Triticum aestivum L.) durch Transformation mit … · 2010. 1. 7. · (Triticum aestivum L.) durch...

Aus dem Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen

der Universität Hohenheim

Prof. Dr. D. Hess

Optimierung des Weizentransformationssystems und Versuche

zur Beeinflussung des Carotinoidmetabolismus von Weizen

(Triticum aestivum L.) durch Transformation mit

Phytoensynthasegenen

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines Doktors

der Naturwissenschaften

vorgelegt der Fakultät II - Biologie

der Universität Hohenheim

von

Matthias Huber

aus Stuttgart

2002

Die vorliegende Arbeit wurde am 10.05.2002 von der Fakultät II – Biologie der Universität Hohenheim als “Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften“ angenommen. Tag der mündlichen Prüfung: 8. November 2002 Dekan: Prof. Dr. K. Bosch Berichterstatter, 1. Prüfer: Prof. Dr. D. Hess Mitberichterstatter, 2. Prüfer: Prof. Dr. E. Kuhn 3. Prüfer: Prof. Dr. R. Hain

INHALTSVERZEICHNIS ___________________________________________________________________________

I

1 EINLEITUNG 1

2 MATERIAL UND METHODEN 18

2.1 Bakterienstämme und Plasmide 182.1.1 Escherichia coli-Stämme 182.1.2 Bakterienkulturmedien 182.1.2.1 Kulturmedien für E. coli-Stämme 182.1.3 Plasmide 192.1.4 Antibiotika 19 2.2 Pflanzenmaterial 202.2.1 Triticum aestivum L. cv. ‘Combi‘ 20 2.3 Isolierung von Nukleinsäuren 202.3.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli 202.3.1.1 Maxipräparation 202.3.1.2 Minipräparation 212.3.2 Isolierung von genomischer DNA 222.3.2.1 Isolierung von genomischer DNA aus Triticum aestivum nach

Hess et al., 1985 22

2.3.2.2 Isolierung von genomischer DNA aus Triticum aestivum mittels Genome Clean

22

2.3.3 Bestimmung der Konzentration und Reinheit von Nukleinsäuren 23 2.4 DNA-modifizierende Reaktionen 242.4.1 Restriktionsspaltung von Plasmid-DNA 242.4.2 Ligation 242.4.2.1 Sticky end-Ligation 242.4.2.2 Blunt end-Ligation 242.4.3 Restriktionsspaltung chromosomaler DNA 25 2.5 Agarose-Gelelektrophorese und Elution von DNA-Fragmenten 252.5.1 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA 252.5.2 Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 26


II

2.6 Transformation von Escherichia coli 262.6.1 Herstellung kompetenter Zellen 262.6.2 Transformation kompetenter Zellen 272.6.3 Selektion rekombinanter Klone 27 2.7 Transformation von Triticum aestivum L. 282.7.1 Anzucht des Pflanzenmaterials 282.7.2 Pflanzenkulturmedien 282.7.3 Isolierung und Kultur unreifer Embryonen 302.7.4 Partikelbeschuss 302.7.4.1 Partikelbeschuss von Scutellarkallus 312.7.4.2 Partikelbeschuss von unreifen Embryonen 312.7.5 Kultur und Selektion des Kallus 312.7.6 Regeneration 322.7.7 Bewurzelung 322.7.8 Ex vitro-Kultur der Regeneratpflanzen 32 2.8 Nachweis der Fremdgene 322.8.1 Southern blot-Analyse 322.8.1.1 Isolierung von Sonden 332.8.1.2 Markierung der Sonden-DNA 332.8.1.3 Hybridisierung und Nachweis der Hybridisierung 34 2.9 Nachweis der Fremdgenexpression 342.9.1 Konzentrationsbestimmung von Proteinextrakten (Bradford, 1976) 342.9.2 Nachweis der Phosphinothricinacetyltransferase-Aktivität (PAT-

Test) (Spencer et al., 1990, modifiziert) 35

2.9.3 Fluoreszenzanalyse verschiedener Gewebebereiche hinsichtlich der gfp-Expression

36

2.9.4 Histochemischer Nachweis der transienten Expression des β-Glucuronidasegens in Kalluskulturen und transgenen Pflanzen

36

2.9.5 Fluorimetrischer Nachweis der β-Glucuronidase (GUS-Test) 362.9.6 Western blot-Analyse des Green fluorescent protein (GFP) 372.9.7 Nachweis von Carotinoiden mit der Hochleistungs-

Flüssigkeitschromatographie (HPLC) 40


III

3 ERGEBNISSE 41

3.1 Konstruktion der Transformationsvektoren 413.1.1 Herstellung von Vektoren zu Konstruktionszwecken 413.1.1.1 Das Plasmid pUnosT 423.1.1.2 Das Plasmid p5‘3‘MAR 423.1.2 Konstruktion der Markierungsgenkassette 433.1.2.1 Das Plasmid pGFPBAR 433.1.2.2 Das Plasmid p5‘uidA3‘ 443.1.3 Konstruktion der Nutzgenkassetten 453.1.3.1 Das Plasmid pIB2 453.1.3.2 Das Plasmid p5‘IB23‘ 453.1.3.3 Das Plasmid pUT 463.1.3.4 Das Plasmid p5‘UT3‘ 463.1.3.5 Das Plasmid pGT 473.1.3.6 Das Plasmid p5‘GT3‘ 48

3.2 Überprüfung der Konstrukte mittels Southern blot-Analysen 49

3.3 Versuche zur Optimierung des Weizentransformationssystems

und Analyse der Regeneratpflanzen 53

3.3.1 Partikelbeschuss von embryogenem Scutellarkallus 543.3.1.1 Partikelbeschuss von embryogenem Scutellarkallus unter

Verwendung von pAHC25 als Reporter-/selektierbarem Markergenplasmid

54

3.3.1.2 Partikelbeschuss von embryogenem Scutellarkallus unter Verwendung von pGFPBAR als Reporter-/selektierbarem Markergenplasmid

56

3.3.2 Partikelbeschuss von unreifen Embryonen unter Verwendung von pGFPBAR als Reporter-/selektierbarem Markergenplasmid

56

3.3.3 Transiente Expression des uidA-Gens 573.3.4 Transiente Expression des gfp-Gens 583.3.5 Einfluss der osmotischen Behandlung auf die Sprossbildung 603.3.6 Kalluskultur, Regeneration und Beobachtungen an

Regeneratpflanzen 61

3.3.7 Nachweis der Phosphinothricin-N-acetyltransferase-Aktivität (PAT-Test) an Regeneratpflanzen

64


IV

3.3.8 Southern blot-Analysen 653.3.9 Nachweis der β-Glucuronidase-Aktivität (GUS-Test) 733.3.10 Nachweis der gfp-Genexpression 743.3.11 HPLC-Analyse 773.3.11.1 HPLC-Analyse von Blättern 783.3.11.2 HPLC-Analyse von Karyopsen 83 3.4 Analyse der Nachkommen transgener Regeneratpflanzen 863.4.1 Nachweis der Phosphinothricin-N-acetyltransferase-Aktivität

(PAT-Test) in der T1-Generation 88

3.4.2 Expression des gfp-Gens in der T1 und der T2 893.4.3 Embryo rescue 903.4.4 HPLC-Analyse der T1 923.4.5 Southern blot-Analysen in der T1 92 3.5 Übersicht über die Ergebnisse der T1-Generation 97 3.6 Nachweis des Einflusses der MARs auf die Expressionsstärke

des flankierten uidA-Gens 99

4 DISKUSSION 104

4.1 Auswahl geeigneter Nucleotidsequenzen und Konstruktion der

Übertragungsvektoren 105

4.2 Versuche zur Optimierung des Weizen-

Transformationssystems 106

4.2.1 SK-Strategie mit GUS 1064.2.2 SK-Strategie mit GFP 1074.2.3 UE-Strategie mit GFP 1104.2.4 Verbesserte UE-Strategie mit GFP 1134.2.5 Selektion transgener Pflanzen 1154.2.6 Gewebekulturdauer 1164.2.7 Phänotypische Auffälligkeiten an T0- und T1-Pflanzen 116


V

4.3 Transformation und Genexpression 1184.3.1 Übersicht über die Ergebnisse der Southern blot-Analysen von

Pflanzen der T0- und T1-Generation 119

4.3.2 Expression des selektierbaren Markierungsgens bar und der “Reportergene“ uidA und gfp in der T0- und T1-Generation

121

4.3.3 Untersuchungen zur Expression der Phytoensynthasegene in der T0- und T1-Generation

123

4.3.4 Matrix-Anheftungsstellen (MARs), Auswahl der Sequenzen und Einfluss auf die Genexpression

129

4.4 Schlussfolgerungen und Ausblick 132

5 ZUSAMMENFASSUNG 134

6 ANHANG 6.1 Literaturverzeichnis 137 6.2 Abkürzungsverzeichnis 155

EINLEITUNG ___________________________________________________________________________

1

1 EINLEITUNG Die konventionelle Pflanzenzüchtung wird seit Beginn der 80er Jahre durch die pflanzliche Gentechnologie ergänzt. Im Jahr 1986 fand in den USA der erste Freisetzungsversuch mit einer gentechnisch veränderten Pflanze statt (Powell Abel et al., 1986). Bereits acht Jahre

später wurde in den USA die Flavr Savr-Tomate (Smith et al., 1988) als erstes gentechnisch optimiertes Lebensmittel für die Vermarktung zugelassen. Unterdessen existiert für die meisten landwirtschaftlich bedeutsamen Nutzpflanzen ein effizientes und kommerziell einsetzbares Transformationssystem. In den EU-Mitgliedsstaaten wurden bisher 1726 (USA: 4694) Anträge auf die Freisetzung gentechnisch veränderter Organismen genehmigt oder beantragt (Stand Februar 2002; Quelle: Robert Koch Institut). Neben Bakterien, Viren und Hefen handelt es sich hier um 51 (USA: 52) verschiedene Pflanzenarten, wobei sich der größte Teil mit 71 % der Anträge auf Mais (Zea mays), Raps (Brassica napus), Zuckerrübe (Beta vulgaris) und Kartoffel (Solanum tuberosum) beziehen. In den USA entfallen 73 % auf Mais (Zea mays), Kartoffel (Solanum tuberosum), Sojabohne (Glycine max) und Tomate (Lycopersicon esculentum). Bezogen auf die Anzahl der Anträge rangiert Weizen auf Position 10 (USA: 12), was die Bedeutung des Weizens als wichtigste Pflanze der menschlichen Ernährung (FAO, 1997) nicht widerspiegelt. Weltweit stieg die Fläche auf denen gentechnisch veränderte Sorten kommerziell angebaut wurden im Jahr 2001 zwar auf 52,6 Mio. Hektar an (James, 2001). Für den kommerziellen Landbau zugelassene gentechnisch veränderte Weizensorten befanden sich jedoch nicht darunter. In Kanada ist zwar eine herbizidresistente Weizensorte zugelassen, da diese jedoch durch eine chemisch bedingte Mutation erzeugt worden ist, gilt sie nach europäischem Recht nicht als „gentechnisch verändert“. In Nordamerika ist mit einer Markteinführung transgener Weizensorten erst ab dem Jahr 2005 zu rechnen (Quelle: http://www.transgen.de). Die Gründe für dieses „Defizit“ liegen nicht in einem mangelnden Interesse, Weizen gentechnisch zu modifizieren, sondern vielmehr in den zu bewältigenden Schwierigkeiten bei dessen Transformation. Transformation von Weizen Die ersten Transformationsversuche an Weizen mittels Agrobakterien erfolgten durch Injektion von Agrobakterien in Weizenkeimlinge (Woolston et al., 1988) und durch Einträufeln der Agrobakterien in Weizenährchen (Hess et al., 1990). Mooney et al. (1991) bewiesen in in vitro Experimenten, dass Agrobakterien ihre T-DNA in Weizenzellen übertragen können. Nahezu zeitgleich veröffentlichten Vasil et al. (1991) ihre Daten über die

EINLEITUNG ___________________________________________________________________________

2

erste transformierte Kalluslinie von T. aestivum. Erreicht wurde dies durch den Partikelbeschuss von Zellsuspensionen. Auch die ersten fertilen und stabil transgenen Weizenpflanzen konnten mittels der Partikelbeschusstechnik erhalten werden, wobei als Zielgewebe für den Beschuss embryogener Kallus eingesetzt worden war (Vasil et al., 1992). Erst fünf Jahre später erschien die erste Publikation über Weizentransformante, die via Agrobakterien stabil transformiert worden waren (Cheng et al., 1997). Unreife Embryonen und embryogener Kallus dienten hier als rezipierende Gewebe. Nahezu zeitgleich gelangen Viertel et al. (1997) der indirekte Gentransfer über isolierte Sprossspitzen. Dabei konnte in einigen Fällen die Expression und stabile Übertragung der Gene gezeigt werden. Im Jahr 2001 veröffentlichten Weir et al. ihre Ergebnisse über Agrobakterien-vermittelte Transformation von Weizen. Um dies zu erreichen, waren Bedingungen, die sich bei der Transformation von Suspensionskulturen des Weizen als optimal herausgestellt hatten, auf isolierte Scutella unreifer Embryonen und Scutellarkalli übertragen worden. Ein weiterer wichtiger Schritt, um den Agrobakterieneinsatz bei der Weizentransformation als Routinetechnik zu etablieren, ist erst in jüngster Zeit durch Evaluierung beeinflussender Faktoren und der Entwicklung optimaler Konditionen gemacht worden (Amoah et al., 2001). Akzeptor war in diesem Fall unreifes Infloreszenzgewebe. Die Arbeiten mit Agrobakterien sind umso bemerkenswerter, da Monocotyledonen nicht zum natürlichen Wirtsspektrum der Agrobakterien gehören. Die Methode der Wahl ist gegenwärtig unbestritten die Partikelbeschusstechnik. Hierzu wurden bisher vier unterschiedliche Zielgewebe erfolgreich eingesetzt: unreife Embryonen (Vasil et al., 1993; Weeks et al., 1993; Becker et al., 1994; Zhou et al., 1995; Karunaratne et al., 1996; Altpeter et al., 1996a; Blechl and Anderson, 1996; Srivastava et al., 1996; Takumi and Shimada, 1996; Leckband and Lörz, 1998; Wirtzens et al., 1998; Uze et al., 1999; Zhang et al., 2000; Jordan, 2000; Abranches et al., 2000; Wright et al., 2001; Shlumukov et al., 2001), isolierte Scutella unreifer Embryonen (Nehra et al., 1994; Barro et al., 1997; Bliffeld et al., 1999; Pastori et al., 2001; Rasco-Gaunt et al., 2001), embryogene Scutellarkalli (Vasil et al., 1992; Ortiz et al., 1996; De Block et al., 1997; Stoger et al., 1998; Iser et al., 1999; Fettig and Hess, 1999; Weeks et al., 2000) und aus Mikrosporen entstandene Kalli (Folling and Olesen, 2001). Ein wesentlicher Faktor für eine erfolgreiche Gewebekultur und Transformation von Weizen ist der verwendete Genotyp (nur Gewebekultur untersucht: Fennell et al., 1996; Viertel et al., 1998; Transformation untersucht: Takumi and Shimada, 1997; Iser et al., 1999). Am häufigsten werden hier „Modell-Genotypen“, wie ’Bobwhite’ oder ’Florida’ verwendet, die agronomisch betrachtet jedoch von untergeordneter Bedeutung sind (Rasco-Gaunt et al., 1999). Im Gegensatz dazu wird in der vorliegenden Arbeit die agronomisch relevante Varietät

EINLEITUNG ___________________________________________________________________________

3

‘Combi‘ verwendet. Sie zeichnete sich bei einer vergleichenden Untersuchung von 18 der 20 im Jahr 1996 in Deutschland zugelassenen und angebauten Sommerweizenvarietäten durch ihre gute Regenerationsfähigkeit aus embryogenem Scutellarkallus (Viertel et al., 1998) und ihre Transformierbarkeit aus (Iser et al., 1999). Wie eine Empfehlung der Brandenburgischen Landesanstalt für Landwirtschaft zeigt (Quelle: http://www.brandenburg.de/land/ mlur/l/pflanze/oek_sw.htm), wird ‘Combi‘ noch immer aufgrund seiner guten Qualitätseigenschaften zum Anbau empfohlen. Dies gilt vor allem für den ökologischen Landbau. Selektierbare Markierungsgene in der Weizentransformation Für eine effiziente Transformationstechnik ist ein System unabdingbar, das es erlaubt, mit einem Minimum an Aufwand und einem Maximum an Effizienz transgene Pflanzen zu erhalten und das bei einer nur geringen Anzahl an nicht-transgenen “Ausreißerpflanzen“ (Barsby et al., 2001). Selektierbare Markierungsgene bilden die Basis, um einer solchen Forderung gerecht zu werden, indem sie transgenen Zellen, Organen oder Pflanzen eine erhöhte Toleranz gegenüber Herbiziden oder Antibiotika verleihen, um sie so von ihren Wildtypformen abgrenzen zu können (zur Übersicht: Yoder and Goldsbrough, 1994). Bailey and Kaeppler (2001) verschafften sich einen Überblick über die in der Pflanzentransformation eingesetzten selektierbaren Markierungsgene, indem sie die Präsentationen auf dem Weltkongress für in vitro Biologie des Jahres 2000 dahingehend auswerteten. Danach entfielen allein 72 % auf Antibiotika (nptII, hpt)- oder Herbizid (bar, pat)- Resistenzgene und 17 % auf Fluoreszenzmarkergene (gfp), wobei diese für gewöhnlich mit Antibiotika- oder Herbizidresistenzgenen kombiniert verwendet worden waren. Die übrigen 11 % entfielen entweder auf Gene, die Pflanzen in die Lage versetzen Substanzen zu verwerten, die ansonsten nicht für den Stoffwechsel genutzt werden können (pmi, xyla) oder auf Gene, die sich auf das Wachstum und/oder die Morphogenese transgener Zellen/Pflanzen fördernd auswirken (ipt, rolA, rolB). Folgende Gene wurden bereits erfolgreich zur Transformation von Weizen eingesetzt: Das hpt-Gen aus E. coli kodiert für die Hygromycin-Phosphotransferase und verleiht eine erhöhte Toleranz gegenüber dem Antibiotika Hygromycin. Ortiz et al. (1996) gelangten auf diesem Weg zu transgenen Weizenpflanzen. Jedoch berichteten einige Autoren (Witrzens et al., 1998) auch über Schwierigkeiten im Umgang mit dem Hygromycin-System, was sich in einer verringerten Sprossregeneration aus transgenem Gewebe niederschlug. Das Genprodukt des nptII-Gens aus E. coli ist die Neomycin-Phosphotransferase. Obwohl Gramineen natürlicherweise schon eine hohe Toleranz gegenüber Kanamycin aufweisen

EINLEITUNG ___________________________________________________________________________

4

(Nehra et al., 1994), gelang es so, transgene Weizenpflanzen zu erzeugen (Hess et al., 1990; Nehra et al., 1994; Viertel et al., 1997; Cheng et al., 1997; Witrzens et al., 1998). Aus der Gruppe der herbizidgestützten Selektionssysteme sind das GOX-Gen (Glyphosat-Oxidoreduktase) in Kombination mit dem CP4-Gen (mutierte 3-Enolpyruvyl-Shikimat-5-Phosphat-Synthase, kurz: EPSPS) von Zhou et al. (1995) erfolgreich zur Erzeugung Glyphosat-resistenter Weizenpflanzen herangezogen worden. Glyphosat ist der aktive

Bestandteil des Totalherbizids RoundUp (Monsanto). Es hemmt die pflanzliche EPSP-Synthase. Ein Gen für eine Cyanamid-Hydratase (cah-Gen aus Myrothecium verrucaria) versetzt transgene Pflanzen in die Lage, Cyanamid in Harnstoff umzuwandeln. Weeks et al. (2000) verwendeten erfolgreich Cyanamid als selektives Agens bei der Weizentransformation. Das am weitesten verbreitete selektierbare Markierungsgen ist das bar-Gen aus Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al., 1987). Sowohl das bar-Gen, als auch das pat-Gen (aus Streptomyces viridochromogenes; Strauch et al., 1988) codieren für das Enzym Phosphinothricin-Acetyltransferase, welches in der Lage ist, Phosphinothricin (PPT, DL-Homoalanin-4-(methyl)-phosphinsäure) und Bialaphos (Derivat des Phosphinothricins) über

Acetylierung zu inaktivieren. PPT ist die Wirkkomponente des Totalherbizids Basta

(Hoechst), Glufosinat (Ammoniumsalz des PPT) die des Herbizids Liberty (Fa. AgrEvo). Sie sind in der Lage, durch Hemmung der Glutamin-Synthetase eine Ammoniakvergiftung der Pflanze herbeizuführen. Zur Selektion transgener Weizenpflanzen über PPT oder Bialaphos wurde bisher nur auf das bar-Gen zurückgegriffen (erstmals Vasil et al., 1993). Ein „neues“, nicht auf Antibiotika oder Herbizide gestütztes Selektionssystem basiert auf dem Phosphomannose-Isomerasegen manA aus Escherichia coli (Wright et al., 2001). Nur manA transgene Weizenpflanzen vermochten sich das im Medium erhaltene Mannose-6-phosphat als Kohlenhydratquelle zu erschließen, indem sie dieses in Fructose-6-phosphat umwandelten. Selektierbare Markierungsgen-freie Pflanzen Im Rahmen der vorliegenden Arbeit kann auf allgemeine Vorbehalte gegenüber der „Grünen Gentechnik“ nicht eingegangen werden. Jedoch soll dem geplanten EU-weiten Verbot von Antibiotika- und Herbizidresistenzgenen ab dem Jahr 2005 (nach einem Vorschlag der Kommission der Europäischen Union; Direktive 90/220/EEC) im Bereich der Gentechnologie Rechnung getragen werden, indem kurz auf aktuelle Möglichkeiten zur Erzeugung Markierungsgen-freier, transgener Pflanzen eingegangen wird, beziehungsweise alternative Marker für die Pflanzentransformation vorgestellt werden:

EINLEITUNG ___________________________________________________________________________

5

Transformation nur mit Nutzgenen: Wenn das Nutzgen nicht auch als Markergen fungieren kann, wäre eine zeit- und kostenaufwendige Analyse aller Regeneratpflanzen zum Beispiel mittels PCR unumgänglich. In der Praxis ist eine solche Methode nicht umsetzbar. Transformation mit Nutzgen und geeignetem Reportergen: Ausschließlich über eine visuelle Selektion gelang die Erzeugung transgener Sonnenblumen (Müller et al., 2001). Jedoch wurde neben dem notwendigen gfp-Gen auch ein Gen zur Kanamycinresistenz übertragen, das sich auf dem binären Plasmid befand. Auf eine Selektion über Kanamycin wurde jedoch nicht zurückgegriffen. Verwendung eines Rekombinationssystems: Beim cre/loxP-Rekombinationssystem werden transgene Pflanzen generiert, deren selektierbares Markergen von zwei lox-Sequenzen flankiert wird. Durch die mittels der Übertragung des cre-Gens über eine zweite Transformation katalysierte Rekombination zwischen den beiden lox-Bereichen, wird das selektierbare Markergen entfernt (Dale and Ow, 1991; Gleave et al., 1999). Das notwendige zweite Transformationsereignis kann umgangen werden, wenn das cre-Gen durch einen induzierbaren Promotor gezielt aktiviert werden kann, oder nur transiente Aktivität aufweist. Das cre/loxP-System wurde in Weizen auch erfolgreich dazu verwendet, um aus transgenen Weizenpflanzen, die eine multiple Kopienzahl des übertragenen Gens enthielten, Pflanzen zu generieren, die nur noch eine einzige Kopie dieses Gens enthielten (Srivastava et al., 1999). Das für eine Transposase codierende Ac-Element aus Zea mays L. aktiviert ein Ds transponierbares Element, das einen Ausbau und einen Einbau an einer neuen Position des pflanzlichen Genoms bedingt. Ein Markergen zwischen zwei solchen Ds-Elementen würde dem gleichen Prozess unterliegen. Es gehen über 10 % der ausgebauten Elemente verloren (Yoder and Goldsbrough, 1994). Es gibt noch weitere Rekombinationssysteme, die geeignet sind, auf diese Weise Markierungsgen-freie Pflanze zu produzieren. Namentlich zu nennen wären hier das FLP-frt- (Kilby et al., 1995) und das R-RS-System (Onouchi, 1995). Verwendung des MAT-Systems (Multi-Auto-Transformation): Eine Kombination des R-RS-Systems mit Oncogenen (ipt- oder rol-Gen) aus Agrobacterium tumefaciens wurde zur Selektion transgener Pflanzen entwickelt (Ebinuma and Komamine, 2001). Die verwendeten Gene stimulieren Wachstum und Morphogenese der transgenen Pflanzen und werden somit zu einer „Positiv-Selektion“ eingesetzt. Mittels dem R-RS-System können später diese Gene, ohne Kreuzung, wieder entfernt und die transgenen Pflanzen in ihren „normalen“ Phänotyp überführt werden. Überexpression eines induzierbaren Isopentenyltransferase-Gens: Die Überexpression eines induzierbaren Isopentenyltransferase-Gens (ipt-Gen) führt zu einer vermehrten Synthese von Cytokininen, welche die Sprossregeneration fördern. Durch ein hinsichtlich des Auxingehalts

EINLEITUNG ___________________________________________________________________________

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eingestelltes Medium kann so die Regeneration von nicht-transformierten Zellen unterbunden werden (Ebinuma et al., 1997; Kunkel et al., 1999). Verwendung des Phosphomannose-Isomerase-Systems: Wie schon im Abschnitt selektierbare Markierungsgene erwähnt, versetzte die Expression des bakteriellen manA-Gens (auch pmi-Gen genannt) eine Weizentransformante in die Lage, Mannose-6-phosphat als Kohlenhydratquelle zu nutzen (Wright et al., 2001; Reed et al., 2001). Verwendung des Xylose-Isomerase-Systems: Haldrup et al. (2001) zeigten, dass das Xylose-Isomerase-Gen (xylA-Gen) als effektiver Marker in Kartoffel, Tabak und Tomate für die Selektion regenerierender Pflanzen auf xylosehaltigem Medium eingesetzt werden kann. Xylose-Isomerase katalysiert die Isomerisierung von D-Xylose zu D-Xylulose, die dann nach Phosphorylierung für die Pflanze verwertbar ist. Cotransformation: Durch den gleichzeitigen Beschuss von Zellen mit zwei Plasmiden, eines trägt das Nutzgen, das andere selektierbares Markierungs- und Reportergen, entstehen Transgene die zumeist 100 % cotransformiert sind (Altpeter et al., 1996b; Fettig and Hess, 1999; Scheyhing, 1999). Wenn die Plasmide ungekoppelt eingebaut werden, ergibt sich die Möglichkeit, dass nach der Meiose markierungsgenfreie transgene Pflanzen erhalten werden können (Yoder and Goldsbrough, 1994; Pedersen et al., 1997). Weizentransformation und Reportergene Sowohl bei der Etablierung als auch bei der Optimierung von Weizentransformations-systemen werden Reportergene eingesetzt. Im allgemeinen werden sie dazu verwendet, schon auf Ebene der transienten Expression die prinzipielle Funktionsfähigkeit der eingesetzten Transformationstechnik und des verwendeten Promotors kontrollieren zu können. Besonders wenn der Einfluss verschiedener Parameter der Partikelbeschusstechnik auf die Transformation untersucht werden soll, ermöglichen Reportergene schon in einem sehr frühen Stadium der Gewebekultur eine Bewertung auf Ebene der transienten Expression. Hierbei ist es jedoch nicht möglich, einen quantifizierbaren Zusammenhang zwischen transienter Expression und späterer Transformationsrate herzustellen (Iser et al., 1999; Takumi and Shimada, 1996). Das für Weizentransformation am häufigsten verwendete Reportergen ist das

uidA-Gen (auch gus-Gen genannt). Es kodiert für die β-Glucuronidase, welche die Hydrolyse

von X-Gluc (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronsäure) katalysiert und nach dessen oxidativer Dimerisierung einen gut sichtbaren Indigofarbstoff ergibt (Jefferson et al., 1987). Nachteile des GUS-Systems sind die destruktive Wirkung des Nachweisverfahrens auf getestete Zellen, sowie endogene Aktivitäten und mikrobielle Verunreinigungen, die eine Reportergenaktivität “vortäuschen“ können (Tör et al., 1992).

EINLEITUNG ___________________________________________________________________________

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Ein neues Reportergen für Weizen ist das OxO-Gen, das für die Oxalat-Oxidase kodiert. Die OxO-Aktivität kann durch ein entstehendes, purpurfarbenes Präzipitat, das durch Oxidation von 4-Chloro-1-naphtol in Gegenwart von H2O2 entsteht, histochemisch nachgewiesen werden (Simmonds et al., 2001a). Reportergene, die für nicht-destruktive Nachweissysteme stehen und schon am Weizen getestet wurden, sind: Das luc-Gen, das in Anwesenheit von ATP die Oxidation von D(-)-Luciferin zu Oxyluciferin und die Emission von gelbem Licht bewirkt (Ow et al., 1987; Lonsdale et al., 1998). C1, B und R-Gene, sind in die Biosynthese der Anthocyane involviert und erlauben transformiertes Gewebe an einer rötlichen Pigmentierung zu identifizieren (Ludwig et al., 1990; McCormac et al., 1998; Chawla et al., 1999; Mentewab et al., 1999). Ebenso erlaubt das gfp (green fluorescent protein) -Gen einen einfachen nicht-destruktiven Nachweis seiner Genexpression. Anregung mit ultraviolettem oder blauem Licht führt zu einer strahlend grünen Fluoreszenz. Da das Wildtyp GFP dazu neigt, cytotoxische und nicht-funktionelle Aggregate zu bilden (Haseloff et al., 1997), wurde eine große Anzahl von modifizierten Wildtyp gfp-Genen und synthetischen gfp-Genen für den Einsatz in Pflanzen entwickelt (zur Übersicht: Stewart, 2001). Das von Pang et al. (1996) publizierte gfp-Gen weist eine Mutation an der Aminosäureposition 65 auf, die zu einem Austausch von Serin durch Threonin führt. Dieses synthetische S65TGFP zeichnet sich durch eine verbesserte Löslichkeit, sowie Intensität und einer verminderten Neigung zum Ausbleichen bei Bestrahlung mit Blaulicht aus. Die Anregungswellenlänge dieser nicht cytotoxischen GFP-Variante liegt bei 489 nm (Wildtyp GFP: 395 nm und 475 nm), das emittierte Licht hat eine Wellenlänge von 511 nm (Wildtyp GFP: 509 nm und 540 nm). Pang et al. (1996) bewiesen die Expression diese gfp-Gens in Arabidopsis, Tabak, Mais und Weizen. Jordan (2000) verwendete eine sehr ähnliche GFP-Variante (Chiu et al. 1996) ebenfalls als optischen Marker für die Transformation von Weizen via Partikelbeschuss. McCormac et al. (1998) und Weir et al. (2001) verwendeten gfp bei Agrobacterium tumefaciens-vermittelten Transformationsexperimenten an Weizen. Nutzgene in der Weizentransformation Sofern Herbizidresistenz nicht eigentliches Ziel, oder zumindest gewünschter Nebeneffekt, eines anwendungsorientierten Transformationsexperimentes ist, stellen sowohl selektierbare Marker-, als auch Reportergene derzeit nur eine technische Hilfestellung bei der Erzeugung transgener Weizenpflanzen dar. Übergeordnetes Ziel ist jedoch die Übertragung von Nutzgenen.

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Die Anwendungsgebiete bei der gentechnischen Verbesserung von Weizen sind mit denen der konventionellen Züchtung deckungsgleich. Qualitätsverbesserung und Ertragssteigerung stehen dabei im Vordergrund. Im folgenden wird kurz auf Arbeiten eingegangen, die sich im weitesten Sinne mit Ertragssteigerung beim konventionellen Anbau von Weizen beschäftigen. Um Weizen eine erhöhte Resistenz gegen pilzliche Erkrankungen zu verleihen, wurde unter der Kontrolle des Ubiquitin-Promotors aus Zea mays L. (Christensen et al., 1990) ein Stilbensynthasegen (sts-Gen) aus Vitis vinifera (Hain et al., 1993) übertragen, das dort zur Produktion des Phytoalexins Resveratrol führte (Fettig and Hess, 1999). Nach Transformation mit einem Gen für ein Thaumatin-ähnliches Protein (tlp-Gen) konnte eine erhöhte Resistenz gegen Fusarium graminearum festgestellt werden (Chen et al., 1999). Ebenso sollen Pflanzen, die ein Klasse II Chitinasegen (chi-Gen) konstitutiv exprimierten, eine verstärkte Resistenz gegen Erysiphe graminis gezeigt haben (Bliffeld et al., 1999). Warum diese, sehr verheißungsvoll wirkende Arbeit, bisher keine publikationswürdige Weiterführung erfuhr, erscheint wenig einsichtig. Auf dem Gebiet der Virusresistenz gelangen Karunaratne et al. (1996) die Übertagung eines Gens, das für ein Hüllprotein des Gelbverzwergungsmosaikvirus (BYDMV) codiert. Über eine dadurch bedingte erhöhte Virusresistenz wurde bisher nicht berichtet. Durch die Überexpression eines Trypsin-Inhibitor-Gens aus der Gerste (BTI-Cme-Gen) konnte ein positiver Effekt beim Befall der Gerstenmotte Sitotroga cereallela auf Karyopsen transgener Weizenpflanzen verglichen mit Körnern nicht-transgener Kontrollpflanzen festgestellt werden (Altpeter et al., 1999). Ein schützender Effekt auf blattfressende Schadinsekten konnte hingegen nicht beobachtet werden. Transgene Weizenpflanzen, die ein Lectin-Agglutinin-Gen (gna-Gen) aus Galanthus nivalis exprimierten, verringerten bei der Getreideblattlaus Sitbion avenae, die sich von den betreffenden Pflanzen ernährten, deren Fortpflanzungsvermögen (Stöger et al., 1999). Ferner erscheinen Arbeiten interessant, die sich mit der verstärkten Stickstoff-Fixierung bei Weizen beschäftigen (Sabry et al., 1997) oder sich der Erzeugung männlich-steriler Pflanzen durch Übertragung eines barnase-Gens unter Kontrolle eines tapetumspezifischen Promotors widmen (DeBlock et al., 1997). Neben der Ertragssteigerung kommt der Qualitätsverbesserung des Weizens eine große Bedeutung zu. Sie bezieht sich in der Regel auf die Mehl- beziehungsweise Backqualität. Um den Anteil an Gluteninen mit hohem Molekulargewicht zu steigern, wurden weitere Gene (1Ax1-; 1Dx5-Gen) für Gluteninuntereinheiten in Weizen übertragen (Altpeter et al., 1996a; Blechl and Anderson, 1996; Barro et al., 1998). Man erreichte dadurch eine verbesserte Teigstärke und Elastizität.

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Sparks et al. (2001) versuchten, durch die Expression eines Saccharose-Phosphatsynthase- (sps-Gen) und eines Glycin-Decarboxylase-Gens (gdc-Gen) in transgenem Weizen den Kohlenstoffhaushalt zu beeinflussen. Auf einem anderen Gebiet forschten Shlumukov et al. (2001). Sie überexprimierten ein Phytochrom A-Gen (phyA-Gen) aus Hafer in Weizen. In den betroffenen Pflanzen führte dies zu verschiedenen Reaktionen, wenn sie mit dunkelrotem Licht bestrahlt wurden. So veränderte sich unter anderem das Wachstumsverhalten der Keimlinge und es kam zu einer erhöhten Anthocyanbildung in den Koleoptilen. Promotoren Ein ebenso wichtiger Bestandteil wie die proteincodierende Region eines Gens ist dessen Promotor. Bei der Konstruktion geeigneter Transformationsvektoren verwendet man in der Regel nicht die natürlichen, Gen-eigenen Promotoren, welche häufig nur schlecht untersucht sind, sondern Promotoren, die in Kombination mit geeigneten Reportergenen zur gewünschten Expression hinsichtlich Stärke, Gewebespezifität und Induzierbarkeit in der betreffenden Pflanze geführt haben. Der bei Dicotyledonen zweifellos meistgenutzte Promotor ist der konstitutiv arbeitende CaMV 35S-Promotor. Im Gegensatz zu transformierten Dicotyledonen zeigt er in Gramineen jedoch eine wesentlich geringere Aktivität (zum Beispiel Chen et al., 1999), so dass der Actin-Promotor (act1) aus Reis (McElroy et al., 1990) oder der Promotor des Polyubiquitingens 1 (ubi1) aus Mais (Christensen et al., 1992; Christensen and Quail, 1996) die bessere Wahl darstellen, wenn ein stark konstitutiv arbeitender Promotor gewünscht wird. In der Weizentransformation wurde sowohl der act1-Promotor (Becker et al., 1994; Nehra et al., 1994; Takumi and Shimada, 1996; Witrzens et al., 1998; Srivastava et al., 1999; Bliffeld et al., 1999; Bieri et al., 2000; Jordan et al., 2000), als auch der ubi1-Promotor (Vasil et al., 1993; Weeks et al., 1993; Zhou et al., 1995; Altpeter et al., 1996a und b; Blechl and Anderson, 1996; Barro et al., 1997; Witrzens et al., 1998; Iser et al., 1999; Bliffeld et al., 1999; Fettig and Hess, 1999; Chen et al., 1999; Srivastava et al., 1999; Zhang et al., 2000; Wright et al., 2001) erfolgreich eingesetzt. Manche Versuchsansätze benötigen eine gewebespezifische Expression des übertragenen Gens. Hierzu wurden bei Weizen bisher folgende gewebespezifische Promotoren eingesetzt: Tapetumspezifische Promotoren aus Reis (pE1- und pT72-Promotor) und Mais (pca55-Promotor) führten in Kombination mit dem barnase-Gen zu männlich sterilen Pflanzen (De Block et al., 1997). Der aleuronspezifische Promotor LtpW1 aus Weizen konnte mit Hilfe des uidA-Gens in transgenem Weizen näher charakterisiert werden (Simmonds et al., 2001b). Die korrekte Funktion des endospermspezifischen Gliadin-Promotors (Aryan et al., 1991) aus

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Weizen wurde bisher nur auf transienter Ebene im Endosperm nachgewiesen (Iser et al., 1999). Endospermspezifische Glutenin-Promotoren aus Weizen wurde sowohl zur Verbesserung des Glutengehalts (Altpeter et al., 1996a; Barro et al., 1997; Blechl and Anderson, 1996), als auch für grundlegende Untersuchungen ihres Expressionsmusters in Weizen verwendet (Lamacchia et al., 2001). Expressionsverstärkende Elemente Enhancer: Enhancer-Elemente sorgen dafür, dass die Transkription verstärkt wird. Sie zeichnen sich dabei durch ihre Positions- und Orientierungsunabhängigkeit aus. Das Enhancer-Element des CaMV 35S-Gens ist besonders effektiv, wenn es in duplizierter Form vorliegt (Odell et al., 1985). Leckband und Lörz (1998) konnten diese Wirkung auch für transgenen Weizen belegen. Introns: Eine expressionssteigernde Wirkung ist auch durch Introns, wie zum Beispiel dem ersten, zweiten und sechsten Intron des Alkoholdehydrogenasegens 1 (adh1-Gen) zu erreichen. Befand sich zwischen Promotor und kodierender Sequenz das zweite oder sechste Intron des adh1-Gens, konnte in Mais-Protoplasten eine Expressionssteigerung des Reportergens um das 12 bis 20fache festgestellt werden (Mascarenhas et al., 1990). An Weizen konnten mit dem adh1-Intron 1 entsprechende Ergebnisse erzielt werden (Oard et al., 1989; Chibbar et al., 1991). Takumi et al. (1994) untersuchten die Wirkung von sechs Promotor-Intron-Kombinationen auf die transiente Reportergenaktivität in Einkorn, Emmer und Weizen. Das shrunken-1-Intron1 des Saccharosesynthasegens aus Mais steigerte die Reportergenexpression in Protoplasten mehrerer Gräserarten um das 90fache (Vasil et al., 1989). Bei Weizen konnten durch das shrunken-1-Intron1 jedoch keine Expressionssteigerung erzielt werden (Schuster, 1995; Viertel et al., 1997). Die bei der Weizentransformation gängigen Promotoren Ubiquitin (Christensen and Quail, 1987) und Actin (McElroy et al., 1990) besitzen genauso Intronregionen wie der 35S-CaMV-Promotor, der die Genexpression in einem für Monokotyledonen optimierten synthetischen gfp-Gen steuert (Pang et al., 1996). Bei letzterem handelt es sich um das hsp70-Intron aus Zea mays. ATG-Konsensus-Sequenzen: Schon 1986 bewies Kozak, dass der AUG-Konsensus bei Vertebraten für die Funktion des AUG und damit für die Genregulation von Bedeutung ist. Auf transienter Ebene konnte bei Pflanzen nachgewiesen werden, dass eine optimale Konsensussequenz zu einer Steigerung der Genexpression führen kann (Lukaszevicz et al., 2000). Die Insertion der Codons für die Aminosäuren Methionin, Alanin, Serin, Serin unmittelbar nach dem ATG-Startcodon (Nucleotide +4 bis +11) und vor der proteincodierenden Region des nativen uidA-Enzyms, resultierte in einer 30- bis 40fach

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stärkeren GUS-Aktivität, verglichen mit der Wildtypform des Enzyms. Die Experimente wurden an transgenem Tabak durchgeführt (Sawant et al., 2001). Matrix attachment regions (MARs) Um bei den Replikations- und Transkriptionsabläufen im eukaryotischen Interphase-Zellkern die notwendige Präzision zu gewährleisten, muss das Chromosom hochgradig organisiert sein. Elektronenmikroskopische Untersuchungen legten die Hypothese nahe, dass die 30 nm Chromatinfibrille in Schleifen aufgehängt ist (loop domains) und mit einer proteinhaltigen Struktur interagiert. Diese Struktur wird abhängig von der Extraktionsmethode “nuclear scaffold“ oder “nuclear matrix“ genannt (Breyne et al., 1992). Es handelt sich um eine Struktur des eukaryotischen Zellkerns, die der des Cytoskeletts vergleichbar ist. Biochemisch gesehen ist die Kernmatrix als das unlösliche Material definiert, das nach Extraktion von Zellkernen mit Hochsalz-Lösungen oder mit dem chaotropischen Agens Lithiumdiiodosalicylat und einer DNase-Behandlung zurückbleibt (Berezney and Coffey, 1974; Markovitch et al., 1984). Matrix-Anheftungsstellen (MARs) sind Fragmente der genomischen DNA, die durch ihre Bindungsfähigkeit zu der filamentösen, proteinhaltigen Kernmatrix charakterisiert sind (Mirkovitch et al., 1984). So können MARs in der ausgedehnten Genomregion des Mais adh1-Gens 7 bis 70 kb lange DNA-Schleifen bilden (Avramova and Bennetzen, 1993). MARs scheinen in einer Vielzahl von Vorgängen eingebunden zu sein: Beginnend bei der Bildung der Chromatinschleifen, über die Abgrenzung von Genen, bis hin zur Bindungsstelle für Aktivator- oder Repressorproteine (zusammengefasst in Strissel et al., 1996). Besonders interessant erscheint der Einfluss von verschiedenen MARs auf die Genexpression in transgenen Pflanzen. So wurde bei Versuchen mit dem uidA-Reportergen, das von MARs aus Arabidopsis thaliana flankiert worden war, eine um das fünf- bis zehnfach stärkere Reportergenexpression in transgenen Tabakpflanzen festgestellt (Liu and Tabe, 1998). In transgenem Reis verstärkten flankierende MARs aus Tabak die GUS-Aktivität um das Sechseinhalbfache (Cheng et al., 2001). In zahlreichen Arbeiten wurde der Einfluss von MARs auf die Expressionsstärke und die Schwankung der Expressionsstärke in transgenen Pflanzen zwischen einzelnen Transformanten untersucht (zusammengefasst in Holmes-Davis and Comai, 1998; Allen et al., 2000). In transgenen Tabakpflanzen führte die Flankierung des uidA-Gens mit RB7 Matrix-Anheftungsstellen aus Tabak zu einer Verdopplung der GUS-Aktivität (Ülker et al., 1999). Interessanter erscheint in diesem Zusammenhang jedoch die Tatsache, dass MARs den Verlust der uidA-Expression in den Nachkommenschaften transgener Pflanzen reduzieren konnten. In 63 % dieser Nachkommenpflanzen war eine GUS-

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Aktivität festzustellen. Bei Kontrollpflanze ohne Matrix-Anheftungsstellen war dies bei lediglich 20 % der Fall. Der Effekt der MARs auf die Expressionsstärke eines von ihnen beeinflussten Gens bewegte sich bei T-DNA-vermitteltem Gentransfer zwischen dem 2 und 10fachen, bei via Partikelbeschuss erhaltenen transgenen Pflanzen zwischen dem 2 und 60fachen. Verglichen wurde immer mit Kontrollpflanzen, die das entsprechende Gen ohne MARs enthielten (Allen et al., 2000). Han et al. (1997) gelang bei Experimenten mit Pappeln durch Flankierung des selektierbaren Markergens nptII eine Verbesserung der Transformationsrate. Schon früh war bekannt, dass MARs nicht wie typische Enhancer arbeiten, sondern in das Wirtsgenom integriert sein müssen, um ihren Effekt zeigen zu können (Stief et al., 1989). Als erstes stellten Allen et al. (1993) die Hypothese auf, dass MARs einen Schutz vor Homologie-abhängiger Genstilllegung bieten könnten. Genkonstrukte mit MARs waren weniger anfällig für Cosuppression als Kontrollkonstrukte ohne MARs. Vorraussetzung war jedoch, dass die Kopienzahl der übertragenen uidA-Gene in den stabil transformierten Tabakzelllinien zwischen 30 und 40 lag (Allen et al., 1993). Diese Hypothese konnte dahingehend verfeinert werden, dass MARs vor transkriptionellen Genstilllegungen schützen können, dies jedoch irrelevant wird, wenn posttranskriptionelle Genstilllegung vorliegt (Allen et al. 2000). Sehr wahrscheinlich spielen MARs bei der Regulation des Übergangs von kondensiertem zu offenem Chromatin eine wichtige Rolle. Experimente belegten auch, dass MARs zu einer stärkeren Expression mit geringerer Schwankungsbreite zwischen einzelnen Transformanten führen können (zusammengefasst in Holmes-Davis und Comai, 1998) und bei der Verhinderung von Genstilllegungseffekten helfen (Allen et al., 2000). Carotinoide: Biosynthese, Regulation und biologische Funktion Im Abschnitt „Nutzgene“ war bereits kurz auf aktuelle Arbeiten, die sich mit der Qualitätsverbesserung von Weizen mit Hilfe gentechnischer Verfahren beschäftigen, eingegangen worden. Für die vorliegende Arbeit von besonderer Bedeutung sind Gene, die an der Biosynthese der Carotinoide beteiligt sind. Besonderes Augenmerk soll dabei auf das Phytoensynthasegen (psy bzw. tom5) beziehungsweise dessen Genprodukt, die Phytoensynthase, gelegt werden. Biosynthese: Das C40-Grundgerüst der Carotinoide ist aus acht Isoprenresten symmetrisch aufgebaut. Carotinoide sind somit als Tetraterpene zu klassifizieren. Die Terpene können auf mindestens zwei Wegen aus Primärmetaboliten synthetisiert werden. Zum einen werden im cytosolischen Acetat/Mevalonat-Weg (MVA) drei Moleküle Acetyl-CoA zu Mevalonsäure verbunden, welche dann durch Phosphorylierung, Decarboxylierung und Dehydrierung zu

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Isopentenylpyrophosphat (IPP) umgesetzt werden kann. Ein zweiter Weg (1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Weg, kurz: DOXP-Weg) ermöglicht die Bildung von IPP aus Phosphoglycerinaldehyd (3-PGA), einem Zwischenprodukt der Glykolyse und des photosynthetischen Calvin-Zyklus, und dem aus der Glykolyse stammenden Pyruvat. Mittels der 1-Deoxyxylose-5-phosphat-Synthase (DXS) wird DOXP gebildet. Über verschiedene enzymatische Reaktionen entsteht 2C-Methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphat (MEP). Diese auch als Nicht-Mevalonat-Weg bezeichnete Synthese ist plastidären Ursprungs (Lichtenthaler, 1998 und 1999). Beide genannten Synthesewege führen zum Vorläufer aller anderen Isoprenoide, der aktiven C5-Einheit IPP. Aus der Kopf-Schwanz-Additionen von IPP und Diemthylallyl-pyrophosphat leiten sich alle weiteren Isoprenoide ab. IPP reagiert mit seinem Isomer Dimethylallylpyrophosphat (DPP oder DMAPP) zu Geranylpyrophosphat (GPP), weiter zu Farnesylpyrophosphat (FPP) und Geranylgeranylpyrophosphat (GGPP) (Hirschberg, 2001). Die Kondensationsreaktion zweier FPP-Moleküle ergibt Squalen, C30-Vorläufer der Sterole und Saponine (zusammengefasst in Cunningham and Gantt, 1998). Sesqui- und Triterpenoide werden im Cytoplasma, Mono-, Di- und Tetraterpenoide in Plastiden synthetisiert (Kleinig, 1989). Bei der Biosynthese der Tetraterpene katalysiert das Enzym Phytoensynthase aus zwei Einheiten GGPP, über das instabiles Zwischenprodukt Präphytoenpyrophosphat (PPPP), den C40-Körper Phytoen. Dies ist die erste Reaktion, die als spezifisch für die Carotinoidbiosynthese angesehen werden muss (zusammengefasst in Cunningham and Gantt, 1998). Die Phytoensynthase (PSY) besetzt hier also eine Schlüsselposition, von der aus Abzweigungen nicht nur zu den Carotinoiden und zur Abscisinsäure, sondern auch zu den Synthesewegen des Phytols, der Plastochinone und Gibberelline führen. Verfolgt man den Weg des Phytoens weiter, so gelangt man durch die katalytische Funktion der

Phytoendesaturase (PDS) über Phytofluen zum ζ-Carotin und durch den Einfluss der ζ-Carotindesaturase (ZDS) zum Neurosporin und Lycopin. Diese Desaturierungsreaktionen vergrößern die Anzahl an konjugierten Doppelbindungen, die das Chromophor der Carotinoidpigmente begründen und das Farblose des Phytoens in das Rot des Lycopins umwandeln (zusammengefasst in Cunningham and Gantt, 1998). Lycopin ist mengenmäßig das vorrangige Pigment in roten Tomaten. Vermittelt durch zwei unterschiedliche

Lycopinzyklasen verläuft der weitere Weg entweder über δ-Carotin zu α-Carotin und Lutein

oder über γ-Carotin zum β-Carotin. Vom β-Carotin aus können Xanthophylle, wie Zeaxanthin, Antheraxanthin, Violaxanthin und Neoxanthin gebildet werden. Die 9-cis geometrischen Isomere des Violaxanthin und des Neoxanthin werden enzymatisch gespalten

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und somit die Umwandlung der Epoxycarotinoide zu Abscisinsäure (ABA) katalysiert (Zeevaart and Creelman, 1988). Enzymtopologie und Regulation: In Plastiden ist die aktive Form der Phytoensynthase eng mit Membranen assoziiert (Misawa et al., 1993; Schledz et al., 1996). Für den Import der Phytoensynthase durch die Membranen in die Plastiden und der nachfolgende Orientierung an der inneren Membran (im Falle der Chloroplasten: Thylakoidmembran) ist das Vorläuferprotein mit einem n-terminalen Transitpeptid ausgestattet (Soll and Alefsen, 1993). Vermutlich liegt PSY zusammen mit IPI (IPP-Isomerase) und GGPS (GGPP-Synthase) als Enzymkomplex vor (Fraser et al., 2000). In der Tomate wurden bisher zwei etwas unterschiedliche Phytoensynthasegene, psy-1 und psy-2, entdeckt (91 % Sequenzhomologie auf Basis der cDNA). Das Produkt von psy-1 ist an der Carotinoidbildung in reifenden Früchten (in Chromoplasten) beteiligt, die zweite Form (psy-2) herrscht in grünem Gewebe (in Chloroplasten) vor (Fraser et al., 1999). Untersuchungen zeigten, dass psy-1-Mutanten keine Möglichkeit haben, in reifen Früchten Phytoen zu bilden. Psy-2 kann diesen Ausfall nicht kompensieren und ist folglich nicht an der Phytoensynthese in Chromoplasten beteiligt. Die Transkription des psy-2-Gens konnte in in vitro-Experimenten jedoch bewiesen werden. Es liegt daher nahe, dass die Regulation nach der Hypothese der Metabolitenkanalisierung erfolgt, also eine Kompartimentierung des Stoffwechsels vorliegt, die zu einer Kanalisierung von Zwischenprodukten führt (Fraser et al., 1999). Da für die vorliegende Arbeit von Interesse, sei erwähnt, dass das psy-1-Gen (Slater et al., 1985) auch als Klon pTOM5 bezeichnet wird (Ray et al., 1987; Barley et al., 1992). In Sinapis alba Keimlingen steigt die Menge an psy mRNA unter Lichteinfluss aufgrund einer Phytochrom A-vermittelten Regulation an, wohingegen die Expression der Phytoen-desaturase- und GGPP-Synthase-Gene konstant bleibt (v. Lintig et al., 1997). Biologische Funktion: Carotinoide stellen eine wichtige Gruppe der Pigmente, in Tier- und Pflanzenreich, und sind deshalb in lebenden Organismen weit verbreitet. Die jährliche Gesamtsyntheseleistung wird auf 108 t geschätzt (Armstrong, 1994). Optisch treten sie im Pflanzenreich vor allem dadurch in Erscheinung, dass sie wesentlich zur optischen Attraktivität von Blüten und Früchten beitragen. Das Farbspektrum der fettlöslichen Pigmente reicht dabei von gelb über orange bis rot. Carotinoide können in allen photosynthetisch aktiven Organismen sowie einigen nicht-photosynthetisch aktiven Bakterien, Pilzen und Hefen synthetisiert werden (siehe Goodwin, 1980). In photosynthetisch aktiven Geweben agieren sie in Form akzessorischer Pigmente als Lichtsammler-Komplex und spielen, durch ihre Fähigkeit freie Radikale und Singulettsauerstoff zu inaktivieren, eine wichtige Rolle beim Schutz vor Photooxidation. Ihr antioxidatives Potential ist abhängig von ihrer chemischen

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Struktur, wie zum Beispiel die Anzahl konjugierter Doppelbindungen, strukturellen Endgruppen und sauerstoffhaltigen Substituenten. Ihre in situ antioxidative Aktivität ist auch durch ihre Photostabilität und Fähigkeit, sich in Membranen zu integrieren, beeinflusst (Albrecht et al., 2000). a) Ernährungsphysiologische, medizinische und kommerzielle Bedeutung der Carotinoide: Verschiedene Feldfrüchte sind nicht zuletzt aufgrund ihres Carotinoidgehaltes

ernährungsphysiologisch wertvoll. Jedoch sind nur Carotine mit mindestens einem β-Iononring Vorstufen des Vitamin A (Retinol). Von den circa 600 natürlich vorkommenden Carotinoiden sind dies circa 10 % (Bendich und Olson, 1989). Provitamine A sind essentielle Komponenten in der Ernährung aller Säugetiere. Zahlreiche klinische und epidemiologische Studien weisen auf Zusammenhänge zwischen einer Carotinoidunterversorgung und Herz-Kreislauferkrankungen, Erkrankungen des Auges - wie altersbedingte Makuladegeneration, Katarakt und Xerophtalmie - Fehlgeburten, verschiedenen Krebsarten (wie zum Beispiel Lungenkrebs) und dem Zustand des Immunsystems hin (zur Übersicht: Bendich et al., 1994; Bartley and Scolnik, 1995). Während in den industriell hochentwickelten Staaten kein Mangel an Provitaminen A herrscht, findet man vor allem in wenig industrialisierten Ländern, deren Ernährung auf geschältem Reis basiert, entsprechende Mangelerscheinungen. Vitamin A-Mangel korreliert auch mit einer erhöhten Neigung zu potentiell gefährlichen Krankheiten wie Diarrhöe, Erkrankungen des Atmungssystems und Kinderkrankheiten wie Röteln (Burkhardt et al., 1997). Laut einer UNICEF Statistik könnten weltweit durch eine ausreichende Versorgung mit Provitamin A jährlich nahezu 1-2 Millionen Kinder und 0,25-0,5 Millionen Jugendliche vor dem Tod bewahrt werden (Humphrey et al., 1992).

In vivo konnte nachgewiesen werden, dass β-Carotin eine antioxidative, antimutagene, antikarzinogene und anticlastogene Wirkung besitzt (Rauscher et al., 1998; Zhao et al., 1998).

Besonders β-Carotin scheint auch unabhängig von seiner Umwandlung in Vitamin A eine wichtige Rolle bei der Chemoprävention verschiedener Tumorarten zu spielen (Krinsky 1989; Ziegler, 1989). Entsprechende Wirkungen konnten auch für andere Carotinoide belegt werden (Rauscher et al., 1998; Zhao et al., 1998). Der wachsende Markt mit Carotinoiden als Nahrungs- oder Futtermittelzusatz erreichte 1995 nahezu 500 Millionen US $ (Johnson and Schröder, 1995).

Um in Nutzpflanzen den Gehalt an Carotinoiden (vor allem β-Carotin) zu erhöhen, kann es etwa wie bei Raps (Brassica napus) genügen, das Phytoensynthasegen samenspezifisch zu überexprimieren (Shewmaker et al., 1999). Bei Reis führte dies nur zu einer Akkumulation

von Phytoen im Endosperm (Burkhardt et al., 1997). Um eine β-Carotin-Akkumulation zu erreichen, war es notwendig, zusätzlich die Gene für eine bakterielle Phytoendesaturase (crtl),

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und die Lycopin-β-Zyklase (lcy) zu übertragen und zur Expression zu bringen (Ye et al., 2000). Interessanterweise fand man auch in transgenen Reispflanzen, die das übertragene

Lycopin-β-zyklase-Gen nicht besaßen, β-Carotin und Lutein. Dies lässt darauf schließen, dass das entsprechende Gen entweder im natürlichen Reisendosperm konstitutiv exprimiert wurde oder aufgrund der Lycopinbildung induziert worden war. b) Pflanzenphysiologisch und agronomische Aspekt der Carotinoidbiosynthese: Wildtyp-Tomaten, die mit einer zusätzlichen Kopie des chromoplastenassoziierten Phytoensynthasegens psy-1 transformiert worden waren, zeigten unter anderem einen dwarf-Phänotyp (Fray et al., 1995). Die konstitutive Expression des Phytoensynthasegens in transgenen Tomaten führte zu einer Ableitung von GGPP aus der Biosynthese der Gibberelline, was in einer Verzwergung der betreffenden Pflanzen resultierte. Obwohl es möglich ist, dass eine Überexpression des Phytoensynthasegens auch zu einer Erhöhung der Abscisinsäure-Konzentration führt, war der ABA-Spiegel der verzwergten Tomaten, verglichen mit Kontrollpflanzen, nicht beeinflusst worden (Fray et al., 1995). Mit einer Antisense-Strategie konnte in transgenen Tomaten eine Reduktion des Carotinoidgehaltes und eine Erhöhung des Gibberellinspiegels erreicht werden (Bird et al., 1991; Fraser et al., 1995). Der Verbesserung der Standfestigkeit kommt im Weizenanbau besondere Bedeutung zu. Der Einsatz des Wachstumsregulators CCC (Chlormequatchlorid plus Cholinchlorid) zählt heutzutage zu einer Standardmaßnahme, um das Lagern (Umfallen der Weizenpflanzen) und damit verbundene Ernteausfälle zu verhindern. Rund 80 bis 90 % der Weizenschläge werden mit diesem oder ähnlichen halmverkürzenden Mitteln behandelt. Obwohl CCC ein sehr preiswertes Betriebsmittel darstellt, ist aus Gründen der höheren Krankheitsgefährdung der Weizenpflanzen nach CCC-Einsatz und des stets anzumahnenden Umweltschutzes jegliche Überdosierung zu vermeiden (Reiner et al., 1992). Ferner ist auch die Belastung der Umwelt durch zusätzlichen Schadstoffausstoß und zusätzlichen Bodendruck, beziehungsweise schädliche Bodenverdichtung als dessen mögliche Folgeerscheinung bei der Ausbringung der halmverkürzenden Mittel zu erwähnen. Angesichts dieser Tatsachen wäre eine durch das Phytoensynthasegen vermittelte Stauchung (dwarf-Syndrom) und eine damit verbundene Verbesserung der Standfestigkeit von agronomisch bedeutsamen Weizenvarietäten sehr wünschenswert. Vor dem Hintergrund, dass schon die Hemmung eines einzelnen Enzyms des Synthesewegs einen letalen Phänotyp zur Folge haben kann, ist die Carotinoidbiosynthese auch ein interessantes Feld für die Herbizidforschung. Für die im Abschnitt “Biosynthese“ genannten Enzyme sind zahlreiche Inhibitoren bekannt. So vermag zum Beispiel das Herbizid Norflurazon die Aktivität der Phytoendesaturase zu hemmen (Pardo and Schiff, 1980).

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Zielsetzung der Arbeit Durch die Übertragung eines Phytoensynthasegens mittels der Partikelbeschusstechnik sollte die Carotinoidbiosynthese in Weizen (Triticum aestivum L. cv. ‘Combi‘) beeinflusst werden. Hierzu sollten proteincodierende Regionen der natürlicherweise fruchtspezifischen Phytoensynthasegene psy1 aus Paprika (Capsicum annuum) und ptom5 aus der Tomate (Lycopersicon esculentum) eingesetzt werden. Über den Einsatz entsprechender Promotoren sollten zwei Zielsetzungen verfolgt werden: Einerseits sollte nach Transfer eines endospermspezifisch exprimierten Genkonstruktes die Akkumulation von Carotinoiden im Korn erhöht werden. Dieser Ansatz berücksichtigt über die humanphysiologische Wirksamkeit der Carotinoide ernährungsphysiologische und medizinische Aspekte. Andererseits sollte nach Transfer eines stark konstitutiv exprimierten Genkonstruktes die Biosynthese der Carotinoide in der gesamten Weizenpflanze gefördert und die konkurrierende Biosynthese der Gibberelline beeinträchtigt werden. Als Folge sollte eine Stauchung des Sprosses und damit eine Erhöhung der Standfestigkeit zu beobachten sein. Dieser Ansatz zielt auf die physiologische Dimension der Phytoensynthase im Metabolismus der Pflanze ab und sollte die Möglichkeit evaluieren, auf diesem Weg eine Halmverkürzung und eine damit verbundene verbesserte Standfestigkeit zu erreichen. Ein kritischer Punkt ist die Frage, ob das Substrat der Phytoensynthase GGPP in den jeweiligen Geweben überhaupt angeboten wird. In photosynthetisch aktiven Geweben ist diese Frage unstrittig. Aufgrund der Tatsache, dass das Xanthophyll Lutein im Endosperm des Weizensamens vertreten ist (Sims and Lepage, 1968; Kaneko and Oyanagi, 1995; Pinzino, 1999), konnte davon ausgegangen werden, dass auch GGPP im Endosperm vorliegt. Zu den angesprochenen Transformationsversuchen mit den Phytoensynthasegenen sollte in parallel verlaufenden Experimenten der Einfluss von MARs (matrix attachment regions) auf die Expression der in Weizen übertragenen Phytoensynthasegene untersucht werden. Es sollte sowohl eine Erhöhung der Expressionsstärke als auch die Verringerung von Homologie-bedingten Genstilllegungseffekten angestrebt werden. Die hierzu geeigneten Übertragungsvektoren, welche entsprechende chimäre Genkassetten enthalten sollten, mussten konstruiert und in Weizen übertragen werden. Um die genannten Ziele in einem angemessenen Zeitrahmen verwirklichen und bewerten zu können, war es erforderlich, eine entsprechend große Zahl an transgenen Weizenpflanzen zu erzeugen. Nach ersten Transformationsversuchen deutete sich an, dass das bestehenden System hierzu zu arbeitsintensiv und zeitaufwendig war. Die Verbesserung des Transformationssystem für das gewählte, agronomisch relevante Kultivar ‘Combi‘ stand daher zunächst im Vordergrund der vorliegenden Arbeit.

MATERIAL UND METHODEN ___________________________________________________________________________

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2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 BAKTERIENSTÄMME UND PLASMIDE

2.1.1 Escherichia coli-Stämme

Escherichia coli DH5α (Hanahan, 1983) Genotyp: F- φ80dlacZ∆M15 ∆(lacZYA-argF)U169 deoR recA1 endA1 hsdR17(rK

-, mK+

phoA supE44λ- thi-1 gyrA96 relA1 Escherichia coli XL1 blue (Bullock et al., 1987) Genotyp: supE, hsdR, lac-, F’ proAB+ laclqlacZ∆M15

2.1.2 Bakterienkulturmedien

2.1.2.1 Kulturmedium für E.coli-Stämme

LB-Vollmedium (Lennox L Broth Base, Fa. SIGMA) Pepton aus Casein 1,0 % (w/v); Hefeextrakt 0,5 % (w/v); NaCl 1,0 % (w/v); Agar (bei Festmedium) 15g/l; pH 8.0. Antibiotika wurden nach dem Autoklavieren des Mediums (121 °C, 2 bar, 20 min) in entsprechender Konzentration zugegeben.


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2.1.3 Plasmide

Tab. 1: Übersicht über die verwendeten Plasmide Plasmid

Resistenz [mg x l-1]

Verwendungszweck

Referenz

pBS +/- Ampicillin [100] Konstruktion Short et al., 1988 pPCRScript® Ampicillin [100] Konstruktion Fa. STRATAGENE pAHC25 Ampicillin [100] Konstruktion Christensen und Quail, 1996 pUnosT Ampicillin [100] Konstruktion diese Arbeit pMON30049 Kanamycin [50] Konstruktion / Transformation Pang et al., 1996 ptom5 Ampicillin [100] Konstruktion Ray et al., 1987 p3zMAR1 Ampicillin [100] Konstruktion Avramova et al., 1998 p3zMAR2 Ampicillin [100] Konstruktion Avramova et al., 1998 pGFPBAR Ampicillin [100] Transformation diese Arbeit pUBIBAR Ampicillin [100] Konstruktion diese Arbeit p5zMAR-3zMAR Ampicillin [100] Konstruktion diese Arbeit pIB2 Ampicillin [100] Transformation Bader, 1999 p5’IB23’ Ampicillin [100] Transformation Bader, 1999 pUT Ampicillin [100] Konstruktion / Transformation diese Arbeit p5’UT3’ Ampicillin [100] Transformation diese Arbeit pGT Ampicillin [100] Konstruktion / Transformation diese Arbeit p5’GT3’ Ampicillin [100] Transformation diese Arbeit pBIN5‘uidA3‘ Kanamycin [50] Transformation Pisch, 2000 puidA Ampicillin [100] Transformation von Triticum diese Arbeit p5‘uidA3‘ Ampicillin [100] Transformation von Triticum diese Arbeit

2.1.4 Antibiotika Tab. 2: Die verwendeten Antibiotika

Antibiotikum

Konzentration

Bezugsquelle

Ampicillin Kanamycin

100 mg x l-1

100 mg x l-1

Fa. SIGMA Fa. SIGMA


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2.2 PFLANZENMATERIAL

2.2.1 Triticum aestivum L. cv. ‘Combi‘

Triticum aestivum L. cv. ‘Combi‘ (Engelen-Büchling; Oberschneiding; Zulassung 1990) 2.3 ISOLIERUNG VON NUKLEINSÄUREN

2.3.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli

2.3.1.1 Maxipräparation nach Sambrook et al., 1989

50 ml LB-Medium, das mit dem entsprechenden Antibiotika versetzt wurde, wurden mit 10 µl einer Glycerinkultur, oder einer Vorkultur des benötigten Bakterienstammes beimpft und über Nacht bei 37 °C geschüttelt. 40 ml der über Nacht gewachsenen Kultur wurden in Zentrifugenröhrchen überführt und zentrifugiert (Kühlzentrifuge Sorvall RC 5B Plus, HB-4-Rotor, 4000 rpm, 10 min, 4 °C). Der Niederschlag wurde in 1 ml Lösung I resuspendiert. Die alkalische Lyse der Zellen erfolgte durch Zugabe von 1,3 ml Lösung II und einer Inkubation von 5 min auf Eis. Durch Neutralisation mit 1,15 ml eiskalter Lösung III wurde die Lyse abgestoppt und weitere 10 min auf Eis inkubiert. Hierbei wurden Proteine und chromosomale DNA ausgefällt, während die Plasmid-DNA in Lösung blieb. Durch Zugabe von 1,35 ml Lösung IV und einer erneuten 10 minütigen Inkubation auf Eis wurde dieser Vorgang verstärkt. Die Abtrennung der ausgefällten Proteine und der chromosomalen DNA erfolgte durch Zentrifugation (SS 34-Rotor, 15000 rpm, 20 min, 4 °C). Der Überstand wurde in frische, sterile Zentrifugenröhrchen überführt, mit 5 ml H2O, sowie 20 ml vergälltem, 96 %igem Ethanol (RT) vermischt und zentrifugiert (Kühlzentrifuge Sorvall RC 5B Plus, SS 34-Rotor, 12000 rpm, 20 min, 4 °C). Die ausgefällte und sedimentierte Plasmid-DNA wurde im Vakuum getrocknet. Der Niederschlag in 500 µl Lösung V gelöst, mit 12 µl RNase-Lösung versetzt und 10 min bei 60 °C inkubiert. Anschließend wurde die DNA-Lösung in ein Eppendorfgefäß überführt und zur Entfernung von Proteinresten einer Phenolextraktion zugeführt. Hierzu wurde die Lösung mit 400 µl Phenol versetzt und gemischt, anschließend die Phasen durch Zentrifugation in einer Eppendorfzentrifuge getrennt. Die obere, wässrige Phase mit der DNA wurde in ein frisches


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Eppendorfgefäß überführt, mit 400 µl einer 1:1 (v/v) Mischung Phenol/Chloroform versetzt und wie oben weiter behandelt. Die wässrige Phase wurde erneut abgenommen, in ein frisches Eppendorfgefäß überführt und mit 400 µl Chloroform wie oben beschrieben behandelt. Wieder wurde die wässrige Phase in ein frisches Eppendorfgefäß überführt und durch Zugabe von 1 ml (dies entsprach dem 2,5fachen Volumen) absolutem Ethanol (RT) bei -20 °C für mindestens 20 min gefällt. Es folgte eine Zentrifugation (Eppendorfzentrifuge 5402, 14000 rpm, 15 min, 4 °C) und das Aufnehmen des Niederschlags in 200 µl Lösung V. Nach Zugabe von 200 µl Lösung VI wurde die DNA erneut - wie oben beschrieben - gefällt und abzentrifugiert. Nach Waschen des Niederschlags mit 70 %igem Ethanol (RT), wurde kurz (2 min) abzentrifugiert, so dass der Niederschlag im Vakuum getrocknet und abschließend in 150 µl sterilem H2O aufgenommen werden konnte. Lösungen und Geräte: Lösung I:

25 mM Tris/HCl; 10 mM Na2EDTA; 50 mM Glucose; pH 8.0; autoklaviert

Lösung II: 0,2 N NaOH; 1 % SDS (w/v); vor Gebrauch aus Stammlösungen frisch anzusetzten

Lösung III: 5 M Kaliumacetat; pH 4.8; autoklaviert Lösung IV: 10 M Ammoniumacetat; autoklaviert Lösung V: 10 mM Tris/HCl; 1 mM Na2EDTA; pH 8.0; autoklaviert Lösung VI: 0,3 M Natriumacetat; autoklaviert RNase-Lösung: 10 mg x ml-1 DNase-freie, pankreatische RNase wurden in 10 mM Tris/HCl (pH 7.5),

15 mM NaCl gelöst; die Lösung wurde für 15 min auf 100 °C erhitzt, dann langsamabgekühlt; die RNase-Lösung wurde in 1ml Aliquots portioniert und bei -20 °C gelagert.

Phenol: Geschmolzenes Phenol, 0,1 % (w/v) Hydroxychinolin und 0,2 % (v/v) Mercaptoethanol wurden mit dem gleichen Volumen an Phenolpuffer (1 M Tris/HCl; 0,1 M Na2EDTA;pH 8.0) gemischt. Die Phasentrennung wurde durch Zentrifugation (GS-3 Rotor,5000 rpm, 10 min) beschleunigt. Die Phenolphase wurde zweimal mit 1/10 Phenolpuffer ausgeschüttelt und dann in Schnappdeckelgläser überführt, mit Phenolpuffer überschichtet und bei -20 °C gelagert.

Chloroform: Chloroform : Isoamylalkohol im Verhältnis 24 : 1 (v/v) Phenol/Chloroform: Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol = 25 : 24 : 1 (v/v) Kühlzentrifugen: Sorvall RC 5B Plus und Eppendorfzentrifuge 5402 Rotoren: SS 34; HB-4

2.3.1.2 Minipräparation nach He et al., 1990 (modifiziert)

Aus 5 ml einer Übernachtkultur wurden 1,5 ml in einem sterilen Eppendorfgefäß abzentrifugiert (Eppendorfzentrifuge, 2 min). Nach Entfernung des Überstands wurden erneut 1,5 ml der Übernachtkultur zugegeben und wie beschrieben zentrifugiert. Das Sediment wurde in 100 µl Aufschlußlösung resuspendiert und mit dem gleichen Volumen Phenol/Chloroform auf dem Reagenzglasschüttler durchmischt. Es folgte eine Zentrifugation (Eppendorfzentrifuge 5402, 14000 rpm, 1 min, RT). Die obere, wässrige Phase wurde mit dem 2fachen Volumen an eiskaltem, absolutem Ethanol vermischt,


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um die DNA dann bei -20 °C für ca. 20 min zu fällen. Das Präzipitat wurde abzentrifugiert (Eppendorfzentrifuge 5402, 14000 rpm, 15 min, 4 °C) und mit 1 ml absolutem Ethanol gewaschen. Anschließend wurde der Niederschlag im Vakuum getrocknet und in 30 µl sterilem H2Obidest. aufgenommen. Lösungen und Geräte:

Aufschlusslösung: 50 mM Tris/HCl, pH 8.0; 2,5 mM LiCl; 62,5 mM Na2EDTA; 4 % (w/v) Triton X-100

Phenol/Chloroform: Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol = 25 : 24 : 1 (v/v) Zentrifuge: Eppendorf Centrifuge 5402 Einhandschüttler: Whirl mix, Reax 2000, Heidolph

2.3.2 Isolierung genomischer DNA

2.3.2.1 Isolierung von genomischer DNA aus Triticum nach Hess et al., 1985 (modifiziert)

Zur Isolierung genomischer DNA wurde bevorzugt das Fahnenblatt der Weizenpflanze verwendet, wobei 150 bis 200 mg frisches oder bei -20 °C eingefrorenes Blattmaterial eingesetzt wurde. Nach Zerreiben des Materials in flüssigem Stickstoff wurde das entstandene, feine Pulver in 700 µl Extraktionspuffer aufgenommen und kräftig durchmischt. Proteine wurden durch Zugabe von 500 µl Phenol entfernt. Nach Zentrifugation (10000 rpm; 10 min; 4 °C) erfolgten zwei weitere Reinigungsschritte mit 500 µl Chloroform/Isoamylalkohol (24:1); anschließend wurde zur Entfernung von Salzen über Nacht bei Raumtemperatur dialysiert. Lösungen und Geräte:

Extraktionspuffer: Dialysepuffer: Dialyseschläuche:

0,15 M NaCl; 0,1 M EDTA; 0,5 % (w/v) SDS; pH 8.0 5 mM Tris/HCl; 5 mM NaCl; 0,5 mM EDTA; 2,5 % (w/v) PEG4000; pH 8.0 Nadir / Kalle, Porengröße 1,5 - 2 nm; vor Verwendung wurden die Schläuche jeweils 10 min in 5 % (w/v) Na2CO3-Lösung und 10 mM EDTA-Lösung gekocht und anschließend mehrfach mit sterilem H2Odeion. gewaschen.

2.3.2.2 Isolierung von genomischer DNA aus Triticum mittels Genome Clean

Für die rasche Gewinnung pflanzlicher DNA wurde außer der unter 2.3.2.1 genannten Methode auch der Genome Clean-Kit der Fa. ASG verwendet. Hierzu wurde ca. 150 mg Blattmaterial in flüssigem Stickstoff mit Mörser und Pistill pulverisiert und in 180 µl Puffer 1 aufgenommen und gut durchmischt. Nach einer 10 minütigen Inkubationsphase bei 68 °C


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wurde 180 µl Chloroform zugegeben, gemischt und 3 min in der Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, mit 180 µl H2Obidest, steril und 20 µl Puffer 2 versetzt und 10 min bei RT inkubiert. Nach 2 minütiger Zentrifugation wurde der Überstand verworfen, der Niederschlag in 60 µl Puffer 3 gelöst und anschließend mit 150 µl 96 % EtOH gefällt. Es wurde 10 min zentrifugiert (Kühlzentrifuge Sorvall RC 5B Plus, Eppendorf-Rotor, 12000 rpm, 4 °C), der Nierderschlag getrocknet und anschließend in 20 µl TE-Puffer aufgenommen. Lösungen und Geräte:

Genome Clean-Kit der Fa. ASG TE-Puffer: Zentrifugen:

10 mM Tris-HCl, pH 8.5 Sorvall RC 5B Plus und Eppendorfzentrifuge 5402

2.3.3 Bestimmung der Konzentration und Reinheit von Nukleinsäuren

Zur Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von DNA- oder RNA werden wässrige DNA- bzw. RNA-Lösungen hergestellt, die dann spektralphotometrisch untersucht werden. Das Absorptionsmaximum von Nukleinsäuren liegt bei λ = 260 nm. Bei der Verwendung von 1 cm dicken Quarzküvetten entspricht die Extinktion von 1,0 einer DNA-Konzentration von 50 µg x ml-1 für doppelsträngige DNA, 40 µg x ml-1 bei einzelsträngiger DNA oder RNA. Unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors kann mittels der gemessenen Absorption die Konzentration einer Plasmid-DNA-Lösung näherungsweise wie folgt berechnet werden: c [µg/ml] = E260 x 50 x F. Wobei c die Konzentration der DNA, E260 die Extinktion bei λ = 260 nm und F der Verdünnungsfaktor ist. Um eine Aussage über die Reinheit der DNA machen zu können, wird zusätzlich die Extinktion bei λ = 280 nm bestimmt. In diesem Bereich besitzen aromatische Aminosäuren und Phenole ihre Absorptionsmaxima. Das Verhältnis von E260/E280 liegt für reine DNA-Präparationen bei 1,8, für reine RNA-Präparationen bei 2,0. Man muß hierbei beachtet, dass vorhandene RNA das Ergebnis der Messung erheblich verfälschen kann. Aus diesem Grund wurde auch eine Abschätzung der DNA-Konzentration über die Fluoreszenz von gebundenem Ethidiumbromid vorgenommen, indem die Fluoreszenzintensität der Fragmentbande auf einem Agarosegel mit den entsprechenden Banden des Längenstandards verglichen wurde. Hierbei betrug die Konzentration der 1,636 kb Bande des Längenstandards 10 % der insgesamt eingesetzten Menge. In 1 µl des Längenstandards sind 0,1 µg DNA enthalten. Es wurden in der Regel 5 µl des Längenstandards eingesetzt. Ein weiterer Vorteil der Abschätzung auf dem Agarosegel war, dass chromosomale DNA von Plasmid-DNA aufgrund ihrer unterschiedlichen Laufparameter abgetrennt wurde.


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2.4 DNA-MODIFIZIERENDE REAKTIONEN

2.4.1 Restriktionsspaltung von Plasmid-DNA

Zur Spaltung von Plasmid-DNA wurden normalkonzentrierte (10-20 Units µl-1, 1 Unit pro µg DNA), zur Spaltung von genomischer Pflanzen-DNA hochkonzentrierte (60-100 Units µl-1, 2,5 Units pro µg DNA) Restriktionsendonukleasen der Firmen Pharmacia, Roche und Gibco BRL eingesetzt. Die Reaktion wurde in den jeweils mitgelieferten und firmenseitig empfohlenen Puffersystem für 2-16 h bei 37 °C durchgeführt. Zur Spaltung genomischer Pflanzen-DNA wurden zusätzlich ca. 2 Units RNase T1 pro µg DNA verwendet.

2.4.2 Ligation

2.4.2.1 Sticky end-Ligation Zur Ligation wurde mit Vektor-Insert-Verhältnis im Reaktionsansatz gearbeitet, die sich zwischen 1:1 und 1:100 bewegten. Die eingesetzte DNA-Menge lag im Bereich 50 bis 300 ng. Um die Wasserstoffbrücken zwischen den Basen kohäsiver Enden zu lösen, wurde die DNA 5 min bei 42 °C inkubiert. Es wurden 2 µl Ligasepuffer zugegeben, der Ansatz mit H2Obidest. auf 9 µl aufgefüllt und mit 1 µl T4-DNA-Ligase versetzt. Die Reaktion erfolgte bei RT für 1 h. Anschließend wurde die Reaktion durch 10 minütige Inkubation bei 65 °C im Wasserbad abgestoppt. 2.4.2.2 Blunt end-Ligation Die blunt end-Ligation wurde wie die sticky end-Ligation durchgeführt, mit dem Unterschied, dass bis zu 10 u Ligase eingesetzt wurden und die Reaktion im Kryostaten bei 14 °C durchgeführt wurde. Lösungen und Geräte:

T4-DNA-Ligase : 2 u x µl-1 ;-20 °C (Fa. Pharmacia) Ligasepuffer (5fach konzentriert): (Fa. Gibco) Kryostat: Haake F3


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2.4.3 Restriktionsspaltung chromosomaler DNA

Im Unterschied zur Restriktionsspaltung plasmidaler DNA wurden hochkonzentrierte Restriktionsenzyme (>40 u x µl-1) entsprechend den Herstellerangaben eingesetzt. Zur Spaltung genomischer Pflanzen-DNA wurden zusätzlich ca. 2 u RNase T1 pro µg DNA verwendet. 2.5 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE UND ELUTION VON DNA-

FRAGMENTEN

2.5.1 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA

Zur elektrophoretischen Auftrennung von Nukleinsäuren wurden Agarosegele (0,8 % [w/v]; NEEO, Roth) verwendet, denen zur Sichtbarmachung der Nukleinsäuren unter UV-Licht 0,2 µg x ml-1 Ethidiumbromid (Stammlösung: 10 mg x ml-1 H2Odeion.) zugesetzt worden waren. Die Nukleinsäurelösungen wurden im Verhältnis 9:1 mit Probenpuffer vermischt, um sie so auf das Gel aufzutragen zu können. Zur Identifizierung spezifischer Fragmente wurde der 1 kb DNA-Längenstandard der Firma Gibco/BRL herangezogen. Die Elektrophorese wurde in 1 x TBE-Puffer bei einer Stromstärke von 50 bis 100 mA durchgeführt. Sollten DNA-Fragmente < 500 bp analysiert werden, die Agarose in einer Konzentration von bis zu 2,0 % (w/v) eingesetzt. Zum Einsatz kam in diesem Falle außerdem ein 100 bp-Längenstandard (Gibco/BRL). Die Dokumentation der Agarosegele erfolgte nach beendeter Trennung der Fragmente photographisch unter UV-Licht (302 nm Durchlicht; Eagle Eye® Still Video System; Stratagene). Lösungen:

10 x TBE-Puffer: 0,89 M Tris/HCl; 0,89 M Borsäure; 0,02 M EDTA; pH 8.0 Probenpuffer: 0,5 % (w/v) Bromphenolblau; 50,0 % (v/v) Glycerin; 49,5 % (v/v) 1 x TBE-Puffer DNA-Längenstandard: GIBCO BRL ready loadTM 1 kb Längenstandard: 0,1 µg/µl DNA,

10 mM Tris/HCl (pH 7.5); 5 mM NaCl; 10 mM EDTA; 0,05 % Bromphenolblau; 5 % Glycerin


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2.5.2 Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

DNA-Fragmente definierter Länge, die innerhalb der angefallenen Konstruktionsschritte oder als Sonden-DNA für Southern blot-Analysen verwendet werden sollten, wurden aus den Agarosegelen mittels des QIAquick®-Gel Extraction Kits der Firma Qiagen entsprechend den Angaben des Herstellers eluiert. Lösungen und Geräte:

Bindungspuffer: QX 1 (Fa. Qiagen) Waschpuffer: PE (Fa. Qiagen) Lösungspuffer: 10 mM Tris (pH 8.0); autoklaviert Zentrifugensäulchen: QIAquick spin columns (Fa. Qiagen) Zentrifuge: Eppendorf 5414

2.6 TRANSFORMATION VON ESCHERICHIA COLI

2.6.1 Herstellung kompetenter Zellen

Mit 200 µl einer Übernachtkultur von E. coli (siehe 2.1) wurden 25 ml SOB-Medium in einem 250 ml Erlenmeyerkolben beimpft und 2 bis 3 Stunden bei 37 °C und 200 UpM geschüttelt. Bei einer optischen Dichte von etwa 0,5 bei λ=546 nm, wurde die Suspension in 50 ml Zentrifugenbecher überführt, für 15 min auf Eis inkubiert und abzentrifugiert (Rotor SS34, 3000 rpm, 15 min, 4 °C). Der Niederschlag wurde in 8 ml RF1-Puffer resuspendiert und 15 min auf Eis gekühlt. Es wurde unter denselben Bedingungen wie oben abzentrifugiert und der Niederschlag in 2 ml RF2-Puffer aufgenommen und erneut für 15 min auf Eis gestellt. Anschließend wurden 200 µl Portionen in Eppendorfgefäße überführt, sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70 °C bis zu ihrer Weiterverwendung gelagert. Lösungen und Geräte:

SOB-Medium: 2 % (w/v ) Fleischextrakt; 0,5 % (w/v) Hefeextrakt; 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl; 10 mM MgCl2; 10 mM MgSO4; pH 6,8; autoklaviert

RF1-Puffer: 100 mM RbCl; 50 mM MnCl2 x 4H2O; 30 mM KAc; 10 mM CaCl2 x 2H2O; 15 % (w/v) Glycerin; pH 5.8 (0,2 M Essigsäure); sterilifiltriert (0,22 µm Porenweite)

RF2-Puffer: 10 mM MOPS; 10 mM RbCl; 75 mM CaCl2 x 2H2O; 15 % (w/v) Glycerin; pH 6.8 (NaOH); sterilfiltriert (0,22 µm Porenweite)

Photometer: Beckman DU-64 Spektrophotometer


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2.6.2 Transformation kompetenter Zellen

Zur Transformation wurden pro Ansatz 200 µl kompetenter Zellen (siehe 2.6.1) auf Eis aufgetaut. Nach Zugabe des Ligationsansatzes (siehe 2.4.2) erfolgte für 30 min eine Inkubation auf Eis. Die Aufnahme der DNA in die Bakterienzellen wurde durch eine Hitzeschockbehandlung für 4 min bei 42ºC erreicht. Anschließend wurde für etwa 10 min auf Eis gekühlt. Nach Zugabe von 800 µl SOC-Medium wurden die Zellen bei 37 °C für 60 min leicht (80 - 100 rpm) geschüttelt. 100 µl eines jeden Ansatzes wurden nachfolgend auf selektive Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Lösungen und Geräte:

SOC-Medium: Das Medium entsprach dem SOB-Medium (2.6.1), wobei 20 mM Glucose zugesetzt wurde.

2.6.3 Selektion rekombinanter Klone

Eine hohe Zahl von Klonen lässt sich sehr schnell mit Hilfe einer Blau-Weiß-Selektion untersuchen, die bei Klonierungen in pUC-Vektoren und deren Derivaten, wie zum Beispiel den Klonierungsvektoren pBS+/- und pPCR-Script eingesetzt werden kann. Voraussetzung für eine Blau-Weiß-Selektion ist, dass der Wirtsbakterienstamm in seinem β-Galaktosidasegen die Mutation lacZ∆M15 trägt und sich im selben Bakterium ein Plasmid mit einem lacZ-Gen befindet, dessen Produkt, das α-Peptid, diese Mutation komplementieren kann. Als Induktor für die aktive β-Galaktosidase dient das Lactose-Analogon Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG), als Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-Gal). Das Enzym spaltet hydrolytisch den Galaktoserest ab, was zu einer Blaufärbung der entsprechenden Bakterienkolonie führt. Befindet sich ein Insert in diesem lacZ-Gen, so kann kein α-Peptid gebildet werden. Die α-Komplementation entfällt und die entsprechenden Bakterienkolonien sind weiß. Durchführung: 100 µl der frisch angesetzten X-Gal-Farbstoff-Lösung und 10 µl IPTG-Lösung wurden auf selektiven LB-Platten ausgestrichen und kurz getrocknet. Anschließend wurden 100 µl der zu untersuchenden Bakteriensuspension ausplattiert und bei 37 °C über Nacht inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurden die Platten für ca. 3 Stunden bei 4 °C gelagert, was zu einer Intensivierung der Blau-Färbung führte. Die weißen Kolonien wurden erneut auf Selektionsmedium ausgestrichen und mittels Restriktionsspaltungen ihrer durch Mini-präparation gewonnenen Plasmid-DNA molekulargenetisch untersucht.


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Lösungen:

LB-Platten: 20 g/l LB Fertigmedium; 15 g/l Agar; zur Selektion 100 mg/l Ampicillin oder 50 mg/l Kanamycin

X-Gal-Lösung: 1 % (w/v) 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-Galactosid (Fa. Roth) in Dimethylformamid; frisch angesetzt

IPTG-Lösung: 100 mM Isopropyl-β-D-Thiogalactosid (Fa. Roth) in H2O (bei –20 °C gelagert)

2.7 TRANSFORMATION VON TRITICUM AESTIVUM L.

2.7.1 Anzucht des Pflanzenmaterials

Die Keimung und Anzucht der Weizenpflanzen erfolgte ganzjährig im Gewächshaus. Pro 10 Liter Plastikgefäß wurden 30 Karyopsen ausgesät. Das Substrat bestand aus 70 % Kompost und 30 % Lehm. Eine Zusatzbeleuchtung mit Quecksilberdampflampen gewährte für das ganze Jahr eine Mindestbeleuchtungsstärke von 178,6 µmol m-2s-1 in Pflanzenhöhe. Die Mindesttemperatur betrug 20 °C. Es wurde wöchentlich mit Volldünger (GabiPlus; N/P/K = 12/8/11) gedüngt. Im Bedarfsfall wurde mit Schwefel-Verdampfung gegen Mehltau vorgegangen. Saugende Insekten wurden mit Pirimor (ICI, Frankfurt) und Spruzit (Neudorff GmbH, Emmerthal) bekämpft.

2.7.2 Pflanzenkulturmedien

L3-5 Medium (Jähne et al., 1991; modifiziert) Angaben pro Liter: Makroelemente: 1750 mg KNO3; 450 mg CaCl2 x 2 H2O; 350 mg MgSO4 x 7 H2O; 200 mg KH2PO4;

200 mg NH4NO3 Mikroelemete: 18,95 mg MnSO4 x H2O; 9,23 mg ZnSO4 x 7 H2O; 5 mg H3BO3; 0,75 mg KJ;

0,25 mg Na2MoO4 x 2 H2O; 0,025 mg CoCl2 x 6 H2O; 0,025 CuSO4 x 5 H2O Fe-EDTA: 37,3 mg Na2EDTA; 27,8 mg FeSO4 x 7 H2O Vitamine: 100 mg myo-Inosit; 10 mg Thiamin HCl; 1 mg Ascorbinsäure; 1 mg Nicotinsäure;

1 mg p-Aminobenzoesäure; 1 mg Pyridoxin HCl; 0,5 mg Ca-Pantothenat; 0,5 mg Cholinchlorid; 0,2 mg Folsäure; 0,1 mg Riboflavin; 0,005 mg Biotin

Aminosäuren: 750 mg Glutamin; 150 mg Prolin; 100 mg Asparagin organische Säuren: 10 mg Äpfelsäure; 10 mg Citronensäure; 10 mg Fumarsäure; 5 mg Natriumpyruvat Kohlenhydrate: 125 mg Cellobiose; 125 mg Fructose; 125 mg Mannose; 125 mg Rhamnose;

125 mg Ribose; 125 mg Xylose; 30 g Maltose Phytohormone: 1 mg (= 5 µM) 2,4-D Gelrite (Roth): 2 g BASTA® (Hoechst): fallweise 2,0 mg, oder 5,0 mg Phosphinothricin (PPT) aus einer BASTA®-

Stammlösung von 200 g x l-1 PPT, vor dem Sterilfiltrieren zugegeben pH: 5.8


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Die Komponenten des Mediums wurden doppelt konzentriert sterilfiltriert (Media Cap, Porengröße 0,2 µm, Microgon) und vor dem Gießen zur Verfestigung im Verhältnis 1:1 mit einer aufgekochten und auf ca. 50 °C abgekühlten Gelrite-Lösung gemischt. R1-Medium (Murashige und Skoog, 1962, modifiziert; Ahuja et al., 1982) zur Regeneration aus Weizen-Gewebekulturen: Zusammensetzung pro Liter: Makroelemente: 1,9 g KNO3; 1,65 g NH4NO3; 440 mg CaCl2 x 2 H2O; 370 mg MgSO4 x 7 H2O; 170 mg

KH2PO4 Mikroelemente: 16,9 mg MnSO4 x H2O; 8,6 mg ZnSO4 x 4 H2O; 6,3 mg H3BO3; 0,83 mg KJ; 0,25 mg

Na2MoO4 x 2 H2O; 0,025 mg CoCl2 x 6 H2O; 0,025 mg CuSO4 x 5 H2O Fe-EDTA: 37,3 mg Na2EDTA; 27,8 mg FeSO4 x 7 H2O Vitamine: 100 mg myo-Inosit; 10 mg Thiamin HCl; 1 mg Nicotinsäure; 1 mg Pyridoxin HCl (nach

Gamborg et al., 1968) Kohlenhydrate: 30 g Maltose Phytohormone: 0,5 mg BAP; 0,05 mg NAA Gelrite: 2 g BASTA®: 5,0 mg Phosphinothricin (PPT) aus einer BASTA®-Stammlösung von 200 g x l-1 PPT, vor

dem Sterilfiltrieren zugegeben pH: 5.8

Das Gelrite wurde doppelt konzentriert unter Erwärmen gelöst, mit dem doppelt konzentrierten Medium gemischt und autoklaviert (121 °C, 2 bar, 20 min).

190-2-Medium (Zhuan et al., 1984) zur Bewurzelung der Regeneratpflanzen Zusammensetzung pro Liter: Makroelemente: 1 g KNO3; 300 mg KH2PO4; 200 mg MgSO4 x 7 H2O; 200 mg (NH4)2SO4; 100 mg Ca(NO3)2

x 4 H2O; 40 mg KCl Mikroelemente: 6 mg MnSO4 x H2O; 3 mg ZnSO4 x 7 H2O; 3 mg H3BO3; 0,5 mg KJ Fe-EDTA: 37,3 mg Na2EDTA; 27,8 mg FeSO4 x 7 H2O Vitamine: 100 mg myo-Inosit; 1 mg Thiamin HCl; 0,5 mg Pyridoxin HCl; 0,5 mg Nicotinsäure Aminosäuren: 2 mg Glycin Kohlenhydrate: 30 g Saccharose Gelrite: 2 g Aktivkohle: 10 g pH: 6.0 autoklaviert (121 °C, 2 bar, 20 min)


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2.7.3 Isolierung und Kultur unreifer Embryonen

Zur Kultur unreifer Weizenembryonen wurden unreife Karyopsen ca. zwölf Tage nach Anthese herangezogen. Die entspelzten Karyopsen wurden 15 min in einer 25 %igen „Domestos-Stammlösung“ mit 0,01 % (w/v) Captan (Merck) und 0,01 % Tween 80 (Serva) oberflächensterilisiert und anschließend 4 mal in sterilem Wasser gewaschen. Unreife Embryonen wurden unter dem Stereomikroskop präpariert, indem die Karyopse oberhalb des Embryos aufgeschnitten und dieser unter leichtem Druck mit dem Skalpell auf die Spitze der Karyopse freigelegt wurde. Die so präparierten unreifen Embryonen wurden zur Kallusinduktion mit der embryonalen Achse nach unten auf L3-5-Medium (siehe ) gelegt und entweder 4-6 Tage für den Beschuss unreifer Embryonen oder drei Wochen für den Beschuss von Scutellarkallus bei 25 °C und Dunkelheit kultiviert. Domestos-Stammlösung: 10,5 % (w/v) NaOCl; 0,3 % (w/v) Na2CO3; 10 % (w/v) NaCl; 0,5 % (w/v) NaOH

2.7.4 Partikelbeschuss

Aufbereitung der Mikroprojektile Es wurden 60 mg Goldpartikel (Durchmesser 1 µm; BioRAD) in 70 %igem Ethanol aufgenommen und 10 min geschüttelt. Nach Abzentrifugieren (ca. 10 s) in der Tischzentrifuge wurde der Überstand verworfen und dreimal mit sterilem Wasser gewaschen. Anschließend wurden die Goldpartikel in 1 ml einer 50 %igen Glycerinlösung aufgenommen. Beladung der Mikroprojektile In 50 µl homogenisierter Goldsuspension wurden 10 µl DNA-Lösung (Konzentration 1 µg µl-1) pipettiert und 1 min auf dem Whirl Mix durchmischt und auf Eis gestellt. Durch die gleichzeitige Zugabe von 20 µl einer 0,1 M Spermidinlösung und 50 µl einer 2,5 M CaCl2-Lösung wurde die Fällung der DNA erreicht. Diese Suspension wurde 3 min durchmischt und kurz abzentrifugiert. Der entstandene Niederschlag wurde zweimal mit 250 µl 70 %igem Ethanol gewaschen und in 72 µl 98 %igem Ethanol aufgenommen. Pro Beschuss wurden 12 µl der Suspension eingesetzt. Vorbereitung der Makroprojektile Die Makroprojektile wurden 1 h in 70 %igem Ethanol oberflächensterilisiert, getrocknet und in die dafür vorgesehenen Halterungen eingesetzt. Die 12 µl Gold-DNA-Suspension (bei Kontrollen Gold-Suspension) wurde in die Mitte der Makroprojektile aufgetropft und die Trocknung der Goldsuspension abgewartet.


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Partikelbeschuss Verwendet wurde die Apparatur PDS-1000/He (Russel-Kikkert, 1993) der Firma BioRad, München. Das Vakuum betrug 27 zoll Quecksilbersäule. Dies entspricht einem Unterdruck von circa 915 hpa. Der durch Helium der Reinheit 4.6 erzeugte Beschussdruck lag bei 1350 psi, wobei der Abstand zwischen Abstoppgitter und Zielgewebe betrug circa 6 cm.

2.7.4.1 Partikelbeschuss von Scutellarkallus

Etwa drei Wochen nach Induktion wurde der Scutellarkallus unter dem Stereomikroskop subkultiviert. Hierbei wurden sämtliche nicht-embryogene Gewebebereiche entfernt. Der erhaltene embryogene Kallus wurde gleichmäßig auf eine kreisrunde Fläche (Ø 2,4 cm) in der Mitte einer Petrischale mit L3-5-Medium verteilt. Pro Beschuss mussten hierzu, je nach Menge des gewonnenen Kallus, zwischen 40 und 125 unreife Embryonen eingesetzt werden. Der Partikelbeschuss erfolgte am darauffolgenden Tag.

2.7.4.2 Partikelbeschuss von unreifen Embryonen

Pro Beschuss wurden zwischen 50 oder 75 unreife Embryonen präpariert und zur Kallusinduktion auf L3-5-Medium ausgelegt. Nach 4-6 Tagen Vorkultur wurden die Embryonen auf frisches L3-5-Medium mit 0,5 M Mannit umgesetzt. Diese osmotische Behandlung wurde für 5 bis 6 h vor und für 16 h nach dem Partikelbeschuss aufrechterhalten. Zur weiteren Kultur wurden die Embryonen auf L3-5-Medium ohne Mannit überführt.

2.7.5 Kultur und Selektion des Kallus

Am 8. Tag nach dem Partikelbeschuss wurden die Kalli bzw. unreifen Embryonen auf selektives L3-5-Medium überführt, das 2 mg l-1 Phosphinothricin enthielt. Ab dem 15. Tag wurde die Konzentration auf 5 mg l-1 PPT erhöht. Die Versuchsansätze wurden von folgenden Kontrollansätzen begleitet: Zum einen wurden Scutellarkalli bzw. Embryonen mitgeführt, die keinem Partikelbeschuss unterzogen worden waren und zum anderen Scutellarkalli und Embryonen die mit nicht-DNA-beladenen Goldpartikeln beschossen worden waren. Diese Kontrollen wurden dann in der Regel keinem PPT vermitteltem Selektionsdruck ausgesetzt. Nur zur Überprüfung der Selektionseffizienz wurden die Kontrollen wie die Versuchsansätze auf phosphinothricinhaltigen Medien kultiviert, um die Regenerationsfähigkeit solcher Kalli zu untersuchen.


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2.7.6 Regeneration

Nach vier Wochen wurden die Kalluskulturen subkultiviert und auf Regenerationsmedium R1 mit 4 mg l-1 PPT überführt. Bei den versuchsansätzen wurde R1-Medium ohne PPT verwendet. Im Falle der beschossenen Kalli wurde unter dem Binokular embryogener Kallus vom Rest abgetrennt und auf R1P4 weiterkultiviert. Im Falle der beschossenen unreifen Embryonen im GFP-System wurden unter Fluoreszenzbedingungen gfp-exprimierende Gewebebereiche abgenommen und auf R1P4-Medium überführt. Anschließend wurden die Petrischalen zunächst bei Schwachlicht (ca. 6,8 µmol m-2s-1) und nach zwei Tagen im Vollicht ( ca. 54 µmol m-2s-1) bei 25 °C und einer Photoperiode von 16 h kultiviert. Regenerierende Sprosse ab einer Länge von 5 mm wurden in Schnappdeckelgläser (75 mm Höhe, 26 mm Durchmesser, 5 ml Medium) mit R1P4-Medium umgesetzt.

2.7.7 Bewurzelung

Zur Bewurzelung wurden regenerierte Pflänzchen in 1000 ml Glasgefäße mit Bewurzelungsmedium 190-2 überführt. Die Kulturbedingungen blieben gleich.

2.7.8 Ex vitro-Kultur der Regeneratpflanzen

Regeneratpflanzen mit ausgeprägtem Wurzelsystem wurden in Plastiktöpfe mit gedämpfter Einheitserde (Typ P) gesetzt und mit lichtdurchlässigen Plastiktüten als Verdunstungsschutz für weitere drei Tage, wie oben erwähnt kultiviert. Anschließend wurden die Pflanzen ins Gewächshaus überführt und dort weitere 3 Tage unter den Plastiktüten belassen. Anschließend erfolgte die Kultur wie unter 2.7.1 beschrieben. 2.8 NACHWEIS DER FREMDGENE

2.8.1 Southern blot-Analyse

Nach Restriktionsspaltung und gelelektrophoretischer Auftrennung der DNA-Fragmente wurde das Agarosegel zur Depurinierung der DNA für 10 min in 0,25 N HCl inkubiert. Nach 10 minütigem Waschen des Gels in H2Odeion. wurde es zur Denaturierung der DNA für 10 min


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in Transferpuffer behandelt. Der eigentliche Transfer der DNA auf die Nylonmembran (Gene Screen Plus®, DuPont; Hybond™-N, Amersham) erfolgte durch Kapillarkräfte unter denaturierenden Bedingungen über Nacht bei RT. Nach dem Waschen der Membran in 2 x SSC wurde die DNA durch UV-Bestrahlung (120 mJ; Stratagene UV Stratalinker 1800) irreversibel an die noch feuchte Membran gebunden. Depurinierungslösung: 0,25 N HCl Transferpuffer: 0,4 N NaOH; 3,0 M NaCl 20 x SSC: 0,3 M Na3Citrat; 3,0 M NaCl; autoklaviert

2.8.1.1 Isolierung von Sonden

Die enzymatisch gespaltenen (2.4.1) und gelelektrophoretisch aufgetrennten Fragmente (2.5.1) wurden aus dem Agarosegel eluiert (2.5.2). Tab. 3 zeigt die verwendeten Sonden, deren Herkunft und die verwendeten Restriktionsenzyme. Tab. 3: Übersicht über die für die Southern blot-Analyse verwendeten Sonden

Sondenbezeichnung Plasmid verwendete Restriktionsenzyme Größe der Sonde [kb] bar pAHC25 PstI 0,60 uidA pAHC25 SacI / XbaI 1,90 gfp pMON30049 PstI / EcoRI 1,35 tom5 pTOM5 PstI / KpnI 1,46 psy pPSY BamHI / SacI 1,28 5zMAR p5zMAR XbaI / XhoI 1,22 3zMAR p3zMAR EcoRI / BamHI 2,49

2.8.1.2 Markierung der Sonden-DNA

Die radioaktive Markierung von Sonden-DNA erfolgte nach Feinberg und Vogelstein, 1984 (modifiziert) in Form einer Doppelmarkierung mit [α32P] dATP und [α32P] dCTP unter Verwendung des RadPrime-Markierungssystems der Firma Gibco/BRL. Das Gesamtvolumen eines jeden Markierungsansatzes betrug 50 µl, wobei pro dNTP 20 bis 30 µCi Aktivität eingesetzt wurden. Zusammensetzung und Inkubationsdauer eines Markierungsansatzes entsprachen den Herstellerempfehlungen. Nach erfolgter Markierung wurde die Sonden-DNA mit Hilfe einer Gelfiltration (Sephadex G 50-Säule, Nick-Column DNA-Grade, Pharmacia)


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von nichteingebauten dNTPs gereinigt. Anschließend wurde der Einbau der radioaktiv markierten dNTPs unter Verwendung eines Szintillationszählers (Benchcount 2000, DuPont) geprüft. G 50-Puffer: 10 mM Tris/HCl; 0,1 mM EDTA; 0,5 % (w/v) SDS; pH 8,0

2.8.1.3 Hybridisierung und Nachweis der Hybridisierung

Zur Absättigung freier Bindungsstellen wurde eine zwei- bis vierstündigen Prähybridisierung (Hybridisation Oven, Appligene) bei 65 °C durchgeführt. Anschließend wurde die denaturierte 32P-markierte Sonden-DNA zugeggben. Die eigentliche Hybridisierung erfolgte dann für 18 bis 20 h, ebenfalls bei 65 °C. Zur Entfernung nicht spezifisch gebundener oder freier Sonden-DNA wurden die Nylonmembranen nach der Hybridisierung mit SSC-Lösungen absteigender Konzentration bei 65 °C gewaschen: 1x kurz in Waschlösung I schwenken; 1x 10 min in Waschlösung I anschließend 2x 10 min in Waschlösung II und 1x 10 min in Waschlösung III. Lösungen:

Prähybridisierungslösung: 1,0 M NaCl; 10,0 % (w/v) Dextransulfat; 3,0 % (w/v) SDS; 100 µ ml-1 denaturierte Lachssperma-DNA

Waschlösung I: 6x SSC (s. 2.13.2); 1 % (w/v) SDS Waschlösung II: 2x SSC; 1 % (w/v) SDS Waschlösung III: 0,1x SSC; 1 % (w/v) SDS Der Nachweis einer Hybridisierung erfolgte autoradiographisch mit Hilfe von auf die Mambranen aufgelegten Röntgenfilmen (Kodak X-OMAT AR). Die Exposition dauerte drei bis fünf Tage und wurde bei -70 °C in Röntgenfilmkassetten mit Verstärkerfolie (Quanta III, DuPont) durchgeführt. 2.9 NACHWEIS DER FREMDGENEXPRESSION

2.9.1 Konzentrationsbestimmung von Proteinextrakten (Bradford, 1976)

Zur Bestimmung von Proteinkonzentrationen in Proteinextrakten wurde das Färbereagenz der Firma Biorad (Protein Assay Dye Reagent) eingesetzt. Von dem mit H2O 1 zu 1000 verdünnten Proteinextrakt wurden 800 µl in Plastikküvetten (Roth) mit 200 µl der Färbelösung vermischt. Nach einer Inkubationszeit von 5 bis 10 min bei Raumtemperatur


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wurde die Extinktion bei einer Wellenlänge von λ = 595 nm gemessen (Beckman DU-64 Spektralphotometer). Mit Hilfe einer Eichgeraden (10 mg x ml-1 BSA in H2O) konnten dann die Proteinkonzentrationen bestimmt werden.

2.9.2 Nachweis der Phosphinothricinacetyltransferase-Aktivität (PAT-Test) (Spencer et al., 1990, modifiziert)

Dieses als PAT-Test bezeichnete Verfahren basiert auf der Fähigkeit der PPT-Acetyltransferase, aus Acetyl-Coenzym A den Acetylrest auf Phosphinothricin (PPT) zu übertragen. Um diese Reaktion verfolgen zu können wird 14C-markiertes Acetyl-Coenzym A eingesetzt. Das Produkt dieser Reaktion, 14C-Acetyl-PPT, kann nach dünnschicht-chromatographischer Auftrennung auf einem Röntgenfilm sichtbar gemacht werden. Ca. 100 mg Blattmaterial wurden in flüssigem Stickstoff zerrieben und in 70 µl Extraktionspuffer aufgenommen. Nach dem Zentrifugieren (10000 rpm, 15 min, 4 °C) wurde die Proteinkonzentration im Rohextrakt bestimmt (s. 2.9.1). 50 µg Protein wurden in einem maximalen Volumen von 14 µl Extraktionspuffer gelöst. Nach der Zugabe von 3 µl 10 % (v/v) BASTA®-Lösung (200 g x l-1 PPT; Hoechst) und 2 µl 14C-Acetyl-CoA (0,1 µCi) wurde der Ansatz 45 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde auf Eis abgestoppt und das gesamte Volumen punktförmig auf eine DC-Fertigplatte (Kieselgel 60 / 20 x 20 cm / Schichtdicke: 0,25 mm; Merck) aufgetragen. Nach dem Lauf der Dünnschichtchromatographie (~3 h) wurde die Platte getrocknet und ca. vier Tage autoradiographiert (Kodak X-OMAT AR, Quanta III, DuPont). Die Aktivität des Enzyms ließ sich so anhand des 14C-acetylierten Phosphinothricins erfassen. Lösungen:

Extraktionspuffer: 50 mM Tris/HCl; 2 mM EDTA; 0,15 mg x l-1 Leupeptin; 0,15 mg x l-1

Phenylmethylsulfonylfluorid; 0,3 mg x l-1 BSA; 0,3 mg x l-1 Dithiothreitol; pH 7,5 Laufmittel: 1-Propanol / Ammoniak [25 %] (3:2) BASTA®-Lösung: 20 g x l-1 PPT in Extraktionspuffer


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2.9.3 Fluoreszenzanalyse verschiedener Gewebebereiche hinsichtlich der gfp-Expression

Die Expression des gfp-Gens wurde unter Verwendung des folgenden Filtersatzes durchgeführt: Anregungsfilter BP 450-490 nm (Zeiss), Sperrfilter OG 515 nm (AHF-Analysetechnik AG, Tübingen, Deutschland). Als Lichtquelle diente eine Osram HBO 100 Quecksilberdampf-Kurzbogenlampe, die über einen Flüssiglichtleiter (FL S, Fa. Zeiss) mit einem Fokussiervorsatz (FL S 0,4, Fa. Zeiss) verbunden war. Die Beobachtungen wurden mit einem Zeiss Stemi SV11-Stereomikroskop durchgeführt. Die fotografische Dokumentation erfolgte mit einer Zeiss Mikroskopkamera MC 80 und Fujichrome Sensia 100 ASA Filmen.

2.9.4 Histochemischer Nachweis der transienten Expression des β-Glucuronidasegens in Kalluskulturen und transgenen Pflanzen

Als Ausgangsmaterial wurde embryogener Kallus, zwei Tage nach Partikelbeschuss, sowie Pollen und Blattmaterial von Regeneratpflanzen. Sowohl Kallus als auch Pollen wurde zwei Tage in der Färbelösung bei 37 °C inkubiert und anschließend unter dem Stereomikroskop (Stemi SV 11, Zeiss) ausgewertet. Blattmaterial wurde vor der Auswertung zur Entfernung von Chlorophyll für ein bis zwei Tage bei 37 °C mit 70 % (v/v) EtOH behandelt. Färbelösung: 50 mM NaH2PO4/Na2HPO4; 0,5 mM 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronid Cyclo-

hexylammoniumsalz (Biosynth, Staad / Schweiz); 0,5 mM K3[Fe(CN)6]; 0,5 mM K4[Fe(CN)6]; pH 7.0

2.9.5 Fluorimetrischer Nachweis der β-Glucuronidase (GUS-Test)

Das Blattmaterial wurde in flüssigem Stickstoff homogenisiert und in 800 µl Extrak-tionspuffer aufgenommen. Nach Zentrifugation (10000 rpm, 15 min, 4 °C) und Proteinkonzentrationsbestimmung (s. 2.10.1) wurden 50 µg Protein zu 500 µl Reaktionspuffer hinzugegeben. Die einzelnen Reaktionsansätze wurden bei 37 °C im Wasserbad (Köttermann) inkubiert. Zu den Zeitpunkten 0, 15, 30 und 60 min nach Reaktionsstart wurden jeweils 100 µl entnommen und die Reaktion mit 900 µl Stop-Puffer beendet. Die Messung der GUS-Aktivität erfolgte nach Kalibrierung des Fluorimeters (BioRad VersaFluor) durch die Bestimmung der gebildeten Menge an 4-Methylumbelliferon (4-MU) bei einer


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Anregungswellenlänge von λ = 365 nm und einer Emissionswellenlänge von λ = 460 nm. Die Enzymaktivität wurde in pmol 4-MU x min-1 x mg-1 angegeben. Lösungen:

Extraktionspuffer: 50 mM NaH2PO4/Na2HPO4; 10 mM Dithiothreitol; 1 mM EDTA; 0,1 % (w/v) Laurylsarcosin; 0,1 % (w/v) Triton X-100; pH 7.0

Reaktionspuffer: 1 mM 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid (MUG) in Extraktionspuffer Stop-Puffer: 0,2 M Na2CO3 Eichlösung: 100 nM 4-Methylumbelliferon (MU) in Stop-Puffer

2.9.6 Western blot-Analyse des Green fluorescent proteins (GFP)

a) Proteinextraktion In 1,5 ml Eppendorfgefäße wurde 200 µl Extraktionspuffer vorgelegt und auf Eis gekühlt. Zirka 100 mg Pflanzenmaterial wurde in flüssigem Stickstoff gemörsert und in den vorgelegten Extraktionspuffer geben. Nachdem auf dem Whirl mix gut gemischt worden war wurde in der Kühlzentrifuge 10 min bei 14000 rpm (4 °C) abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und erneut 10 min bei 14000 rpm und 4 °C abzentrifugiert. Der Überstand wurde erneut abgenommen und bei –80 °C aufbewahrt. Lösungen:

Extraktionspuffer: 50 mM Tris-HCl pH 8.0 10 mM EDTA 10 mM Dithiothreitol 18% Glycerol sterilfiltriert

b) SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese Der Gelaufbau wurde zum Abdichten auf 1 %ige Agarose gestellt. Kleines Trenngel (12,5 %): Es wurden 3,9 ml Acrylamid-Stammlösung, 2,3 ml Trenngel-Puffer, 3,0 ml H2O, 107 µl APS-Lösung gemischt und entgast. Nachdem 11 µl TEMED zugeben wurden, wurde das Gel sofort in der bereitstehenden Gelapparatur gegossen und mit n-Butanol überschichtet. Nach der Polymerisierung wurde das n-Butanol mit Papier abgesaugt.


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Kleines Sammelgel (4 %): Es wurden 465 ml Acrylamid-Stammlösung, 890 µl Sammelgel-Puffer, 2,2 ml H2O, 35,7 µl APS-Lösung gemischt und entgast. Nach der Zugabe von 3,6 µl TEMED wurde sofort in die Gelapparatur gegossen und der Kamm eingesetzt. Nach dem Aufbau der Elektrophoreseapparatur wurde der Kamm entfernt und die Taschen mit Wasser gespült. Nachdem das Wasser mittels einer Kanüle wieder entfernt worden war, wurde das Gel mit Elektrophoresepuffer überschichtet. Drei Teile Proteinextrakt wurden mit einem Teil 4x Roti-Load-Puffer gemischt, 5 min bei 95 °C denaturiert und je nach Taschengröße bis zu 40 µl Probe aufgetragen. Der Gellauf erfolgte mit ca. 90 mA für ungefähr 2 h. Lösungen:

Sammelgel-Puffer: Trenngel-Puffer: 4x Roti-Load: 2x Elektrophoresepuffer: Acrylamid-Stammlösung: APS-Lösung:

0,5 M Tris/HCl, pH 6.8; 0,4% (w/v) SDS 1,5 M Tris/HCl, pH 8.8; 0,4% (w/v) SDS Roti-Load Proteinauftragspuffer, reduzierend (Roth) 50 mM Tris/HCl, pH 8.3; 384 mM Glycin; 0,1% (w/v) SDS Rotiphorese Gel 30 10% (w/v) in H20

c) Proteintransfer mittels Semi-Dry-Verfahren Aufbau der Blotting-Apparatur: Kathode 6 Lagen Filterpapier / Kathodenpuffer Polyacrylamidgel PVDF-Membran 3 Lagen Filterpapier / Anodenpuffer I 3 Lagen Filterpapier / Anodenpuffer II Anode Das verwendete Whatman-Papier und die PVDF-Membran wurden passgenau auf das zu blottende Polyacrylamidgel zugeschnitten. Die Filterpapiere wurden vor dem Aufbau in dem entsprechenden Transferpuffer getränkt. Die PVDF-membran wurde einige Minuten lang in Methanol und anschließend 10 min in Anodenpuffer I getränkt. Die Graphitelektroden wurden zuvor mit H2Obidest. gesättigt und das überschüssige Wasser anschließend entfernt. Der Aufbau erfolgte luftblasenfrei. Bei einer Stromstärke von 1 mA pro cm2 wurde 1,5 bis 2 h lang bei RT transferiert.


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Lösungen und Geräte:

Anodenlösung I: 0,3 M Tris/HCl; pH 10.4; 20 % (v/v) Methanol Anodenlösung II: 25 mM Tris/HCl; pH 10.4; 20 % (v/v) Methanol Kathodenlösung: 40 mM 6-Aminohexalsäure; 20 % (v/v) Methanol Whatman-Papier: 3 MM Chromatographiepapier; Fa. Whatman PVDF-Membran: HybondTM-P; PVDF Transfer Membran; Fa. Amersham/Pharmacia d) Immunodetektion von Proteinen Die Membran wurde für 2 h oder über Nacht in Blockierungslösung inkubiert und dann kurz in TTBS gewaschen. Die Bindung des Primären Antikörpers (GFP monoklonaler Antikörper, Fa. Quantum) wurde in einem Volumen von 5-10 ml für 1 bis 2 h durchgeführt. Anschließend wurde 3mal 5 min mit TTBS gewaschen und 1 h mit dem Sekundären Antikörper (Peroxidase-Konjugat) inkubiert. Es wurde 2mal mit TTBS und 2mal mit TBS gewaschen. a) Nachweis mittels TMB Die Membran mit wenig TMB-Lösung überschichtet und 5 – 30 min unter leichtem Schütteln inkubiert, bis die gewünschten Signale sichtbar waren. Die Reaktion konnte mit Wasser abgestoppt werden. Anschließend konnte die Membran an der Luft getrocknet und lichtgeschützt aufbewahrt werden. b) Nachweis mittels ECL-System Die nachfolgenden Arbeiten wurden in der Dunkelkammer durchgeführt. Die Membran wurde 1 min in einer Lösung aus gleichen Teilen der ECL-Reagenzien 1 und 2 inkubiert. Nach Einschlagen der Membran in knitterfreie Folie erfolgte die Belichtung eines Röntgenfilms. Die Expositionszeiten lagen zwischen 10 s und 10 min. Lösungen und Geräte:

TBS: TTBS: Blockierungslösung: Hybridisierungslösung: Sek. Antikörper: TMB: ECL-System: Röntgenfilm:

10 mM Tris/HCl, pH 7.5; 150 mM NaCl 20 mM Tris/HCl, pH 7.5; 500 mM NaCl; 0,05% (v/v) Tween 20 3% BSA in TBS GFP-Antikörper 1: 1000 verdünnt in Blockierungslösung Protein-A-Meerettichperoxidase-Konjugat 1: 10.000 TMB, unlöslich, CALBIOCHEM Reagenzien 1 und 2 Hyperfilm-ECL; Fa. Amersham/Pharmacia


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2.9.7 Nachweis von Carotinoiden mit der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)

Die HPLC-Analysen wurden im Labor von Prof. Dr. R. Hain, Abt. Molekulare Wirkstoffforschung / Biotechnologie der Bayer AG in Monheim durchgeführt. Ca. 0,5 g Blattmaterial oder Karyopsen wurden mit flüssigem Stickstoff gemörsert und anschließend mit 3 ml Aceton + Spatelspitze Magnesiumoxid gepottert, bis das Chlorophyll nahezu vollständig aus den Zellen entfernt worden ist. Die Suspension wurde durch einen 0,2 µm Spritzenfilter filtriert und in Probengläser überführt. Als Trennsäule diente eine Protosil 200-5 C30; 150 mm x 5,0 mm (Fa. Bischoff-Chromatography). Das Injektionsvolumen je Probe betrug 25 µl. Fließmittel waren Methanol in Wasser (90 %) und Ethylacetat (100 %). Die Flussrate betrug 1 ml/min. Folgender Gradient wurde verwendet: linearer Gradient für 30 min von 30 % bis 60 % Ethylacetat, es schloss sich an ein linearer Gradient über 5 min von 60 % bis 90 % Ethylacetat, gefolgt von einem isokratischen Gradienten von 5 min Ethylacetat (90 %) in einem Methanol / Wasser-Gemisch (9:1 [v/v]). Es wurden Messungen bei 280 nm, 350 nm, 400 nm und 450 nm durchgeführt. Die Identifizierung der Carotinoide und Chlorophylle erfolgte durch Vergleich der Retentionszeiten und Spektren mit Literaturdaten (Britton, 1995; Busch, 2001).

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

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3 ERGEBNISSE Durch die Übertragung eines Phytoensynthasegens in Weizen (Triticum aestivum L. cv. ‘Combi‘) sollte in die Carotinoidbiosynthese und daran anschließende Biosynthesewege des Weizens eingegriffen werden. Über den Einsatz entsprechender Konstrukte wurden zwei Zielsetzungen verfolgt: Zum einen sollte nach Transfer eines endospermspezifisch exprimierten Genkonstruktes die Akkumulation von Carotinoiden im Endosperm erhöht werden. Zum anderen sollte nach Übertragung eines konstitutiv stark exprimierten Genkonstruktes die Biosynthese der Carotinoide sowie der Abscisinsäure in der gesamten Weizenpflanze gefördert und die konkurrierende Biosynthese der Gibberelline beeinträchtigt und somit eine Halmverkürzung bewirkt werden. Des Weiteren sollte der Einfluss von MARs (matrix attachment regions) auf die Expression des übertragenen Nutzgens untersucht werden. Für diese Vorhaben sollte eine Vielzahl von Konstrukten in Weizen übertragen werden. Da für jedes der Konstrukte eine repräsentative Anzahl an transgenen Pflanzen erhalten werden sollte, musste zunächst das etablierte System für die Varietät ‘Combi‘ (Iser et al., 1999; Fettig und Hess, 1999) weiter verbessert werden. Die erste Veränderung sollte das bisher verwendete Reportergen uidA betreffen. Es sollte durch das Vitalmarkierungsgen gfp ersetzt werden. Ferner sollte ein anderes rezipierendes Gewebe, also anderes Zielobjekt für den Partikelbeschusses verwendet werden. Am Beginn der vorliegenden Arbeit stand daher zunächst die Konstruktion einer geeigneten Markierungsgenkassette sowie die Herstellung der benötigten Nutzgenkassetten. 3.1 KONSTRUKTION DER TRANSFORMATIONSVEKTOREN 3.1.1 Herstellung von Vektoren zu Konstruktionszwecken Um die anliegenden Konstruktionsarbeiten zu vereinfachen, wurden zunächst Zwischenplasmide hergestellt, die als Basis für eine Vielzahl von Transformationsvektoren dienen konnten. Ein Plasmid (pUnosT) sollte so konstruiert werden, dass es mit dem konstitutiv exprimierenden Promotor des Ubiquitin-1-Gens (Christensen et al., 1992) aus Zea mays L. und der Terminationssequenz des Nopalinsynthase-Gens aus Agrobacterium tumefaciens ausgestattet ist und den einfachen Einbau von proteincodierenden Regionen erlaubt. Des Weiteren wurde ein Plasmid benötigt, das die 5‘- und 3‘MAR-Sequenzen des adh1-Gens aus Zea mays L. (Avramova et al., 1995) enthielt und den Einbau kompletter, chimärer Genkassetten ermöglichte. Dieses Plasmid wird im Folgenden mit p5‘3‘MAR bezeichnet.

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

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Die Ergebnisse dieser Konstruktionsarbeiten werden in den nachfolgenden Kapiteln vorgestellt. Die Abbildungen 2 bis 10 zeigen nur die im gegebenen Zusammenhang wichtigen Bereiche der Plasmide. 3.1.1.1 Das Plasmid pUnosT Auf Basis des pBS+/- Phagemids (Fa. Stratagene) entstand pUnosT (Abb. 1). Ein Vektor, zu Konstruktionszwecken, der aus dem Mais Ubiquitin-Promotor (Christensen et al., 1992) und der Terminationssequenz des Nopalinsynthasegens aus Agrobacterium tumefaciens besteht. Zwischen Promotor und Terminator befinden sich mehrere Restriktionserkennungsstellen, darunter eine für das stumpfe Enden generierende Restriktionsenzym SmaI. Diese Schnittstelle ermöglichte die Insertion beliebiger Fragmente mit stumpfen Enden.

Abb. 1: pUnosT (Gesamtgröße : 5462 bp). Nos-T = Terminator des Nopalinsynthasegen. Exon, Intron des Ubiquitin-1-Gens. Die wichtigsten Restriktionenzyme und die Positionen der Schnittstellen sind angegeben.

3.1.1.2 Das Plasmid p5‘3‘MAR Aus dem 4,10 kb großen Plasmid p5zMAR wurde ein 1,22 kb großes XbaI/KpnI-Fragment, das die Sequenz der 5‘MAR-Stelle umfasste, ausgeschnitten und in den mit XbaI/KpnI linearisierten Vektor pBS subkloniert, um die HincII-Schnittstelle des pBS-Vektors für die weitere Konstruktion nutzen zu können. Aus diesem neuentstandenen Plasmid wurde mittels XhoI und HincII das die 5‘MAR-Sequenz umfassende, 1,23 kb große Fragment, isoliert und in die entsprechenden Schnittstellen des Plasmids p3zMAR1 (Avramova et al., 1995) eingebaut. Abbildung 2 zeigt die Restriktionskarte des mit p5‘3‘MAR bezeichneten 6,65 kb großen Plasmids (siehe auch Bader, 1999).

AflIII 580

HindIII 972SphI 978PstI 984XbaI 1013

ScaI 4669

EcoRI 3279

XhoI 1679

XbaI 2357PstI 2970HincII 2974SalI 2976XbaI 2982BamHI 2988SmaI 2991KpnI 2993SacI 2999

NdeI 2757NdeI 2774NdeI 2860

XbaI 2585

Intron

PvuII 756 SalI 1581

BglII 1925XbaI 2002NcoI 2022

Ubiquitin-Promotor Exon nos T

0 5462

BglI 5029

PvuI 4779XmnI 4549

SspI 4349NdeI 3989

Pvu I 3429

PvuII 3399

pBS +/-

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

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KpnI 2202XhoI 2221

BamHI 2448BamHI 2717BamHI 2754

XbaI3441SalI 3447HincII 3449SalI 3451HindIII 3466EcoRV 3470EcoRI 3472

5‘zMAR 3‘zMAR

BamHI 5962XbaI 5974NotI 5981SacII 5987SacI 5994PvuII 6122PvuI 6151

SacI 5788SacII 5836SacII 5852

SphI 5306EcoRV 5426BglII 5476

NdeI 4687NdeI 4738SspI 4754

SspI 4309PstI 3474PvuII 3569

Abb. 2: Ausschnitt aus dem 6650 bp großen Plasmid 5‘3’MAR. Es besitzt zwischen den beiden MARs die singuläre Erkennungsstelle für HincII, ein Enzym, das stumpfe Ende generiert. Ferner stehen singuläre Erkennungsstellen für HindIII und EcoRI zur Verfügung. Erstere befindet sich in den verwendeten Konstrukten am 5‘-Ende des Ubiquitin-Promotors, letztere am 3‘-Ende des nos-Terminators. Diese Erkennungsstellen ermöglichen die universelle Verwendung des Plasmids 5‘3‘MAR, so dass zwischen die beiden MARs eine Vielzahl chimärer Gene ligiert werden können. 5‘zMAR = Matrix-Anheftungsstelle vom 5‘-Ende des adh1-Gens, 3‘zMAR = Matrix-Anheftungsstelle vom 3‘-Ende des Mais adh1-Gens.

3.1.2 Konstruktion der Markierungsgenkassette 3.1.2.1 Das Plasmid pGFPBAR Das Plasmid pGFPBAR (Abb. 3) enthielt neben dem selektierbaren Markierungsgen bar aus Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al., 1987) noch das synthetische gfp-Gen aus dem Vektor pMON30049 (Pang et al., 1996). Das bar-Gen steht unter Kontrolle des konstitutiv exprimierenden Promotors des Ubiquitin-1-Gens (Christensen et al., 1992) aus Zea mays L. Als Terminator diente die Terminationssequenz des Nopalinsynthasegens aus Agrobacterium tumefaciens. Für die Konstruktion wurde zunächst das 2,85 kb große HindIII/EcoRI-Fragment aus pAHC25 (Christensen und Quail, 1996) isoliert und im pPCR-Script-Vektor subkloniert. Dieser neu entstandene Vektor pUBIBAR wurde mit SmaI linearisiert und mit einem 2,97 kb großem PvuII-Fragment aus pMON30049 ligiert, welches sich zusammensetzt aus: CaMV35S-Promotor, dem Intron des 70 kD Hitzeschockproteins (HSP 70) aus Zea mays, der synthetischen, proteincodierenden S65T-gfp-Region (Pang et al., 1996), dem Intron des ST-LS1-Gen (codiert für eine Komponente des wasseroxidierenden Komplexes des Photosystems II) aus Solanum tuberosum (Eckes et al., 1986) und der Nopalinsynthase-Polyadenylierungsregion aus Agrobacterium tumefaciens. Während das ST-LS1-Intron dazu dient, die Expression des Gens in Prokaryoten zu verhindern, handelt es sich bei dem HSP 70-Intron um ein translationelles Enhancerelement.

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

44

Abb. 3: Ausschnitt aus dem Übertragungsvektor pGFPBAR (8806 bp). nosT = Terminator des Nopalinsynthasegen. Exon, Intron des Ubiquitin-1-Gens. bar = bar-Gen, 35S-Pro = CaMV 35S-Promotor (Odell et al., 1985), gfp = synthetisches gfp-Gen. Die wichtigsten Restriktionenzyme und die Positionen der Schnittstellen sind angegeben.

3.1.2.2 Das Plasmid p5‘uidA3‘ Für die Konstruktion des Plasmids p5‘uidA3‘ wurde aus pAHC25 das 4175 bp lange chimäre uidA-Gen mittels HindIII-Restriktionsverdau gewonnenen und in den mit HindIII linearisierten Vektor p5‘3‘MAR eingebaut. Das resultierende Produkt besitzt eine Gesamtgröße von 10825 bp (Abb. 4).

Abb. 4: Ausschnitt aus dem Vektor p5‘uidA3‘, der eine Gesamtgröße von 10825 bp besitzt. Das chimäre uidA-Gen aus pAHC25 wird von den beiden Matrix-Anheftungsstellen (5‘zMAR und 3‘zMAR) aus p5‘3‘MAR (siehe Abb. 2) flankiert. Exon, Intron des Ubiquitin-1-Gens. uidA = Gen für die β-Glucuronidase.

nosT

bar

PstI 2745SalI 2752XbaI 2757BamHI 2764

Ubiquitin-Promotor Exon Intron

KpnI 657XhoI 674SalI 682HindIII 697 SphI 703 PstI 709XbaI 738

NdeI 2482 NdeI 2499NdeI 2585

XhoI 1398

XbaI 2082

XbaI 2310(EcoRI 2096)

SalI 1300HincII 1302

BglII 1637 XbaI 1727NcoI 1765

35S-Pro nosT

NcoI 6143EcoRI 6149PvuI 6159EcoRV 4282

BglII 4397XbaI 4504

EcoRV 6415SmaI 6421NotI 6426

PstI 4791

XbaI 5209BamHI 5215NcoI 5229

KpnI 5452

SphI 3190 SphI 3223KpnI 3299BglII 3332SalI 3342PstI 3348

EcoRI 3631PstI 3634NotI 3735HindIII 3748PstI 3758

NotI 6629SacII 6635SacI 6642

pPCR-Script Amp SK (+)gfp

KpnI 2202XhoI 2221


XbaI3441SalI 3447HincII 3449SalI 3451HindIII 3466SphI 3473PstI 3479XbaI 3511

5‘zMAR 3‘zMAR




NdeI 8701 NdeI 8752SspI 8768

SspI 8323

nosTuidAUbiquitin-Promotor Exon Intron

SacI 7376 EcoRI 7656HindIII 7662


XhoI 4152

XbaI 4856


SalI 4074BglII 4411XbaI 4491NcoI 4529

PstI 5465SalI 5471XbaI 5477BamHI 5483SmaI 5488

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

45

3.1.3 Konstruktion der Nutzgenkassetten 3.1.3.1 Das Plasmid pIB2 Das Plasmid pIB2 (Bader, 1999) beinhaltet die 1,3 kb große proteincodierende Region des Phytoensynthasegens aus Capsicum annuum L. (Kuntz et al., 1993) unter Kontrolle des Ubiquitin-1-Promotors aus Zea mays L. (Christensen et al., 1992). Abbildung 5 zeigt das Plasmid pIB2, wie es zu Transformationsversuchen eingesetzt worden ist.

Abb. 5: Das Plasmid pIB2 (6730 bp). Psy = proteincodierende Region des Phytoensynthasegens aus Capsicum annuum L. Die übrigen Elemente wie in Abb. 1 (pUnosT).

3.1.3.2 Das Plasmid p5‘IB23‘ Ausgehend von den Vektoren p5‘3‘MAR und pIB2 entstand der Übertragungsvektor p5IB23. Siehe hierzu auch Bader, 1999.

Abb. 6: Ausschnitt aus p5‘IB23‘ (10220 bp). Wie pIB2 (Abb.5), nur zusätzlich flankiert von den MARs des Plasmids 5‘3‘ MAR (Abb. 2).

AflIII 65HindIII 2272SphI 2276PstI 2282XbaI 2311

EcoRI 5849

XbaI 3656EcoRI 3670

PstI 4270HincII 4274SalI 4276XbaI 4282BamHI 4288NdeI 4055

NdeI 4072NdeI 4157

XbaI 3884

Intron

KpnI 5563SacI 5569

PvuII 2056 SalI 2873 BglII 3220XbaI 3301NcoI 3319

Ubiquitin-Promotor Exon nosT

PvuII 4612NdeI 4687

PvuII 5167

psy

SspI 6475

Pvu I 5993

PvuII 5964

pBS

KpnI 2202XhoI 2221


XbaI 3441SalI 3447HincII 3449SalI 3451HindIII 3466SphI 3472PstI 3478XbaI 3507


BglII 4414XbaI 4495NcoI 4513 XbaI 4850

(EcoRI 4864)



XhoI 4167

XbaI 4723

5‘zMAR psy nosT 3‘zMAR




SspI 8325

EcoRI 7043PstI 7045PvuII 7140

PstI 5464HincII 5468SalI5470XbaI 5476BamHI 5482

PvuII 5806

PvuII 6361 KpnI 6709SacI 66763

SspI 7880

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

46

3.1.3.3 Das Plasmid pUT Im Vektor pUnosT (Abb. 1) befindet sich das 2,10 kb HindIII/BamHI Ubiquitin-Promotor-Fragment aus pAHC25 und das 0,27 kb SacI/EcoRI Nopalinsynthase-Terminator-Fragment aus pAHC25. Beide Fragmente wurden in die entsprechenden Schnittstellen des pBS +/- (3,2 kb) eingebaut. Durch Linearisierung dieses Plasmids mit SmaI war es möglich, das 1,46 kb SspI-Fragment aus ptom5 (Ray et al., 1992) einzubringen. Das Plasmid tom5 beinhaltet zwischen den Erkennungsstellen für EcoRI/XhoI die cDNA mit der proteincodierenden Region eines Phytoenesynthasegens aus Lycopersicon lycopersicum (Ray et al., 1992). Der neu konstruierte Übertragungsvektor pUT (6,92 kb) stand nun zu Co-transformationsversuchen zur Verfügung. Abbildung 7 zeigt den Übertragungsvektor pUT.

Abb. 7: Ausschnitt aus dem Vektor pUT, der eine Gesamtgröße von 6917 bp besitzt. Es handelt sich um ein chimäres Gen mit der proteincodierenden Region des Phytoensynthasegens tom5 aus der Tomate. Übrige Bereiche wie bei pUnosT (Abb. 1).

3.1.3.4 Das Plasmid p5‘UT3‘ Das 3,76 kb lange HindIII/EcoRI-Fragment aus pUT wurde in den mit HindIII und EcoRI linearisierten Vektor p5‘3‘MAR (siehe 3.1.2.2) eingebaut. Das entstandene Plasmid 5‘UT3‘ ist in Abbildung 8 dargestellt.

HindIII 972SphI 978PstI 984XbaI 1013

EcoRI 4734

XhoI 1679

XbaI 2357 PstI 2970HincII 2974SalI 2976XbaI 2982BamHI 2988NdeI 2757

NdeI 2774NdeI 2860

XbaI 2585

Intron

KpnI 4448SacI 4454

SacI 4165

NdeI 4262NdeI 4305

SalI 1581 BglII 1925XbaI 2002NcoI 2022

Ubiquitin-Promotor Exon nosT

BglII 3405

NdeI 3476

tom5

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

47

Abb. 8: Ausschnitt aus dem 10405 bp großen Übertragungsvektor p5‘UT3‘. Wie pUT, nur flankiert von den 5‘z und 3‘zMAR-Bereichen aus 5‘3‘MAR (siehe Abb. 2).

3.1.3.5 Das Plasmid pGT Basierend auf dem Vektor pBS-G (Iser, 1995), der den 0,6 kb langen Gliadin-Promotor aus Triticum aestivum cv. Yamhill (Aryan et al., 1991) beinhaltet, entstand der Übertragungsvektor pGT. Hierzu wurde die Nopalinsynthase-Terminationssequenz mittels SacI/EcoRI aus pAHC25 ausgeschnitten und in die entsprechenden Schnittstellen von pBS-G ligiert. Wie in 3.1.2.3 beschrieben, wurde aus ptom5 ein SspI-Fragment ausgeschnitten, welches in das mit SalI und BamHI linearisierte Gliadin-nosT-Plasmid eingebaut wurde. Zuvor war es nötig geworden die überstehenden Enden der SalI, beziehungsweise BamHI-Schnittstellen mit Hilfe des Klenow-Fragments aufzufüllen. Der entstandene Übertragungs-vektor pGT (5,53 kb) wird in Abbildung 9 dargestellt.

EcoRI 3268

BglII 1524SphI 1534PstI1540 HincII 1542

BglII 1971 NdeI 2042

SacI 2714

NdeI 2811 NdeI 2857

SmaI 2944KpnI 2950SacI 2956

tom5 nosTGliadinPromotor

HindIII 928

XbaI 991

XbaI 1190NcoI 1413

pBS +/-

Abb. 9: Ausschnitt aus dem 5525 bp großen Vektor pGT. Die proteincodierende Region des Phytoensynthasegens tom5 steht hier unter Kontrolle des Gliadin-Promotors aus Weizen.

KpnI 2202XhoI 2221


XbaI3441SalI 3447HincII 3449SalI 3451HindIII3466SphI 3472PstI 3478XbaI 3507


BglII 4414XbaI 4495NcoI 4513




XhoI 4167

XbaI 4723

5‘zMAR tom5 nosT 3‘zMAR




NdeI 8273NdeI 8324SspI 8340EcoRI 7228

PstI 7230PvuII 7325

PstI 5464HincII 5468SalI5470XbaI 5476BamHI 5482

BglII 5899

NdeI5970

SacI 6659 NdeI 6756 NdeI 6799

KpnI 6942SacI 6948

SspI 7895

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

48

3.1.3.6 Das Plasmid p5‘GT3‘ Als Ausgangsplasmid für diesen Konstruktionsschritt diente, ebenso wie in Abschnitt 3.1.2.4, der Vektor p5‘3‘MAR, welcher zuvor mit HindIII/EcoRI linearisiert worden war. In diese Schnittstellen wurde das 2,34 kb große Fragment aus pGT ligiert und die Phosphodiesterbindungen mittels Ligase (siehe 2.4.2) wieder verbunden. Der Übertragungsvektor p5‘GT3‘ ist in Abbildung 10 zu sehen.

Abb. 10: Ausschnitt aus dem 8863 bp großen Plasmid p5‘GT3‘. Es entspricht pGT, wird jedoch von den Matrix-Anheftungsstellen aus 5‘3‘MAR (siehe Abb. 2) flankiert.

BamHI 8176 XbaI 8188NotI 8195SacII 8201SacI 8208PvuII 8336PvuI 8365


SphI 7520EcoRV 7640 BglII 7690

NdeI 6731 NdeI 6782SspI 6798EcoRI 5686

PstI 5688PvuII 5783

BglII 3960SphI 3970PstI 3976HincII 3978SalI 3978

BglII 4407 NdeI 4478

SacI 5167

NdeI 5264 NdeI 5307

KpnI 5450SacI 5406

SspI 6353

tom5 nosT 3‘zMARGliadinPromotor

KpnI 2202XhoI 2221


XbaI3441SalI 3447HincII 3449SalI 3451HindIII 3466

5‘zMAR

XbaI 3529

XbaI 3728NcoI 3849

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

49

3.2 ÜBERPRÜFUNG DER KONSTRUKTE MITTELS SOUTHERN BLOT-ANALYSEN

Um die Richtigkeit der konstruierten Plasmide zu überprüfen, wurden sie Southern blot-Analysen unterzogen. Hierzu wurde spezifische, Digoxigenin-dUTP-markierte Sonden-DNA eingesetzt. Tabelle 1 gibt eine Übersicht über die verwendeten Sonden, Restriktionsenzyme und die zu erwartenden Fragmentlängen nach spezifischer Hybridisierung. Tab. 4: Übersicht über die Southern blot-Analysen der neukonstruierten Plasmide. a) Verwendete Sonden Sonden-bezeichnung

Herkunft Länge Abbildung

S-gfp PstI/EcoRI-Fragment aus pMON30049 (Pang et al., 1996)

1,36 kb Abb. 13

S-tom PstI/KpnI-Fragment aus ptom5 (Ray et al.,1997)

1,41 kb Abb. 11

S-5‘zMAR BamHI/HindIII-Fragment aus pBS5‘MAR (Bader, 1999)

1,26 kb Abb. 12

S-3‘zMAR EcoRI/BglII-Fragment aus pBS3’MAR (Bader, 1999)

2,00 kb Abb. 12

b) Übersicht über die Southern blot-Analysen zur Plasmidüberprüfung Plasmid Restriktionsenzym(e) Sonde erwartete(s)

Signal(e) bei Fragmentlänge1

Abbildung

pGFPBAR EcoRV S-gfp 2,13 kb Abb. 13 pGFPBAR BamHI S-gfp 2,45 kb Abb. 13 pGT EcoRI/HindIII S-tom 2,34 kb Abb. 11 pGT BglII S-tom 0,45 kb, 5,08 kb Abb. 11 pUT EcoRI/HindIII S-tom 1,75 kb Abb. 11 pUT BglII S-tom 1,48 kb, 5,44 kb Abb. 11 p5GT3 EcoRI/HindIII S-tom 2,22 kb Abb. 11 p5GT3 BglII S-tom 0,47 kb, 3,28 kb Abb. 11 p5GT3 HindIII/KpnI S-5‘zMAR 1,26 kb Abb. 12 p5GT3 BamHI/EcoRI S-3‘zMAR 2,49 kb Abb. 12 p5UT3 BamHI/EcoRI S-tom 1,75 kb Abb. 11 p5UT3 BglII S-tom 1,48 kb, 5,44 kb Abb. 11 p5UT3 HindIII/KpnI S-5‘zMAR 1,26 kb Abb. 12 p5UT3 BamHI/EcoRI S-3‘zMAR 2,49 kb Abb. 12

1 nach spezifischer Hybridisierung mit Digoxigenin-dUTP-markierter Sonden-DNA

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

50

Abb. 11: Southern blot-Analysen der konstruierten Plasmide hinsichtlich der proteincodierenden Region des tom5-Gens. Ausschnitte aus den Restriktionskarten der Nutzgenkassetten pGT (Abb. 11 a), pUT (b), p5GT3 (c)

e4

1 2 3 4

1,75 kb1,48 kb

3,33 kb

1,45 kb

1 2 3 4

e2

1,75 kb1,48 kb

5,44 kb

1,45 kb

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

51

und p5UT3 (d). Dargestellt sind nur die für die Southern blot-Analyse relevanten Restriktionsschnittstellen und die eingesetzten DIG-dUTP markierten Sonden. Im einem separaten Kasten sind jeweils die nach entsprechendem Restriktionsverdau erwarteten Fragmente gezeigt. Das zur Sonde komplementäre Fragment ist unterstrichen. In Abb. 11 e sind die Nylonmembranen nach Hybridisierung gegen die DIG-dUTP markierte S-tom-Sonde und Färbereaktion abgebildet. Die entsprechende Fragmentlänge ist jeweils rechts der Nylonmembran angezeigt: e1: Bahn 1, pGT mit BglII gespalten. Bahn 2, pGT mit EcoRI/HindIII gespalten. e2: Bahn 1, pUT mit BglII. Bahn 2, pUT mit BamHI/EcoRI. e3: Bahn 1, p5GT3 BglII-Verdau. Bahn 2, p5GT3 EcoRI/HindIII-Verdau. e4: Bahn 1, p5UT3 BglII-Verdau. Bahn 2, p5UT3 BamHI/EcoRI-Verdau. Die Bahnen 3 zeigen jeweils die Negativkontrolle (Plasmid pBS); die Bahnen 4 die entsprechende Positivkontrolle (Sonden-DNA).

p5G

T3

(886

3 bp

)

BamHI/EcoRI: 2,49 kb; 2,93 kb; 3,44 kbHindIII/KpnI: 1,26 kb; 3,48 kb; 4,12 kb

tom5 nosT 3‘zMARGliadinPromotor5‘zMAR

S-5‘zMAR

HindIII EcoRIKpnIBamHIBamHI

BamHI BamHI BamHI

S-3‘zMAR

a

p5U

T3

(104

05 b

p)

BamHI/EcoRI: 0,04 kb; 0,27 kb; 1,75 kb; 2,49 kb; 2,73 kb; 3,13 kbHindIII/KpnI: 1,26 kb; 3,48 kb; 5,67 kb

Ubiquitin-Promotor Exon Intron5‘zMAR tom5 nosT 3‘zMAR

BamHIEcoRIBamHI

BamHI

BamHI BamHI

S-5‘zMAR S-3‘zMAR

KpnIHindIII

b

Sout

hern

blo

t-Ana

lyse 1 2 3 4 1 2 3 4

c1 c2

2,49 kb

1,26 kb

c

KpnI

KpnI

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

52

Abb. 12: Southern blot-Analysen der konstruierten Nutzgenkassetten p5UT3 (a) und p5GT3 (b) hinsichtlich der MARs. In den Abbildungsteilen a und b sind Ausschnitte der entsprechenden Restriktionkarten und die zu erwartenden Fragmente abgebildet. Das zur Sonde komplementäre Fragment ist unterstrichen. In Abb 12 c sind die Nylonmembranen nach Hybridisierung gegen die DIG-dUTP markierten MARs-Sonde und anschließender Färbereaktion abgebildet. Abb. 12 c1: Hybridisierung gegen die S-5‘zMAR-Sonde. Bahn 1, p5GT3; Bahn 2, p5UT3 je HindIII/KpnI-Verdau. c2: Hybridisierung gegen die S-3‘zMAR-Sonde. Bahn 1, p5GT3; Bahn 2, p5UT3 je BamHI/EcoRI-Verdau. In c1 und c2 stellen die Bahn 3 jeweils die Negativ- (Plasmid pUT), Bahn 4 jeweils die Positivkontrolle (Sonden-DNA) dar.

Abb. 13: Southern blot-Analysen des konstruierten Plasmids pGFPBAR (Abb. 13 a) hinsichtlich des chimären gfp-Gens aus pMON30049 (Pang et al., 1996). Im Abbildungsteil 13 a ist der entsprechende Restriktionkartenausschnitt und die zu erwartenden Fragmente nach entsprechendem Restriktionsverdau abgebildet. In Abb. 13 b ist die Nylonmembranen nach Hybridisierung gegen die DIG-dUTP markierten S-gfp-Sonde und anschließender Färbereaktion gezeigt. Abb. 13 b: Hybridisierung gegen die S-gfp-Sonde. Bahn 1, pGFPBAR BamHI-Spaltung, Bahn 2 pGFPBAR EcoRV-Spaltung. Bahn 3 Negativ- (Plasmid pAHC25), Bahn 4 Positivkontrolle (Sonden-DNA). In den Bahnen 1, 2 und 3 sind schwache Signale zu erkennen, die auf unspezifische Hybridisierungen zurückzuführen sind.

pGFP

BA

R (8

806

bp) EcoRV: 2,13 kb; 6,67 kb

BamHI: 2,45 kb; 6,36 kb

Ubiquitin-Promotor Exon Intron syn

S65T

GFP

ST-L

S1 In

tron

HSP

70 In

tron

bar P-e35SnosT nosTsyn

gfp:

1

syn

GFP

: 1

S-gfpBamHI BamHI EcoRVEcoRV

Sout

hern

blo

t-Ana

lyse 1 2 3 4

a

1,36 kb

2,13 kb2,45 kb

a

b

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

53

Durch die Southern blot-Analysen wurde die Korrektheit der neukonstruierten Plasmide bestätigten, so dass diese nun für Transformationsexperimente am Weizen eingesetzt werden konnten.

3.3 VERSUCHE ZUR OPTIMIERUNG DES WEIZENTRANSFORMATIONS-

SYSTEMS UND ANALYSE DER REGENERATPFLANZEN Es sei erwähnt, dass die Ergebnisse, dem besseren Verständnis dienend, chronologisch dargestellt sind. Tatsächlich mussten viele Versuchsansätze der Vergleichbarkeit wegen (zumindest in Teilen) jedoch parallel durchgeführt werden. In der vorliegenden Arbeit sollten Nutzgen und selektierbares Markierungsgen in Co-transformationsexperimenten übertragen werden (zur Übersicht: Yoder und Goldsbrough, 1994). Für die verwendete Weizenvarietät ‘Combi‘ existierte sowohl ein Regenerations-, als auch ein auf der Partikelbeschusstechnik basierendes Transformationssystem (Viertel et al., 1998; Iser et al., 1999; Scheyhing, 1999; Fettig, 1999; Fettig und Hess, 1999). Zielobjekt für den Partikelbeschuss war embryogener Kallus aus dem Scutellum unreifer Embryonen (SK-Strategie. Siehe auch 2.7.3 und 2.7.4). Zur Überprüfung der Beschusseffizienz wurde auf das GUS-System zurückgegriffen (SK-Strategie mit GUS). Diese Strategie entspricht der in Abb. 14 dargestellten SK-Strategie mit GFP, mit dem Unterschied, dass nach erfolgtem Partikelbeschuss 25-50 % der beschossenen Kalli für einen transienten GUS-Test eingesetzt werden mussten. Ein Ziel dieser Arbeit war es, das bestehende Transformationssystem (SK-Strategie mit GUS) weiter zu verbessern. Hierzu sollte zunächst das gfp-Gen eingesetzt werden (SK-Strategie mit GFP). Des Weiteren wurde untersucht, ob der Einsatz unreifer Embryonen als Zielobjekt des Partikelbeschusses eine Optimierung des Systems bedingen kann (UE-Strategie mit GFP). Abbildung 14 vermittelt einen Überblick über die auf dem GFP-System basierenden Gewebekulturstrategien.

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

54

SK-STRATEGIEmit GFP

4-6 Tage3 WochenM

Embryonen-präparation

Partikelbeschuss

ex-vitro Kultur

4 WochenKalluskultur(ab dem 8. Tag 2 mg/l PPT, ab dem 15. Tag 5 mg/l PPT)

4-6 WochenRegeneration(5 mg/l PPT)

alle Kalli / Embryonenwerden weiterkultiviert

alle Kalliwerden weiterkultiviert

S

UE-STRATEGIEmit GFP

2-4 WochenBewurzelung

Abb. 14: Gewebekulturstrategie. SK = Zielobjekte des Partikelbeschusses sind embryogene Scutellarkalli. UE = Zielobjekte sind unreife Embryonen. S = nicht-embryogene Kallusbereiche werden selektiert und verworfen. Embryogene Kalli werden weiterverwendet. M = Osmotische Behandlung mit 0,5 M Mannit: 5 bis 6 h Vor- und 16 h Nachbehandlung. Bei der SK-Strategie beträgt der Zeitraum zwischen Embryonenpräparation und ex vitro-Kultur durchschnittlich 105 Tage. Die UE-Strategie ist rund 15 Tage kürzer.

3.3.1 Partikelbeschuss von embryogenem Scutellarkallus 3.3.1.1 Partikelbeschuss von embryogenem Scutellarkallus unter Verwendung von

pAHC25 als Reporter-/selektierbarem Markierungsgenplasmid Wie schon in vorangegangenen Arbeiten beschrieben (Scheyhing, 1999; Fettig, 1999) wurde zur Cotransformation das Plasmid pAHC25 (Christensen und Quail, 1996) eingesetzt. Es enthält sowohl das selektierbare Markierungsgen bar als auch das Reportergen uidA, die jeweils unter der Kontrolle des Ubiquitin-Promotors stehen. Dieses Plasmid wurde in Kombination mit einer der folgenden Nutzgenkassetten zur Cotransformation eingesetzt: pGT, p5GT3, pUT, p5UT3, pIB2 und p5IB23 (G steht für Gliadin-, U für Ubiquitin-Promotor, T für die proteincodierende Region des tom5-Gens. 5 und 3 bezeichnen die verwendeten MARs, hinter der Abkürzung IB2 verbirgt sich das psy-Gen unter Ubiquitin-Promotor Kontrolle; siehe auch 3.1.3). Zielgewebe war embryogener Kallus, der drei Wochen

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

55

nach Induktion von nicht-verwertbarem Gewebe unter dem Stereomikroskop abgetrennt worden war (siehe 2.7.4). Die Versuche wurden von vier Arten von Kontrollexperimenten begleitet. So wurden Kalli mitgeführt, die keinem Partikelbeschuss unterzogen wurden. Diese Versuche werden im weiteren mit UK, für unbehandelte Kontrolle, abgekürzt. Solche Kalli wurden dann zum Teil auf selektivem Medium (UK+S) und zum Teil auf nicht selektivem Medium (UK-S) weiterkultiviert, um später eine Aussage über die Regenerationsfähigkeit des eingesetzten Materials treffen zu können. Für ein weiteres Kontrollexperiment wurden embryogene Scutellarkalli mit Gold beschossen, das nicht mit DNA beladen war (im Folgenden GK). Auch hier wurde ein Teil der Kalli auf selektivem (GK+S) und ein Teil auf nicht-selektivem Medium (GK-S) weitergeführt. Bei allen Versuchsansätzen wurden die gleichen Beschussparameter angelegt. Der Beschussdruck lag bei 1350 psi (entspricht zirka 87000 hpa). Der Abstand zwischen Zielgewebe und Abstoppgitter betrug 6,5 cm. Tabelle 5 zeigt Umfang und Art der verschiedenen Transformationsansätze sowie die begleitenden Kontrollversuche. Tab. 5: Übersicht über Umfang und Art der einzelnen Transformationsansätze und der begleitenden Kontrollversuche.

Verwendete

Plasmidkombination Anzahl beschossener embryogener

Scutellarkalli1 Anzahl beschossener und

weiterkultivierter embryogener Scutellarkalli2

pAHC25 / pGT 1567 1233 pAHC25 / p5GT3 1036 863 pAHC25 / pUT 1039 908 pAHC25 / p5UT3 1072 873 pAHC25 / pIB2 1498 1278 pAHC25 / p5IB23 828 689 UK - S3 841 759 UK +S3 86 65 GK - S3 454 348 GK +S3 115 95

1 bezogen auf die ursprünglich präparierten unreifen Embryonen, aus denen embryogene Kalli hervorgingen, die zum Beschuss verwendet werden konnten. 2 Die Differenz von circa 25 % zu den in der 2. Spalte dargestellten Werten erklärt sich durch die für den histochemischen GUS-Test benötigten Kalli (siehe Abb. 15). 3 Sowohl bei der unbehandelten Kontrolle (UK), als auch bei der Goldkontrolle (GK) wurden nur circa 10 % der Kalli für einen histochemischen GUS-Test herangezogen.

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

56

3.3.1.2 Partikelbeschuss von embryogenem Scutellarkallus unter Verwendung von

pGFPBAR als Reporter-/selektierbarem Markierungsgenplasmid Dieser Versuchsansatz entsprach dem unter 3.2.1.1 beschriebenen mit dem Unterschied, dass nun nicht mehr das uidA-Gen als Reportergen (in pAHC25), sondern das gfp-Gen (in pGFPBAR) eingesetzt wurde. Tabelle 6 fasst Umfang und Art dieses Versuches zusammen. Bei diesen Ansätzen wurden alle beschossenen Kalli weiterkultiviert. Auf Kontrollexperimente unter selektiven Bedingungen wurde in diesem Zusammenhang verzichtet. Tab. 6: Versuchsübersicht: Scutellarkalli, pGFPBAR.

Verwendete Plasmidkombination

Anzahl beschossener embryogener Scutellakalli

pGFPBAR / pGT 1117 pGFPBAR / p5GT3 838 pGFPBAR / pUT 1156 pGFPBAR / p5UT3 870 pGFPBAR / pIB2 983 PGFPBAR / p5IB23 797 UK –S 841 GK –S 348

UK = unbehandelte Kontrolle GK = Goldkontrolle. Beschuss mit nicht DNA-beladenen Goldpartikeln.

3.3.2 Partikelbeschuss von unreifen Embryonen unter Verwendung von pGFPBAR als Reporter-/selektierbarem Markierungsgenplasmid

Im Gegensatz zu den bisher dargestellten Versuchen waren hier nicht embryogene Scutellarkalli, sondern 4-6 Tage alte unreife Embryonen Gegenstand des Partikelbeschusses (siehe 2.7.4.2). Da die Embryonen 5-6 h vor und 16 h nach dem Beschuss einer Mannitbehandlung (siehe 2.7.4.2) unterzogen wurden, gestalteten sich die begleitenden Kontrollversuche wie folgt: UK –M = nicht beschossene Embryonen, keine Mannitbehandlung. UK +M = nicht beschossene Embryonen, Mannitbehandlung wie erwähnt. GK –M = mit nicht-DNA-beladenem Gold beschossene Embryonen, keine Mannitbehandlung. GK +M = mit nicht-DNA-beladenem Gold beschossene Embryonen, Mannitbehandlung wie erwähnt. Diese Kontrollen dienten vor allem der Bewertung der

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

57

Mannitbehandlung hinsichtlich Kalluswachstum und Regeneration. Der gesamte Versuchsansatz ist in Tabelle 7 zusammengefasst. Tab. 7: Versuchsübersicht: Embryonen, pGFPBAR

Verwendete Plasmidkombination

Anzahl beschossener unreifer Embryonen

pGFPBAR / pGT 991 pGFPBAR / p5GT3 818 pGFPBAR / pUT 906 pGFPBAR / p5UT3 955 pGFPBAR / pIB2 813 pGFPBAR / p5IB23 888 UK –M 124 UK +M 202 GK –M 185 GK +M 216

3.3.3 Transiente Expression des uidA-Gens Bei der Verwendung des Plasmids pAHC25 wurden circa 25 % der beschossenen Kalli 24 h nach Beschuss wie in 2.9.4 beschrieben, histochemisch untersucht, um eine Aussage über die Aktivität des uidA-Gens treffen zu können. Der Test erlaubte eine rasche Beurteilung darüber, ob die Fremd-DNA über den Partikelbeschuss in den Zellkern gelangt war oder nicht. Semiquantitative Auswertungen ließen keinen Zusammenhang zwischen transienter uidA-Aktivität in Form der Anzahl blauer Gewebebereiche und einer späteren Transformationsrate erkennen. Abbildung 15 zeigt embryogenen Scutellarkallus nach Beschuss mit der Plasmidkombination pAHC25 / pGT.

Abb. 15: Transiente uidA-Expression an Kalli unreifer Embryonen. Die Kalli wurden 24 h nach Beschuss histochemisch angefärbt.

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

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3.3.4 Transiente Expression des gfp-Gens Eine effektive und schnelle Methode, um die Funktionsfähigkeit eines neukonstruierten gfp beinhaltenden Vektors prüfen zu können, ist, noch grüne Weizenkaryopsen (15 bis 20 Tage nach Anthese) mit dem zu testenden Konstrukt zu beschießen. Schon 16 h später konnte unter dem Fluoreszenzbinokular die gfp-Expression beobachtet werden (Abb. 16.). Mikroskopische Untersuchungen zeigten, dass die GFP-Fluoreszenz in der Epidermis und der ersten angrenzenden Zellschicht des inneren Gewebes der Fruchtwandung vorgefunden werden konnte. In Zellen der folgenden chlorophyllhaltigen Schicht konnte keine GFP-Fluoreszenz nachgewiesen werden.

Abb. 16: Transiente gfp-Expression 16 h nach Beschuss von Karyopsen mit pGFPBAR. Auf dem linken Bild (a) ist sowohl die chlorophyllbedingte Rotfluoreszenz wie auch die grüne GFP-Fluoreszenz zu sehen. Der Pfeil deutet auf einen fluoreszierenden Gewebebereich hin. Das rechte Bild (b) stellt eine beschossene Karyopse vergrößert dar. Die Fluoreszenz in den langgestreckten Zellen der Frucht-/Samenschale ist deutlich zu erkennen. Der Pfeil deutet beispielhaft auf eine einzelne fluoreszierende Zelle hin.

Abb. 17: Transiente gfp-Expression. a: embryogene Scutellarlalli; b: unreife Embryonen. Auf diese Weise konnte auch ohne aufwendige Embryonenpräparation rasch eine Aussage über die Beschusseffizienz getroffen werden.

a b

a b

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

59

Die Überprüfung der transienten gfp-Expression an beschossenen unreifen Embryonen erfolgte 24 h nach dem Partikelbeschuss. Die Beobachtungen mussten an der geschlossenen Petrischale vorgenommen werden, da das verwendete Binokular nicht unter sterilen (genauer: aseptischen) Bedingungen eingesetzt werden konnte. Gleiches galt für die Beobachtung an beschossenen unreifen Embryonen. Diese wurden nach erfolgter Mannitbehandlung (16 h nach Beschuss) vollständig auf frisches Medium überführt und weiterkultiviert. Erst gegen Ende der experimentellen Arbeiten eröffnete sich die Möglichkeit, mit einem Fluoreszenzbinokular unter aseptischen Bedingungen arbeiten zu können. Dies führte dazu, dass nach erfolgtem Beschuss nur diejenigen Embryonen weiterkultiviert wurden, die eine gfp-Expression aufwiesen. Abbildung 17 zeigt transiente gfp-Expression an Kalli und Embryonen, wie sie 24 h nach Partikelbeschuss mit pGFPBAR/pGT beobachtet werden konnte. Abbildung 18 zeigt den Verlauf der transienten gfp-Expression in Abhängigkeit von der Zeit. Hierzu wurden Kalli mit dem Plasmid pMON30049 beschossen. Zu den Zeitpunkten 16 h, 24 h, 48 h, 72 h, 120 h und 196 h nach Beschuss wurde jeweils die Anzahl fluoreszierender Gewebebereiche ermittelt. Um eine visuelle Zählung zu ermöglichen, wurde darauf geachtet, dass nur Beschussansätze gewertet wurden, die weniger als 50 fluoreszierende Gewebebereiche pro Kallus zeigten.

Abb. 18: Zeitlicher Verlauf der transienten gfp-Aktivität, beginnend 16 h nach Partikelbeschuss. Die Expression nach 24 h wurde auf 100 % festgelegt.

Zeit

16 h 24 h 48 h 72 h 120 h 196 h

gfp-

Expr

essi

on [%

]

0

20

40

60

80

100

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

60

Zehn Beschussansätze mit insgesamt 836 Kalli flossen in das Experiment ein. Es war zu beobachten, dass die größte Anzahl an gfp-exprimierenden Gewebebereichen zwischen 16 h und 48 h nach Beschuss vorlag. Nach 196 h konnte nicht mehr zweifelsfrei zwischen tatsächlicher gfp-Expression und endogenen Fluoreszenzerscheinungen differenziert werden, so dass die Wahrscheinlichkeit, einen einzelnen fluoreszierenden Gewebebereich, der 16 h nach Beschuss erstmals beobachtet wurde, über den gesamten Verlauf seiner Entwicklung, bis hin zu einer eventuellen Sprossregeneration zu verfolgen sehr gering ist. Erst 3 bis 4 Wochen nach Beschuss konnten wieder gfp-exprimierende Gewebebereiche visuell beobachtet und dokumentiert werden (siehe 3.3.10 und Abb. 29). Im gezeigten Diagramm wurde die Expression zum Zeitpunkt 24 h mit 100 % festgelegt. 3.3.5 Begleitende Kontrollversuche und Einfluss der osmotischen Behandlung

auf die Sprossbildung Um mögliche Auswirkungen der osmotischen Behandlung auf die Anzahl der gebildeten Sprosse pro Explantat (Sprossbildungsrate) zu untersuchen, wurden die auf R1-Medium (ohne selektiven Druck) regenerierenden Sprosse ausgezählt. In die Auswertung acht Wochen nach Beschuss flossen nur solche Pflänzchen ein, die mindestens 8 bis 10 Millimeter groß und damit potentiell im Stande waren, unter geeigneten Kulturbedingungen tatsächlich zu fertilen Pflanzen heranzuwachsen zu können. Tabelle 8 zeigt die durchgeführten Ansätze: Tab. 8: Einfluss der osmotischen Behandlung auf die Sprossbildungsrate. SK = Scutellarkallus, UE = 4 bis 6 Tage alte unreife Embryonen, UK = unbehandelte (nicht beschossene) Kontrolle, GK = Beschuss ohne DNA, -M = ohne Mannitbehandlung, +M = mit Mannitbehandlung, -S = ohne Selektionsdruck, +S = mit Selektionsdruck (5 mg x l-1 PPT, siehe 2.7.6). Die Gesamtzahl der eingesetzten unreifen Embryonen ist in Klammern dargestellt.

Ansatz Sprossbildungsrate ± σ (Anzahl Zielobjekte)

Zielobjekt des

Beschusses

Art der Behandlung

Osmotische Behandlung

Selektion

SK

UK

-M

-S

4,93 ± 1,19 (477)

UE UK -M -S 4,17 ± 1,60 (128) UE UK +M -S 3,35 ± 1,35 (202) SK GK -M -S 3,39 ± 1,47 (348) UE GK -M -S 2,38 ± 0,81 (185) UE GK +M -S 1,57 ± 1,22 (216)

SK UK -M +S 0,00 ± 0,00 (98) SK GK -M +S 0,00 ± 0,00 (85) UE UK -M +S 0,01 ± 0,02 (80) UE GK +M +S 0,00 ± 0,00 (71)

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

61

In einem Fall konnte acht Wochen nach Beschuss ein Spross auf selektivem Medium gefasst werden. Der im Versuch UE UK –M +S regenerierte Spross starb jedoch nach dem planmäßigen Umsetzen auf frisches Medium mit 5 mg x l-1 PPT ab (siehe 2.7.6). In Abbildung 19 sind die genannten Ergebnisse graphisch dargestellt. Auf die Darstellung der Kontrollversuche mit Selektionsdruck wurde verzichtet. Es ist zu sehen, dass ein Einfluss der osmotischen Behandlung auf die Sprossbildungsrate beim verwendeten Kultivar ‘Combi‘ statistisch nicht fassbar war.

Abb. 19: Einfluss der osmotischen Behandlung auf die Sprossbildungsrate. SK = Scutellarkallus, UE = 4 bis 6 Tage alte unreife Embryonen, UK = unbehandelte (nicht beschossene) Kontrolle, GK = Goldkontrolle, d.h. mit nicht-DNA beladenen Goldpartikeln beschossen, +M = osmotische Behandlung wurde durchgeführt, -M = keine osmotische Behandlung.

3.3.6 Kalluskultur, Regeneration und Beobachtungen an Regeneratpflanzen Nach Partikelbeschuss unterschieden sich die Gewebekulturarbeiten bei beiden Strategien nicht. Nach einer dreiwöchigen Kultur mit steigendem Selektionsdruck auf kallusinduzierendem Medium im Dunkeln folgte eine vierwöchige Kultur auf selektivem Regenerationsmedium bei 16 h Photoperiode. Grüne, gesunde Sprosse mit einer Länge von mindestens 1 cm wurden in Schnappdeckelgläser mit selektivem Medium überführt und nach weiteren vier Wochen zur Bewurzelung auf 190-2-Medium (mit 5 mg x l-1 PPT) umgesetzt. Zwei Drittel bis drei Viertel der in Schnappdeckelgläser überführten Sprosse konnten später auf Bewurzelungsmedium überführt werden. Die bewurzelten Pflänzchen konnten ex vitro erfolgreich weiterkultiviert werden. Insgesamt wurden aus Versuchen mit beschossenen Kalli 37 Pflanzen ins Gewächshaus überführt. Aus Versuchen mit beschossenen Embryonen gelangten 115 Pflanzen ins Gewächshaus. Diese Zahlen beziehen sich auf Experimente, bei denen Nutzgenkassetten zusammen mit einem Reporter-/selektierbaren

SK UK -M IE UK -M IE UK +M SK GK -M IE GK -M IE GK +M

Anz

ahl S

pros

se p

ro E

xpla

ntat

0

1

2

3

4

5

6

7

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

62

Markierungsgenplasmid übertragen werden sollten. Von diesen Pflanzen waren sechs vollständig steril (104.4, pIB2/pAHC25; 180.10, pGFPBAR; 266.1.4, pUT/pGFPBAR; 316.1.1.1, pIB2/pGFPBAR; 316.1.2, pIB2/pGFPBAR; 349.3, pUT/pGFPBAR). Vier andere Regeneratpflanzen wiesen eine reduzierte Fertilität auf (Anzahl Karyopsen pro Ähre; siehe Tabelle 19). Da dies auch bei Kontrollpflanzen auftrat, dürfte die Ursache in somaklonalen Variationen zu suchen sein. Zwölf transgene Pflanzen zeigten eine mehr oder weniger starke Verzweigung der Ähren (Abb. 20 g). Diese Fortsätze bildeten in der Regel keine funktionstüchtigen Blütchen und somit keine Karyopsen. Dieser Phänotyp trat unabhängig davon auf, welche Genkonstrukte oder welches Zielobjekt beim Partikelbeschuss verwendet worden war. Auch waren nicht immer alle Ähren einer Pflanze betroffen. Die Nachkommen solcher Pflanzen, sofern sie welche hervorbrachten, hatten zum Teil ebenfalls geteilte Ähren. Bei der T0-Pflanze 266.1.3

(pUT/pGFPBAR) hatten alle vier Nachkommen wieder geteilte Ähren. Dieser Phänotyp trat auch bei zwei Regeneratpflanzen auf, die aus Kontrollversuchen stammten. Es konnte daher kein Zusammenhang zwischen diesem Phänomen und einer eventuellen Nutzgenaktivität hergestellt werden. Eine Regeneratpflanze (81.5.7, pGT/pAHC25) des natürlicherweise grannenfreien Kultivars ‘Combi‘ wies bis zu 5 cm lange Grannen auf (Abb. 20 h). Von 20 Nachkommen dieser Pflanze zeigten vier dasselbe Phänomen (Abb. 20 i). Die statistische Untersuchung mit dem Chi-Quadrat-Test ergab, dass das beobachtete Spaltungsverhältnis signifikant unterschiedlich zu dem erwarteten von 3:1 war. Bei Kontrollpflanzen trat dieser Phänotyp nicht auf. Bei fünf transgenen Regeneratpflanzen (266.1.3, pUT/pGFPBAR; 329.1.1.1, p5UT3/pGFPBAR; 329.2, p5UT3/pGFPBAR; 347.9.2, pUT/pGFPBAR; 348.1, pUT / pGFPBAR) war die Seneszenz stark verzögert. Die betroffenen Weizenpflanzen reiften rund 6 Wochen später, als die entsprechenden Kontrollpflanzen. Besonders die T0-Pflanze 266.1.3 war in ihrer Seneszenz stark verzögert. Immer wieder schob die Pflanze neue Sprosse nach, während die begleitenden Kontrollen schon abgereift waren. Gleiches trat bei einer von 20 Nachkommen der Mutterpflanze 329.1.1.1, bei fünf von 20 Nachkommen der Pflanze 329.2, bei vier von elf Nachkommen der Pflanze 347.9.2 sowie einer von drei Nachkommen der Regeneratpflanze 348.1 auf. Verzögerte Seneszenz trat nur bei Pflanzen auf, bei denen via Southern blot-Analyse ein Ubiquitin-Promotor gesteuertes Phytoensynthasegen nachgewiesen worden war. Kontrollpflanzen zeigten keine Verzögerung der Seneszenz. Diese Beobachtungen legen den Schluss nahe, dass die verzögerte Seneszenz mit der Aktivität der übertragenen psy-Gene zusammenhängt.

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

63

Abb. 20: Regeneration, uidA-Expression in Weizenpollen und beobachtete Phänotypen. a: Unreife Embryonen unterschiedlichen Alters und Größe. Für den Beschuss unreifer Embryonen und zur Erzeugung von Scutellarkalli wurden Embryonen eingesetzt, die 10 bis 12 Tage nach der Anthese isoliert worden waren (dritter und vierter Embryo von rechts). Für den Partikelbeschuss muss, anders als hier dargestellt, die Scutellumseite des Embryos oben liegen. b: Regenerierender Kallus, ca. 6 Wochen nach Beschuss, unter

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

64

Selektionsdruck kultiviert. c: Regeneratpflänzchen ca. 10 Wochen nach Beschuss in Schnappdeckelgefäßen mit Selektionsdruck (5 mg l-1 PPT). Linke Bildhälfte: PPT tolerantes Pflänzchen. Rechts: PPT sensitives Pflänzchen. d: Regeneratpflanzen auf Bewurzelungsmedium 190-2, ca. 15 Wochen nach Partikelbeschuss. e: Pollen einer T0-Pflanze nach GUS-Aktivitätsfärbung (vgl. 3.3.9). Der linke Pollen zeigt deutliche GUS-Aktivität. f: T1-Pflanzen unterschiedlichen Alters im Gewächshaus. Bei blühenden Pflanzen (hinten) wurden die Ähren mit Zellophantüten vor einer Fremdbestäubung geschützt. g: Verzweigte Ähre. h: Begrannung bei der transgenen Regeneratpflanze 81.5.7 (pGT/pAHC25). i: T1-Generation. Mehrere Nachkommen (Pfeile) waren ebenfalls begrannt.

3.3.7 Nachweis der Phosphinothricin-N-acetyltransferase-Aktivität (PAT-Test)

an Regeneratpflanzen Die unter selektiven Bedingungen regenerierten und ins Gewächshaus überführten Pflanzen wurden auf die Aktivität der Phosphinothricinacetyltransferase hin getestet (siehe 2.9.2). Abbildung 21 zeigt beispielhaft das Autoradiogramm eines solchen PAT-Tests. Neben transgenem Tabak (PS2), der als Positivkontrolle fungierte, wurden vier weitere Proben (von Weizenregeneraten) als PAT-positiv gewertet.

222.

5.1

232.

1

266.

1.1

266.

1.2

266.

1.4

266.

1.9

267.

5

K- PS2

Lauf

richt

ung

Abb. 21: Autoradiogramm PAT-Test. Getestet wurden T0-Pflanzen, die unter selektiven Bedingungen regeneriert wurden. Eine Ausnahme stellt die Negativkontrolle (K-) dar. Sie wurde unter nicht-selektiven Bedingungen aufgezogen. PS2 = transgener Tabak. Der Pfeil markiert 14C-Acetyl-PPT. Die Pflanzen 232.1, 266.1.1, 266.1.2 und 267.5, sowie der transgene Tabak wurden als Pflanzen mit PAT-Aktivität gewertet. Aus Experimenten, bei denen mit Markergen- und Nutzgenplasmid beschossen worden war, gingen 36 Pflanzen hervor, die PAT-Aktivität aufwiesen (siehe Tab. 10).

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

65

3.3.8 Southern blot-Analysen Aufgrund der Vielzahl zu untersuchender Gene und dem Mangel an Blattmaterial, konnten in der T0-Generation Southern blot-Analysen hinsichtlich der Integration des Fremdgens nicht in allen Fällen durchgeführt werden. Die für die Southern blot-Analysen verwendeten Sonden und deren Herkunft sowie die Länge dieser Sonden sind in der Tabelle 9 zusammengestellt. Tab. 9: Übersicht über die für die Southern blot-Analysen verwendeten Sonden und deren Herkunft.

Sonden-bezeichnung

Herkunft Länge Abbildung

gfp PstI/EcoRI-Fragment aus pMON30049 (Pang et al., 1996)

1,36 kb Abb. 22; Abb. 42

bar PstI-Fragment aus pAHC25 (Christensen und Quail, 1996)

0,63 kb Abb. 23; Abb. 43

uidA PstI/SacI aus pAHC25 (Christensen und Quail, 1996)

1,91 kb Abb. 24

tom PstI/KpnI-Fragment aus pTOM5 (Ray et al.,1997)

1,41 kb Abb. 26; Abb. 27; Abb. 44

psy PstI/SacI-Fragment aus pIB2 (Bader, 1999)

1,30 kb ohne Abb.

5‘zMAR BamHI/HindIII-Fragment aus pBS5‘MAR (Bader, 1999)

1,26 kb Abb. 45

3‘zMAR EcoRI/BglII-Fragment aus pBS3’MAR (Bader, 1999)

2,00 kb Abb. 25; Abb. 45

Zum Nachweis des internen gfp-Fragments wurde die DNA der Regeneratpflanzen mit BamHI/EcoRI gespalten und gegen die gfp-Sonde (Tab. 9) hybridisiert. Das interne Fragment wurde bei 0,93 kb erwartet und konnte in zahlreichen Regeneratpflanzen nachgewiesen werden (siehe Abb. 22 und Tab. 10). Für den Nachweis der Integration (durch Nachweis von Hybridfragmenten aus Plasmid-DNA und genomischer Pflanzen-DNA) und zur Abschätzung der Anzahl übertragener Genkopien wurde mit BamHI gespalten und ebenfalls gegen die gfp-Sonde hybridisiert (Abb. 22). Für den Nachweis der intakten Übertragung des bar-Gens wurde mit EcoRI/HindIII gespalten und gegen die bar-Sonde hybridisiert. Das beobachtete Signal trat wie erwartet auf der Höhe 2,93 kb auf (Abb. 23 und Tab. 10). Der Nachweis für das uidA-Gen erfolgte durch Spaltung mit HindIII und Hybridisierung gegen die uidA-Sonde und Dokumentation eines 4,2 kb-Fragments (Abb. 24 und Tab. 10). Die MARs wurden durch BamHI/EcoRI-Spaltung und entsprechender Hybridisierung anhanden eines 2,49 kb-Fragments identifiziert (Abb. 25). Das interne Fragment des tom5-Gens konnte nach Spaltung mit BamHI/EcoRI durch ein 1,75 kb großes Signal (Abb. 26 und Tab. 10) und die tom5-Integration anhand variabler Signale nach HindIII-Spaltung nachgewiesen werden (Abb. 27).

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

66

a) gfp-Gen

Abb. 22: Southern blot-Analyse der T0-Generation auf das interne Fragment (BamHI/EcoRI) des gfp-Gens und auf dessen Integration (BamHI) ins Wirtsgenom. a: Ausschnitt der Plasmidkarte von pGFPBAR mit den für die Analyse relevanten Restriktionsschnittstellen. Die erwarteten Fragmente bei entsprechender Restriktionsspaltung des Plasmids sind angegeben, wobei das zu erwartende Hybridisierungssignal unterstrichen ist. Bei Spaltung mit BamHI ist die Größe des zu erwarteten Hybridisierungssignal an die Entfernung der nächsten im Genom auftretenden BamHI-Schnittstelle gebunden. Dies wurde in der Abbildung durch einen unterbrochenen Pfeil verdeutlicht. Ein Balken symbolisiert die verwendete gfp-Sonde. b: Autoradiogramm: pGFPBAR, Positivkontrolle; -, Negativkontrolle; 1-11, Regeneratpflanzen bei denen auf das interne Fragment der Größe 0,93 kb getestet wurde. Die Pflanzen in den Bahnen 2, 4, 5 und 8 wurden als positiv gewertet. Bei den ebenfalls positiven Pflanzen in den Bahnen 12a, 13a, 14a und 15a sind die jeweiligen Signale des internen Fragments zu sehen. In den jeweils daneben liegenden Bahnen 12b, 13b, 14b und 15b wurden dieselben Pflanzen hinsichtlich der Integration getestet. Hierbei sind in den Bahn 12b und 13b jeweils mindestens drei Signale (Genkopien), in der Bahn 14b zwei und der Bahn 15b vier bis fünf Signale zu erkennen.

pGFP

BA

R(8

806

bp)

Ubiquitin-Promotor Exon Intron bar P-e35SnosT nosT

gfp

b

pGFP

BA

R

0.93 kb

3 kb

2 kb

10 kb

5 kb

- 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 143 - - - -15 16 17 18 19

Ubiquitin-Pro. Exon Intron bar P-e35SnosT nosT

gfp

apG

FPB

AR

- 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13a3 - - - -14a14b- 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12a3 - - - - 15a12b 13b 15b

pGFP

BA

R (8

806

bp)

Sout

hern

blot

-Ana

lyse

BamHI/EcoRI: 0,87 kb; 0,93 kb; 1,58 kb; 5,43

BamHI: 2,45 kb; 6,36 kb

HSP

70 In

tron

S65T

GFP

syng

fp: 1

ST-L

S1 In

tron

synG

FP: 1

BamHI 5251 bpBamHI 2764 bp EcoRI 3631 bp EcoRI 6149 bp

0,93 kb

2 kb

3 kb

5 kb

10 kb

0,93 kb

pGFP

BA

R(8

806

bp)


gfp

b

pGFP

BA

R

0.93 kb

3 kb

2 kb

10 kb

5 kb

- 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 143 - - - -15 16 17 18 19


gfp

apG

FPB

AR

- 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13a3 - - - -14a14b- 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12a3 - - - - 15a12b 13b 15b

pGFP

BA

R(8

806

bp)

Sout

hern

blot

-Ana

lyse


BamHI: 2,45 kb; 6,36 kb

HSP

70In

tron

S65T

GFP

syng

fp: 1

ST-L

S1In

tron

synG

FP: 1


0,93 kb

2 kb

3 kb

5 kb

10 kb

0,93 kb

pGFP

BA

R(8

806

bp)


gfp

b

pGFP

BA

R

0.93 kb

3 kb

2 kb

10 kb

5 kb

- 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 143 - - - -15 16 17 18 19


gfp

apG

FPB

AR

- 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13a3 - - - -14a14b- 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12a3 - - - - 15a12b 13b 15b

pGFP

BA

R (8

806

bp)

Sout

hern

blot

-Ana

lyse


BamHI: 2,45 kb; 6,36 kb

HSP

70 In

tron

S65T

GFP

syng

fp: 1

ST-L

S1 In

tron

synG

FP: 1


0,93 kb

2 kb

3 kb

5 kb

10 kb

0,93 kb

pGFP

BA

R(8

806

bp)


gfp

b

pGFP

BA

R

0.93 kb

3 kb

2 kb

10 kb

5 kb

- 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 143 - - - -15 16 17 18 19


ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

67

b) bar-Gen

Abb. 23: Southern blot-Analyse der T0-Generation auf das interne Fragment (EcoRI/HindIII) des bar-Gens. a: Ausschnitt aus der pGFPBAR-Plasmidkarte mit den für die Analyse relevanten Restriktionsschnittstellen. Die erwarteten Fragmente bei entsprechender Restriktionsspaltung des Plasmids sind im Kasten oben links abgebildet. Das zur bar-Sonde komplementäre Fragment (2,93 kb) ist unterstrichen. b: Autoradiogramm: pGFPBAR, Positivkontrolle; -, Negativkontrolle; 1-15, Regeneratpflanzen. In den Bahnen 3, 5 bis 8, 12 bis 13 sind Signale auf der erwarteten Höhe 2,93 kb zu sehen.

pGFP

BA

R (8

806

bp) EcoRI/HindIII: 1,17 kb; 2,40 kb;

2,93 kb; 3,35 kb

Ubiquitin-Pro. Exon Intron syn

S65T

GFP

ST-L

S1 In

tron

HSP

70 In

tron


gfp:

1

syn

GFP

: 1

barEcoRI 3631 bpHindIII 697 bp

Sout

hern

blo

t-Ana

lyse

a

b

pGFP

BA

R

2,93 kb

-

2,93 kb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

pGFP

BA

R (8

806


2,93 kb; 3,35 kb


S65T

GFP

ST-L

S1 In

tron

HSP

70 In

tron


gfp:

1

syn

GFP

: 1

barEcoRI 3631 bpHindIII 697 bp

Sout

hern

blo

t-Ana

lyse

a

b

pGFP

BA

R

2,93 kb

-

2,93 kb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

68

c) uidA-Gen

Abb. 24: Southern blot-Analyse der T0-Generation auf das interne Fragment des uidA-Gens. a: Ausschnitt aus der Plasmidkarte von p5’uidA3’ mit den für die Analyse relevanten Restriktionsschnittstellen. Im Kasten oben links sind die erwarteten Fragmente bei entsprechender Restriktionsspaltung des Plasmids angegeben. Das zur uidA-Sonde komplementäre Fragment (4,2 kb) ist unterstrichen. Ein Balken symbolisiert die verwendete uidA-Sonde. b: Autoradiogramm: p5uidA3, Positivkontrolle; -, Negativkontrolle; 1-9, Regeneratpflanzen. In den Bahnen 1, 2, 5, 6, 7 und 8 sind Signale auf der erwarteten Höhe von 4,2 kb zu sehen.

b

a

5‘zMAR 3‘zMARnosTuidAUbiquitin-Promotor Exon Intron

p5ui

dA3

1082

5 bp

Sout

hern

blo

t-Ana

lyse

HindIII 7662 bp4,2 kb

HindIII: 4,20 kb; 6,63 kb

HindIII 3466p5

uidA

3

-

4,2 kb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

uidA

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

69

d) MARs

Abb. 25: Southern blot-Analyse der T0-Generation auf das interne 3zMARs-Fragment. a: Ausschnitt aus der Plasmidkarte von p5UT3 mit den für die Analyse relevanten Restriktionsschnittstellen. Im Kasten oben links sind die erwarteten Fragmente bei entsprechender Restriktionsspaltung des Plasmids mit BamHI/EcoRI angegeben. Das zur 3zMAR-Sonde komplementäre Fragment ist unterstrichen. Der Balken symbolisiert die verwendete 3zMAR-Sonde. b: Autoradiogramm: p5UT3, Positivkontrolle; -, Negativkontrolle; 1-9, Regeneratpflanzen. In den Bahnen 1 bis 9 ist jeweils ein Signal auf der erwarteten Höhe von 2,49 kb zu sehen.

EcoRI

Ubiquitin-Pro. Exon tom nos

BamHI

Sout

hern

blo

t-Ana

lyse

2,49 kb

p5U

T3

-

p5U

T3

1040

5 bp

BamHI 9718EcoRI 72283zMAR

2,49 kb

BamHI/EcoRI: 0,04 kb; 0,27 kb; 1,74 kb; 2,49 kb; 2,73 kb; 3,14 kb

Ubiquitin-Pro. Exon Intron5‘zMAR tom5 nosT 3‘zMAR

a

b

1 2 3 4 5 6 7 8 9

BamHI 5482BamHI 2448 BamHI 2717 BamHI 2754

Sout

hern

blo

t-Ana

lyse

2,49 kb

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

70

e) Phytoensynthasegen tom5

Abb. 26: Southern blot-Analyse der T0-Generation auf das interne Fragment des tom5-Gens. a: Plasmidkartenausschnitt von pUT mit den für die Analyse wichtigen Restriktionsschnittstellen. Die erwarteten Fragmente bei entsprechender Restriktionsspaltung des Plasmids sind in dem Kasten oben links dargestellt. Das zur tom5-Sonde komplementäre Fragment (1,75 kb) ist unterstrichen. Ein Balken symbolisiert die verwendete tom5-Sonde. b: Autoradiogramm: pUT, Positivkontrolle; - , Negativkontrolle. 1 –13, Regeneratpflanzen. In den Bahnen 2 bis 5, 9 und 10 sind Signale auf der erwarteten Höhe von 1,75 kb zu erkennen.

tom5

1,75 kb

pUT

(691

7bp

)

-pUT

1,75 kb

a

b

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

BamHI/EcoRI: 1,75 kb; 5,17 kb

EcoRI 4734

Ubiquitin-Pro. Exon Intron tom5 nosT

BamHI 2988

Sout

hern

blo

t-Ana

lyse

tom5

1,75 kb

pUT

(691

7bp

)

-pUT

1,75 kb

a

b

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

BamHI/EcoRI: 1,75 kb; 5,17 kb

EcoRI 4734

Ubiquitin-Pro. Exon Intron tom5 nosT

BamHI 2988

Sout

hern

blo

t-Ana

lyse

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

71

Abb. 27: Southern blot-Analyse der T0-Generation auf die Integration des tom5-Gens mittels HindIII-Spaltung. a: Plasmidkartenausschnitt von pGT mit den für die Analyse wichtigen Restriktionsschnittstellen. Das erwartete Fragment bei entsprechender Restriktionsspaltung des Plasmids pGT mit HindIII beträgt 5,5 kb. Ein Balken symbolisiert die verwendete tom5-Sonde. b: Autoradiogramm: pGT, Positivkontrolle; - , Negativkontrolle. In den darauffolgenden elf Bahnen wurde DNA von Regeneratpflanzen aufgetragen. In den Bahnen 3 und 5 sind jeweils zwei Signale zu erkennen, die oberhalb des Signals von 5,53 kb für das linearisierte Plasmid liegen. In der Bahn 9 sind bis zu sechs Signale zu erkennen. Das unterhalb der 5,53 kb-Markierung liegende Signal in der Bahn 9 kann darauf hindeuten, dass hier nur ein Bruchstück einer Genkopie vorliegt. Alle Ergebnisse der durchgeführten Transformationsexperimente wie verwendete Plasmidkombinationen, Anzahl der beschossenen und selektierten Pflanzen, die Anzahl der erhaltenen transformierten und cotransformierten Pflanzen, die Ergebnisse der Southern blot-Analysen und die Enzym- (PAT, GUS) beziehungsweise fluoreszenzoptischen Tests (GFP) sind in der Tabelle 10 zusammengefasst. Für diese Experimente wurden insgesamt 18242 Embryonen verwendet.

Sout

hern

blo

t-Ana

lyse

a

b

pGT

-

pGT

552

5 bp

HindIII 928 bp

Gliadin-Pro. tom5 nosT

HindIII: 5,53 kb

5,53 kb

tom5

ca. 10 kb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Sout

hern

blo

t-Ana

lyse

a

b

pGT

-

pGT

552

5 bp

HindIII 928 bp


HindIII: 5,53 kb

5,53 kb

tom5

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

72

Tab. 10: Ergebnisse der Transformationsexperimente der T0-Generation. Statistische Auswertungen wie Students t-Test, sind im Text erwähnt. Verwendete Abkürzungen bei den Plasmidbezeichnungen: G = Gliadin-Promotor, U = Ubiquitin-Promotor, T = tom5, 5 = 5zMAR, 3 = 3zMAR, IB2 = Ubiquitin-Promotor-psy-Konstrukt. pAHC25 beinhaltet die proteincodierenden Regionen des uidA- und des bar-Gens, jeweils unter Kontrolle des Ubiquitin-Promotors, pGFPBAR beinhaltet die proteincodierende Region des gfp-Gens unter Kontrolle des CaMV 35S-und die proteincodierende Region des bar-Gens unter Kontrolle des Ubiquitin-Promotors. a) SK-Strategie: Partikelbeschuss von embryogenen Scutellarkalli mit pAHC25 als Reporter- / selektierbares

Markierungsgenplasmid

Southern positive

Enzyme / Proteinassay

positive

Transf.

rate1

Plasmidkombination für Cotransformation

beschossene Explantate

selekt.

Pflanzen

Transgene (co-transf.)

bar uidA psy / tom5 PAT GUS

pAHC25 / pGT 1233 8 3 (2) 2 1 2 1 1 0,24 %pAHC25 / p5GT3 863 2 2 (1) 1 1 2 0 0 0,23 %pAHC25 / pUT 908 3 0 0 0 0 0 0 0 %pAHC25 / p5UT3 873 6 0 0 0 0 0 0 0 %pAHC25 / pIB2 1278 4 2 (1) 1 2 1 1 1 0,16 %pAHC25 / p5IB23 689 0 - - - - - - 0 % Kontrollen2 841 0 - - - - - - -

b) SK-Strategie: Partikelbeschuss von embryogenen Scutellarkalli mit pGFPBAR als Reporter- / selektierbares Markierungsgenplasmid

Southern positive

Enzyme / Proteinassay positive

Transf.

rate1



selekt.

Pflanzen


bar gfp psy / tom5 PAT GFP

pGFPBAR / pGT 1117 4 3 (2) 3 2 2 1 2 0,27 %pGFPBAR / p5GT3 838 4 1 (1) 1 0 1 0 0 0,12 %pGFPBAR / pUT 1156 2 1 (0) 1 1 0 1 1 0,09 %pGFPBAR / p5UT3 870 1 1 (0) 1 1 0 0 0 0,11 %pGFPBAR / pIB2 983 3 1 (0) 1 0 0 0 0 0,10 %pGFPBAR / p5IB23 797 0 0 - - - - - 0 % Kontrollen2 wie in Tab.

10a

c) UE-Strategie: Partikelbeschuss von unreifen Embryonen mit pGFPBAR als Reporter- / selektierbares

Markierungsgenplasmid

Southern positive

Enzyme / Proteinassay

positive

Transf.

rate1



selekt.

Pflanzen


bar gfp psy / tom5 PAT GFP

pGFPBAR 200 10 6 6 5 - 3 2 3,00 % pGFPBAR / pGT 991 8 4 (0) 2 3 0 2 0 0,40 %pGFPBAR / p5GT3 818 5 3 (1) 3 3 1 1 1 0,37 %pGFPBAR / pUT 906 51 25 (9) 21 16 9 13 7 2,76 %pGFPBAR / p5UT3 955 29 18 (10) 16 15 10 13 9 1,88 %pGFPBAR / pIB2 813 19 6 (0) 4 2 0 2 2 0,74 %pGFPBAR / p5IB23 888 3 1 (1) 1 1 1 1 1 0,11 % Kontrollen2 225 0 - - - - - - - 1 einschließlich cotransformierter Pflanzen 2 nicht beschossen

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

73

Abb. 28: Transformationsraten. a: Gegenüberstellung der Transformationsraten der Experimente, bei denen Scutellarkallus als Zielobjekt des Partikelbeschusses gedient hatte (vgl. Tab. 10a und b). Die Bezeichnungen pAHC25 beziehungsweise pGFPBAR weisen auf das in den Cotransformationsexperimenten verwendete Markierungsgenplasmid hin. Die Mittelwerte der jeweiligen Versuchsreihen unterschieden sich statistisch nicht voneinander. b: Gegenüberstellung der Transformationsraten einerseits der Versuche mit Scutellarkallus (vgl. Tab. 10a und b), andererseits mit unreifen Embryonen (vgl. Tab. 10c) als rezipierende Gewebe des Partikelbeschusses.

Die Transformationsraten der Cotransformationsexperimenten mit pAHC25 und pGFPBAR unterschieden sich nicht (Abb. 28 a). Wie aus Abbildung 28 b hervorgeht, ist der Unterschied zwischen den Transformationsraten von Scutellarkallus (0,12 %) und unreifen Embryonen (1,06 %) statistisch signifikant. Eine Auswertung, wie effektiv der gewählte Selektionsdruck von 5 mg/l PPT war, ergab, dass in 77 der 163 selektierten und untersuchten Pflanzen mindestens eines der übertragenen Gene nachgewiesen werden konnte (vgl. Tab. 10). Dies bedeutet, dass 52,8 % der selektierten Pflanzen als Falschpositive betrachtet werden mussten. 3.3.9 Nachweis der β-Glucuronidase-Aktivität (GUS-Test) Die Pollen aller acht transgenen Regeneratpflanzen, die aus Cotransformationsexperimenten mit pAHC25 hervorgegangen waren, wurden histochemisch auf ihre β-Glucuronidase-Aktivität hin untersucht (siehe auch Abb. 20 e). Zwei dieser Pflanzen (104.4 pIB2 / pAHC25 und 163.3.2 pGT / pAHC25) stellten sich als GUS-positiv heraus. Die Auszählung ergab bei beiden Pflanzen eine Pollensegregation von 1 : 1. Dies zeigte, dass die Pflanzen hemizygot für das getestete uidA-Gen waren. Für die Nachkommen wurde daher eine 3:1 Segregation des uidA-Gens erwartet.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

Tran

sfor

mat

ions

rate

[%]

Tran

sfor

mat

ions

rate

[%]

pAHC25 pGFPBARSK-

StrategieUE-

Strategie

a b

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

Tran

sfor

mat

ions

rate

[%]

Tran

sfor

mat

ions

rate

[%]

pAHC25 pGFPBARSK-

StrategieUE-

Strategie

a b

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

74

3.3.10 Nachweis der gfp-Genexpression Für den fluoreszenzoptischen Nachweis der gfp-Expression standen zwei Filterkombinationen zur Verfügung. Angeregt wurde immer durch einen Filter, der Licht der Wellenlänge 450 bis 490 nm passieren ließ. Das vom Untersuchungsobjekt emittierte Licht passierte entweder Sperrfilter 1 (BP 515-530 nm) oder Sperrfilter 2 (LP 515 nm). Abbildung 29 zeigt die Transmissionspektren (a) und Aufnahmen (b bis e), die die Eigenschaften der beiden Sperrfilter verdeutlichen. Der Unterschied war bei chlorophyllfreiem Material wie Kallus (Abb. 29 b und c) weniger deutlich, wobei LP 515 nm lichtstärker und daher für fotographische Aufnahmen besser geeignet ist. Deutlicher wurde der Unterschied bei der Betrachtung von chlorophyllhaltigem Gewebe wie Blättern (Abb. 29 d und e) oder unreifen Karyopsen (ohne Abbildung). Hier unterdrückte der Sperrfilter 2 die rötliche Fluoreszenz des Chlorophylls vollständig (Abb. 29 e). Als Nachteil stellte sich heraus, dass eine grünliche Fluoreszenz, die auf phenolische Substanzen zurückging, mit diesem Filter (Sperrfilter 2) schwer vom GFP zu unterscheiden war. Eine grünliche Fluoreszenz trat vor allem bei alterndem beziehungsweise absterbendem Gewebe auf. Sperrfilter 1 ermöglichte hier eine eindeutigere Aussage, da dieser die nicht auf GFP zurückzuführende Fluoreszenz gelblich erscheinen ließ.

Abb. 29: Vergleich der Filterkombinationen. a: Transmissionsspektren der verwendeten Filter. BP = band pass-Filter; LP = low pass-Filter. Quelle: www.Zeiss.de, verändert. b und c: Für die Aufnahme b wurde der Filter LP 515 nm, für c der Filter BP 515-530 nm verwendet. Zu sehen ist ein gfp-exprimierender Mikrokallus (Pfeil), der von nicht-gfp-exprimierendem Kallusgewebe umgeben ist. Die Aufnahme wurde vier Wochen nach Beschuss gemacht. d und e: Blattmaterial aus dem Gewächshaus. Jeweils links: nicht-transgene Kontrolle, jeweils rechts: gfp-exprimierendes Blatt (zirka 16 Wochen nach Beschuss von unreifen Embryonen). Für d wurde LP 515 nm, für e BP 515-530 nm verwendet.

b c

d e

a

Anregungsfilter: BP 450-490 nmSperrfilter 1: BP 515-530 nmSperrfilter 2: LP 515T [%]

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

75

Des Weiteren war der Unterschied zwischen gfp-exprimierendem und GFP-freiem Gewebe mit Sperrfilter 1 im Allgemeinen deutlicher zu erkennen. Aufnahmen mit Sperrfilter 1 waren farbintensiver und wirkten realistischer. Aus den genannten Gründen wurde der Sperrfilter 1 bevorzugt verwendet. Vom Zeitpunkt des Partikelbeschusses bis zur abreifenden Regeneratpflanze wurde die Expression des gfp-Gens beobachtet und dokumentiert (Abb. 30).

Abb. 30: Expression des gfp-Gens in verschiedenen Geweben transgener Weizenpflanzen. a: Kallus, 4 Wochen nach Beschuss. Gfp-exprimierender Kallus, umgeben von nicht-exprimierendem Kallusgewebe. b: Regnerierender Kallus 5 Wochen nach Beschuss. c: GFP-Fluoreszierender Spross, 6 Wochen nach Beschuss. d: Gfp-exprimierende Wurzel und chlorophyllhaltiges Blatt derselben Pflanze. e: Junge Blätter von ins Gewächshaus überführten Regeneratpflanzen. Transgene (oben) und Kontrolle (unten). f: Blütenorgane einer Transgenen (links) und einer Kontrollpflanze (rechts). g: Junge Karyopsen von außen im Normallicht aufgenommen. Oben sind Karyopsen von Kontrollpflanzen, unten die von Transgenen abgebildet h: Wie g, nur unter Fluoreszenzbedingungen. i: Proteinrohextrakte unter Fluoreszenzbedingungen. Von rechts: Tabak-Positivkontrolle, Tabak-Negativkontrolle, jeweils Blattextrakte. Weizen-Negativkontrolle, fünf Transgene, alles Extrakte aus Karyopsen.

Vier Wochen nach Beschuss zeigten rund 8 % der Kalli gfp-exprimierende Zellcluster (Abb. 30 a). Zirka 5 Wochen nach Beschuss konnten sich auf Regenerationsmedium aus einem solchen Cluster heraus Sprosse bilden (Abb. 30 b), die bei entsprechend starker gfp-Expression eine Woche später noch GFP-Fluoreszenz zeigten (Abb. 30 c). Häufig wurde die

e

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

76

GFP-Fluoreszenz bei bewurzelten gfp-transgenen Pflanzen durch eine chlorophyllbedingte Fluoreszenz überdeckt; sie konnte jedoch noch immer an den Wurzeln beobachtet werden (Abb. 30 d). Bei ins Gewächshaus überführten transgenen Pflanzen konnte nur in deren jungem Blattgewebe GFP-Fluoreszenz gefunden werden (Abb. 30 e). In Ovarien und Filamenten, nicht jedoch in Stigmata oder Antherenwänden, konnte GFP optisch nachgewiesen werden (Abb. 30 e). Auch in Pollen transgener Pflanzen konnte kein GFP beobachtet werden (ohne Abbildung). Die starke Autofluoreszenz der Pollen störte hier die Analyse. Junge Karyopsen (10 bis 15 Tage nach der Anthese; Abb. 30 g, Normallicht), die durch Selbstung transgener T0-Pflanzen erhalten worden waren, zeigten häufig eine starke gfp-Expression (Abb. 30 h; Fluoreszenzbedingungen). In den Proteinrohextrakten solcher Karyopsen konnte ebenfalls GFP nachgewiesen werden (Abb. 30 i). Abbildung 31 a zeigt quergeschnittene Karyopsen einer transgenen Pflanze und einer Kontrollpflanze. Die Samenhülle und das Endosperm zeigten bei der Transformanten GFP (vgl. Abb. 41 e-g). In Abb. 31 b sind die freipräparierten Embryonen (mit Scutella) zu sehen. Nur der Embryo der transgenen Pflanze zeigte GFP-Fluoreszenz.

Abb. 31: Querschnitt durch zwei Weizenkaryopsen und freipräparierte Embryonen. a: Quergeschnittene Karyopsen. Der Blick fällt auf die Schnittfläche, deren größter Teil durch das Endosperm ausgefüllt wird. Abgebildet ist je eine Karyopsenhälfte einer transgenen T0-Regeneratpflanze (links) und einer nicht-transgenen Regeneratpflanze (rechts). b: Der isolierte Embryo einer transgenen Mutterpflanze (Pfeil) zeigt GFP-Fluoreszenz, wohingegen ein Embryo der Kontrollpflanze nur eine schwache Eigenfluoreszenz aufweist.

Neben der optischen Bewertung der GFP-Fluoreszenz wurde auch ein immunologischer Nachweis des GFPs mittels Western blot-Analyse durchgeführt. Die Gewinnung des Proteinrohextraktes erfolgte wie in 2.9.6 beschrieben. Abb. 30 i zeigt eine Reihe solcher Proteinrohextrakte wie sie aus den Blättern (im Falle des Weizens auch aus Karyopsen) von transgenen Weizen- und Tabakpflanzen sowie entsprechender Negativkontrollen gewonnen worden waren. Die Proteinextrakte zeigten nach Anregung mit blauem Licht (λ= 450-490 nm) und Einsatz eines entsprechenden Sperrfilters (λ= 515 nm) die erwartete Grünfluoreszenz. Die mitgeführten Kontrollen erschienen hingegen matt bräunlich. Zur besseren Handhabung waren die Extrakte in klaren Eppendorfpipettenspitzen aufgenommen worden.

a b

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

77

Mittels Western blot-Analysen konnte bewiesen werden, dass grün-fluoreszierendes Gewebe auch spezifisch auf GFP-Antikörper ansprach. Der Nachweis wurde sowohl für Proteinrohextrakte, die aus Blättern gewonnen worden waren wie auch für Proteinrohextrakte, die aus Karyopsen isoliert worden waren, erbracht. In Abbildung 32 sind Chemilumineszenz-Aufnahmen der beschriebenen Western blot-Analyse dargestellt. Das GFP besitzt ein Molekulargewicht von 26,9 kDa. Auf der entsprechenden Position des Gels beziehungsweise der Chemilumineszenz-Aufnahme konnten die erwarteten Signale identifiziert werden. Neben diesen erwarteten Signalen traten auch unspezifische Hybridisierungen des Antikörpers mit nicht-charakterisierten Proteinen des Weizens auf (siehe Abb. 32 a, Bahn 1, Negativkontrolle).

1 2 3 4 5 6

26,9 kDa

b

1 2 3 4 5 6 7

26,9 kDa

a

Abb. 32: Western blot-Analyse auf GFP. a: Bahn 1, Negativkontrolle Weizen, Proteinrohextrakt aus dem Blatt. Bahnen 2 bis 6: Proteinrohextrakte aus den Blättern transgener Weizenpflanzen. Die Bahnen 2 sowie 5 und 6 (schwaches Signal) zeigen ein Signal auf der richtigen Höhe. Bahn 7, positiv Kontrolle (GFP-Tabak). b: Bahnen 1 und 2 Negativkontrollen Tabak, Bahnen 3 und 4 positiv Kontrollen Tabak, Bahn 5 negativ Kontrolle Weizen. Bahn 6, Proteinrohextrakt aus der Karyopse der selben Pflanze, wie in Abb. 31a Bahn 2. Das Signal auf Höhe 26,9 kDa ist deutlich zu erkennen. 3.3.11 HPLC-Analyse Um die Expression der übertragenen Phytoensynthasegene fassen und ihre eventuelle Auswirkung auf den Carotinoidmetabolismus bewerten zu können, wurden transgene Pflanzen und nicht transgene Kontrollpflanzen einer HPLC-Analyse unterzogen. Dabei wurden nur solche transgene Pflanzen untersucht, bei denen die Southern blot-Analyse auf das Phytoensynthasegen positiv ausgefallen war. An dieser Stelle sollen sowohl die Analyseergebnisse von T0- als auch die von T1-Pflanzen angesprochen werden. Auf Analysen von Karyopsen der T0-Generation musste aufgrund des meist nur in geringen Mengen zur Verfügung stehenden Materials und um das Fortbestehen der Linie nicht zu gefährden verzichtet werden. Insgesamt wurden Blätter von 18 T0- und 19 T1-Pflanzen, die Kornextrakte von elf T1- sowie Blatt- und Kornextrakte von 15 nicht-transgenen Regenerat-, bzw. T1-Pflanzen, die als Kontrollen das Experiment begleitet haben, untersucht.

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

78

Folgende Substanzen (Tabelle 11) konnten aufgrund eines Vergleichs ihrer Retentionszeiten und Spektren mit entsprechenden Standards und Literaturangaben zugeordnet werden: Tab. 11: Mit der HPLC untersuchte Substanzen und deren Retentionszeiten. Substanz Retentionszeit in min Violaxanthin und Neoxanthin 3,7 Lutein 6,7 Chlorophyll b 8,1 Chlorophyll a 11,5 Phytoen 16,7 α-Carotin 22,0

β-Carotin 24,1

ζ-Carotin 34,0 Lycopin 37,0

Die Aufzeichnungen erfolgten gleichzeitig bei den Wellenlängen 400 nm, 450 nm, 350 nm und 280 nm über einen Zeitraum von 45 min.

3.3.11.1 HPLC-Analyse von Blättern Abbildung 33 zeigt ein typisches Elutionsprofil von Blattextrakten.

Abb. 33: Elutionsprofil des Blattextrakts einer nicht-transgenen Weizenregeneratpflanze. Die Aufzeichnung erfolgte parallel bei den Wellenlängen (von oben): 400 nm, 450 nm, 350 nm und 280 nm. Identifizierte Signale: Retentionszeit 3,653 min: Violaxanthin und Neoxanthin; 6,772 min: Lutein; 8,007 min: Chlorophyll b; 11,542 min Chlorophyll a; 22,98 min: α-Carotin; 24,127 min: β-Carotin.

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

79

Um bewerten zu können, ob die HPLC-Analyse aussagekräftig ist, wurden drei Proben einer Kontrollpflanze unabhängig voneinander aufgearbeitet und gemessen. In Tabelle 12 sind Mittelwerte und Standardabweichungen der untersuchten Metaboliten aufgeführt. Tab. 12: Stationäre Konzentrationen ausgesuchter Metaboliten zur Überprüfung der Aussagekraft der HPLC-Analyse. Metabolit ξ ± s

[µg/g] s1

[%]

Violaxanthin/Neoxanthin 117,4 ± 4,4 4 Lutein 157,6 ± 14,7 9 Chlorophyll b 596,4 ± 42,4 7 Chlorophyll a 2845,2 ± 257,5 9 α-Carotin 1,5 ± 1,3 87

β-Carotin 127,3 ± 10,2 8

ξ = Mittelwert aus den Messungen der Kontrollpflanzen; s = Standardabweichung; s1 = Standardabweichung in %. Die Standardabweichung lag, außer bei α-Carotin, bei allen Metaboliten unter 10 %. Die 87 % Standardabweichung bei α-Carotin deutet darauf hin, dass bei diesem Pigment an der Empfindlichkeitsgrenze der HPLC-Anlage gearbeitet wurde. Da die Messungen der übrigen Metaboliten reproduzierbar waren, wurden, trotz der Schwankungsbreite der α-Carotin-Werte, HPLC-Einzelmessungen als ausreichend genau betrachtet. Die zu untersuchenden T0-Pflanzen liefen über einen Zeitraum von zwei Jahren auf. Bei der Probenanalyse war daher damit zu rechnen, dass die stationären Konzentrationen der Metaboliten stärkeren Schwankungen unterliegen. Diese können auf wechselnde Bedingungen während der Gewächshauskultur zurückgeführt werden. Die Schwankungsbreiten der einzelnen Substanzen wurde mit Blättern von fünf nicht-transgenen T0-Pflanzen und sechs nicht-transgenen T1-Pflanzen untersucht (Tab. 13). Tab. 13: Stationäre Konzentrationen ausgesuchter Metaboliten in Blättern nicht-transgener Kontrollpflanzen der T0 und T1. Metabolit T0-Generation T1-Generation ξ ± s

[µg/g] s1

[%] ξ ± s

[µg/g] s1

[%] Violaxanthin + Neoxanthin 115 ± 32 28 134 ± 22 16 Lutein 163 ± 46 28 161 ± 17 11 Chlorophyll b 569 ± 188 33 507 ± 182 36 Chlorophyll a 2352 ± 629 27 2369 ± 241 10 α-Carotin 2 ± 2,8 140 3 ± 3 100 β-Carotin 73 ± 35 48 84 ± 26 31 ξ = Mittelwert aus den Messungen der Kontrollpflanzen; s = Standardabweichung; s1 = Standardabweichung in %.

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

80

T 0-G

ener

atio

n T 1

-Gen

erat

ion

In Tabelle 14 sind die Ergebnisse der HPLC-Analyse von Blättern der T0 und T1 aufgelistet. Tab. 14: Ergebnisse der HPLC-Analyse von Blättern transgener T0- und T1-Pflanzen sowie der entsprechenden Kontrollen. Die Reihenfolge der Metaboliten orientiert sich an deren Retentionszeiten im Elutionsprofil.

Pflanzen-Nr. Violaxanthin + Neoxanthin

[µg/g]

Lutein

[µg/g]

Chlorophyll b

[µg/g]

Chlorophyll a

[µg/g]

α-Carotin

[µg/g]

β-Carotin

[µg/g]

81.5.7 129,0 211,0 699,8 3026,4 0,0 149,384.5 159,4 229,4 814,7 3539,1 0,0 176,3

163.5.5 109,7 139,9 494,9 1963,0 0,0 84,2222.4.2.2 97,8 156,0 567,7 2177,0 3,1 84,3

233.1 90,4 170,6 552,6 2114,9 0,0 92,3253.1 113,8 181,2 678,3 2605,2 2,9 115,2253.2 162,3 268,1 911,2 3935,7 0,0 203,6253.3 137,3 263,4 841,7 3681,1 0,0 165,0253.4 134,7 227,0 731,8 3223,1 0,0 132,9253.5 102,3 177,2 590,3 1576,9 5,3 35,1

266.1.4 119,4 219,1 660,9 2847,5 0,0 129,5267.8 118,8 157,7 519,3 2377,0 0,0 108,0

267.11 87,6 102,8 385,7 1487,8 0,0 47,7329.1.1.2 130,7 180,8 607,4 2458,7 0,0 41,5

333.8.2 83,3 152,7 592,6 2087,2 0,0 102,6348.5.2 129,8 216,3 800,4 3107,4 4,0 138,3

348.9 119,9 176,2 635,4 2308,0 3,0 90,9349.3 146,9 203,5 648,0 2800,0 0,0 132,6

Kontrolle 1 85,9 138,0 469,4 1977,4 5,1 58,5Kontrolle 2 144,4 180,7 614,9 2688,3 0,0 77,1Kontrolle 3 99,5 151,9 597,6 2254,2 5,1 75,1Kontrolle 4 89,7 113,1 327,5 1608,8 0,0 27,8

Kontrolle 5 154,3 233,3 836,5 3230,1 0,0 124,1

253.4 / 17 52,0 70,9 288,8 1081,1 0,0 36,1253.5 / 2 53,9 64,7 241,8 989,9 0,0 3,7

266.1.3 / 1 65,5 86,3 269,3 1185,2 0,0 25,9266.1.3 / 2 152,0 180,2 671,9 2569,5 2,7 101,5266.1.3 / 4 129,4 180,8 658,0 2533,9 2,9 106,5

329.1.1.1 / 5 80,3 139,1 472,4 1948,0 0,0 68,4329.2 / 18 123,0 161,6 625,3 2425,1 0,0 100,1331.1 / 19 112,6 177,1 594,4 2505,0 6,1 105,5333.1 / 8 108,2 182,2 626,6 2709,5 0,0 101,9

333.1 / 10 112,9 112,9 433,8 1685,6 0,9 46,7333.1 / 19 112,6 177,1 594,4 2504,7 0,0 105,5

333.8.2 / 10 113,4 167,3 623,5 2426,2 2,7 104,3333.8.2 / 13 141,2 187,7 678,7 2751,8 3,4 129,1336.2.1 / 8 124,6 170,2 615,7 2377,2 2,6 101,7

348.1 / 1 156,1 169,0 486,8 2384,0 3,4 96,7348.1 / 2 134,5 154,8 589,0 2302,3 0,0 88,0388.5 / 7 91,4 101,9 374,0 1500,3 0,0 59,9388.5 / 8 111,1 121,7 412,6 1731,4 0,0 44,2

388.5 / 18 96,2 104,3 372,4 1530,2 0,0 67,3

Kontrolle 1 165,0 182,8 642,1 2668,2 7,7 115,2Kontrolle 2 157,1 160,7 548,3 2458,1 0,0 41,8Kontrolle 3 133,3 180,7 672,2 2607,9 2,6 104,6Kontrolle 4 108,9 146,6 160,7 2168,4 5,5 77,2Kontrolle 5 125,5 145,3 509,6 2207,1 0,0 90,7

Kontrolle 6 116,5 148,9 509,3 2106,2 2,2 73,3

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

81

In keiner der untersuchten Proben konnte Phytoen nachgewiesen werden. Bei den Kontrollen der T0-Generation handelte es sich um Regeneratpflanzen. Bei den Kontrollen der T1-Generation handelte es sich um die Nachkommen solcher nicht-transgener Regeneratpflanzen. Wie aus den Tabellen 13 und 14 ersichtlich, schwankte die Konzentration einzelner Pigmente von Pflanze zu Pflanze stark. So wurden bei den T0-Kontrollen Standardabweichungen von 27 % bis über 100 % festgestellt. Bei T1-Kontrollen reduzierten sich die Standardabweichungen auf Werte zwischen 10 % und 100 %. Die Ermittlung von Pigmentverhältnissen zeigte, dass diese relativ konstant waren. Deren Standardabweichungen lagen bei der T0 zwischen 4 % und 34 %, bei der T1 zwischen 7 % und 44 % (siehe Tab. 15). Tab. 15: Pigmentverhältnisse in Blättern nicht-transgenen Kontrollpflanzen der T0 und T1. Verhältnis T0-Generation T1-Generation ξ ± s

[mol/mol] s1

[%] ξ ± s

[mol/mol] s1

[%] Gesamtchlorophylle/Gesamt-carotinoide

5,49 ± 0,2 4 4,97 ± 0,37 7

Violaxanthin/Lutein 0,67 ± 0,08 12 0,79 ± 0,09 11 Chlorophyll a/β-Carotin 22,64 ± 7,71 34 19,43 ± 8,45 44

ξ = Mittelwert aus den Messungen der Kontrollpflanzen; s = Standardabweichung; s1 = Standardabweichung in %. Die Bewertung der Pigmentverhältnisse transgener Pflanzen wurde auf Basis der Ergebnisse der aus Tabelle 15 ersichtlichen Fehler vorgenommen. So wurde zum Beispiel die errechnete Fehlerbreite von 12 % für das Violaxanthin/Lutein-Verhältnisse bei T0-Kontrollpflanzen auf die dahingehend untersuchten T0-Pflanzen übertragen. In Abbildung 34 sind die Pigmentverhältnisse von Gesamtchlorophylle zu Gesamtcarotinoide (Abb. 34 a) und Violaxanthin/Neoxanthin zu Lutein (Abb. 34 b) von transgenen und nicht-transgenen T0-Pflanzen graphisch dargestellt.

Abb. 34: Pigmentverhältnisse in T0-Pflanzen. a: Verhältnis von Gesamtchlorophylle zu Gesamtcarotinoide. b: Verhältnis von Violaxanthin und Neoxanthin zu Lutein.

4

4,5

5

5,5

6

6,5

Pig

men

tver

hältn

is [m

ol/m

ol]

81.5

.784

.516

3.5.

522

2.4.

2.2

233.

125

3.1

253.

225

3.3

253.

425

3.5

266.

1.4

267.

826

7.11

329.

1.1.

233

3.8.

234

8.5.

234

8.9

349.

3

K1

K2

K3

K4

K5

a

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

Pig

men

tver

häl

tnis

[m

ol/m

ol]

b

81.5

.784

.516

3.5.

522

2.4.

2.2

233.

125

3.1

253.

225

3.3

253.

425

3.5

266.

1.4

267.

826

7.11

329.

1.1.

233

3.8.

234

8.5.

234

8.9

349.

3

K1

K2

K3

K4

K5

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

82

Die Pflanze 253.5 (pGFPBAR/p5UT3) zeigte beim Verhältnis von Gesamtchlorophylle zu Gesamtcarotinoide einen statistisch signifikanten Unterschied zu den Kontrollpflanzen (Abb. 34 a). In der Southern blot-Analyse dieser Pflanze konnten alle Gene (bar, gfp, tom5) der zum Beschuss verwendeten Plasmidkombination nachgewiesen werden. Die Pflanze zeigte ferner bar- und gfp-Expression (vgl. Tab. 10). Das Violaxanthin/Neoxanthin zu Lutein-Verhältnis unterschied sich bei 253.5 nicht signifikant von dem der Kontrollpflanzen. In Abbildung 35 sind die Pigmentverhältnisse von Gesamtchlorophylle zu Gesamtcarotinoide (Abb. 35 a) und Violaxanthin/Neoxanthin zu Lutein (Abb. 35 b) von transgenen und nicht-transgenen T1-Pflanzen graphisch dargestellt.

Abb. 35: Pigmentverhältnisse in T1-Pflanzen. a: Verhältnis von Gesamtchlorophyllen zu Gesamtcarotinoiden. b: Verhältnis von Violaxanthin und Neoxanthin zu Lutein.

Das Gesamtchlorophylle/Gesamtcarotinoide-Verhältnis der T1-Pflanze 253.5/2 (pGFPBAR/p5UT3) ist gegenüber denen der Kontrollpflanzen signifikant erhöht (Abb. 35 a). Hinsichtlich des Violaxanthin/Neoxanthin zu Lutein-Verhältnisses (Abb. 35 b) unterscheiden sich die untersuchten transgenen T1-Pflanzen statistisch nicht signifikant von den T1-Kontrollen.

4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

7,5

Pig

men

tver

hältn

is [m

ol/m

ol]

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

1,1

Pig

men

tver

hältn

is [m

ol/m

ol]

K1

K2

K3

K4

K5

K6

253.

4/17

253.

5/2

266.

1.3/

126

6.1.

3/2

266.

1.3/

432

9.1.

1.1/

532

9.2/

1833

1.1/

1933

3.1/

833

3.1/

1033

3.1/

1933

3.8.

2/10

333.

8.2/

1333

6.2.

1/8

348.

1/1

348.

1/2

388.

5/7

388.

5/8

388.

5/18

a

K1

K2

K3

K4

K5

K6

253.

4/17

253.

5/2

266.

1.3/

126

6.1.

3/2

266.

1.3/

432

9.1.

1.1/

532

9.2/

1833

1.1/

1933

3.1/

833

3.1/

1033

3.1/

1933

3.8.

2/10

333.

8.2/

1333

6.2.

1/8

348.

1/1

348.

1/2

388.

5/7

388.

5/8

388.

5/18

b

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

83

3.3.11.2 HPLC-Analyse von Karyopsen In Abbildung 36 ist ein typisches Elutionsprofil eines Kornextraktes abgebildet.

Abb. 36: Typisches Elutionsprofil eines Kornextraktes.

Für die Erfassung der Fehlerbreite der Pigmentkonzentrationen wurden Karyopsen von vier nicht-transgenen Kontrollpflanzen aufgearbeitet und analysiert (Tab. 16). Tab. 16: Stationäre Konzentrationen ausgesuchter Metaboliten in Karyopsen nicht-transgener Kontrollpflanzen der T0 und T1. Metabolit T1-Generation ξ ± s

[µg/g] s1

[%] Violaxanthin + Neoxanthin 4,08 ± 0,01 0,3 Lutein 6,35 ± 1,03 16 Chlorophyll b 18,55 ± 4,69 25 Chlorophyll a 69,88 ± 21,93 31 α-Carotin 0 ± 0 -

β-Carotin 0 ± 0 -

ξ = Mittelwert aus den Messungen der Kontrollpflanzen; s = Standardabweichung; s1 = Standardabweichung in %.

Die relative Schwankungsbreite der Metaboliten bewegte sich zwischen 0,3 % (für Violaxanthin und Neoxanthin) und 31 % (für Chlorophyll a).

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

84

Die stationären Konzentrationen der untersuchten Substanzen von Karyopsen sind in Tabelle 17 zusammengefasst. Um genügend Material für die Analyse bereitstellen zu können und gleichzeitig den Bestand der transgenen Linie nicht zu gefährden, wurden ausschließlich Karyopsen von T1-Pflanzen verwendet. Ferner ist zu berücksichtigen, dass aufgrund der zu erwartenden Segregation der Fremdgene nicht jede Karyopse einer transgenen Pflanze auch transformiertes Endosperm beinhaltet. Es wurden daher, nach Entfernung der Embryonen, nur gfp-exprimierende Karyopsen zur HPLC-Messung verwendet. Die isolierten Embryonen wurden dem Embryo rescue zugeführt (vgl. 3.4.3 und 4.3.2). Die Beschränkung auf gfp-exprimierendes Gewebe konnte mit der Tatsache begründet werden, dass das Nutzgen, auch bei der angewanden Cotransformationstechnik, in der Regel gekoppelt mit den Markergenen vererbt worden war (vgl. Tab. 21 und 4.3.1). Ergänzend sei erwähnt, dass die Technik des Embryo rescue zum Zeitpunkt der Analyse von T0-Pflanzen noch nicht verfügbar war (vgl. 3.4.3). Tab. 17: Ergebnisse der HPLC-Analyse von Karyopsen der T1-Pflanzen sowie entsprechende Kontrollen. Die Reihenfolge der Metaboliten orientiert sich an deren Retentionszeiten im Elutionsprofil. Pflanzen-Nr. Violaxanthin

+ Neoxanthin [µg/g]

Lutein

[µg/g]

Chlorophyll b

[µg/g]

Chlorophyll a

[µg/g]

α-Carotin

[µg/g]

β-Carotin

[µg/g]

329.1.1.1 / 10 3,2 4,7 12,6 44,7 0,0 0,0329.1.1.1 / 11 3,6 5,0 13,8 48,1 0,0 0,0329.1.1.1 / 14 6,8 8,8 27,3 89,0 0,0 0,0

333.1 / 7 3,2 4,7 11,8 44,8 0,0 0,0333.1 / 10 4,3 6,1 15,2 53,2 0,0 0,0

333.8.2 / 10 3,7 5,5 14,5 55,9 0,0 0,0333.8.2 / 13 2,2 3,2 7,7 27,9 0,0 0,0333.8.2 / 17 3,9 4,9 14,4 56,1 0,0 0,0336.2.1 / 5 6,1 9,8 30,5 122,2 0,0 0,0336.2.1 / 7 6,2 10,1 30,1 123,8 0,0 4,6336.2.1 / 8 5,4 6,6 19,6 72,6 0,0 0,0

Kontrolle 1 4,3 5,5 15,8 56,6 0,0 0,0Kontrolle 2 5,1 7,7 25,2 102,6 0,0 0,0Kontrolle 3 3,5 6,6 18,4 62,0 0,0 0,0Kontrolle 4 3,4 5,6 14,8 58,3 0,0 0,0

Nur bei den Pflanzen mit der Versuchsbezeichnung 336.2.1 stand das übertragene Phytoensynthasegen unter Kontrolle des Gliadin-Promotors. In allen anderen aufgeführten Pflanzen stand das Nutzgen unter Kontrolle des Ubiquitin-Promotors. In der Pflanze 336.2.1/7 konnte β-Carotin nachgewiesen werden (Abb. 37). Es wurde hierbei eine Konzentration von 4,6 µg/g berechnet. Phytoen wurde in keiner der untersuchten Proben gefunden.

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

85

Abb. 37: Elutionsprofile des Kornextraktes der Pflanze 336.2.1 / 7. Der Pfeil deutet auf das Signal hin, dessen Retentionszeit der des β-Carotin entspricht.

Die Konzentrationen einzelner Pigmente schwankten in Karyopsen von Pflanze zu Pflanze stark (vgl. Tab. 16 und 17). Die Ermittlung von Pigmentverhältnissen bei den Kontrollen zeigte, dass auch hier die Schwankungen mit 14 % (Gesamtchlorophylle/Gesamtcarotinoide) und 15 % (Violaxanthin/Lutein) noch relativ groß waren (Tab. 18). Möglicherweise lagen die ermittelten Konzentrationen am Rande der Empfindlichkeitsgrenze der HPLC-Anlage. Tab. 18: Pigmentverhältnisse in Karyopsen nicht-transgener Kontrollpflanzen der T0 und T1. Verhältnis T1-Generation ξ ± s

[mol/mol] s1

[%] Gesamtchlorophylle/Gesamt-carotinoide

5,48 ± 0,74 14

Violaxanthin/Lutein 0,65 ± 0,10 15

ξ = Mittelwert aus den Messungen der Kontrollpflanzen; s = Standardabweichung; s1 = Standardabweichung in %.

Die mit nicht-transgenen Kontrollpflanzen errechneten relativen Fehler wurden auf die ermittelten Pigmentverhältnisse der transgenen Pflanzen übertragen (Abb. 38).

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

86

Abb. 38: Pigmentverhältnisse in Karyopsen von T1-Pflanzen. a: Verhältnis von Gesamtchlorophyllen zu Gesamtcarotinoiden. b: Verhältnis von Violaxanthin und Neoxanthin zu Lutein.

Die Betrachtung der Pigmentverhältnisse in den Karyopsen zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen Kontrollen und transgenen Pflanzen. Dies traf auch auf die Pflanze 336.2.1/7 zu, bei der als einzige β-Carotin in den Karyopsen gefunden worden war (vgl. Tab. 17). 3.4 ANALYSE DER NACHKOMMEN TRANSGENER REGENERATPFLANZEN Aufgrund der großen Anzahl (71 transgene T0-Pflanzen) konnte nicht von allen transgenen T0-Pflanzen die Nachkommenschaft untersucht werden. Die Auswahl erfolgte dahingehend, dass nur Samen von Pflanzen ausgelegt worden waren, bei deren Mutterpflanze entweder das Nutzgen nachgewiesen worden war oder die durch ihren interessanten Phänotyp aufgefallen waren. Von 29 transgenen T0-Pflanzen wurden insgesamt 470 Nachkommen erhalten. Hierzu wurden pro Elternpflanze maximal 20 Karyopsen ausgelegt, die gekeimten Pflanzen kultiviert und analysiert. Tabelle 19 zeigt eine Übersicht über die Plasmidkombination die im entsprechenden Cotransformationsexperiment, aus der die jeweilige transgene Mutterpflanze hervorging, eingesetzt worden war. Die Anzahl erhaltener Ähren und Karyopsen, Anzahl der ausgelegten Karyopsen und die Keimraten sind dort ebenfalls angegeben. Die Anzahl an Karyopsen pro Ähre, die einen Hinweis auf die Fertilität zulässt, schwankte zwischen einzelnen transgenen Regeneratpflanzen beträchtlich (siehe Tab. 19). Da dies auch bei nicht-transgenen Regeneratpflanzen der Fall war (Daten nicht dargestellt), wurde ein Zusammenhang mit den übertragenen Genen ausgeschlossen. Die Keimungsrate (67 % bis 100 %) von Karyopsen transgener Pflanzen war ebenfalls nicht von der nicht-transgener Pflanzen zu unterscheiden.

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

Pig

men

tver

hältn

is [m

ol/m

ol]

K1

K2

K3

K4

329.

1.1.

1/10

329.

1.1.

1/11

329.

1.1.

1/14

333.

1/7

333.

1/10

336.

2.1/

8

336.

2.1/

7

336.

2.1/

6

336.

2.1/

5

333.

8.2/

17

333.

8.2/

13

b

2

3

4

5

6

7

8P

igm

entv

erhä

ltnis

[mol

/mol

]

K1

K2

K3

K4

329.

1.1.

1/10

329.

1.1.

1/11

329.

1.1.

1/14

333.

1/7

333.

1/10

336.

2.1/

8

336.

2.1/

7

336.

2.1/

6

336.

2.1/

5

333.

8.2/

17

333.

8.2/

13

a

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

87

Tab. 19: Übersicht über die zur Analyse der T1-Generation verwendeten Regeneratpflanzen. Anzahl erhaltener Ähren und Karyopsen aus der T0-Generation sowie Anzahl ausgelegter und gekeimter Karyopsen. Nr. Pflanze /

Plasmidkombination Anzahl Karyopsen

(Anzahl Ähren) Anzahl ausgelegter

Karyopsen Anzahl

gekeimter Pflanzen

Keimrate in Prozent [%]

1 K 81.5.7 pGT / pAHC25

29 (3)

20 20 100

2 K 163.3.2 pGT / pAHC25

3 (1)

3 2 67

3

E 336.2.1 pGT / pGFPBAR

48 (3) 20 15 75

4 K 166.1

p5GT3 / pAHC25 33 (2)

20 20 100

5 K 166.4 p5GT3 / pAHC25

51 (2)

20 20 100

6 E 269.8 p5GT3 / pGFPBAR

54 (2) 20 18 90

7

E 388.5 p5GT3 / pGFPBAR

94 (6) 20 19 95

8 E 222.4.1

pUT / pGFPBAR 90 (5)

20 20 100

9 E 222.4.2.1 pUT / pGFPBAR

83 (6)

22 22 100

10 E 222.4.2.2 pUT / pGFPBAR

49 (6)

20 17 85

11 E 266.1.2 pUT / pGFPBAR

1 (6)

1 1 100


6 (5)

6 4 67

13 E 267.5 pUT / pGFPBAR

29 (4) 20 16 80


17 (5) 17 10 59

15

E 347.9.4.1 pUT / pGFPBAR

21 (4) 20 18 90

16

E 348.1 pUT / pGFPBAR

4 (4) 4 3 75

17


37 (3) 20 20 100

18

E 348.8.1 pUT / pGFPBAR

48 (4) 20 18 90

19 E 253.1

p5UT3 / pGFPBAR 115 (7) 20 18 90

20 E 253.2 p5UT3 / pGFPBAR

78 (3) 20 20 100


47 (8) 20 18 90


68 (4)

20 20 100


38 (5)

20 18 90

24 E 329.1.1.1 p5UT3 / pGFPBAR

59 (3) 20 20 100

25

E 329.2 p5UT3 / pGFPBAR

76 (3) 20 17 85

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

88

26


70 (3) 20 19 95

27

E 333.8.2 p5UT3 / pGFPBAR

98 (4) 20 20 100

28

E 185.2.2 pGFPBAR

88 (7) 20 19 95

29

E 180.6 pGFPBAR

86 (9) 20 18 90

Σ 553 Σ 470 ∅ 90 3.4.1 Nachweis der Phosphinothricin-N-acetyltransferase-Aktivität (PAT-Test)

in der T1-Generation T1-Pflanzen der in Tabelle 19 aufgelisteten transgenen Regeneratpflanzen wurden untersucht. Bei 23 dieser Pflanzen war in der T0-Generation PAT-Aktivität nachgewiesen worden. In 15 dieser Linien wurden auch in der T1-Generation PAT-positive Pflanzen gefunden. Der einzige Nachkomme der Pflanze 266.1.2 konnte aufgrund seines geringen Wuchses nicht untersucht werden. In Abbildung 39 ist beispielhaft der PAT-Test von 20 Nachkommen der Pflanze 253.1 gezeigt. Die Ergebnisse des PAT-Aktivitätstests der in Tabelle 19 aufgeführten und untersuchten Pflanzen sind in Tabelle 16 zusammengefasst.

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20PS2 K-

Abb. 39: Autoradiogramm der Dünnschichtchromatographie von 20 Nachkommen einer T0-Regeneratpflanze. Hier sind exemplarisch Nachkommen der T0-Pflanze 253.1 (p5UT3/pGFPBAR) dargestellt. Die Nachkommen wurden ohne Selektionsdruck im Gewächshaus aufgezogen. PS2, transgener Tabak als Positivkontrolle. K-, untransformierte Regeneratpflanze als Negativkontrolle. Bahnen 1 bis 20, Nachkommen der T0-Pflanze 253.1. Die Nachkommen in den Bahnen 3 bis 6, 8 bis 10, 12 und 17 bis 20 zeigen jeweils ein deutliches Signal, das 14C-Acetyl-PPT (Pfeil) entspricht. Die Signale in den Bahnen 7 und 16 sind nur schwach.

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

89

3.4.2 Expression des gfp-Gens in der T1 und der T2 Beobachtungen an T1-Pflanzen Ebenso wie auf die Aktivität des bar-Gens wurden alle erhaltenen T1-Pflanzen auf die Expression des gfp-Gens hin untersucht. In Abbildung 40 sind einige der gemachten Beobachtungen dokumentiert. Analysierte man im Gewächshaus ausgelegte Nachkommenpflanzen, konnte man feststellen, dass häufig im Wurzelbereich eine deutliche GFP-Fluoreszenz zu erkennen war, diese in den oberirdischen Pflanzenteilen durch die Chlorophyllfluoreszenz jedoch nur schwer zu sehen war (Abb. 40 b). Nur bei wenigen Pflanzen wurde das gfp-Gen so stark exprimiert, dass die Fluoreszenz auch im chlorophyllhaltigen Gewebe deutlich war. Abb. 40 a zeigt einen Querschnitt durch den Internodienbereich einer solchen Pflanze. Am deutlichsten konnte die Expression in unreifen Karyopsen verfolgt werden (Abb. 40 c).

Abb. 40: GFP-Fluoreszenz der T1-Nachkommen. a: Querschnitt durch den Stengel einer Nachkommenpflanze. Der Schnitt verlief durch den Internodienbereich des Stengels und eines umhüllenden Blattes. Der rötliche Bereich in der Mitte entspricht der entstehenden Markhöhle. Vor allem im Bereich des Markparenchyms und der Leitbündel ist die GFP-Fluoreszenz deutlich sichtbar. b: Übergang vom Wurzelbereich zum Stengel. Während an den Wurzeln die GFP-Fluoreszenz gut zu beobachten war, wurde diese zum Spross hin zunehmend schwächer. Grund hierfür ist die störende Rotfluoreszenz des Chlorophylls in den oberirdischen Pflanzenteilen. c: Karyopse im Ährchen einer transgenen T1-Pflanze. Nur eine Blüte setzte ein Korn an. Diese Karyopse fluoreszierte deutlich grün (GFP), wohingegen bei den Spelzen die Rotfluoreszenz des Chlorophylls dominierte. Auch sind grünlich fluoreszierende Pollen zu sehen. Beobachtungen an Kontrollpflanzen zeigten, dass deren Fluoreszenz nicht mit GFP in Zusammenhang zu bringen war, von einer endogenen Eigenfluoreszenz herrührte.

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

90

Beobachtungen an T2-Pflanzen Neben den gemachten Beobachtungen an der T1-Generation soll in diesem Abschnitt auch auf einige Untersuchungen eingegangen werden, die mit der T2-Generation durchgeführt worden waren. Für diese Versuche wurden fluoreszierende Karyopsen verwendet. Die beobachtete Fluoreszenz der Karyopse war die der Samenhülle (Abb. 41 a). Ob nun auch das triploide Endosperm und der Embryo gfp-bedingt fluoreszierten, war an der unversehrten Karyopse von außen nicht zu erkennen. Um zu überprüfen, ob die GFP-Fluoreszenz (und damit auch das gfp-Gen) von der T1 in die T2-Generation weitervererbt worden war, wurde der Embryo aus der Karyopse isoliert. Auf diese Weise konnten Frucht-/Samenschale (T1-Generation), Endosperm (T2-Generation) und Embryo (T2-Generation) auf Fluoreszenz hin analysiert werden (Abb. 41). In Tabelle 20 sind beispielhaft fünf dieser Versuche dargelegt. Ausgewählt wurden diese Pflanzen, weil sie eine besonders deutliche gfp-Expression gezeigt hatten. Für einen hemizygot monohybriden Erbgang wird bei einer Selbstung ein Spaltungsverhältnis von 3:1 in den T1-Pflanzen und 5:3 in den T2-Pflanzen erwartet. Zur Überprüfung wurde der Chi-Quadrat-Test durchgeführt. In keinem der untersuchten Fällen ließ sich ein signifikanter Unterschied zum erwarteten Spaltungsverhältnis von 5:3 nachweisen. Tab. 20: gfp-Expression bei T1 / T2-Nachkommenpflanzen. Die Anzahl der Freiheitsgrade betrug (nach der Formel f = k-1) 1. Die Aussage beruhte auf dem 5 %-Signifikanzniveau (p ≤ 0,05).

gfp-Expression (Anzahl) ermittelter Chi-

Quadrat-Wert

Unterschied zwischen beobachtetem und

erwarteten Spaltungsverhältnis

Pflanze Anzahl untersuchter Karyopsen

Samenschale Endosperm Embryo

333.1 / 16 26 26 21 21 2,96 nicht signifikant 333.1 / 10 13 13 7 7 0,13 nicht signifikant 333.1 / 8 17 17 9 9 0,32 nicht signifikant 329.1.1.1 / 12 21 21 9 0 2,67 nicht signifikant 333.8.2 / 16 4 4 1 1 1,07 nicht signifikant Die angesprochene Analyse wurde von der T0 (Regeneratpflanzen) in die T1-Generation nicht durchgeführt, da zu diesem Zeitpunkt das erforderliche Embryo rescue (siehe unten) unter sterilen Bedingungen noch nicht etabliert war (siehe auch 3.3.3). 3.1.1 Embryo rescue Die obengenannten freipräparierten Embryonen konnten auf geeignetem Medium (siehe 2.7.2) kultiviert werden, so dass sie später ins Gewächshaus überführt und zu fertilen Pflanze herangezogen werden konnten. In Abbildung 41 b-d sind die Entwicklungsstadien 3 d, 5 d

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

91

und 6 d nach der Isolation zu sehen. Beispielhaft sind auch drei Hälften quergeschnittener Karyopsen mit den jeweiligen Embryonen abgebildet, die die Beobachtungen der GFP-Fluoreszenz in diesen Geweben dokumentieren (Abb. 41 e-f).

Abb. 41: Embryo rescue (b bis d) und Analyse des Vererbungsmodus (a, e bis g) an der T2-Generation. a: Alle T2-Karyopsen einer transgenen T1-Pflanze zeigten GFP-Fluoreszenz. Die GFP-Fluoreszenz der Samenhülle überdeckte eine eventuelle Fluoreszenz des Endosperms und des Embryos, so dass es nicht möglich war, durch alleinige Betrachtung der unversehrten Karyopsen eine Aussage über die Vererbung des gfp-Gens auf die Nachkommen zu treffen. Nach Isolierung des Embryos wurde dieser eine Woche lang im Dunkeln kultiviert. Während dieser Zeit konnte die GFP-Fluoreszenz im noch chlorophyllfreien Gewebe gut beobachtet werden: b: Embryo 3 d nach der Isolierung. c: 5 d nach der Isolierung: Beginnende Keimung. d: 6 d nach Isolierung: Wachstum der Primärwurzeln und des Sprosses waren deutlich fortgeschritten. e bis g: Querschnitt durch T2-Karyopsen. Gelber Pfeil, Endosperm. Roter Pfeil, Samenhülle. Blauer Pfeil, Embryo (mit Scutellum), der aus der darüber abgebildeten Karyopse freipräpariert worden war. Die Intensität der GFP-Fluoreszenz der Samenhülle schwankte zwischen den einzelnen Karyopsen nur schwach, die des Endosperms und des Embryos hingegen stark. e: Endosperm und Embryo zeigten eine schwache GFP-Fluoreszenz. f: Starke GFP-Fluoreszenz des Endosperms und des Embryos. g: Weder Endosperm noch Embryo zeigten eine gfp-Expression.

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

92

Das Embryo rescue ermöglichte nicht nur die Kultur, der zur HPLC- (vgl. 3.3.11.2) und GFP-Analyse freipräparierten Embryonen und damit die Erhaltung dieser transgenen Linien, sondern verkürzte auch die Generationsdauer (hier von der Anthese der T1 bis zur Anthese der T2) von 17 auf 8 Wochen. Ein Verkürzung ist besonders bei Untersuchungen transgener Linien über mehrere Generationen hinweg willkommen. 3.4.4 HPLC-Analyse der T1 Die HPLC-Analyseergebnisse der T1-Generation wurden der Übersichtlichkeit wegen vorgezogen und bereits im Abschnitt 3.3.11 dargelegt. 3.4.5 Southern blot-Analysen in der T1 Da in der T0-Generation die Integration der übertragenen Gene ins Weizengenom schon bewiesen werden konnte und exemplarisch dargestellt wurde (3.3.8), konzentrierten sich die Southern blot-Analysen der T1-Pflanzen im Wesentlichen auf die Nachweise der internen Fragmente. Da in diesem Rahmen nicht alle durchgeführten Southern blot-Analysen in Form von Autoradiogrammen dargestellt werden können, wurden für jedes Gen ein bis zwei exemplarisch ausgewählt und abgebildet. In Tabelle 21 werden dann die Ergebnisse der molekularen Analysen der T1-Generation zusammengefasst. Für den Nachweis des gfp-Gens wurde anders als in Abb. 22 nicht nur die proteincodierende Region erfasst, sondern durch die gewählte HindIII/SmaI-Spaltung auch die Anwesenheit des 35S-Promotors (2,67 kb großes Signal) indirekt nachgewiesen (Abb. 42). Auch beim bar-Gen wurde die Anwesenheit des intakten chimären Gens (2,93 kb) nachgewiesen (Abb. 43). Die Anwesenheit des tom5-Gens konnte nach BamHI/EcoRI-Spaltung und Hybridisierung durch das erwartete Auftreten des 1,75 kb-Signals dokumentiert werden (Abb. 44). Die Übertragung des 3’zMAR wurde indirekt durch Spaltung mit BamHI und Identifikation eines 4,24 kb-Signals erfasst (Abb. 44). Das Vorhandensein des tom5-Gens in der genomischen DNA von Nachkommenpflanzen wurde durch HindIII-Spaltung und Hybridisierung gegen die tom5-Sonde bewiesen (Abb. 45). Hierbei konnte anhanden der beobachteten Hybridsignale auch die Anzahl übertragener Genkopien abgeschätzt werden (4.3.1).

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

93

a) gfp-Gen Die Pflanzen der T1-Generation wurden durch Spaltung mit den Enzymen HindIII/SmaI auf die Anwesenheit des intakten chimären gfp-Gens hin untersucht. Exemplarisch ist in Abbildung 42 das Autoradiogramm von 16 Nachkommen der Regeneratpflanze 333.1 abgebildet.

Abb. 42: Southern blot-Analyse von 16 Nachkommen der transgenen T0-Pflanze 333.1 auf das gfp-Gen. a: Plasmidkartenausschnitt von pGFPBAR. Eingezeichnet sind nur die für die Analyse verwendeten Restriktionsenzyme. Im Kasten oben links sind die zu erwartenden Fragmentgrößen bei entsprechender Spaltung des Plasmids gezeigt. Das zur gfp-Sonde komplementäre Fragment ist unterstrichen. b: Autoradiogramm. Die Hybridisierung erfolgte erwartungsgemäß mit dem 2,67 kb großen komplementären Fragment. pGFPBAR, Positivkontrolle; -, Negativkontrolle; 1 bis 16 Nachkommenpflanzen. Außer in den Bahnen 1, 3, 8 und 12 sind überall die erwarteten Signale zu sehen.

pGFP

BA

R (8

806

bp) HindIII/SmaI: 2,67 kb; 3,05 kb; 3,09 kb


S65T

GFP

ST-L

S1 In

tron

HSP

70 In

tron


gfp:

1

syn

GFP

: 1

gfp

SmaI 6421 bpHindIII 3748 bp

Sout

hern

blo

t-Ana

lyse

a

b

pGFP

BA

R

2,67 kb

- 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 143 15 16

2,67 kbHindIII 697 bp

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

94

b) bar-Gen

Abb. 43: Southern blot-Analyse von 16 T1-Pflanzen der transgenen T0-Pflanze 333.1 hinsichtlich des bar-Gens. Diese Pflanze wurde exemplarisch ausgewählt. a: Ausschnitt aus der Plasmidkarte von pGFPBAR. Eingezeichnet sind nur die für die Analyse verwendeten Restriktionsenzyme. Die zu erwartenden Fragmentgrößen bei entsprechender Spaltung des Plasmids sind im Kasten oben links dargestellt. b: Autoradiogramm. Die Hybridisierung der bar-Sonde erfolgte erwartungsgemäß mit dem 2,93 kb großen komplementären Fragment (unterstrichen). pGFPBAR, Positivkontrolle; -, Negativkontrolle; in den Bahnen 1 bis 16 sind die Proben der Nachkommenpflanzen dargestellt. Die beobachteten Signale weisen darauf hin, dass alle getesteten Nachkommen der Pflanze 333.1 das intakte chimäre bar-Gen enthielten.

pGFP

BA

R (8

806


2,93 kb; 3,35 kb


S65T

GFP

ST-L

S1 In

tron

HSP

70 In

tron


gfp:

1

syn

GFP

: 1

bar

EcoRI 3631 bpHindIII 697 bp

Sout

hern

blo

t-Ana

lyse

a

b

pGFP

BA

R

2,93 kb

-

2,93 kb

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

95

c) tom5-Gen

Abb. 44: Southern blot-Analyse von Nachkommen transgener T0-Pflanzen auf das tom5-Gen. Exemplarisch sind hier Nachkommen von Pflanzen dargestellt bei denen in der T0 ein chimäres tom5-Gen ohne MARs (222.4.2) beziehungsweise ein chimäres tom5-Gen mit MARs (329.1.1.1) nachgewiesen worden waren. a: Ausschnitte aus

Sout

hern

blo

t-Ana

lyse

a

b

1 2 3 4 5 6 7 8pUT

- 9 1011121314

p5U

T3

1040

5 bp


Ubiquitin-Pro. Exon Intron5‘zMAR tom5 nosT 3‘zMAR

BamHI 9718BamHI 5482

BamHI: 0,04 kb; 0,27 kb; 2,73 kb; 3,13 kb; 4,24 kb

Vierzehn Nachkommen der Pflanze 329.1.1.1 (p5UT3/pGFPBAR)

pUT

691

7 bp

BamHI/EcoRI 1,75 kb; 5,17 kb

1,75

kb

4,24

kb

tom5

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

96

den Plasmidkarten von pUT und p5UT3. Eingezeichnet sind nur die für die Analyse verwendeten Restriktionsenzyme. Im Kasten oben links sind jeweils die zu erwartenden Fragmentgrößen bei entsprechender Spaltung des Plasmids dargestellt. b: Autoradiogramm. Die Hybridisierung der tom5-Sonde erfolgte bei 222.4.2 nach Spaltung mit BamHI/EcoRI erwartungsgemäß mit der 1,75 kb großen proteincodierenden Region des tom5-Gens. Die Nachkommen der Pflanze 329.1.1.1 wurden mit BamHI gespalten. Das erwartete 4,2 kb große Signal umfaßt neben der proteincodierenden Region des tom5-Gens, die mit der tom5-Sonde hybridisierte auch die Sequenz des 3zMARs. pUT und p5UT3, Positivkontrollen; -, Negativkontrolle; linkes Autoradiogramm: Zwölf Nachkommen der Regeneratpflanze 222.4.2. Rechtes Autoradiogramm: 14 Nachkommen der Regeneratpflanze 329.1.1.1.

Abb. 45: Southern blot-Analyse von Nachkommen der transgenen T0-Pflanze 336.2.1.1 (pGT/pGFPBAR) auf die Integration des tom5-Gens. a: Plasmidkartenausschnitt von pGT. b: Autoradiogramm: pGT, Positivkontrolle; - , Negativkontrolle. In den darauffolgenden 16 Bahnen wurde DNA von Nachkommen der Pflanze 336.2.1.1 aufgetragen. In den Bahnen 2, 3, 5, 6, 8, 10, und 14 sind Hybridisierungssignale zu erkennen. Bei den deutlicher zu sehenden Signalen in der Bahn 10 sind mindestens vier Signale (Genkopien) zu erkennen. Dieses Muster

Sout

hern

blo

t-Ana

lyse

a

b

1 2 3 4 5 6 7 8pGT

- 9 10 11 12

pUT

691

7 bp

5,53 kb

13 14 15 16

HindIII 928 bp


HindIII: 5,53 kb

tom5

Sout

hern

blo

t-Ana

lyse

a

b

1 2 3 4 5 6 7 8pGT

- 9 10 11 12

pUT

691

7 bp

5,53 kb

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

97

Signale, die unterhalb der 5,53 kb Markierung liegen, könnten darauf hindeuten, dass es sich um Bruchstück einer Genkopie handelt. b: Autoradiogramm. pGT, Positivkontrollen; -, Negativkontrolle; linkes Autoradiogramm: 12 Nachkommen der Regeneratpflanze 222.4.2. Rechtes Autoradiogramm: 14 Nachkommen der Regeneratpflanze 329.1.1.1. 3.5 ÜBERSICHT ÜBER DIE ERGEBNISSE DER T1-GENERATION Die Anzahl der untersuchten Nachkommen von transgenen Regeneratpflanzen sowie die durchgeführten Analysen sind in der Tabelle 16 dargestellt. Die Ergebnisse der HPLC-Analysen wurden bereits in 3.3.11 besprochen und sind an dieser Stelle nicht erneut dargestellt. War ein enzymatischer (GUS, PAT) beziehungsweise fluoreszenzoptischer (GFP) oder molekularer (Southern blot-Analyse) Test schon bei der Mutterpflanze negativ ausgefallen, so ist dies mit „1“ vermerkt. Solche Pflanzen wurden mitgeführt, weil sie in der T0-Generation durch einen interessanten Phänotyp aufgefallen waren. Teilweise waren Analyseergebnisse trotz Wiederholung der entsprechenden Versuche nicht eindeutig. Bei der angegebenen Anzahl handelt es sich dann um die Mindestanzahl der als eindeutig positiv zu wertenden Pflanzen. Dies ist in der Tabelle mit „2“ markiert. Die beobachteten Spaltungsverhältnisse der einzelnen Gene in der T1-Generation wurden auf Basis des Chi-Quadrat-Tests mit dem zu erwartenden Spaltungsverhältnis von 3:1 verglichen. War das beobachtete Spaltungsverhältnis bei einer 5 % Irrtumswahrscheinlichkeit nicht signifikant unterschiedlich zu 3:1, so wird dies in der Tabelle 21 mit „3“ angegeben. Tab. 21: Zusammenfassung der Ergebnisse der enzymatischen / fluoreszenzoptischen und molekularen Analysen der T1-Generation. Angegeben ist jeweils die Anzahl der als positiv getesteten Pflanzen.

Southern blot-Analyse Nr. Pflanze /

Plasmidkombination Anzahl

gekeimter Pflanzen

PAT

GFP / GUS

bar gfp / uidA tom5 / psy

1 K 81.5.7 pGT / pAHC25

20 01 01 143 143 143

2 K 163.3.2 pGT / pAHC25

2 0 0 0 0 0

3

E 336.2.1 pGT / pGFPBAR

15 8 12 123 123 123

5 K 166.4

p5GT3 / pAHC25 20 3 3 2 3 32

6 E 269.8 p5GT3 / pGFPBAR

18 01 01 02 5 02

7

E 388.5 p5GT3 / pGFPBAR

19 11 11 113 113 93

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

98

9 E 222.4.2.1 pUT / pGFPBAR

22 01 01 0 0 01

10 E 222.4.2.2 pUT / pGFPBAR

17 0 0 21 21 5


1 - - - - -


4 3 3 33 33 1

13 E 267.5 pUT / pGFPBAR

16 0 0 16 16 01


10 92 1 4 73 4

15

E 347.9.4.1 pUT / pGFPBAR

18 01 01 123 0 123

16


3 1 1 13 13 13

17


20 0 0 - - 62

18

E 348.8.1 pUT / pGFPBAR

18 0 01 - - 3

19 E 253.1

p5UT3 / pGFPBAR 18 122 14 143 143 7


20 9 9 9 9 01


18 12 12 123 123 62


20 14 12 143 143 32


18 10 10 92 82 103

24 E 329.1.1.1 p5UT3 / pGFPBAR

20 8 8 8 7 8

25


17 01 01 - - 133

26


19 11 11 19 19 01

27

E 333.8.2 p5UT3 / pGFPBAR

20 9 12 - 123 113

28

E 185.2.2 pGFPBAR

19 10 10 10 10 -

29

E 180.6 pGFPBAR

18 0 2 02 22 -

1 Gen / Genaktivität konnte auch in der T0-Pflanze nicht nachgewiesen werden. 2 Analyseergebnis war nicht eindeutig. - Analyse nicht durchgeführt. 3 Statistische Auswertung mittels χ2-Test ergab, dass das Spaltungsverhältnis nicht signifikant verschieden zur erwarteten 3:1-Spaltung war (p ≤ 0,05). Bei vier der 29 untersuchten Linien konnte im Unterschied zu deren Mutterpflanzen weder PAT- noch GUS-Aktivität beziehungsweise GFP-Fluoreszenz nachgewiesen werden (siehe Tab. 21). In den Nachkommenschaften 24 transgener T0-Pflanzen konnten wiederum transgene Pflanzen gefasst werden, wovon in 16 dieser Linien Fremdgenaktivität (bar, uidA bzw. gfp) festgestellt wurde. Die einzige Nachkommenpflanze von 266.1.2 war für Untersuchungen zu klein. Die molekulargenetische Analyse der T1-Generation transgener

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

99

Regeneratpflanzen (T0) zeigte, dass in zwei Fällen (163.3.2 und 222.4.2.1) kein Fremdgen mehr nachzuweisen war. Bei dreizehn Nachkommenschaften unterschied sich das Spaltungsverhältnis, zumindest eines der untersuchten Gene, statistisch nicht signifikant vom erwarteten 3:1 Verhältnis. Im Falle der Nachkommen der Pflanze 347.9.4.1 konnte das gfp-Gen mit der Southern blot-Analyse nicht gefasst werden. Das auf dem selben Plasmid (pGFPBAR) gelegene bar-Gen hingegen konnte in zwölf der achtzehn T1-Pflanzen nachgewiesen werden. 3.6 NACHWEIS DES EINFLUSSES DER MARs AUF DIE EXPRESSIONS-

STÄRKE DES FLANKIERTEN UIDA-GENS Um den Einfluss der in dieser Arbeit verwendeten MARs (matrix attachment regions) aus dem Mais adh1-Gen (Avramova et al., 1998) auf ein von ihnen flankiertes Gen untersuchen zu können, wurden diese zunächst in Tabakpflanzen übertragen (Pisch, 2000), wobei das uidA-Gen als Reporter diente. Fluorometrische GUS-Tests zeigten, dass die Expressionsstärke des chimären uidA-Gens mit MARs in den transgenen Tabakpflanzen um den Faktor 10,4 höher lag, als in Tabakpflanzen, die mit einem entsprechenden uidA-Gen ohne MARs transformiert worden waren. In der vorliegenden Arbeit sollte nun geklärt werden, ob ein solcher Effekt auch in transgenen Weizenpflanzen zu fassen ist. Mittels der Partikelbeschusstechnik wurden Weizenembryonen mit den Plasmiden p5‘uidA3‘/pGFPBAR beziehungsweise puidA/pGFPBAR cotransformiert und die Regeneratpflanzen fluorometrisch hinsichtlich ihrer uidA-Expression untersucht (fluorometrischer GUS-Test). Aus dem Ansatz mit p5‘uidA3‘/pGFPBAR gingen insgesamt acht transgene Pflanzen hervor, wovon sieben GUS-Aktivität aufwiesen und für die weiteren Untersuchungen eingesetzt werden konnten. Die Transformationsrate dieses Experimentes lag bei 2,73%. Aus dem Ansatz puidA/pGFPBAR ging eine transgene Pflanze hervor, wobei diese keine GUS-Aktivität zeigte und somit nicht weiter verwendet wurde. Die Transformationsrate lag hier bei 0,41 %. Fasst man beide Ansätze zusammen, so wurde eine Transformationsrate von 1,7 % erreicht. Der Umfang des Experiments betrug 539 Embryonen und zusätzlich 100 Embryonen, die das Experiment als Kontrollen begleiteten. Da für eine statistische Auswertung zu wenig uidA-exprimierende Pflanzen ohne Matrix-Anheftungsstellen vorhanden waren, wurde zusätzlich auf uidA-aktive Weizenlinien (T4-Nachkommen der Pflanze 77) zurückgegriffen, die aus der Promotionsarbeit von Fettig (1999) stammten. Abbildung 47 zeigt einen histochemischen GUS-Test an einer Weizen-Negativkontrolle und zwei Transgenen.

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

100

Für die Bewertung der Testgenauigkeit wurden neben der Verwendung von transgenen Tabakpflanzen (Positivkontrollen) und nicht-transformierten Regeneratpflanzen (Negativkontrollen) folgenden Versuche durchgeführt:

a) Genauigkeit der auf dem Bradfordtest basierenden Proteinkonzentrationsbestimmung: Ein Proteinrohextrakt wurde in mehrere Proben geteilt und die Proteinkonzentration der Proben unabhängig voneinander bestimmt. Der Mittelwert betrug 16,04. Die Berechnung der Standardabweichung ergab ± 0,28 bzw. ± 1,7 % (siehe Tabelle 22 a).

b) Reproduzierbarkeit des GUS-Aktivitätstests: Aus einem Proteinextrakt einer GUS-positiven Pflanze (77B/8-15.2) wurde nach Proteinkonzentrationsbestimmung 3mal die gleiche Menge an Protein entnommen und entsprechend weiterbehandelt. Der größte Fehler lag dabei bei ± 1,96 %. In Tabelle 22 b sind diese Ergebnisse dargestellt.

c) Schwankungen zwischen unabhängigen GUS-Tests des gleichen Ausgangsmaterials: Ein einziges Blatt einer Pflanze (77B/8-11.1) wurde in vier etwa gleich große Stücke geteilt, aufgearbeitet, jeweils die Proteinkonzentration bestimmt und der fluorometrische GUS-Test durchgeführt. Die Schwankungsbreite der ermittelten Werte bewegte sich dabei zwischen ± 1,46 und ± 12,65 % (siehe Tabelle 22 c). Der Durchschnitt lag bei ± 6,2 %.

In Tabelle 22 und Abb. 46 sind die Ergebnisse dieser Untersuchungen zusammengestellt. Tab. 22: Übersicht über die Versuche zur Bewertung der Genauigkeit des fluorometrischen GUS-Tests Pflanzen-Nr. Proteinkonzentration

[µg / µl] spezifische GUS-Aktivität [pMol MU min-1 mg-1] mit

Standardabweichung ad a) Protein-Probe 1 16,27 n.b. Protein-Probe 2 15,94 n.b. Protein-Probe 3 15,63 n.b. Protein-Probe 4 15,98 n.b. Protein-Probe 5 16,34 n.b.

77B/8-15.2, Probe 1 - 6361 ± 34 77B/8-15.2, Probe 2 - 5095 ± 100

ad b)

77B/8-15.2, Probe 3 - 5961 ± 100 77B/8-11.1, Probe 1 - 4876 ± 617 77B/8-11.1, Probe 2 - 4845 ± 250 77B/8-11.1, Probe 3 - 3413 ± 50

ad c)

77B/8-11.1, Probe 4 - 2648 ± 149

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

101

Abb. 46: Fluorometrischer GUS-Test. Neben GUS-positivem Tabak und GUS-negativen Weizenregeneratpflanzen wurden zur Überprüfung der Testqualität zwei weitere Experimente durchgeführt (siehe Text). Aufgrund dieser Ergebnisse konnte der fluorometrischen GUS-Test, für die Beurteilung des MARs-Einflusses auf die Expressionsstärke des uidA-Gens, als ausreichend genau betrachtet werden. Blätter der fluorometrisch getesteten Pflanzen wurden auch einem histochemischen GUS-Test unterzogen. Exemplarisch ist das Ergebnis einer solchen Anfärbung in Abbildung 47 a dargestellt. Die Expression des unter Kontrolle des Ubiquitin-Promotors stehenden uidA-Gens wurde auch im Weizenendosperm transgener Pflanzen untersucht. Angefärbt wurde auch eine transgene Karyopse, bei der ein Gliadin-Promotor das nachfolgende uidA-Gen gesteuert hat (Hahn, unveröffentlichte Daten). Beide Promotoren waren in der Lage das uidA-Gen zur Expression zu bringen und somit eine Blaufärbung des Endosperms zu bedingen (Abb. 47 b). In der mitgeführten Kontrolle konnte keine GUS-Aktivität nachgewiesen werden.

pos.

Tab

ak

neg.

Kon

trolle

77B/

8-11

.1.1

77B

/8-1

5.2

GU

S-Ak

tivitä

t [pM

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in-1

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]

0

2000

4000

6000

8000

10000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

102

Abb. 47: Histochemischer GUS-Test an Weizenblättern und Karyopsen. a: Von links: Negativkontrolle, 77B/8-11.2, GUSMAR 3. b: Quergeschnittene Karyopsen. GUS-Färbung des Endosperms. Von Links: transformiert mit Gliadin-Promotor-uidA-Konstrukt, nicht-transgene Kontrolle, transformiert mit Ubiquitin-Promotor-uidA-Konstrukt.

Die Ergebnisse der fluorometrischen GUS-Tests, die den Einfluss der MARs auf die Expressionsstärke des von ihnen flankierten chimären uidA-Gens in transgenen Weizenpflanzen bewerten sollten, sind in Tabelle 23 zusammengefasst. In Abbildung 48 sind diese Ergebnisse zusätzlich graphisch dargestellt. Tab. 23: Ergebnisse des fluorimetrischen GUS-Tests. Zur Bezeichnung der Pflanzen siehe Text. Pflanzen-Nr. spezifische GUS-

Aktivität [pMol MU min-1 mg-1]

Pflanzen-Nr. spezifische GUS-Aktivität

[pMol MU min-1 mg-1] Positiv-Tabak 1 45205 ± 7558 77B/8-11.1 4845 ± 354 Positiv-Tabak 2 30337 ± 189 77B/8-11.2 6727 ± 565 Negativkontrolle 1 133 ± 141 77B/8-11.3 13087 ± 47 Negativkontrolle 2 133 ± 188 77B/2-17.7.2 4462 ± 330 Negativkontrolle 3 267 ± 141 77B/2-18.3.3 6061 ± 47 Negativkontrolle 4 233 ± 142 77B/8-15.2 5095 ± 141 Negativkontrolle 5 233 ± -67 77B/8-11.4 2648 ± 211 Negativkontrolle 6 167 ± 133 GUSMAR 1 14869 ± 6475 Negativkontrolle 7 168 ± 233 GUSMAR 2 4562 ± 659 Negativkontrolle 8 300 ± 141 GUSMAR 3 13187 ± 235 Negativkontrolle 9 401 ± 47 GUSMAR 4 10223 ± 188 GUSMAR 5 14236 ± 448 GUSMAR 6 17816 ± 140 GUSMAR 7 22811 ± 282

ERGEBNISSE ___________________________________________________________________________

103

Wie aus Abbildung 48 hervorgeht, unterscheiden sich auf Basis des t-Tests nach Student mit Ausnahme der Pflanze GUSMAR 2 alle Pflanzen mit Matrix-Anheftungsstellen signifikant vom Mittelwert der im Experiment überprüften Pflanzen ohne Matrix-Anheftungsstellen hinsichtlich ihrer spezifischen GUS-Aktivität. Die Expressionssteigernde Wirkung der MARs auf das uidA-Gen war damit auch in Weizen bewiesen.

Abb. 48: Spezifische GUS-Aktivität (in pMol min-1 mg-1). Pos. Tabak = 35S-GUS-3 Tabak als Positivkontrolle; neg. K. = Weizen-Negativkontrolle; uidA o. MARs = GUS-positive Pflanzen, ohne uidA-flankierende MARs; GUSMAR 1 bis GUSMAR 7 = sieben transgene Linien, cotransformiert mit p5‘uidA3‘ / pGFPBAR, die alle GUS-Aktivität aufwiesen. Eingezeichnet sind die Standardabweichungen. Statistische Basis war der t-Test nach Student. Signifikante Unterschiede sind durch unterschiedliche Buchstaben symbolisiert.

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

GU

S-A

ktiv

ität [

pMol

min

-1 m

g -1

]

a

b

c

d

dd

d

d

d

c

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Taba

k

neg.

K.

uidA

o. M

AR

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GU

SMA

R 1

GU

SMA

R 2

GU

SMA

R 3

GU

SMA

R 4

GU

SMA

R 5

GU

SMA

R 6

GU

SMA

R 7

DISKUSSION ___________________________________________________________________________

104

4 DISKUSSION Durch die Übertragung eines Phytoensynthasegens sollte die Carotinoidbiosynthese in Weizen (Triticum aestivum L. cv. ‘Combi‘) beeinflusst werden. Hierzu wurden proteinkodierende Regionen der natürlicherweise fruchtspezifischen Phytoensynthasegene psy1 aus Paprika (Capsicum annuum L.) und tom5 aus der Tomate (Lycopersicon esculentum L.) eingesetzt. Über den Einsatz entsprechender Promotoren sollte zum einen eine endospermspezifische Expression des Gens die Akkumulation von Carotinoiden im Korn fördern, zum andern sollte nach Transfer eines stark konstitutiv exprimierten Genkonstruktes die Biosynthese der Carotinoide in der gesamten Weizenpflanze gefördert und die konkurrierende Biosynthese der Gibberelline beeinträchtigt werden. Eine Beeinträchtigung der Gibberellinsynthese sollte durch die Schlüsselposition, die die Phytoensynthase im Metabolismus besetzt, ebenso denkbar sein wie eine reduzierte Phytolproduktion und die Förderung der Abscisinsäuresynthese. Als Transformationstechnik wurde der Mikroprojektilbeschuss, als Transferstrategie die Cotransformation eingesetzt. Die Cotransformationstechnik gewährleistete eine einfachere Konstruktion der benötigten Plasmide, da ein Plasmid, welches selektierbares Markierungs- und Reportergen in sich vereinigt, mit unterschiedlichen Nutzgen tragenden Plasmiden kombiniert werden kann, ohne dass ein neuer Übertragungsvektor konstruiert werden muss. Die genannte Vorgehensweise sollte ferner den Weg offen halten, markierungsgenfreie Pflanzen zu erhalten. Wenn diese Plasmide ungekoppelt eingebaut werden, ergibt sich in der T1-Generation die Möglichkeit, dass markierungsgenfreie Transformanten erhalten werden können (Yoder und Goldsbrough, 1994; Pedersen et al., 1997). In parallel verlaufenden Experimenten wurde der Einfluss von MARs (matrix attachment regions) auf die Expression der in Weizen übertragenen Phytoensynthasegene untersucht. Der erste Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Konstruktion geeigneter Nutzgenkassetten, die es erlaubten, die proteinkodierende Region des Phytoensynthasegens tom5 aus Lycopersicon esculentum (Ray et al., 1992) im geeigneten Kontext in Weizen (Triticum aestivum L. cv. ‘Combi‘) zu übertragen. Um die genannten Ziele verwirklichen und bewerten zu können, war es erforderlich, eine entsprechend große Zahl an transgenen Weizenpflanzen zu erzeugen. Dies setzte voraus, dass das bestehende Transformationssystem (Iser et al., 1999; Fettig und Hess, 1999) für das gewählte agronomisch relevante Kultivar ‘Combi‘ verbessert werden musste.

DISKUSSION ___________________________________________________________________________

105

4.1 AUSWAHL GEEIGNETER NUCLEOTIDSEQUENZEN UND

KONSTRUKTION DER ÜBERTRAGUNGSVEKTOREN Phytoensynthasegene Es wurden zwei Phytoensynthasegene eingesetzt, die beide für fruchtspezifische Phytoensynthasen kodieren. Der cDNA-Klon ptom5 (Ray et al., 1987) stammt aus der Tomate (Lycopersicon esculentum L.), der Klon psy beinhaltet die cDNA eines Phytoensynthasegens (Römer et al., 1993) aus Paprika (Capsicum annuum L.). Antisense-Experimente mit tom5 an Tomatenpflanzen zeigten, dass der Carotinoidgehalt in Früchten um bis zu 97 % reduziert wurde, in den Laubblättern jedoch unverändert blieb (Bramley et al., 1992). Eine Überexpression der gleichen cDNA unter Kontrolle des 35S-Promotors führte bei den transgenen Tomaten zu einer Verzwergung (Fray et al., 1995). Dieses dwarf-Syndrom umfasste auch einen um das 30fach reduzierten Gibberellinsäure A1 (GA1)-Spiegel, einen reduzierten Chlorophyllgehalt und einen veränderten Carotinoidgehalt, der sich vor allem durch das verstärkte Auftreten von Phytoen, Epoxyphytoen, Hydroxyphytoen, ζ-Carotin und Lycopin auszeichnete (Fray et al., 1995). Die in der vorliegenden Arbeit verwendete Sequenz aus ptom5 beinhaltet alle expressions-relevanten Bereiche, einschließlich der Sequenz für das Transitpeptid. Dieses Signalpeptid ist für die Lokalisierung des aktiven Enzyms in der Thylakoidmembran der Chloroplasten verantwortlich. Die verwendete Sequenz des Phytoensynthasegens psy aus Paprika (Römer et al., 1993, Kuntz et al., 1993) beinhaltet ausschließlich die 1267 bp große proteinkodierende Region des Gens. Dieser Abschnitt wurde von Bader (1999) mittels PCR amplifiziert und zur Konstruktion der Übertragungsvektoren pIB2 und p5IB23 verwendet. Ein Sequenzvergleich zwischen dem tom5- und dem psy-Gen ergab eine 90 %ige Homologie auf Ebene der Aminosäuren. Die größten Unterschiede liegen in der Abwesenheit von zwölf Aminosäuren im Transitpeptid des Tomaten-psy1-Gens (tom5), wohingegen am Carboxylende der Phytoensynthase aus Paprika fünf Aminosäuren weniger vorhanden sind im Vergleich zum aus der Tomate stammenden Phytoensynthasegen (Römer et al., 1993). Die Korrektheit der Konstruktionsarbeiten für die Nutzgenkassetten mit dem tom5-Gen (pGT, p5GT3, pUT, p5UT3) wurde durch Restriktions- und Southern blot-Analysen bestätigt (siehe 3.2). Selektierbares Markierungsgen und Reportergene Mit dem Plasmid pAHC25 (Christensen et al., 1992) stand ein Übertragungsvektor zur Verfügung, der als selektierbares Markierungsgen das bar-Gen und als Reportergen das uidA-Gen jeweils unter Kontrolle des konstitutiv arbeitenden Ubiquitin-Promotors aus Mais enthielt. Das Plasmid pAHC25 wurde in der Weizentransformation sowohl alleine als auch in

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Cotransformationsstrategien mit Erfolg verwendet (zum Beispiel: Vasil et al., 1993; Iser et al., 1999; Fettig und Hess, 1999). Ein Nachteil des uidA-Gens ist der destruktive Aktivitätsnachweis seines Produktes, der β-Glucuronidase. In seiner histochemischen Variante wurde dieser GUS-Test bei der Weizentransformation bisher auf transienter Ebene zur Überprüfung der Beschusseffizienz und in seiner fluorometrischen Form bei transgenen Pflanzen zur Quantifizierung und/oder Lokalisierung einer Promotoraktivität eingesetzt. Des weiteren ermöglichte der histochemische GUS-Test bei Pollen eine Aussage über die zu erwartende Segregation des uidA-Gens in den T1-Nachkommenschaften. Für die Überprüfung der Beschusseffizienz wurden rund 25 % der beschossenen Explantate (50 % bei Scheyhing, 1999 und Fettig, 1999) eingesetzt und somit der weiteren Gewebekultur entzogen. Im Gegensatz zum GUS-System arbeitet das GFP-System mit einem Vitalmarker. Das gfp-Gen wurde bei der Weizentransformation schon von mehreren Arbeitsgruppen eingesetzt (Jordan et al., 2000; McCormack et al., 1998; Pang et al., 1996). Diese Experimente zeigten, dass die gfp-Expression gut am lebenden Weizengewebe beobachtet werden konnte. Um eine Arbeitsersparnis durch bessere Ausnützung der präparierten Embryonen zu erreichen, sollte in einem Teil der Versuche das uidA- durch das gfp-Gen ersetzt werden und so die angesprochenen destruktiven GUS-Tests vermieden werden. Die Korrektheit des neukonstruierten Vektors, der bar- und gfp-Gen in sich vereinigt, wurde durch Restriktions-, sowie Southern blot-Analysen nachgewiesen. 4.2 VERSUCHE ZUR OPTIMIERUNG DES WEIZENTRANSFORMATIONS-

SYSTEMS Vorweg sei erwähnt, dass über die durchgeführten Experimente dem besseren Verständnis wegen in einer vermeintlich chronologischen Abfolge, häufig kausal zusammenhängend, berichtet wird. Tatsächlich jedoch wurden viele Versuchsreihen parallel zueinander durchgeführt. Dies war erforderlich, um auftretenden qualitative, jahreszeitlich bedingte Schwankungen des aus dem Gewächshaus stammenden Ausgangsmaterials entgegenzutreten und die Vergleichbarkeit der Experimente zu gewährleisten. 4.2.1 SK-Strategie mit GUS Primäres Ziel der vorliegenden Arbeit war eine großen Anzahl hinsichtlich der Nutzgene transformierter Weizenpflanzen zu erhalten. Für die verwendete Weizenvarietät ‘Combi‘ existierte sowohl ein Regenerations- als auch ein auf der Partikelbeschusstechnik basierendes Transformationssystem (Viertel et al., 1998; Iser et al., 1999; Scheyhing, 1999; Fettig, 1999; Fettig und Hess, 1999). Zielobjekt für den Partikelbeschuss war Scutellarkallus (SK),

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gewonnen aus unreifen Embryonen (siehe 2.7.3). Da das uidA-Reportergen verwendet wurde, erhielt dieses System die Bezeichnung „SK-Strategie mit GUS“ (siehe Abb. 49). Transformations- und Cotransformationsraten Zunächst wurde mit Transformationsexperimenten begonnen, bei denen embryogener Scutellarkallus mit pAHC25 als Reportergen- / selektierbares Markierungsgenplasmid und unterschiedlich gestalteten Nutzgenkassetten cotransformiert werden sollten. Es stellte sich im Verlauf dieser Experimente heraus, dass Arbeits- und Zeitaufwand das Erreichen des primären Ziels in Frage stellten. Nach Abschluss der Experimente zeigte sich, dass sich die Transformationsraten bei den einzelnen Plasmidkombinationen zwischen 0 % und 0,24 % bewegten. Insgesamt wurde eine Transformationsrate von 0,12 % erreicht. Dies entsprach sieben transgenen Weizenpflanzen, wovon vier Pflanzen cotransformiert waren. Ein erster Schritt zur Optimierung des Transformationssystems sollte, wie schon erwähnt, durch das GFP-System erreicht werden. Hierzu wurde, außer in einem Fall, bei dem nur mit pGFPBAR beschossen worden war (vgl. Tabelle 10 c), immer die Cotransformationstechnik unter Berücksichtigung entsprechender Nutzgenkassetten eingesetzt. 4.2.2 SK-Strategie mit GFP Der große Vorteil, den gfp gegenüber allen anderen Reportergenen besitzt, liegen darin, dass weder exogene Substrate bzw. Cofaktoren noch Antikörper zur Visualisierung erforderlich sind (Sheen et al., 1995). Lediglich Licht aus dem blauen bzw. UV-Bereich sowie Sauerstoff sind für die grüne Fluoreszenz notwendig (Chalfie et al., 1994). Die Liste der in Frage kommenden GFP-Varianten war lang. Sie unterschieden sich hinsichtlich ihrer Fluoreszenzstärke, ihrer Stabilität, ihrer Anregungs- und Emissionsspektren sowie ihrer Löslichkeit (zur Übersicht: Stewart Jr., 2001). Ausgelöst durch Experimente mit Arabidopsis thaliana, bei denen eine verringerte Regenerationsrate stark exprimierender Pflanzen beobachtet worden war (Haseloff et al., 1995 und 1997), entstand eine Diskussion über eine mögliche Cytotoxizität des green fluorescent proteins aus Aequorea victoria, die mitunter dazu führte, dass für einige Zeit GFP-Varianten mit einer Lokalisation ausschließlich im endoplasmatischen Retikulum favorisiert wurden (Haseloff et al., 1997). Verschiedene Studien scheinen jedoch die Hypothese eines für die Pflanzenzelle cytotoxischen GFPs zu widerlegen (Pang et al., 1996; Elliot et al., 1999; Harper et al., 1999). Bei Säugerzellen hingegen stellte Liu et al. (1999) einen Zusammenhang zwischen GFP und einer Induktion der Apoptose her und regte weitere Untersuchungen in diese Richtung an. Doch auch hier wird die Frage der Cytotoxizität kontrovers diskutiert. Andere Arbeitsgruppen, die mit GFP an Säugerzellen und transgenen Mäusen arbeiteten, fanden keinerlei Hinweise für eine cytotoxische Wirkung des GFPs (zum Beispiel: Zernicka-Goetz et al., 1997).

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Für die vorliegende Arbeit wurde die gut untersuchte GFP-Variante S65T eingesetzt (Pang et al., 1996). Diese GFP-Variante hatte den Vorteil, dass sie für Monokotyledonen optimiert und auch schon in Weizen eingesetzt worden war (Pang et al., 1996). Parallel zu den Konstruktionsarbeiten, die das chimäre, synthetische gfp-Gen aus pMON30049 (Pang et al., 1996) mit dem chimären, selektierbaren Markierungsgen aus pAHC25 (Christensen und Quail, 1996) verbinden sollten, waren im Zuge der vorliegenden Arbeit Cotransformationsexperimente mit der Plasmidkombination pMON30049 / pAHC25 durchgeführt worden. Aus 2761 beschossenen Explantaten gingen fünf transgene Weizenpflanzen hervor (Transformationsrate 0,18 %). Diese Transformationsrate unterscheidet sich statistisch gesehen nicht von den 0,12 %, die in Cotransformationsexperimenten mit pAHC25 und verschiedenen Nutzgenkassetten erreicht worden waren. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legten auch nahe, dass eine Cytotoxizität des GFPs nicht vorlag. Nachdem durch diese Ergebnisse die in das GFP-System gesetzten Erwartungen prinzipiell erfüllt worden waren, das Konstrukt pGFPBAR fertiggestellt und via Southern blot-Analyse bestätigt worden war, konnten Experimente mit pGFPBAR begonnen werden. Transiente gfp-Expression Die Funktionstüchtigkeit der gfp-Kassette pGFPBAR konnte nach Partikelbeschuss von Weizenkaryopsen auf Ebene der transienten Expression rasch bewiesen werden. Hierzu war es nicht erforderlich, unter sterilen Bedingungen zu arbeiten, da bereits 24 h nach Beschuss ein aussagekräftiges Ergebnis vorlag und zu diesem Zeitpunkt noch keine störenden Infektionen aufgetreten waren. Die fluoreszierenden Zellen der Karyopsen sind langgestreckt, wobei sich die Fluoreszenz auf das Cytoplasma (das die Zelle als dünner Wandbelag auskleidet) und auf eine Region um den Zellkern begrenzt. Diese Beobachtung war schlüssig, da die verwendete GFP-Variante auch bei transgenen Arabidopsis im Bereich des Cyto- und Nukleoplasmas lokalisiert war (Haseloff et al., 1997). Nicht-beschossene und mit Goldpartikeln, die nicht mit DNA beladen worden waren, beschossene Karyopsen zeigten keine GFP- oder GFP-ähnlichen Fluoreszenzerscheinungen. Untersuchungen an beschossenen Karyopsen zeigten auch, dass eine GFP-Fluoreszenz nur in den der Epidermis folgenden Zellschichten, also dem inneren Gewebe der Fruchtwandung zu beobachten war. Die tangential gestreckte chlorophyllhaltige Zellschicht wies keine gfp-exprimierenden Zellen auf. Diese Beobachtungen stimmen mit Untersuchungen von Fettig (1999) überein, der nachweisen konnte, dass die transiente uidA-Expression vor allem in den oberen beiden Zellschichten beschossener Scutella unreifer Embryonen stattfindet. Bei Versuchen mit Tabaksuspensionskulturen stellte sich heraus, dass bei rund 94 % der das Fremdgen exprimierenden Zellen sich die Goldpartikel innerhalb des Zellkerns der durch Partikelbeschuss transformierten Zelle befanden (Yamashita et al., 1991). Es sei angemerkt, dass der Weizennukleus aufgrund der vorliegenden Größenverhältnisse (Nukleus 15-20 µm,

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Goldpartikel 1 µm; siehe zum Beispiel: Abranches et al., 2000) gute Chancen hat den Partikelbeschuss ohne irreversible Schäden zu überstehen. Das neu konstruierte Plasmid pGFPBAR wurde zu weiterführenden Cotransformations-versuchen eingesetzt. Zunächst wurde an embryogenem Scutellarkallus als Zielobjekt des Partikelbeschusses festgehalten (Abb. 49). Beobachtungen über die Entwicklung der transienten gfp-Expression im Verlauf der Zeit - Grundlage waren die Anzahl fluoreszierender Gewebebereiche („GFP-Spots“) - ließen ein Maximum an fluoreszierenden Gewebebereichen im Zeitraum 16 h bis 48 h nach erfolgtem Partikelbeschuss annehmen (siehe 3.3.4, sowie Abb. 18). Ging man von einer Expression nach 24 h von 100 % aus, so reduzierte sich die Anzahl an fluoreszierenden Gewebebereichen alle 24 h um circa 30 % und ließ sich nach 196 h nicht mehr zweifelsfrei beobachten. Die durchschnittliche Anzahl an gfp-exprimierenden Gewebebereichen pro Isolat betrug 3,6 ± 1,7, was 274 ± 171 Gewebebereichen pro Beschuss entsprach. Jordan (2000) beschrieb, dass die transiente gfp-Expression ab 24 h nach Beschuss zu beobachten war. Da er mit einer anderen Filterkombination und einem anderen Promotor (Actin-Promotor) arbeitete, ist dieser Unterschied erklärbar. Bei den Versuchen mit pGFPBAR und Scutellarkallus als Zielobjekt des Partikelbeschusses wurden insgesamt Kalli aus 5761 Embryonen beschossen und weiterkultiviert, was zu sieben transgenen Weizenpflanzen führte (siehe Tabelle 10). Mit pAHC25 wurden insgesamt 5844 Embryonen (co-)beschossen und weiterkultiviert, was ebenfalls zu sieben transgenen Pflanzen führte (Tab. 10). Bei den zuletzt aufgeführten Zahlen muss jedoch berücksichtigt werden, dass rund 25 % mehr Embryonen präpariert worden waren, als dann letztlich in die Gewebekultur einfließen konnten. Die Differenz erklärt sich dadurch, dass zur Überprüfung der Beschusseffizienz mit Hilfe des histochemischen GUS-Tests rund ein Viertel der beschossenen Kalli verwendet worden waren. Der Durchschnitt an blauen Gewebebereichen betrug 6,8 ± 8,6 pro Isolat. Bei Fettig (1999) lag diese Anzahl bei 6,3 ± 6,7 pro Isolat. Der Vergleich mit anderen Daten gestaltet sich schwierig. So erreichten zum Beispiel Becker et al. (1994) nach eigenen Angaben im Durchschnitt 100 transient fassbare Transformationsereignisse pro Isolat. Die proteinkodierende Region des uidA-Gens war hier jedoch durch den Actin-Promotor aus Reis gesteuert. Außer dass sie mit der Winterweizensorte ‘Florida‘ auch ein anderes Kultivar verwendeten, setzten sie für den Beschuss Goldpartikel anderer Größe ein. Die Ergebnisse von Iser et al. (1999) bewiesen, dass die Anzahl blauer Gewebebereiche zwischen verschiedenen Kultivaren, bei ansonsten gleichen experimentellen Bedingungen, stark schwanken kann. Ebenso schwankten die Werte zwischen einzelnen Beschussversuchen stark. Ein statistisch ermittelter Unterschied zwischen dem transienten Expressionsverhalten von gfp- (in pGFPBAR) und uidA-Gen (in pAHC25) war, da das gfp-Gen den 35S-Promotor, das uidA-Gen hingegen den Ubiquitin-Promotor enthielt, nur wenig aussagekräftig.

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Transformations- und Cotransformationsraten Die Transformationsraten lagen bei den Experimenten mit pAHC25 beziehungsweise pGFPBAR mit jeweils 0,12 % im gleichen Bereich wie bei Fettig und Hess (1999) und Scheyhing (1999), die 0,10 % beziehungsweise 0,12 % erreichten. Auch die in diesen Arbeiten erzielten Cotransformationsraten von 0,09 % bei Fettig und Hess (1999) und 0,10 % bei Scheyhing (1999) unterschieden sich nicht signifikant von den in dieser Arbeit erreichten Werten von 0,07 % bzw. 0,05 %. In beiden Arbeiten wurde wie in der vorliegenden versucht, das Kultivar ‘Combi‘ zu cotransformieren. In anderen Arbeiten, bei denen eine Cotransformation von Nutzgen und selektierbarem Markierungs- / Reportergen versucht worden war, lagen die Transformationsraten zwischen 0,3 % (Altpeter et al., 1996a) und 0,9 % (Barro et al., 1997). Sollte nur ein Plasmid übertragen werden, konnten Transformationsraten von 2 % (Altpeter et al., 1996b; Vasil et al., 1992) und 0,96 % (Iser et al., 1999) erzielt werden. In allen bisher aufgeführten Fällen wurde isolierter embryogener Kallus beschossen. 4.2.3 UE-Strategie mit GFP Der Einsatz des GFP-Systems führte zwar zu einer Arbeitserleichterung, da die bisher durch den histochemischen GUS-Test bedingten Verluste an beschossenem Material vermieden werden konnten. Die Transformationsrate von 0,12 % war jedoch nicht gesteigert worden. Es wurde daher nach Wegen gesucht, das Weizentransformationssystem weiter zu optimieren. Ziel war es hierbei die Transformationsrate zu steigern. Ein weiterer Punkt, der verbesserungswürdig erschien, war die Dauer der Gewebekulturphase zwischen Embryonenpräparation und ex vitro-Kultur, die gut 13 bis 17 Wochen in Anspruch nahm. Basierend auf entsprechenden Arbeiten (Weeks et al., 1993; Rüd, 1999) wurden nun Experimente begonnen, bei denen nicht mehr drei Wochen alte isolierte Scutellarkalli, sondern vier bis sechs Tage alte unreife Embryonen als rezipierende Gewebe eingesetzt wurden (Abb. 49). Der wesentliche Unterschied zwischen beiden Methoden besteht darin, dass bei der herkömmlichen Praxis die embryogenen Kalli vom restlichen Gewebe abgenommen werden, bevor sie beschossen werden (Scutellarkalli). Dies kann in einem Zeitraum von 7 (Ortiz et al., 1996) bis 35 Tagen (De Block et al., 1997) nach Embryonenpräparation geschehen. Bei der Verwendung unreifer Embryonen verbleibt der eventuell proliferierte Kallus hingegen am Scutellum. Das Alter der zu beschießenden Embryonen liegt üblicherweise zwischen einem Tag (Becker et al., 1994) und 14 Tagen (Karunaratne et al., 1996). Unreife Embryonen sind bei der Weizentransformation das gebräuchlichste Akzeptorgewebe (Weeks et al., 1993; Vasil et al., 1993; Becker et al., 1994;

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Zhou et al., 1995; Karunaratne et al., 1996; Altpeter et al., 1996a; Blechl und Anderson, 1996; Srivastava et al., 1996; Takumi und Shimada, 1996; Leckband und Lörz, 1998; Wirtzens et al., 1998; Uze et al., 1999; Zhang et al., 2000; Jordan, 2000; Abranches et al., 2000; Wright et al., 2001; Shlumukov et al., 2001). Nachdem eine osmotische Behandlung der Explantate bei Mais die Transformationsrate verbesserte (Vain et al., 1993), optimierte Altpeter et al. (1996a) die osmotische Behandlung mit Mannit für das Kultivar ‘Bobwhite‘. Eine längere Nachbehandlung schlug sich dabei zwar in einer verbesserten transienten uidA-Expression, jedoch auch in einer reduzierten Regenerations- und Transformationsrate nieder. In der Literatur finden sich verschiedentlich Hinweise auf eine osmotische Mannitbehandlung von Weizenexplantaten in Zusammenhang mit der Partikelbeschusstechnik (Zhou et al., 1995; Blechl und Anderson, 1996; Stöger et al., 1998; Uze et al., 1999; Jordan, 2000; Salgueiro, 2000; Weeks et al., 2000; Zhang et al., 2000). Auf Daten, die den Vorteil einer solchen Behandlung belegen könnten, wird darin jedoch nicht eingegangen. Vermutlich geht die möglicherweise positive Wirkung einer solchen osmotischen Behandlung auf die Plasmolyse der Zielzellen zurück. Dies reduziert das Ausströmen des Protoplasmas nach Penetration der Zellen durch die Goldpartikel (Vain et al., 1993). In der vorliegenden Arbeit wurden die Embryonen einer osmotischen Behandlung mit 0,5 M Mannit unterzogen. Die hierbei angewendeten Parameter haben sich für das Kultivar ‘Combi‘ als günstig erwiesen (Rüd, 1999). Die Embryonen wurden nach der Präparation 4-6 Tage auf L35-Medium kultiviert und für die Vor- und Nachbehandlung auf Medium mit 0,5 M Mannit umgesetzt. Zu diesem Zeitpunkt waren die Embryonen angeschwollen und an den Rändern der Scutella zeigten sich Bereiche mit proliferierenden Kalli. Zunächst wurde darauf verzichtet, mit einem Nutzgenplasmid zu beschießen, so dass nur pGFPBAR zum Einsatz kam. Transformations- und Cotransformationsraten Aus nur 200 beschossenen Explantaten gingen sechs transgene Pflanzen hervor, was einer Transformationsrate von 3 % entsprach (siehe Tabelle 10). Ein Vergleich mit Arbeitsgruppen, die eine höhere Transformationsrate erreichten, zeigt Folgendes: Karunaratne et al. (1996) 3,3 %; 5,5 % Ortiz et al. (1996) und Zhang et al. (2000) 6,3 %. Letztere regenerierten jedoch mehrfach aus denselben transgenen Kalluslinien über einen Zeitraum von bis zu 11 Monaten. Diese Daten sind daher mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit schwer zu vergleichen. Ortiz et al. verwendeten das hpt-Gen für Hygromycin-Resistenz als selektierbaren Marker. Mit dem bar-Gen, das auch in der vorliegenden Arbeit zum Zuge kam, erreichten sie 2,6 % Transformanten. Ein wesentlicher Faktor für das Erreichen einer hohen Transformationsrate scheint die Auswahl der zu beschießenden Embryonen zu sein. Bieri et al. (2000) verwendeten nur

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Embryonen für den Partikelbeschuss, bei denen nach 5-7 Tagen eine erfolgreiche Kallusinduktion beobachtet werden konnte. Dies war bei rund 45 % der ursprünglich präparierten Explantate der Fall. Die Transformationsrate lag bei dem erwähnten Experiment bei 1 %. Ebenso spielen Alter und Zustand der Explantate eine Rolle. Pastori et al. (2001) untersuchten den Zusammenhang zwischen Transformationsrate und dem Alter der Pflanzen, deren Embryonen beziehungsweise isolierten Scutella als Akzeptorgewebe fungierten. Mit Material von 75 Tage alten Pflanzen wurde eine Transformationsrate erreicht, die fast 8 mal höher war, als wenn das Material von 82 Tage alten Pflanzen stammte. Nachdem das Vorexperiment für die UE-Strategie mit GFP mit dem Übertragungsvektor pGFPBAR erfolgreich verlaufen war, sollten auf die gleiche Weise auch die Gene der Nutzgenkassetten übertragen werden. Insgesamt wurden 5371 Embryonen mit den unterschiedlichen Plasmidkombinationen beschossen und 57 transgene Weizenpflanzen erhalten, die mit mindestens einem der übertragenen Gene transformiert worden waren. Davon enthielten 21 Pflanzen Gene aus beiden, an der Cotransformation beteiligten, Plasmiden. Die ermittelte Transformationsrate lag bei 1,06 % und damit fast um das 9fache höher als bei der SK-Strategie mit GFP. Dieser Unterschied war auf Basis des t-Tests nach Student sehr signifikant. Die Cotransformationsrate lag bei 0,39 % und damit um das Achtfache höher als die 0,05 % aus der SK-Strategie mit GFP. Alle Experimente mit Nutzgenkassetten zusammengefasst, waren 38 von 71 T0-Pflanzen cotransformiert. Die Sichtung entsprechender Publikationen zeigte deutliche Unterschiede bei den ermittelten Cotransformationsraten: 20 von 21 (95 %; Altpeter et al., 1996a), 8 von 9 Pflanzen (Fettig, 1999), 27 von 32 (84 %; Stöger et al., 1999) 5 von 7 (Barro et al., 1997), 18 von 26 (69 %, Blechl und Anderson, 1996) 4 von 6 (Leckband und Lörz, 1998), 37 von 56 (66 %, Uze et al., 1999), 64 von 98 (45 % bis 82 %, Sparks et al., 2001), 60 % bei Wright et al., 2000. Die in der vorliegenden Arbeit erreichte Cotransformationsrate von 54 % ist am unteren Ende dieser Aufzählung einzuordnen. Sie unterscheidet sich jedoch nicht maßgeblich von den meist in jüngster Zeit veröffentlichten Daten. Die Cotransformationsrate müsste sich bei den Experimenten, bei denen sowohl auf GFP- als auch auf PPT-Basis „selektiert“ worden war, steigern lassen, wenn die beiden Gene gfp und bar auf unterschiedlichen Plasmiden lägen. Ergebnisse der osmotischen Behandlung Da der Rahmen der Arbeit durch eine Variierung der Mannitparameter gesprengt worden wäre, wurden alle Transformationsexperimente mit unreifen Embryonen entweder mit einer 0,5 M Mannitbehandlung oder ohne Mannitbehandlung durchgeführt (siehe 2.7.4.2). Die Auswirkung der osmotischen Behandlung auf das Regenerationsverhalten wurde durch

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Versuche mit unbehandelten Embryonen (nicht-beschossen; UK) und mit Gold-Kontrollen (Beschuss mit nicht-DNA-beladenen Goldpartikeln; GK) untersucht (siehe 3.3.5). Tendenziell gesehen führte die osmotische Behandlung zu einer etwas geringeren Sprossbildungsrate. Es konnte jedoch kein statistisch signifikanter Unterschied bei der Sprossbildungsrate nachgewiesen werden. Die Frage, ob die durchgeführte osmotische Behandlung einen Einfluss auf die Transformationsrate hatte, musste offen bleiben. 4.2.4 Verbesserte UE-Strategie mit GFP Die GFP-Fluoreszenz wurde bisher lediglich zur Überprüfung der Beschusseffizienz herangezogen. Wenn 24 h nach Beschuss keinerlei fluoreszierende Gewebebereiche beobachtet werden konnten, musste davon ausgegangen werden, dass entweder die Beladung des Goldes misslungen oder die verwendete Plasmid-DNA nicht funktionstüchtig war. Solche Beschussversuche wurden verworfen. Wurde hingegen transiente gfp-Expression gefunden, wurden alle Explantate dieses Beschusses in der Gewebekultur weiter verwendet (Abb. 49). Die GFP-Fluoreszenz wurde während der gesamten Gewebekulturphase und darüber hinaus ständig verfolgt und dokumentiert. Diese Beobachtungen legten schon bald die Konsequenz nahe, nur solche Gewebe weiterzukultivieren, die eine Expression des gfp-Gens aufwiesen (Abb. 49). Die Selektion nicht-exprimierender Bereiche ist jedoch zwingend an ein aseptisches Arbeitsumfeld gebunden. Ein solches Arbeiten unter geeigneten Fluoreszenzbedingungen war erst gegen Ende der eigentlichen Gewebekulturexperimente möglich geworden. Zwar wurde schon vorher versucht, fluoreszierende Bereiche durch Markierungen am Petrischalendeckel und anschließender Isolierung unter aseptischen Bedingungen gezielt weiterzukultivieren. Dieses Verfahren erwies sich jedoch bald als zu arbeitsintensiv und unpraktikabel. Wie noch auszuführen sein wird, ergaben die Versuche mit den Matrix-Anheftungsstellen (MARs) in Kombination mit dem Nutzgen (Phytoensynthasegen) keine auswertbaren Ergebnisse hinsichtlich einer eventuellen Expressionsverstärkung. Es lag daher nahe, die schon verwendeten MARs mit einem quantifizierbaren Reportergen wie dem uidA-Gen, zu kombinieren (siehe 3.3.10). Verlauf und Ergebnisse der angesprochenen Experimente werden später im Abschnitt 4.3.4 ausführlich dargelegt. An dieser Stelle soll nur auf die Gewebekulturseite eingegangen werden: Die Embryonen wurden wie beschrieben (siehe 2.7.4.2) vorbereitet und mit der entsprechenden Plasmidkombination beschossen. Vierundzwanzig Stunden nach erfolgtem Partikelbeschuss wurden nur solche Embryonen auf neues Medium umgesetzt, die punktförmige GFP-Bereiche aufgewiesen hatten. Alle anderen Embryonen wurden verworfen. Die anschließende Gewebekultur verlief wie beschrieben mit steigendem PPT-

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Selektionsdruck. Vier Wochen nach Beschuss mussten die entstandenen Kalli auf Regenerationsmedium umgesetzt werden. Es wurden auch hier nur die fluoreszierenden Bereiche isoliert und weiterkultiviert.

Abb. 49: Übersicht über die verschiedenen Gewebekultur- / Transformationsstrategien. SK = embryogene Scutellarkalli; UE = unreife Embryonen; S = Selektion von nicht-embryogenem Gewebe; M = osmotische Behandlung mit 0,5 M Mannit; PPT = Phosphinothricin.

Transformations- und Cotransformationsraten Die Gewebekulturphase war also durch eine Kombination von PPT-Selektion und GFP-Screening geprägt (Abb. 49). Dieses Verfahren erwies sich als wenig arbeitsintensiv, da die entsprechenden Schritte mit den Standardarbeiten der Gewebekultur zusammenfielen.

SK-STRATEGIEmit GFP

4-6 Tage3 WochenM


Partikelbeschuss

alle Kalli / Embryonenwerden weiterkultiviert

S

UE-STRATEGIEmit GFP

Verbesserte UE-STRATEGIEmit GFP

4-6 TageM


Partikelbeschuss

ex-vitro Kultur

4 WochenKalluskultur im Dunkeln(ab dem 8. Tag 2 mg/l PPT,ab dem 15. Tag 5 mg/l PPT)

4-6 WochenRegeneration und Elongation(5 mg/l PPT)

nur Embryonen mit gfp-Expressionwerden weiterkultiviert

nur Kalli mit gfp-Expressionwerden weiterkultiviert

2-4 WochenBewurzelung

S

alle Kalli mit gfp-Expressionwerden weiterkultiviert

S

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Aus 539 beschossenen Embryonen konnten insgesamt neun transgene Pflanzen erhalten werden. Dies entsprach einer Transformationsrate von 1,7 %. Dieser Wert unterscheidet sich statistisch betrachtet nicht von den 1,06 %, die durch die UE-Strategie mit GFP erzielt worden waren. In der Transformationsrate 1,7 % wurden Experimente mit zwei verschiedenen Plasmidkombinationen zusammengefasst. Mit der Kombination puidA/pGFPBAR waren 0,41 %, mit p5’uidA3’/pGFPBAR 2,73 % erzielt worden (siehe 3.6). Betrachtet man diese Werte so lassen sie sich nahtlos in die Werte der Tabelle 10 c einreihen, in der die Transformationsraten für die verschiedenen Plasmidkombinationen aufgelistet sind, die mit der UE-Strategie mit GFP erreicht worden waren. 4.2.5 Selektion transgener Pflanzen Insgesamt konnten in der vorliegenden Arbeit aus 163 selektierten Pflanzen 77 Transgene gefasst werden. Das bedeutete, dass in 47,2 % der selektierten und ins Gewächshaus überführten Pflanzen zumindest eines der übertragenen Gene gefunden werden konnte. Die Konzentration des selektiven Agens lag bei 5 mg/l PPT. Bei anderen Arbeiten, bei denen ein gleich starker Selektionsdruck ausgeübt worden war, enthielten 53,3 % (Fettig, 1999) beziehungsweise 38,5 % (Scheyhing, 1999) der ‘Combi‘-Kultivare mindestens ein Fremdgen. Ein höherer Selektionsdruck mit 8 mg PPT pro Liter Medium führte nur zu einem geringfügig höheren Wert von 53,6 % (Iser et al., 1999). Eine Erklärung für die „hohe“ Anzahl an sogenannten „Ausreißern“, also Pflanzen die auf selektivem Medium wachsen, ohne dass dies auf die Anwesenheit bzw. Aktivität eines entsprechenden Resistenzgens zurückzuführen ist, könnte ein „Helfereffekt“ sein. Hierbei ermöglicht transgener Kallus, der im vorliegenden Fall das bar-Gen exprimiert, nicht-transgenem Kallus die Regeneration, indem er das Medium durch die Aktivität seiner Phosphinothricin-Acetyltransferase „entgiftet“. Fettig (1999) bemerkt hierzu richtigerweise, dass solche Pflanzen nach Vereinzelung also ohne „Helferkallus“ bei gleichbleibendem Selektionsdruck nicht weiter überleben dürften. Möglicherweise handelt es sich aber bei den Ausreißerpflanzen auch um Chimäre (vgl. 4.3.2). Während verschiedene Arbeitsgruppen (Vasil et al. 1993; Nehra et al. 1994) davon ausgehen, dass bei transgenen Weizenregeneratpflanzen, die über somatische Embryogenese erzeugt worden waren, keine Chimären auftreten können, belegten die Experimente von Stöger et al. (1998) deren Vorkommen. Eine weitere Erklärung wäre, dass es sich bei den „Ausreißern“ um somaklonale Variationen (Lazzeri und Shewry, 1993) der Wildtyppflanze handelt, die durch die Einwirkung des potentiell mutagenen Dedifferenzierungsmittels 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure eine erhöhte Toleranz gegen Phosphinothricin aufwiesen. Bei den begleitenden Kontrollversuchen waren jedoch unter selektiven Bedingungen keine nennenswerten Sprossbildungen zu beobachten.

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Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der gewählte Selektionsdruck ausreichend hoch war. Der Selektionserfolg war dabei unabhängig von der Art des gewählten Zielgewebes. 4.2.6 Gewebekulturdauer In der vorliegenden Arbeit konnte die Gewebekulturdauer (vom Zeitpunkt der Embryonenpräparation bis zur ex vitro Kultur) durch die Strategie mit 4-6 Tage alten unreifen Embryonen (UE-Strategie) auf 11 bis 15 Wochen gegenüber den 13 bis 17 Wochen, welche die Strategie mit isolierten Scutellarkalli (SK-Strategie) benötigte, verkürzt werden. Die Produktion der ersten transgenen Weizenpflanze nahm 10-13 Monate in Anspruch (Vasil et al., 1992). Im Durchschnitt liegt die Gewebekulturdauer modernerer Verfahren bei 12 bis 17 Wochen (wie zum Beispiel: Weeks et al., 1993; Nehra et al., 1994; Bieri et al., 2000). Die kürzeste Gewebekulturphase mit 8 bis 9 Wochen findet sich bei Altpeter et al. (1996). Die Zeitersparnis resultierte vor allem aus einer um 2 Wochen verkürzten Kalluskultur im Dunkeln nach dem Beschuss und einer um knapp 2 Wochen kürzeren Regenerationsphase. Ob das Kultivar ‘Combi‘ in diesen Phasen der Gewebekultur weiteres Potential zur Kürzung birgt, konnte im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht überprüft werden. 4.2.7 Phänotypische Auffälligkeiten an T0- und T1-Pflanzen Alle Regeneratpflanzen und deren Nachkommen wurden nach ihrer Überführung ins Gewächshaus sorgfältig auf phänotypische Veränderungen hin kontrolliert. Besonderes Augenmerk wurde hierbei auf das Auftreten einer möglichen Verzwergung transgener Pflanzen gelegt. Dieses dwarf-Syndrom durch die Aktivität des zuübertragenden Phytoensynthasegens zu erreichen, stellte ein Ziel dieser Arbeit dar. Dass die nachfolgend beschriebenen Phänotypen auf Mutationen zurückzuführen sind, die durch Integration eines Fremdgens in ein Gen des Wirtsgenoms verursacht worden sind, muss als eher unwahrscheinlich angesehen werden. Weniger als 3 % des 16.000 Mb großen Weizengenoms repräsentieren Gene (Gill et al., 1996). Ferner sind die Integrationsmuster übertragener Gene sehr komplex (Gill et al., 1996) und es besteht wohl keine Präferenz für eine Lokalisation in einem bestimmten Genom, auf einem bestimmten Chromosom oder Chromosomenarm (Jackson et al., 2001). Sterilität transgener Regeneratpflanzen Zwei der transgenen Weizenpflanzen aus den Versuchen mit Phytoensynthasegenen und drei transgene Weizenpflanzen aus den Versuchen mit den Matrix-Anheftungsstellen in

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Kombination mit dem uidA-Gen (ohne Phytoensynthasegene) waren steril (siehe 3.3.6). Daneben fanden sich auch bei nicht-transgenen Pflanzen Exemplare, die keine Körner ansetzten. Die Sterilität trat also unabhängig von einem erfolgten Transformationsereignis auf und kann daher nicht auf eine Fremdgenexpression zurückgeführt werden, sondern sollte vielmehr als Folge der Gewebekultur betrachtet werden. In seltenen Fällen waren auch einzelne Nachkommenpflanzen von normalen, fertilen, nicht-transgenen Regeneratpflanzen steril. Möglicherweise handelte es sich hierbei um ein zufällig auftretendes Phänomen. In vielen Weizentransformations-Veröffentlichungen scheint Sterilität kein Thema zu sein, oder wird, wie bei Weeks et al. (2000) mit dem Hinweis, dass die meisten transgenen Pflanzen normal waren und zur Blüte kamen, manche Pflanzen jedoch eine verminderte Fertilität und reduzierten Samenansatz zeigten, nur ungenau beschrieben. Altpeter et al. (1996a) fanden eine sterile Pflanze unter ihren neun Transgenen, Weeks et al. (1993) eine Sterile von 65 Pflanzen. Bei Bliffeld et al. (1996) waren nur 75 % der erhaltenen transgenen Regeneratpflanzen auch fertil. Nehra et al. (1994) stellten aufgrund ihrer Untersuchungen einen Zusammenhang zwischen dem Auftreten einer männlichen Sterilität und einer vorangegangenen langen Gewebekulturphase her. Diese Annahme wird durch die Arbeit von Zhang et al. (2000) unterstützt, die bei lang-zeit („long-term“) Kalluskulturen lediglich 50 % fertile, transgene Pflanzen erhielten. Der Wert der in dieser Arbeit erzielten hohen Transformationsrate von 6,3 % sollte unter diesem Aspekt mit Vorsicht betrachtet werden. Zwergwuchs Neun Regeneratpflanzen zeigten Zwergwuchs, wobei sich nach Southern blot-Analyse davon drei als Ausreißerpflanzen herausstellten, bei denen keines der übertragenen Gene nachgewiesen werden konnte. Es ist daher davon auszugehen, dass die unterschiedlichen Wuchshöhen auf die Folgen der Gewebekultur zurückzuführen waren. Begrannte Ähren Das verwendete Kultivar ‘Combi‘ ist unbegrannt. Die Regeneratpflanze 81.5.7 mit der Plasmidkombination pGT/pAHC25 (psy unter Kontrolle des Gliadin-Promotors) fiel hingegen durch ihre gut 6 cm langen Grannen auf. Interessanterweise vererbte sich dieses Phänomen in die T1-Generation weiter. Vier der 20 Nachkommenpflanzen waren wiederum begrannt. Statistisch betrachtet ist dieses Verhältnis bei einer Signifikanzschwelle von 5 % signifikant unterschiedlich zu einem für einen hemizygot monohybriden Erbgang erwarteten Spaltungsverhältnis von 3 : 1. Die Ursache der Begrannung kann möglicherweise auch eine somaklonale Variation genetischer oder epigenetischer Natur während der vom Einfluss des 2,4-D geprägten Kallusphase sein (Lazzeri und Shewry, 1993). Verzweigte Ähren Ein weitaus häufiger aufgetretenes Phänomen war das der verzweigten Ähren. Insgesamt zwölf transgene Regeneratpflanzen sowie zwei Regeneratpflanzen aus Beschusskontrollen

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zeigten diesen Phänotyp. Das Ereignisses war bei den transgenen Pflanzen unabhängig von der eingesetzten Plasmidkombination aufgetreten. Unter ihnen waren auch zwei Pflanzen, die nur mit dem Plasmid pGFPBAR beschossen worden waren. Häufig waren auch nicht alle Ähren einer Pflanze betroffen. Die Blütchen an den betroffenen Ähren brachten meist nur sehr wenig Karyopsen hervor. Die vier Nachkommen der Pflanze 266.1.3 (pUT/pGFPBAR) hatten ebenfalls alle verzweigte Ähren. Deformierte Ähren können durch den pilzlichen Schaderreger Sclerophthora macrospora (Wiese, 1986), aber auch durch Pestizide wie das hormonell wirkende Herbizid 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (Prescott et al., 1994) verursacht werden. 2,4-D wurde sechs bis sieben Wochen während der Gewebekultur von Kallus verwendet. Auch hier wäre eine somaklonale Variation des Phänotyps, bedingt durch das Kallusstadium und/oder durch das während dieser Phase eingesetzte 2,4-D, eine mögliche Erklärung. Verzögerte Seneszenz Insgesamt zeigten fünf transgene T0-Pflanzen gegenüber den begleitenden Kontrollpflanzen eine verzögerte Seneszenz (siehe 3.3.6). Besonders die T0-Pflanze 266.1.3 (pUT/pGFPBAR) und deren vier Nachkommen waren in ihrer Seneszenz stark verzögert. Immer wieder schob(en) die Pflanze(n) neue Sprosse nach, während die begleitende Kontrolle schon abgereift waren. Letztlich wurden die betroffenen Weizenpflanzen rund 6 Wochen älter, als die entsprechenden Kontrollpflanzen. Das gleiche trat bei einer von 20 Nachkommen der Pflanze 329.1.1 (p5UT3/pGFPBAR), bei fünf von 20 Nachkommen der Pflanze 329.2 (p5UT3/pGFPBAR), bei vier von 11 Nachkommen der Pflanze 347.9.2 (pUT/pGFPBAR) sowie einer von drei Nachkommen der Regeneratpflanze 348.1 (pUT/pGFPBAR) auf. Auffallend ist hierbei, dass das Auftreten der verzögerten Seneszenz in einem Zusammenhang mit dem Vorhandensein von Ubiquitin-Promotor-psy-Konstrukten steht. Bei einer gesteigerten Phytoensynthaseaktivität, die eine verstärkte Carotinoidsynthese nach sich ziehen kann, wäre zu erwarten, dass auch die Synthese der Abscisinsäure als seneszenzförderndes Phytohormon gefördert wird. Das Phänomen der verzögerten Seneszenz wird an späterer Stelle im Zusammenhang mit der Nutzgenexpression (4.3.3) erneut aufgegriffen und ausführlicher diskutiert. 4.3 TRANSFORMATION UND GENEXPRESSION Nutzgen und selektierbares Markierungsgen, auf unterschiedlichen Plasmiden liegend, sollten mittels Cotransformation übertragen werden. Diese von Yoder und Goldsbrough (1994) erwähnte Strategie sollte ursprünglich, da Nutz- und Markierungsgen zwar gemeinsam übertragen, jedoch in unterschiedlichen Kopplungsgruppen des Wirtsgenoms integriert werden können, die Eliminierung der Markierungsgene in der Nachkommenschaft

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ermöglichen. In dieser Arbeit wurde die Cotransformation noch aus zwei weiteren Gründen einer „einfachen“ Transformation mit nur einem Übertragungsvektor vorgezogen. Die Cotransformationsstrategie ermöglicht einerseits die rasche Kombination des selektierbaren Markierungs-/ Reportergenplasmids mit verschiedenen Nutzgenkassetten, ohne eine erneute Konstruktionsarbeit durchführen zu müssen. Andererseits wäre ein Plasmid, wenn es alle benötigten Gene auf sich vereinigt hätte, so groß, dass die verwendeten pUC-Derivate an ihre Aufnahmekapazität gestoßen wären. 4.3.1 Southern blot-Analysen von Pflanzen der T0- und T1-Generation Aus den Versuchen, bei denen das Ziel die Cotransformation mit selektierbarem Markierungs-/Reportergenplasmid und Nutzgenplasmid war, überlebten insgesamt 152 Pflanzen die Selektion mit PPT. Davon erwiesen sich 71 Pflanzen in der Southern blot-Analyse für mindestens eines der eingesetzten Gene als positiv. Achtundzwanzig Pflanzen beinhalteten Gene sowohl des selektierbaren Markierungsgen-/Reportergenplasmids als auch des Nutzgenplasmids und waren somit cotransformiert. Die Integration der angesprochenen Gene ins Genom der Weizenpflanzen wurde durch entsprechende Southern blot-Analysen („Hybrid-blot“) entweder in der T0- oder in der T1-Generation bewiesen. Die Anzahl der übertragenen Genkopien bewegte sich zwischen einer und sieben Kopien. Fettig (1999) gab für das übertragene Nutzgen eine Mindestkopienzahl von einem bis vier an. Becker et al. (1994) berichteten von drei bis elf Kopien des pat- beziehungsweise des uidA-Gens. Srivastava et al. (1996) fanden bis zu fünf Kopien des übertragenen uidA-Gens. Auch De Block et al. (1997) fanden ein bis fünf Kopien des übertragenen bar beziehungsweise barnase-Gens. Das Glutenin-1-Gen lag in transgenem Weizen mit einer Kopienzahl zwischen zwei und zehn vor (Barro et al., 1997). Stöger et al. (1998) untersuchten 69 transgene Weizenpflanzen hinsichtlich ihrer molekularen Charakteristika, wobei sie feststellten, dass die meisten Pflanzen zwei bis sechs Kopien der übertragenen Gene aufwiesen. In seltenen Fällen (siehe 3.3.8 c) Pflanze 1011.2) deutete die Southern blot-Analyse auf das interne Fragment das Vorhandensein einer weiteren, jedoch unvollständigen Kopie des Gens an. Das Auftreten solcher unvollständiger Kopien ist bei der Weizentransformation über die Partikelbeschusstechnik keine Ausnahme (zum Beispiel: Wright et al., 2001). War in der T0-Generation mehr als eine Genkopie in das Genom integriert worden, deutet ein einheitliches Hybridisierungsmuster bei transgenen T1-Pflanzen darauf hin, dass die Integration der Kopien innerhalb einer Kopplungsgruppe stattgefunden hat. Dies traf bei nahezu alle untersuchten T1-Pflanzen der vorliegenden Arbeit zu und deckt sich auch mit anderen publizierten Ergebnissen (zum Beispiel: Becker et al., 1994). Bei einer Integration in verschiedene Kopplungsgruppen sind unterschiedliche Bandenmuster innerhalb der Nachkommenschaft dieser Pflanze zu erwarten. Nur bei den Nachkommen der T0-Pflanze

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336.2.1 (pGT/pGFPBAR) wurde genau dieses Phänomen festgestellt. Auch Stöger et al. (1998) berichteten über eine solche Pflanze. Die Integration in unterschiedlichen Kopplungsgruppen scheint bei Weizen ein eher seltenes Phänomen zu sein. Die gleiche Schlussfolgerung zogen auch andere Arbeitsgruppen aus ihren Ergebnissen (Karunaratne et al., 1996; Barro et al., 1998; Shlumukov et al., 2001). De Block et al. (1997) kommen, gestützt durch ihre Untersuchungen, zu einem anderen Ergebnis: Transgene Weizenpflanzen, bei denen während der Gewebekulturphase Niacinamid eingesetzt worden war, enthielten in rund 75 % der Fälle eine bis drei Genkopien. Die Analyse der T1-Generation zeigte dabei, dass die meisten dieser Kopien nicht innerhalb einer Kopplungsgruppe der T0-Pflanze integriert worden waren und somit segregierten. Die durch die Cotransformationstechnik theoretisch eröffnete Möglichkeit, dass die beiden kombinierten Plasmide in der T1-Generation segregieren, konnte in keinem einzigen Fall eindeutig nachgewiesen werden. Diese Beobachtung deckt sich mit bereits publizierten Arbeiten, die ebenfalls keine unabhängige Vererbung von Genen, die auf unterschiedlichen Plasmiden liegend übertragen worden waren, festgestellt hatten (Altpeter et al., 1996; Blechl und Anderson, 1996; Barro et al., 1997; Leckband und Lörz, 1998; Stöger et al., 1998; Fettig und Hess, 1999; Bliffeld et al., 1999; Chen et al., 1999). Auch, wenn die Integration von Fremdgenen an mehreren Stellen im Genom stattfindet (Pedersen et al., 1997; Abranches et al., 2000), können dort beide Plasmide eingebaut werden (Kohli et al., 1998). Zur Erzeugung Markierungsgen-freier transgener Weizenpflanzen sollte auf andere Verfahren zurückgegriffen werden (siehe Einleitung). Im Rahmen dieser Arbeit war es nicht möglich Nachkommen von allen erhaltenen transgenen T0-Pflanzen (71 Pflanzen) anzuziehen und zu untersuchen. Die Auswahl erfolgte dahingehend, dass nur Samen von Pflanzen ausgelegt worden waren, bei deren Mutterpflanze entweder das Nutzgen nachgewiesen worden war oder wenn diese durch einen interessanten Phänotyp aufgefallen waren. So wurden von 29 transgenen T0-Pflanzen insgesamt 470 Nachkommenpflanzen erhalten, wobei pro Elternpflanze maximal 20 Karyopsen ausgelegt. worden waren (Tabelle 19). Die Analyse zum Vererbungsmodus der übertragenen Gene ergaben folgendes: Bei 13 Nachkommenschaften unterschieden sich die beobachteten Spaltungsverhältnisse nicht signifikant von dem für einen hemizygoten, monohybriden Erbgang erwarteten Verhältnis von 3:1. Bei vier dieser Nachkommenschaften traf dies für alle der übertragenen Gene zu. In drei Nachkommenschaften konnte keines der zuvor in der T0-Generation gefundenen Fremdgene wieder nachgewiesen werden. In weiteren 13 Nachkommenschaften waren die Spaltungsverhältnisse signifikant unterschiedlich zu 3:1. Der Grund hierfür kann, wie auch schon früher beobachtet, eine Eliminierung des Fremdgens (Hess et al., 1990; Mendel et al., 1990) sein. Die Integration des Fremdgens in das extrachromosomale Genom des Weizens könnte eine weitere Erklärung hierfür sein.

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4.3.2 Expression des selektierbaren Markierungsgens bar und der

„Reportergene“ uidA und gfp in der T0- und T1-Generation Expression des bar-Gens Alle regenerierten Pflanzen und deren Nachkommen wurden mit dem PAT-Aktivitätstest auf die Expression des bar-Gens hin untersucht. Dabei wurden nur deutlich zu erkennende Signale als PAT-positive gewertet. Damit erklärt sich möglicherweise auch, warum einige der unter Selektionsdruck regenerierten und später als transgen analysierten Pflanzen scheinbar keine PAT-Aktivität zeigten. Doch ist auch denkbar, dass die Expression des bar-Gens mit Wegfall des Selektionsdruck nachgelassen hatte. Karunaratne et al. (1996) stellten bei einigen transgenen Weizen mit zunehmendem Alter eine abnehmende PAT-Aktivität fest. Weeks et al. (1993) erhielt transformierte Weizen, die sowohl das bar- als auch das uidA-Gen jeweils unter Ubiquitin-Promotor-Kontrolle enthielten, wobei nur das uidA-Gen exprimiert wurde. Cannell et al. (1999) stellten genau den umgekehrten Fall fest. Weizen, die mit dem bar- und dem uidA-Gen transformiert worden waren verloren in den Folgegenerationen zunehmend die Fähigkeit das uidA-Gen zu exprimieren. Eine solche „späte“ Inaktivierung des Gens kann mit einer Vielzahl von verschiedenen Genstilllegungs-Mechanismen zusammenhängen (Lakshminarayan, 2000) und sehr spezifisch nur eines der übertragenen Gene betreffen (Cannell et al., 1999). In der vorliegenden Arbeit konnte in den Nachkommenschaften von sechs genaktiven T0-Pflanzen die Aktivität der übertragenen Markierungs- / Reportergenen nicht mehr nachgewiesen werden. Bei der Pflanze 180.6 (pGFPBAR) betraf dies nur das bar-Gen. Bei allen anderen dieser Pflanzen waren beide Gene betroffen (siehe Tabelle 21). Expression des uidA-Gens Bis zur vollständigen Etablierung des GFP-Systems wurde das uidA-Gen als Reportergen eingesetzt. Der Begriff „Reportergen“ wird gewöhnlich im Zusammenhang mit der Quantifizierung einer Genexpression verwendet (Bowen, 1993), also bevorzugt bei Promotoranalysen. Man unterscheidet die Reportergene somit auch von den selektierbaren Markierungsgenen. In der vorliegenden Arbeit wurde uidA während der Gewebekulturphase nur zur Überprüfung der Beschusseffizienz eingesetzt. Die Pollen aller Regeneratpflanzen, bei deren Transformation auch das uidA-Gen verwendet worden war, wurden einem histochemischen GUS-Test unterzogen. In den acht transgenen Pflanzen, die aus diesen Experimenten erhalten werden konnten, wurde bei vier Pflanzen das uidA-Gen mittels Southern blot-Analyse festgestellt, wovon wiederum zwei Pflanzen GUS-aktive Pollen zeigten. Die Auszählung der Pollen ergab eine 1:1-Segregation für das uidA-Gen. Für die Nachkommen dieser hemizygoten Pflanzen wurde daher eine 3:1-Segregation für das uidA-Gen erwartet.

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Das uidA-Gen wurde in einem anderen Experiment dann auch als klassisches Reportergen eingesetzt. Hierbei sollte der Einfluss der Matrix-Anheftungsstellen auf seine Expression untersucht werden. Im Kapitel 4.3.4 werden diese Versuche ausführlich diskutiert. Auf das transiente Expressionsverhalten der Reportergene wurde bereits in den Kapiteln 4.2.1 und 4.2.2 eingegangen. Expression des gfp-Gens Für Beobachtungen an gfp-exprimierenden Geweben standen zwei Sperrfilter mit unterschiedlichen Transmissionsspektren zur Verfügung. Obwohl Sperrfilter 1, im Gegensatz zu Sperrfilter 2 die rötliche Fluoreszenz des Chlorophylls herausfiltert, wurden dennoch die meisten Beobachtungen und fotographischen Aufnahmen mit Sperrfilter 2 gemacht. Dessen Vorteil war die höhere Lichtdurchlässigkeit, die sich positiv auf die Belichtungszeiten beim Fotografieren niederschlug und auch für intensivere Farben und realistisch wirkende Aufnahmen sorgte. Auch konnte mit Sperrfilter 2 eine gelbliche Fluoreszenz, die wohl auf phenolische Substanzen zurückzuführen war, besser von der GFP-Fluoreszenz unterschieden werden. Diese störende Fluoreszenz trat vor allem bei älterem Gewebe auf und erschien mit Sperrfilter 1, ähnlich wie GFP, grün. Die Expression des gfp-Gens wurde während allen Entwicklungsstadien der Pflanze beobachtet und fotografisch dokumentiert. Besonders gut konnte GFP in chlorophyllfreiem Gewebe wahrgenommen werden. Bei älteren Blättern überdeckte das unter den gewählten Fluoreszenzbedingungen rot leuchtende Chlorophyll die GFP-Fluoreszenz. In absterbendem Gewebe war die gelblich-grüne Hintergrundfluoreszenz nicht mehr eindeutig von einer GFP-Fluoreszenz zu unterscheiden. Ferner konnte kein GFP in Pollen transgener T0 und T1-Pflanzen gefasst werden. Dem gfp-Gen vorgeschaltet war der 35S-Promotor aus CaMV, der auch in anderen Pflanzen keine gfp-Expression in Pollen hervorrufen konnte (van der Geest und Petolino, 1998; Nehlin et al., 2000). Eigene Untersuchungen an Pollen von Kontrollpflanzen ergaben, dass Weizenpollen unter den gewählten Fluoreszenzbedingungen altersabhängig zu einer starken gelblich-grünen Eigenfluoreszenz neigen, die eine Abgrenzung von einer echten GFP-Fluoreszenz ohnehin sehr erschweren würde. Aus diesen war Gründen keine GFP-Segregationsanalyse an Pollen möglich. Bei Betrachtung ganzer, stark gfp-exprimierender Karyopsen transgener Regeneratpflanzen lag der Gedanke nahe, dass auf dieser Basis eine Segregationsanalyse durchgeführt werden könnte. Die zu beobachtende GFP-Fluoreszenz der Karyopse war jedoch die der Samenhülle, die von den beiden maternalen Integumenten geliefert worden war. Ob eine Fluoreszenz, auf das triploide Endosperm bzw. den Embryo oder nur auf die Samenhülle zurückzuführen war, konnte bei der äußerlichen Betrachtung intakter Körnern nicht entschieden werden. Um dies zu überprüfen war es notwendig, die Samenhülle zu entfernen. Frucht-/Samenschale (T0-Generation) und Endosperm (T1-Generation) einerseits, sowie der Embryo (T1-Generation)

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andererseits, konnten auf diese Weise hinsichtlich ihrer Fluoreszenz analysiert werden. Bei einem hemizygot monohybriden Erbgang wird von der T1-Generation ein Spaltungsverhältnis von 3:1 erwartet, in der T2-Generation von 5:3. Die Tests wurden vor allem in der T2-Generation durchgeführt. Die Segregation der Embryonen hinsichtlich des gfp-Gens folgte bei allen getesteten Pflanzen den Mendelschen Regeln. Abweichungen von der erwarteten Segregation wären zum Beispiel durch mehrfache Insertionen des gfp-Gens auf jedem der beiden Schwesterchromatiden oder durch Integration auf einem extrachromosomalen Erbträger zu erklären gewesen. Die isolierten Embryonen konnten durch Embryo rescue weiterkultiviert und zu fertilen Pflanzen herangezogen werden, so dass die transgene Linie erhalten wurde. Dieses Verfahren besitzt noch einen weiteren Vorteil: Wollte man bisher die Nachkommen einer Pflanze untersuchen, verstrichen mindestens 17 Wochen von der Anthese der T0-Pflanze bis zur Anthese ihrer Nachkommen (T1). Da die Zeit bis zum Abreifen der Karyopsen und die Keimruhe nicht mehr abgewartet werden müssen, verkürzt sich die Dauer durch Embryo rescue auf 8 Wochen. Auf diese Weise ist eine enorme Zeitersparnis möglich, soll zum Beispiel die stabile Vererbung eines Fremdgens über mehrere Generationen hinweg untersucht werden. Die Beobachtungen der gfp-Expression an jungen Blättern ließen bei zwei Pflanzen die Vermutung zu, dass es sich um Chimären handeln könnte. Da die genomische DNA dieser Pflanzen nicht aus verschiedenen Geweben isoliert und untersucht worden waren, konnte die Southern blot-Analyse hier keinen Aufschluss geben. Vasil et al. (1993) berichteten, dass aus ihren Experimenten keine Chimären hervorgingen, was darauf zurückzuführen sei, dass die transgenen Pflanzen aus einer einzigen transformierten Zelle hervorgegangen waren. Auf der anderen Seite gibt es jedoch Arbeiten, die von chimären Weizenpflanzen nach Transformation via Partikelbeschuss berichten (Stöger et al., 1998; Jordan, 2000). 4.3.3 Untersuchungen zur Expression der Phytoensynthasegene in der

T0- und T1-Generation Neben dem funktionstüchtigen Phytoensynthasegen gibt es einen weiteren wesentlichen Faktor bei der Phytoenproduktion. Es ist dies die Verfügbarkeit von Geranyl-geranylpyrophosphat, dem Substrat der Phytoensynthase. In allen photosynthetisch aktiven Geweben ist diese Voraussetzung prinzipiell erfüllt. Dass Lutein im Endosperm des Weizenkorns vorkommt (Chen und Geddes, 1945; Sims und Lepage, 1968; Kaneko und Oyanagi, 1995; Pinzino, 1999), setzt voraus, dass das Substrat der Phytoensynthase auch dort vorhanden ist. Chen und Geddes (1945) maßen den Carotinoidgehalt des Stärkeendosperms, des Embryos und der Kleie getrennt voneinander.

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Diese Untersuchungen belegten eindeutig, dass im Stärkeendosperm des Weizens Carotinoide produziert werden. Aussagekraft der HPLC-Analytik Blätter: Die HPLC-Analyse von drei Proben einer Kontrollpflanze zeigte, dass die Fehlerbreite der Einzelmessung unter 10 % des Mittelwertes lag. Aus diesem Grund war es vertretbar nur Einzelmessungen durchzuführen. Die Schwankungsbreiten der stationären Pigmentkonzentrationen bewegten sich, α-Carotin ausgenommen, in der T0 zwischen 27 und 48 %, in der T1 zwischen 10 und 36 %. Erklärt werden kann dies dadurch, dass die Wachstumsbedingungen während der Gewächshauskultur im Verlauf eines Jahres trotz gewährleisteter Mindestlichtmenge und -temperatur nicht konstant gehalten werden können. Die geringeren Schwankungsbreiten bei der T1 lassen sich dadurch erklären, dass hier die Probennahmen über einen Zeitraum von 3 Monaten, die der T0 über 2 Jahre erfolgt waren. Bei α-Carotin lag die Fehlerbreite bei 100 %. Dies lässt vermuten, dass sich die α-Carotin-Konzentrationen bei manchen Pflanzen außerhalb der Empfindlichkeitsgrenzen der HPLC-Anlage bewegten Bildet man die Verhältnisse verschiedener Pigmente zueinander, so sind die Schwankungen auch bei Pflanzen, die unterschiedlichen Wachstumsbedingungen ausgesetzt waren, deutlich geringer (4 bis 12 %). Nur beim Chlorophyll a/β-Carotin-Verhältnis war mit 44 % der Fehler relativ groß. Karyopsen: Für die HPLC-Analyse mussten jeweils drei bis fünf unreife Karyopsen einer Pflanze eingesetzt werden. Aufgrund der zu erwartenden Segregation der Fremdgene war jedoch zu erwarten, dass nicht bei jeder Karyopse einer transgenen Pflanze das Endosperm auch transgen ist. Es wurden nur gfp-exprimierende Karyopsen zur HPLC-Messung verwendet. Aus diesen waren zuvor die Embryonen isoliert und dem Embryo rescue zugeführt worden. Die Beschränkung auf gfp-exprimierendes Endosperm konnte mit der Tatsache begründet werden, dass Nutzgen und Markergene (gfp, bar), auch bei der angewanden Cotransformationstechnik, zusammen auf die Nachkommen vererbt worden sind (vgl. Tab. 21 und 4.3.1). Durch das Embryo rescue konnte das Fortbestehen der untersuchten transgenen Linien gesichert werden. Da die Technik des Embryo rescue zum Zeitpunkt der Analyse von T0-Pflanzen noch nicht verfügbar war (vgl. 3.4.3), wurden nur Karyopsen von T1-Pflanzen zur HPLC-Analyse herangezogen. Die Fehlerbreiten der stationären Pigmentkonzentrationen lagen zwischen 0,3 und 31 %. Die Metaboliten α- und β-Carotin konnten nicht nachgewiesen werden. Die Schwankungsbreiten bei den Pigmentverhältnissen lagen zwischen 14 und 15 %. Das Phytoensynthasegen unter Kontrolle des Ubiquitin-Promotors Theoretisch sollte es möglich sein, durch eine ubiquitäre Überexpression des Phytoensynthasegens einen erhöhten Verbrauch an GGPP herbeizuführen und dadurch

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Einfluss auf den Carotinoidhaushalt und auf andere Stoffwechselwege (Phytol-, Gibberellin-, ABA-Synthese) des Weizens auszuüben. Von den 19 untersuchten transgenen T0-Pflanze zeigten Blätter der Pflanze 253.5 (pGFPBAR/p5UT3) ein signifikant reduziertes Gesamtchlorophylle/Gesamtcarotinoide-Verhältnis. Verglichen mit der mittleren Gesamtcarotinoidkonzentration nicht-transgener Kontrollen wies diese Pflanze 22 % mehr Carotinoide auf. Der Anstieg ist vor allem auf eine um 46 % erhöhte Luteinkonzentration zurückzuführen. Die β-Carotinkonzentration war hingegen um 35 % geringer. Bei der Berechnung dieser Konzentrationen wurden die Schwankungen der Pigmentkonzentrationen innerhalb der T0 ausgeglichen, indem sie rechnerisch auf gleiche Gesamtchlorophyllkonzentrationen bezogen wurden. Doch gerade aufgrund dieser Schwankungen (vgl. 3.3.11.1) sollten diese Ergebnisse nicht überbewertet werden. In dieser Pflanze waren alle Gene (tom5, bar, gfp) der beiden zum Beschuss eingesetzten Plasmide via Southern blot-Analyse nachgewiesen worden. Die Expression des bar- und des gfp-Gens konnte ebenfalls gezeigt werden. Das Violaxanthin/Neoxanthin zu Lutein-Verhältnis dieser Pflanze ließ sich nicht signifikant von dem der nicht-transgenen T0-Kontrollpflanzen unterscheiden. Interessanterweise war bei einer der transgenen Nachkommen dieser Pflanze (253.5/2, pGFPBAR/p5UT3) das Gesamtchlorophylle/ Gesamtcarotinoide-Verhältnis gegenüber den nicht-transgenen T1-Kontrollen signifikant erhöht. Diese Pflanze war wie ihre Mutter in der Southern blot-Analyse auf tom5, bar und gfp positiv getestet worden und zeigte bar- und gfp-Expression. 253.5/2 war jedoch selbststeril. Alle anderen Nachkommen der Pflanze 253.5 waren fertil. Leider konnte nicht geklärt werden, ob 253.5/2 homozygot für das tom5-Gen war und damit das Fremdgen besonders stark exprimiert worden war. In der Publikation von Burkhardt et al. (1997) wird berichtet, dass nur 54 % der erhaltenen transgenen Reispflanzen, in die ein Phytoensynthasegen aus Narcissus pseudonarcissus übertragen worden war, fertil waren. Sie spekulierten, dass die Kombination des CaMV 35S-Promotors mit der Phytoensynthase-cDNA möglicherweise zu pleiotropischen Effekten führte, die in eine reduzierte Fertilität mündeten. Busch et al. (2002) beobachteten an Tabakpflanzen, die ein vom 35S-Promotor gesteuertes psy-Gen aus Tabak überexprimierten, eine deutliche Reduzierung der Wuchshöhe und starke Abnormitäten der Blattmorphologie sowie eine signifikante Reduzierung der Chlorophyllkonzentration. Des weiteren akkumulierten die Pflanzen Phytoen und Lycopin. Das Gen stark exprimierende Pflanzen wiesen darüber hinaus eine reduzierte Blütenbildung auf. Eine Beeinflussung des Carotinoidhaushaltes durch eine Phytoensynthasegenüberexpression kann unter anderem zu einem Mangel an Gibberellinen und damit zu einem dwarf-Phänotyp der betroffenen Pflanze führen. Transgene Tomaten, die ein fruchtspezifisches Phytoensynthasegen unter Kontrolle des CaMV 35S-Promotors überexprimierten, waren im Habitus gestaucht. Dieses Phänomen war begleitet von einem reduzierten Gibberellinsäurespiegel und einer verringerten Chlorophyllkonzentration, sowie einer Akkumulation von Phytoen und Lycopin (Fray et al., 1995). Interessante Ergebnisse lieferten

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auch die Untersuchungen von Burkhardt et al. (1997): Die vom 35S-Promotor gesteuerte Expression eines Phytoensynthasegens aus Narcissus pseudonarcissus in transgenem Reis führte nur in zwei von elf Fällen zu einer erhöhten Phytoenkonzentration. Ein dwarf-Phänotyp trat bei keiner der transgenen Pflanzen auf. Bei keiner aus der vorliegenden Arbeit hervorgegangenen transgenen Weizenpflanzen, die ein Phytoensynthasegen unter Kontrolle des Ubiquitin-Promotors besaßen, konnte eines der zuvor genannten Symptome zweifelsfrei einer Nutzgenexpression zugeordnet werden. Auch die Sterilität war ja kein für transgene Pflanzen typisches Phänomen, sondern war auch bei nicht-transgenen Kontrollpflanzen aufgetreten (vgl. 4.2.7). Die Ursachen hierfür können auf unterschiedlichen Ebenen gesucht werden: Möglicherweise war die Expression des Gens auch trotz der MARs zu schwach, als dass ein Effekt mit den angewendeten Techniken hätte erfasst werden können. Führt man den großen Komplex der Fremdgenstilllegung als Argument an, so drängt sich die Frage auf, weshalb nur das Nutzgen, nicht jedoch gfp- oder bar-Gen betroffen sind? Wie schon im vorherigen Kapitel angesprochen kann die Stilllegung ganz spezifisch nur eines der Fremdgene betreffen (Cannell et al., 1999). Alvarez et al. (2000) hatten HMW-GS (high molecular-weight seed glutenin subunit protein) -Gene in Weizen übertragen und mussten überrascht feststellen, dass in manchen Linien zwar das Fremdgen exprimiert wurde, die endogenen HMW-GS-Gene jedoch teilweise und in zwei Linien sogar vollständig stillgelegt worden waren. Ebenfalls bei Experimenten mit HMW-GS-Genen an Weizen wurde eine verminderte Expression sowohl des Fremd- als auch des endogenen HMW-GS-Gens festgestellt (Blechl und Anderson, 1996). In diesem Fall handelte es sich vermutlich um eine Cosuppression also um eine Homologie-abhängige Genstilllegung (Meyer and Saedler, 1996). Auch das signifikant erhöhte Gesamtchlorophylle/Gesamtcarotinoide-Verhältnis bei der aus der vorliegenden Arbeit stammenden Weizenpflanze 253.5/2 könnte mit einem solchen Cosuppressionseffekt erklärt werden. Belegt werden konnte diese Vermutung jedoch nicht, da Nachweise für die Genexpression auf RNA-Ebene fehlten. Alles in allem kann man aber sagen, dass das komplexe und große Weizengenom wohl besonders anfällig für die Stilllegung von Fremdgenen zu sein scheint (zum Beispiel: Patnik und Khurana, 2001). Neben Schwierigkeiten bei der Gewebekultur und der Transformation ist dies ein weiterer Grund, weshalb Weizen unter den Gentechnologen als schwieriges Objekt eingestuft wird. In 4.2.7 wurde bereits kurz auf das Phänomen der verzögerten Seneszenz hingewiesen. An dieser Stelle soll hierzu der Versuch eines Erklärungsansatzes angeboten werden: Es ist bekannt, dass Carotinoide aufgrund ihrer Schutzfunktion vor photooxidativ bedingten Schädigungen für photosynthetisch aktive Membranen unersetzlich sind (zusammengefasst in Frank und Codgell, 1996). Von Lintig et al. (1997) entdeckten, dass das psy-mRNA-Niveau durch Licht unterschiedlicher Qualitäten gesteigert und dies durch das Phytochromsystem kontrolliert worden war. Der Anstieg an Carotinoiden verläuft dabei koordiniert mit einer Zunahme des Chlorophyllgehaltes ab. In vielen Pflanzen steigt der Gesamtxanthophyllgehalt unter Starklichtbedingungen an, wobei das Verhältnis zwischen Lutein und den Xanthophyll-

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Zyklus-Komponenten Zeaxanthin, Antheraxanthin und Violaxanthin abnimmt (Hirschberg, 2001). Ergebnisse von Lu et al. (2001) weisen darauf hin, dass der Xanthophyll-Zyklus während der Seneszenz eine Rolle bei der Ableitung übermäßiger Lichtenergie vom Photosystem II spielt. Bei der Seneszenz von Fahnenblättern des Weizens, die nicht vor dem 20. Tag nach der Blüte beginnt, fallen die Konzentrationen von β-Carotin und Neoxanthin gleich wie die Chlorophylle ab, während der Gehalt an Lutein und den Pigmenten des Xanthophyll-Zyklus davon wenig betroffen ist (Lu et al., 2001). Es wäre nicht verwunderlich, wenn ein Eingriff, wie die in der vorliegenden Arbeit angestrebte ubiquitäre Überexpression eines Phytoensynthasegens in den Carotinoidhaushalt, sich auch auf die Seneszenz der betroffenen Pflanze auswirkt. Untersuchungen zum Abscisinsäure- und Gibberellingehalt der transgenen T0- und T1-Weizenpflanzen waren an den zu geringen Mengen an zur Verfügung stehendem Pflanzenmaterial gescheitert. Die Analyse soll mit T2-Pflanzen erneut angegangen werden. Die genaue regulatorische Wirkung der Xanthophylle auf die Mechanismen der Blattseneszenz ist bisher nicht erforscht. In weiterführenden Experimenten könnten die aus dieser Arbeit hervorgegangenen Seneszenz-verzögerten Pflanzen möglicherweise bei der Beantwortung dieser Frage hilfreich sein. Ein zweiter Erklärungsansatz kann unter Berücksichtigung des Ubiquitin-Promotors wie folgt gestaltet sein: Garbarino et al. (1995) übertrugen einen mit der proteinkodierenden Region des uidA-Gens fusionierten Ubiquitin-Promotor aus der Kartoffel in Kartoffeln. Sie konnten während der Seneszenzphase der Blätter eine besonders hohe Expression feststellen. Diese Ergebnisse stimmen mit der Erwartung überein, dass Ubiquitin während der Seneszenz und der Stressreaktion bei Pflanzen eine Rolle spielt (zusammengefasst in Belknap und Garbarino, 1996). Vor diesem Hintergrund ist es nicht auszuschließen, dass das Phytoensynthasegen unter Kontrolle des Ubiquitin-Promotors beim Einsetzen der Seneszenz transgener Weizenpflanzen über seine konstitutive Basisexpression hinausgehend induziert wird und entweder über die schon angesprochene Rolle der Xanthophylle während dieser Phase oder über einen Cosuppressionseffekt ein Hinauszögern der Seneszenz bewirken kann. In unabhängig voneinander transformierten Tomaten führte das gleiche psy-Genkonstrukt in manchen Pflanzen zu Phänomenen, die sich durch Überexpression, in anderen Pflanzen jedoch zu Phänomenen, die sich nur mit einem Cosuppressionseffekt erklären lassen (Fray et al., 1993). Das Phytoensynthasegen unter Kontrolle des Gliadin-Promotors In einer der Proben mit transgenen Karyopsen konnte β-Carotin nachgewiesen werden. Die Konzentration betrug 4,6 µg/g. Auffällig war, dass diese Pflanze eine vom Gliadin-Promotor gesteuerte Nutzgenkassette hatte. Die anderen transgenen Pflanzen, die untersucht worden waren, trugen Ubiquitin-Promotor gesteuerte Nutzgenkassetten. Die ermittelten Pigmentverhältnisse dieser Pflanze unterschieden sich nicht signifikant von den Kontrollen. Die gemessene β-Carotin-Konzentration ist gering, so dass sie möglicherweise nur auf eine

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Schwankung der Einzelmessung und nicht auf eine Nutzgenaktivität zurückgeht, auch, wenn bei den nicht-transgenen Kontrollen kein β-Carotin gefunden werden konnte. Burkhardt et al. (1997) erhielten durch die endospermspezifische Expression eines Phytoensynthasegens aus Narcissus pseudonarcissus eine Akkumulation von Phytoen im sonst carotinoidfreien Reisendosperm. In Raps mündete die endospermspezifische Überexpression eines bakteriellen Phytoensynthasegens (ergänzt durch ein funktionelles, pflanzliches Signalpeptid) zu einer 50fachen Erhöhung des Carotinoidgehaltes (Shewmaker et al. 1999). An psy-überexprimierenden Karotten wurde eine Verfünffachung des Carotinoidgehaltes in der Wurzel beobachtet (Hauptmann et al., 1997). Betroffen waren vor allem Lycopin, α-Carotin, β-Carotin und Phytoen. In Tabak führte die psy-Überexpression in Blättern zu einem Anstieg der β-Carotin- und Xanthophyllkonzentration. Ebenso akkumulierten diese Pflanzen Phytoen (Busch et al., 2002). Die Überexpression des fruchtspezifischen psy1-Gens aus der Tomate zog eine 1,5-2fache Erhöhung der Phytoen- und Lycopinkonzentration nach sich (Fray et al. 1993). All diesen Arbeiten ist gemein, dass Phytoen als Folge der psy-Überexpression akkumuliert wird. Phytoen konnte in der vorliegenden Arbeit in Karyopsen nicht nachgewiesen werden. Möglicherweise war die Expression zu schwach, und die stationäre Konzentration zu gering, um sie mit der eingesetzten Menge an Pflanzenmaterial nachweisen zu können. Vielleicht könnte ein starker, induzierbarer Promotor hier einen Ansatzpunkt zur Klärung liefern. Quantitativ verwertbare Daten über die Stärke des verwendeten Gliadin-Promotors in Weizen auf Basis quantitativer Reportergenexperimente liegen nicht vor. Muhitch und Shatters (1998) beobachteten im Endosperm beschossener Maiskörner eine transiente Expression des durch den Ubiquitin-Promotor gesteuerten uidA-Gens. Eigene Ergebnisse zeigten, dass der Gliadin- ebenso wie der Ubiquitin-Promotor (Abb. 47 b) in der Lage war, das uidA-Gen im Weizenendosperm transgener Pflanzen zur stabilen Expression zu bringen. Bisher war nur über eine transiente GUS-Aktivität von Gliadin-Promotor-uidA- und Ubiquitin-Promotor-uidA-Konstrukten im Weizenendosperm berichtet worden (Iser, 1995). Man darf in diesem Zusammenhang nicht vergessen, dass die HPLC-Analyse für die Messung einzelner Karyopsen zu unempfindlich ist. Beim Einsatz mehrerer Karyopsen kann man in der T1-Generation in der Regel nicht davon ausgehen, dass diese Karyopsen alle auch transgenes Endosperm aufweisen. Nur bei homozygoten Linien könnte eine ausreichend große Menge an nahezu gleichstark tom5-exprimierenden Karyopsen bereitgestellt werden, um mit der HPLC-Analyse reproduzierbare Resultate erzielen zu können. Burkhardt et al. (1997) setzten zum Beispiel 50 reife Reiskörner für ihre HPLC-Analysen ein und fanden darin (bezogen auf das Trockengewicht) 0,74 µg/g Phytoen.

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4.3.4 Matrix-Anheftungsstellen (MARs). Auswahl der Sequenzen und Einfluss auf die Genexpression

Pflanzen die unabhängig voneinander mit dem gleichen DNA-Konstrukt transformiert wurden, zeigen eine große Variabilität in der Expression des Fremdgens, was häufig über die Position der Fremdgenintegration ins Wirtsgenom begründet wird (Abranches et al., 2000). Diese Positionseffekte spiegeln den Einfluss der DNA-Umgebung und der Chromatinstruktur, welche unmittelbar mit der DNA-Organisation im Zellkern zusammenhängt, wider. Untersuchungen über die Integrationsstellen von Fremdgenen im Weizengenom, die von Abranches et al. (1998 und 2000) durchgeführt wurden, zeigten folgende Ergebnisse: a) die Integrationsstellen, die im Metaphase-Chromosom weit auseinanderliegen (> 1 Mbp), befinden sich im Interphase-Zellkern in enger physikalischer Nähe; b) die Konfiguration der Fremdgenloci legt nahe, dass während dieser Zellkernphase das Integrationsereignis einzuordnen ist; c) diese räumliche Nähe während der Interphase könnte auch die Paarung der homologen Fremdgensequenzen und damit die Genstilllegung einleiten oder die Methylierung fördern. All die genannten Punkte implementieren einen hohen Grad an reproduzierbaren Organisationsstrukturen der Interphase-Chromosomen und zeigen die Bedeutung der Chromatinorganisation auf allen Stufen der Expressionsregulation. MARs tragen dazu bei, dass während der Replikations- und Transkriptionsabläufe im eukaryotischen Interphase-Zellkern die notwendige Präzision gewährleistet wird. Sie verdanken dies ihrer Bindungsfähigkeit zu der filamentösen, proteinhaltigen Kernmatrix (Mirkovitch et al., 1984). Deshalb ist der Einsatz der Matrix-Anheftungsstellen in der vorliegenden Arbeit berechtigt. In zahlreichen Arbeiten wurde der Einfluss von MARs auf die Expressionsstärke von Fremdgenen und die Schwankung der Expressionsstärke zwischen einzelnen Transformanten untersucht (zusammengefasst in Holmes-Davis und Comai, 1998; Allen et al., 2000). Der Effekt der MARs auf die Expressionsstärke eines von ihnen beeinflussten Gens bewegte sich bei Agrobakterien-vermitteltem Gentransfer zwischen dem 2 und 10fachen, bei mittels Partikelbeschuss erzeugten transgene Pflanzen zwischen dem 2 und 60fachen. Verglichen wurde immer mit Kontrollpflanzen, die das entsprechende Gen ohne MARs enthielten (Allen et al., 2000). Transgene Reispflanzen, in denen das übertragene uidA-Gen von MARs aus Tabak flankiert wurde zeigten eine bis zu 6,5fach stärkere GUS-Aktivität als die Kontrollpflanzen, die diese Matrix-Anheftungsstellen nicht besaßen (Cheng et al. 2001). Bieri et al. (2000) übertrugen ein von Tabak-MARs flankiertes Gen für ein ribosomeninaktivierendes Protein aus der Gerste in Weizen. Sie wiesen in dieser Arbeit darauf hin, dass die stabile Expression des Gens über vier Generationen möglicherweise mit dem Einfluss der MARs zusammenhängen könnte. Das „loop domain“-Modell unterstützt die Annahme, dass MARs als Bindungselemente fungieren, um so den Einfluss umliegender regulatorischer Elemente auf das Fremdgen zu reduzieren oder es vor einer Ausbreitung der

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Chromatinkondensation in seine Domäne zu schützen (Allen et al., 2000). Die Chromatinkondensation wiederum ist ein grundlegender Faktor bei der transkriptionellen Genstilllegung. Verursacht wird die Kondensation durch Histondeacetylasen, deren Bildung mit der Methylierung von DNA-Sequenzen ursächlich zusammenhängt (van Blockland et al., 1997; Wade et al., 1998). Dass die Genstilllegung übertragener Gene auch beim Weizen auf Methylierungseffekte zurückgehen kann, wurde durch Experimente mit transformierten Protoplasten bewiesen (Müller et al., 1996). In diesem Zusammenhang erscheint die Bedeutung der MARs sehr komplex zu sein. MARs schützen offensichtlich nicht gegen posttranskriptionelle Genstilllegung (Vaucheret et al., 1998) und bewahren wohl auch nicht vor trans-Inaktivierungen, wie sie von Sequenzhomologien verursacht werden können (Allen et al., 2000). Alvarez et al. (2000) übertrugen Gene für hochmolekulare Gluteninuntereinheiten (HMW-GS) in Weizen (T. aestivum cv. ‘Federal‘). Vier von sechs transgenen Linien exprimierten zwar das übertragene 1Ax1-Gen, das endogene 1Ax2-Gen hingegen wurde stillgelegt. Solche Cosuppressionsphänomene gehören zu Gruppe der posttranskriptionellen Genstilllegungen (van Blokland et al., 1997) und könnten durch den Einsatz der MARs nach gegenwärtigen Kenntnissen nicht verhindert werden. Gegen transkriptionelle Genstilllegung, die durch cis-Interaktionen zwischen Sequenzwiederholungen von mehreren Fremdgenkopien bedingt werden, können MARs ihre Wirkung entfalten (Allen et al., 2000). In der vorliegenden Arbeit wurden die das Alkoholdehydrogenase1-F-Gen aus Zea mays L. flankierenden Matrix-Anheftungsstellen 5zMAR und 3zMAR (Avramova et al., 1995) verwendet. Der Einfluss der angesprochenen MARs sollte auf die Expressionsstärke eines flankierten uidA-Gens zunächst in transgenen Tabakpflanzen (Pisch, 2000) untersucht werden. In diesen Experimente stellte sich heraus, dass die MARs flankierten uidA-Gene zu einer 10fach stärkeren spezifischen GUS-Aktivität führten als entsprechende uidA-Konstrukte ohne MARs. Aufgrund dieser vielversprechend Ergebnisse, sollte die Auswirkung dieser MARs dann auch in transgenen Weizenpflanzen (vorliegende Arbeit) untersucht werden. Nach der ursprünglichen Planung sollten die MARs das zu übertragende Nutzgen flankieren und dessen Expressionsverhalten verbessern. Wie sich im Verlauf der Experimente zeigte, war eine Nutzgenexpression, wenn vorhanden, nicht zweifelsfrei zu erfassen und somit eine eventuelle Wirkung der MARs nicht zu bewerten. Die Wirkung der Matrix-Anheftungsstellen in Weizen sollte daher in Kombination mit einem Reportergensystems bewertet werden. Für diese Versuche wurde ein Übertragungsvektor konstruiert, der ein MARs-flankiertes uidA-Gen unter Kontrolle des Ubiquitin-Promotors enthielt. Dieses Plasmid wurde mit der Partikelbeschusstechnik in Cotransformationsexperimenten zusammen mit pGFPBAR übertragen. Ebenso wurde versucht das Plasmid puidA, das ein chimäres uidA-Gen, jedoch ohne Matrix-Anheftungsstellen, besaß, in Weizen zu übertragen. Die Experimente waren eine Weiterentwicklung der UE-Strategie mit pGFPBAR. Die Beobachtung der GFP-Fluoreszenz wurde nun dazu benützt, nur Embryonen weiter zu kultivieren, die eine transiente gfp-

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Expression zeigten. Nach vier Wochen Kalluskultur wurden nur Kalli zur Regeneration gebracht, die gfp-exprimierende Kallusbereiche aufgewiesen hatten. Auch diese Arbeiten konnten jetzt unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Insgesamt wurden 293 unreife Embryonen mit der Plasmidkombination p5’uidA3’/pGFPBAR beschossen. Acht transgene Pflanzen konnten über Southern blot-Analysen gefasst werden, was einer Transformationsrate von 2,73 % entsprach. Mit der Kombination puidA/pGFPBAR konnte nach Partikelbeschuss von 246 Embryonen nur eine transgene Pflanze ermittelt werden, was einer Transformationsrate von 0,41 % entsprach. Sieben der acht p5’uidA3’ exprimierten das uidA-Gen. Die einzige Pflanze mit puidA zeigte keine spezifische GUS-Aktivität. Voraussetzung für eine Quantifizierbarkeit der spezifischen GUS-Aktivität der betroffenen Weizenpflanzen ist die Güte des GUS-Tests. Hierzu wurden drei unterschiedliche Versuche durchgeführt: Es wurde die Genauigkeit der Proteinkonzentrationsbestimmung durch Aliquotierung eines Proteinrohextraktes und anschließender Konzentrationsbestimmung mittels Bradford-Test untersucht. Die Reproduzierbarkeit des GUS-Tests wurde bewertet, indem ein Proteinrohextrakt portioniert und mit den Aliquots unabhängige GUS-Tests durchgeführt wurden. Die Schwankung zwischen unabhängig voneinander durchgeführten GUS-Tests aus verschiedenen Proben eines Blattes wurden ebenfalls betrachtet. Die ermittelten Ergebnisse ließen hierbei die Aussage zu, dass die erhaltenen Unterschiede zwischen uidA-exprimierenden Pflanzen mit MARs und solchen ohne MARs tatsächlich aussagekräftig sind. Durchschnittlich war die GUS-Aktivität bei transgenen Pflanzen, die mit einem von Matrix-Anheftungsstellen flankierten uidA-Gen transformiert worden waren, mehr als doppelt so hoch als bei den von Fettig (1999) und Iser et al.(1999) stammenden Pflanzen ohne MARs. Ein Vergleich mit anderen Arbeiten, die sich mit der Wirkung von MARs auf die Fremdgenexpression befassen, gestaltet sich extrem schwierig, da die Experimente mit den unterschiedlichsten Pflanzen, Promotoren und MARs durchgeführt worden waren. Allen et al. (2000) bieten einen guten Überblick über bisher veröffentlichte „MARs-Arbeiten“. Die in den eigenen Experimenten verwendeten MARs aus Zea mays L. wurden bisher nur in Tabak auf ihre expressionssteigernde Funktion hin überprüft (Pisch, 2000). Die Untersuchungen ergaben, wie schon erwähnt, eine Verzehnfachung der GUS-Aktivität, gegenüber GUS-positiven Pflanzen bei denen das übertragene uidA-Gen nicht von MARs flankiert war. Die erzielten Ergebnisse mit dem Reportergen uidA, sowohl in Tabak als auch in Weizen, deuten das Potential der MARs zur Expressionssteigerung auch von Nutzgenen an.

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4.4 SCHLUSSFOLGERUNGEN UND AUSBLICK Aus den bisher in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnissen können folgende Schlussfolgerungen gezogen werden: 1. Durch die Integration des GFP-Systems in die zuvor etablierte Methode der

Weizentransformation für das agronomisch relevante Kultivar ‘Combi‘ (Viertel et al., 1998; Iser et al., 1999) konnte das bisher verwendete, auf dem uidA-Gen basierende System ersetzt werden. Der Vitalmarker GFP ermöglichte neben einer einfachen optischen Beurteilung der Beschusseffizienz ohne den Verlust des untersuchten Materials, der sonst 25 bis 50 % ausgemacht hatte, auch eine nahezu lückenlose Beobachtung der gfp-Expression. Diese Veränderungen schlugen sich vor allem in einer deutlichen Arbeitsersparnis nieder.

2. Die Entscheidung, statt weiterhin drei Wochen alte embryogene Scutellarkalli nun vier bis sechs Tage alte unreife Embryonen als Zielobjekt für den Partikelbeschuss zu verwenden, führte neben einer 9fach höheren Transformationsrate auch zu einer Verkürzung der Gewebekulturphase um zwei Wochen.

3. Die naheliegende Konsequenz, GFP neben seiner Funktion als Reportergen parallel zum selektierbaren Marker PAT zum Screening einzusetzen, erbrachte eine nochmalige Erhöhung der Transformationsrate um das Zweieinhalbfache, wobei auch der Arbeitsaufwand während der Gewebekulturphase weiter verringert werden konnte. Nach zweimaligem GFP-Screening (vgl. Abb. 49) mussten bei der verbesserten UE-Strategie mit GFP, verglichen mit der UE-Strategie mit GFP, durchschnittlich nur noch ein Viertel der Kalli auf Regenerationsmedium überführt werden.

4. HPLC-Analysen von Blättern transgener Weizenpflanzen deuteten eine Beeinflussung des Carotinoidhaushaltes durch das übertragene Ubiquitin-Promotor gesteuerte tom5-MARs-Genkonstrukt an. Das Längenwachstum transgener Pflanzen war davon unbeeinflusst. Anders als bei Tabak (Busch, 2000) oder Tomaten (Fray et al., 1995) hatte eine ubiquitäre Überexpression eines Phytoensynthasegens auch in Reis keinen Effekt auf das Längenwachstum der Pflanzen (Burkhardt et al., 1997). Möglicherweise deutet dies darauf hin, dass in Monocotyledonen die Regulation der Gibberellinsynthese und die physiologische Wirkung der Gibberelline sich von der in Dicotyledonen unterscheidet.

5. Obwohl (oder gerade weil?) das Substrat der Phytoensynthase auch im Endosperm des Weizens vorhanden ist (Chen und Geddes 1945), zeigten HPLC-Analysen transgener Weizenpflanzen dort weder einen veränderten Phytoen- noch Carotinoidspiegel. Im natürlicherweise carotinoidfreien Reisendosperm zog die endospermspezifische Expression eines Phytoensynthasegens eine Akkumulation von Phytoen nach sich (Burkhardt et al., 1997). Die ermittelten Pigmentkonzentrationen lagen teilweise am Rande der Messbarkeit. Deshalb wird angestrebt, durch Erzeugung homozygoter Weizenlinien die

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Vorraussetzung dafür zu schaffen, dass eine deutlich größere Menge an Karyopsen für die HPLC-Analyse zur Verfügung gestellt werden kann. Dies ist notwendig, um reproduzierbare HPLC-Ergebnisse über die Carotinoidzusammensetzung im Weizenendosperm erhalten zu können. Ferner ist zu diskutieren, ob in Weizen weitere Gene, die für entsprechende Enzyme der β-Carotinsynthese codieren, übertragen werden sollten, um den verzweigten Biosyntheseweg der Carotinoide in Richtung der β-Carotinsynthese zu „zwingen“.

6. Mit den angesprochenen homozygoten, transgenen Linien sollen dann auch Untersuchungen zum Abscisinsäure- und Gibberellingehalt durchgeführt werden, die möglicherweise zur Klärung des Verzögerte-Seneszenz-Phänomens beitragen können.

7. Die das uidA-Gen flankierenden MARs aus Mais führten in Weizen zu einer Verdoppelung der GUS-Aktivität verglichen mit einem chimären uidA-Gen ohne MARs.

Die ersten Ergebnisse zur Überexpression des Phytoensynthasegens in Weizen sind vielversprechend und deuteten auf eine Reihe von Aspekten hin, die es wert sind, in homozygoten Nachkommenpflanzen noch weiter untersucht zu werden. Auch sollte die Expression des Phytoensynthasegens auf RNA-Ebene, zum Beispiel über Northern blot-Analysen, bewiesen werden. Diese weiterführenden Analysen würden auch dazu dienen, die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse auf eine umfangreichere Datenmenge und damit zuverlässigere Basis zu stellen. Fasst man alle Cotransformationsversuche zusammen, so fanden sich bei 44 % der transgenen Weizenpflanzen Gene von beiden Plasmiden. Eine unabhängige Segregation der beiden Plasmide in der T1-Generation konnte nicht gefunden werden. Um die Cotransformationsrate zu steigern, wäre es sinnvoll, dass jedes Plasmid nur eines der beiden zur Selektion einsetzbaren Gene bar oder gfp beinhalten würde. Bei kombinierter Selektion wäre dann die Wahrscheinlichkeit sehr groß, dass sich Gene beider Plasmide in der transgenen Pflanze befinden. Die Southern blot-Analysen belegten, dass immer beide Gene, die auf einem Plasmid vereinigt waren, auch ins Genom der Weizenpflanzen integriert worden waren. Die in dieser Arbeit erreichte Optimierung des Weizentransformationssystems ermöglicht die Produktion einer großen Anzahl an unabhängig voneinander transformierten Pflanzen, wobei der Arbeitsaufwand gegenüber dem bisher verwendeten System deutlich geringer ist. Somit könnten nun auch Projekte, die unter Umständen an der zu geringen Anzahl an erhaltenen transgenen Pflanzen „gescheitert waren“, erneut aufgegriffen werden. Die größten Probleme bei der Transformation auch von landwirtschaftlich bedeutsamen Weizenkultivaren wie zum Beispiel ‘Combi‘ scheinen überwunden zu sein. Es ist daher zu hoffen, dass sich in Zukunft die Bedeutung des Weizens als eine der wichtigsten Pflanze für die menschliche Ernährung auch an seiner Präsenz innerhalb der gentechnisch optimierten Pflanzen widerspiegelt.

ZUSAMMENFASSUNG ___________________________________________________________________________

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5 ZUSAMMENFASSUNG Ziel der vorliegenden Arbeit war es, durch die Übertragung eines Phytoensynthasegens in die agronomisch relevante deutsche Sommerweizenvarietät ‘Combi‘ (Triticum aestivum L. cv. ‘Combi‘) die Carotinoidbiosynthese des Weizens zu beeinflussen. Hierzu sollten chimäre Gene mit den proteincodierenden Regionen der fruchtspezifischen Phytoensynthasegene psy1 aus Paprika (Capsicum annuum) und ptom5 aus der Tomate (Lycopersicon esculentum) mittels der Partikelbeschusstechnik übertragen werden. Das Enzym Phytoensynthase katalysiert aus zwei Einheiten Geranylgeranylpyrophosphat Phytoen und somit die erste spezifische Carotinoidbiosynthesereaktion. Von der Schlüsselposition, die die Phytoensynthase besetzt, zweigen nicht nur Synthesewege zu den Carotinoiden und zur Abscisinsäure, sondern auch zum Phytol, den Plastochinonen und Gibberellinen ab. Durch die Wahl geeigneter Promotoren, die die Expression der Phytoensynthasegene steuern sollten, wurden zwei Zielsetzungen verfolgt: Der aus Weizen stammende Gliadin-Promotor sollte zu einer endospermspezifischen Expression des Phytoensynthasegens und damit zu einer Akkumulation von Carotinoiden im Korn führen. Dieser Ansatz berücksichtigte über die humanphysiologische Wirksamkeit der Carotinoide ernährungsphysiologische und medizinische Aspekte. Durch die Kontrolle des Mais Ubiquitin-Promotors sollte eine starke, konstitutive Expression des Phytoensynthasegens in der gesamten Weizenpflanze gewährleistet werden. Dieser Ansatz zielte auf die Schlüsselposition der Phytoensynthase im Metabolismus der Pflanze ab und sollte die Möglichkeiten zur Beeinflussung der Gibberellin- und Abscisinsäuresynthese in der betroffenen Weizenpflanzen evaluieren. Ein solcher Eingriff könnte sich letztlich in einer Stauchung der Sprossachse und damit in einer verbesserten Standfestigkeit der häufig zum Lagern neigenden modernen Hochertragssorten niederschlagen. Nachdem geeignete Übertragungsvektoren, welche die entsprechenden chimären Genkassetten enthielten, konstruiert worden waren, wurde deren Korrektheit durch Restriktions- und Southern blot-Analysen bestätigt. Neben den bereits angesprochenen Sequenzen sollte in parallel verlaufenden Experimenten der Einfluss von flankierenden Matrixanheftungsstellen (matrix attachment regions) auf die Expression der in Weizen übertragenen Phytoensynthasegene untersucht werden. Ziel war es dabei, sowohl eine Erhöhung der Expressionsstärke als auch eine Verringerung von Homolgie-bedingten Genstilllegungseffekten zu erreichen. Als selektierbares Markierungsgen wurde das bar-, als Reportergen das uidA-Gen, beide auf einem Plasmid liegend und jeweils unter Kontrolle des Ubiquitin-Promotors stehend, verwendet.


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Die Übertragung dieses Plasmids in Kombination mit je einem der angesprochenen Nutzgen tragenden Vektoren erfolgte durch Cotransformation. Der Partikelbeschuss von embryogenem Scutellarkallus ergab sieben unabhängig voneinander transformierte Regeneratpflanzen, was einer Transformationsrate von 0,12 % entsprach. Vier transgene Pflanzen waren cotransformiert worden. Um eine ausreichend große Anzahl an transgenen Weizenpflanzen für die verschiedenen Plasmidkombinationen erhalten zu können, wurde das bestehende Transformationssystem in zwei Schritten optimiert. Zunächst wurde an Stelle des uidA-Gens das am lebenden Gewebe nachweisbare gfp-Gen gesetzt. Das durch den CaMV 35S-Promotor gesteuerte gfp-Gen diente auf transienter Ebene der Kontrolle der Beschusseffizienz. Dadurch konnten die bisher in Kauf genommenen Verluste durch den destruktiven histochemischen GUS-Test zum Nachweis der transienten uidA-Expression vermieden werden. Diese Versuche führten zu sieben weiteren transgenen Weizenpflanzen. Die Transformationsrate betrug wieder 0,12 %. Als zweiter Schritt wurde das bisherige Zielobjekt des Beschusses, der embryogene Scutellarkallus, durch vier bis sechs Tage alte unreife Embryonen ersetzt. Dadurch konnte nicht nur die Gewebekulturphase um zwei Wochen verkürzt, sondern auch die Transformationsrate um das 9fache auf 1,06 % gesteigert werden. Aus diesem Experiment gingen 57 Transgene hervor, wobei sich 21 als cotransformiert erwiesen. Die Expression des gfp-Gens konnte in jeder Entwicklungsphase und in nahezu allen Organen sowohl in Regeneratpflanzen als auch in deren transgenen Nachkommen fluoreszenzoptisch nachgewiesen werden. Western blot-Analysen stützten diese Untersuchungen. Die Expression des bar-Gens konnte ebenso wie die Expression des uidA-Gens durch entsprechende Aktivitätstests nachgewiesen werden. HPLC-Analysen hinsichtlich der Chlorophylle und verschiedener Carotinoide sowie des Phytoens wurden mit Blättern und Karyopsen von Regeneratpflanzen und deren Nachkommen durchgeführt. Die Ergebnisse deuten eine Beeinflussung des Carotinoidgehaltes durch die Übertragung eines ubiquitär exprimierten Phytoensynthasegens an. Bei der betroffenen Pflanze war das Gesamtchlorophylle/Gesamtcarotinoide-Verhältnis statistisch signifikant niedriger als bei nicht-transgenen Kontrollpflanzen, was auf einen erhöhten Carotinoidgehalt in der betroffenen Pflanze schließen lässt. Ein Nachkomme dieser Pflanze wies ein signifikant erhöhtes Gesamtchlorophylle/Gesamtcarotinoide-Verhältnis auf. Der Einfluss der Matrix-Anheftungsstellen (MARs) auf das flankierte psy-Gen konnte nicht bewertet werden. Um das Potential der MARs dennoch einschätzen zu können, wurde ein mit MARs flankiertes uidA-Gen in Weizen übertragen. Durch fluorometrische GUS-Tests konnte eine Verdoppelung der uidA-Expression bei MARs flankierten Genkassetten gegenüber MARs-freien Konstrukten nachgewiesen werden. Diese neun transgenen Pflanzen gingen aus Versuchen hervor, bei denen zum bisherigen bar-Gen basierten System zusätzlich das GFP-System zum Screening verwendet worden war. Neben einer Arbeitsersparnis in der Gewebekulturphase konnte die Transformationsrate nochmals, auf 1,7 %, gesteigert werden.


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Es wurden zahlreiche vom Wildtyp abweichende Phänotypen beobachtet. Ein direkter Zusammenhang zum übertragenen Nutzgen konnte nicht hergestellt werden. Insgesamt wurden 86 unabhängig voneinander transformierte Weizenpflanzen nachgewiesen, wobei 71 dieser transgenen Pflanzen aus Versuchen mit Phytoensynthasegenen hervorgingen. Achtundzwanzig dieser Pflanzen waren cotransformiert und enthielten auch das übertragene Phytoensynthasegen. Zehn transgene Pflanzen stammten aus Versuchen zur Etablierung des GFP-Systems. Aus den Experimenten mit den MARs und dem uidA-Gen wurden neun transgene Weizenpflanzen erhalten. Basierend auf dem bestehenden Weizentransformationssystem entstand durch den Einsatz des GFP-Systems und der Verwendung unreifer Embryonen als Zielobjekt des Partikelbeschusses ein hoch effizientes Transformationssystem. Die erwünschten Effekte des übertragenen Phytoensynthasegens wie Verzwergung oder Erhöhung des β-Carotingehaltes im Endosperm blieben zwar aus, doch sind die erhaltenen Ergebnisse zur Überexpression des Phytoensynthasegens in Weizen vielversprechend. Eine Reihe von Aspekten, vor allem das Phänomen der verzögerten Seneszenz sind es wert, mit ergänzenden Methoden weiter untersucht zu werden.

ANHANG ___________________________________________________________________________

137

6 ANHANG 6.1 Literatur Abranches, R., Beven, A.F., Aragon-Alcaide, L., and Shaw, P. (1998): Transcription sites are not correlated with chromosome territories in wheat nuclei. Journal of Cell Biology 143: 5-12. Abranches, R., Santos, A.P., Wegel, E., Williams, S., Castilho, A., Christou, P., Shaw, P., and Stöger, E. (2000): Widely seperated multiple transgene integration sites in wheat chromosomes are brought together at interphase. The Plant Journal 24(6): 713-723. Albrecht, M., Takaichi, S., Steigler, S., Wang, Z.-Y., and Sandmann, G. (2000): Novel hydroxycarotenoids with improved antioxidative properties produced by gene combination in Escherichia coli. Nature Biotechnology 18: 843-846. Allen, G.C., Hall, G.E., Childs, L.C., Weissinger, A.K., Spiker, S., and Thompson, W.F. (1993): Scaffold attachment regions increase reporter gene expression in stably transformed plant cells. The Plant Cell 5: 603-613. Allen, G.C., Spiker, S., and Thompson, W.F. (2000): Use of matrix attachment regions (MARs) to minimize transgene silencing. Plant Molecular Biology 43: 361-376. Altpeter, F., Vasil, V., Srivastava, V., Stöger, E., and Vasil, I.K. (1996a): Accelerated production of transgenic wheat (Triticum aestivum L.) plants. Plant Cell Reports 16: 12-17. Altpeter, F., Vasil, V., Srivastava, V., and Vasil, I.K. (1996b): Integration and expression of the high-molecular-weight glutenin subunit 1Ax1 gene into wheat. Nature Biotech 14: 1155-1159. Altpeter, F., Diaz, I., Macauslane, H., Gaddour, K., Carbonero, P., and Vasil, I.K. (1999): Increased insect resistance in transgenic wheat stably expressing trypsin inhibitor Cme. Molecular breeding 5: 53-63. Amoah, B.K., Wu, H., Sparks, C., and Jones, H.D. (2001): Factors influencing Agrobacterium-mediated transient expression of uidA in wheat inflorescence tissue. Journal of Experimental Botany 358: 1135-1142.

ANHANG ___________________________________________________________________________

138

Armstrong, G.A. (1994): Eubacteria show their true colors: Genetics of carotenoid pigment biosynthesis from microbes to plants. Journal of Bacteriology, 176: 4795-4802. Aryan, A.P., An, G., and Okita, T.W. (1991): Structural and functional analysis of promoter from gliadin, an endosperm-specific storage protein gene of Triticum aestivum L. Molecular General Genetics 225: 65-71 Avramova, Z., and Bennetzen, J.L. (1993): Isolation of matrices from maize leaf nuclei: identification of a matrix-binding site adjacent to the Adh1 gene. Plant Molecular Biology 22: 1135-1143. Avramova, Z., SamMiguel, P., Georgieva, E., and J.L. Bennetzen J.L. (1995): Matrix attachment regions and transcribed sequences within a long chromosomal continuum containing maize adh1. The Plant Cell 7: 1667-1680. Avramova, Z., Tikhonov, A., Chen, M., and Bennetzen, J.L. (1998): Matrix attachment regions and structural colinearity in the genomes of two grass species. Nucleic Acids Research 26: 761-767. Bader, I. (1999): Konstruktion eines Plasmids mit einem Phytoensynthase-Gen aus Paprika (Capsicum annuum L.) unter der Kontrolle des Ubiquitin-Promotors aus Mais (Zea mays L.) flankiert von Matrix-Anheftungsstellen. Diplomarbeit am Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen, Universität Hohenheim. Barro, F., Rooke, L., Békés, F., Gras, P., Tatham, A.S., Fido, R., Lazzeri, P.A., Shewry, P.R., and Barcelo, P. (1997): Transformation of wheat with high molecular weight subunit genes results in functional properties. Nature Biotechnology 15: 1295-1299. Barsby, T., Power, J.B., Freeman, J., Ingram, H.M., Liversy, N.L., Risacher, T., and Davey, M.R. (2001): Transformation of wheat. In: Bonjean A.P. and Angus W.J. (eds.) The world wheat book. Lavoisier Publishing London, Paris, New York. pp.1081-1094. Bartley, G.E., Viitanen, P.V., Bacot, K.O., and Scolnik, P.A. (1992): A tomato gene expressed during fruit ripening encodes an enzyme of the carotenoid biosythesis pathway. The Journal of Biological Chemistry 267: 5036-5039. Bartley, G.E. and Scolnik, P.A. (1995): Plant Carotenoids: Pigments for photoprotection, visual attraction, and human health. The Plant Cell 7: 1027-1038.

ANHANG ___________________________________________________________________________

139

Bailey, M. and Kaeppler, H.F. (2001): Workshop presentations from the 2000 World congress on in vitro biology. In vitro Cellular & Developmental Biology-Plant 37: 101-102. Becker, D., Brettschneider, R., and Lörz, H. (1994): Fertile transgenic wheat from microprojectile bombardment of scutellar tissue. The Plant Journal 5: 583-592. Belknap, W.R. and Garbarino, J.E. (1996): The role of ubiquitin in plant senescence and stress responses. Trends in Plant Science 1(10): 331-335. Berezney, R. and Coffey, D.S. (1974): Identification of a nuclear protein matrix. Biochemical and Biophysical Research Communications 60: 1410-1470. Bieri, S., Potrykus, I., and Fütterer, J. (2000): Expression of active barley seed ribosome-inactivating protein in transgenic wheat. Theoretical & Applied Genetics 100: 755-763. Blechl, A.E. and Anderson, O.D. (1996): Expression of a novel high-molecular-weight glutenin subunit gene in transgenic wheat. Nature Biotechnology 14: 875-879. Bliffeld, M., Mundy, J., Potrykus, I., and Fütterer, J. (1999): Genetic engineering of wheat for increased resistance to powdery mildew disease. Theoretical & Applied Genetics 98: 1079-1086. Bowen, B.A. (1993): Markers for plant gene transfer. In: Transgenic Plants Vol. 1. pp. 89-123. Academic Press, Inc. USA. Bramley, P., Teulieres, C., Blain, I., Bird, C., and Schuch, W. (1992): Biochemical characterization of transgenic tomato plants in which carotinoid synthesis has been inhibited through the expression of antisense RNA to pTOM5. The Plant Journal 2: 343-349. Britton, G. (1995): UV/Visible Spectroscopy. Carotenoids, Volume 1B: Spectroscopy, Birkhäuser Verlag Basel. Bullock, W.O., Fernandez, J.M., and Short, J.M. (1987): XL1-Blue: a high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with beta-galactosidase selection. Biotechniques 5: 374-379.

ANHANG ___________________________________________________________________________

140

Burkhardt, P.K., Beyer, P., Wünn, J., Klöti, A., Armstrong, G.A., Schledz, M., von Lintig, J., and Potrykus, I. (1997): Transgenic rice (Oryza sativa) endosperm expressing daffodil (Narcissus pseudonarcissus) phytoene synthase accumulates phytoene, a key intermediate of provitamin A biosynthesis. The Plant Journal 11: 1071-1078. Busch, M. (2001): Funktionale Analyse des Biosynthesewegs der Carotinoide in Tabak. Dissertation Universität Hohenheim. Busch, M., Seuter, A., and Hain, R. (2002): Functional analysis of the early steps of carotenoid biosynthesis in tobacco. Plant Physiology 128: 439-453.

Cannell, M.E., Doherty, A., Lazzeri, P.A., and Barcelo, P. (1999): A population of wheat

and Tritordeum transformants showing a high degree of marker gene stability and heritability.

Theoretical and Applied Genetics 99: 772-784.

Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W.W., and Prasher, D.C. (1994): Green

fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263, 802-805.

Chawla, H.S., Cass, L.A., and Simmonds, J.A. (1999): Expression of anthocyanin pigmentation in wheat tissues transformed with anthocyanin regulatory genes. Curr. Sci. 76: 1365-1370. Chen, K.T. and Geddes, W.F. (1945): Studies on the wheat pigments. In Pomeranz, Y. (ed.): Wheat: Chemistry and Technology (1988); p. 480. American Association of Cereal Chemists, Minnesota, USA. Chen, W.P., Chen, P.D., Liu, D.J., Kynast, R., Friebe, B., Velazhahan, R., Muthukrishnan, S., and Gill, B.S. (1999): Development of wheat scab symptoms is delayed in transgenic wheat plants that constitutively express a rice thaumatin-like protein gene. Theoretical & Applied Genetics 99: 755-760. Cheng, Z.Q., Targolli, J., and Wu, R. (2001): Tobacco matrix attachment region sequence increased transgene expression levels in rice plants. Molecular Breeding 7: 317-327. Chibbar, R.N., and Kartha, K.K. (1994): Transformation of plant cells by bombardment with microprojectiles. Current Topics of Plant Molecular Biology: 37-59, CRC Press, Inc.

ANHANG ___________________________________________________________________________

141

Chiu, W., Niwa, Y., Zeng, W., Hirano, T., Kobayashi, H., and Sheen, J. (1996): Engineered GFP as a vital reporter in plants. Current Biology 3: 325-330. Christensen, A.H., Sharrock, R.A., and Quail, P.H. (1992): Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Molecular Biology 18: 675-689 Christensen, A.H. and Quail, P.H. (1996): Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Research 5: 213-218. Cunningham, Jr., F.X. and Gantt, E. (1998): Genes and enzymes of carotenoid biosynthesis in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 49: 557-583. Dale, E.C. and Ow, D.W. (1991): Gene transfer with subsequent removal of the selection gene from the host genome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 88: 10558-10562. DeBlock, M., Debrouwer, D., and Moens, T. (1997): The development of a nuclear male sterility system in wheat. Expression of the barnase gene under control of tapetum specific promoters. Theoretical & Applied Genetics 95: 125-131. Ebinuma, H., Sugita, K., Matsunaga, E., and Yamakado, M. (1997): Selection of marker-free transgenic plants using the isopentenyl transferase gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94: 2117-2121. Ebinuma, H. and Komamine, A. (2001): MAT (Multi-Auto-Transformation) vector system. The oncogenes of Agrobacterium as positive markers for regeneration and selection of marker-free transgenic plants. In vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 37: 103-113. Eckes, P., Rosahl, S., Schell, J., and Willmitzer, L. (1986): Isolation and characterization of a light-inducible organ-specific gene from potato and analysis of its expression after tagging and transfer into tobacco and potato shoots. Molecular and General Genetics 205: 14-22 Elliott, A.R., Campbell, J.A., Dugdale, B., Brettell, R.I.S., and Grof, C.P.L. (1999): Green-fluorescent protein facilitates rapid in vivo detection of genetically transformed plant cells. Plant Cell Reports 18: 707-714.

ANHANG ___________________________________________________________________________

142

Fennell, S., Bohorova, N., van Ginkel, M., Crossa, J., and Hoisington, D. (1996): Plant regeneration from immature embryos of 48 elite CIMMYT bread wheats. Theoretical & Applied Genetics 92: 163-169. Fettig, S. (1999): Expression eines chimären Stilbensynthasegens in Weizen (Triticum aestivum L.). Dissertation, Universität Hohenheim, Verlag U.E. Grauer, Stuttgart. Fettig, S. and Hess, D. (1999): Expression of a chimeric stilbene synthase gene in transgenic wheat lines. Transgenic Research 8: 179-189. Folling, L. and Olesen, A. (2001): Transformation of wheat (Triticum aestivum L.) microspore-derived callus and microspores by particle bombardment. Plant Cell Reports. Published online 20 July 2001. Frank, H.A. and Codgell, R.J. (1996): Carotenoids in photosynthesis. Photochemistry and Photobiology 63: 257-264. Fraser, P.D., Kiano, J.W., Truesdale, M.R., Schuch, W., and Bramley, P.M. (1999): Phytoene synthase-2 enzyme activity in tomato does not contribute to carotinoid synthesis in ripening fruit. Plant Molecular Biology 40: 687-698. Fraser, P.D., Schuch, W., and Bramley, P.M. (2000): Phytoene synthase from tomato (Lycpersicon esculentum) chloroplasts – partial purification and biochemical properties. Planta 211: 361-369. Fray, R.G., Wallace, A., Fraser, P.D., Valero, D., Hedden, P., Bramley, P.M., and Grierson, D. (1995): Constitutive expression of a friut phytoene synthase gene in transgenic tomatoes causes dwarfism by redirecting metabolites from the gibberellin pathway. The Plant Journal 8: 696-701. Garbarino, J.E., Oosumi, T., and Beknap, W.R. (1995): Isolation of a polyubiquitin promotor and its expression in transgenic potato plants. Plant Physiology 109(4): 1371-1378. Geest A.H.M. van der and Petolino J.F. (1998): Expression of a modified green fluorescent protein gene in transgenic maize plants and progeny. Plant Cell Reports 17: 760-764. Gill, K.S., Gill B.S., Endo, T.R., and Taylor, T. (1996): Identification and high-density mapping og gene-rich regions in chromosome group 1 of wheat. Genetics 144: 1883-1891.

ANHANG ___________________________________________________________________________

143

Gleave, A.P., Mitra, D.S., Mudge, S.R., and Morris, B.A.M. (1999): Selectable marker-free transgenic plants without sexual crossing: transient expression of cre recombinase and use of a conditional lethal dominant gene. Plant Molecular Biology 40: 223-235. Goodwin, T.W. (1980): The biochemistry of the carotenoids. Vol. 1, Plants. Chapman and hall, New York. Hain, R., Reif, H.J.., Krause, E., Langebartels, R., Kindl, H., Vornam, W., Wiese, E., Schmelzer, E., Schreier, P.H., Stöcker, R.H., and Stenzel, K. (1993): Disease resistance results from foreign phytoalexin expression in a novel plant. Nature 361: 153-156 Haldrup, A., Noerremark, M., and Okkels, F.T. (2001): Plant selection principle based on xylose isomerase. In vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 37: 114-119. Han, K.-H., Ma, C., and Strauss, S.H. (1997): Matrix attachment regions (MARs) enhance transformation frequency and transgene expression in poplar. Transgenic Research 6: 415-420. Hanahan, D. (1985): Techniques for transformation of E. coli. In: Clover, D.M. (ed.): DNA cloning. 1: 109-135, IRL Press Oxford. Haseloff, J., and Amos, B. (1995): GFP in plants. Trends in Genetics 11: 328-329. Haseloff, J., Siemering, K.R., Prasher, D.C., and Hodge, S. (1997): Removal of a cryptic intron and subcellular localization of green fluorescent protein are required to mark transgenic Arabidopsis plants brightly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94: 2122-2127. Harper, B.K., Stewart Jr., C.N. (2000): Patterns of expression and fluorescence of green fluorescent protein in single transgenic plants. Plant Molecular Biology Reports 18: 141a-141i. Hauptmann, R., Eschenfeldt, W.H., English, J., and Brinkhaus, F.L. (1997): Enhanced carotinoid accumulation in storage organs of genetically engineered plants. US Patent 5,618,988. Hess, D., Dressler, K., and Nimmrichter, R. (1990): Transformation experiments by pipetting Agrobacterium into the spiklets of wheat (Triticum aestivum L.). Plant Science 72: 233-244.

ANHANG ___________________________________________________________________________

144

Hirschberg, J. (2001): Carotinoid biosynthesis in flowering plants. Current Opinion in Plant Biology 4:210-218. Iser, M. (1995): Versuche zum indirekten Gentransfer in Tabak (Nicotiana tabacum L.) und Weizen (Triticum aestivum L.). Dissertation, Universität Hohenheim und Verlag U.E. Grauer, Stuttgart. Iser, M., Fettig, S., Scheyhing, F., Viertel, K., and Hess, D. (1999): Genotype-dependent stable genetic transformation in German spring wheat varieties selected for high regeneration potential. Journal of Plant Physiology 154: 509-516. Iyer, L.M., Kumpatla, S.P., Chandrasekharan, M.B., and Hall, T.C. (2000): Transgene silencing in monocots. Plant Molecular Biology 43: 323-346. Jackson, S.A., Zhang, P., Chen, W.P., Phillips, R.L., Friebe, B., Muthukrishnan, S., and Gill, B.S. (2001): High-resolution structural analysis of biolistic transgene integration into the genome of wheat. Theoretical & Applied Genetics 103: 56-62. James, C. (2001): Global review of commercializde transgenic crops: 2001. ISAAA Briefs No. 24: Preview. ISAAA: Ithaca, New York, USA. Johnson, E.A. and Schröder, W. (1995): Microbial carotenoids. Adv Biochem. Eng. Biotechnol. 53: 119-178. Jordan, M.C. (2000): Green fluorescent protein as a visual marker for wheat transformation. Plant Cell Reports 19: 1069-1075. Kaneko, S. and Oyanagi, A. (1995): Varietal differences in the rate of esterification of endosperm lutein during the storage of wheat seeds. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59: 2312-2313. Karunaratne, S., Sohn, A., Mouradov, A., Scott, J., Steinbiss, H.H., and Scott, K.J. (1996): Transformation of wheat with the gene encoding the coat protein of barley yellow mosaic virus. Australian Journal of Plant Physiology 23: 429-435. Kilby, N.J., Snaith, M.R., and Murray, J.A.H. (1995): Site-specific recombinase: tools for genome engineering. Trends. Genet. 9: 413-421.

ANHANG ___________________________________________________________________________

145

Kleinig, H. (1989): The role of plastids in isoprenoids biosynthesis. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 40: 39-59. Kozak, M. (1986): Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell 44: 283-292. Kunkel, T., Niu, Q.W., Chan, Y.S., and Chua, N.H. (1999): Inducible isopentenyl transferase as a high-efficiency marker for plant transformtion. Nature Biotechnology 17: 916-919. Kuntz, M., Römer, S., Hugueney, P., Bouvier, F., and Camara, B. (1993): Expression of the genes encoding the early carotinoid biosynthetic enzymes in Capsicum annuum. Biochemical and Biophysical Research Communications 196: 1414-1421. Lamacchia, C., Shewry P.R., Di Fonzo, N., Forsyth, J.L., Harris, N., Lazzeri, P.A., Napier, J.A., Halford, N.G., and Barcelo, P. (2001): Endosperm-specific activity of a storage protein gene promoter in transgenic wheat seed. Journal of Experimental Botany 52: 243-250. Lazzeri, P.A. and Shewry, P.R. (1993): Biotechnology of cereals. Biotech. Genet. Engin. Rev. 11: 79-146. Leckband, G. and Lörz, H. (1998): Transformation and expression of a stilbene synthase gene of Vitis vinifera L. in barley and wheat for improved fungal resistance. Theoretical & Applied Genetics 96: 1004-1012. Lichtenthaler, H-K. (1998): The plants’ 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway for biosynthesis of isoprenoids. Fett/Lipid 100: 128-138. Lichtenthaler, H-K. (1999): The 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway of isoprenoid biosynthesis in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 50: 47-65. Liu, H.-S., Jan, M.-S., Chou, C.K., Chen, P.H., and Ke, H.J. (1999): Is green fluorescent protein toxic to the living cells? Biochemical and Biophysical Research Communications 260: 712-717.

ANHANG ___________________________________________________________________________

146

Lu, C., Lu, Q., Zhang, J., and Kuang, T. (2001): Characterization of photosynthetic pigment composition, photosystem II photochemistry and thermal energy dissipation during leaf senescence of wheat plants grown in the field. Journal of Experimental Botany 52: 1850-1810. Ludwig, S.E., Bowen, B., Beach, L., and Wessler, S.R. (1990): A regulatory gene as a novel visible marker for maize transformation. Science 247: 449-450. Lukaszewicz, M., Feuermann, M., Jerouville, B., Stas, A., and Boutry, M. (2000): In vivo evaluation of the context sequence of the translation initiation codon in plants. Plant Science 154: 89-98. Mascarenhas, D., Mettler, I.J., Pierce, D.A., and Lowe, H.W. (1990): Intron-mediated enhancement of heterologous gene expression in maize. Plant Molecular Biology 15: 913-920. McCormac, A.C., Wu, H., Bao, M., Wang, Y., Xu, R., Elliott, M.C., and Chen, D.F. (1998): The use of visual markers genes as cell-specific reporters of Agrobacterium mediated T-DNA delivery to wheat (Triticum aestivum L.) and barley (Hordeum vulgare L.). Euphytica 99: 17-25. McElroy, D., Zhang, W., Cao, J., and Wu, R. (1990): Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation. Plant Cell 2: 163-171. Mendel, R.R., Clauss, E., Hellmund, R., Steinbiss, H.H., and Tewes, A. (1990): Gene transfer to barley. In: Nijkamp, H.J.J., Van er Plas, L.H.W., and Aartrijk, J. (eds). Progress in plant cellular and molecular biology, pp. 73-78. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. Mentewab, A., Letellier, V., Marque, C., and Sarrafi, A. (1999): Use of anthocyanin biosynthesis stimulatory genes as markers for the genetic transfomation of haploid embryos and isolated microspores in wheat. Cereal Research Communications 27: 17-24. Meyer, P. and Saedler, H. (1996): Homology dependent gene silencing in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 47: 23-48. Mirkovitch, J., Mirault, M.E., and Laemmli, U.K. (1984): Organization of the higher-order chromatin loop: Specific DNA attachment sites on nuclear scaffolds. Cell 39: 223-232.

ANHANG ___________________________________________________________________________

147

Misawa, N., Masamoto, K., Hori, T., Ohtani, T., Böger, P., and Sandmann, G. (1994): Expression of an Erwinia phytoene desaturase gene not only confers multiple resistance to herbicides interfering with carotenoid biosynthesis but also alters xanthophyll metabolism in transgenic plants. The Plant Journal 6: 481-489. Muhitch, M.J. and Shatters, R.G. (1998): Regulation of the maize ubiquitin (ubi-1) promoter in developing maize (Zea mays L.) seeds examined using transient gene expression in kernels grown in vitro. Plant Cell Reports 17(6-7): 476-481. Müller, A., Iser, M., and Hess, D. (2001): Stable transformation of sunflower (Helianthus annuus L.) using a non-meristematic protocol and green fluorescent protein as a vital marker. Transgenic Research 10: 435-444. Müller, E., Lörz, H., and Lutticke, S. (1996): Variability of transgene expression in clonal cell lines of wheat. Plant Science 114: 71.82. Nehlin, L., Möllers, C., Bergman, P. and Glimelius, K. (2000): Transient β-gus and gfp gene expression and viability analysis of microprojectile bombardment microspores of Brassica napus L. Journal of Plant Physiology 156: 175-183. Nehra, N.S., Chibbar, R.N., Leung, N., Caswell, C., Mallard C., Steinhauer, L., Baga, M., and Kartha, K.K. (1994): Self-fertile transgenic wheat plants regenerated from isolated scutellar tissues following microprojectile bombardment with two distinct gene constructs. The Plant Journal 5: 285-297. Oard, J.H., Paige, D., and Dvorak, J. (1989): Chimeric gene expression using maize intron in cultured cells of breadwheat. Plant Cell Reports 8: 156-160. Odell, J.T., Nagy, F., and Chua, N. (1985): Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35 S promoter. Nature 313: 810-812. Onouchi, H., Nishihama, R., Kudo, M., Machida, Y., and Machida, C. (1995): Visualization of site-specific recombination catalyzed by a recombinase from Zygosaccharomyces rouxii in Arabidopsis thaliana. Molecular and General Genetics 247: 653-660. Ortiz, J.P.A., Reggiardo, M.I., Ravizzini, R.A:, Altabe, S.G., Cervigni, G.D.L., Spitteler, M.A., Morata, M.M., Elias, F.E., and Vallejos, R.H. (1996): Hygromycin resistance as an efficient selectable marker for wheat stable transformation. Plant Cell Reports 15: 877-881.

ANHANG ___________________________________________________________________________

148

Pang, S.Z., DeBoer, D.L., Wan, Y., Guangning, Y., Layton, J.G., Neher, M.K., Armstrong, C.L., Fry, J.E., Hinchee, M.A.W., and Fromm, M.E. (1996): An improved green fluorescent protein gene as a vital marker in plants. Plant Physiology 112: 893-900. Pardo, A.D. and Schiff, J.A. (1980): Plastid and seedling development in SAN-9789 (4-chloro-5-methylamine)-2-(a,a,a-trifluoro-m-tolyl)-3-(2H)-pyridazinone)-treated etiolated bean seedlings. Canadian Journal of Botany. 58, 25. Pastori, G.M, Wilkinson M.D., Steele, S.H., Sparks, C.A., Jones, H.D., and Parry, A.J. (2001): Age-dependent transformation frequency in elite wheat varieties. Journal of Experimental Botany 2: 857-863. Pedersen, C., Zimny, J., Becker, D., Jähne-Gärtner, A., and Lörz, H. (1997): Localization of introduced genes on the chromosomes of transgenic barley, wheat and Triticale by fluorescence in situ hybridization. Theoretical & Applied Genetics 94: 749-757. Pinzino, C., Capocchi, A., Galleschi, L., Saviozzi, F., and Zandomeneghi, B.N.M. (1999): Aging, free radicals, and antioxidants in wheat seeds. Journal of Agricultural and Food Chemistry 47: 1333-1339. Pisch, T. (2000): Konstruktion eines binären Plasmids zur Untersuchung des Einflusses von Matrix-Anheftungsstellen aus Zea mays L. auf die Expressionsstärke des uidA-Gens in transgenen Tabakpflanzen. Diplomarbeit am Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen, Universität Hohenheim. Powell Abel, P.A., Nelson, R.S., De, B., Hoffmann, N., Rogers, S.G., Fraley, R.T., and Beachy, R.N. (1986): Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene. Science 232: 738-743. Prescott, J.M., Burnett, P.A., Saari, E.E., Ransom, J., Bowman, J., de Milliano, W., Singh, R.P., and Bekele, G. (1994): Wheat diseases and pests. A guide for field identification. International maize and wheat improvement center. Mexico. Rasco-Gaunt, S., Riley, A., Barcelo, P., and Lazzeri, P.A. (1999): Analysis of particle bombardment parameters to optimise DNA delivery into wheat tissues. Plant Cell Reports 19: 118-127.

ANHANG ___________________________________________________________________________

149

Rasco-Gaunt, S., Riley, A., Cannell, M., Barcelo, P., and Lazzeri, P.A. (2001): Procedures allowing the transformation of a range of European elite wheat (Triticum aestivum L.) varieties via particle bombardment. Journal of Experimental Botany 52: 865-874. Ray, J., Bird, C., Maunders, M., Grierson, D., and Schuch, W. (1987): Sequence of pTOM5, a ripening related cDNA from tomato. Nucleic Acids Research 15: 10587. Reed, J., Privalle, L., Powell, M.L., Meghji, M., Dawson, J., Dunder, E., Suttie, J., Wenck, A., Launis, K., Kramer, C., Chang, Y.-F., Hansen, G., and Wright, M. (2001): Phosphomannose isomerase: An efficient selectable marker for plant transformation. In Vitro Cell. Dev. Biol. – Plant 37: 127-132. Sabry, S.S., Saleh, S.A., Batchelor, C.A., Jones J., Jotham, J., Webster, G., Kothari, S.L., Davey, M.R., and Cocking, E.C. (1997): Endophytic establishment of Azorhizobium caulinodans in wheat. Proceedings of the Royal Society of London 264: 341-346. Salgueiro, S., Pignocchi, C., and Parry, A.A.J. (2000): Intron-mediated expression in tritordeum and wheat resulting from particle bombardment. Plant Molecular Biology 42: 615-622. Sawant, S.V., Kiran, K., Singh, P.K., and Tuli, R. (2001): Sequence architecture downstream of the initiator codon enhances gene expression and protein stability in plants. Plant Physiology 126: 1630-1636. Scheyhing, F. (1999): Transformation von Weizen (Triticum aestivum L.) mit chimären Pilzresistenzgenen zur Verbesserung der Phytopathogenabwehr. Dissertation, Universität Hohenheim, Verlag U.E. Grauer, Stuttgart. Schledz, M., Al-Babili, S., v. Lintig, J., Haubruck, H., Rabbani, S., Kleinig, H., and Bayer, P. (1996): Phytoene synthase from Narcissus pseudonarcissus: functional expression, galactolipid requirement, topological distribution in chromoplasts and induction during flowering. The Plant Journal 10: 781-792. Schuster, C. (1995): Einfluss regulatorischer Elemente auf die Reportergenexpression in transienten Expressionssystemen, basierend auf Gewebekulturen des Weizens (Triticum aestivum L.). Dissertation, Universität Hohenheim, Verlag U.E. Grauer, Stuttgart. Sheen, J., Hwang, S., Niwa, Y., Kobayashi, H. and Galbraith, D. W. (1995): Green-

fluorescent protein as a new vital marker in plant cells. The Plant Journal 8: 777-784.

ANHANG ___________________________________________________________________________

150

Shewmaker, C.K., Sheey, J.A., Daley, M., Colburn, S., and Ke, D.Y. (1999): Seed-specific overexpression of phytoene synthase: increase in carotenoids and other metabolic effects. The Plant Journal 20: 401-412. Shlumukov, L.R., Barro, F., Barcelo, P., Lazzeri, P., and Smith, H. (2001): Establishment of far-red high irradiance responses in wheat through transgenic expression of an oat phytochrome A gene. Plant Cell and Environment 24: 703-712. Simmonds, J., Cass, L., Davidson, A., Routly, E., Donaldson, P., and Sommonds, D. (2001a): Oxalat oxidase: a novel reporter for monocot and dicot transformation. http://res2.agr.ca/ecorc/staff/simon-j.htm. Agriculture and Agri-Food Canada. Eastern Cereal and Oilseed Research Centre. Simmonds, J., Cass, L., Harris, L., and Allard, S. (2001): Isolation and chararcetrization of a cereal aleurone promoter from wheat. http://res2.agr.ca/ecorc/staff/simon-j.htm. Agriculture and Agri-Food Canada. Eastern Cereal and Oilseed Research Centre. Sims, R.P.A. and Lepage, M. (1968): A basis for measuring the intensity of wheat flour pigments. Cereal Chemistry 45: 605-611. Slater, A., Maunders, M.K., Edwards, K., Schuch, W., and Grierson, D. (1985): Isolation and characterisation of cDNA clones for tomato polygalaturonase and other ripening-related proteins. Plant Molecular Biology 5: 137-147. Smith, C.J.S., Watson, C.F., Ray, J., Bird, C.R., Morris, P.C., Schuch, W., and Grierson, D. (1988): Antisense RNA inhibition of polygalacturonase gene expression in transgenic tomatoes. Nature 334: 724-726. Soll, J. and Alefsen, H. (1993): The protein import apparatus of chloroplasts. Physiologica Plantarum 87: 433-440. Sparks, C.A., Castleden, C.K., West, J., Habash, D.Z., Madgwick, P.J., Paul, M.J., Noctor, G., Harrison, J., Wu, R., Wilkinson, J., Quick, W-P., Parry, M.A.J., Foyer, C.H., and Miflin, B.J. (2001): Potential for manipulating carbon metabolism in wheat. Annals of applied Biology 138: 33-45. Spiker, S. and Thompson, W.F. (1996): Nuclear matrix attachment regions and transgene expression in plants. Plant Physiology 110: 15-21.

ANHANG ___________________________________________________________________________

151

Srivastava, V., Vasil, V., and Vasil, I.K. (1999): Molecular characterisation of the fate of transgenes in transformed wheat (Triticum aestivum L.). Theoretical & Applied Genetics 92: 1031-1037. Srivastava, V., Anderson, O.D., and Ow, D.W. (1999): Single-copy transgenic wheat generated through the resolution of complex integration patterns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96: 1117-11121. Stewart, Jr. C.N. (2001): The utility of green fluorescent protein in transgenic plants. Plant Cell Reports 20: 376-382. Stief, A., Winter, D.M., Strätling W.H., and Sippel, A.E. (1989): A nuclear DNA attachment element mediates elevated and position-independent gene activity. Nature 341: 343-345. Stöger, E., Williams S., Christou, P., Down, Re., and Gatehouse, J.A. (1999): Expression of the insecticidal lectin from snowdrop (Galanthus nivalis agglutinin; GNA) in transgenic wheat plants: effects on predation by the grain aphid Sitobion avenae. Molecular Breeding 5: 65-73. Strauch, E., Wohlleben, W., and Pöhler, A. (1988): Cloning of a phosphinothricin N-acetyltransferase gene from Streptomyces viridochromogenes Tü494 and its expression in Streptomyces lividans and Escherichia coli. Gene 63: 65-74. Takumi, S., Otani, M., and Shimada, T. (1994): Effect of six promoter-intron combinations on transient reporter gene expression in einkorn, emmer and common wheat cells by particle bombardment. Plant Science 103: 161-166. Takumi, S. and Shimada, T. (1997): Variation in transformation frequencies among six common wheat cultivars through particle bombardment of scutellar tissues. General & Genetic Systems 72: 63-69. Takumi, S. and Shimada, T. (1996): Production of transgenic wheat through particle bombardment of scutellar tissues: frequency is influenced by culture duration. Journal of Plant Physiology 149: 418-423. Thompson, C.J., Movva N.R., Tizard, R., Crameri, R., Davies, J.E., Lauwereys, M., and Botterman, J. (1987): Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus. EMBO Journal 6: 2519-2525.

ANHANG ___________________________________________________________________________

152

Tör, M., Mantell, S.H., and Ainsworth, C. (1992): Endophytic bacteria expressing b-Glucuronidase cause false positives in transformation of Dioscorea species. Plant Cell Reports 11: 452-456. Ülker, B., Allen, G.C., Thompson, W.F., Spiker, S., and Weissinger, K. (1999): A tobacco matrix attachment region reduces the loss of transgene expression in the progeny of transgenic tobacco plants. The Plant Journal 18(3): 253-263. Uze, M, Potrykus, I, and Sautter, C. (1999): Single-stranded DNA in the genetic transformation of wheat (Triticum aestivum L.): Transformation frequency and integration pattern. Theoretical and Applied Genetics 99: 487-495. Van Blokland, R., ten Lohuis, M., and Meyer, P. (1997): Condensation of chromatin in transcriptional regions of an inactivated plant transgene: evidance for an active role of transcription in gene silencing. Molecular and General Genetics 257: 1-13. Vasil, V., Clancy, M., Ferl, R.J., Vasil, I.K., and Hannah, L.C. (1989): Increased gene expression by the first intron of maize shrunken-1 locus in grass species. Plant Physiology 91: 1575-1579. Vasil, V., Castillo, A.M., Fromm, M.E., and Vasil, I.K. (1992): Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus. Bio/Technology 10: 662-674. Vasil, V., Srivastava, V., Castillo, A.M., Fromm, M.E., and Vasil, I.K. (1993): Rapid production of transgenic wheat plants by direct bombardment of cultured immature embryos. Bio/Technology 11: 1553-1558. Vaucheret, H., Elmayan, T., Thierry, D., van der Geest, A., Hall, T., Conner, A.J., Mlynarova, L., and Nap, J.P. (1998): Flank matrix attachment regions (MARs) from chicken, bean, yaest or tobacco do not prevent homolgy-dependent trans-silencing in transgenic tobacco plants. Molecular and General Genetics 259: 388-392. Viertel, K., Iser, M., Schmid, A., and Hess, D. (1997): Indirekter Gentransfer in Weizen über isolierte Sprossspitzen. Vortr. Pflanzenzüchtung 38: 17-39. Viertel, K., Iser, M., Schmid, A., and Hess, D. (1998): Regeneration of German spring wheat varieties from embryogenic scutellar callus. Journal of Plant Physiology 152: 167-172.

ANHANG ___________________________________________________________________________

153

Von Lintig, J., Welsch, R., Bonk, M., Giuliano, G., Batschauer, A., and Kleinig, H. (1997): Light-dependent regulation of carotenoid biosynthesis occurs at the level of phytoene synthase expression and its mediated by phytochrome in Sinapis alba and Arabidopsis thaliana seedlings. The Plant Journal 12: 625-634. Wade, P.A., Gegonne, A., Jones, P.L., Ballestar, E., Aubry, I.F., and Wolffe, A.P. (1999): Mi-2 complexes couples DNA methylation to chromatin remodelling and histone deacetylation. Nature Genetics 23: 62-66. Weeks, J.T., Anderson, O.D., and Blechl, A.E. (1993): Rapid production of multiple independent lines of fertile transgenic wheat (Triticum aestivum). Plant Physiology 102: 1077-1084. Weeks, J.T., Koshiyama, K.Y., Maier-Greiner, U., Schäeffner, T., and Anderson, O.D. (2000): Wheat transformation using cyanamide as a new selective agent. Crop Science 40: 1749-1754. Weir, B., Gu, X., Wang, M.B., Upadhyaya, N., Elliott, A.R., and Brettell, R.I.S. (2001): Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of wheat using suspension cells as a model system and green fluorescent protein as a visual marker. Australian Journal of Plant Physiology 28(8): 807-818. Welsch, R., Beyer, P., Hugueney, P., Kleinig, H., and von Lintig, J. (2000): Regulation and activation of phytoene synthase, a key enzyme in carotinoid biosynthesis, during photomorphogenesis. Planta 211: 846-854. Wiese, M.V. (1986): Compendium of wheat diseases. Sec. Edition; p. 35. The American Phytopathological Society. Woolston, C.J., Barker, R., Gunn, H., Boulton, M.I., and Mullineaux, P.M. (1988): Agroinfection and nucleotide sequence of cloned wheat dwarf virus DNA. Plant Molecular Biology 11: 35-43. Wright, M., Dawson, J., Dunder, E., Suttie, J., Reed, J., Kramer, C., Chang, Y., Novitzky, R., Wang, H., and Artim-Moore, L. (2001): Efficient biolistic transformation of maize (Zea mays L.) and wheat (Triticum aestivum L.) using the phosphomannose isomerase gene, pmi, as the selectable marker. Plant Cell Reports

ANHANG ___________________________________________________________________________

154

Witrzens, B., Brettell, R.I.S., Murray, F.R., McElroy, D., Li, Z., Dennis, E.S. (1998): Comparison of three selectable marker genes for transformation of wheat by microprojectile bombardment. Australian Journal of Plant Physiology 25: 39-44. Yamashita, T., Lida, A., and Morikawa, H. (1991): Evidence that more than 90% of β-Glucuronidase-expressing cells after particle bombardment directly receive the foreign gene in their nucleus. Plant Physiology 97: 829-831. Ye, X., Al-Babili, S., Klöti, A., Zhang, J., Lucca, P., Beyer, P., and Potrykus, I. (2000): Engineering the provitamin A (β-carotene) biosynthetic patway into (carotenoid-free) rice endosperm. Science 287: 303-305. Yoder, J.D. and Goldsbrough, A.P. (1994): Transformation systems for generating marker-free transgenic plants. Bio/Technology 12: 263-267. Zeevaart, J.A.D. and Creelman, R.A. (1988): Metabolism and physiology of abscisic acid. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 39: 439-473. Zernicka-Goetz, M., Pines, J., Hunter, M.L., Dixon, J.P.C., Siemering, K.R., Haseloff, J., and Evans, M.J. (1997): Following cell fate in the living mouse embryo. Development 124: 1133-1137. Zhang, L., Rybczynski, J.J., Langenberg, W.G., Mitra, A., and French, R. (2000): An efficient wheat transformation procedure: transformed calli with long-term morphogenic potential for plant regeneration. Plant Cell Reports 19: 241-250. Zhou, H., Arrowsmith, J.W., Fromm, M.E., Hironaka, C.M., Taylor, M.L., Rodriguez, D., Pajeau, M.E., Brown, S.M., Santino, C.G., and Fry, J.E.(1995): Glyphosate-tolerant CP4 and GOX genes as a selectable marker in wheat transformation. Plant Cell Reports 15: 159-163.

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6.2 Abkürzungsverzeichnis bar Phosphinothricin-N-acetyltransferasegen bp Basenpaare BSA Rinderserumalbumin CaMV Cauliflower Mosaic Virus cv. Cultivar d Tag 2,4-D 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure DIG Digoxygenin dATP Desoxyadenosintriphosphat dCTP Desoxycytosintriphosphat E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraessigsäure gfp Gen für das green fluorescent protein GFP green fluorescent protein GUS β-Glucuronidase h Stunde kb Kilobasenpaare L. Linné L3-5 L3-Medium mit 5 µM 2,4-D M Mol pro Liter MAR Matrix-Anheftungsstelle mg Milligramm µg Mikrogramm min Minute MS Murashige-Skoog Medium MU 4-Methylumbelliferon MUG 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid PAT Phosphinothricin-N-acetyltransferase PEG Polyethylenglycol PPT Phosphinothricin (DL-Homoalanin-4-(methyl)-phosphinsäure) psi pounds per square inch psy Phytoensynthasegen PSY Phytoensynthase rpm rounds per minute RT Raumtemperatur SDS Natriumdodecylsulfat TBE Tris / Borsäure / EDTA TE Tris / EDTA Tris Tris-hydroxymethyl-aminomethan U unit uidA β-Glucuronidasegen vgl. vergleiche mit X-Gluc 5-Brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronid

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. D. Heß für die Überlassung des interessanten Themas, seine wertvollen Anregungen und Hinweise sowie die stets gewährte Unterstützung. Ganz herzlich bedanken möchte ich mich bei allen Mitarbeitern des Instituts für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen. Besonderes Dipl. Biol. K. Dressler, Dr. R. Hahn und Dipl. Biol. M. Bayer sowie Dr. S. Fettig, Universität Bayreuth, danke ich für ihre Ausdauer bei wissenschaftlichen Gesprächen und ihre stete Hilfsbereitschaft. Frau J. Babo sei für ihre exzellente und umfangreiche technische Assistenz gedankt. Ebenso Frau B. Rösing, Frau U. Glück-Behrens und Frau E. Wenzelburger für ihre Bereitschaft helfend einzuspringen, falls Not am Mann war. Ferner möchte ich mich bei Frau I. Blaich und Herrn G. Blaich sowie ihren Mitarbeiterinnen für die sehr gute Betreuung der Pflanzen im Gewächshaus bedanken. Weiterhin gilt mein Dank Prof. Dr. R. Hain/Bayer AG, Monheim in dessen Labor ich die HPLC-Analysen meiner Pflanzen durchführen konnte und Dr. M. Busch, der mich dabei unterstützt hat. Für die Überlassung von Vektoren oder anderem DNA-Material danke ich: Dr. M. E. Fromm, Monsanto, St. Louis, USA für pMON30049. Dr. P.H. Quail, UC-Berkeley, Albany, USA für pAHC25. Dr. Z. Avramova, Purdue University, Lafayette, USA für 5’z und 3’z Adh1-MARs. Dr. D. Grierson, University of Nottingham, Loughborough, UK für pTOM5. Dr. M. Kuntz, Université J. Fourier, Grenoble, France für psy aus Capsicum. Der größte Dank jedoch gilt meiner Frau Heike, meinen Kindern Katrin und Sarah, meinen Eltern und Schwiegereltern.

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