In-vitro Callus Propagation and Secondary Metabolite Quantification in Sericostoma pauciflorum

KULTUR JARINGANTUGAS PRODUKSI DAN STANDARISASI BAHAN ALAMOLEH :YOSSI FITRIANTI S.FARM, APT1421012009PROGRAM PASCASARJANAFAKULTAS FARMASI UNIV. ANDALAS

Teknik bagaimana mengisolasi bagian-bagian tanaman (organ, sel, polen, protoplasma dll) ditumbuhkan secara tersendiri, dipacu untuk memperbanyak diri, akhirnya diregenerasikan kembali menjadi tanaman lengkap dalam suatu lingkungan yang aseptik dan terkendali.PENGERTIAN

KJTMencakup berbagai ilmu, budidaya pertanian, biologi murni, in vitro (budidaya) in vivo (alamiah) difarmasi.Tanaman adalah sumber senyawa obat. Dimana metabolit sekunder dari tanaman tersebut dapat berfungsi sebagai obat dan racunTujuan untuk menghasilkan tanaman yang sangat berkualitas dan berkuantitas.Sehingga disitu org farmasi dapat memperoleh senyawa aktif yang banyak dan baik, yang dapat dijadikan senyawa obat.

Cara KerjaPembuatan mediaInisiasiSterilisasi MultiplikasiPengakaran aklimatisasiTeknik kultur jaringan adalah mengisolasi bagian tanaman (minimal satu sel)Sel yang diisolasi ditumbuhkan dalam media buatan secara aseptis atau bebas hama.Media diisi dengan nutrisi yang lengkap (semua nutrisi yang diperlukan buat perkembangan sel ) beserta dengan hormonDikerjakan dalam wadah yang tertutup, butuh SM, tembus cahaya.Sehinga sel tanaman tadi dpt memperbanyak dirinya, regenerasi, menjadi tanaman yang lengkap

Kultur jaringanKEUNTUNGAN 1.Bibit (hasil) yang didapat berjumlah banyak dan dalam waktu yang singkat2.Sifat identik dengan induk3.Dapat diperoleh sifat-sifat yang dikehendaki4.Metabolit sekunder tanaman segera didapat tanpa perlu menunggu tanaman dewasaKEKURANGAN Bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap hama penyakit dan udara luarBagi orang tertentu, cara kultur jaringan dinilai mahal dan sulit.Membutuhkan modal ivestasi awal yang tinggi untuk bangunan (laboratorium khusus), peralatan dan perlengkapan.Diperlukan persiapan SDM yang handal untuk mengerjakan perbanyakan kultur jaringan agar dapat memperoleh hasil yg memuaskanProduk kultur jaringan pd akarnya kurang kokoh

KULTUR JARINGANTUGAS PRODUKSI DAN STANDARISASI BAHAN ALAMOLEH :YOSSI FITRIANTI S.FARM, APT1421012009PROGRAM PASCASARJANAFAKULTAS FARMASI UNIV. ANDALAS

KULTUR KALUS

Kultur kalus teknik budidaya kalus tanaman dlm suatu lingkungan terkendali dan dalam keadaan aseptis atau bebas mikroorganismeKALUSSuatu jaringan yg tersusun oleh sel-sel terdediferensiasi yg umumnya dihasilkan oleh jaringan yg luka atau kultur jaringan pada media yang berisi auxin tttPertumbuhan aktif massa sel yg belum & terdiferensiasi dan tidak terorganisir yg berkembang dari jaringan luka atau kultur jaringan yg ditanam pada media dengan tambahan zat pengatur tumbuhMemperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi dan ditumbuhkan dlm lingkungan terkendali diharapkan mampu memperbanyak diri secara terus-menerusMenjamin kesinambungan kerja kulturMeningkatkan jumlah kalus untuk produksi/ perbanyakanSarana bank plasma nutfah yang efisienDapat digunakan utk tujuan produksi metabolit sekunderTUJUANTekstur kalusRemah (friable) kalus yang tumbuh terpisah-pisah mjd fragmen-fragmen yg kecilKeras dan kompak kalus mengalami pembentukan lignifikasi

KompakRemah13Warna kalusWarna kalus dapat bermacam-macam warna kekuning-kuningan, putih, hijau, kuning kejingga-jingaan (karena adanya pigmen antosianin ini terdapat pada kalus kortek umbi wortel).

14

15Berdasarkan kebutuhan ZPT untuk membentuk kalus, jaringan tanaman digolongkan dlm 4 grup :Jaringan tanaman yg membutuhkan hanya auksin selain gula & garam mineral utk dpt membentuk kalus. Seperti : umbi artichokeJaringan yg memerlukan auksin & sitokinin selain gula dan garam mineral. spt: empulur tembakau.Jaringan yg tidak perlu auksin dan sitokinin, hanya gula dan garam mineral spt: jaringan kambium.Jaringan yg membutuhkan hanya sitokinin, gula, dan garam-garam mineral seperti parenkhima xylem dari akar turnip.

Pada umumnya, kemampuan pembentukan kalus dari jaringan tergantung juga dari : Umur fisiologi dari jaringan waktu diisolasi Musim pada waktu bahan tanaman diisolasi Bagian tanaman yang dipakai Jenis tanaman.Inisiasi pembelahan sel yang hanya terbatas di lapisan luar dari jaringan, menurut Yeoman (1970) kemungkinan disebabkan oleh faktor-faktor :1. Ketersediaan oksigen yang lebih tinggi2. Keluarnya gas CO23. Kesediaan hara yang lebih banyak4. Penghambat yg bersifat folatik lebih cepat menguap5. CahayaSel-sel yg heterogen selain berasal dari materi asalnya, dpt jg tjd akibat masa kultur yg panjang melalui subkultur berkali-kali. Perubahan yg terjadi, dapat merupakan : Aberasi kromosom Mutasi gen Endoreduplikasi yang menghasilkan poliploidi Transposisi urutan DNA (DNA sequences transposition)Amplifikasi gen : Jumlah gen untuk suatu sifat ttt per genome haploid bertambahHilangnya suatu gen (deletion).

In-vitro Callus Propagation and Secondary Metabolite Quantification in Sericostoma pauciflorum

Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2012)AbstrakSericostoma pauciflorum (Fam. Boraginaceae) digunakan sebagai obat kanker, diabetes, dan menjaga kesehatan. Kultur kalus berasal dari eksplan batang dan dikultur pada medium Murashige dan Skoog (MS) konsentrasi 1,5 mg / L dengan hormon pertumbuhan yang berbeda-beda yaitu kinetin (Kn), indole 3-acetic acid (IAA) dan indole 3-butyric acid (IBA). Pada usia 6 minggu, kalus tersebut dipanen, dikeringkan dan diekstraksi menggunakan petrolium eter, metanol dan air. Ekstrak dikeringkan, ditimbang (%) dan dianalisis untuk melihat bioefficacy-nya. Di antara semua ekstrak uji, ekstrak kalus batang yang tumbuh dengan IBA ditemukan lebih efektif pada ekstrak petrolium eter menunjukkan aktivitas terhadap bakteri uji dan jamur (S. aureus- IZ 14,00 0,57 mm dan T. rubrum- 16,33 0,32 mm), diikuti oleh ekstrak metanol (S. aureus- IZ 13,00 0,57 mm, A. niger dan P. chrysogenum- IZ 16,66 mm ). Potensi antioksidan, semua ekstrak lebih aktif dengan ekstrak IBA dan Kn yang menunjukkan nilai IC50 pada 0,06 mg / mL (% inhibisi 93,30 dan 92,70 masing-masing pada konsentrasi 0,8 mg / mL) dengan 366 6.69 dan 343 3,34 setara dgn potensi antioksidan asam askorbat 1 mg / mL. Selain itu, profil kimia ekstrak uji dilakukan. 21Abstrak....Aktifitas antimikroba diuji menggunakan metode difusi agar dan potensi antioksidan diuji dengan metode DPPH dan FRAP. Metabolit sekunder bioaktif, -sitosterol dan asam caffeat diisolasi dari kultur jaringan kalus berumur 6 minggu, dan dilakukan identifikasi dan konfirmasi dengan reaksi warna, TLC dan spektrum IRDi antara semua ekstrak uji, ekstrak kalus batang yang tumbuh dengan IBA ditemukan lebih efektif pada ekstrak petrolium eter menunjukkan aktivitas terhadap bakteri uji dan jamur (S. aureus- IZ 14,00 0,57 mm dan T. rubrum- 16,33 0,32 mm), diikuti oleh ekstrak metanol (S. aureus- IZ 13,00 0,57 mm, A. niger dan P. chrysogenum- IZ 16,66 mm ). Potensi antioksidan, semua ekstrak lebih aktif dengan ekstrak IBA dan Kn yang menunjukkan nilai IC50 pada 0,06 mg / mL (% inhibisi 93,30 dan 92,70 masing-masing pada konsentrasi 0,8 mg / mL) dengan 366 6.69 dan 343 3,34 setara dgn potensi antioksidan asam askorbat 1 mg / mL. Selain itu, profil kimia ekstrak uji dilakukan. 22Sericostoma pauciflorum dikenal juga dengan karvas merupakan tanaman yang dapat bertahan hidup pada lingkungan yang sedikit air, tumbuh terurai pendek di bawah-semak, secara luas ditemukan diseluruh pantai laut Saurashtra dan Maharashtra dan digunakan dalam pembuatan obat di Ayurveda dikenal "Krishnavalli", yang digunakan untuk mengobati kanker, diabetes, dehidrasi, kelebihan asam dan menjaga kesehatan.Mengandung metabolit sekunder yaitu, -sitosterol, leupeol, -Amirin, -Amirin, pauciflorinyl asetat, pauciflorol asetat dan sericostinyl asetat yang dikenal berkhasiat sebagai anti-inflamasi, antikanker, antibakteri dan antioksidan.Penelitian ini bertujuan membandingkan efek dari hormon pertumbuhan yang berbeda terhadap produksi metabolit sekunder (antioksidan dan antimikroba). A xerophyte is a species of plant that has adapted to survive in an environment with little water23EXPERIMENTALSemua bahan kimia dan pelarut yang digunakan : analytical grade dari HiMedia Chemicals Mumbai, IndiaBahan TanamanTanaman S. pauciflorum dikumpulkan dari ladang lokal Jaipur selama bulan Juli-Oktober, 2008. Identitas botani dilakukan di Herbarium, Departemen Botani, Universitas Rajasthan, Jaipur. Pembiakan kultur selEksplan batang yang dipotong dari tanaman muda, dicuci di bawah air mengalir selama 30 menit, dipotong menjadi potongan-potongan kecil dan kemudian dicuci dengan deterjen 2% selama 5 menit. Permukaan didesinfeksi dengan merkuri klorida (0,1% selama 4 menit) dan dicuci dengan air suling steril selama 5 menit.

Stek batang dikultur pada media MS yang terdiri dari : garam basal dan vitamin dengan 3% b / v sukrosa dan 0,8% agarDilengkapi dengan pengatur tumbuh : Indole-3-acetic acid (IAA), Indole-3-butyric acid (IBA) dan Kinetin (kn) dengan konsentrasi (0,5, 1, 1,5 dan 2 mg / L). PH medium diatur sampai 5,8 dan media diautoklaf pada 15 psi selama 15 menit. Kultur disimpan pada suhu 26 2 C selama16 jam dengan penyinaran lampu fluorescent(2000-3000 lux) dan kelembaban relatif 55 5%. Kalus umur 6 minggu dipanen dan digunakan untuk studi lebih lanjut. Indeks pertumbuhan dan kadar air dihitung. Penyiapan ekstrakKalus dari hormon pertumbuhan yang berbeda dipanen (20 mg berat kering dari masing-masing perlakuan) diambil keseluruhan tanaman termasuk akar, batang dan daun diekstraksi berturut-turut dalam petroleum eter, metanol dan air (60 C, 24 h). Ekstrak disaring melalui Whatman Filter NO. 1, dikeringkan, ditimbang dan disimpan pada 4C untuk percobaan lebih lanjutAnalisa FitokimiaJumlah fenolat diukur dengan menggunakan reagen Folin Ciocalteu.Total kandungan flavonoid diukur dengan uji kolorimetri aluminium klorida (10).Ekstrak ditotolkan pada KLT bersama dengan senyawa standar, dielusi didalam bejana yang berisi fase gerak benzena: heptana: alkohol (100: 100: 1) untuk triterpenoid dan (ekstrak pet eter.) dan n-butanol: asam asetat: air (4: 1: 5) untuk fenolat (ekstrak metanol).Identifikasi senyawa dilakukan dengan mengekspos plat KLT dengan uap I2, uap NH3 pada ruang sinar UV. Penyemprotan terpenoid dilakukan dengan 20% H2SO4 dan 10% SbCl3 secara terpisah, sedangkan penyemprotan senyawa fenolik dengan1% AlCl3 dalam metanol dan reagen Folin Ciocalteu. Nilai Rf dari standar dan sampel dihitung.Spot yang sejajar standar dari plat yang tidak disemprot, dielusi dengan metanol, disaring, diuapkan sampai kering, sampai diperoleh kristal. Titik leleh senyawa hasil isolasi ditentukan dalam tabung kapiler (alat titik leleh Toshniwal) dan diuji menggunakan spektrum ir (Perkin Elmer 337, spektrofotometer inframerah)Kuantifikasi senyawa Kuantifikasi dilakukan dengan menggunakan PTLC. Jumlah terpenoid diperkirakan secara colorimetri dengan metode Das dan Benergee. Densitas optik (OD) diukur pada 540 nm terhadap blanko. Kurva standar senyawa dibuat 0,01-0,1 mg/mL.Jumlah kadar asam caffeat ditentukan secara kolorimetri dengan menggunakan reagen Folin Ciocalteu . OD diambil pada 760 nm menggunakan spektrofotometer UV-vis. Kurva standar asam caffeat dibuat 0,01-0,01 mg / mL.Uji aktivitas antibakteriPada skrining antibakteri digunakan kultur murni bakteri uji. Uji antimikroba dilakukan dengan metode sumur difusi agar.Aktivitas radikal 1,1-Diphenyl-2-pikrilhidrazil (DPPH)Efek radikal DPPH ditentukan menggunakan metode Fogliano dkk.HASIL DAN KESIMPULANDari tiga hormon yang digunakan, IAA dan IBA kalus yang dihasilkan kecoklatan dan embriogenik sedangkan Kn menghasilkan kalus kehijauan dan non-embriogenik.Media MS dengan Kn menghasilkan kandungan total fenolik yang paling tinggi.Media MS dengan IBA menghasilkan flavonoid total yang paling tinggi.Media MS dengan Kn menghasilkan kandungan -sitosterol dan asam caffeat yang paling tinggi.Media MS dengan IBA memiliki aktifitas antibakteri dan jamur yang paling efektif.Media MS dengan Kn memiliki aktifitas antioksidan yang paling max