UNIVERSIDAD AUTOMOMA -KANA
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casaabiertaaltiempo UNIVERSIDAD AUTOMOMA -KANA DNISIO# bE CIENCIA8 II#)LOQK=AS Y DE U $ALUD SERVICIO SOCIAL REF: SS.CBS.196.93 LIC. JULIO DE LARA ISASSI Coord. de Sistemas Escolares P r e s e n t e . t L' . I .. . i i ~ja,:, '' < j Por medio de la presente se hace constar que el alumno cuyos datos se describen a continuación, concluyó su - Servicio Social: NOMBRE: MARIA ELENA SANCHEZ CONTRERAS MATRICULA: 86346574 I i LICENCIATURA: BIOLOGIA EXPERIMENTAL PROYECTO: CARACTERIZACION DE LAS PROTEASAS DE Anopheles albimanus (* Se extiende la presente para los fines que al intere- sacio convengan a los veintitres dias del mes de junio de mil novecientos noventa y tres. ATENTAMENTE CASA ABIERTA AL TIEMPO" M. f-d5zi2i: N C. ROSAURA GRE DIRECTORA *LPC UNIDAD IZlAPALAPA kv Mic;1oacan y La Purísima lztapalapa 09340. MBxico, D. F. A.P. 55-535 Fax: (51612-80-83 Tels. 724-4881 y 85
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casaabiertaaltiempo
UNIVERSIDAD AUTOMOMA -KANA DNISIO# bE CIENCIA8 II#)LOQK=AS Y DE U $ALUD SERVICIO SOCIAL
REF : SS.CBS.196.93
LIC. JULIO DE L A R A ISASSI Coord. de Sistemas Escolares P r e s e n t e .
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L' . I
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Por medio de la presente s e hace constar que e l alumno cuyos datos s e describen a continuación, concluyó su - Servicio Social:
NOMBRE: MARIA ELENA SANCHEZ CONTRERAS
MATRICULA: 8 6 3 4 6 5 7 4
I
i LICENCIATURA: BIOLOGIA EXPERIMENTAL
PROYECTO: CARACTERIZACION DE LAS PROTEASAS DE Anopheles albimanus (*
Se extiende l a presente para l o s fines q u e a l intere- sacio convengan a los veintitres dias del mes de junio de mil novecientos noventa y tres.
A T E N T A M E N T E CASA ABIERTA AL TIEMPO"
M. f-d5zi2i: N C. ROSAURA GRE DIRECTORA
* L P C
UNIDAD IZlAPALAPA
kv Mic;1oacan y La Purísima lztapalapa 09340. MBxico, D. F. A.P. 55-535 Fax: (51612-80-83 Tels. 724-4881 y 85
A
INDICE
Indice de figuras ................................ i Indice de tablas ................................ i i Agradecimientos ................................ i i i
Resumen ................................ 1
Introduccidn
Generalidades .................................. 3
Plasmodium ..................................... 6
. Ciclo de vida del plasmodium ..................... 7
. Desarrollo extraeritrocitico ..................... 7
. Desarrollo eritrocitico .......................... 8
mosquito .......................................... 9
su desarrollo dentro del mosquito . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
. Desarrollo del pardsito en el estbmago del
. Limitaciones encontradas por el parisito durante
. Encapsulacidn humoral ............................. 11
Ciclo de vida de los mosquitos ...................... 14
Anatomia y fisiologia del estdmago del mosquito . . Organizacidn general del aparato digestivo en
insectos ......................................... 17 . Membrana peritrbfica .............................. 18 . Proceso digestivo en dipteros ..................... 19
en mosquitos ...................................... 20 . Modelo propuesto para la digestidn en mosquitos . . . 22 . Proceso de formacidn de la membrana peritrdfica
Interaccibn de las enzimas proteoliticas del est.&mago de los rnosqui tos con e 1 parasi to Plasmodium ......................................... 25
. Actividad enzimatica reportada en a 1 gunas especies de mosquitos ............................ 25
. Serin proteasas .................................. 25
. Tripsina ......................................... 26
. Sintesis y secrecidn d e tripsinas . . . . . . . . . . . . . . . . 28
. Aminopeptidasas y quimiotripsina . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
Justificaci6n ..................................... 31
Objetivos ......................................... 33
Materiales y metodos .............................. -0btencidn de mosquitos ........................... -Preparacidn de tejidos ........................... -Determinacifin de la cantidad de protefna . . . . . . . . . -Electrofbresis en geles de poliacrilamida-Dodecil Sulfato de Sodio (SDS). copolimerizado con substrato ....................................
-Geles de poliacrilamida-SDS copolimerizados con gelatina (SDS.PAGE.G) ...........................
-Geles de poliacrilamida-SDS copolimerizados con caseina (SDS.PAGE.C) .............................
-Geles de poliacrilamida-SDS copolimerizados con hemoglobina (SDS.PAGE.H) .........................
-Ensayo para actividad de proteasas en presencia de inhibidores de proteasas y distintos pHs . . . . . . -Anblisis fluorografico ........................... Resultados ........................................ -Deteccidn de la actividad proteolitica en distintas partes del mosquito .............................. -Analisis comparativo de la actividad proteolitica en machos y hembras .............................. -1dentificacidn del tipo de proteasa . . . . . . . . . . . . . . -Cin&tica de aparicidn de las proteasas inducidas por una alimentacidn con sangre . . . . . . . . . . . . . . . . . .
-1dentificacidn de proteasas tipo "tripsina" . . . . . . Discusih . -Caracterizaci6n de las proteasas presentes en An . albimanus .................................... -Relacidn de la actividad proteolitica con el esthago del mosquito ............................
-Tipos de proteasas presentes en estdmago de . albimanus ........................................ -1nducibilidad de proteasas por una alimentacidn con sangre ...........................................
Conclusidn ......................................... Perspectivas ....................................... Bibliograffa .......................................
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34 34 35
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54 60
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64
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69
7 0
J1
INDICE DE FIGURAS
Fig 1. Distribucidn mundial de la malaria en la decada de los ochentas... .................... 4
Fig 2. Ciclo de vida del Plasmodium . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Fig 3. Ciclo de vida de la hembra Anopheles . . . . . . . . . 16 Fig 4. Deteccidn de la actividad de proteasas
en estdmago y glandula saliva1 . . . . . . . . . . . . . . 44 Fig 5. Coincubacibn de gldndulas salivales y
estdmagos de A n . albimanus . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Fig 6. Deteccidn de la actividad de proteasas
en estdmagos disectados y mosquitos
hembra completos ............................ 46
Fig 7. Deteccidn de la actividad proteolitica
en tdrax, abdomen, moscos completos y
estdmagos disectados de m. albimanus . . . . . . . 47
Fig 8. Comparacidn de la actividad proteolitica
en moscos machos y hembras . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
Fig 9. Identificacidn del tipo de proteasa . . . . . . . . . 53
Fig 10. Cinetica de aparicidn de proteasas,
utilizando como substrato gelatina . . . . . . . . . 57
Fig 11. Cinstica de aparicidn de proteasas,
utilizando como substrato caseina . . . . . . . . . . 58
Fig 12. Cinbtica de aparicidn de proteasas,
utilizando como subst.rato hemoglobina . . . . . . 59
F i g 13. Identificacidn de las proteasas tipo
?? tripsina" 61 ..................................
i .. _L.
INDICE DE TABLAS
Tabla no. I Efecto de los inhibidores utilizados
sobre las proteasas del estdmago de
An. albimanus. ........................ 52
Tabla no. I 1 Proteasas encontradas en cada
substrato e inducibilidad en el mismo. . . 56
AGRADECIMIENTOS.
A mis padres.
Por el esfuerzo que han realizado
siempre en busca de la superacibn
de la familia y por el amor que
me han brindado.
A mis hermanos.
Por el apoyo, cariño y comprensibn
que me han brindado; especialmente
a mi hermana Angeles.
A mis sobrinos.
Porque con su inocencia crean bellos
y gratos momentos, que forman parte
de mi vida.
A la M. en C. Angeles Aguilar.
Porque a. sido parte importante, en
mi formacidn profesional; y por la
comprensidn y guia brindadas.
A l M. en C. Hector Serrano
P o r el intert2.s que mostr6 siempre
en este trabajo, proporcionando
sugerencias y estfmulos para la
realizacidn de1 mismo.
A l D. en C. Fidel de la Cruz Hernandez H.
Porque ha sido para mi, no solo un
maestro, sino tambi&n un amigo, que
al confiar en mi me ha ayudado a salir
adelante; convirtiendose en una parte
muy importante de m i formacidn
profesional.
CARACTERIZACION DE LAS PROTEASAS DE An. a 1 b i manus
RESUMEN
En este trabajo se describen las especies proteoliticas
presentes en los estdmagos de adultos machos y hembras de An.
albimanus. Para el caso de las hembras se describen los
patrones de enzimas antes y despubs de una alimentacibn con
sangre. Para cumplir este objetivo se realizaron zimogramas
de diferentes tejidos de los mosquitos usando tres diferentes
substratos: gelatina, caseina y hemoglobina, demostrando las
diferencias en la actividad de las enzimas. Las proteasas se
detectaron principalmente en los estbmagos, ya que las
gldndulas salivales aisladas no presentaron actividad y
cuando se usaron los mosquit.os enteros o tdrax aislados, no
se modificd el patrdn observado en los zimogramas con
respecto al de los estdmagos disecado. El peso molecular de
las proteasas observadas estuvo en un rango de mds de 200 a.
25 kDa. Para identificar las clases de proteasas presentes en
los estbmagos, se usaron inhibidores de proteasas y s e
observd que la mayor parte de las actividades son serina o
cisteina proteasas. En estudios cin&t.icos de la aparicidn de
proteasas en el estbmago se observb que despuirs de una
alimentacibn con sangre, las especies proteoliticas presentes
en los estdmagos cambiaron despues de 5h, incrementandose la
actividad de varias especies proteoliticas. Estas nuevas
bandas fueron : >200, 170, 142, 60, 55 y 25 kDa con actividad
de gelatinasa; 170, 5 0 , 40 Y 25 con actividad de
hernoglobinasa y 147, 50, 42 Y 31 kDa con actividad de
caseinasa. El marcaje radioactivo de las serina pr0t.easa.s
usando el inhibidor DFP tritiado, permitid identificar en
una cingtica de aparicidn de proteasas lo siguient.e: que en
contraste con Aedes, ya existen en los estdrnagos de hembras
no alimentadas, "tripsinas" con pesos moleculares de 30 kDa,
mantenigndose su actividad hasta 48 horas postaliment.acibn
(hp). A las 12 hp aparece una "tripsina tardia" de 25 kDa, Y
a las 12 hp tarnbibn se observa inducibilidad en la regiones
de z 200 y 40 kDa.
INTRODUCCION
GENERALIDADES
El est.udio de los mosquitos es importante porque estos
pueden ser vectores de par6sitos que causan enfermedades en
el hombre, entre las que se encuentran padecimientos causados
por protozoarios, como paludismo o malaria y leishmaniasis:
afecciones producidas por virus como: dengue, fiebre amarilla
y la encefalitis japonesa entre otras; o los padecimient.0~
producidos por gusanos conocidos como filarias, causantes de
la elefantiasis.
Una de estas enfermedades, el paludismo es, segitn reportes
de la organitacidn mundial de la salud una de las
enfermedades infecciosas con mayor distrihucidn mundial
(aproximadamente el 40% de la poblacidn mundial esta en
riesgo de infeccidnl. ( W H O , 1991 ) . En la figura nQmero 1 se
puede observar la distribucidn de la malaria en el mundo
durante la decada de los ochentas.
Durante muchos asos se han realizado campa.ñas para tratar
de controlar la dispersidn del paludismo. Sin emhargo, el
control de la propagacidn de la malaria s e ha visto afectado
por varias razones: El incremento en la migracidn de gente
que vive en Areas donde la malaria prevalece y que s e
establece en Areas no endemicas, la aparicidn de mosquit.os
resistentes a los insecticidas y de parAsitos re5istent.e~ a
los fdrmacos antipalctdicos. (Martinez-Palomo, 1990)
Fig l. Distribuci6n mundial de la malaria en la dgcada
de los ochenta.
En el pasado muchas partes de Europa y 0tra.s regiones
templadas eran propensas a epidemias de malaria dura.nte el
verano. Actualmente la erradicacidn de la malaria se ha.
logrado en regiones templadas pero el problema continua en
los trbpicos. Knell A . J. (1991)
Arear donde la
transmisión ocurre
La morbilidad del paludismo en Mexico entre los a ñ o s 1941
a 1987 mostrd una caida notable, seguida de dos
reactivaciones; la primera, modesta, a principios de los
setentas y la segunda, mas importante, en la actualidad. A
partir de 1960 se inicid el repunte de infecciones: para 1970
se registraron mds de 57,000 casos, y en los irltimos 15 años
la morbilidad por paludismo fue adquiriendo proporciones
epidgmicas. Durante este lapso, el nhmero de enfermos
registrados aumentd entre 5 y 6 veces, hasta a1canza.r un
m6ximo de 133,698 en 1985, la cifra mds alta registrada en el
pais desde el inicio de la campaña de erradicacidn del
paludismo en 1956 (Martinez-Palomo, 1990). En los dltimos 3
años, la Secretaria de Salud a traves de la campaga contra el
paludismo, introdujo el Programa de Actividades lntensivas
Simultaneas (PAIS) en las localidades afectadas. Estas
medidas comprenden el rociado intradomiciliar, la aplicacidn
de nebulizaciones, el tratamiento de criaderos potencia.les
con larvicidas, asi como el tratamiento profildctico de los
individuos que viven en las Areas bajo control.
Algunos estados de la repdblica mexicana se consideran
libres de Paludismo ( Guanajuato, Morelos, Puebla, Distrito
Federa 1 1 ; pero en otros la transmisidn de la enfermedad
continlfia. Los estados con mayor ndmero de casos de paludismo
son: Michoacdn, Oaxaca Y Chiapas, particu1arment.e en el
distrito de Tapachula. De los casos de paludismo que se
presentan en Mexico, el 98% de ellos los causa E. vivax, el
2% p. falciparum y ocasionalmente la infeccidn la causa
p. malarie. El principal vector del Plasmodium en el estado
de Chiapas es el mosquito h. albimanus, sobre todo en el
Area de la costa. (Wernsdorfer 1988).
PLASMODIUM.
Existen mds de 125 especies conocidas de Plasmodium, el
parasito protozoario causante del paludismo, la mayoria de
las cuales infectan aves, pero tambith se han encontrado en
reptiles y mamiferos. La infeccidn es especifica de especie
(GonzAlez C . L . 1993). Existen cuatro especies de Plasmodium
que infectan al hombre. Plasmodium vivax produce en el hombre
el paludismo terciano; E. malarie origina el paludismo
cuartano; p. falciparum causa el paludismo terciano maligno,
y E. ovale da lugar a una forma de paludismo terciano,
relativamente raro y de moderada gravedad (Thorn. G W 1984).
Las distintas especies de Plasmodium difieren mucho en su
capacidad para invadir a los eritrocitos. E. vivax y p. ovale
atacan unicamente eritrocitos inmaduros y p. malarie sdlo a
los senescentes, E. falciparum invade los eritrocitos
cualquiera que sea su edad y puede causar niveles
extremadamente elevados de parasitemia. (Thorn. GW 1984)
.....
Ciclo de vida del Plasmodium
El hombre es el huesped intermedio del Plasmodium y el
mosquito el definitivo, lo cual significa que en este dltimo
se lleva a cabo el desarrollo sexual del pardsito.
El ciclo de vida del pardsito es complejo y comprende una
secuencia de cuatro fases. En el mosquito se llevan a cabo la.
fase sexual seguida de una fase asexual. En el huesped
humano, una fase asexual ocurre en el higado y otra en la
sangre. Cada fase origina nuevos pardsitos invasivos. En la
sangre el pardsito se multiplica varias veces, algunos de
gstos se diferencian a formas sexuadas llamadas gamet.ocit.os.
Un nuevo ciclo comienza cuando estas fases son tomadas por
los mosquitos Anopheles (Knell A.J., 1991). fig. 2 )
Desarrollo extraeritrocitico
Cuando un ser humano es infectado, ocurre una ronda de
desarrollo extraeritrocitico en el higado, al cabo de la
cual se genera la forma del parasito conocida como
esquizonte, la cual al madurar rompe los hepa.tocit.os,
liberdndose la siguiente forma del Plasmodium, 1 os
merozoitos.
Desarrollo eritrocitico
Los merozoftos pasan a la circulacidn sanguinea e invaden
los eritrocitos circulantes, en donde se reproducen
asexualmente. Este ciclo eritrocitico es periddico y su
duracitjn es constante y caracteristico para cada especie de
Plasmodium.
Casi inmediatamente despuks de invadir el eritrocito, el
parbsito, en su forma de merozoito, desarrolla una vacuola
y adquiere la forma de anillo. Posteriormente, el pardsito
sigue creciendo y el citoplasma exhibe varios grados de
movimiento de acuerdo a 1.a especie de Plasmodium. En
Plasmodium vivax, despues de 12 a 24 horas los movimientos
disminuyen, la vacuola desaparece y aparecen grdnulos de
pigmento en el citoplasma; estos son residuos de la
digestidn de la hemoglobina del eritrocito. El pardsito es
ahora un cuerpo sdlido y ocupa una porcidn variable de la
c&lula hu&sped, a e s t a etapa en el ciclo de vida del pardsito
se le denomina trofotoito. El ndcleo de los pardsitos inicia
la divisibn en diferentes tiempos (mas rdpidamente en
5.falciparum y mbs lentamente en E. malarie) durante la
esquizogonia la cual culmina con la formacidn de un ntlmero
especifico de merozoftos, que son liberados a la circulacidn
e invaden nuevos er i t.r~ci t.06.
,._.. . > ../.
Desarrollo del pardsito en el estdmago del mosquito
Durante la repeticidn del ciclo eritrocitico, algunos de
los eritrocitos 5e 1 lenan de formas sexuales (gamet.ocit.os1.
Los gametocitos no causan lisis celular y detienen su
desarrollo hasta que son ingeridas por un mosquit.0
apropiado. Cuando la sangre llega al estdmago del insecto
los macrogametocitos escapan r6pidamente del eritrocito
formando un macrogameto. La microgarnetogt5nesis procede mas
lentamente, despuks de 10 minutos de haber llegado al
intestino, el núcleo se divide en 8 porciones y sobre la
superficie del organismo aparece un fi1ament.o. Estas cglulas
son los microgametos flagelados, que tienen una longitud
aproximada de 20 micrdmetros, son muy mdviles y comprenden lo
que se denomina el cuerpo exflagelante. Movi@ndose
vigorosamente, los parasitos quedan libres de 1 cuerpo
parental y fertilizan al macrogameto. Los n6cleos de las
c&lulas gamgticas se fusionan y se forma el cigoto. En un
periodo de 18 horas o menos a partir de que el mosquito
ingirid la sangre, el cigoto s e elonga formando un o~cineto
mdvil de 20 micrdmetros de longitud aproximadament.e; el
oocineto puede penetrar la membrana peritrdfica y el epit.elio
del estbmago. Sobre la superficie externa del estdmago se
forma el a0cis t .o (24 a 7 2 horas despugs de la ingestidn de
sangre), el cual contiene un nCtcleo Cgnico, grdnulos
pigmentados y varias estructuras residuales del oocineto. El
oocisto se expande y el nGcleo se divide repetidamente y de
cada nacleo hijo se forma un esporozoito (aproxima.darnente
10,000 esporozoitos pueden estar presentes en un solo
oocisto). Finalmente, los esporozoitos escapan del oocisto y
viajan en el fluido hemoceldmico para acumularse en las
cilulas acinares de las glandulas salivales CWernsdorfer
1988 ) .
Limitaciones encontradas por el pardsito durante su
desarrollo dentro del mosquito.
Warburg A. y Miller L . H. (1991) sugieren que el
desarrollo completo de los parllsitos de la malaria en el
estdmago, hemocele y gldndulas salivales del mosquito vector
depende de su habilidad para vencer una serie de barreras:
La gametog&nesis se dispara en el mosquito por las
condiciones ligeramente alcalinas (pH 8 . 0 ) y la reduccidn de
la temperatura. Se ha observado que algunas rnolt2culas que se
encuentran en el mosquito estimulan la exflagelacidn y en
algunas especies, la actividad de enzimas digestivas puede
alterar la habilidad del oocineto para penetrar la pared del
e s tdmago.
Aunque existe mucha controversia con respecto al mecanismo
por el cual los oocinetos pasan desde el lumen del estdmago
., .I 1. .l.
al hemocele, se ha observado, por medio de microscopia
electrbnica, que muchas especies de Plasmodium se encuentran
solo dentro de las cdlulas epiteliales. Una excepcidn notable
fue E. falciparum encontrdndose que pasa entre las c€%:lulas
del estbmago sin invadirlas. Los oocinetos de P.gallinaceum
fueron vistos dentro de las cglulas epiteliales del estdmago
y entre estas, sugiriendo que a la invasibn epitelial le
sigue la salida a la. regibn intercelular. (Warburg y Miller
1991).
Del otro lado de la pared del est.bmago, los o0cinet.o~ y
quistes pueden ser atacados por componentes de la hemolinfa
del mosquito. A pesar de esto, los pardsit.os en el
apropiado permanecen aparentemente invisibles al
inmune de su hugsped.
Encapsulacibn humoral.
Uno de los mecanismos de defensa mds evidentes
mosquitos Anopheles resistentes a los pardsitos
encapsulacibn humoral. La reaccidn es causada
vector
sistema
de los
es la
por la
activacihn de la cascada fenoloxidasa, una compleja secuencia
de reacciones quimicas que causan la acumulacidn de complejos
proteicos sobre cuerpos extraños. Col lins y c o l a b o r a . d o r e s
( 1986 ) logra.ron seleccionar una linea de mosquitos de ]a
especie An. gambie que e s completamente resistente a
p. cynomolgi, y que muest.ra diferentes grados de resist.encia.
a p. falciparum, E. ovale y 5. vivax. La resistencia s e debe
a que estos mosquitos tienen una mayor eficiencia pa.ra
encapsular y melanizar oocinetos y ooquistes. El proceso por
el cual los parAsitos son reconocidos corno extrasos por el
sist.ema inmune de mosquitos resi5t.ent.e~ e s desconocido, pero
esta habilidad es codificada al menos por do5 genes, uno de
los cuales esta ligado a un locus de esterasa. (Warburg y
Miller 1991)
Vernick Y Collins (1989) Propusieron que el locus Est
(esterasa) podria ser el que controla la caracteristica
fenotipica de resistencia en A n . gambiae contra p. cynomol8i.
Se piensa que muchas esterasas son proteasas que son
funcionalmente categorizadas como serin proteasas o como
serin hidrolasas y estas serin proteasas han sido implicadas
en la activacidn de la profenoloxidasa en la cascada de
melanizacidn durante la respuesta de encapsulacidn del
insecto.
Fig 2. Ciclo de vida del Plasmodium.
Fase 1. Fertilizacibn: Inicia cuando una hembra de Anopheles s e alimenta con sangre de una persona infectada. Los gametocitos escapan de los eritrocitos convirtiendose en gametos libres, de machos y hembras. Los gametos machos producen 8 o mAs flagelos, durante la exflagelacidn ( 1 ) . Este rompimiento libera a los flagelos y cada uno queda. con un nucleo adherido. Si se encuentra con un gameto hembra se produce la fertilizacidn (2) y se forma un cigoto (3). Este se desarrolla y forma un oocineto invasivo (41, que atra.viesa la pared del estdmago y se convierte en un oocisto.
Fase 2. Esporogonia: Desarrollo asexual en el mosquito. El oocisto crece ( 1 1 , s e divide y produce miles de esporozoitos invasivos (2). El oocisto maduro s e rompe ( 3 ) y los esporozoitos libres migran a traves del cuerpo del mosquito e invaden las gldndulas salivales de este.
Fase 3. Esquizogonia hepatica: Desarrollo asexual en el higado. Cuando el mosquito se alimenta de nuevo los esporozoitos son inyectados a la circulacidn sanguinea e invaden las cglulas del higado ( l > , convirtiendose entonces en trofotoitos hepdticos (21, que crecen y se dividen para producir miles de merozoitos invasivos (3). Las cblulas del higado infectadas se rompen, liberando los merozoft.os a la circulacidn sanguinea ( 4 ) . Algunos esporozoitos se convierten en hipnozoitos, los cuales permanecen como formas durmientes en las c&lulas del higado, para desarrollarse meses o asos despues y causar la enfermedad al liberarse.
Fase 4. Esquizogonia erit.rocitica: Desarrollo asexual en la sangre. Los merozoitos invaden a los eritrocitos ( 1 ) y se convierten en trofozoitos eritrocfticos (2). Estos crecen, y se dividen en 8 a 16 nuevos merozo2t.o~ (3). Cuando los merozoitos maduran, el eritrocito se rompe, y los merozoftos son liberados 141, iniciando nuevamente el ciclo (5). Conforme avanza la enfermedad algunos merozoitos se desarrollan a gametocitos machos o hembras (6, 7 ) . Estos permanecen en la circulacidn pero se desarrollan posteriormente cuando son ingeridos por un mosquito.
CICLO DE VIDA DE LOS MOSQUITOS.
El ciclo de vida de 105 mosquitos se desarrolla en cuatro
formas o estadios: huevo, larva, pupa y adulto, de los cuales
solo el irltimo tiene la capacidad de volar, mientras que en
los tres estadios iniciales se desarrollan como organismos
acuAticos. El ciclo de vida de los mosquitos comienza con el
proceso de oviposicibn, el cual ocurre generalmente en sitios
de crianza, tales como charcos o lagunas. Durante el proceso
de oviposicibn, los huevecil los pasan por el oviduct.0 y son
fertilizados por 105 espermatozoides que depositd el macho
dentro de la hembra durante la cbpula.
Despues de varios dias la larva, con forma de pequeño
gusano, sa 1 e del hueveci 1 1 o rompihdo lo con la ayuda de una
espina localizada en la superficie dorsal de su cabeza. La
larva s e alimenta de bacterias, protozoarios y plantas
unicelulares que se encuentran en su hdbitat acudtico.
Posteriormente, la larva del mosquito se convierte en pupa;
durante este periodo se lleva a cabo un proceso de
reorganizacidn extensa de 1a.s estructuras del cuerpo de la.
larva, orientados al desarrollo del mosquito adulto. Cuando
el insecto adu1t.o e s t & listo para emerger, rompe la cuhiert.a.
pupal, la cual utiliza para flotar en la superficie del agua.
por algGn tiempo. Una vez que los adultos han emergido,
necesitan de las primeras 24 a 72 horas para completar el
desarrollo de sus a.la.s, su aparato digestivo y a.parato
reproductor.
Despugs de uno o dos dias, los mosqui t.os machos y hembras
estdn listos para reproducirse. La hembra almacena desde la
primera c6pula espermatozoides suficientes para toda su vida,
que es de tres semanas aproximadamente.
Cuando una hembra ya ha sido inseminada comienza a buscar
una alimentacifin especial, consistente en sangre de
vertebrados, la cual contiene factores indispensables para el
desarrollo de sus huevecil los. En la mayoría de las especies
de mosquit.0 existe una marcada preferencia por un huesped en
particular; algunas prefieren al hombre para alimentarse,
otras se alimentan de mamíferos, aves, anfibios y reptiles (
HernAndez, et al 1992) Fig. (3).
Fig 3 , Ciclo de vida de la hembra Anopheles
Noche 1: Alimentacibn. La hembra s e alimenta con sangre.
Dia 2: Descanso. Durante el dia la hembra descansa en sitios frios,
sombreados y hbmedos. Comienza el proceso de digestibn de la sangre ingerida e inicia el desarrollo de sus huevecillos.
Noche 2: Descanso y semi gravidez. La digestidn de la sangre y la produccibn de los
hueveci 1 los continua. El mosquito puede dejar la ca.ss o cambiar su sitio de descanso.
Dia 3: Descanso y gravidez completa.
producci6n de huevecillos se completa. Permaneciendo en un sitio hdmedo sombreado y frfo; la
Dia 3: Por la tarde. La hembra gravida vuela hacia un cuerpo de agua disponible y deposita de 50 a 150 huevecillos. El mosquito hembra puede entonces alimentarse nuevamente con sangre e iniciar el ciclo nuevamente.
Larva. Los huevos se incuban 2 a 3 dias. Las larvas se alimentan filt.rando algas y otros materiales de el agua. En condiciones favorables las larvas crecen rdpidamente. Sufriendo tres procesos de muda.
Pupa. Despues de la tercer muda la larva se alimenta y crece nuevamente, entonces se convierte en una pupa mdvil. En este estado no se alimenta. La pupa respira a traves de dos estructuras llamadas trompetas, mientras el desarrollo del adulto procede internamente.
Emergencia del mosquito adulto. DespuCs de dos a tres dfas el adulto emerge. La pupa se abre liberando a un adult.0, que necesita secarse durante un tiempo para endurecer sus estructuras y posteriormente poder volar.
Fertilizacibn. El apareamiento es la primera activid3.d de los adultos que recien han emergido. Despues de la copulacibn, en el conducto genital de la hembra se forma. un tapbn, probablemente de una secrecidn depositada por el macho al final de la copulacibn. Knell A . J. ( 1 9 9 1 )
ANATOMIA Y FISIOLOGIA DEL ESTOMAGO DEL MOSQUITO.
Por lo anteriormente expuesto se comprende la importancia
de conocer la relacidn que existe entre el parAsit.0 y el
medio que encuentra dentro del estdmago del mosquito.
Organizacidn general del aparato digestivo en insectos.
En general el canal alimenticio de los insectos consta de
tres partes: El intestino anterior ( o esbfago), el intest.ino
medio o estdmago y el intestino posterior. El int.est.ino
anterior y el posterior est6 cubierto con cut.icula; en el
intestino medio las c&lulas est.dn libremente expuestas.
(Wigglesworth V.B. 1 9 8 4 ) .
El intestino anterior no tiene otra funcidn conocida que
la de conducir el alimento hacia el intestino medio, de aqui
pasa en forma mas o menos continua hacia el int.estino
posterior. En los lepiddpteros y en muchos dipt.ero5
(Culicide, Tabanide), los alimentos ingeridos estiran el
intestino medio y entonces estos alimentos son almacenados y
digeridos.
En muchos dipteros el intestino medio consiste de varios
segmentos caracterizados por diferencias en el epitelio; la
regidn mds prdxima probablemente se involucra solo con la
absorcibn, la regidn posterior con la digestidn y absorcidn.
Casi todos los insectos tienen un esfinter muscular, donde
el intestino ant.erior y el intestino medio se unen, por el
cual el contenido de las dos regiones puede ser separada; y
muchas veces se encuentra un drgano conocido como
proventriculo. El provent.riculo es una entidad morfoldgica
diferente en diferentes grupos, su funcidn tambien varia
(Wigglesworth 1984) .
Membrana peritrdfica.
El estdmago de los insectos no contiene g1dndula.s que
producen mucus, por lo que las particulas de alimento no son
lubricadas como en el intestino de los vertebrados. En los
insectos la proteccibn de las c&lulas epiteliales se obtiene
al cubrir los alimentos en el estdmago, con una membra.na que
esta compuesta de quitina y prot.einas, la membrana
peritrdfica, la cual es permeable a enzimas digestivas y a
productos de la digestibn. (Wigglesworth 1984)
Las funciones atribuidas a la membrana peritrdfica son:
a) Proporcionar una proteccidn mecdnica a las ct2lula.s del
estdmago.
b) Servir como una barrera fisica contra microorganismos
invasores.
c) Funcionar como una barrera permeable para las enzimas
digestivas y sus productos de digestidn y de alguna forma
compartamelizando el proceso de digestidn. (Terra W. R. 1990)
En contraste al sistema en vertebrados, las ct2lulas
digestivas del mosquito contienen solo algunos grdnulos
secretorios y estos no estdn cargados con grAnulos de
zimdgeno, como en las celulas exocrinas del pancreas. En el
mosquito, las funciones de secrecidn y absorcidn no estan
presentes en celulas diferentes como en los vertebra.dos,
sino que al parecer ocurren simu1tdneament.e en las mismas
c&lulas. (Barillas 1992).
Proceso digestivo en Dipteros.
Para describir el proceso digestivo en los dipteros,
Billingsley ( 1 9 9 0 ) , dividid el estdmago de los dipteros sol@
en dos regiones. El intestino anterior (IA), que comprende
solo un tubo, por el que, si bien pasa la sangre ingerida no
sufre ningCtn proceso de degradacibn, siendo el IA responsable
solamente de la absorcidn de los a.zCtcares. Las celulas del 1A
normalmente poseen abundantes microvellosidades, formando un
laberinto basal bien definido que descansa sobre una ldmina
basal continua. Billingsley nombra a la regidn posterior
del tubo digestivo intestino posterior (IF>. El IP BE, un saco
expansible, abierto en un extremo y cerrado en la pa.rte
;:::t..’ .... ..
posterior, las celulas pueden ser multifuncionales t.eniendo
un mínimo de tres papeles fisioldgicos: regula-cihn del
equilibrio osmdtico, sfntesis y secrecidn de productos
celulares relacionados con la digestidn y absorcidn de
nutrientes.
El IP sufre gran deformacidn cuando la sangre es ingerida.
y est.a fuerza mecdnica es compensada por la presencia de
uniones intercelulares en las membranas celulares 1at.erales.
En especies de Anopheles, las celulas del I P estdn unida5 por
desmosomas septados en el tercio apical de las membranas
celulares laterales (zonnula continua y zonnula ocludens).
El 1P permite el paso libre de particulas mayores de 2nm
de diAmetro a travgs de la zonnula continua, estas fugas del
epitelio son afectadas positivamente por el grado de
estiramiento durante la alimentacibn.
Proceso de formacidn de la membrana peritrdfica en
mosquitos.
Para el proceso de formacidn de la membrana peritrdfica
Billingsley ha encontrado que en los mosquitos culícidos y
anofelinos, la membrana peritrdfica no tiene el mismo proceso
de formacibn. Por ejemplo en cglulas del intestino de h.
gambie y A n . stephensi, se encuentran presentes grdnulos de
secrecidn con localizacidn apical en las c&lulas del
int.estino. Estos grAnulos son liberados en el lumen del IP
durante el proceso de alimentacidn en respuesta solamente a
la tensidn mbs que a algdn componente especifico de la diet.a,
y son rea.bastecidos durante la subsecuente digestidn de la
sangre. El contenido de las vesiculas se funde y entonces se
condensa para formar la llamada membrana peritrdfica ( M P ) , l a
cual es compacta y en m. stephensi se encuentra formada por N - acetil galactosamina, galactosa y glucosa. P o r otra
parte en los mosquit.0~ culfcidos la MP es formada dg novo
por las ct2lulas del IP. Al parecer se requiere de part.iculas
sd1 idas en la diet.a para que puedan ser secretados los
componentes de la MP; en los mosquitos &. aegypti se ha
identificado como componentes de la MP a N - acet.i 1
glucosamina y glucosa, aunque pueden estar presentes otros
azbcares.
..... , . A" .:... . . ) I . .,
Modelo propuesto para la digestidn en mosquitos.
Para la digestibn en mosquitos Billingsley (19901 ha
propuesto un modelo que consta de seis fases:
a) Fase de maduracidn del aparato digestivo.
En la primera fase considerada por este autor, no ha.y
realmente digesti6n sino que ocurre la maduracidn del
aparato digestivo. Este periodo comprende de las cero horas a
los tres dias postemergencia. DespuOs de que el mosquito
adulto emerge el sistema digestivo no est& cnrnp1et.ament.e
diferenciado: por ejemplo, las c@lulas del IP de e. egypt.i son de forma irregular con pocas microvellosidades y un
aparato sintetico secretorio pobremente desarrollado.
b) Fase osmorregulatoria.
Una vez alcanzada la madurez de las c&lulas del int.estino,
el mosquit.o hembra puede alimentarse con sangre. Durant,e e
inmediatamente despues de la alimentacibn, el estbmago
posterior puede remover el exceso de agua de la sangre y usar
esta para remover otros productos excretados, que pudieran
haberse acumulado antes de la alimentacibn.
c)Fase secretoria no sintetica.
La fase no sintetica se considera de las cero a una hora
despues de la alimentacibn. A los pocos minutos de la
alimentacibn, la secrecidn de materiales sintetizados durante
.L .,..S ' .) .. .. . .. . , .
la fase de maduracidn ocurre; liberdndose grdnulos
precursores de la. membrana peritrbfica, y mat.eria1 celular
endocrino.
d) Fase sint&tica secretoria
Esta fase comprende entre las dos a. treinta horas desputiis
de la alimentacibn. Este periodo se caract.eriza por la
sfntesis y secrecidn de la MP, enzimas digestivas y otras
protefnas involucradas en el proceso de digestidn (prot.einas
estructurales y hormonas). En la primera parte de esta fase,
los organelos secretorios y sintt5ticos de las cglulas del I P
se incrementan enormemente, y son sintetizados nuevos
ribosomas. Estos cambios cuant.itativos correlacionan con la
sfntesis y secrecibn, dent.ro del lumen, de la tripsina. En la
segunda parte de esta fase, todos los pardmetros celulares
sinteticos estdn aumentados, y la tripsina puede ser
localizada en vesículas secretorias y en la periferia de1
lumen, particularmente en el IP.
e ) Fase de absorcibn.
La incorporacidn de albdmina radiactiva a la dieta
permitid identificar que la absorcidn de los productos de la
digestidn de proteinas en el est.bma.go puede comenzar desde
las 4 horas despues de una alimentacibn con sangre; y que
algunos amino dcidos libres en el estbmago pueden a.bsorberse
inmediatamente despu&s de la ingesti6n del alimento.
,.... .I._ . ..' 63.
f > Fase de recuperacibn.
Se considera a la fase de recuperacien desde las treinta y
seis horas a las set.enta horas despues de la alimentacibn.
En esta fase se observa un decremento gradual del aparato de
Golgi, resultando en un decremento en la localizacidn Y
actividad de enzimas. Durante esta fase, los sobrantes del
contenido del estdmago, la actividad residual de enzimas y la.
membrana peritrdfica son eliminados del estbmago, y entonces
las celulas entran a un estado de descanso, en espera de una
posterior alimentacibn.
INTERACCION DE LAS ENZIMAS PROTEOLITICAS DEL ESTOMAGO DE LOS MOSQUITOS CON EL PARASITO PLASMODIUM
Desde las primeras investigaciones hechas con los mosquitos
transmisores de enfermedades, se ha demostrado la importancia
de las proteasas del estbmago, ya que es el medio donde se
desarrollan los virus y parasitos causantes de las
enfermedades. Yeates., (1981) demostraron, mediante
estudios in vitro, que las proteasas de &. aegypti, sin
necesidad de algftn otro factor, destruyen los oocinetos de 5.
gallinaceum, siendo este efecto dependiente de la
concentracidn de proteasa.6. Un resultado similar fue obtenido
por Imbunga, et. a l (1992>, al estudiar in vitro los factores
que inducen la diferenciacidn del Tryuanosoma brucei brucei
en la mosca ts&ts&. Estos investigadores observaron que la
uti 1 izacibn de inhibidores de proteasas, principa1ment.e
inhibidores de tripsina, bloquean el ciclo de transformacibn
de los pardsitos.
Actividad enzimdtica reportada en algunas especies de
mosquito.
Serin proteasas.
Dentro de las serin proteasas se incluyen dos familias
distintas: La superfamilia quimiotripsina y la superfa.milia.
subtilisina. Las enzimas pertenecientes a la superfamilia
.,:"*L.: .' ....
quimiotripsina se han encontrado tanto en microorganismos
procariontes como en eucariontes, en plantas y en anima.les
vertebrados e invertebrados. Las enzimas pert.enecientes a la
superfamilia subtilisina sdlo se han encontrado en bacterias.
La superfamilia quimiotripsina incluye muchas proteasas
extracelulares, tales como la tripsina, elastasa y trombina..
(Hidalgo 1989)
Estas familias, difieren una de la otra en su secuencia
de aminodcidos, a pesar de tener un sitio activo comim y el
mismo mecanismo enzimdtico. La caracteristica de su sitio
activo es la triada catalitica compuesta por A s p en la
posicidn 102, His 57, Ser 195. La catdlisis procede via un
estado de transicibn tetraddrico intermediario durante los
pasos de acilacidn y desacilacidn del substrato.
Las diferencias en la especificidad de substrato pueden
relacionarse con la substitucidn de amino dtcidos en el sitio
de unidn del substrat.0 primario, comunmente denotado, como
P1, y a diferencias menGres en los sitios de unibn
secundarios. Los genes que codifican para tripsina,
quimiotripsina y elastasa, difieren en el ncmero y
distribucidn de intrones. (Neurath H. 1989)
Tripsina.
Las especies proteoliticas que se encuentran en los
estdmagos de algunas especies de mosquito han sido
. , : . . , . . . . , . . . .. ..
report.adas por varios autores: Kunz (19781, describid las
proteasas de las larvas de A s . aegypti, logrando detect.ar y
purificar proteasas de tipo tripsina. Este autor encontrd
ademds que la actividad proteolitica se asocia
principalmente con el estbmago; ya que no encuentra pat.rones
de proteasas diferentes cuando ut.iliza extractos de la.rvas
completas. Kunz (1978b), realizd un estudio de las prot.easas
presentes en el estdmago del mosquito adu1t.o &. aegypti, e
hizo una comparacidn entre las proteasas de la larva y 9 1
adulto. Est.e investigador encontrd en el mosquito adulto
hembra ocho diferentes proteasas, a diferencia de las larvas
donde encontrd diez diferentes proteasas. El peso molecular
aproximado para est.as protea.sas es de 20 a 23 KDa. , En base a.
experimentos donde analiz4 el punto isoelectrico de est-as
enzimas, Kunz propuso que estas proteasas son isoenzima.~.
Este autor reportb tambien que la actividad proteolitica se
inhibe completamente con diisopropilfluorufosfato (DFP),
indicando que las proteasas presentes son de tipo serina.
Los patrones de actividad de proteasa que encontrd fueron
iguales para estdmagos aislados que para mosquitos completos,
sugiriendo esto que, en sus condiciones, la mayor parte si no
toda la act.ividad proteolitica se encuentra en el tract.0
digestivo.
.... I .
.:L. I . ? .: ?..?
Sintesis y secrecibn de tripsinas.
La sintesis y secrecidn de tripsinas en el mosquito As.
aegypti parece ser afectada por factores originados del
proceso de alirnentacidn con sangre o bien por factores de
naturaleza endocrina. Graf y Briegel (1989) investigaron los
eventos regulatorios durante la sintesis de tripsina en el
mosquito &. aegypti. Ellos encontraron que el comienzo del
ciclo digestivo es caracteriza.do por una int.ensa sint.esis de
proteinas. Al inicio las tripsinas contienen solo formas de
entre 32 y 36 KDa, pero a las 6 horas de iniciado el ciclo
digestivo aparecen formas de 30 KDa, las cuales aumentan
hasta que a las 12 horas de iniciado el ciclo estas son las
formas principales. Despues de las 12 horas la sintesis de
proteina total en las cdlulas del epitelio del estdmago asi
como de tripsina declina. Para descartar la posibilidad de
que las formas iniciales de "tripsina" (tripsinas tempra.nas>
de 32 a 36 KDa fueran precursores de la forma principal de
"tripsina" (tripsinas tardias) de 30 KDa , estos aut.ores
utilizaron experimentos de pulso y caza, con los cuales ellos
concluyen que la sintesis de las tripsinas t.ardSas e s
distinta de la sintesis de las tripsinas tempranas.
Graf y Eriegel ( 1989 ) Incubaron in vitro estbma.gos
disecado con una mezc 1 a de aminoacidos marcados
radiactivarnente, con io cual observd que la sintesis de
tripsinas tardias no decae sino hasta despu&s de 16 a 20
horas. Estos autores nos dicen que la secuencia. de
aminoAcidos deducida para las tripsinas t.ardias indica que
solo hay dos residuos de metionina en la prot.eina, y que
ambos estbn presentes en la regidn pr0puest.a para ser la
secuencia sesal para la secrecibn de proteina. Esto implica
que entre las 1 2 y 18 horas despuks de la aliment.acidn la
sintesis de proteinas es mas rrjlpida que la de secrecibn y las
formas precursoras son
la tripsina solo son
marcadas con metionina.
sintetizadas de novo
perdiendo los residuos
la tripsina activa
autorradiograf fa.
acumuladas. Las formas precursoras de
detectadas cuando las prot.einas son
Despuks de las 18 horas las tripsina.~
son secretadas casi inmediatamente,
de metionina marcados y por lo t.anto
no puede ser detect.ads. por
La existencia de un zimdgeno (tripsindgeno) que diera
origen a las tripsinas tardias no ha podido ser confirmada
directamente. Para explicar la aparicidn de act.ividad de las
tripsinas, Barillas (1992) propuso que la activacidn de las
tripsinas tardias puede deberse a autocatdlisis, c? bien a que
las formas de tripsinas tempranas pudieran e5t.ar part,icipando
en la activacicftn de 1 a.s tripsinas tardfa.s, O
alternativamente, la activacidn de l a 5 tripsinas tardias
fuera realizada por la quimiotripsina, que esta present.e
siempre en niveles bajos en el intestino.
..., .. .. .. '..! i
. .
b) Aminopeptidasas y quimiotripsina.
Aunque ha sido reportado que la tripsina es la proteasa
principal en el estdmago del mosquit-o hembra, tambiCn se ha
encontrado la presencia de aminopept.idasa, y quimiot.ripsina.
Billingsley y Hecker ( 1991 ) plantean que aunque la tripsina
es la responsable de los eventos proteoliticos principales en
el estdmago, la digestidn secundaria de pgptidos es llevada. a
cabo por amino y carboxi peptidasas; asf la actividad de
aminopeptidasa puede correlacionar con pbptidos mds que con
proteinas en el estbmago. Aunque algunos de estos pueden
estar libres en el suero, muchos m6s pueden ser liberados por
la degradacih proteolitica de glicoproteinas de la sangre,
especialmente de las membranas de eritrocitos.
Billingsley y Hecker (1991) reportaron la existencia de
arninopeptidasa en estbmagos de mosquito An. stephensi. Ellas
encuentran que la actividad de tripsina incrementa partiendo
de una linea base de no actividad en insectos no alimentados,
a un mdximo de actividad de aproximadamente 15 unidades de
enzima (15EU) a las 30 horas despuBs de una alimentacidn con
sangre, para declinar a no actividad a. las 60 horas.
Simultdneamente, la actividad de aminopeptidasa asciende a
partir de una 1 fnea base de 3EU por est6mago ant.es de la
alimentacibn, a un mdximo de 12 EU a las 30 h o r a s dsspu&s de
una aliment.acidn con sangre. Est.a actividad declina y
alcanza los niveles basales hasta las 60 horas despues de u n a
alimentacien con sangre.
. . .,. , . .I:, _I.
JUSTIFICACION
Basandose en los datos epidemioldgicos varios autores, han
pronosticado un aumento en la incidencia del pa.ludismo en
Mexico (Martinez-Palomo, 1990 ) , por lo que es necesaria la
bctsqueda, de formas de control de la malaria.
Los mgtodos para controlar la reproduccidn del pariksito en
el huesped, se han visto obstaculizados porque el parbsito
muestra varios mecanismos de evasidn de la respue5t.a inmune
del hugsped vertebrado. L o s pardsitos del paludism@ pueden
escapar fdcilmente a la respuesta inmune porque la mayor
parte de su ciclo de vida permanecen como pa.rAsit.@s
intracelulares, de tal forma que los anticuerpos son
incapaces de reconocerlos como organismos extraEos
(Wernsdorfer 1988). Se ha propuesto que existen ademds o t r o s
mecanismos mds complejos de evasidn de la respuesta inmune,
como por ejemplo, la adquisicidn de macromol€kulas del
huesped para. ocultar los antigenos propios, comparable a lo
observado en los tripanosomas africanos.(Wernsdorfer 1988).
Para el control de la. dispersidn de la malaria han sido
propuestos numerosos m&t.odos de control del vector, sobre
todo los de tipo biolbgico, como por ejemplo la int.roduccidn
en areas problemdticas, de peces depredadores d e la . rvas de
mosquito, o la introduccibn de bacterias que daEan a. la5
larvas de los mosquitos.
Sin embargo, est.os m&todos de control no representa.n una
solucidn global del problema del paludismo, por lo que se
estudian otras alternativas como aquellas encaminados a la
elaboracibn de una vacuna.
Una posible forma de control del paludismo propuesta.
recientemente, es la modificacibn genetica del vector, con el
objeto de obtener insectos resistentes a la invasidn del
parasito. Para este propbsito se ha considerado importa,nte
estudiar el papel que desempeKan las proteasas producidas en
el estbmago de los insectos hematbfagos, debido a que este es
el medio donde se desarrollan y multiplican v i r u s y
parasitos.
.... . .. , .
. ,. . ... ... . .
OBJETIVOS
De lo anteriormente expuesto se deduce la importancia de
conocer algunos de los factores presentes en el sistema.
digestivo de los mosquitos y definir cuales participan en el
desarrollo del parasito Plasmodium en el int.erior del vect.or.
Por estos motivos se plantean como objetivos de este trabajo:
Objetivo general.
Analizar las especies proteoliticas producidas en el
estdmago de mosquitos hembra de A n . albimanus.
Objetivos especificos,
1 ) Caracterizar las proteasas presentes en el intestino medio
de los mosquitos hembra de An. a.lbimanus, de acuerdo a su
peso molecular y actividad proteolitica.
2) Verificar la existencia de actividad de proteasas en
distintos drganos y tejidos del mosquito.
3 ) Caracterizar el tipo de proteasas presentes en l o s
mosquitos hembra An. albimanus, mediant.e la utilizacidn de
inhibidores de proteasas.
4 ) Caracterizar la cingtica de aparicidn de prot.easas durante
una aliment.acibn con sangre en los mosquitos hembra de A n .
albimanus.
MATERIALES Y METODOS
Obtencibn de mosquitos.
Los mosquitos utilizados en este estudio pertenecen a la
especie e. albimanus y fueron obtenidos del insectario del
centro de investigaciones sobre el paludismo (CIP) en
Tapachula Chiapas.
Preparacibn de tejidos.
Los estbmagos, gldndulas salivales, abdomenes y tdrax de
mosquitos preal imentados ( este t.rjrrmino es utilizado para
nombrar a mosquitos a los que se les permitid aliment.arse
solo con agua azucarada ad libitum) o postalimentados (este
tgrmino es ut.ilizado para nombrar a mosquitos que se les
permitid alimentarse con sangre de conejo sano) son
disectados, lavados con solucidn salina y colocados en buffer
de muestra para electrofbresis 2 x , etiquetados y alma.cenados
a -20°C hasta su uso.
El homogenado de los mosquitos y/o s u s drganos disecado se
obtuvo rompiendo el material bioldgico mediant.e 3 ciclos de
congelacibn-descongelacibn con nit.r6geno liquido Y
cent.rifugando a 12,000 xg durante 30 segundos; para
finalmente obtener la fraccibn sobrenadante.
Determinacidn de la cantidad de proteina.
La cantidad de prot.eina en cada uno de los homogenados se
realizb de acuerdo al procedimiento de Lowry y col. (1951),
utilizando una curva estdndar de albürnina bovina. Muestras de
2 a 15 1-11 se llevaron a un volumen final de 200 1-11 con agua,
bidestilada entonces se le adiciond 20 pl de deoxicolato de
sodio se incubd 5 rnin. en hielo y ent.onces se le adiciond 20
pl de dcido tricloro acetic0 al 72%. Finalrnent-e la muestra s e
centrifugdi durante 15 rnin. en frio, el sobrenadante se
desechd y la pastil la se secd al a.ire. A las muestras se les
adiciond 1 m1 de una solucidn que contenia carbonato de sodio
2%, NaOH 0.4%, tartrato de Na y K 0.02% y CuS04'5HZO 0.5%. La
soluciin contenida en tubos eppendorf se mezcldi con la ayuda.
de un vortex y se dejd reposar 10 min.a t.emperatura
ambiente. Despues a los tubos se les añadib 100 1-11 de
reactivo de fenol Folin-Ciocalteus diluido 1:l con agua. Las
muestras se dejaron reposar 45 rnin. a temperatura ambiente y
despugs se determind la absorbencia a 660nm de las muestras
antes de que transcurriera 5 horas. La curva de calibracidn
se prepard con albCmina serica bovina ( 1 pg/pl) en un rango
de 5 a 50 pg de proteina.
Electrofdresis en gel de Poliacrilamida-Dodecil Sulfato de
Sodio (SDS), copolimerizado con distintos substratos.
Los homogenados de las distint3.s part.es del mosquito se
fraccionaron por electrofdresis en geles de polia.crilarnida.-
SDS (SDS-PAGE) al 10 % (Laemmli 1970) copolimerizados con
distintos sustratos (McKerrow y col 1985).
Los geles se prepararon en placas de 7.0 x 9 . 5 cm
inicialmente, pero se observd una mejor resolucidn de las
bandas en placas de 15 x 17 cm (0.75 mm de espesor), por lo
que finalmente se decidid trabajar con estas ultimas, para su
preparacidn se agregaron 20 m1 de la solucicjn del gel
separador, la cual consistib de una solucidn de acrilamida
(Bio-Rad, EU) al lo%, 0.Sg de N,N’-metilh bisacrilamida
(Bio-Rad, EU), y 0.1% de sustrato (gelatina, caseina o
hemoglobina). El gel se polimerizd mediante la adicibn de
0.05% de persulfato de amonio (Bio-rad) y 0.003% de TEMED (
Bio-Rad, EU), disueltos en trisrna base (Sigma) 0.38M, pH 8.8.
Despues de que el gel separador polimerizb, se asadid la
solucidn del gel concentrador, la cual contenia acrilamida al
4%, N;N’-rnetilen bisacrilamida al 0.36%, SDS al O. 1%,
persulfato de amonio al 0.05% y TEMED al 0.005% disue1t.o~ en
trisma base 0.125M pH 6.8. Ant.es d e que polimerizara el gel
concentrador, s e colocd el peine formador de los pozos pa.ra
las muestras. Posteriormente el gel se colocd sobre la camara
.I.. .... (.
I >
de electrofdresis ( B R L , ELJ) , se agregd a est.a el amortiguador
de corrida, la cual consistii de trisma base 0.025M y glicina
(Sigma) 0.192 M, pH 8.3 con SDS al 0.1%.
a) Geles de poliacrilamida-SDS copolimerizados con gelatina
(SDS-PAGE-GI.
Para detectar el mayor ndmero posible de prot.easas en el
estdmago del mosquito hembra An. albimanus, se utilizd como
substrato a la gelatina, debido a que estd compuesta de una
mezcla de proteinas. La gelatina (0.1%) se disolvii en la
cantidad de agua calculada para preparar el gel separador,
para lo cual se calentd el agua hasta observarse una
disolucibn completa, entonces s e dejd enfriar un poco y se
procedi6 a adicionar los elementos restantes: Mezcla
acrilamida-bisacrilamida, Tris-HC1 0.375M pH 8.8, SDS 0.1%.
El gel se polimerizd mediante la adicibn de 0.05% de
persulfato de amonio y 0.003% de TEMED . La electrofdresis se llevd a cabo manteniendo un volta.je
de 60 V (a 4"C), durante el tiempo necesario para que el
colorante marcador (Azul de bromo fenol) alcanzara. el fondo
del gel.
Despu@s de la electrofbresis, los geles se incubaron en
una solucitm de triton X-100 al 2.5%, de 30 minut.os a 1 hora,
a temperatura ambiente en agitacidn continua. Posteriormente
se decant.& la solucibn de det.ergente y los geles fueron
incubados de 12 a 16 horas a una temperatura de 37°C en
tris/HCl 20mM, EDTA 5mM, DTT 2mM a pH 7.4. Una vez terminado
este periodo, se desechb la solucidn y se procedid a teZir el
gel con azul de Coomassie al 0.05% (durante 30 minutos)
preparado en una mezcla de metanol al 50% y acid0 acetic0 al
10%. Posteriormente, el gel se destiRb con una soluciin de
metanol al 5% y acid0 acdtico al 7%. Las especies
proteoliticas se observaron como bandas claras sobre fondo
azul. (McKerrow y col. 1985)
b) Geles de poliacrilamida SDS copolimerizados con caseina
(SDS-PAGE-C).
La finalidad de observar la actividad de las enzimas sobre
un substrato de caseina, fue porque est.e subst.rato ha sido
reportado como especifico para enzimas de tipo tripsina.
El porcentaje de caseina utilizado fue de 0.1%; Dehido a
que la caselna se disuelve con pHs alcalinos, esta se
disolvid con la solucidn de t.risma base 0.38M, HCL lN, EDTA
0.2M y una solucibn 1M de NaOH, una vez disuelta la caseina
se a.justd el pH R.8-9.0 y entonces se agregd el volumen de
agua calcula.do, descontando el volumen de NaOH adicionado.
Una vez hecho esto, pueden adicionarse los demds react.ivos de
la mezcla. A part.ir de este punto se sigue el procedimiento
empleado en el inciso (a).
.. . , . . , . . .. . .: :.., ?
c ) Geles de poliacrilamida SDS copolimerixados con
hemoglobina (SDS-PAGE-HI.
El propdsito de utilizar como substrato a la hemoglobina
fue la de contar con un substrat.0 natural de las proteasas
del estdmago del mosquito, para observar su activida.d
proteol ftica.
La hemoglobina al 0.1% se disolvid solamente con agit.aciisn
en 1 a cantidad de agua calculada para e 1 ge 1 separador. Una
vez disuelta la hemoglobina se procedid a adicionar los
elementos restantes para preparar el gel, de la misma manera
en que se describe en el inciso (a).
Ensayo para actividad de proteasas en presencia de
inhibidores de proteasas y distintos pHs.
Para determinar el tipo de proteasa presente en los
estdmagos de A n . albimanus, se ut.ilizaron soluciones
amortiguadoras de incubacidn con distinto pH, a . s l como
distintos inhibidores de proteasas.
La act.ividad de proteasas fue detectada en geles SDS-PAGE-
G , una vez que ha terminado la corrida el gel es cortado en
tiras verticales de apr0ximadament.e 1.5 cm (Lo equivalente a.
dos pozos). Donde se ha colocado la misma cantidad de
protelna de extractos de moscos hembra; Cada porcidn del gel
fue lavada con el detergent.e trit.on X-100 por separado; e
incubados durante 16 a 10 horas en el amort.iguador de
incubacibn elegido para un determinado pH (tris HCl ZOmM,
EDTA 5mM, DTT 2 m M pH 7.4; Glicina NaOH pH 8.6; Glicina. HCL
pH 3 . 6 1 , a 37°C. Posteriormente los geles son teñidos con
azul de Coomasie y analizados.
Los inhibidores y la concentracidn de proteasa utilizados
fueron los siguientes: 0.lmM PMSF, 1 m M PHMB, l0OmM NEM, 10pM
E-64, 10pM leupeptin y 10pM TLCK, 10pM TPCK. Todos los
inhibidores de proteasa utilizados son adicionados desde la
solucidn de triton X-100 y posteriormente a la solucidn de
incubacibn.
Andlisis fluorogrdfico.
Para investigar cuales de las bandas encont.radas en los
estbmagos de los mosquitos hembra h. albimanus son de tipo
tripsina se utilizd el inhihidor diisopropilfluorofosfato
(DFP) marcado con tritio (3H) debido a que esta enzima posee
afinidad por las serin proteasas.
A las muestras de ext.racto crudo de est.dmagos ( 1 2 ~ 1
(0.135mg)) s e les adicionaron 4pl de 1,3(3H > DFP (1.0
mCi/rnl, O. l p ~ o l / m l ) y se les sometid a electrofdresis en
geles SDS-PAGE-G al (10 % ) . Despugs de la corrida, el gel s e
fijb por una hora en una solucibn de dcido acetic0 al 7% y
metano1 al 5%; posteriormente el gel se incubd durante dos
horas con solucidn En 3hance (New England Nuclear), despu@s
se retird esta solucidn y se le adiciond agua fria durante 15
minutos. Finalmente el gel se seed al vacio a una temperatura
de 70°C y se expuso a placas para radiografía durant.e t.res
semanas.
. . . . " .... i.6 ..' . d...
RESULTADOS
Deteccibn de la actividad proteolitica en distintas parte5
del mosquito.
La identif icacidn de las especies prot.eo1 iticas present.es
en distint.as partes del cuerpo de mosquitos hembra An.
albimanus fue realizada por SDS-PAGE-G.
Como primer paso, se realizaron electrofbresis en presencia
de 1 substra.to gelatina de extractos de est.dmagos
(prealimentados) y glhndula salival, de h. albimanus con la
finalidad de conocer y comparar los patrones proteoliticos
(figura 41, La electrofdresis se realizd en geles pequeEos
(7.0 x 8.5). La actividad proteolitica se encontrd sdlo en
los extractos de estbmagos; con un nitmero de bandas
aproximado de 7, con pesos moleculares que van >ZOO a 25 kDa.
La ausencia de actividad proteolitica en las glAndulas
salivales propicib la btlsqueda de actividad de iniciadores de
proteasas en glAndulas salivales; Para investigar e s t a
cuestidn se coincubaron extractos de estdmagos y gldndula
salival en diferentes proporciones (figura S ) , la
electrofdresis fue realizada en geles de tamaño 7.0 x 8.5 cm,
para probar si estos presuntos inhibidores a.fectan a 1a.s
proteasas presentes en estdmago. Se observd que, se presenta
el mismo patrdn de bandeo en las mezclas de gldndula saliva1
y estdmago que en el control donde solo se colocaron
extract.0~ de estbmago, Io que indica que la actividad
proteolitica de los estdmagos no se ve a.fect.ada por la
presencia del extracto de glandulas salivales.
Adicionalmente los extractos de tdrax y abdomen y los
estbmagos disectados de mosquitos hembra fueron sometidos a
electrofdresis (en geles de tamazo 15 x 17 cm, en los cuales
fue observada una mejor resolucidn de las bandas, siendo por
esta razdn empleados los geles de est.e tamazo en los
experimentos subsecuentes) para comparar su pa.trdn
proteolitico; se observd ( figura 6 ) que el nCunero de
bandas encontrado fue de alrededor de 9, los pesos
moleculares encontrados van de >200 a 25 kDa; La act.ivida.d
proteolitica es mds intensa. en rnoscos completos (abdomen y
tbrax), que en estdrnagos disectados, aunque al parecer es el
mismo patrdn de bandeo. En los extractos de tbrax no s e
observa actividad proteolitica (datos no most.rados en esta
figura); al parecer la actividad proteolitica corresponde en
su mayor parte al est.dmago, sin embargo, faltaria verificar
si los restos del abdomen cuando e s disectado el estdmago
presentan actividad proteolitica.
Por otra part.e, se analizaron extractos de tbrax, abdomen,
y estbmagos disectados, uti 1 izando como subst.rat.o caseina,
obteniendose bdsicamente los mismos resultados. (Fig 7 )
Figura 4. Deteccidn de la actividad de proteasas en
estdmago y gldndula salival.
Extractos de protefnas de estbmago y gldndula salival,
preparados como se describid en material y mgtodos se
corrieron en SDS-PAGE-G ( 10%). El gel se tiñb con azul de
Coomasie, de acuerdo a las condiciones descritas en
materiales y mktodos. Carril 1- 0.13 pg de extracto de
estbmagos, carril 2 - 0.8 pg de extracto de estbma.gos; ca.rri1
3- 0.13 pg del extracto de gldndula salival, carril 4- 0.8 pg
del extracto de gldndula salival.
M.W. kDs 1 2 3 4
200
97
68
43
29
... ̂ . i! i::., . ....
Figura 5. Coincubacibn de glhdulati salivales y estdmagos
de A n . al bimanus.
Extractos de glrinndulas salivales y estdmagos de mosquitos
hembra se analizaron, independientemente o mezclados, por
medio de SDS-PAGE-G (10%); Teñido con azul de Coomassie, de
acuerdo a las condiciones descrit.as en materiales y metodos.
1 - proporcidn 1:0 (0.13 pg de gldndulas salivales y O pg de
estdmagos), 2 - proporcidn 0:l ( 0 pg de glAndulas salivales y
O. 13 p g de estdmagos), 3 - proporcidn 1:2 O. 1 3 pg de
gldndulas salivales y 0.26 pg de est.bmagos>, 4 - proporcidn
2:l ( 0.26 pg de glAndulas salivales y 0.13 pg de estbmagos),
5 - proporcibn 1:l (0.13 pg de gldndulas salivales y 0.13 pig
de estbmagos).
M.W. kDa 1 2 3 4 5
200
97
68
43
29
Figura 6. Deteccibn de la actividad de proteasas en
estdmagos disectados y mosquitos hembra completos.
Las proteinas se analizaron por medio de SDS-PAGE-G (10%);
Teñido con azul de Coomassie. 1 y 2. Extracto de estbma.go
(2.0 p g > ; 3 y 4. Extracto de moscos hembra completos (2.0
.ug) *
M.W. kD a
200
97
68
43
29
1 2 3 4
Figura 7. Deteccidn de la actividad proteolitica en tbrax.
abdomen, moscos completos y estdmagos disectados.
E x t r a c t o s d e moscos hembra d e l tdrax , abdomen, rno5cos
completos ( tbrax y abdomen) y esttjmagos d isec tados fuermn
sometidos a SDS-PAGE-C. La t i n c i d n se rea , l izd c o n azul d e
Coornasie. C a r r i l 1 a 3 , e x t . r a c t . 0 ~ de t b r a . x ; c a r r i l 4 a ‘I,
abdornenes de moscos; c a r r i l 7 a 9 , rnoscos complet .os ; carr i l
1 0 a. 1 1 , estdimagos disect.ados. La ca.ntida.d d e protefna.
colocada por c a r r i l fue de 0 . 1 3 pg.
M.W. kDa
1 2 3 4 5 6 200
97
68
43
29
7 8 9 10 11
Andlisis comparativo de la actividad proteolitica en
machos y hembras.
Dado que los moscos machos no se alimentan con sangre, se
decidid comparar la a.ctividad proteolit.ica de los est.dmagos
en ambos sexos. Para lo cual se realiza.ron SDS-PAGE-G. ( F i g
8 ) . En ambos sexos se encontraron bandas con pesos
mo leculares de >200 a 25 kDa. En los moscos hembras 1 a.
actividad proteolltica es mds intensa sobre todo en la regidn
de 60 kDa y se presenta una banda. de 42 kDa que no se
presenta en machos. En los moscos machos se present.a una
banda especifica de aproximadamente 49 kDa.
Figura 8. Corparacibn de la actividad proteolitica en
MOSCOS machos y hembras.
Extractos de estdmagos de moscos machos y hembras fueron
sometidos a SDS-PAGE-C. La tincidn fue realizada con azul de
Coornasie. Carril 1 y 2, extracto de estbmagos de moscos
machos; Carril 3 y 4, extracto de estdmagos de rnoscos hembra.
La cantidad de proteina colocada por carril fue de 0.13 pg.
M.W. kDa 1 2 3 4
200
97
68
43
29
..... . I...., '8 . I . .... ..
Identificacidn del tipo de proteasa ( S ) .
Para investigar el t.ipo de proteasa presente en los
extractos de los estdmagos de los mosquitos hembra se llevo
a cabo un SDS-PAGE-G incubando las reacciones con diferentes
inhibidores de proteasas, y a dos val ores de pH de
incubacidn pH 6.0 y 7.4, (figura 9). Los patrones
proteoliticos obtenidos para el control sin inhibidores a pH
6.0 mostraron 9 bandas, con pesos moleculares de >200, 200,
68, 60, 42, 32, 31, 30, y 25 kDa.
En el aphdice I se describen las caracteristicas de los
inhibidores utilizados.
Con respect.0 al control, el TLCK a pH 6.0 inhibe las
bandas; con pesos moleculares de 68, 60, 42, y 25 kDa.
Mientras que a pH 7.4 solo se inhibe a las bandas con pesos
moleculares 68, 30, y 25. Por lo que se sugiere que son serin
proteasas.
El leupeptin a pH 6.0 suprimid completamente las bandas
con pesos moleculares de >200, 68, 60, 42, 32, 31, y 25.
Con el inhibidor E-64 a pH 6.0, se inhiben las bandas con
pesos moleculares 68, 60, 42, y 25, mientras que e5t.e mismo
inhibidor a pH 7.4 afecta solo un poco a las bandas de pesos
moleculares 68, 60, 30 y 25.
"
Esto podria indicar que algunas de 1a.s prot.easas s o n
cisteina proteasas, sin embargo, habrfa que plantear la
posibilidad de que algunos inhibidores son menos especificos
para determinadas proteasas, o bien que la concentracidn
utilizada no fue a.propiada. En la tabla I se resume el
efecto de los inhibidores sobre las prot.easas, en varios
experimentos realizados.
BANDA No.
TABLA No. 1 EFECTO DE LOS INHIBIDORES UTILIZADOS SOBRE LAS PROTEASAS
DEL ESTOHAGO DE h. albimanus.
PESO HOLECULAR
)200
200
68
60
42
32
31
30
25
CONTROL
PH 7.4 6.0 "
TLCK
PH 7.4 6.0 " I
LEUPEPT IN
PH 7.4 6.0 " I
E-64
PH 7.4 6.0 " I
TPCK
PH 7.4
t
t
-
t
t
t
t
t
t
I PH 7.4
t
t
t
t
t
I PHENANTROL I NA PH
7.4
t
t
t
t
t
t
t
t
( + I = No se inhibe (-1 = Sufre inhibicibn
........ ~
s...i . . .. . . . . . .. .
Figura 9. Identificacibn del tipo de proteasas.
Extractos de moscos hembra completos fueron somet.idos a SDS-
PAGE-G (al 10 %). La tincibn s e realizd con azul de
Coomassie. Carril 1 y 2 extract.0 de mosquitos hembra
incubados en amort.iguador de citrato a pH 6.0 , Carril 3 y 4
extracto de mosquitos hembra con TLCK (10 p M > e incubado con
amortiguador de citrato a pH 6.0 : Carril 5 y 6 extracto de
mosquitos hembra con el inhibidor leupeptin (10 JJM) e
incubado con amortiguador de citrato a pH 6.0 ; Carril 7 y f3
extractos de moscos hembra con el inhibidor E-64 ( 1 0 pM) e
incubado con amortiguador de citrato a pH 6.0 ; Carril 9 y 10
extractos de moscos hembra con el inhibidor TLCK (10 JIM) e
incubado con el inhibidor tris/HCl, EDTA, DTT pH 7.4; Carril
11 y 12 extractos de moscos hembra con el inhibidor E-64 (10
JJM) e incubados con el amortiguador t.ris/HCl, EDTA, DTT pH
7.4.
M.W. kDa
200
97
68
43
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2
29
Cin&tica de aparicidn de las proteasas inducidas por una alimentacidn con sangre.
Para est.udiar que es lo que ocurre con las proteasas en los
estdmagos de mosquitos hembra; durante y despues de una
alimentacidn con sangre, se obtuvieron extractos de estdmagos
y / o abdomenes de mosquitos hembra An. albirnanus a diferentes
tiempos de postalimentacidn (hp) ( O a 8 ) . Los ext.ractos
obtenidos de las diferentes horas fueron sometidos a
electrofdresis en geles de poliacrilamida al 10%
copolimerizados con 3 diferentes substratos: caseina,
gelatina, hemoglobina, en una concentracibn del 0.1%.
Con el substrato de gelatina se observd (figura lo), que a
las 0 y 1 hp aparecen 9 bandas con pesos moleculares de 68,
6 0 , 5 5 , 50, 42, 34, 32, 31, 25, kDa. A las 3 hp se induce una
banda con peso molecular de 60 kDa y se mantiene hasta las 8.
A part.ir de las 4hp se induce una nueva banda con peso
mo 1 ecul ar de 55 kDa que permanece hasta las 8 horas. Y 1a.s
bandas con pesos moleculares de >200, 170, 142 y 25 kDa que
no t.enian act.ividad desde las cero horas, presentan gran
incremento en la actividad de gelatinasa a las 5 hp.
Un resumen del numero de bandas encontra.das con ca,da
substsato, su peso molecular e inducibilidad en el substrat.0
puede verse en la tabla no. 11.
1 ; i:: .. .. -. .
La cingtica de aparicidn de proteasas capa.ces de digerir
al subst.rat.o de caseina (figura 1 1 1 mostrtr que durant.e 1a.s
primeras cuatro horas, cuat.ro bandas con pesos molecula.res de
147, 50, 42, 36, 3 1 y 25 kDa tienen actividad de caseinas. A
partir de las cinco horas de postalimentacidn se observa
mayor induccidn de estas bandas.
La cinetica de aparicien de proteasas encontrada. al
est.udiar el proceso con el substrato hemoglobina mostrd que
(figura 12) a partir de las 5 hora.5 se inducen cua.tro banda.s
con pesos moleculares de 170, 50, 40 y 25 kDa. Una. de las
bandas con p e s o molecular de 28 kDa, observa una. mayor
actividad de hemoglobina a partir de las 5 horas.
TABLA No. I I PROTEASAS ENCONTRADAS EN CADA SUBSTRATO E INDUCIBILIDAD EN EL HlSHO.
L
PESO HOLECULAR
> 200
170
147
142
68
60
55
50
42
40
36
32
31
25
GELAT I NA
t
t
SUBSTRATO
CASE I NA HEHOGLOB INA
( * ) = lnducibilidad en el substrato ( + I = Se encuentra presente
.. . .. , s . .. .,.. . .
M .w. kDa
200
97
68
43
29
1 2 3 4 5 6 7 8
.... .. .... .... . ... , )..
Figura 11. Cinetica de aparicidn de proteasas utilizando
como substrato caseina.
Extractos de estdmagos de mosquitos hembra disect.ad0.s a
distintas hp ( O a El horas) se analizaron por SDS-PAGE-C (al
10%). La cant.ida.d de protefna colocada. por carril fue de O. 12
.pg. C.arri 1 1 extracto de O hp, carril 2 - 1 hp, carril 3 - 2
hp. carril 4 - 3 hp, carri 1 5 - 4 hp, carri 1 6 - 5 hp,
carril 7 - 6 hp, carri 1 8 - 7 hp, carril 9 - 8 hp.
M .w kD a 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0
/.. . . ... . . , .. . ..
M.W. kD a
200
97
68
43
29
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0
IdentificaciQn de proteasas tipo "tripsina",
Para investigar cuales de las bandas de actividad
corresponden a prot.easas t.ipo tripsina, se utilizd al
inhibidor DFP marcado con tritio, el cual ha sido emplea.do
para reconocer las bandas relacionadas con est.a enzima debido
a su afinidad por las serin proteasas en general y en
particular por tripsina. Se utilizaron los extractos de
est.Qmago de mosquitos hembra A n . albimanus de dist.intas hp
( O a 36 horas); y se analizaron por SDS-PAGE-G en geles a.1
10% (figura 13). El nimero de bandas reconocidas por el
inhibidor DFP a las O hp fue de 5 con pesos moleculares de
142, 98, 69, 31 kDa. A las 12 hp aparecieron bandas con peso
molecular de 194, 47 y 26 kDa. A las 30 hp Las bandas de peso
molecular de 1 4 2 , 98 Y 69 kDa aparecen. Mientras que la banda
con un peso molecular de 31 kDa s e encuentra presente desde
las cero horas pero incrementa su intensidad a partir de las
1 2 hp. IJna. banda con un peso molecular de 25 kDa s e induce a
las 5 hp permaneciendo hasta las 36 horas.
. . . .. .. .... ,
Figura 13. Identificacibn de las proteasas tipo "tripsina".
Extractos de estima.gos de mosquitos hembra disect.ados a
distintas hp (0 a 38) fueron sometidas a SDS-PAGE-G (al 10%);
Previamente a los extractos de estbma.go (0.13 p g ) s e ] e s
adicioni 4 pl de 1,3 ( 3 H ! DFP ( . í . O mCi/ml, 0.1 pnol/ml). Una
vez t.ermina.da la corrida, el gel f u e t.rat.ado para
f luorograf fa de acuerdo a como se describe en mat.eria.]es y
m&todos. Carril 1 - Ohp, carril 2 - lhp, carri 1 3 - Zhp,
carril 4 - 3hp, carri 1 5 - 4hp, carril 6 - 5hp, carri 1 7 -
6hp, carril 8 - 7 h p , carril 3 - 8hp, carri 1 1 0 - 12hp, carri 1
11 - 18hp, carril 1 2 - 24hp, carri 1 1 3 - 30hp, carril 14 -
36hp, carril 15- tripsina bovina.
M.W. kDa
200 97
68
43
29
18
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 1 3 1 4 15
.... L..> _L.
D 1 SCUS I ON
Caracterizacihn de las proteasas presentes en A n . albimanus.
La tgcnica de electrofdresis en geles de
poliacrilamida-SDS, copolimerizado con substrato permit.e
identificar numerosas enzimas (incluyendo a.mi lasas,
deshidrogenasas y proteasas); gracias a que estas pueden ser
renaturalizadas in situ despues de la elect-rofbresis. La
actividad enzimdtica. e5 detecta.da. in situ por la a.ccihn de
las enzimas sobre el substrato introducido en el gel, de tal
manera que la deteccidn de las proteinas s e realiza p o r su
actividad enzimatica despu4s de haberse separado en la
electrofdresis. (Lacks and Sanford 1980)
Briegel H. (1975>, Graf ( 1 9 8 2 ) , Billingsley (19911 entre
otros, han reportado que en estrfrmagos de mosquitos de las
especies e. aegipty y &-J. stephensi solo hay actividad de
tripsina, quimiotripsina y aminopeptidasa, despues de una
alimentacidn con sangre. Por lo que en est.e trabajo se
consider& adecuado limitarse al estudio de estas prnt.easas,
enfocandose principalmente a proteasas tipo "tripsina". La
identificacidn de las proteasas s e bas6 sobre todo atendiendo
al p e s o molecular report.a.do, a la uti1 izacidn de inhibidores
y a la ut.ilizacidn de substratos especificos como la caseina,
que f u e utilizada para detect.ar proteasas de tipo "tripsina"
y a substratos como la hemoglobina que fue empleada como
:... . i..i ...
suhstrato natural de las proteasas del estdmago del mosquito.
La gelatina fue utilizada como substrat.0, porque est.a.
compuesta de una gran varieda.d de proteinas, y de esta. forma.
se esperaba que mostrara la actividad de la mayor parte de
las proteasas. La posibilidad de que se present.aran proteasas
de la sangre de conejo, se descartd al introducir comc
control, en la cinetica de a.paricidn de prot.easas, sa.ngre de
conejo. De esta forma nos fue posible obtener los pa.trones
proteoliticos de h. albimanus.
Relacidn de la actividad proteolitica con el estdmago
del mosquito..
A l analizar, por medio de la t.&cnica de SDS-PAGE
copolimerizado con substrato, la actividad proteolitica de
las glandulas salivales, est.dmagos disectados y t.drax de
mosquitos hembra de A n . albimanus, se logrd det.ectar la
actividad sdlo en el estbmago del mosquito. Estos result.a.dos
coinciden con lo report.ado por Kunz (1978bI; por lo qlue s e
decidid no hacer un andlisis exhaustivo. Por otra part.e, este
autor describid la. presencia de 8 proteinas en &. aegypti
hembra alimentadas; l o s pesos moleculares que reportcj se
encuentran en un rango de 22 a 25 kDa. En est.e trabsjo s e
encontraron, en mosquitos &. a.lbimanus hembra al imentadas
con sangre de conejo, 6 bandas cuando se utiliza como
substrato caseina y / o hemoglobina; con pesos moleculares
desde >lo0 kDa a pesos de 25 kDa. Mientras que cuando s e
utilizd como substrato a la gelat.ina se encontraron 11
proteinas con un rango de pesos moleculares >200 kDa a pesos
de 25 kDa (a partir de las 4 hp).
El ntSrmero de proteinas encontradas en estdmagos de
mosquitos hembra prealimentados utilizando como substrato a.
la gelatina es de 8, mient.ras que en los subst.ra.t.0~ de
hemoglobina y caseina es de 6 ; con un rango de peso molecular
de 5 0 a 25 kDa.
Por otra parte, en el andlisis comparativo de Ia act.ividad
proteolitica en machos y hembras, s e encontrb que en machos
existe una proteasa especifica d e 49 kDa. Mientras que en
hembras existe tambien una proteasa de 42 kDa que no est.a
presente en machos; observandose ademds que las bandas de 81
y 58 kDa presentan una actividad proteolitica mas intensa con
respecto a los machos.
Tipo de proteasas presentes en el estbmago de An. albimanus.
L o s inhibidores DFP, TLCK, y PMSF son considerados
inhibidores especificos para proteasas tipo "tripsina." por
algunos autores (Earil las 1992; Graf 19851. Por lo que en la
identificacidn del tipo de proteasa estos son generalmente
: L . . ,:. E:: ...
empleados. Por est.os motivos, en este trabajo se usaron estos
inhibidores para tratar de identificar a las prot.easas tipo
"tripsina".
Se observd que el leupeptin inhibib actividad de un nthnero
mayor de proteasas >200, 68, 60, 42, 32, 31 y 25 kDa; que
los inhibidores TLCK y PMSF. El TLCK, Leupeptin y PMSF
inhiben las bandas de 30 y 25 kDa a pH 7.4. Estos result.ados
indican que estas handas corresponden a serin proteasas. Por
otra parte es muy claro el efecto del pH sobre la a.cci6n de
los inhibidores.
La banda de PM de 200 kDa, no se ve afectada por los
inhibidores utilizados, se cree, que de acuerdo a su PM
podria trat.arse de una aminopeptidasa ya que est.e peso es
similar al reportado por autores como, Ferreira y Terra.
( 1 9 8 5 ) , para las aminopeptidasas encontradas en el estdmago
de insectos como: Rhvnchosciara Americana. Sin embargo en un
experimento preliminar con el inhibidor fenantrolina (que es
considerado especifico para aminopeptidasas) no se observd
inhibicidn de esta banda; probablemente 1a.s condiciones en
las que se trabajd con este inhibidor no fueron 1a.s
adecuadas, por lo que se debera modificar estas condiciones
para descartar la posibilidad de que esta banda de 200 kDa no
corresponda a una proteasa tipo aminopeptidasa. Otra posible
explicacidn es que la aminopeptidasa, no t.iene una acciin t.an
drdstica sobre el substrato en comparacidn con la tripsina,
debido a. que la a.minopeptidasa corta sdlo los extremos de la
cadena pept.Sdica, por lo que la degra.da.cidn del subst.ra.to e s
mbs lenta dando como resultado que la actividad de la
aminopeptidasa no sera observada en el mismo periodo de
incubacidn que tiene la tripsina con el substrato.
Inducibilidad de proteasas por una alimentacibn con sangre.
En la identificacidn de las prot.ea.sas tipo "t.ripsina."
durante una cingtica de alimentacidn con sangre de conejo,
utilizando DFP tritiado, s e observa un grupo con a.ct.ividad
proteolitica, en la regidn de 30 y 25 kDa que pueden
corresponder a las tripsinas t.empranas y ta.rdias propuesta.s
por Barillas (19921, observdndose con el marca.je radiactivo
que la banda de 30 kDa esta presente desde las cero h o r a s ,
pero su actividad incrementa a partir de 1a.s 5 hp. mi entra.^
que el marcaje radiactivo de la banda de 25 kDa s e observa a
partir de las 5 h0ra.s pero incrementa not.ab1ement.e a las 12
horas. Est.os dat.os correla.cionan con lo encontrado en los
substratos de caseina Y hemoglobina; pero tal pa.rece que la
banda de 30 kDa corresponde a la de 31 k D a en los substratos
de gelat.ina y caseina; sin embargo esta banda presenta,
inducibilidad en el substrat.0 de caseina, mientras que la.
banda de 25 kDa es inducida a las 5 h p en el subst.rato de
hemoglobina. En el substrato de gelatina solo presenta
inducibilidad la banda de 25 kDa; y la ba.nda de 31 kda migra
junto con dos proteasas de PM 34 y 32 kPa. P o r o t ra . parte
analizado el patrdn de inhibicidn para las bandas de peso
molecular de 31 y 25 kDa encont.ramos que estas pueden ser
inhibidas por TLCK y PMSF, por lo que podrian corresponder a
las bandas marcadas con DFP en este mismo peso;
considerdndose por la accidn de estos inhibidores como serin
proteasas, esto apoyaria mds el hecho de que estas pudieran
ser las tripsinas tempranas y tardias proFuest.as por Ea.ril1a.s
(1992).
Por ot.ra parte, en la fluorografia se introdujo como
control un carril con una preparacibn de tripsina bovina tipo
I 1 1 (sigma). Esta preparacibn mostrd varias actividades
proteoliticas sobre gelatina, pero el marcaje con DFP fue
especifico marcandose una sola ba.nda que t.iene un peso
molecular aproximado de 31 kPa. AdemBs nosotros observa.mos
que con el DFP se marcan tambign las prot.easas de mas alto
peso molecular (>200, 142, 98 y 6 8 ) , lo cual nos indica que
tambien 5on serin proteasas. Por lo tanto habria que
corroborar, en ot.ros estudios, si estas prot.easas de m&s
alto peso molecular son las mismas "trip5inas" de bajo p e s o
molecular asociadas entre si o a otras molgcul J.S o , a
estructuras de membrana. Las handas de >200 y 68 kDa sc?lo
tienen actividad de gelatinasa, la de 142 kDa t.iene actividad
en los tres substratos utilizados, la de 47 kDa solo tiene
actividad de hemoglobinasa y la de 98 kDa es inactiva.
La caracterizaci4n general de las prnteasas presentes en los
estbmagos de los mosquitos hembra An. aIbimanus es importa-nte
porque esta especie es una de las mas importantes
transmisores de malaria en Mgxico. Y actua1ment.e todos Ins
estudios realizados sobre malaria se hacen en especies d e
mosquito como: Ax. aegipty y m. stephensi principalmente; que aunque tambign son vectnres de la mala.ria, son endt3micos
en varias zonas de Africa.
CONCLUSlONES
Las conclusiones de este trabajo son:
1. La actividad proteolitica presente en An. albimanus
corresponde en su mayor parte al estdmago del mosquito.
2. La mayoria de las proteasas encontradas son serin
proteasas, muy probablemente, tipo "tripsina".
3. Existe una proteasa especifica de hembras de 43 kDa;
y una proteasa especifica de machos de 49 kDa.
4. La actividad proteolitica total en hembras e s
inducida Por una alimentacidn con sangre;
Encontrandose tres regiones de mayor actividad, una
alrededor de la regi6n de 200, 68 y 30 kDa; con
diferente especificidad de substrato.
5. Las proteasas de 31 y 25 kDa probablemente
corresponden con las "tripsinas" tempranas y tardias.
6. Las tripsinas tempranas presentan actividad proteolitica
desde las cero hp, mientras que las tripsinas tardias
muestran actividad desde las 5 hp, siendo mas notable
a partir de las 12 hp.
7. Mediante la metodologia utilizada es posible detectar
actividad proteolitica desde las O hp.
PERSPECTIVAS
Una caracterizacidn mas completa de las protea.sas presentes
en m. albimanus requiere de estudios mds extensos, ya que lo realizado hasta aquf, solo es el inicio de una identificacibn
definitiva. P o r ejemplo, falta verificar si las protea.sas de
mds alto peso molecular observadas en este t r a b a . j o
corresponden a la unidn de las "t.ripsinas" a moleculas o
estructuras de membrana, o bien corresponden a o t r o t.ipo de
de proteasas.
La aplicacidn a futuro, teniendo ya una identificacibn mas
precisa, esta encaminada a det.erminar los elementos
regulatorios de la expresidn gen@tica de la(s) proteasa(s>
tipo "t-ripsina", que son inducidas durante una alimentacibn
con sangre debido a que se ha observado que #st.as estdn
relacionadas con la resistencia de los mosquit.os a el
pars.sito Plasmodium. Est.0 e s con el fin de t.ener las
herramientas que permitan introducir genes y regular su
expresidn en los mosquitos trAnsgenicos, construidos pa.ra
bloquear el ciclo de transmisidn de los pardsitus; ya. que
modificando la expresidn genetica de estas proteasas, se
lograra que los mosquit.os sean resistentes a los p a r d s i t . o s
y al mismo tiempo malos transmisores de los mismos.
Apendice 1. CARACTERISTICAS DE LOS INHIBIDORES UTILIZADOS.
INHIBIDOR ESPEC I F 1 C I DAD DE CONCENTRAC 1 ON NOTAS INHIBIDOR EFECT 1 VA
TLCK lnhibe irreversible y 10 -100 JIM Estable a 25'C, pH5 6.0 especificamente a trip- Vida oedia 5'. s ina
TPCK lnhibe irreversibleoente 10 - 100 p l No inhibe a tripsina.
PNSF lnhibe serin proteasas 0.1 - 1 dl Reversible por trata- (quimiotripsina, tripsina sientos con DTT. y trombina). Vida media en solucibn
ouy corta.
LEUPEPTIN Inhibe serin y thiol (SH) 10 - 100 jltl
EDTA lnhibe a metaloproteasas 1 - 10 BN
E-64 Inhibidor irreversible de 1 - 10 JIM Estable a pHs 2 a 10 cistein proteasas.
PHENANTROLINA Inhibidor reversible de 1 - 10 flN metaloproteasas.
DFP Inhibidor de tripsina 0.1 an Muy tbrico
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