el potencial de Fli-1 para bloquear el proceso de diferenciación como

alternativa del ausente PU.1 en líneas eritroleucémicas resistentes a los

agentes inductores de la diferenciación (MEL-R).

Introducción

��

1.8. Lecciones del SFFV y del modelo in vitro de célulasMEL

Desde que Charlotte Friend describió la inducción de eritroleucemias

en ratones infectados con el complejoFriend (Friend, 1957), el retrovirus

y la enfermedad que lleva su nombre se han convertido en una herramienta

valiosa para el estudio de la eritropoyesis. Varios aspectos del proceso

tales como la vía de señalización de Epo, el mecanismo de desarrollo de

las leucemias y la patogénesis retroviral han sido objeto de análisis en las

células Friend (Ney y D'Andrea, 2000).

La policitemia inducida por el SFFV en ratones presenta una gran

similitud con la enfermedad policitemiavera de humanos. Esta enfermedad

de origen clonal, que afecta a precursores hematopoyéticos, origina una

sobreproducción de células sanguíneas, especialmente glóbulos rojos

(Golde y col., 1981). Al igual que ocurre durante la fase pre-leucémica de

ratones infectados con el SFFV, en los pacientes con policitemiavera se

produce un incremento en la formación de BFU-Es y CFU-Es en ausencia

de Epo (Casadevall y col., 1982). Se ha sugerido que los progenitores

eritroides de los pacientes podrían expresar una proteína análoga

a la gp55 del virus que es capaz de interaccionar con el receptor de

eritrpoyetina (Epo-R) y activarlo de manera constitutiva (Ruscetti, 1995).

Alternativamente, estos pacientes podrían presentar mutaciones en el gen

que codifica para el receptor de eritropoyetina (Epo-R) que resulten en

una activación aberrante del receptor (Ruscetti, 1995). En la medida que

avancemos en el conocimiento del mecanismo de activación del receptor

por el SFFV, podremos empezar a diseñar terapias para contrarrestar

está activación que, a su vez, podrían aplicarse en el tratamiento de

pacientes con policitemiavera u otras enfermedades asociadas con una

desregulación de la eritropoyesis.

El estudio de las células Friend ha sido útil además para identificar

genes que están involucrados en la susceptibil idad de los ratones a la

transformación con el complejo vírico (Axelrad, 1969). Dentro de este

grupo se ha identificado el locus Fv2 (Friend virus susceptibil ity 2) donde

se encuentra el gen que codifica para una forma truncada del receptor con

actividad tirosina quinasa STK (sf-STK) que carece del dominio extracelular

Introducción

��

pero conserva los dominios transmembrana y quinasa (Persons y col.,

1999). Se ha demostrado que los ratones que no expresan sf-STK son

resistentes a la infección con el complejo Friend. Esta resistencia no se

debe a una interferencia con la entrada del retrovirus o a alteraciones en su

ciclo vital sino a la influencia de sf-STK en la determinación de la capacidad

de la gp55 para inducir la proliferación de los eritroblastos infectados con

el SFFV (Lilly, 1970). De manera consistente con estos resultados, se ha

propuesto que el gen Fv2 podría estar involucrado en la regulación del ciclo

celular de las BFU-Es (Suzuki y Axelrad, 1980). Debido a que las BFU-Es

son las dianas principales de la infección retroviral, el efecto de Fv2 sobre

la proliferación explicaría la importancia de sf-STK para el desarrollo de la

eritroleucemia mediada por el SFFV. En un modelo inicial se planteó que la

gp55 mediaría una interacción funcional entre el receptor de eritropoyetina

(Epo-R) y sf-STK. Sin embargo, Zhang y colaboradores demostraron que

la glicoproteína gp55 del SFFV-P interacciona de forma independiente con

sf-STK y el receptor de eritropoyetina (Epo-R) para inducir eritroblastosis

y policitemia, respectivamente (Zhang y col., 2006). La identificación de

sf-STK permite ampliar el conocimiento de los mecanismos de resistencia

al cáncer en ratones y, por extrapolación, en humanos.

Por otra parte, el modelo de la eritroleucemia murina constituye

también un sistema ampliamente util izado en la investigación del mecanismo

de acción de los distintos agentes inductores de la diferenciacióncelular. Desde el hallazgo del DMSO como un agente inductor de la

diferenciación de las células MEL (1971), se han desarrollado una gran

variedad de compuestos químicos capaces de reactivar la diferenciación e

inhibir la tumorigenicidad de células leucémicas. Entre estos compuestos

se encuentra el HMBA que ha servido de punto de partida para el desarrollo

de compuestos polares de segunda generación que son hasta 2000 veces

más activos, entre los que destacan el EMBA (dietil-bis-[pentametileno-

N,N-dimetilcarboxamida]malonato) y los ácidos hidroxámicos como el SAHA

(suberoylanilida ácido hidroxámico) y el CBHA (ácido m-carboxicinámico

bis-hridroxiamida) (Marks y Breslow, 2007). Uno de estos compuestos, el

SAHA, actúa como un inhibidor de las HDACs que activa la acetilación

de histonas, factores de transcripción y proteínas involucradas en la

regulación de la proliferación, la migración y la muerte celular. En ensayos

Introducción

��

clínicos, el SAHA ha mostrado una potente actividad anticancerígena, tanto

en tumores sólidos como hematológicos a dosis que son bien toleradas

por los pacientes (Marks, 2007; Marks y Breslow, 2007). En conjunto,

estos datos confirman la validez de las células de la eritroleucemia murina

como modelo para el estudio del mecanismodeacciónde losagentesantitumorales y el desarrollo de nuevas terapias anticancerígenos.

2. OBJETIVOS

Objetivos

��

Uno de los objetivos del laboratorio en donde se ha llevado a cabo

la presente tesis doctoral es avanzar en el conocimiento de cómo la

transformación oncogénica perturba el equilibrio proliferación-diferenciación

y cómo estas perturbaciones pueden ser revertidas, restableciendo de ese

modo los controles normales. Como modelo de trabajo se utilizan células

eritroleucémicas que, aunque inmortalizadas por la integración de un

complejo vírico, son capaces de reiniciar el programa de diferenciación.

En el presente trabajo se describe el establecimiento y análisis de líneas

resistentes a la acción de agentes inductores de la diferenciación celular con

el fin de identificar factores involucrados en el bloqueo de la diferenciación

de las líneas tumorales. Los objetivos concretos de este trabajo fueron:

- Establecer y caracterizar líneas eritroleucémicas resistentes a la acción

de los agentes inductores de la diferenciación celular, en este caso el

HMBA.

- Analizar el papel del factor de transcripción PU.1 en el desbloqueo de

la diferenciación en respuesta a los agentes inductores.

- Investigar la potencialidad de las líneas resistentes para reiniciar el

programa de diferenciación hacia el linaje eritroide. Determinar el efecto de

la inhibición de la proliferación celular o de la sobreexpresión de reguladores

del linaje eritroide sobre el desbloqueo de la diferenciación de las líneas

resistentes.

- Analizar las posibles causas de la inhibición de la actividad del gen

regulador GATA-1 en las líneas resistentes.

3. MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales y Métodos

��

3.1.Cultivoscelulares

3.1.1.Líneascelulares

MELDS-19. (Murine erythroleukemia cell line). Línea celular cedida por el

laboratorio del Dr. Arthur I. Skoultchi del Albert Einstein College of Medicine

(USA). Deriva de una de las líneas originales establecidas por Charlotte

Friend a partir de tumores subcutáneos de ratones infectados con el complejo

vírico Friend (Friend y col., 1966; Marks y Rifkind, 1978) formado por el

SFFV (Spleen Focus Forming Virus) y el MuLV (Murine Leukemia Virus).

CB7.Línea celular establecida en el laboratorio del Dr. Yaacov Ben-David del

Department of Medical Biophysics, University of Toronto (Canadá). Derivada

de colonias aisladas de bazo de ratones BABL/c infectados al nacer con el

MuLV (Shibuya y Mak, 1983).

DP18.Línea celular establecida en el laboratorio del Dr. Yaacov Ben-David

del Department of Medical Biophysics, University of Toronto (Canadá).

Derivada de células de bazo de ratones DBA/2 infectados con el SFFV (Ben

David y col., 1988).

MEL-R. Línea celular derivada de MEL DS-19 establecida durante el

transcurso de esta tesis. Las MEL-R se seleccionaron mediante pases

sucesivos en presencia de N,N´-Hexamethylene-bis-acetamide (HMBA)

(Sigma) 5 mM durante 6-8 semanas (ver resultados apartado 4.1.1.).

293T. Línea celular originada a partir de células epiteliales de riñón de

embrión humano transformadas con el DNA del adenovirus tipo 5 que llevan

integrada una copia de la región temprana del genoma de SV40 (ATCC:

CRL-11268).

3.1.2.TransfectantesestablesderivadosdeMEL-R

MEL-RpMTHbetaglobin.neo.Transfectante estable derivado de MEL-R que

contiene integrado el vector de expresión pMTHbetaglobin.neo que confiere

resistencia a neomicina y es inducible por ZnCl2.

MEL-RpMTH.neo.GFP-Mad.Transfectante estable derivado de MEL-R que

contiene integrado el vector de expresión pMTH.neo-GFP-Mad.

MEL-R pSUPER.retro.neo+GFP. Transfectante estable derivado de MEL-

Materiales y Métodos

��

R que contiene integrado el vector de expresión pSUPER.retro.neo+GFP

(OligoEngine).

MEL-RpSUPER.neo+GFP.Myc.Transfectante estable derivado del MEL-R

que contiene integrado el vector de expresión pSUPER.neo+GFP-Myc.

MEL-RpEBBpuro.ERTransfectante estable derivado de MEL-R que contiene

integrado el vector de expresión pEBBpuro.ER.

MEL-RpEBBpuro.GATA-ERTransfectante estable derivado de MEL-R que

contiene integrado el vector de expresión pEBBpuro.GATA-ER.

MEL-R pEBBpuro.PU.1-ER Transfectante estable derivado de MEL-R que

contiene integrado el vector de expresión pEBBpuro.PU.1-ER.

3.1.3.Condicionesdecultivo

Las líneas celulares MEL DS-19, MEL-R y 293T, así que como las líneas

transfectantes derivadas de MEL-R, se mantuvieron en medio de cultivo básico

Eagle Modificado por Dulbeco (DMEM) (Life Technologies, Inc.). Las líneas

celulares CB7 y DP18 se mantuvieron en medio Mínimo Esencial alfa (alpha-

MEM) (Life Technologies, Inc.). Los medios de cultivo se complementaron

con penicilina a una concentración de 100 U/ml (Life Technologies, Inc.),

estreptomicina a una concentración de 100 µgr/ml (Life Technologies,

Inc.) y suero fetal bovino (GIBCO, Euroclone y PAA laboratories GMBH),

previamente inactivado a 55ºC, a una concentración final del 10% (v/v). Los

medios de los transfectantes se complementaron con 5 µgr/ml de puromicina

(Sigma) o con 600 µgr/ml de geneticina (G418) (Calbiochem). El cultivo de

las células MEL-R se llevó a cabo en presencia de HMBA 5 mM. Las células

se incubaron a 37ºC, en atmósfera húmeda, en presencia de CO2 al 5%.

3.1.4.Ensayosdediferenciación

3.1.4.1.TratamientoconHMBALas células MEL son líneas celulares inmortalizadas capaces de reiniciar el

programa de diferenciación bajo la acción de un agente inductor. A lo largo de

este trabajo se utilizó como agente inductor el HMBA, disuelto en agua estéril

a una concentración final de 5 mM (Reuben y col., 1976). El tratamiento con

HMBA se llevó a cabo en cultivos celulares en crecimiento exponencial a

Materiales y Métodos

��

una concentración de 2-3x105 células/ml, recogiéndose muestras a distintos

tiempos. La incubación se realizó bajo las mismas condiciones descritas

para el mantenimiento de los cultivos celulares.

3.1.4.2.TratamientoconotrosagentesinductoresdeladiferenciacióneritroideEl dimetil sulfóxido (DMSO), el butirato de sodio y la hemina son agentes

inductores de la diferenciación de células eritroleucémicas (Friend y col.,

1971; Malinin y Ebert, 1980; Rutherford y col., 1979). El tratamiento con

DMSO al 1%, hemina 50 µM o butirato de sodio 0,5 mM se llevó a cabo en se llevó a cabo en

cultivos celulares en crecimiento exponencial a una concentración de 2-

3x105 células/ml, recogiéndose muestras a distintos tiempos. La incubación

se realizó bajo las mismas condiciones descritas para el mantenimiento de

los cultivos celulares.

3.1.4.3.TratamientoconTPAEl tratamiento con 12-o-tetradecanoil-forbol-13-acetato (TPA) para inducir

la diferenciación hacia el linaje megacariocítico se llevó a cabo en células

MEL y MEL-R en crecimiento exponencial (2-3x105 células/ml). Los cultivos

se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Life Technologies, Inc.) suplementado

con suero fetal bovino, penicilina y estreptomicina a las concentraciones

descritas en el apartado 3.1.3., en presencia de distintas dosis de TPA (1 y

10 nM). Se recogieron muestras a distintos tiempos y se analizó el efecto

sobre la ploidía celular. Se determinó la expresión del marcador alfa-2b-

beta-3 -integrina (αIIbβ3), específico de megacariocitos, mediante citometría

de flujo.

3.1.4.4.Tratamientocon5-Aza-dCLa 5-Aza-2’-deoxicitidina (5-Aza-2-dC) es un inhibidor de las metiltransferasas

que provoca la demetilación del DNA y, por lo tanto, un desbloqueo de la

expresión génica. Se analizó el efecto de distintas concentraciones de 5-

Aza-2-dC (0,2; 0,4; 0,8 y 10 µM) sobre la viabilidad celular en células MEL-

R y se determinó el efecto de la dosis óptima (0,4 µM) sobre el desbloqueo

de la diferenciación. El tratamiento con 5-Aza-2-dC se llevó a cabo en

células MEL-R en crecimiento exponencial (2-3x105 células/ml) cultivadas

Materiales y Métodos

��

en presencia o ausencia de HMBA 5mM, recogiéndose muestras a distintos

tiempos. La incubación se realizó bajo las mismas condiciones descritas

para el mantenimiento de los cultivos celulares. La expresión de PU.1 se

analizó mediante RT-PCR semicuantitativa.

3.1.4.5.TratamientoconTSALa Tricostatina A (TSA) es un inhibidor de las deacetilasas de histonas (HDAC)

capaz de provocar un desbloqueo de la expresión génica. Los cultivos de

células MEL y MEL-R se mantuvieron en presencia de TSA (50 nM) durante

5 días. Se recogieron muestras a distintos tiempos y se analizó la expresión

de PU.1 mediante RT-PCR.

3.1.5.Ensayodebenzidina

Las células diferenciadas se detectaron mediante el ensayo de benzidina

(Gusella y col., 1976; Marks y Rifkind, 1978). La benzidina reacciona con

los grupos heme de la hemoglobina produciendo una coloración azul en las

células diferenciadas. Se mezclaron volúmenes iguales de una suspensión

celular y de una solución 77,7 mM de dihidrocloruro de benzidina (Sigma)

conteniendo 0,3% de peróxido de hidrógeno (Merck). Se incubó durante 10

minutos a temperatura ambiente y se realizó un contaje celular distinguiendo

las células teñidas (diferenciadas) de las no teñidas (no diferenciadas). Para

realizar preparaciones citológicas permanentes se recogieron 1x106 células

a distintos tiempos de tratamiento con HMBA, se lavaron con PBS 1X y se

trataron con benzidina. Las células se centrifugaron 3 minutos a 700 rpm

sobre un portaobjetos utilizando una citocentrífuga (Cytospin 3 SHANDON).

Se agregó una gota del medio de montaje EUKITT (O. Kindler GmbH 86), se

colocó un cubreobjetos y se dejó secar a temperatura ambiente.

3.1.6.TinciónconazuldetoluidinayMayGrünwald-Giemsa

Se recogieron 1x106 células, se lavó el pellet con PBS 1X y se centrifugó

3 minutos a 700 rpm utilizando una citocentrífuga (Cytospin 3 SHANDON).

Las preparaciones se incubaron 10-20 minutos con azul de toluidina (Sigma)

disuelto en agua destilada a una concentración final de 1mg/ml, se lavó

Materiales y Métodos

��

durante un minuto con agua destilada y se secó al aire. Para la tinción May

Grünwald-Giemsa, se incubó durante 5 minutos con May Grünwald (Sigma)

y se lavó en tampón fosfato (20-70 mmol/l), pH 7.2, durante un minuto. A

continuación se incubó durante 15-20 minutos con Giemsa (Sigma) disuelto

1:20 en agua desionizada, se lavó con agua desionizada y se secó al aire.

Las preparaciones se montaron utilizando el medio de montaje EUKITT (O.

Kindler GmbH 86).

3.1.7.TratamientoconFibronectina

La membrana plasmática de las células MEL contiene una proteína de 140

KDa que se une de manera específica a fibronectina (Fn) (Patel y Lodish,

1986). Estudios previos han demostrado que las células MEL son capaces de

diferenciarse a reticulocitos cuando se mantienen adheridas a una matriz de

fibronectina (Patel y Lodish, 1987). El tratamiento con fibronectina (Roche),

diluida en PBS 1X a una concentración final de 50 µg/ml, se llevó a cabo en

células MEL y MEL-R en crecimiento exponencial. Los cultivos se mantuvieron

durante 6 días en presencia de HMBA (5mM) en placas de petri pre-tratadas

durante 1-2 horas a 15- 25ºC con 1-2 ml de fibronectina. Se recogieron

muestras cada 24 horas. Se realizaron preparaciones citológicas.

3.1.8.Cinéticadecrecimientoyviabilidadcelular

La cinética de crecimiento se realizó contabilizando las células con ayuda

de una cámara de Neubauer bajo una lupa MZ6 (Leica) a intervalos de 24hr

durante al menos 3 días. La viabilidad celular se determinó mediante el

método de exclusión del colorante azul de tripano. Se mezclaron volúmenes

iguales de una suspensión celular y de azul de tripano (Sigma) al 0,5%

disuelto en PBS 1X y se cuantificó el número de células no teñidas (vivas)

y teñidas de azul (muertas). En ambos casos se realizaron contajes de al

menos 3 muestras de cultivos independientes.

Materiales y Métodos

��

3.1.9. Distribución en las distintas fases del ciclo celular.Determinacióndeltamañocelular

La distribución de las células a lo largo del ciclo celular se determinó en

función del contenido de DNA mediante la incorporación de ioduro de

propidio (IP) (Crismann, 1973). Se centrifugaron 3-5x105 células durante 5

minutos a 1000 rpm, se lavó el pellet con PBS 1X y se resuspendió en una

solución que contenía PBS 1X, NP-40 al 0,05%, 60 µgr/ml de RNAsa A y 25

µgr/ml de PI. Las muestras se incubaron 20 minutos a temperatura ambiente

y se analizaron en un citómetro de flujo EPICS-XL Coulter que opera a 200

mW, usando una longitud de onda de 488 nm emitida por un láser de argón

con un pico de emisión de 590 nm. La determinación del tamaño celular se

llevó a cabo a partir del 3x105 células. Se centrifugó a 1000 rpm 5 minutos,

se lavó el pellet con PBS 1X y se resuspendió en 300 µl de PBS 1X. Las

muestras se analizaron midiendo la dispersión frontal (forward scattering,

FS) en el citómetro de flujo.

3.2.Transfeccionesconvectoresdeexpresión

3.2.1.Construccióndeplásmidos

pSTBlue-1.Mad. Derivado de pSTBlue-1 AccepTor Vector (Novagen). Se

clonó la secuencia codificante de Mad-1, obtenida mediante PCR usando

como molde cDNA de MEL y como cebadores los oligonucleótidos Mad fw y

Mad rv, en el vector pSTBlue-1 AccepTor Vector.

pEGFP-C1.Mad. Derivado de pEGFP-C1 (Clontech). Se subclonó la secuencia

codificante de Mad-1 obtenida a partir vector pSTBlue-1.Mad digerido con

BamHI y SalI en el vector pEGFP-C1 digerido con las mismas enzimas.

pSTBlue-1.GFP-Mad. Derivado de pSTBlue-1 (Novagen). Se clonó la

secuencia codificante de la proteína de fusión GFP-Mad, obtenida mediante

PCR usando como molde el vector pEGFP-C1.Mad y como cebadores

los oligonuclétidos GFP fw y pEGFPC1 rv, en plásmido pSTBlue-1

AccepTorVector.

pMTH.neo.GFP-Mad. Derivado de pMTHbetaglobin.neo. La secuencia

codificante de la proteína GFP-Mad obtenida a partir del vector pSTBlue-

Materiales y Métodos

��

1.GFP-Mad digerido con BamHI se insertó en el vector pMTHbetaglobin.neo

digerido con la misma enzima.

pSUPER.retro.neo+GFP.Myc. Derivado del pSUPER.retro.neo+GFP

(OligoEngine). Se clonó un fragmento de 64 pb con extremos BamHI y BglII

que contiene la secuencia correspondiente a las posiciones 987-1005 del

exón II del mRNA de c-myc murino en el vector pSUPER.retro.neo+GFP

(Figura 14). La secuencia diana para inhibir la expresión de c-myc fue: 5’-

GAACATCATCATCCAGGAC-’3.

Figura 14. Esquema del siRNA-Myc. El vector pSUPER.GFP-Neo.myc-i se construyó clonando un fragmento de 64 pb con extremos BamHI y BglII que contiene la secuencia correspondiente a las posiciones 987-1005 del exón II del mRNA de c-myc murino en el vector pSUPER.retro.neo+GFP. La secuencia diana para inhibir la expresión de c-myc fue 5’-GAACATCATCATCCAGGAC-’3.

AA5’ 3’GAACATCATCATCCAGGAC

Secuencia diana (c-myc exón 2)

5’-GATCCCGAACATCATCATCCAGGACttcaagagaGTCCTGGATGATGATGTTCTTTTTGGAAA-3’

5’-GGGCTTGTAGTAGTAGGTCCTGtctcttgaaCAGGACCTACTACTACAAGAAAAACCTTTTCGA-3’

Oligos

Ligación

LoopSense Antisense Term. PolII

BglII

BamHI

5’-GAACAUCAUCAUCCAGGACu u c

aa

a g a gGAACAUCAUCAUCCAGGACUU3’-

pSUPER.retro.neo+GFP.Myc

myc-i

H1 Promoter

PGK

Neo-GFP

Materiales y Métodos

��

pEBBpuro.GATA-ER.Derivado de pEBBpuro. Construido en el laboratorio

del Dr. Arthur I. Skoultchi. Contiene la secuencia codificante de GATA-1

fusionada al dominio de unión a estrógeno del receptor de estrógeno humano.

Se contruyó clonando un fragmento BamHI-NotI que contenía la secuencia

codificante de la proteína de fusion GATA-ER en el vector pEBBpuro digerido

con las mismas enzimas (Choe y col., 2003).

pEBBpuro.PU.1-ER.Derivado de pEBBpuro-ER. Se amplificó la secuencia

codificante de PU.1 mediante PCR utilizando como molde cDNA de células

MEL y como cebadores los oligonucleótidos PU.1-ER fw y PU.1-ER rv.

El producto de RT-PCR, que contenía dianas de restricción para BamHI,

fue digerido e insertado en el vector pEBBpuro.ER digerido con la misma

enzima.

3.2.2.Transfeccionesestablesconcationeslipídicos

Se utilizaron 3-5 µgr de DNA plasmídico resuspendido en 0,15 ml de medio

DMEM sin suero (solución A). Se mezclaron 50 µl de lipofectina (Life

Technologies, Inc.) con 0,1 ml de medio DMEM sin suero (solución B) y se

incubó 30-45 minutos a temperatura ambiente. Se mezcló la solución A con

la solución B y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se

añadió la mezcla (A+B) a 5x106 células MEL-R resuspendidas en 0,7 ml de

medio DMEM sin suero y se incubó durante 6 horas a 37ºC en un incubador

de CO2. El aislamiento de clones se llevó a cabo mediante selección de

clones GFP-positivos utilizando un separador de células modelo FACS

Vantage (Becton-Dickinson) o realizando diluciones en serie para distribuir

las células uniformemente en placas de 96 pocillos a una concentración de

1x103 células por pocillo.

3.2.3.Seleccióndetransfectantes

Las líneas transfectadas con pEBBpuro se seleccionaron en 5 µgr/ml de

puromicina cambiándose el medio cada 3 días. Aquellas transfectadas con

pMTHbetaglobin.neo y pSUPER.retro.neo+gfp se seleccionaron en 600 µgr/

ml de G418. Los clones recombinantes se transfirieron a frascos de cultivo

para su amplificación. El análisis de la diferenciación celular se llevó a cabo

Materiales y Métodos

��

en presencia de 5 mM de HMBA. En el caso de los transfectantes estables

derivados de MEL-R que contienen vectores inducibles los cultivos se

mantuvieron además en presencia o ausencia de 100 µM de ZnCl2 (pMTH.

neo.GFP-Mad) o 1x10-7 M de β-estradiol (pEBBpuro.GATA-ER y pEBBpuro.

PU.1-ER).

3.3.PreparaciónyanálisisdeDNA

3.3.1.ExtracciónypurificacióndeDNAplasmídico

Se transformaron bacterias de Escherichia coli de la cepa DH5αF´ con los

plásmidos correspondientes según el protocolo de Hanahan (Hanahan,

1986). Se amplificaron los cultivos en medio selectivo y se aisló DNA

plasmídico utilizando el sistema de extracción High Pure Plasmid Isolation

Kit (Roche).

3.3.2.ExtracciónypurificacióndeDNAgenómico

Se centrifugaron 1x107 células, se lavó el pellet con PBS 1X, se resuspendió

en 3 ml del buffer de lisis (NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM a pH 8.0, EDTA

25 mM a pH 8.0, SDS al 0,5% y Proteinasa K 0,1 mg/ml) y se incubó en

un horno a 55ºC durante 16 horas. Se añadieron 200 U de RNAsa A y se

incubó 20 minutos a 37ºC. Después de centrifugar a 14000 rpm durante 5

minutos a temperatura ambiente para eliminar los restos celulares y añadir

2 ml de TEN (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM y NaCl 150 mM), la muestra

se desproteinizó con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) (PCIA).

Finalmente, el DNA se precipitó con 2,5 volúmenes de etanol al 100% frío.

Se centrifugó a 9000 rpm durante 30 minutos a 4ºC, se lavó con etanol al

70% y se resuspendió en 200 µl de H2O destilada.

Materiales y Métodos

�0

3.3.3. Transferencia, marcaje e hibridación del DNA separado engelesdeagarosa(Southern)

3.3.3.1.TransferenciaasoportessólidosUna vez realizada la electroforesis en geles de agarosa al 0,7%, los geles

se trataron con ácido clorhídrico 0,25 M durante 15 minutos y se lavaron con

agua destilada. El DNA se transfirió por capilaridad en condiciones alcalinas

a membranas de nylon (Zeta Probe, Bio-Rad).

3.3.3.2.MarcajeradiactivodesondasLas diferentes sondas empleadas en esta tesis fueron marcadas con 40 µCi

del precursor radiactivo {α-32P} dCTP, mediante la técnica del random priming

extension utilizando el sistema Ready-to-go de Amersham-Pharmacia. Las

sondas marcadas se purificaron en columnas Sephadex-50 de la misma casa

comercial. Los plásmidos empleados en este trabajo con los correspondientes

fragmentos utilizados como sondas son los siguientes:

- fragmento EcoRI-XhoI de 600 pb del cDNA de la β-globina murina,

contenido en el plásmido pSK+ (Allen y col., 1987).

- plásmido pSTBlue-1.PU.1, conteniendo la secuencia codificante de

PU.1 murino.

- fragmento PstI de 700 pb del cDNA de c-myc murino, contenido en el

plásmido pMC-myc54 (Lachman y Skoultchi, 1984).

- fragmento PstI de 800 pb (sonda A) correspondiente a las posiciones

-12353 a -13124 del locus PU.1 murino, contenido en el plásmido

C45a6b (Moreau-Gachelin y col., 1988).

3.3.3.3.HibridacióndeDNALa solución empleada para hibridar DNA consistió en SSPE 2X (NacCl 360

mM, Na2HPO4×7H2O 20 mM y EDTA 2 mM a pH 8.0), leche descremada al

0,5%, sulfato de dextrano al 10%, SDS al 1% y 0,5 mg/ml de DNA de esperma

de salmón sonicado y desnaturalizado. En todos los casos se realizó una

prehibridación de 3-4 horas a 65ºC en la misma solución. A continuación

se añadió la sonda marcada y desnaturalizada (1x106 cpm/ml) y se incubó

a 65 ºC durante 16 h.Finalizado el tiempo de hibridación las membranas se

lavaron sucesivamente con SSC 2X/SDS 0,1%; SSC 0,5X/SDS 0,1%; SSC

Materiales y Métodos

��

0,1X/ SDS 0,1%, este último precalentado a 65ºC, durante 15 minutos en

cada caso. Para las autoradiografías se emplearon películas AGFA Curix

RP2.

3.3.4.SecuenciacióndeDNA

Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo en el Servicio de

Secuenciación Automática del CIB (CSIC), empleando un secuenciador

automático ABI Prism 3700 DNA Analyser de Applied Biosystems.

3.4.PreparaciónyanálisisdeRNA

3.4.1.ExtracciónypurificacióndeRNA

El aislamiento y purificación de RNA total de cultivos celulares se llevó a cabo

utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen Life Technologies). Se centrifugaron

5-10x106 células, se lavó el pellet con PBS 1X y se resuspendió en 1 ml de

Trizol. El homogeneizado se incubó 5 minutos a temperatura ambiente, se

añadieron 200 µl de cloroformo, se agitó con vórtex y se incubó 2-3 minutos

a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron a 12300 rpm durante

15 minutos a 4ºC y se recuperó la fase acuosa. El RNA se precipitó con 500 µl

de isopropanol, se lavó con etanol al 75% y se resuspendió en agua tratada

con DEPC. Finalmente, se realizó una valoración espectrofotométrica de la

concentración y pureza del RNA.

3.4.2. Transferencia, marcaje e hibridación del RNA separado engelesdeagarosa(Northern)

3.4.2.1.ElectroforesisytransferenciaasoportessólidosSe disolvieron alícuotas de 20 µg de RNA total en una solución desnaturalizante

(formamida 50%, formaldehído 6%, ácido bórico 0,5 M, borato de sodio 50

mM, sulfato de sodio 100 mM, EDTA 10 mM, glicerol 50% y púrpura de

bromocresol 0,74%). Se calentó la muestra durante 5 minutos a 65ºC y

se fraccionó en geles de agarosa al 1,2% con bromuro de etidio 0,5 µg/

ml y formaldehído 3% en tampón borato (ácido bórico 0,5 M, borato de

Materiales y Métodos

��

sodio 50 mM, sulfato de sodio 100 mM y EDTA 10 mM). Se transfirió por

capilaridad a membranas de nylon (Zeta Probe, Bio-Rad) en SSC 10X y se

fijó el RNA exponiendo la membrana a 1200 µJ en un UV StratalinkerTM 1800

de Cultek.

3.4.2.2.HibridacióndeRNAEl marcaje de las sondas se describe en el apartado 3.3.3.2. Se prehibridó

1-2 horas en una solución que contenía Na2HPO4 0,3 M, NaH2PO4 0,2M,

SDS 7%, EDTA 1mM a pH 8.0 y BSA 1%. A continuación se añadió la sonda

marcada y desnaturalizada (2-10x 106 cpm/ml) y se incubó durante 16 h a

65ºC.

Finalizado el tiempo de hibridación se lavaron las membranas dos veces

en una solución de SSC2X/SDS 0,1% a temperatura ambiente y una vez en

una solución de SDS 0,1X/SDS 0,1% a 50ºC durante 5 minutos. Para las

autoradiografías se emplearon películas AGFA Curix RP2.

3.5.RT-PCR

Se sintetizó cDNA a partir de RNA total de células MEL y MEL-R utilizando

oligo dT15 2,5 µM, dNTPs 0,5 mM, SUPERase IN 1 U/µl (AMBION) y 200 U de

transcriptasa reversa M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) (USB). Las

condiciones utilizadas en la reacción enzimática fueron: 10 minutos a 25ºC,

45 minutos a 42ºC y 15 minutos a 99ºC. La amplificación del cDNA por PCR

se llevó a cabo utilizando cebadores a una concentración de 0,5 µM, MgCl2

2mM, dNTPs 0,2 µM y de 2-5 U de las DNA polimerasas recombinantes

Recombitaq (LINUS) y Expand High Fidelity PCR System (Roche). Todos los

oligonucleótidos empleados en esta tesis fueron suministrados por Roche

Molecular Biochemicals (Tablas I y II).

Materiales y Métodos

��

TablaI.Oligonucleótidos empleados en el desarrollo de la tesis.Cebador Forward (fw) Reverse (rv)

Myb 5’-GATGATGGGCGCCCCACTCAA-3’ 5’-CTCACATGACCAGAGTTCGAG-3’

Myc 5’-ACGACGATGCCCCTCAAC-3’ 5’-GTTTATGCACCAGAGTTTCG-3’

Mad-1 5’-GAAGATCTGCAGGATGGCGACAGCCG-3’ 5’-GAAGATCTGAGGTGGAGAGGACTCTC-‘3

GFP 5’-GAACCGTCAGATCCGCTAG-3’ 5’-CAACAGCCACAACGTCTATA-3’

pEGFPC1 5’-GAGAAGCGCGATCACATGGT-3’ 5’-GGTATGGCTGATTATGATCAG-3’

p27 5’-GAGGAGGAAGATGTCAAACGT-3’ 5’-CACCGGA GCTGTTTACGTCT-3’

GATA-1 5’-CCCCAGTGTTCCCATGGATTTTCCTG-3’ 5’-AAGGTCAAGGCTATTCTGTGTACCT-3’

GATA-2 5’-CACCACCCGATACCCACCTAT-3’ 5’-CCATGGCAGTCACCATGCT-3’

FOG-1 5’-CCAGAGAAGATGTGAGCCCA-3’ 5’-GTTTCTCTTCCGTCGCCGAG-3’

Gfi-1b 5’-CTGCTGTAATTCCTGTGGCA-3’ 5’-TGAAGGCTTTGCCACACATC-3’

EKLF 5’-TAGCCTCATAGCCCATGAGGCAGAAGA-3’ 5’-CATCCCCAGTCCTTGTGCAGGATCAC-3’

Fli-1 5’-GAACTCTGGCCTCAACAAAAG-3’ 5’-TGTCTCTGTTGGATGTGGCTG-3’

PU.1 5’-GGATCTGACCAACCTGGAGC-3’ 5’-GCTCAGGAGCCTGGCGGTCTCT-3’

PU.1-ER 5’-GGGGCACCTGGTCCTGAG-3’ 5’-CGCGGATCCGAGTGGGGCGGGAGGCG-3’

GAPDH 5’-ACAACAGTCCATGCCATCAC-3’ 5’-TCCACCACCCTGTTGTA-3’

Shp1 5’-CAGGATGGTGAGGTGGTTT-3’ 5’- CTCAAACTCCTCCCAGAAG-3’

TablaII.Descripción de las condiciones de las reacciones de PCR

Producto Cebadores Desnaturalización Anillamiento Elongación Nºdeciclos

c-myb Myb fw; Myb rv 95ºC 30’ 63ºC 1’ 72ºC 1’ 30

c-myc Myc fw; Myc rv 94ºC 1’ 64ºC 1’ 72ºC 1’ 30

mad-1 Mad-1 fw; Mad-1 rv 94ºC 1’ 65ºC 1’ 72ºC 1’ 30

GFP-Mad pEGFPC1 fw; Mad-rv 94ºC 1’ 65ºC 1’ 72ºC 1’ 30

p27 p27 fw; p27 rv 94ºC 1’ 55ºC 1’ 72ºC 1’ 25

GATA-1 GATA-1 fw; GATA-1 rv 94ºC 1’ 66ºC 1’ 72ºC 1’ 25

GATA-2 GATA-2 fw; GATA-2 rv 94ºC 30’’ 62ºC 30’’ 72ºC 30’’ 30

FOG-1 FOG-1 fw; FOG-1 rv 94ºC 30’’ 65ºC 30’’ 72ºC 30’’ 30

Gfi-1b Gfi-1b fw; Gfi-1b rv 94ºC 30’’ 65ºC 30’’ 72ºC 30’’ 30

EKLF EKLF fw; EKLF rv 94ºC 1’ 66ºC 1’ 72ºC 1’ 25

Fli-1 Fli-1 fw; Fli-1 rv 94ºC 1’ 60ºC 1’ 72ºC 1’ 30

PU.1 PU.1 fw; PU.1 rv 94ºC 1’ 66ºC 1’ 72ºC 1’ 30

PU.1.ER PU.1-ER fw; PU.1-ER rv 94ºC 1’ 66ºC 1’ 72ºC 1’ 30

GAPDH GAPDH fw; GAPDH rv 94ºC 10’’ 65ºC 30’’ 72ºC 2,5’ 20

Shp1 Shp1 fw; Shp1 rv 94ºC 1’ 55ºC 1’ 72ºC 1’ 30

Materiales y Métodos

��

3.6.Preparaciónyanálisisdeproteínas

3.6.1.Purificacióndeproteínas

3.6.1.1.ObtencióndeextractosproteicostotalesLa extracción de proteínas totales de MEL, MEL-R, CB-7, DP18 y 293-T se

llevó a cabo a partir de 5-10x106 células. Se centrifugó a 1000 rpm durante 5

minutos a 4ºC, se lavó el pellet dos veces con PBS 1X frío y se resuspendió

en el tampón de lisis de Laemmli (Tris-HCl 65mM a pH 6.8, glicerol 10%, 2-

-mercaptoetanol 5% y SDS 1%) suplementado con 1% (v/v) de un cóctel de

inhibidores de proteasas (Sigma). A continuación se desnaturalizó a 95ºC

durante 10 minutos y se sonicó en frío. Para separar las proteínas de los

restos celulares se centrifugó a 14500 rpm durante 10 minutos a 4ºC. La

concentración de las diferentes muestras se valoró utilizando el reactivo

Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad).

3.6.1.2.ObtencióndeextractosproteicosnuclearesLa extracción de proteínas nucleares para inmunoprecipitación (IP) de MEL

y MEL-R se llevó a cabó a partir 2-4x107 células. Se centrifugó a 3000

rpm durante 15 minutos a 4ºC, se lavó el pellet dos veces con PBS 1X, se

resuspendió en 1 ml del tampón A (Hepes-KOH 10 mM a pH 7.9, MgCl2 1,5

mM y KCl 10 mM) suplementado con inhibidores de proteasas (Complete

Mini EDTA-free, Roche) y se incubó en hielo durante 10 min. A continuación

se agitó mediante vórtex durante 10 segundos y se centrifugó a 14000 rpm

durante 15 segundos para eliminar la fracción citoplasmática. Los núcleos

se resuspendieron en 300-500 µl del tampón C (Hepes-KOH 10 mM a pH 7.9,

MgCl2 1,5 mM, NaCl 0,42 M y glicerol 25%) suplementado con inhibidores de

proteasas. Se incubó en hielo durante 20 minutos y se centrifugó a 14000 rpm

durante 15 minutos a 4ºC. El sobrenadante constituyó el extracto nuclear.

La concentración de las diferentes muestras se valoró utilizando el reactivo

Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad).

Materiales y Métodos

��

3.6.2.Separaciónelectroforéticadeproteínaseinmunodetección(Western)

La separación de proteínas se realizó en geles de SDS-poliacrilamida del

10-15% según el método Laemmli (Laemmli, 1970) utilizando el sistema

de separación electroforética Mini-Protean (Bio-Rad). La transferencia a

membranas de PVDF (InmobilonTM-P, Millipore) se llevó a cabo mediante

electrotransferencia húmeda (Mini-Protean, Bio-Rad) durante 2 horas a 100

V. Las membranas se bloquearon con agente bloqueante de membranas

(Amersham) o albúmina de suero bovino al 5% en TBST (Tris-HCl 20mM,

NaCl 150 mM y Tween-20 al 0,1%) durante 2 horas a temperatura ambiente.

La incubación con el anticuerpo primario se realizó en la solución de bloqueo

durante 16 horas a 4ºC. Se lavó tres veces durante 10 minutos en TBST y

se incubó con el anticuerpo secundario, conjugado con peroxidasa, diluido

en la solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras otra

serie de lavados con TBST se realizó la detección empleando el sistema

SuperSignal®West Pico Chemoluminiscent Substrate (Pierce). Para las

autoradiografías se emplearon películas AGFA Curix RP2.

3.6.3.Coinmunoprecipitacióndeproteínasendógenas

La interacciones in vivo PU.1-GATA-1 y Fli-1-GATA-1 se analizaron mediante

la coinmunoprecipitación de proteínas endógenas presentes en extractos

nucleares de MEL y MEL-R. El extracto nuclear (1-2 mg) se incubó con

2,5 µg de un anticuerpo monoclonal de rata anti-GATA-1 (N6, Santacruz

Biotechnology) durante 2-3 horas a 4ºC o con 6 µg de un anticuerpo

monoclonal de ratón anti-Fli-1 durante 16 horas a 4ºC. Como control se utilizó

un anticuerpo monoclonal de rata anti-ratón (Santacruz Biotechnology) o un

anticuerpo monoclonal de ratón anti-rata (SIGMA). Se añadieron 50 µl de

proteína G-sefarosa al 50% y se incubó en una noria durante 1 hora a 4ºC.

Se centrifugó a 13000 rpm durante 1 minuto y se lavó el precipitado varias

veces con el tampón de lavado (Hepes-KOH 10 mM a pH 7.9, NaCl 150 mM

y NP-40 0,1%). Las proteínas inmunoprecipitadas se resuspendieron en 50

µl de tampón de carga 2X (SDS 4%, glicerol 20%, Tris-HCl 100 mM a pH 7,5,

DTT 200 mM y azul de bromofenol), se calentó durante 5 minutos a 95ºC y

Materiales y Métodos

��

se separó en geles de SDS-poliacrilamida. La inmunodetección se llevó a

cabo según las condiciones descritas en el apartado anterior.

*Cedido por el laboratorio de la Dra. Ruscetti, Laboratory of Cancer Prevention, National

Cancer Institute-Frederick, Frederick, Maryland (USA).

3.6.4.Inmunomarcaje

La inmunodetección de la subunidad alfa-2b (αIIb/CD41/gpIIb) de la integrina

alfa-2b-beta-3 (αIIbβ3) se llevó a cabo mediante citometría de flujo utilizando

un anticuerpo anti-CD41 acoplado a isotiocianato de fluoresceína (CD41-

FITC). Se centrifugaron 3-5x105 células durante 5 minutos a 1000 rpm, se

lavó el pellet con PBS 1X frío, se resuspendió en una solución de PBS 1X

que contenía el anticuerpo a una concentración final de 0,2 µg/µl y se incubó

30 minutos a 4ºC. A continuación se lavó con PBS 1X frío y se resuspendió el

pellet en 300 µl de PBS 1X frío. Las muestras se analizaron en un citómetro

de flujo EPICS-XL Coulter usando una longitud de onda de 488 nm, emitida

por un láser de argón, con un pico de emisión de 525 nm. Se utilizó como

control un anticuerpo secundario acoplado a FITC.

TablaIII.Anticuerpos empleados en el desarrollo de esta tesis.

Anticuerpo CasaComercial Referencia Dilución

Fli-1 (C-19)

PU.1 (Spi-1) (T-21)

GATA-1 (N6)

α-Tubulina

c-myc (Clone 67P05)

Mad (C-19)

gp-70

Stat1

pStat1

Santa Cruz Biotech.

Santa Cruz Biotech.

Santa Cruz Biotech.

Sigma

NeoMarkers

Santa Cruz Biotech.

*No comercial

Cell Signaling

Cell Signaling

Sc-356

Sc-352

Sc-265

T 9026

MS-1054-P0

Sc:222

-

9172

9171

1:1000

1:1000

1:500

1:10000

1:300

1: 1000

1:10000

1:1000

1:1000

Materiales y Métodos

��

Nota: Se agradece especialmente a las siguientes personas por la cesión de

material biológico utilizado en la presente tesis doctoral:

Dr. Arthur I. Skoultchi, Albert Einstein College of Medicine (USA): plásmido

pEBBpuro.GATA-ER.

Dr. Yaacov Ben-David, Department of Medical Biophysics, University of

Toronto (Canadá): líneas celulares CB7 y DP18.

Dra. Sandra Ruscetti, Laboratory of Cancer Prevention, National Cancer

Institute-Frederick (USA): anticuerpo anti-gp70.

Dr. Timothy Bender, University of Virginia School of Medicine (USA): plásmido

pMTHbetaglobin.neo.

Dra. Françoise Moreau-Gachelin, Institut Curie (Francia): plásmido

C45a6b.

Dr. Olivier Delattre, Institut Curie (Francia): anticuerpo anti-Fli-1.

4. RESULTADOS

Resultados

��

4.1. Caracterización de líneas celulares eritroleucémicasresistentes a la acción de agentes inductores de ladiferenciación

La línea celular eritroleucémica MEL-DS19 deriva de progenitores

eritroides cuya diferenciación ha sido interrumpida o bloqueada por la

integración del complejo vírico Friend (Friend y col., 1966; Marks y Rifkind,

1978). Algunos compuestos químicos como el HMBA actúan de un modo aún

desconocido provocando el reinicio del programa de diferenciación (Marks

y col., 1978). Estas características han convertido a las células MEL en un

sistema idóneo para el estudio de las bases moleculares de la diferenciación

celular así como del mecanismo de acción de algunos agentes inductores

del proceso, como el HMBA, que podrían eventualmente utilizarse como

agentes terapéuticos en procesos tumorales.

En el presente trabajo se han establecido líneas celulares derivadas

de MEL-DS19 con el objeto de estudiar el mecanismo de acción del HMBA

sobre el bloqueo de la diferenciación eritroide. Estas líneas son capaces

de crecer de manera indefinida en presencia de HMBA aunque mantienen

características eritroleucémicas similares a las de la línea progenitora.

En este apartado se describe el establecimiento de estas líneas celulares

resistentes y se comparan algunos parámetros del crecimiento en cultivo

con los de las líneas parentales incluyendo la cinética de crecimiento, el

porcentaje de superviviencia, la distribución de las fases del ciclo celular, el

tamaño celular, la capacidad de diferenciación y la expresión de marcadores

de diferenciación y proliferación celular.

4.1.1. Establecimiento de líneas celulares eritroleucémicasresistentes(MEL-R)alosagentesinductoresdeladiferenciación

El porcentaje de diferenciación espontánea de un cultivo de células

MEL-DS19 creciendo exponencialmente es menor al 1%. Cuando se

exponen estos cultivos a tratamientos con inductores de la diferenciación,

tales como el HMBA, se desencadenan una serie de procesos que conducen

de manera irreversible a la diferenciación hacia el linaje eritroide. Según

resultados previos de nuestro y otros laboratorios, a partir de las 48 horas de

Resultados

�0

tratamiento con 5 mM HMBA el porcentaje de células diferenciadas aumenta

gradualmente hasta alcanzar alrededor del 90% a las 120 horas. En todos

los casos, un porcentaje reducido de células, que con HMBA ronda el 10%,

no responde al agente inductor y permanece en el estadio de proeritroblasto.

Con el fin de establecer cultivos estables a partir de células resistentes se

expusieron cultivos de células MEL-DS19 en presencia continua de HMBA.

La diferenciación inducida por el HMBA, al igual que ocurre durante la

eritropoyesis normal, va acompañada de una inhibición de la división celular.

Por lo tanto, en estas condiciones, sólo podían proliferar aquellas células

que mostraban una resistencia frente al inductor. La resistencia adquirida

se determinó cuantificando el porcentaje de células diferenciadas a distintos

tiempos mediante el ensayo de benzidina que pone de manifiesto las células

hemoglobinizadas (células B+) y, por lo tanto, diferenciadas (Figura 15a).

Después de 45 a 75 días de tratamiento se aisló una población de células

capaces de crecer en presencia de HMBA con un porcentaje de células

B+ inferior al 1%. Este proceso de selección se repitió tres veces bajo las

mismas condiciones y en todos los casos se obtuvo una población de células

con un porcentaje de células diferenciadas similar al de un cultivo de células

MEL indiferenciadas (Figura 15b).

Tal como se comentó en la introducción, además del HMBA existen

otros agentes químicos capaces de inducir la diferenciación de células

eritroleucémicas. Con el objeto de comprobar si la resistencia de las células

MEL-R es una respuesta específica al HMBA o, si por el contrario, es una

propiedad intrínseca de las células resistentes que inhibe el desbloqueo del

programa de diferenciación celular se analizó la respuesta de cultivos MEL-R

frente a tratamientos con otros agentes inductores de la diferenciación tales

como el DMSO, la hemina y el butirato de sodio. En el caso del tratamiento

con DMSO al 1% se partió de 3 cultivos independientes de MEL-DS19 y MEL-

R creciendo en fase exponencial. Para testar la capacidad de diferenciación

de la hemina y el butirato de sodio, además de los cultivos mencionados, se

utilizó la línea celular CB7, derivada de progenitores eritroides infectados

sólo con el F-MuLV, que es resistente al HMBA pero sensible al tratamiento

con hemina y butirato de sodio. Utilizando como en el caso anterior 3 cultivos

independientes, se expuso cada uno de ellos a hemina 50 µM o butirato de

sodio 0,5 mM a lo largo de 5 días de tratamiento. En todos los casos, al final

Resultados

��

a

MEL MEL-R0

20

40

60

80

100

No diferenciadas (B-)Diferenciadas (B+)

5 30 45 69 Días en HMBA

20

40

60

80

% C

élul

as B

+

MEL-RMEL-R2MEL-R3

MEL Líneas resistentes0 5 30 45 69 Días en HMBA

b

% C

élul

as

Figura15.Establecimientode líneaseritroleucémicasresistentesalHMBA.a) Se expusieron células MEL-DS19 (MEL) en presencia continua de HMBA 5mM. Se determinó el porcentaje de células diferenciadas a distintos tiempos mediante el ensayo de benzidina contabilizando el número de células coloreadas (que reaccionan con grupos heme de la hemoglobina) (B+) con respecto al número de células no coloreadas (B-). Se consideró resistentes a aquellas células que no se diferenciaban después de cinco días de tratamiento con HMBA. b) El proceso de selección se repitió 3 veces partiendo de distintos cultivos de células MEL-DS19.

del tratamiento, se contabilizó el porcentaje de células hemoglobinizadas.

De manera similar a lo observado con HMBA, el porcentaje de células

diferenciadas en presencia de DMSO se mantuvo por debajo del 3% en MEL-

R mientras que en las células MEL-DS19 alcanzó valores superiores al 90%

(Figura 16a). Los tratamientos con hemina y butirato de sodio resultaron en

un incremento del porcentaje de células diferenciadas en CB7 alcanzando

valores por encima del 10 y el 30%, respectivamente. La respuesta a estos

inductores de MEL-DS19 y MEL-R fue escasa, observándose sólo un aumento

significativo, mayor del 15%, en el caso de MEL-DS19 frente a butirato de

sodio (Figura 16b).

a

MEL MEL-R0

20

40

60

80

100

No diferenciadas (B-)Diferenciadas (B+)

5 30 45 69 Días en HMBA

20

40

60

80

% C

élul

as B

+

MEL-RMEL-R2MEL-R3

MEL Líneas resistentes0 5 30 45 69 Días en HMBA

b

% C

élul

as

Resultados

��

Con el propósito de comprobar la homogeneidad de los cultivos

resistentes en relación al bloqueo de la diferenciación se aislaron clones a

partir de un cultivo MEL-R utilizando un separador de células. Se analizó a

continuación la respuesta de cada uno de los clones a los agentes inductores

de la diferenciación. De 62 clones aislados se seleccionaron 8 en los cuales

se contabilizó el número de células diferenciadas en presencia de HMBA y

DMSO. Como se muestra en la Figura 17, en todos los clones el porcentaje

de células hemoglobinizadas fue inferior al 1%.

Hemina Butiratode sodio

10

20

30

% C

élul

as B

+

MEL

CB7MEL-R

b

2 5 10

20

40

60

80

Días en DMSO

% C

élul

as B

+MELMEL-R

a

Figura16.Resistenciaaotrosagentesinductoresdeladiferenciacióncelular.a) Los cultivos de células MEL-DS19 (MEL) y MEL-R se trataron con DMSO al 1% y se determinó el porcentaje de células diferenciadas (B+) a distintos tiempos. b) Las células MEL-DS19, MEL-R y CB7 se mantuvieron en presencia de butirato de sodio 0,5 mM y hemina 50 µM. Al cabo de cinco días de tratamiento se contabilizó el número de células hemoglobinizadas (B+).

% C

élul

as B

+

HMBADMSO

MEL 7A 7H 8A 8E 10A 10C 11E11A

30

60

90

Clones MEL-R

Figura 17. Aislamiento de clonesresistentes.Se aislaron clones a partir de un cultivo de MEL-R utilizando un separador de células. De 62 clones aislados se seleccionaron 8 (7A, 7H, 8A, 8H, 8E, 10A, 10C, 11A y 11E) en los cuales se determinó el porcentaje de células diferenciadas (B+) en presencia de HMBA 5mM y DMSO al 1%.

Resultados

��

Por otra parte, se comprobó si la resistencia a reiniciar el proceso de

diferenciación dependía de la presencia continua del agente inductor o si, por

el contrario, las células adquirían características intrínsecas que les permitían

permanecer indefinidamente en el estadio de proeritroblasto. Las células

MEL-R se cultivaron en ausencia de HMBA durante distintos períodos de

tiempo (10, 20 y 30 días) y a continuación se expusieron nuevamente, durante

5 días, al agente inductor. El efecto sobre el desbloqueo de la diferenciación

se analizó contabilizando el número de células hemoglobinizadas (Figura

18). En todos los casos, el porcentaje de células B+ fue inferior al 1% lo cual

indicaba que las células mantenían la resistencia al HMBA aún después de

permanecer durante períodos prolongados en ausencia del agente inductor.

En conjunto, los resultados obtenidos demostraron que las células MEL-

R han adquirido (o perdido) características que inhiben la reactivación del

programa de diferenciación celular en respuesta a los agentes inductores.

5

15

% C

élul

as B

+

5

15

25Día

s si

n H

MB

A

HMBA+ HMBA-

0d 10d 20d 30d 5d

- HMBA + HMBA

MEL-R

Figura18. Irreversibilidadde la resistenciaalHMBA.El esquema representa el diseño del experimento que consta de una fase variable (10, 20 ó 30 días) sin HMBA y una fase constante (5 días) en presencia de HMBA. Al final de esta segunda fase se contabilizaron las células B+. Se cultivaron células MEL-R en ausencia de HMBA durante 10, 20 ó 30 días. A continuación, se agregó HMBA al medio de cultivo y al cabo de 5 días se determinó el porcentaje de células diferenciadas (B+).

Resultados

��

4.1.2. Expresión de marcadores de la diferenciacióneritropoyética

Una de las características de la diferenciación de células

eritroleucémicas, así como de otros linajes celulares, son los cambios en la

expresión génica que ocurren a lo largo del proceso. Así, se ha observado en

las primeras fases una inhibición de la expresión de genes relacionados con

estados proliferativos y al final del proceso un incremento en la expresión

de genes específicos del linaje eritroide (Figura 19) (Ramsay y col., 1986).

Con el objeto de comprobar si las células MEL-R presentaban un patrón de

expresión similar al de las células parentales se llevaron a cabo Northern

blots utilizando sondas correspondientes al oncogen c-myc, marcador de

estados proliferativos, y al gen de la β-globina, característico del fenotipo

diferenciado. Los resultados del patrón de expresión de ambos genes se

presentan en la Figura 19. Tanto en las células MEL-DS19 no tratadas con

HMBA como en las MEL-R se detectó una señal intensa correspondiente al

transcrito de 2,3 kb de c-myc. Como era de esperar, en células MEL-DS19

tratadas con HMBA durante 72 horas, cuando alrededor del 80% de las

MEL

HMBA+-

PU.1c-mycc-myb

GATA-1β-globinamad1

a0 72 RMEL

c-myc

β-globina

18S

b

Figura19.Expresióndemarcadoresdeestadiosproliferativosydiferenciados.a) Cambios de expresión génica que se producen en las células MEL-DS19 (MEL) en respuesta al tratamiento con HMBA. Se muestran dos tubos que contienen el pellet de células MEL-DS19 creciendo en fase exponencial (izquierda) o después del tratamiento con HMBA (derecha). El estadio proliferativo (pellet blanco) se caracteriza por la expresión de protoncogenes como c-myc, c-myb y PU.1. En el estadio diferenciado (pellet rojo) se produce una inactivación de los genes característicos del estadio inmaduro junto con una activación de genes relacionados con la salida del ciclo celular, como mad1, y la adquisición del fenotipo maduro, como GATA-1 y β-globina. b) Northern blots de células MEL-DS19 (MEL) indiferenciadas (0) y tratadas con HMBA durante 72 horas (72) y células MEL-R (R). La hibridación se llevó a cabo con sondas radiactivas específicas para c-myc y β-globina. La tinción con bromuro de etidio se utilizó para verificar integridad del RNA y la carga equitativa en cada muestra.

Resultados

��

células están diferenciadas, se observó una reducción significativa de la

expresión del protoncogen. Lo contrario se observó en el caso del transcrito

de 0,6 kb correspondiente al mRNA de β-globina. Tanto en MEL-R como

en células MEL-DS19 indiferenciadas se observó una señal débil que se

corresponde con una expresión basal del gen. En células MEL-DS19 tratadas

con HMBA, sin embargo, se visualizó una banda conspicua, producto de la

transcripción intensa del gen de la β-globina, dato que corrobora resultados

previos (Vanegas y col., 2003). Estos experimentos demostraron que las

células MEL-R, aún en presencia de HMBA, permanecen en un estado

proliferativo indiferenciado, similar al de las células parentales no tratadas

con el inductor.

4.1.3.Viabilidadcelular,cinéticadecrecimientoydistribucióndelasdistintasfasesdelciclocelulardecultivosMEL-R

Con el objeto de determinar si el tratamiento continuo con HMBA

afectaba a la viabilidad celular se calculó el porcentaje de células viables

utilizando el método de exclusión de azul de tripano. Se partió de 3

cultivos independientes de MEL y MEL-R creciendo en fase exponencial y

se contabilizó el número de células teñidas (muertas) frente al número de

células no teñidas (vivas). Tal y como se representa en la Figura 20a, durante

los primeros 3 días de cultivo el número de células viables en ambos casos

fue mayor al 95%. Estos resultados indicaron que la presencia continua del

HMBA no afecta significativamente a la viabilidad de las células MEL-R.

Para comparar la cinética de crecimiento de las células MEL-DS19 y

MEL-R se utilizaron en cada caso 3 cultivos independientes creciendo en

fase exponencial y se recogieron alícuotas a intervalos de 24 horas (Figura

20b). El tiempo de duplicación de MEL alcanzó valores de entre 10-12 horas,

coincidiendo con resultados previos de nuestro y otros laboratorios (Marks y

Rifkind, 1978; Vanegas y col., 2003). El tiempo de duplicación de MEL-R, sin

embargo, difiere considerablemente del de las líneas parentales alcanzando

valores de entre 16-18 horas. Entre las 72 y las 96 horas los valores se

estabilizan en ambos casos debido probablemente a la saturación de los

cultivos.

Resultados

��

Se ha comprobado que a lo largo del tratamiento con HMBA y a

medida que las MEL-DS19 se diferencian se produce una inhibición de la

proliferación celular debido a una acumulación gradual de las células en la

fase G1 del ciclo celular (Kiyokawa y col., 1993; Rifkind y col., 1996). Con

el fin de comparar la distribución de las distintas fases del ciclo celular

de cultivos MEL-R con respecto a las células parentales a lo largo de la

diferenciación se analizaron muestras de cada población mediante citometría

de flujo. Previamente, se determinó el porcentaje de células diferenciadas

mediante el ensayo de benzidina. Como se muestra en la Figura 21a, se

observó que la distribución entre las fases G1, S y G2+M de las células

0

5

10

15

0 24 48 72 96

15

10

5

24h0h 48h 72h 96h

Nº c

élul

as x

105

MELMEL-R

b

80

90

100

24h0h 48h 72h 96h

% C

élul

as v

iabl

esMELMEL-R

a

Figura 20. Viabilidad y cinética de crecimiento de células MEL-R. a) Curva de viabilidad de células MEL-DS19 (MEL) y MEL-R. Se partió de cultivos creciendo en fase exponencial y se contabilizó el porcentaje de células viables cada 24 horas durante 5 días consecutivos. b) Curva de crecimiento de células MEL-DS19 (MEL) y MEL-R. Se analizaron en cada caso 3 cultivos independientes creciendo en fase exponencial a una concentración de 1x105 células/ml y se determinó el número de células/ml cada 24 horas durante 5 días.

Resultados

��

MEL varía según el tiempo de exposición al HMBA. Tal y como se describió

previamente en cultivos asincrónicos de células MEL (Kiyokawa y col.,

1993; Vanegas y col., 2003), se observó una acumulación gradual de las

células en G1 que comienza a las 48 horas y se prolonga hasta el final del

tratamiento (96 horas) coincidiendo con un incremento en el porcentaje de

células hemoglobinizadas (Figura 21b). El perfil que presentaron las células

MEL-R coincide con el de las células MEL indiferenciadas (0hr), mostrando

una distribución característica de estados proliferativos.

a b

Contenido de DNA

0hr

48hr

MEL-R

2C 4C

96hrNúm

ero

de c

élul

as

Figura21.DistribucióndelasfasesdelciclocelularencélulasMEL-R.a) Las distintas muestras se trataron con ioduro de propidio (IP) y se analizaron mediante citometría de flujo. Se examinó la distribución a lo largo del ciclo celular de células MEL-DS19 indiferenciadas (0hr) y diferenciadas con HMBA durante 48 y 96 horas y células MEL-R. b) En paralelo, se procesó una alícuota de cada muestra según el test de benzidina.

Resultados

��

4.1.4. Incremento del tamaño celular de MEL-R. Es c-myc elresponsable?

El fenotipo del proeritroblasto transformado con el complejo vírico Friend

que da lugar a las células MEL-DS19 difiere significativamente del producto

diferenciado después de una inducción con HMBA. Las consecuencias más

llamativas radican en una disminución sustancial del tamaño celular, una

condensación de la cromatina y, en circunstancias especiales, la exclusión

nuclear en la fase diferenciada (Figura 22).

Figura 22. Diferenciación de células MEL-DS19 adheridas a una matriz de fibronectina. Los cultivos de MEL-DS19 (MEL) se mantuvieron en presencia de HMBA 5mM en placas de petri pre-tratadas con fibronectina. Preparaciones citológicas de cultivos no tratados y tratados con HMBA durante 4, 5 ó 6 días. Se observan proeritroblastos, normoblastos policromáticos y ortocromáticos y reticulocitos que han perdido el núcleo. Aumento: 600X.

El fenotipo de las MEL-R es similar al que presentan las parentales

MEL-DS19 a excepción del tamaño celular, significativamente mayor

comparado con el de las células parentales indiferenciadas. En la Figura

23a se muestra un estudio comparativo de los tamaños relativos de MEL-R

y MEL-DS19 realizado mediante la determinación de la dispersión frontal

(forward scattering, FS) en un citómetro de flujo, datos que corroboran las

observaciones realizadas al microscopio óptico (Figura 23b). Se estimó que

el tamaño de las MEL-R es aproximadamente un 25% mayor que el de las

MEL DS-19 indiferenciadas que, a su vez, son un 25% más grandes que las

MEL DS-19 diferenciadas. Este resultado llevó a especular con una posible

relación entre el incremento del tamaño celular y la expresión aberrante de

c-myc en MEL-R. La regulación del crecimiento celular está generalmente

acoplada a la proliferación celular aunque, en células tumorales, este

MEL

Días en HMBA

3 - 4 5 >6

Proeritroblasto N. policromático N. ortocromático Reticulocito

Resultados

��

acoplamiento puede estar alterado. Se ha demostrado que la oncoproteína c-

Myc juega un papel esencial en este proceso. La inactivación de c-myc retarda

el crecimiento y reduce el tamaño celular mientras que la sobreexpresión

del oncogen incrementa estos valores (Johnston y col., 1999; Piedra y col.,

2002).

Tamaño celular

120hr

0hr

MEL-R

a b

Figura 23. Comparación del tamaño celular de células MEL-DS19 y MEL-R. a) Se determinó el tamaño celular relativo de células MEL-DS19 indiferenciadas (0hr) y diferenciadas con HMBA (120hr) y células MEL-R mediante la medición de la dispersión frontal (forward scattering) en un citómetro de flujo. b) Alícuotas de las muestras utilizadas en a) teñidas con May Grünwald-Giemsa. Aumento: 400X.

Los niveles de expresión de c-myc en las células MEL-R son similares

a los detectados en las líneas parentales (Figura 19b) lo cual descarta la

sobreexpresión del oncogen como posible causa del aumento del tamaño

celular de MEL-R. Sin embargo, c-Myc podría ser el responsable de este

aumento a través de una mayor estabilidad de la oncoproteína. En tumores

primarios y ciertos tipos de linfomas se ha observado con frecuencia la

presencia de mutaciones puntuales en el dominio de transactivación, más

específicamente en la región conocida como caja Myc 1 (MB1) involucrada

en la degradación de c-Myc (véase esquema en Figura 24) (Albert y col.,

1994; Axelson y col., 1995; Bhatia y col., 1993; Clark y col., 1994; Murphy y

col., 1986; Rabbitts y col., 1983; Showe y col., 1985).

Resultados

�0

Con el fin de localizar posibles mutaciones que pudieran alterar

la estabilidad de la oncoproteína en MEL-R se comparó la secuencia de

aminoácidos de c-Myc de células MEL-DS19 y MEL-R con la del genoma

de ratones BALB/c (Figura 25). El grado de similitud fue del 100% en los

3 casos, lo cual descarta la hipótesis de la existencia de mutaciones en la

secuencia codificante de c-myc como posible causa de una estabilización de

la proteína e, indirectamente, del incremento del tamaño celular.

Figura24.Representaciónesquemáticadelaestructuradelaproteínac-Myc. Se indican las regiones conservadas. MB1, caja Myc 1; MB2, caja Myc 2; TAD, dominio de transactivación; NLS, señal de localización nuclear; b, región básica; bHLHZip, motivo tipo”helix-loop-helix” y motivo tipo “cremallera de leucina”. Se muestra la secuencia de aminoácidos de la MB1, incluyendo los sitios de fosforilación Treonina (T) 58 y Serina (S) 62. Se indican con un asterisco (*) los sitios más frecuentemente mutados.

Figura25.Alineamientode lasecuenciadeaminoácidosde laproteínac-Myc.Comparación de las secuencia de aminoácidos de la proteína c-Myc de MEL-DS19 y MEL-R con la del genoma de ratones BALB/c utilizando el programa Clustal del EMBL-EBI. En el recuadro superior se indican los aminoácidos de la caja Myc 1 (MB1). Los aminoácidos representados en rojo corresponden a los sitios de fosforilación Treonina (T) 58 y Serina (S) 62.

MB1 TAD MB2 NLS b HLHZipc-Myc

APSEDIWKKFELLPTPPLSPSR***** ***58 62

P P

MPLNVNFTNRNYDLDYDSVQPYFICDEEENFYHQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVATSMPLNVNFTNRNYDLDYDSVQPYFICDEEENFYHQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVATSMPLNVNFTNRNYDLDYDSVQPYFICDEEENFYHQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVATS********************************************************************************

FSPREDDDGGGGNFSTADQLEMMTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYOAARKDSFSPREDDDGGGGNFSTADQLEMMTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYOAARKDSFSPREDDDGGGGNFSTADQLEMMTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYOAARKDS********************************************************************************

TSLSPARGHSVCSTSSLYLODLTAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCTSSDSTAFSPSSDSLLSSESSPRASPEPLVLTSLSPARGHSVCSTSSLYLODLTAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCTSSDSTAFSPSSDSLLSSESSPRASPEPLVLTSLSPARGHSVCSTSSLYLODLTAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCTSSDSTAFSPSSDSLLSSESSPRASPEPLVL********************************************************************************

HEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQTPAKRSESGSSPSRGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQTPAKRSESGSSPSRGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQTPAKRSESGSSPSRGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYP********************************************************************************

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AYILSIQADEHKLTSEKDLLRKRREQLKHKLEQLRNSGAAYILSIQADEHKLTSEKDLLRKRREQLKHKLEQLRNSGAAYILSIQADEHKLTSEKDLLRKRREQLKHKLEQLRNSGA***************************************

10 20 30 40 50 58 62 70 80

90 100 110 120 130 140 150 160

170 180 190 200 210 220 230 240

250 260 270 280 290 300 310 320

330 340 350 360 370 380 390 400

410 420 430

MELMEL-RRatón

MELMEL-RRatón

MELMEL-RRatón

MELMEL-RRatón

MELMEL-RRatón

MELMEL-RRatón

MB1

Resultados

��

4.1.5. Potencial de MEL-R para la diferenciación hacia el linajemegacariocítico Algunos investigadores han sugerido que las líneas eritroleucémicas

de ratón, al igual que ocurre con las humanas K562 y HEL, podrían derivar

hacia distintos linajes hematopoyéticos (revisado en (Tsiftsoglou y col.,

2003b)). Los linajes eritroide y megacariocítico provienen de un progenitor

bipotencial común y existen evidencias que indican que eritroblastos y

megacarioblastos expresan marcadores específicos comunes a ambos

linajes celulares (Paoletti y col., 1995). El fenotipo de las células MEL-R, en

especial el tamaño celular, podría ser indicativo de que se ha seleccionado

una población que ha perdido la capacidad de diferenciación eritroide en

favor de una diferenciación megacariocítica. Con el fin de investigar esta

posibilidad se trataron los cultivos MEL-R con el éster de forbol TPA, un

agente inductor de la diferenciación megacariocítica. En el análisis del

contenido de DNA y la distribución de las células en G1, S y G2+M después

del tratamiento con distintas dosis de TPA no se observaron indicios de

poliploidización, característica esencial de megacariocitos, ni cambios en la

distribución de las fases del ciclo celular (Figura 26).

Figura26.DistribucióndelciclocelularencélulasMEL-DS19yMEL-Rtratadasconunagenteinductordeladiferenciaciónmegacariocítica.Se expusieron cultivos de células MEL-DS19 y MEL-R a dosis de 1 y 10 nM de TPA durante 96 horas. El contenido de DNA se analizó mediante tinción con ioduro de propidio (IP) y citometría de flujo.

MEL-DS19

Control

TPA 1 nM

MEL-R

Núm

ero

de c

élul

as

TPA 10 nM

2C 4C 8C 8C2C 4C

Resultados

��

Se analizó además la expresión de la integrina alfa-2b-beta-3 (integrina alfa-2b-beta-3 (αIIbβ3),

un marcador de membrana específico de megacariocitos (Figura 27). Tanto

en MEL-R como en MEL-DS19, no se detectó un incremento en el porcentaje

de células CD41+ en respuesta al inductor.

Aún cuando los tratamientos con TPA no provocaron la poliploidización

de los cultivos MEL-R, se observó en ocasiones que algunos clones sufrían

procesos de tetraploidización (Figura 28). Este fenómeno ocurría en general

después de largos períodos de cultivo, tras repetidos ciclos de división celular.

No obstante, las células permanecían siempre en un estado tetraploide y no

prosperaban hacia una ploidía más compleja.

En conjunto estos resultados descartan que las líneas resistentes

respondan a estímulos dirigidos a una diferenciación megacariocítica. Esto

hace suponer que las MEL-R no corresponden a precursores que se han

desviado del linaje eritroide, a favor del megacariocítico, sino que al igual

que las MEL-DS19 están bloqueadas en su capacidad de diferenciación. En

el caso de las MEL-R, sin embargo, han perdido la capacidad de respuesta

a los inductores clásicos de diferenciación eritroide.

0,5%1,2%

1,5%1,0%

TPA 10 nM

TPA 1 nM

0,7%0,7%

MEL-DS19 MEL-R

CD41

Control

Nº d

e cé

lula

s

Figura27.Expresióndelaalfa-2b-beta3-integrina(αIIbβ3)encélulasMEL-DS19yMEL-RtratadasconTPA.Se cultivaron células MEL-DS19 y MEL-R en presencia de TPA 1 y 10 nM durante 96 horas y se analizó la expresión la subunidad αIIb (CD41/gpIIb) mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo anti-CD41. Las barras rojas y los números indican el porcentaje de células CD41 positivo.

Resultados

��

4.1.6. Expresión de genes involucrados en la transiciónproliferación-diferenciación

A lo largo del proceso de diferenciación de las células MEL hacia el

linaje eritroide se producen cambios en la expresión de genes relacionados

con la inhibición de la proliferación celular y la adquisición del fenotipo

diferenciado (Garcia-Sacristan y col., 2005; Kirsch y col., 1986; Lachman y

Skoultchi, 1984; Rao y col., 1997; Stopka y col., 2005; Vanegas y col.,

2003). Con el fin de comparar el patrón de expresión de genes cuyos niveles

cambian durante el proceso de diferenciación eritroide se realizaron RT-

PCRs semicuantitativas en células MEL-R y en células MEL tratadas y no

tratadas con HMBA (Figura 29). Como control se amplificó un fragmento

de 451 pb correspondiente al mRNA de GAPDH. Se seleccionaron genes

pertenecientes a dos grupos esenciales para la diferenciación eritroide,

Tiempo (meses)

MEL-R3

MEL-DS19

Clon 7H

2C 4C 8C 2C 4C 8C 2C 4C 8C

1 2 4

Figura28.Tetraploidizaciónespontáneadelíneasresistentes.Se analizó el contenido de DNA mediante incorporación de ioduro de propidio (IP) de cultivos de células MEL-DS19, del clon resistente 7H y de células resistentes MEL-R3. Las muestras se tomaron a distintos tiempos a lo largo de 4 meses consecutivos.

Resultados

��

un grupo relacionado con la regulación de la proliferación celular y otro

relacionado con el estado diferenciado. Dentro del primer grupo se analizó

la expresión de c-myc y c-myb, dos reguladores positivos de la proliferación

celular cuyos niveles disminuyen en la primeras 48 horas de tratamiento,

coincidiendo con la determinación irreversible de la células hacia el linaje

eritroide (Dmitrovsky y col., 1986; Lachman y Skoultchi, 1984; Smith y

Prochownik, 1992). Por otro lado, se determinó la expresión de inhibidores

de la proliferación celular, como mad1, p27 y p21, cuyos niveles en los

primeros dos casos aumentan significativamente en las células inducidas

coincidiendo con la salida del ciclo celular (Hsieh y col., 2000; Larsson y

col., 1994). En cuanto al segundo grupo, se analizó la expresión de factores

de transcripción que regulan la activación de genes específicos del linaje

eritroide. Se estudió en este caso el patrón de expresión de GATA-1 y EKLF,

cuyos niveles aumentan en las etapas finales de la diferenciación. Por otra

parte, se analizó la expresión de PU.1 que actúa como antagonista de GATA-

1, cuyos niveles disminuyen en las primeras horas de tratamiento con el

inductor. En todos los casos, a excepción de PU.1, el patrón de expresión de

MEL-R fue similar al de las células parentales no tratadas con HMBA.

c-myc

c-myb

mad1p27

p21

GAPDH

48 960 RMEL

GATA-1

EKLF

PU.1GAPDH

48 960 RMEL

Figura29.InactivacióndePU.1encélulasMEL-R.Se sintetizó cDNA de cadena sencilla a partir de RNA de células MEL-DS19 (MEL) indiferenciadas (0) y diferenciadas con HMBA (48 y 96) y células MEL-R (R). La expresión de genes relacionados con la regulación de la diferenciación eritroide se analizó mediante RT-PCR-semicuantitativa utilizando cebadores específicos (ver Materiales y Métodos). Los productos de PCR se analizaron en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio. Como control de carga se amplificó un fragmento de 451 pb correspondiente al cDNA de GAPDH.

Resultados

��

El patrón de expresión observado para PU.1 en MEL-DS19, al igual

que el de c-myc y c-myb, coincide con el comportamiento bimodal descrito

anteriormente y, como ya se sugirió entonces, es la consecuencia de una

inhibición general de la expresión génica durante el período de determinación

(Vanegas y col., 2003). De esta forma, se comienza con niveles de expresión

muy altos que disminuyen drásticamente entre las 12 y las 48 horas de

tratamiento con HMBA para luego recuperarse parcialmente a las 96 horas.

Sin duda, el resultado más sorprendente fue la falta de expresión

de PU.1 en las células MEL-R. Este resultado fue confirmado mediante

Northern blot (Figura 30a) y Western blot incluyendo clones derivados de

MEL-R (R7A y R11A), una segunda población de células resistentes (MEL-

R2) y células resistentes mantenidas en ausencia de HMBA (R-H) (Figura

30b). Paralelamente, se analizó la expresión de la proteína GATA-1, la

principal diana a través de la cual PU.1 inhibe la diferenciación eritroide. La

utilización de un anticuerpo anti-GATA-1 permitió detectar una banda de 49

KDa cuya intensidad fue similar en las líneas resistentes y en las MEL-DS19

parentales (Figura 30c).

PU.1

18S

0 R72a MEL

7A 11A

MEL-R2

R-H

PU.1

MEL-R

α-Tubulina

b

cGATA-1

7A 11A

MEL-R2

R-HMEL-R

α-Tubulina

96 0MEL

MEL

Figura30.AnálisisdelaexpresióndePU.1yGATA-1enlíneasresistentes.a) Northern blot de células MEL-DS19 (MEL) no tratadas (0) y tratadas con HMBA durante 72 horas (72) y células MEL-R (R) hibridado con el cDNA de PU.1 marcado radiactivamente. El gel teñido con bromuro de etidio se utilizó para verificar la integridad del RNA y la carga equitativa en cada muestra. b) Western blot de células MEL-DS19 (MEL), células MEL-R, clones resistentes (7A y 11A), células MEL-R2 y células MEL-R cultivadas en ausencia de HMBA durante 7 días (R-H). La membrana se incubó con un anticuerpo anti-PU.1. Como control de carga se utilizó un anticuerpo anti-α-Tubulina. c) Western blot de células MEL-DS19 (MEL) no tratadas (0) y tratadas con HMBA (96), células MEL-R, clones resistentes (7A y 11A), células MEL-R2 y células MEL-R cultivadas en ausencia de HMBA durante 7 días (R-H). La membrana se incubó con un anticuerpo anti-GATA-1. Como control de carga se utilizó un anticuerpo anti-α-Tubulina.

Resultados

��

Estos resultados demostraron que el silenciamiento de PU.1 en

líneas eritroleucémicas no es suficiente para desbloquear la diferenciación

eritropoyética. Por otra parte, sugieren que la actividad de GATA-1, presente

en las MEL-R, tiene que estar impedida por un factor distinto a PU.1.

4.2.CausasdelainactivacióndePU.1enMEL-R

El proceso de transformación de la células MEL, tal como se describe

en la introducción de la presente tesis, se lleva a cabo en dos fases bien

definidas. Durante la primera fase se produce una activación constitutiva del

receptor de eritropoyetina (EpoR) dando lugar a una proliferación policlonal

de progenitores eritroides (Li y col., 1990). La segunda fase se manifiesta

como una expansión clonal de células malignas en las que se ha producido

la integración del SFFV en una zona cercana al promotor del gen Sfpi/PU.1

induciendo la activación constitutiva de PU.1 (Moreau-Gachelin y col., 1988;

Paul y col., 1989; Paul y col., 1991).

Se ha constatado y descrito en el apartado 4.1.6. que, contrariamente

a lo esperado, la expresión de PU.1 está inhibida en las líneas resistentes.

En este apartado se analizan las posibles causas de la inactivación de PU.1

en MEL-R, tales como los cambios en la expresión de la glicoproteína gp55

del SFFV, la pérdida de la integración del SFFV en el locus Sfpi y los posibles

cambios epigenéticos en el gen que codifica para PU.1.

4.2.1.Expresióndelaglicoproteínagp55delSFFVenMEL-R

Estudios previos han demostrado que la sobreexpresión de PU.1

depende de la activación constitutiva del EpoR mediada por la glicoproteína

gp55 del SFFV (Afrikanova y col., 2002; Quang y col., 1997). Con el objeto de

comprobar si la inactivación de PU.1 en cultivos MEL-R se debía a cambios

en la expresión de la gp55 se efectuó un análisis comparativo de la expresión

de la glicoproteína en las células MEL-R y las líneas parentales MEL-DS19

indiferenciadas y diferenciadas. Ante la falta de un anticuerpo específico

para la gp55 el análisis se llevó a cabo mediante Western blot utilizando un

anticuerpo policlonal anti-gp70, cedido por el laboratorio de la Dra. Sandra

Resultados

��

Ruscetti, que reconoce tanto la gp70 del MuLV así como la gp55 del SFFV

(véase esquema en la Figura 31). Como control se utilizaron extractos totales

de la línea celular DP18, cedida por el laboratorio del Dr. Yacoov Ben-David,

derivada de ratones infectados sólo con el SFFV. Como se muestra en la

Figura 31, se observó un alto nivel de expresión de la proteína gp55 tanto

en células MEL-DS19 indiferenciadas como en las MEL-R. En las células

MEL-DS19 tratadas con HMBA durante 96 horas, cuando más del 90% de las

células están diferenciadas, se observó una disminución en la expresión de

la glicoproteína. Este descenso es debido a una disminución generalizada

de la expresión durante la diferenciación que ocurre también en el caso de

la gp70 y que se ha descrito en otras ocasiones (Vanegas y col., 2003).

En resumen, estos resultados indicaron que la glicoproteína gp55 del

SFFV permanece activa en las células MEL-R, al igual que en las células

progenitoras.

MuLV gp70

ExtracelularMembranaIntracelular

MCF gp70

MuLV gp15Único

Rico enProlinas

Rico enProlinas

Deleciónen SFFV

CCCCCC

C

C

CCCCCC

C

C

CC

CC

CCC

CC

C

CCC

C

C

Friend MCFMuLV

SFFV

a

0 96 RMEL

gp70

gp55

α-Tubulina

DP18b

Figura31.Análisisdelaexpresióndelaglicoproteínagp55encélulasMEL-R.a) Comparación del producto codificado por el gen env del Friend mink cell focus-forming (F-MCF) MuLV (80 kDa) y el SFFV (55 KDa) donde se representa, entre otras cosas, la región derivada de la glicoproteína gp70 del MuLV. C= residuos de cisteína b) Western blot de células MEL-DS19 (MEL) no tratadas (0) y tratadas con HMBA (96), células MEL-R (R) y células DP18 utilizando un anticuerpo policlonal anti-gp70 que reconoce tanto la gp70 del MuLV como la gp55 del SFFV. La membrana se incubó además con un anticuerpo anti-α-Tubulina como control de carga.

Resultados

��

4.2.2.AnálisisdelaintegracióndelSFFVenellocusSfpi/PU.1

Una segunda causa probable de la inactivación de PU.1 en MEL-R

sería la pérdida de la integración del SFFV en el locus Sfpi/PU.1. Con el

propósito de comprobar este supuesto se procedió a analizar la localización

del provirus en las líneas resistentes. El DNA genómico aislado a partir de

células MEL-DS19 y MEL-R y de tejidos de ratones BALB/c se digirió con

las enzimas de restricción BamHI y EcoRV y se analizó mediante Southern

blot (Figura 32). Se utilizó como sonda el plásmido C45a6b que contiene un

fragmento PstI- PstI de 800 pb correspondiente a las posiciones -12353 a

-13124 del locus PU.1 murino y se localiza cerca del extremo 5’ del LTR del

SFFV (Probe A en (Moreau-Gachelin y col., 1988)) (véase esquema de la

Figura 32). Los resultados obtenidos con ambas enzimas evidenciaron una

banda común a las tres muestras correspondiente al alelo normal de Sfpi/

PU.1, de aproximadamente 10,6 kb en el caso de BamHI y 23,4 kb en el de

EcoRV (Figura 32b).

b

a

SFFV-P1 2 3 4 5

B BRV RVC45a6b

Ratón

MELMEL-

R

9.4

6.5

Ratón

MELMEL-

R

BamHI EcoRV

23

9.4

Figura32.AnálisisporSouthern blotdelaintegracióndelSFFVenellocusSfpi-1encélulasMEL-R.a) Esquema del locus Sfpi-1/PU.1 donde se indica la zona de integración del SFFV-P, los exones que codifican para la proteína PU.1 (1-5, segmentos en verde), la sonda utilizada para analizar la integración del virus (C45a6b) y los sitios de corte de las enzimas de restricción BamHI (B) y EcoRV (RV). b) Se digirió DNA genómico de células MEL-DS19 (MEL) y MEL-R y de tejidos de ratones BALB/c con las enzimas de restricción BamHI o EcoRV y se analizó mediante Southern blot utilizando la sonda C45a6b que contiene un fragmento PstI de 800 pb (sonda A) correspondiente al locus PU.1 murino. Los círculos rojos indican la banda correspondiente al alelo en el cual está integrado el provirus.

Resultados

��

Tanto en MEL-DS19 como en MEL-R se detectó además una banda

adicional de menor tamaño, correspondiente al alelo en el cual se ha integrado

el virus (Figura 32b). El tamaño de la banda es similar en ambas muestras,

aproximadamente 6 kb en el caso de BamHI y 9 kb en el de EcoRV, lo cual

demuestra que la integración del SFFV ocurre en el contexto del locus Sfpi/

PU.1 y en la misma localización tanto en MEL-DS19 como en MEL-R.

4.2.3.CambiosepigenéticosenellocusSfpi-1/PU.1

Los resultados obtenidos en los dos apartados anteriores permitieron

corroborar que el gen env del SFFV que codifica para la gp55 estaba activo

en MEL-DS19 y MEL-R y que el sitio de inserción del SFFV en el locus Sfpi/

PU.1 era similar en ambas líneas celulares. Por lo tanto, se descartó que

estos dos eventos fueran las causas directas del silenciamiento de PU.1

en MEL-R. Se planteó entonces la posibilidad de que hubiera diferencias a

nivel epigenético. Para testar esta hipótesis se llevaron a cabo experimentos

utilizando dos agentes ampliamente empleados en diversos sistemas para

estudiar modificaciones epigenéticas: la 5-Aza-2’-deoxicitidina (5-Aza-2-

dC), un análogo de la citosina capaz de inhibir la metilación del DNA y la

Tricostatina A (TSA) un inhibidor de las deacetilasas de histonas (Issa y

Byrd, 2005; Yoshida y col., 1990). Previamente, se efectuaron ensayos para

determinar la dosis óptima de 5-Aza-2-dC que no comprometiera la viabilidad

celular (Figura 33).

% C

élul

as v

iabl

es

20

40

60

80

100

0h 24h 48h 96h 120h72h

0,8 µM

0,2 µM

1 µM5 µM10 µMControl

0,4 µM

Figura 33. Determinación delasdosisóptimade5-Aza-2’-deoxicitidina (5-Aza-2-dC). Se trataron cultivos de células MEL-R en crecimiento exponencial con distintas concentraciones de 5-Aza-2-dC (0,2; 0,4; 0,8, 5 y 10 µM) y se determinó el porcentaje de células viables cada 24 horas durante 5 días consecutivos.

Resultados

�0

Se seleccionaron dosis de entre 0,4 y 0,8 µM en donde se observó que

el porcentaje de células viables alcanzaba valores superiores al 50%

después de 96 horas de tratamiento. La expresión de PU.1 en MEL y MEL-

R se determinó mediante RT-PCR semicuantitativa. Después de 24 horas

de tratamiento con 0,4 µM de 5-Aza-2-dC se observó en todos los casos

una banda de 0,8 kb correspondiente al producto de amplificación de PU.1

(Figura 34a). Por el contrario, después de un tratamiento con TSA durante

5 ó 24 horas se observó un producto amplificado sólo en MEL-DS19 (Figura

34b). De estos resultados se deduce que el tratamiento con 5-Aza-2-dC, a

diferencia del TSA, provoca la activación de PU.1 en las MEL-R. Esto induce

a pensar que al menos parte del locus Sfpi/PU.1 estaría metilado en las

células MEL-R, siendo ésta una de las causas de la inactivación de PU.1 en

las líneas resistentes.

a MEL MEL-RAza+ + -PU.1

GAPDH

b

PU.1

GAPDH

5 h 24 h CRT-

TSAM MMR RR

Figura34.ReactivacióndePU.1encélulasMEL-Rtratadascon5-Aza-2-dC.a)Los cultivos de células MEL-DS19 (MEL) y MEL-R se trataron con 5-Aza-2-dC (Aza) 0,4 µM durante 24 horas y se analizó la expresión de PU.1 mediante RT-PCR semicuantitativa. b) Las células MEL-DS19 (M) y MEL-R (R) se cultivaron en presencia de Tricostatina A (TSA) 50 nM durante 5 y 24h. A continuación se analizó la expresión de PU.1 mediante RT-PCR semicuantitativa.

Debido a que el tratamiento con 0,4 µM de 5-Aza-2-dC inducía la

expresión de PU.1 se analizó el efecto que esta inducción podría ejercer

sobre la diferenciación de MEL-R, en ausencia o presencia de HMBA.

Los resultados obtenidos, representados en la Figura 35, demostraron

que el tratamiento con 5-Aza-2-dC no es suficiente para provocar la

diferenciación de los cultivos y los porcentajes de células B+ obtenidos son,

consecuentemente, insignificantes. Sin embargo, en presencia de HMBA se

observó un incremento importante en el porcentaje de células diferenciadas

que alcanzó valores superiores al 25%.

Resultados

��

72 hr 96 hr 120 hr 144 hr

30

20

25

15

10

5

% C

élu

las

B+ Aza 0,8 µM

Control

Aza 0,4 µM/HMBAAza 0,8 µM/HMBA

Aza 0,4 µM

Figura 35. El tratamientocon 5-Aza-2-dC induce ladiferenciación de MEL-Ren presencia de HMBA.Los cultivos de células MEL-R se mantuvieron en medio conteniendo 5-Aza-2-dC (Aza) 0,4 ó 0,8 µM en presencia o ausencia de HMBA 5 mM durante 5 días y se determinó el porcentaje de células hemoglobinizadas (B+).

De estos resultados se deduce que la metilación del DNA estaría

implicada en la resistencia de las células MEL-R a reiniciar el programa de

diferenciación. La demetilación del DNA sería insuficiente para desbloquear

la diferenciación aunque haría a las células receptivas a la acción de un

agente inductor como el HMBA. Esto no aclara, sin embargo, qué gen o

genes son los “protagonistas” de esta respuesta.

4.2.4.EsPU.1necesarioparaunarespuestaalHMBA?

Los resultados del apartado anterior demostraron que el tratamiento de

las células MEL-R con 5-Aza-2-dC resulta en una reactivación de la expresión

de PU.1. Paralelamente, se ha constatado que este tratamiento induce un

desbloqueo de la diferenciación en presencia de HMBA. A la vista de estos

hechos, se especuló con la idea de que la inactivación de PU.1 podría ser

la causa del bloqueo de la respuesta de las células MEL-R al HMBA, en

cuyo caso la sobreexpresión de PU.1 sería capaz de revertir el proceso.

Para investigar esta posibilidad se establecieron líneas resistentes estables

capaces de sobreexpresar PU.1. Se clonó el fragmento correspondiente a la

zona codificante de PU.1 en el vector inducible pEBBpuro.ER, de forma que

se obtuvo una forma condicional de PU.1 fusionada al dominio de unión a

estrógeno del receptor de estrógeno humano (ER) que se induce en presencia

de β-estradiol (Figura 36a). Previo a las transfecciones, se comprobó la

Resultados

��

fidelidad de la secuencia así como la correcta localización del marco de

lectura con respecto al epítopo ER. La funcionalidad de la proteína de fusión

PU.1-ER en los transfectantes se analizó mediante Western blot (Figura

36b). El efecto de la expresión ectópica de PU.1 sobre un posible desbloqueo

de la diferenciación en respuesta al HMBA se determinó contabilizando el

número de células hemoglobinizadas en cultivos tratados con β-estradiol.

Como se muestra en la Figura 36c, al cabo de 5 días de tratamiento con el

agente inductor, no se observó un incremento en el porcentaje de células

diferenciadas en los transfectantes que expresaban PU.1 exógeno. Por

otra parte, se comprobó que la inducción de la proteína de fusión PU.1-ER

provocaba un retraso en la cinética de crecimiento de los transfectantes

(Figura 36d). Esto último coincide con estudios previos en donde se demuestra

que la sobreexpresión de PU.1 en células eritroleucémicas induce una

inhibición de la proliferación celular (Yamada y col., 1997). Estos resultados

sugieren que la activación de PU.1 no es suficiente para desbloquear el

proceso de diferenciación en respuesta al HMBA.

Figura 36. La expresión ectópica de PU.1 es insuficiente para desbloquear la diferenciación en respuestaalHMBAencélulasMEL-R.a) Esquema del vector pEBBpuro.PU.1-ER donde se representa el gen que codifica para la resistencia a puromicina (PuroR), cuya expresión está regulada a través del promotor PGK, y el fragmento que codifica para la proteína de fusión PU.1-ER, clonado corriente abajo del promotor EF1α. b) La eficiencia de la construcción se analizó mediante Western blot de extractos proteicos totales de los transfectantes PU.1-ER 3 (P-ER 3), PU.1-ER 7 (P-ER 7) y PU.1-ER 8 (P-ER 8). Como control negativo se utilizó un cultivo transfectado con el pEBBpuro.ER (Control). c) Se determinó el efecto de la expresión ectópica de PU.1 sobre el desbloqueo de la diferenciación en respuesta al HMBA en cultivos tratados con β-estradiol 0,1 µM durante 24 ó 120 horas. Como control positivo se muestra un cultivo de células MEL-R tratado con 5-Aza-2-dC (Aza) 0,4 µM en presencia o ausencia de HMBA. d) Curva de crecimiento de los transfectantes no tratados (3, 7 y 8) y tratados con β-estradiol (3, 7 y 8 + Est). Los números 3, 7 y 8 corresponden a los transfectantes PU.1-ER 3, PU.1-ER 7 y PU.1-ER 8, respectivamente.

c

PuroR PU.1 ERPGK EF1α

P-ER 7P-ER 3 P-ER 8 Aza

10

20

30 0h24h120h

% C

élul

as B

+

HMBA+ + + + + + + + - ++

a

P-ER3

P-ER7

P-ER8

Contro

l

PU.1-ERα-Tubulina

b

90

100 3

3+Est

78

7+Est8+Est

60

30

24h0h 48h 72h

Nº d

e cé

lula

s x

104

dβ-estradiol

Resultados

��

4.2.5.LainactivacióndePU.1enMEL-RnoinfluyeenlaactividaddeSTAT1

En un estudio reciente, el grupo de la Dra. Ruscetti del National

Cancer Institute (USA) sugirió que la inmortalización de los progenitores

eritroides infectados con el SFFV estaba provocada, entre otras cosas, por

un bloqueo de las señales de diferenciación activadas por la proteína STAT1.

Este bloqueo, se especulaba, se debía a unos altos niveles de la fosfatasa

Shp-1 inducidos a su vez por la expresión inoportuna de PU.1 (Nishigaki y

col., 2006). De hecho, se demuestra en el mismo trabajo que la estimulación

con Epo resulta en una activación de la vía de señalización de STAT1 en

líneas eritroleucémicas que no expresan PU.1. Los resultados descritos

en esta tesis demuestran que las células MEL-R sufren un bloqueo de la

diferenciación que es independiente de la actividad de PU.1. Es improbable,

por lo tanto, que este bloqueo esté relacionado con una inactivación de la vía

de señalización de STAT1 a través de PU.1. En este apartado se describen

los resultados de experimentos llevados a cabo para esclarecer esta

contradicción. Se determinó el grado de fosforilación de STAT1 en cultivos

de células MEL-DS19 y MEL-R en respuesta a Epo e interferón-α (INF-α), un

activador constitutivo de la fosforilación de las proteínas STAT. En la Figura

37a se muestra un Western blot en donde se utilizó un anticuerpo anti-

STAT1 que detecta las isoformas α y β de STAT1 fosforiladas en el residuo

tirosina 701. Se observan dos bandas de 84 y 91 KDa correspondientes a

STAT1 α y β, respectivamente, lo cual demuestra que ambas isoformas están

fuertemente fosforiladas en respuesta a la estimulación con INF-α, tanto en

MEL-DS19 como en MEL-R. Por el contrario, no se detectaron indicios de

fosforilación en ninguno de los cultivos, antes o después del tratamiento

con Epo. En paralelo, se testaron los niveles de expresión de la fosfatasa

Shp-1 mediante RT-PCR semicuantitativa. Se observó que Shp-1 presenta

unos niveles altos de expresión en células MEL-DS19 indiferenciadas y que

estos niveles disminuyen cuando las células se diferencian (Figura 37b). La

expresión de Shp-1 en MEL-R es similar a la de las células MEL-DS19 no

inducidas.

Resultados

��

ba48 960 R

MEL

Shp-1

GAPDH

C E IC E IMEL MEL-R

pSTAT1α

STAT1pSTAT1ß

Figura37.BloqueodelafosforilacióndeSTAT1encélulasMEL-R.a) Western blots de extractos proteicos de células MEL-DS19 (MEL) y MEL-R tratadas con INF-α 500 U/ml o Epo murina 100 U/ml. La membrana se incubó sucesivamente con un anticuerpo anti-pstat1 que reconoce las isoformas STAT1 α y STATβ fosforiladas en el residuo tirosina 701 y un anticuerpo anti-stat1 que reconoce tanto las isoformas fosforiladas como las no fosforiladas. C= Control, E= Epo y I= INF-α. b) Análisis mediante RT-PCR semicuantitativa de la expresión de Shp-1 en células MEL-DS19 (MEL) no tratadas (0) y tratadas con HMBA (48 y 96) y células MEL-R (R).

En conjunto, estos resultados sugieren que la fosfatasa Shp-1 podría

estar involucrada en el bloqueo de la diferenciación de las líneas resistentes,

aunque su actividad no vendría regulada por PU.1. Los resultados no

resuelven, sin embargo, la implicación de las STAT1 en este proceso.

4.3.Desbloqueodeladiferenciaciónhaciaellinajeeritroide

Las líneas eritroleucémicas resistentes al HMBA establecidas en

la presente tesis doctoral comparten muchas de las características de la

línea progenitora MEL-DS19, tal como se ha demostrado en los apartados

anteriores. La diferencia más significativa radica sin duda en el silenciamiento

de la expresión de PU.1. Se ha comprobado que este silenciamiento no es si

acaso el único responsable de la incapacidad de las líneas resistentes para

desbloquear la diferenciación en respuesta a diferentes inductores. En ese

caso, la expresión ectópica de PU.1 sería capaz de revertir el fenotipo de las

MEL-R induciendo la respuesta al HMBA. Se ha demostrado en un apartado

anterior que la expresión ectópica de PU.1 sólo produce un retardo en el

crecimiento celular pero en ningún caso el desbloqueo de la diferenciación

(apartado 4.2.4., Figura 36c). Quedaba pendiente por establecer si las MEL-

R son susceptibles de retomar el programa de diferenciación, incluso en

ausencia de PU.1, y, en ese caso, si el resultado sería la diferenciación

hacia el linaje eritroide. Algunos resultados previos obtenidos en células

MEL-DS19 han permitido establecer que el desbloqueo de la diferenciación

exige que concurran dos procesos: la inhibición de la proliferación celular

Resultados

��

y la activación de factores de transcripción específicos (Choe y col., 2003;

Matushansky y col., 2000; Matushansky y col., 2003).

En este bloque de resultados se analizan los efectos que produce

la interferencia en la expresión de factores que regulan el ciclo celular en

relación con el desbloqueo de la diferenciación en MEL-R. Asimismo, se

investigan las consecuencias de una sobreexpresión de GATA-1, uno de

las factores de transcripción imprescindibles para el desarrollo del linaje

eritroide.

4.3.1.EfectodelaexpresiónectópicadeMad1sobreladiferenciacióndecélulasMEL-R

Tal como se describió en la introducción (apartado 1.5.2.2.) Mad1 es

capaz de formar heterodímeros con Max y ejercer una función antagonista

de c-Myc (Cultraro y col., 1997a). La expresión de Mad1 es característica

de estadios diferenciados (Cultraro y col., 1997b). En el Western blot de

la Figura 38a se observa una intensa señal debido a la alta expresión

de Mad1 en células MEL-DS19 diferenciadas así como la prácticamente

ausencia de proteína en MEL-DS19 indiferenciadas y MEL-R. Con el objeto

de comprobar si la expresión de Mad1, que teóricamente debería provocar

una parada del ciclo celular, induce un desbloqueo de la diferenciación en

MEL-R se establecieron transfectantes estables capaces de expresar de

manera ectópica la proteína Mad1. Para ello, se clonó un fragmento capaz

de codificar para la proteína de fusión GFP-Mad en el vector de expresión

pMTHbetaglobin.neo que transcribe bajo la regulación del promotor de

la metalotionina y, por lo tanto, es inducible por ZnCl2 (Figura 38b). Se

transfectaron células MEL-R con dicho vector y se seleccionaron en grupos,

en presencia de G418. Una segunda selección se llevó a cabo utilizando

un separador de células para aislar aquellos clones que expresaran altos

niveles de GFP. Del total de 56 clones obtenidos se seleccionaron 6 en los

cuales se confirmó, mediante Western blot, una alta expresión de la proteína

de fusión GFP-Mad (Figura 38c).

Resultados

��

1 2 5 8 19 22CGFP-Mad

α-Tubulina

c

bGFP Mad

PGK MTH

ZnCl2

NeoR

a

α-Tubulina

Mad10 96 RMEL

Figura38.Establecimientode transfectantesestablesqueexpresan laproteínade fusiónGFP-Mad. a) Análisis por Western blot de los niveles de Mad1 en células MEL-DS19 (MEL) indiferenciadas (0) y diferenciadas con HMBA (96) y células MEL-R (R). b) Esquema del vector pMTH.neo.GFP-Mad donde se representa el promotor PGK, el gen que codifica para la resistencia a neomicina (NeoR) y el fragmento que contiene la secuencia codificante de la proteína GFP-Mad, cuya expresión está regulada por el promotor de metalotionina (MTH) inducible por ZnCl2. c) Se transfectaron células MEL-R con la construcción pMTH.neo.GFP-Mad y se aislaron clones que expresaban altos niveles de GFP utilizando un separador de células. La expresión de la proteína de fusión GFP-Mad se analizó mediante Western blot utilizando un anticuerpo anti-Mad1. Los números representan transfectantes individuales, C= control y corresponde a células MEL-R transfectadas con el vector vacío.

Se analizó a continuación el potencial de cada uno de estos clones para

reiniciar la diferenciación contabilizando el número de células diferenciadas

según el ensayo de benzidina. En la Tabla I y la Figura 39a se muestran los

porcentajes de células diferenciadas después de 4 días de crecer los cultivos

en presencia o ausencia de ZnCl2 y/o HMBA. El porcentaje de diferenciación

espontánea en todos los casos es relativamente bajo, llegando a un máximo

del 25,9% en el clon 19. Los porcentajes de diferenciación se incrementan

en todos los casos en presencia de HMBA superando el 80% de células

diferenciadas en los clones que expresan GFP-Mad más eficientemente

(clones 8, 19 y 22). Por otra parte, la reacción positiva de las células al

ensayo de benzidina, tal y como se deduce de la coloración azul de los

núcleos (Figura 39b), se origina a causa de la interacción de los grupos

heme de la hemoglobina con la benzidina y, por lo tanto, es una indicación

del linaje eritroide. No se observaron diferencias en el porcentaje de células

B+ en presencia o ausencia de ZnCl2 debido, probablemente, al escape del

promotor de la metalotionina, hecho que ocurre con frecuencia en este tipo

de vectores.

Resultados

��

TablaI.DiferenciacióndelostransfectantesGFP-Mad%CélulasBenzidinaPositivo

-HMBA +HMBA

ZnCl2 - + - -

Control 1,7 0,8 0,8 1,3

Clon 1 5,3 5,3 28,2 36,5

Clon 2 0,7 0,7 28,4 37,1

Clon 5 5,4 5,4 19,0 19,4

Clon 8 2,4 8,8 88,9 90,8

Clon 19 9,4 25,9 98,0 97,6

Clon 22 6,6 12,3 87,8 90,6

Los clones MEL-R pMTH.neo.GFP.Mad se cultivaron en medio DMEM completo con G418 en presencia o ausencia de 100 µM ZnCl2 y/o 5 mM HMBA durante 4 días. El porcentaje de células B+ se estimó mediante el ensayo de benzidina. Se utilizó como control un clon MEL-R pMTHbetaglobin.neo.

Figura39.LaexpresiónectópicadeMad1provocaundesbloqueodeladiferenciacióndecélulasMEL-RenpresenciadeHMBA.a) Porcentaje de células diferenciadas (B+) en transfectantes cultivados en presencia o ausencia de ZnCl2 100 µM y/o HMBA 5mM. Cada barra corresponde a la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes. Los números representan clones individuales, C= control, corresponde a células MEL-R transfectadas con el vector vacío. b) Tinción con benzidina de los transfectantes tratados y no tratados con HMBA. Se muestran campos representativos de los experimentos descritos en a).

HMBA

Control

Clon 1

Clon 2

Clon 5

- +

Clon 8

Clon 19

Clon 22

HMBA- +b

a

C 1 2 5 8 19 22

20

40

60

80

100

% C

élul

as B

+

Zn/HMBA-/-+/--/++/+

Resultados

��

Cuando se analizó mediante citometría de flujo el contenido de DNA

de los clones 8, 19 y 22 tratados con ZnCl2 y HMBA se observó que los

perfiles coincidían con el de un cultivo diferenciado de células MEL-DS19

observándose un pico de acumulación en la fase G1 del ciclo celular (Figura

40). De estos resultados se deduce que la expresión ectópica de Mad1, aún

sin actuar directamente sobre el desbloqueo de la diferenciación, predispone

a las células MEL-R hacia un estado que les permite responder al HMBA.

Se demostró que las MEL-R mantienen aún la capacidad de diferenciarse y,

al menos cuando se utiliza HMBA como agente inductor, llevan a cabo una

diferenciación hacia el linaje eritroide.

Contenido de DNA

Nº d

e cé

lula

s

2C 4C

Control

2C 4C

Clon 19

2C 4C

Clon 8

2C 4C

Clon 22

Figura40.Acumulaciónen la faseG1delciclocelularen los transfectantesMEL-RpMTH.neo.GFP-Mad.Los clones 8, 19 y 22 se trataron con ZnCl2 100 µM y HMBA 5mM durante 96 horas y se analizó el contenido de DNA mediante citometría de flujo. Control= células transfectadas con el vector pMTHbetaglobin.neo.

4.3.2. Efecto de la inhibición de la expresión de c-Myc sobre ladiferenciacióndecélulasMEL-R

Los resultados obtenidos, descritos en el apartado anterior, permitieron

demostrar que la sobreexpresión de Mad1 influye en el desbloqueo de

la diferenciación de las células MEL-R. Es de suponer que el efecto de

Mad1 sobre el proceso radica en su capacidad para antagonizar con c-Myc

interfiriendo de esta forma con la proliferación celular. Si esta hipótesis es

correcta la inhibición de c-Myc debería producir un efecto similar. Con el

objeto de comprobar si esto es así, se establecieron transfectantes estables

que expresaban un RNA interferente de c-Myc. El RNA interferente se diseñó

utilizando como molde una zona específica del exón 2 de c-myc, tal y como se

describe en Materiales y Métodos (apartado 3.2.1.), y se incorporó al vector

Resultados

��

de expresión pSUPER.retro.neo+GFP (Figura 41a). Una vez seleccionados

los transfectantes, primero en grupos resistentes a G418 y luego en clones

que expresaban altos niveles de GFP, se confirmó mediante Western blot la

capacidad del vector para silenciar la expresión de c-Myc (Figura 41b).

aNeoRGFPsiRNA-Myc

H1 PGK

siRNA-Myc- + - +c-Myc

α-Tubulina

MEL MEL-Rb

Figura41. Inhibiciónde laexpresióndec-MycmediantesiRNA.a)Esquema del vector pSUPER.retro.neo+GFP.Myc donde se indica el fragmento que codifica para el siRNA anti-Myc (siRNA-Myc), clonado corriente abajo del promotor H1, y el fragmento que codifica para la proteína quimérica GFP-NeoR, cuya expresión está regulada por el promotor PGK. b) La funcionalidad de la construcción se analizó por Western blot en células MEL-DS19 (MEL) y MEL-R transfectadas con pSUPER.retro.neo+GFP (-) o pSUPER.retro.neo+GFP.Myc (+). Las membranas se incubaron con un anticuerpo monoclonal anti-c-Myc. Como control de carga se utilizó un anticuerpo anti-α-Tubulina.

Como era de esperar, aquellos clones más eficientes en su capacidad

de expresar el RNA interferente eran también los más deficientes en cuanto

a crecimiento y viabilidad celular. De un total de 22 clones se seleccionaron

8 cuya curva de crecimiento se representa en la Figura 42. La capacidad de

proliferación de la mayoría de los clones seleccionados fue prácticamente

nula (clones 6, 7, 10, 13 y 14) o al menos muy reducida (clones 2, 4 y 9) en

comparación con el control.

0h 24h 48h 72h

Nº d

e cé

lula

s x

104

20

40

60

80

Control24679101314

Figura42.Inhibicióndelaproliferacióncelular en los transfectantes MEL-RpSUPER.retro.neo+GFP.Myc. Se realizó una curva de crecimiento partiendo de cultivos en crecimiento exponencial (1x105 células/ml). Se contabilizó el número de células/ml cada 24 horas durante 4 días consecutivos. Los números corresponden a clones individuales. Cada curva representa la media de tres experimentos independientes.

Resultados

�0

Cuando se analizó el porcentaje de células hemoglobinizadas en

cultivos no tratados y tratados con HMBA durante 96 horas se observó un

incremento en el porcentaje de células diferenciadas sólo en el caso de

aquéllos que habían crecido en presencia del inductor (Figura 43a y b). Esto

se observa más claramente para los clones 2 y 4, que son asimismo dos de

los que presentaron un mayor crecimiento con respecto al control.

b

% C

élul

as B

+

C 2 4 6 9 13

10

20

30 - HMBA+ HMBA

a - +

Control

Clon 4

Clon 2

HMBA

Figura 43. La inhibición específica de c-Myc provoca un desbloqueo de la respuesta de la células MEL-RalHMBA.a) Se analizó el efecto de la inactivación de c-Myc sobre la diferenciación celular contabilizando el porcentaje de células hemoglobinizadas (B+)en presencia o ausencia de HMBA 5mM. Los números corresponden a clones individuales. C= transfectante control, corresponde a células MEL-R transfectadas con el vector vacío. b) Tinción con benzidina del control y los clones pSUPER.retro.neo+GFP.Myc tratados y no tratados con HMBA.

Estos resultados son consistentes con la noción de que el silenciamiento

de c-myc induce un bloqueo de la proliferación celular y confirman que la

inhibición de la proliferación es un requisito indispensable para que se

produzca la diferenciación celular. Tal y como ocurría con la sobreexpresión

de Mad1, el silenciamiento de c-myc no provoca directamente un desbloqueo

de la diferenciación, sino que predispone a las células MEL-R para responder

a inductores del proceso, en este caso el HMBA.

4.3.3.DiferenciaciónespontáneaenrespuestaalasobreexpresióndeGATA-1

El factor de transcripción GATA-1 es un regulador clave de la

eritropoyesis que coordina la inhibición de la proliferación con la maduración

celular actuando tanto como activador o represor de genes involucrados

Resultados

��

en ambos procesos (Rodriguez y col., 2005; Rylski y col., 2003). Estudios

previos en MEL-DS19 han demostrado que la sobreexpresión de GATA-1

induce un desbloqueo espontáneo de la diferenciación (Choe y col., 2003).

GATA-1 está activo en las líneas MEL-R así como en las progenitoras MEL-

DS19 y su nivel de expresión es alto incluso en células indiferenciadas. No

obstante, los niveles del factor de transcripción se incrementan discretamente

en células diferenciadas (Figuras 29 y 30c). Con el objeto de investigar si

la sobreexpresión de GATA-1 producía algún efecto sobre la diferenciación

de las líneas resistentes se transfectaron células MEL-DS19 y MEL-R con el

vector inducible, pEBBpuro.GATA-ER, que expresa una forma condicional de

GATA-1 fusionada al dominio de unión a estrógeno del receptor de estrógeno

humano (ER) (Figura 44a). Previamente, se analizó la eficiencia del vector

mediante transfecciones transitorias en células 293T, que no expresan GATA-

1, y se comprobó la funcionalidad de la proteína quimérica en respuesta a β-

estradiol (Figura 44b). De los transfectantes originados a partir de MEL DS-

19 y MEL-R se aislaron clones resistentes a puromicina mediante diluciones

en serie y se analizó el nivel de expresión de la proteína de fusión GATA-ER

mediante Western blot (Figura 44c).

ERPuroR GATA-1PGK EF1a

a 293T

pEBBpuro.G-ER

MEL

GATA-ER

GATA-1

β-estradiol--

- --

+++

b

cC 4 10 C 9 5 1

MEL MEL-R

GATA-ER

GATA-1

Figura44.ObtencióndetransfectantesestablesquesobreexpresanlaproteínadefusiónGATA-ER.a) Esquema del vector pEBBpuro.GATA-ER donde se representan el gen que codifica para la resistencia a puromicina, clonado corriente arriba del promotor PGK, y el fragmento que codifica para la proteína de fusión GATA-ER, cuya expresión está regulada por el promotor EF1α. b) La funcionalidad de la construcción se analizó mediante Western blot en células 293T transfectadas con pEBBpuro.GATA-ER tratadas y no tratadas con β-estradiol 0,1 µM. La membrana se incubó con un anticuerpo anti-GATA-1 que reconoce tanto la proteína endógena como la quimérica. Como control positivo se incluyeron células MEL-DS19 (MEL). c) Se transfectaron células MEL-DS19 y MEL-R con la construcción pEBBpuro.GATA-ER y se aislaron clones mediante diluciones en serie. La expresión de GATA-ER en presencia de β-estradiol 0,1 µM se analizó mediante Western blot utilizando un anticuerpo anti-GATA-1. Los números representan transfectantes individuales; C= transfectante control, corresponde a células MEL-R transfectadas con el vector pEBBpuro.ER.

Resultados

��

En todos los casos, a excepción de los controles, se observaron dos

bandas de 75 KDa y 49 KDa correspondientes a la proteína de fusión GATA-

ER y a la proteína endógena, respectivamente. El efecto de la sobreexpresión

de GATA-1 sobre un posible desbloqueo de la diferenciación en presencia o

ausencia de HMBA y/o β-estradiol se determinó contabilizando el porcentaje

de células B+ (Tabla II y Figura 45a y b).

TablaI.DiferenciacióndelostransfectantesGATA-ER%CélulasBenzidinaPositivo

-HMBA +HMBA

β-estradiol - + - -

MEL 4 0,1 93,6 94,1 93,5

MEL 10 0,1 5,3 94,4 94,7

MEL-R 9 3,6 49,3 15,8 44,5

MEL-R 5 0,4 29,0 6,6 30,4

MEL-R 1 0,5 3,9 3,9 19,6

Los transfectantes MEL y MEL-R pEBBpuro.GATA.ER se cultivaron en medio DMEM completo con puromicina en presencia o ausencia de 0,1 µM β-estradiol y/o 5 mM HMBA durante 4 días. El porcentaje de células B+ se estimó mediante el ensayo de benzidina.

Clon 9Control Clon 5 Clon 1β-estradiolHMBA

- + - +- - + +

- + - +- - + +

- + - +- - + +

- + - +- - + +

15

30

45

% C

élul

as B

+

β-estradiol

Control

Clon 5

Clon 9

- +a b

Figura45.LasobreexpresióndeGATA-1induceladiferenciaciónespontáneadelascélulasMEL-R.a) El efecto de la sobreexpresión de GATA-1 sobre el desbloqueo de la diferenciación de MEL-R se analizó contabilizando el número de células hemoglobinizadas (B+) en presencia o ausencia de β-estradiol 0,1 µM y/o HMBA 5 mM. Cada barra corresponde a la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes. b) Preparaciones citológicas teñidas con benzidina de los clones MEL-R pEBBpuro.GATA-ER tratados o no tratados con β-estradiol. Se muestran campos representativos de los experimentos descritos en a).

Resultados

��

Se comprobó que la sobreexpresión de GATA-1 induce un incremento

significativo del porcentaje de células hemoglobinizadas. En los clones que

expresaban niveles más altos de la proteína de fusión, como era el caso

del clon 9, el porcentaje de células B+ alcanzó valores superiores al 50%

y, como era de esperar, se observó que la expresión de β-globina era más

pronunciada (Figura 46). El porcentaje de células diferenciadas no sufrió

grandes variaciones cuando se añadió HMBA al medio de cultivo, a diferencia

de lo que ocurría en el caso de las transfecciones con Mad-1 y c-Myc. Estos

resultados demostraron que la sobreexpresión de GATA-1 es suficiente

para inducir un desbloqueo de la diferenciación en las células resistentes,

diferenciación que ocurre invariablemente hacia el linaje eritroide.

18S

C C4 5 910

β-globina

β-estradiol- + - + - + - + - + - +

MEL MEL-R

Figura 46. Análisis mediante Northern blot de la expresión de β-globina enlostransfectantesGATA-ER.Se aisló RNA total de los transfectantes MEL-DS19 (MEL) y MEL-R pEBBpuro.GATA-ER tratados o no tratados con β-estradiol 0,1 µM, se fraccionaron alícuotas de 10 µg en un gel desnaturalizante y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa. El filtro se hibridó con el vector pSK(+)β-globina, linearizado con EcoRI, marcado radiactivamente. La tinción con bromuro de etidio se utilizó para verificar la integridad del RNA y la carga equitativa de la muestras.

4.4.Fli-1,antagonistadeGATA-1enausenciadePU.1

GATA-1 es uno de los factores de transcripción fundamentales del

sistema eritropoyético. Aún cuando se expresa constitutivamente en MEL-

DS19 y en MEL-R (Figura 30c) de forma similar a como ocurre en todos los

precursores eritropoyéticos, la actividad de GATA-1 está bloqueada en las

células eritroleucémicas (Rekhtman y col., 2003; Stopka y col., 2005; Zhang

y col., 2000). En el presente trabajo se ha demostrado que la sobreexpresión

de GATA-1 provoca la diferenciación espontánea de las células MEL-R

(apartado 4.3.3., Tabla II y Figura 45). Existen evidencias que sugieren

que PU.1 inhibe la diferenciación de MEL-DS19 uniéndose y reprimiendo a

Resultados

��

GATA-1 (Rekhtman y col., 1999; Zhang y col., 2000). En MEL-R, donde la

actividad de PU.1 está silenciada, se deduce que debería existir otro factor

(o factores) con la capacidad de bloquear la función de GATA-1.

En este apartado se investiga el papel del factor de transcripción Fli-

1 como un posible antagonista alternativo de GATA-1 capaz de bloquear

la respuesta a los agentes inductores de la diferenciación en ausencia de

PU.1.

4.4.1. Análisis de la expresión de genes que codifican paraproteínasqueregulanlaactividaddeGATA-1

De los resultados obtenidos en apartados anteriores se deduce que la

inactivación de PU.1 es insuficiente para inducir el desbloqueo de GATA-1.

En un intento de comprobar si existe otro factor alternativo a PU.1 en MEL-

R se analizó mediante RT-PCR semicuantitativa la expresión de genes que

codifican para proteínas capaces de regular la actividad de GATA-1 durante

la diferenciación eritroide (Figura 47).

b48 960 R

MEL

GATA-2

GAPDH

Fli-1

48 960 RMEL

FOG-1

Gfi-1b

GAPDH

a

Figura 47. Análisis de la expresión de genes que codifican para proteínas capaces de modificar laactividaddeGATA-1.Análisis por RT-PCR semicuantitativa del nivel de expresión de genes que codifican para reguladores positivos a) o negativos b) de la actividad de GATA-1 y la eritropoyesis en células MEL-DS19 (MEL) indiferenciadas (0) y diferenciadas con HMBA (48 y 96) y células MEL-R (R).

Se investigaron inicialmente dos reguladores positivos de la actividad

de GATA-1, FOG-1 y Gfi-1b (Figura 47a). En el caso de FOG-1 se observó

un producto de amplificación cuya intensidad era similar en MEL-R y MEL

DS-19 indiferenciadas. En las células MEL-DS19 tratadas con HMBA, se

observó un incremento en los niveles de FOG-1 que coincide en el tiempo

con una mayor expresión de GATA-1 y estaría en línea con estudios recientes

que indican que FOG-1 es activado de manera directa por GATA-1 (Welch y

Resultados

��

col., 2004). En el caso del factor de transcripción Gfi-1b se observaron

dos bandas correspondientes a transcritos alternativos que no mostraban

diferencias significativas a nivel de expresión entre las células MEL-R y

las progenitoras MEL-DS19. Estos resultados demuestran que los niveles

de FOG-1 y Gfi-1b son similares en MEL-DS19 y MEL-R y, por lo tanto, no

parece que exista una inactivación inapropiada en ningún caso. De forma

indirecta se deduce que ninguno de estos factores participa en el bloqueo

de la actividad de GATA-1 en las líneas resistentes.

Se analizaron asimismo GATA-2 y Fli-1 como ejemplos de reguladores

negativos de GATA-1 e inhibidores de la diferenciación eritroide (Figura 47b).

La expresión de GATA-2 tanto en las células MEL-R como en las MEL-DS19

diferenciadas fue prácticamente indetectable. Por lo tanto GATA-2, al estar

inactivo en MEL-R, no podría ser el responsable del bloqueo de la actividad

de GATA-1. Los niveles de expresión de Fli-1, por el contrario, son altos

tanto en MEL-R como en MEL-DS19. En los cultivos de MEL-DS19 tratados

con HMBA se observa un descenso en los niveles de Fli-1 que coincide en el

tiempo con el inicio de la diferenciación. Para comprobar si la expresión de

Fli-1 a nivel de proteína reproducía los resultados anteriores se analizaron

mediante Western blot extractos proteicos de MEL-DS19, MEL-R y dos

clones derivados de MEL-R, 7A y 11A. Se utilizó un anticuerpo anti-Fli-1 que

reconoce dos isoformas que se originan a partir de codones de iniciación

alternativos (ver esquema de la Figura 48a) (Sarrazin y col., 2000). En todos

los casos se detectaron dos bandas, de 48 y 51 KDa, correspondientes a las

dos isoformas mencionadas anteriormente. La intensidad relativa de ambas

isoformas difería en las líneas resistentes y las parentales.

Figura48.Regulacióndiferencialdelaexpresióndelasisoformasde48y51KDadeFli-1enMEL-DS19yMEL-R.a) Representación esquemática de los dos mRNAs que codifican para las isoformas de Fli-1. Ambos comparten el mismo marco de lectura, pero se originan en el AUG+1 y el AUG+100 dando lugar a las isoformas de 48 y 51 KDa, respectivamente. b) Análisis por Western blot de la expresión de las isoformas de Fli-1 en extractos proteicos totales de MEL-DS19 (MEL), MEL-R y los clones resistentes 7A y 11A.

AUG AUG UAG51 kDa48 kDa

+1 +100 +1356a b MEL

MEL

-R

7A 11A48 kDa51 kDa

Resultados

��

a IPGATA-1

M MR R

Input 1%

PU.1

GATA-1**

M R M RM R

Input3%

IPFli-1

IPControl

GATA-1

b

Figura 49. Interacción entre Fli-1 y GATA-1 en células MEL-R. a) Se inmunoprecipitaron extractos nucleares de MEL-DS19 (M) y MEL-R (R) con un anticuerpo monoclonal anti-GATA-1. Las proteínas inmunoprecipitadas se analizaron mediante Western blot utilizando anticuerpos anti-PU.1 y anti-GATA-1. La tercera y la cuarta línea corresponden al 1% de los extractos totales utilizados en la inmunoprecipitación. b) Los extractos nucleares de MEL-DS19 (M) y MEL-R (R) se inmunoprecipitaron con un anticuerpo monoclonal anti-Fli-1 o un anticuerpo irrelevante (control). Las proteínas inmunoprecipitadas se analizaron mediante Western blot utilizando un anticuerpo anti-GATA-1. La primera y la segunda línea corresponden al 3% de los extractos totales utilizados en la inmunoprecipitación.

En MEL-DS19 la banda correspondiente a la isoforma de 48 KDa es

más intensa que la de 51 KDa. Lo contrario se observa en MEL-R y en los

clones 7A y 11A (Figura 48b). Es posible que el cambio en la relación entre

ambas isoformas esté relacionado con el bloqueo de la respuesta a los

inductores en las líneas resistentes. Por otro lado, la presencia activa de Fli-

1 en las líneas resistentes induce a pensar en este factor de transcripción

como un posible candidato alternativo a PU.1 capaz de interaccionar con

GATA-1 y bloquear la diferenciación de MEL-R.

4.4.2.PU.1,Fli-1yelbloqueodelaactividaddeGATA-1enMEL-R

PU.1 interacciona físicamente con GATA-1 cuando este último

está unido al DNA de sus genes diana. Se especula que esto permite el

reclutamiento de un complejo represor que provoca el silenciamiento de la

cromatina creando así un entorno estructural inactivo (Stopka y col., 2005).

Con el propósito de corroborar que PU.1 se une a GATA-1 en las líneas

parentales se analizó la interacción PU.1/GATA-1 mediante experimentos

de coinmunoprecipitación de proteínas endógenas utilizando un anticuerpo

monoclonal anti-GATA-1 para inmunoprecipitar y anticuerpos anti-PU.1

y anti-GATA-1 para la detección. Se comprobó que GATA-1, presente en

extractos nucleares de MEL-DS19 y MEL-R, coinmunoprecipitaba con PU.1

en MEL-DS19. Como era de esperar, no se observó ninguna interacción en

las células MEL-R (Figura 49a).

Resultados

��

En el apartado anterior se demostró que Fli-1, un factor de transcripción

que comparte características estructurales y funcionales con PU.1, está

activo en MEL-R. Con el objeto de comprobar si Fli-1 interactuaba con

GATA-1, supliendo probablemente la función de PU.1, se llevaron a cabo

experimentos de coinmunoprecipitación de proteínas endógenas de células

MEL-R y MEL-DS19 utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón anti-Fli-1.

Tal y como se observa en la Figura 49b, se comprobó que Fli-1, presente

en ambos extractos nucleares, interacciona con GATA-1 tanto en las células

MEL-R como en las MEL-DS19 parentales.

De estos experimentos se deduce que Fli-1 podría estar implicado en

el bloqueo de GATA-1 en las líneas resistentes. No se descarta que Fli-1

incluso coopere con PU.1 para bloquear a GATA-1 en las células progenitoras

MEL-DS19.

5. DISCUSIÓN

Discusión

��

5.1.Desbloqueodeladiferenciacióndecélulaseritroleucémicas

La caracterización de genes involucrados en el desbloqueo de la

diferenciación de las células eritroleucémicas ha sido objeto de numerosos

estudios. La hipótesis de la existencia de un “gen maestro” que activa la

determinación hacia un linaje específico, como se propuso para Myo-D en

el linaje muscular, no ha encontrado una correspondencia plena en el linaje

eritroide. Los resultados obtenidos demuestran que la determinación celular

hacia el linaje eritroide es un proceso complejo cuya regulación implica

mucho más que un único gen regulador (Cantor y Orkin, 2002; Iwasaki y

Akashi, 2007; Tenen, 2003). Actualmente, se cree que la activación de la

diferenciación hacia un linaje específico del sistema hematopoyético depende

de la acción combinada de factores de transcripción específicos así como de

éstos y varios factores constitutivos que, en un fino equilibrio cuantitativo,

dan lugar a uno u otro linaje celular (Perry y Soreq, 2002). Un ejemplo en

este sentido lo constituye la exquisita proporción que debe existir entre los

factores de transcripción hematopoyéticos GATA-1 y PU.1 para determinar

la diferenciación eritroide o mieloide (Rekhtman y col., 2003; Rekhtman y

col., 1999; Tenen, 2003; Zhang y col., 2000).

Se ha demostrado que el tratamiento de las células eritroleucémicas con

agentes inductores de diferenciación celular resulta en cambios selectivos

de la expresión génica que conducen a las células de forma irreversible a la

diferenciación eritroide. En los primeros estadios se produce una inhibición

de la expresión de genes relacionados con un fenotipo inmaduro, como

GATA-2, c-myb y c-myc, junto con una acumulación de las células en la

fase G1 del ciclo celular (Lachman y Skoultchi, 1984; Matushansky y col.,

2000; Rifkind y col., 1996). De manera coordinada con el cese de la división

celular, la activación de factores de transcripción específicos y los cambios

en la conformación de la cromatina inducen la reactivación del programa

de diferenciación. El proceso culmina con la síntesis de hemoglobina y

otros marcadores específicos del linaje eritroide y la reversión del fenotipo

transformado.

En la presente tesis doctoral se han abordado algunos aspectos

relacionados con el desbloqueo de la diferenciación de las células

eritroleucémicas utilizando como modelo las células Friend. En un intento

Discusión

�0

por identificar y caracterizar factores involucrados en la respuesta al HMBA

se establecieron líneas eritroleucémicas derivadas de MEL-DS19 que son

resistentes a la acción del inductor (MEL-R). Se demostró que las células

resistentes son capaces de reiniciar el programa de diferenciación hacia el

linaje eritroide cuando se induce una parada de la proliferación celular o

se sobreexpresa el regulador transcripcional GATA-1. Contrariamente a lo

esperado, se constató que la expresión de PU.1 está inhibida en las líneas

resistentes, aún cuando la integración del SFFV ocurre en el mismo sitio

que en las células progenitoras. El tratamiento de las células MEL-R con 5-

Aza-2-dC provocó una reactivación de la expresión de PU.1, lo cual sugiere

que el gen Sfpi-1/PU.1 está metilado en MEL-R y que ésta podría ser la

principal causa de la inactivación de PU.1 en las líneas resistentes. Por

último, los resultados obtenidos sugieren que el factor de transcripción Fli-1

podría actuar como un inhibidor de GATA-1, alternativo a PU.1, en células

eritroleucémicas.

5.2.MEL-RylaresistenciaalHMBA

Cuando se exponen cultivos de células MEL-DS19 a tratamientos con

inductores de la diferenciación tales como el HMBA se desencadena una serie

de procesos que conducen a la reactivación del programa de diferenciación

eritroide. En el presente trabajo se aisló una población de células que, a

diferencia de las MEL-DS19 parentales, son capaces de proliferar en presencia

de HMBA y presentan un porcentaje de células diferenciadas similar al de

un cultivo de células MEL-DS19 indiferenciadas (Figura 15). Experimentos

posteriores revelaron que la resistencia observada no es específica para el

HMBA, ya que las células MEL-R son también resistentes a otros agentes

inductores de la diferenciación celular, como el DMSO, el butirato de sodio

y la hemina. Las dianas moleculares del HMBA, así como del resto de los

agentes mencionados, no han sido aún identificadas. En ocasiones se ha

sugerido que el modo de acción del HMBA y el DMSO estaría asociado a

cambios en la actividad PKC (Protein Kinase C), activación de tirosinas

fosfatasas, variaciones en la concentración de calcio en las células, etc

(revisado en (Tsiftsoglou y col., 2003a)). Por otra parte, el modo de acción

Discusión

��

del butirato de sodio, un inhibidor de las HDACs, podría estar relacionado con

la inhibición de ERK (Extracellular Signal-Regulated Kinases) y la activación

de “vías transduccionales de p38” (p38 signal transduction pathways) (Witt y

col., 2000). Sea cual fuere el mecanismo de acción de los distintos agentes

inductores ninguno es capaz de desbloquear la diferenciación de las

células resistentes, lo que induce a pensar que el modo de acción de estos

inductores converge en una vía común. Paralelamente, se comprobó que la

resistencia al HMBA no depende de la presencia continua del inductor ya

que las células MEL-R conservan la resistencia aún después de permanecer

largos períodos en ausencia de HMBA. Se desconoce, sin embargo, si los

factores que confieren esta resistencia son inherentes a las MEL-R o si, por

el contrario, se manifiestan sólo después del tratamiento con HMBA.

El análisis de la distribución de las distintas fases del ciclo celular

en células MEL-R tratadas con HMBA confirmó que las células resistentes

presentan una distribución característica de estados proliferativos, a

diferencia de las MEL-DS19 inducidas con HMBA en donde se produce una

acumulación gradual en la fase G1 del ciclo celular (Kiyokawa y col., 1993;

Vanegas y col., 2003). Junto con el patrón de expresión de marcadores

de proliferación y diferenciación celular, c-myc y β-globina, nuestros

experimentos confirmaron que las líneas resistentes se mantienen en un

estado indiferenciado. No obstante, se observaron algunas diferencias

fenotípicas entre las células MEL-DS19 indiferenciadas y las MEL-R. La

comparación de la cinética de crecimiento de ambas poblaciones puso

de manifiesto la existencia de un alargamiento considerable del tiempo

de duplicación de las células MEL-R con respecto al de la línea parental.

Asimismo, se comprobó que el tamaño de las células resistentes es un 25%

mayor que el de las células MEL-DS19 indiferenciadas, que a su vez son

un 25% más grandes que las MEL-DS19 diferenciadas. Este incremento

podría tener relación con la inhibición de la salida del ciclo celular en las

líneas resistentes. Se ha sugerido que la oncoproteína c-Myc juega un papel

esencial en el acoplamiento entre proliferación y crecimiento celular. c-Myc

activa la expresión de genes relacionados con la biogénesis ribosómica,

el metabolismo de los nucleótidos y la regulación de la traducción, lo cual

trae acoplado un incremento del tamaño celular (revisado en (Dang, 1999;

Oskarsson y Trumpp, 2005)). Johnston y colaboradores demostraron que

Discusión

��

dmyc, el ortólogo de c-myc en Drosophila, regula el tamaño celular durante

el desarrollo. La pérdida de dmyc en las células del ala de Drosophila retarda

el crecimiento celular y como consecuencia se reduce el tamaño del ala,

mientras que la sobreexpresión de dmyc incrementa la tasa de crecimiento

y el tamaño celular (Johnston y col., 1999). Asimismo, se ha constatado

que la sobreexpresión de c-Myc induce un incremento significativo del

tamaño celular en células B y en fibroblastos (Beier y col., 2000; Iritani y

Eisenman, 1999; Schuhmacher y col., 1999). En base a estos datos se ha

sugerido que el potencial de c-Myc para estimular la progresión del ciclo

celular se debe, en parte, a su capacidad para activar el crecimiento celular

(Eisenman, 2001). En el caso de MEL-R, se pensó en un principio que el

aumento del tamaño podría estar relacionado con una sobreexpresión de c-

myc. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en el nivel de

expresión de las células MEL-DS19 parentales indiferenciadas y las MEL-

R. Aún es posible, no obstante, que el incremento del tamaño celular esté

relacionado con una estabilización anormal de la proteína que podría tener

su origen en mutaciones específicas. En un trabajo reciente, Buschbeck y

colaboradores confirmaron que la desestabilización de c-Myc, a través de

PML4 (Promyelocitic leucemia gene isoform 4), potencia la diferenciación

granulocítica en células U937 tratadas con vitamina D (Buschbeck y col.,

2007).

En linfomas de Burkitt, así como en linfomas asociados a la infección

con HIV y en cierto tipo de leucemias linfoblásticas agudas se ha observado

una alta frecuencia de mutaciones puntuales en la zona codificante de c-myc

(Marcu y col., 1992). Estas mutaciones se localizan principalmente en el

dominio de transactivación dentro o cerca de la caja Myc 1 (MB1) y resultan

en una inhibición de la fosforilación de los residuos treonina 58 y/o serina 62,

involucrados en la degradación de c-Myc. El residuo treonina 58 fosforilado

por GSK3 es reconocido por la proteína FBW7, que regula la ubiquitinización

de c-Myc para su posterior degradación a través de la vía del proteasoma.

Las mutaciones puntuales que afectan al residuo treonina 58, o a residuos

que forman parten de la vía de señalización que regula la fosforilación del

residuo treonina 58, inhiben la degradación de c-Myc y resultan en una

estabilización anormal de la proteína (Bahram y col., 2000; Hoang y col.,

1995) . Los resultados de la secuenciación de c-myc en las células MEL-R

Discusión

��

desecharon la hipótesis de la presencia de mutaciones específicas como

causa de una posible estabilización anormal de la oncoproteína. No se

descarta, sin embargo, la existencia de otras modificaciones que pudieran

resultar en una mayor estabilidad de c-Myc en las líneas resistentes.

Estudios recientes han puesto de manifiesto que la estabilización de c-Myc

podría estar relacionada con alteraciones en la ruta de degradación GSK3

– FBW7. En células de pacientes con leucemia linfoblástica aguda (ALL)

que carecen de mutaciones en la secuencia codificante la estabilización

de c-Myc está relacionada con una menor afinidad por la GSK3β (Glycogen

Synthase Kinase3β), la quinasa que fosforila a c-Myc en el residuo treonina

58. (Malempati y col., 2006). Por otra parte, en células de osteosarcoma

(U2OS) se ha descrito una proteasa, USP28, que antagoniza la función de

FBW7α aumentando la estabilidad de c-Myc en el núcleo (Popov y col.,

2007). Los mismos autores demostraron que USP28 es necesaria para la

estabilización de c-Myc en células tumorales humanas y que la inhibición de

USP28 tiene el mismo efecto sobre proliferación y diferenciación celular que

la pérdida de c-Myc.

El incremento del tamaño celular de las MEL-R, unido al hecho de que

las células fueran incapaces de reiniciar el programa de diferenciación hacia

el linaje eritroide, llevó a suponer que las mismas podrían haber perdido

la capacidad de diferenciación eritroide en favor de una diferenciación

megacariocítica. Se ha sugerido que las células MEL podrían, al igual que ocurre

con las líneas humanas K562 o HEL, derivar hacia el linaje megacariocítico

(Tsiftsoglou, 2003a). De hecho en algún caso se observó que la inducción de

células MEL con HMBA en presencia de cantidades limitantes de suero podía

activar el programa de diferenciación megacariocítico a expensas del eritroide

(Paoletti y col., 1995). Los resultados de los experimentos llevados a cabo

con el éster de forbol TPA, un inductor de la diferenciación megacariocítica,

han permitido comprobar que las células MEL-R no responden al TPA y por

lo tanto no se diferencian hacia el linaje megacariocítico. Esta hipótesis

está reforzada además por la falta de expresión de marcadores del linaje

megacariocítico.

Por otra parte, se verificó que después de largos períodos en cultivo

las células resistentes tienden a duplicar su contenido de DNA en ausencia

de una división celular posterior para dar lugar a tetraploides estables. La

Discusión

��

duplicación del juego de cromosomas para producir células tetraploides es

un paso intermedio para el posterior desarrollo de aneuploidías en células

tumorales (Margolis, 2005; Margolis y col., 2003; Storchova y Pellman,

2004). Esta inestabilidad genómica podría explicar la adquisición de

características especiales de las células tumorales tales como la capacidad

de hacer metástasis y desarrollar resistencia a los agentes anticancerígenos

(Beckman y Loeb, 2005; Prochownik, 2005; Storchova y Pellman, 2004). De

hecho, los genes implicados en el checkpoint encargado de eliminar células

tetraploides, como p53 y Rb, están inactivos en la mayoría de los tumores

(Margolis y col., 2003). Se ha observado que la inactivación de p53 junto

con una desregulación de la expresión de c-myc acelera el desarrollo de

tetraploidías o pseudotetraplodías en fibroblastos y células mieloides de

orígen murino (Li y Dang, 1999; Yin y col., 1999). La tetrapliodización de las

MEL-R sería por lo tanto la consecuencia de un aumento de la inestabilidad

genómica. Es posible que las células resistentes a los agentes inductores de

la diferenciación posean una grado de tumorigenicidad más elevado y por lo

tanto tiendan a tetraploidizar más fácilmente. La causa de este aumento (+

myc? - PU.1?) está aún por resolver.

5.3.EsPU.1indispensableparaelbloqueodeladiferenciacióndelascélulasFriend?

El resultado más sorprendente obtenido a lo largo del desarrollo

del presente trabajo fue la inactivación de PU.1 observada en las líneas

resistentes (Figuras 29 y 30a y b). La activación de la expresión de PU.1 debido

a la integración del SFFV en el locus Sfpi-1/PU.1 es un evento considerado

esencial para la transformación de los progenitores eritroides infectados

con el complejo Friend (Li y col., 1990). Se ha sugerido, y es ampliamente

aceptado, que la activación constitutiva de PU.1 es la principal causa del

bloqueo de la diferenciación de las células MEL (Moreau-Gachelin, 1994;

Rekhtman y col., 1999; Zhang y col., 2000). Asimismo, se ha constatado

que la sobreexpresión de PU.1 en células MEL impide el desbloqueo de

la diferenciación en respuesta al tratamiento con HMBA (Rao y col., 1997;

Yamada y col., 1997), mientras que el silenciamiento de PU.1, mediante la

Discusión

��

utilización de siRNA, induce un desbloqueo parcial de la diferenciación de

células eritroleucémicas (Atar y Levi, 2005). La concurrencia simultánea de

la inactivación de PU.1 y el bloqueo de la diferenciación que se aprecia en

las líneas resistentes representan por lo tanto un desafío al posible papel

que se le atribuye a PU.1.

Con el fin de determinar las posibles causas del silenciamiento de

PU.1 en las líneas resistentes se consideraron distintas hipótesis. Por un

lado, la inactivación de PU.1 podría estar relacionada con la inhibición de

la expresión de la glicoproteína gp55 del SFFV. Quang y colaboradores

demostraron que la expresión de gp55 es necesaria tanto para el inicio

como para el mantenimiento de la transformación mediada por el SFFV

(Quang y col., 1997). De acuerdo con esto último, se ha postulado que la

actividad transcripcional del promotor de PU.1 depende de la activación del

receptor de eritropoyetina (Epo-R) a través de la gp55 (Afrikanova y col.,

2002; Quang y col., 1997). El análisis de la expresión de la gp55 confirmó

que la glicoproteína del SFFV permanece activa en las células MEL-R, al

igual que ocurre en las células parentales y que, por lo tanto, no puede ser

la causa del silenciamiento del gen Sfpi-1/PU.1. Como alternativa a esta

hipótesis se pensó que la inactivación de PU.1 podría deberse a la pérdida

de la integración del SFFV en el locus Sfpi-1/PU.1 de las células MEL-R. En

varias líneas celulares infectadas con el SFFV el lugar de integración del

provirus ocurre en el 95% de los casos en la zona promotora del gen Sfpi-1/

PU.1 (Moreau-Gachelin, 1994). El análisis mediante Southern blot demostró

que la integración del SFFV ocurre en la misma zona , dentro del locus Sfpi-

1/PU.1, tanto en MEL-DS19 como en MEL-R. Por lo tanto, se descarta la

pérdida de la integración del provirus como posible causa del silenciamiento

de PU.1.

Por último, otra hipótesis plausible intenta relacionar la inactivación

de PU.1 con cambios epigenéticos. Los resultados obtenidos señalan que el

gen Sfpi-1/PU.1 está metilado en las líneas resistentes. El tratamiento con 5-

Aza-2-dC, un inhibidor de la metilación del DNA, induce el desbloqueo de la

respuesta al HMBA. De este resultado se deduce que la metilación del DNA

podría estar involucrada en la resistencia de las células MEL-R a reiniciar el

programa de diferenciación en respuesta al HMBA. De manera consistente

con esta hipótesis, existen evidencias que confirman que el tratamiento

Discusión

��

con drogas antitumorales resulta, en muchos casos, en una demetilación

del DNA con la consecuente reactivación de la expresión génica y la

reversión del fenotipo transformado (Di Croce y col., 2002). Por otra parte,

el tratamiento con inhibidores de las DNA metiltransferasas o las HDACs

provoca, en muchos casos, una reactivación del programa de diferenciación

y la consecuente pérdida de la tumorigenicidad (Lotem y Sachs, 2006).

Debido a que el tratamiento con 5-Aza-2-dC provoca tanto la reactivación

de PU.1 como el desbloqueo de la diferenciación en presencia de HMBA

se especuló con la posibilidad de que la inactivación de PU.1 podría ser la

causa de la resistencia de MEL-R al agente inductor. Sin embargo, tal como

se deduce de los transfectantes de PU.1 (apartado 4.2.4.), la expresión

ectópica de PU.1 es insuficiente para inducir el desbloqueo de la respuesta

al HMBA. Es posible que se trate de una respuesta compleja mediada por

varios rutas simultáneas en donde PU.1 sea sólo uno más de los factores

necesarios para dicha respuesta.

Por otra parte, en un intento por dilucidar el papel de PU.1 en células

eritroleucémicas se analizó la activación de las proteínas STAT. Un estudio

reciente del laboratorio de Sandra Ruscetti del National Cancer Institute

(USA) sugiere que uno de los mecanismos a través de los cuales PU.1

inhibe la diferenciación de las células MEL podría estar relacionado con la

inactivación de las proteínas STAT1/3 (Nishigaki y col., 2006). Según Nishigaki

y colaboradores el bloqueo de la fosforilación de STAT1 en las células MEL

se debe a una activación aberrante de la fosfatasa hematopoyética Shp-1,

inducida a su vez por una expresión inapropiada de PU.1. De esta manera, la

inhibición de la actividad de las proteínas STAT1/3 en las células MEL estaría

directamente relacionada con la activación constitutiva de PU.1 (Nishigaki

y col., 2006). De manera contraria a lo esperado, nuestros experimentos

confirman que la fosforilación de STAT1 está bloqueada en MEL-R, a pesar

del silenciamiento del gen Sfpi-1/PU.1. Por otra parte, se observó que el nivel

de expresión de Shp-1 en MEL-R es similar al de MEL-DS19. Por lo tanto,

si bien la fosfatasa Shp-1 podría ser la principal responsable del bloqueo de

STAT1, su activación no dependería de PU.1. Nuestros resultados no aclaran,

sin embargo, la implicación de STAT1 en el bloqueo de la diferenciación en

respuesta al HMBA.

Discusión

��

5.4.LainhibicióndelaproliferacióncelularylareactivacióndelarespuestaalHMBA

El cese de la división celular es un requisito indispensable, aunque

no suficiente, para la diferenciación eritropoyética. A lo largo del proceso

de diferenciación de las células MEL hacia el linaje eritroide se produce

una inactivación de genes relacionados con estadios proliferativos, como

c-myc y c-myb, junto con una activación de reguladores negativos de la

proliferación celular, como p21, p27 y mad1 (Dmitrovsky y col., 1986; Hsieh

y col., 2000; Lachman y Skoultchi, 1984; Larsson y col., 1994; Matushansky

y col., 2000; Smith y Prochownik, 1992). Nuestros resultados demuestran

que el patrón de expresión de estos genes en las líneas resistentes es

similar al observado en un cultivo no inducido de células MEL-DS19. Existen

evidencias que indican que la activación inoportuna de factores implicados

en la progresión del ciclo celular, como c-Myb, c-Myc o Cdk6, bloquea la

diferenciación de las células MEL en respuesta a los agentes inductores

(Chen y col., 2002; Dmitrovsky y col., 1986; Matushansky y col., 2003). Por

el contrario, la sobreexpresión de inhibidores de la proliferación celular como

Mad1, antagonista de c-Myc, es capaz de revertir el bloqueo y reactivar el

programa de diferenciación (Cultraro y col., 1997a; McArthur y col., 2002).

Cultraro y colaboradores comprobaron que la sobreexpresión de Mad1 en

un transfectante estable de células MEL que contiene integradas 36 copias

del gen c-myc humano resulta en una reactivación de la diferenciación en

respuesta al HMBA (Cultraro y col., 1997a). Éstos, y otros autores, postulan

que el desbloqueo de la diferenciación mediada por Mad1 estaría relacionado

con la formación de heterodímeros Mad1:Max a expensas del complejo Myc:

Max. En el mismo trabajo se comprobó que los mutantes de Mad1 que no

interaccionan con Max y mSin3 son incapaces de inducir el desbloqueo de

la diferenciación. Estos resultados confirman la importancia del complejo

represor Max-Mad1-mSin3 en la transición proliferación-diferenciación.

Los resultados obtenidos en los apartados 4.3.1. y 4.3.2. ponen

de manifiesto que tanto la inhibición de la expresión de c-Myc como la

expresión ectópica de Mad1 provocan un incremento en el porcentaje de

células diferenciadas en MEL-R, en presencia de HMBA. En el caso de los

transfectantes de Mad1 que expresan altos niveles de la proteína de fusión

Discusión

��

GFP-Mad (clones 8, 19 y 22) el porcentaje de células hemoglobinizadas es

superior al 80%. El análisis de la distribución de las fases del ciclo celular

confirmó que el desbloqueo de la diferenciación, tal como ocurre en las

células MEL-DS19 tratadas con HMBA, va acompañado de una acumulación

de las células en la fase G1 del ciclo celular (Kiyokawa y col., 1993; Vanegas

y col., 2003). En los transfectanes estables de c-Myc, el incremento, aunque

significativo, del porcentaje de células hemoglobinizadas es inferior al

observado en los transfectantes de Mad1. El silenciamiento parcial de c-myc

mediado por el RNA interferente podría ser la causa de la diferencia en el

porcentaje de células diferenciadas entre los transfectantes de c-Myc y los

de Mad1. Una inhibición más eficiente de c-myc compromete la viabilidad

celular, tal como se observó en el caso de algunos clones (clones 6, 7, 10,

13 y 14). En conjunto, nuestros resultados demuestran que, tal como se

representa en el esquema de la Figura 50a, la inhibición de la proliferación

celular, a través de modificaciones en la expresión de los componentes de la

red Myc-Max-Mad, induce el desbloqueo de la diferenciación de las células

MEL-R en respuesta al HMBA. Se podría deducir entonces que la resistencia

de MEL-R a los inductores de la diferenciación podría estar causada, en

parte, por un fallo en la parada de la proliferación celular.

Figura50.DesbloqueodeladiferenciacióneritroideencélulasMEL-R. La inhibición de la proliferación celular, ya sea mediante la expression ectópica de Mad1 o la inhibición de la expresion de c-Myc, provoca un desbloqueo de la diferenciación de MEL-R en respuesta al HMBA (a), mientras que la activación de GATA-1, un factor de transcripción indispensable para la diferenciación eritroide, es suficiente para inducir el desbloqueo espontáneo de la diferenciación de las células MEL-R (b).

Inhibición de la proliferación celular

Activación de genes específicos del linaje eritroide

c-MycMad1

HMBA

GATA-1

a

b

Discusión

��

5.5. GATA-1 y el desbloqueo de la diferenciación de las célulasMEL-R

La diferenciación de las células MEL requiere, además de la salida

del ciclo celular, de reguladores transcripcionales específicos que activen la

expresión de marcadores del linaje eritroide. La sobreexpresión del factor de

transcripción GATA-1 en células MEL induce el desbloqueo espontáneo de la

diferenciación eritroide (Choe y col., 2003). De manera consistente con estos

resultados, en la presente tesis doctoral se comprobó que la sobreexpresión

de GATA-1 provoca el desbloqueo de la diferenciación también en las

células MEL-R. Sin embargo, a diferencia de los observado en el caso de la

diferenciación inducida por la expresión ectópica de Mad1 o la interferencia

de Myc, que dependen de la presencia de HMBA, la sobreexpresión de

GATA-1 por sí sola es suficiente para inducir la diferenciación de las células

MEL-R (ver esquema de la Figura 50b).

La capacidad de GATA-1 para provocar la diferenciación espontánea

de las células MEL-R podría estar relacionada con dos requisitos

indispensables para la diferenciación: la parada de la proliferación celular

y la adquisición de características específicas del linaje eritroide. GATA-1

lleva a cabo una doble función: actúa como un inhibidor de la proliferación

celular reprimiendo la expresión de c-myc (Rylski y col., 2003) y al mismo

tiempo activa la expresión de genes específicos del linaje eritroide, como

las globinas o las enzimas involucradas en la síntesis de los grupos heme

(ALAS-S, ALA-D, PBG-D). Rodríguez y colaboradores, utilizando un sistema

de marcaje con biotina seguido de una purificación con streptavidina,

demostraron in vivo en células eritroides que GATA-1 interacciona con

factores de transcripción hematopoyéticos y proteínas remodeladoras de

la estructura de la cromatina. Estos complejos están relacionados con la

represión de genes característicos de estadios inmaduros (GATA-1/FOG-

1-MeCP1), la parada de la proliferación (GATA-1/Gfi-1B) y la activación de

genes específicos del linaje eritroide (GATA-1/FOG-1, GATA-1/Lbd1, GATA-

1/TAL-1) (Rodriguez y col., 2005). Por lo tanto, GATA-1, a través de sus

diferentes interacciones, actúa simultáneamente deteniendo proliferación y

activando diferenciación eritroide, lo cual explica que su sola sobreexpresión

provoque la diferenciación de células MEL-DS19 y MEL-R.

Discusión

�00

5.6.AntagonismoentreGATA-1yPU.1

GATA-1 y PU.1 son factores de transcripción específicos que regulan

la diferenciación hacia los linajes eritroide y mieloide, respectivamente.

La diferenciación hacia un linaje u otro depende del balance entre ambas

proteínas (ver esquema Figura 8). El antagonismo entre GATA-1 y PU.1

reside en la interacción física del dominio de “dedos de zinc” del extremo C-

terminal de GATA-1 y el dominio “ets” de PU.1 (Figura 8) (Liew y col., 2006;

Rekhtman y col., 1999; Zhang y col., 1999). En el linaje mieloide, GATA-

1 inhibe la función de PU.1 bloqueando la interacción con c-Jun (Figura

11). En el caso del linaje eritroide, se han postulado dos mecanismos que

podrían ser complementarios. El grupo del Skoultchi, del Albert Einstein

College of Medicine (USA), sostiene que la inhibición de GATA-1 mediada

por PU.1 depende del reclutamiento de la proteína del retinoblastoma (Rb)

que, junto con otras proteínas represoras como HP1α y Suv39H, provoca

un silenciamiento de los genes diana de GATA-1 (ver esquema Figura 12)

(Rekhtman y col., 2003; Stopka y col., 2005). Como alternativa, los trabajos

del grupo de Blobel, del Children’s Hospital of Philadelphia (USA), señalan

que PU.1 se une a GATA-1 e inhibe la acetilación, mediada por CBP (Creb-

Binding Protein), de dos motivos ricos en lisinas altamente conservados que

se localizan cerca de los dominios de “dedo de zinc” de los extremos N y

C-terminal de la proteína (Hong y col., 2002). Existen suficientes evidencias

tanto in vitro como in vivo que corroboran que la acetilación de GATA-1

incrementa la actividad transactivadora y está relacionada con su habilidad

para inducir la diferenciación eritroide (Boyes y col., 1998; Choi y col.,

2006; Hung y col., 1999). Se ha descrito que la mutación de cualquiera de

estos motivos de acetilación inhibe parcialmente la capacidad de GATA-

1 para inducir diferenciación de precursores eritroides mientras que la

eliminación simultánea de ambos la anula totalmente (Hung y col., 1999).

Independientemente del modelo planteado, en ambos casos se acuerda que

PU.1 actúa como un inhibidor de la actividad de GATA-1 en el linaje eritroide

(Rekhtman y col., 2003; Rekhtman y col., 1999; Stopka y col., 2005; Zhang

y col., 1999; Zhang y col., 2000).

Discusión

�0�

Los resultados obtenidos en este trabajo corroboran que GATA-1 se

expresa constitutivamente en MEL-DS19 y demuestran que lo mismo ocurre

en las líneas resistentes. La sobreexpresión de GATA-1, de forma similar

a lo observado en MEL-DS19 (Choe y col., 2003), induce la diferenciación

espontánea de la células MEL-R. En MEL-R, sin embargo, a diferencia de

lo que ocurre en las células progenitoras MEL-DS19, el gen que codifica

para PU.1 está silenciado. Los experimentos de coinmunoprecipitación

de proteínas endógenas confirmaron que PU.1 interacciona con GATA-1

en MEL-DS19 mientras que, como era de esperar, no se observó ninguna

interacción en las células MEL-R. Si, como se postula, la activación de PU.1

es la principal causa del bloqueo de la actividad de GATA-1 en MEL-DS19,

y MEL-R carece de PU.1, debería existir otro factor (o factores) responsable

de la inhibición de GATA-1. En este sentido, un estudio reciente a nivel

molecular dejó en evidencia que la interacción entre PU.1 y GATA-1 es muy

débil (Liew y col., 2006). En base a esos resultados los autores proponen

un posible mecanismo que permitiría cambios rápidos en la regulación de la

composición de los complejos de GATA-1 con otras proteínas.

5.7.CausasdelbloqueodelaactividaddeGATA-1enlascélulasMEL-R

Tal como se discute en el apartado anterior los resultados del trabajo

sugieren que en las líneas resistentes otro factor, distinto de PU.1, es el

responsable del bloqueo de la actividad de GATA-1. Entre las proteínas que

se unen a GATA-1, y son esenciales para su actividad activadora o represora

de la transcripción, destacan Gfi-1b y FOG-1. El factor de transcripción Gfi-

1b se une a GATA-1 para suprimir la expresión de genes involucrados en

proliferación celular, tales como c-myb y c-myc, en estadios tempranos de

la diferenciación (Rodriguez y col., 2005). Por otra parte, los mutantes de

GATA-1 que no pueden interactuar con FOG-1 son incapaces de inducir la

diferenciación de progenitores eritroides que no expresan GATA-1 (Crispino y

col., 1999). Sin emabrago, la posibilidad de que FOG-1 y/o Gfi-1b fueran

responsables del bloqueo de la actividad de GATA-1 quedó descartada en base

a los análisis de expresión mediante RT-PCR semicuantitativa. En ninguno

Discusión

�0�

de los casos se observaron cambios significativos entre MEL-DS19 y MEL-R.

Paralelamente, se analizó la expresión de GATA-2, un importante regulador

de la hematopoyesis cuya inactivación es crucial para la diferenciación

eritropoyética. GATA-2 es capaz de unirse a las dianas de GATA-1 y reprimir

su expresión, inhibiendo de esta manera la diferenciación eritroide (Grass y

col., 2003). Los resultados revelaron que el gen que codifica para GATA-2

está inactivo en MEL-R. Por lo tanto, GATA-2 no podría estar involucrado en

el bloqueo de la actividad de GATA-1.

Fli-1 es otro de los factores de transcripción del linaje hematopoyético

que posee el potencial de inhibir la diferenciación eritroide. Starck y

colaboradores demostraron que Fli-1 interacciona con GATA-1 en células

MEL indiferenciadas (Starck y col., 2003). A diferencia de lo que ocurre en

las células MEL-DS19 tratadas con HMBA, los niveles del mRNA de Fli-1 se

mantienen altos en las células MEL-R. La presencia activa de Fli-1 en MEL-R

induce a pensar en una alternativa a PU.1 capaz de interaccionar con GATA-1

y bloquear la diferenciación de MEL-R. El análisis a nivel de proteínas reveló

la existencia de una relación inversa en la expresión de las dos isoformas de

Fli-1 en MEL-DS19 y MEL-R. Estas isoformas se originan mediante el uso

de codones de iniciación de la traducción alternativos, el AUG+1 da lugar

a la isoforma de 51 KDa mientras que el AUG+100, que se encuentra en el

mismo marco de lectura que el primero, da lugar a la isoforma de 48 KDa

(Sarrazin y col., 2000). No se descarta la posibilidad de que este cambio en

la expresión relativa de ambas isoformas esté relacionado con el bloqueo

de la respuesta a los inductores en las líneas resistentes. Experimentos de

sobreexpresión en células MEL revelaron que tanto la isoforma de 48 KDa

como la de 51 KDa inhiben la diferenciación en respuesta al HMBA (Sarrazin

y col., 2000). Se ha especulado con la posibilidad de que ambas isoformas

estén involucradas en la regulación de la expresión de Fli-1 a nivel post-

transcripcional o traduccional (Sarrazin y col., 2000).

Los experimentos de coinmunoprecipitación de proteínas endógenas

demostraron que Fli-1 interacciona con GATA-1 tanto en las células MEL-R

como en las MEL-DS19. Fli-1, por lo tanto, es un candidato potencial para

sustituir a PU.1 y bloquear la actividad de GATA-1 en las líneas resistentes.

No se descarta incluso la posibilidad de que Fli-1 coopere con PU.1 para

reprimir a GATA-1 en MEL-DS19. De manera consistente con esta hipótesis,

Discusión

�0�

Starck y colaboradores demostraron que Fli-1 es una diana transcripcional de

PU.1 (Starck y col., 1999). Los autores del trabajo sugieren que la capacidad

de PU.1 para inhibir la diferenciación eritroide podría depender, al menos en

parte, de la activación de Fli-1.

Tanto Fli-1 como PU.1 han sido identificados como oncogenes cuya

activación provoca la transformación de progenitores eritroides (Athanasiou y

col., 2000; Ben-David y col., 1991; Moreau-Gachelin y col., 1996; Pereira

y col., 1999; Tamir y col., 1999). Por otro lado, se ha demostrado que la

sobreexpresión de Fli-1, al igual que la de PU.1, inhibe la diferenciación de

las células MEL en respuesta a los agentes inductores (Rao y col., 1997;

Starck y col., 1999; Yamada y col., 1997). En ambos casos la interacción con

el dominio de unión a DNA de GATA-1 se produce a través de este dominio

(Eisbacher y col., 2003; Rekhtman y col., 1999; Starck y col., 2003; Zhang

y col., 1999) (Figura 8). Tanto en el caso de PU.1 como en el de Fli-1, la

interacción con GATA-1 no resulta en una inhibición de la unión GATA-1-

DNA (Eisbacher y col., 2003; Rekhtman y col., 1999). Hong y colaboradores

observaron que PU.1 inhibe la acetilación de GATA-1 en células MEL (Hong

y col., 2002). En un estudio posterior, Liew y colaboradores aportaron una

explicación a nivel molecular y propusieron que el dominio ets de PU.1

bloquea el acceso de CBP a los sitios de acetilación de GATA-1 (Liew y

col., 2006). Esto mismo podría ocurrir en el caso del dominio ets de Fli-1,

lo cual resultaría en un bloqueo de la capacidad de GATA-1 para activar la

diferenciación eritroide (Figura 51).

Figura51.InhibicióndelaactividadtranscripcionaldeGATA-1mediadaporFli-1encélulasMEL-R.Modelo para explicar la inhibición de la actividad de GATA-1 en las líneas resistentes. a) En células MEL tratadas con HMBA la interacción CBP/GATA-1, a través de los dominios de “dedo de zinc”, provoca la acetilación de GATA-1 estimulando se actividad transcripcional. b) En células MEL-R la interacción Fli-1/GATA-1, a través de los dominios de “dedo de zinc”, podría, entre otras cosas, inhibir la union de CBP bloqueando la reactivación de los genes diana de GATA-1.

a b

GATA-1

CBP

GATA-1

Fli-1

MEL + HMBA MEL-R + HMBA(T/A)GATA(A/G) (T/A)GATA(A/G)

Discusión

�0�

Estudios preliminares en células eritroleucémicas han puesto de

manifiesto que, además de PU.1, otros miembros de la familiaEts podrían

inhibir el proceso de diferenciación interfiriendo con la acetilación de factores

nucleares involucrados en la regulación del balance entre proliferación

celular y maduración (Hong y col., 2002).

La interacción entre Fli-1 y GATA-1 no siempre tiene un efecto

antagónico. Se ha constatado que en el linaje megacariocítico Fli-1 unido

a GATA-1 activa la expresión de genes linaje-específicos (Eisbacher y col.,

2003). Esto no elimina, sin embargo, la posibilidad de que en un contexto

distinto, en este caso en el linaje eritroide, Fli-1 actúe como un inhibidor de

GATA-1. Se podría pensar en la posibilidad, dada la cercanía entre ambos

linajes, de que Fli-1 actúe como un regulador de la actividad de GATA-1

inhibiendo su capacidad para activar el programa de diferenciación eritroide

en favor de la activación de programa megacariocítico.

En conjunto, los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral

apoyan la hipótesis de que la activación de la diferenciación eritropoyética

depende de una compleja red de factores, entre los que se encuentran

factores de transcripción específicos y factores constitutivos, que funcionan

en un delicado equilibrio para activar o reprimir el programa de diferenciación

eritroide (Figura 52). El papel determinante de PU.1 como principal ejecutor

del bloqueo de la diferenciación en células eritroleucémicas queda en parte

cuestionado. Se añade, sin embargo, un nuevo elemento a la compleja red

de factores que regulan la eritropoyesis, Fli-1, cuya habilidad para inhibir la

diferenciación eritroide podría deberse, entre otras cosas, a su capacidad

para unirse y reprimir a GATA-1.

Para confirmar la hipótesis de Fli-1 como posible antagonista de

GATA-1 en células eritroleucémicas se debería analizar su capacidad para

inhibir la inducción de la diferenciación de MEL-R mediada por GATA-1.

En el caso de que Fli-1 sea capaz de inhibir la actividad de GATA-1, sería

interesante estudiar el mecanismo mediante el cual se produce el bloqueo.

En ese sentido, tal como se ha sugerido, se podría analizar el efecto de Fli-1

sobre la acetilación de GATA-1 a través de la acetiltransferasa CBP (Creb-

Binding Protein).

Discusión

�0�

PU.1

Fli-1Rb

Shp-1

STAT1

JAK2

EPO-R

EKLFCBP

Bcl-X

GATA-2

Gfi-1BFOG

ß-globina

c-Mycgp55

Bcl-2

GATA-1

Mad1

Figura52.Reddefactoresimplicadosenladiferenciacióndecélulaseritroleucémicas. En verde se indican los factores de transcripción GATA-1 y PU.1, en azul las proteínas que constituyen diana directas o que interaccionan directamente con ambos reguladores transcripcionales. En rojo se representan las proteínas que interaccionan con GATA-1 y PU.1 de manera indirecta y que están involucradas en el bloqueo/desbloqueo de la diferenciación eritroide. Las flechas en curva representan una autoregulación transcripcional, las flechas con sentido único indican una activación transcripcional, las líneas terminadas en una barra indican una represión transcripcional, las flechas de dos sentidos indican una interacción proteína-proteína, las líneas dobles indican un antagonismo y las líneas dobles discontinuas en color rojo representan un probable antagonismo.

6. CONCLUSIONES

Conclusiones

�0�

1- Se han establecido líneas celulares eritroleucémicas derivadas

de MEL-DS19 resistentes a la acción de los agentes inductores de

la diferenciación celular. A diferencia de la línea parental, las células

resistentes son capaces de proliferar indefinidamente y permanecer en

un estadio indiferenciado en presencia de los agentes inductores de la

diferenciación.

2- Se ha comprobado que la resistencia al HMBA no depende de la

presencia continua del inductor sino de factores intrínsecos de las células

resistentes que inhiben la reactivación del programa de diferenciación

celular.

3- Se ha demostrado que, a diferencia de lo que ocurre en la línea

progenitora, el gen que codifica para el factor de transcripción PU.1

está silenciado en las líneas resistentes. La inactivación de PU.1 es,

sin embargo, insuficiente para inducir el desbloqueo de la diferenciación

celular.

4- Se ha comprobado que el tratamiento con agentes demetilantes

del DNA induce la reactivación de PU.1. Este resultado sugiere que la

inhibición de la expresión de PU.1 en las líneas resistentes podría estar

relacionada con cambios en la estructura de la cromatina.

5- Se ha constatado que la activación de la fosfatasa hematopoiética

Shp-1, involucrada en la inhibición de la fosforilación de STAT1, es

independiente de PU.1.

6- Se ha demostrado que las líneas resistentes son capaces de reiniciar

el programa de diferenciación en respuesta al HMBA cuado se induce la

parada del ciclo celular. Tanto la inactivación de c-Myc como la expresión

ectópica de Mad1 provocan una inducción de la diferenciación hacia el

linaje eritroide en presencia del inductor.

Conclusiones

�0�

7- Se ha demostrado que la sobreexpresión de GATA-1 induce la

diferenciación de las líneas resistentes. A diferencia de lo observado con

c-Myc y Mad1, se ha comprobado que la sobreexpresión de GATA-1 es

suficiente para inducir el desbloqueo de la diferenciación hacia el linaje

eritroide de las líneas resistentes.

8- Se han encontrado evidencias que señalan al factor de transcripción

Fli-1 como un posible inhibidor, alternativo a PU.1, de la capacidad de

GATA-1 para inducir la diferenciación hacia el linaje eritroide.

7. BIBLIOGRAFÍA

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Yamashita, T., Wakao, H., Miyajima, A. y Asano, S. (1998). Differentiation inducers modulate cytokine signaling pathways in a murine erythroleukemia cell line. Cancer Res 58, 556-561.

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Yomogida, K., Ohtani, H., Harigae, H., Ito, E., Nishimune, Y., Engel, J. D. y Yamamoto, M. (1994). Developmental stage- and spermatogenic cycle-specific expression of transcription factor GATA-1 in mouse Sertoli cells. Development 120, 1759-1766.

Yoshida, M., Kijima, M., Akita, M. y Beppu, T. (1990). Potent and specific inhibition of mammalian histone deacetylase both in vivo and in vitro by trichostatin A. J Biol Chem 265, 17174-17179.

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Zhang, J., Randall, M. S., Loyd, M. R., Li, W., Schweers, R. L., Persons, D. A., Rehg, J. E., Noguchi, C. T., Ihle, J. N. y Ney, P. A. (2006). Role of erythropoietin receptor signaling in Friend virus-induced erythroblastosis and polycythemia. Blood 107, 73-78.

Zhang, P., Behre, G., Pan, J., Iwama, A., Wara-Aswapati, N., Radomska, H. S., Auron, P. E., Tenen, D. G. y Sun, Z. (1999). Negative cross-talk between hematopoietic regulators: GATA proteins repress PU.1. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 8705-8710.

Zhang, P., Zhang, X., Iwama, A., Yu, C., Smith, K. A., Mueller, B. U., Narravula, S., Torbett, B. E., Orkin, S. H. y Tenen, D. G. (2000). PU.1 inhibits GATA-1 function and erythroid differentiation by blocking GATA-1 DNA binding. Blood 96, 2641-2648.

Zhu, L. y Skoultchi, A. I. (2001). Coordinating cell proliferation and differentiation. Curr Opin Genet Dev 11, 91-97.

Zon, L. I., Yamaguchi, Y., Yee, K., Albee, E. A., Kimura, A., Bennett, J. C., Orkin, S. H. y Ackerman, S. J. (1993). Expression of mRNA for the GATA-binding proteins in human eosinophils and basophils: potential role in gene transcription. Blood 81, 3234-3241.

8. ANEXO

Anexo

���

Publicacionesoriginalesderivadasdeestatesisdoctoral:

- García-Sacristán, A, Fernández-Nestosa,MJ, Hernández, P, Schvartzman,

JB y Krimer, DB (2005). Protein kinase clk/STY is differentially regulated

during erythroleukemia cell differentiation: a bias toward the skipped splice

variant characterizes postcommitment stages. Cell Research 15 (7): 495-

503.

- Fernández-Nestosa, MJ, Hernández, P, Schvartzman, JB y Krimer, DB

(2007). PU.1 is dispensable to block erytrhoid differentiation in Friend

erythroleukemia cells. Leukemia Res doi:10.1016/j.leukres (in press).

- Fernández-Nestosa, MJ, Hernández, P, Schvartzman, JB y Krimer, DB

(2007). Fli-1 interacts and represses GATA-1 to block MEL resistant cells

erythroid differentiation. Manuscrito.