(1)

การวเคราะหปฏสมพนธทางกายภาพระหวางโปรตน Tripatite Motif-Containing 21 (TRIM21) และ Fas-Associated Death Domain (FADD)

Analysis of Physical Interaction between Tripatite Motif-Containing 21 (TRIM21) and Fas-Associated Death Domain (FADD) Proteins

นรยา วาจ

Nureeya Waji

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญา

วทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาชวเคม มหาวทยาลยสงขลานครนทร

A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science in Biochemistry

Prince of Songkla University 2558

ลขสทธของมหาวทยาลยสงขลานครนทร

(2)

ชอวทยานพนธ การวเคราะหปฏสมพนธทางกายภาพระหวางโปรตน Tripatite Motif-Containing 21 (TRIM21) และ Fas-Associated Death Domain (FADD)

ผเขยน นางสาวนรยา วาจ สาขาวชา ชวเคม

อาจารยทปรกษาวทยานพนธหลก คณะกรรมการสอบ

............................................................. ..........................................ประธานกรรมการ

(ผชวยศาสตราจารย ดร.เดชา เสรมวทยวงศ) (ผชวยศาสตราจารย ดร.กสมาลย นอยผา)

......................................................กรรมการ

(ผชวยศาสตราจารย ดร.เดชา เสรมวทยวงศ)

......................................................กรรมการ

(ดร.นฐ ตณศลา)

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยสงขลานครนทรอนมตใหนบวทยานพนธฉบบนเปนสวนหนงของการศกษา ตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาชวเคม

....................................................................

(รองศาสตราจารย ดร.ธระพล ศรชนะ) คณบดบณฑตวทยาลย

(3)

ขอรบรองวา ผลงานวจยนเปนผลมาจากการศกษาวจยของนกศกษาเอง และขอขอบคณผ ทมสวนเกยวของทกทานไว ณ ทน

ลงชอ………………………………………………..

(ผชวยศาสตราจารย ดร.เดชา เสรมวทยวงศ) อาจารยทปรกษาวทยานพนธ

ลงชอ………………………………………………..

(นางสาวนรยา วาจ) นกศกษา

ชอวทยานพนธ การวเคราะหปฏสมพนธทางกายภาพระหวางโปรตน Tripatite Motif-Containing 21 (TRIM21) และ Fas-Associated Death Domain (FADD)

ผเขยน นางสาวนรยา วาจ สาขาวชา ชวเคม ปการศกษา 2557

บทคดยอ Fas-associated death domain (FADD) และ Tripartite motif-containing 21

(TRIM21) โปรตนทท าหนาทในหลายๆ สวนของเซลลทงการเกด apoptosis, proliferation, หรอในกระบวนการของ innate immunity และพบวา FADD ชวยเพมประสทธภาพของ TRIM21 ในการควบคมการลดระดบการท างานของวถการสราง interferon α (IFN-α) ซงชวยเพมประสทธภาพในการตอตานการตดเชอไวรสของเซลลได โดยโครงสรางของ FADD ประกอบดวย DED และ DD domain สวน TRIM21 คอ Ring, B-box, coiled-coil (CC) และ B30.2 domain ถงแมมการพบปฏสมพนธระหวางโปรตนทงสองแลว แตกยงขาดองคความรในเรองกระบวนการเกดหรอรปแบบของปฏสมพนธนนวาเกดไดอยางไร เชน B30.2 domain ซงเปนโดเมนทพบไดในโปรตนหลายชนดและถกระบวามสวนเกยวของโดยตรงกบการเกดปฏสมพนธนนจ าเปนและเพยงพอตอการเกดปฏสมพนธนหรอไม ในการทดลองครงนท าทง in vitro และ ex vivo ผลการทดลองจากแบคทเรยพบวา FADD และ TRIM21 มความสามารถในการละลายต า ในขณะท B30.2 domain ของ TRIM21 ละลายได แตตองใชการ induce ทอณหภมต า และความเขมขนของ IPTG ต า หรอการ coexpression กบโปรตนพเลยง ถงแมวาระบบของแบคทเรยสามารถใชในการศกษาขนาดและโครงสรางได แตไมเหมาะกบการศกษาการเกดปฏสมพนธ เนองจากผลการทดสอบดวย pull down assay ไมพบปฏสมพนธระหวางโปรตนเสนเตม FADD (wild type) หรอ F25Y FADD mutant กบ TRIM21 อาจเปนเพราะปฏสมพนธนจ าเปนตองอาศยการเกด post translational modification บางประการของโปรตนทงสองชนด สวนการทดลองใน tissue culture ดวย HEK 293T cells พบการแสดงออกของ wild type FADD และ TRIM21 ขนาดตางๆ กนทอยในรปทละลายน าได จงใชวธ Co-immunoprecipitation พบปฏสมพนธของ hFADDHisFlag กบทง HAhTRIM21 และ HAhTRIM21Δ3 (131-475) ซงรคอมบแนนททงสองมสวนของ CC อยหนา B30.2 domain สวน HAhTRIM21Δ1 (287-475), HAhTRIM21Δ4 (131-275) และ HAhTRIM21Δ5 (183-475) ไมสามารถเกดปฏสมพนธกบโปรตน FADD ดงนน B30.2 domain จงจ าเปนแตไมเพยงพอตอการเกดปฏสมพนธระหวางโปรตนทงสอง ตองม CC domain ทครบทง

โดเมนดวย นอกจากนผ วจยไดสรางโปรตนลกผสม HAyCChTRIM21Δ1 ซงใชสวนของ CC domain จากยสต โปรตนลกผสมดงกลาวไมสามารถสรางปฏสมพนธกบ hFADD ได ดงนนการศกษาหนาทของ CC domain และ การเกด post-translational modification จงเปนทนาสนใจในการศกษาตอไป

Thesis Title Analysis of Physical Interaction between Tripatite Motif-Containing 21 (TRIM21) and Fas-Associated Death Domain (FADD) Proteins

Author Miss Nureeya Waji Major Programs Biochemistry Academic Year 2014

Abstract

Fas-associated death domain (FADD) and Tripartite motif-containing 21 (TRIM21) play multiple functions, including apoptosis, proliferation, and innate immunity. Previously, it was shown that FADD enhances TRIM21 function to negatively down regulate the interferon-alpha (IFN-α) pathway. Although the physical association between FADD and TRIM21 has been studied, a complete picture of how they interact requires further investigation. For example, it is not known whether the B30.2 domain of TRIM21 is sufficient for interaction with FADD. In this report, the physical association between FADD and TRIM21 was characterized by using both bacterial and mammalian expression systems. The bacterial system result showed that FADD and TRIM21 were mostly insoluble when expressed in bacteria. Expression of the B30.2 domain of TRIM21 in bacteria required a low temperature and a low concentration of IPTG or coexpression with chaperones. While the bacterial system is suitable for structural studies of FADD and TRIM21, it is not the best system for studying their interaction. The pull down assay results did not show any interaction between FADD or F25Y FADD and TRIM21. Perhaps, some post-translational modifications might play a role in such interaction. Thus, the mammalian expression system was used to analyze the interaction. And for result of tissue culture with HEK293T cells, the expression FADD and TRIM21 were partial soluble protein. Co-immunoprecipitation technique showed the interaction between FADD and HAhTRIM21 or HAhTRIM21∆3 (131-475), which contains the coiled-coil (CC) and B30.2 domains, HAhTRIM21Δ1 (287-475), HAhTRIM21Δ4 (131-275) และ HAhTRIM21Δ5 (183-475) were unable to interact with FADD. These results suggest that B30.2 domain is essential but not sufficient to interact with FADD. Both CC and B30.2 domains are sufficient for interaction with FADD. To test whether TRIM21 dimerization,

which is created by the CC domain, is needed for such interactions, a chimeric HAyCChTRIM21∆1 protein is created. In this construct, the CC domain was replaced with the CC domain from yeast GCN4 protein. The results showed that HAyCchTRIM21 was unable to interact with FADD. Thus, the roles of CC domain and post-translational modification in interaction with FADD require further investigation.

สารบญ

เรอง หนา สารบญ (11) รายการตาราง (12) รายการภาพประกอบ (13) สญลกษณค ายอและตวยอ (16) บทท

1. บทน า 1 1.1 ทมาและความส าคญ 1 1.2 การตรวจเอกสาร 2 1.3 วตถประสงค 18

2. วธการวจย 2.1 รายการสารเคม 19 2.2 วสดอปกรณ 23 2.3 วธการทดลอง 24

3. ผลการทดลอง 51 4. วเคราะหผลการทดลอง 81 5. สรปผลการทดลอง 87

เอกสารอางอง 88 ภาคผนวก 99 รายการน าเสนอผลงาน 102 ประวตผ เขยน 108

รายการตาราง

ตาราง หนา 2.1 แสดงการท า double digestion 25 2.2 แสดงไพรเมอรพรอมต าแหนงทใชในการทดลอง 26

2.3 แสดงรายการพลาสมดทสรางขนเพอใชในการวจยครงน 35 2.4 ตารางแสดงความเหมาะสมของแตละปจจยในการใช LipofectamineTM2000 47 2.5 ตารางแสดงความเหมาะสมของแตละปจจยในการใช TransIT®-LT1 Transfection 48

รายการภาพประกอบ

ภาพประกอบ หนา 1.1 แสดงการเปรยบเทยบโดเมนอนรกษและต าแหนงทเกดการเตมหมฟอสเฟต

ของ FADD ระหวางสงมชวต 7 สปชส 3 1.2 ภาพแสดงโครงสรางของ FADD ในมนษย 3 1.3 แสดงโครงสราง DED domain ของ FADD 4 1.4 แสดงโครงสราง DD domain ของ FADD 6 1.5 แสดงภาพประกอบปฏสมพนธของ death-inducing signaling complex (DISC)

ระหวาง Fas, FADD และ Procaspase 8 7 1.6 แสดงโครงสรางของ TRIM21 พรอมขอบเขตของแตละโดเมน 13 2.1 ภาพแสดงสปนคอลมนทเตรยมขนจากหลอดทดลองขนาด 0.5 และ 1.5 ml 26 2.2 ภาพแสดงคอลมน Sephadex G-25 จาก micropipette tip ขนาด 1 และ 5 ml ในหลอดทดลองขนาด 15 ml 31 2.3 แสดงโครงสรางของ insert รวมทง expression และ co-expression plasmid ทใชในการทดลองในแบคทเรย 34 2.4 แสดงตวอยางโครงสรางของ insert และ plasmid ทใชส าหรบการทดลองใน tissue culture 34 3.1 ผลการแสดงออกของยน และความสามารถในการละลายของรคอมบแนนท โปรตน HishTRIM21Δ2(287-475) 53 3.2 ความเขมขนของเกลอในบฟเฟอรไมมผลตอการละลาย HishTRIM21Δ2(287-475) 54 3.3 การกระตนเซลลดวย 0.02 mM IPTG สรางรคอมบแนนท HishTRIM21Δ2(287-475) ทมคณสมบตของการละลายมากกวาการกระตนดวย 0.2 mM IPTG 55 3.4 ผลการแสดงออกของยน HishTRIM21Δ2(287-475) และการท าบรสทธรคอมบแนนท โปรตนรวมกบโปรตนพเลยง 57 3.5 แสดงผลการสงเคราะหรคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21Δ2(287-475) ภายใตระบบ SPM ท 37๐C 69

3.6 ผลการแสดงออกของยน และความสามารถในการละลายของรคอมบแนนท โปรตน HishTRIM21Δ1(275-475) 60

รายการภาพประกอบ (ตอ)

ภาพประกอบ หนา 3.7 รคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21Δ1(275-475) ทสงเคราะหรวมกบโปรตนพเลยง มการแสดงออกของยน ความสามารถในการละลาย และการท าบรสทธโปรตนไดมากขน ดวยการเลยงท 18๐C 61 3.8 ผลการสงเคราะห hFADDΔ1HisSTRx2 (F25Y) และความสามารถในการละลายท มากขนเมอเปรยบเทยบกบ hFADDΔ1HisSTRx1(wt) ท าใหท าบรสทธโปรตนไดมาก 63 3.9 hFADDΔ1HisSTRx2(F25Y) ไมเกดปฏสมพนธกบ HishTRIM21Δ2(287-475) โดยแสดงผลการท า Strep-Tactin pull down assay 64 3.10 hFADD1HisSTRx2(F25Y) ไมเกดปฏสมพนธกบ HishTRIM211 ดวยการทดสอบ ดวย Strep-Tactin pull down assay ทงโปรตนทอยในรปทบรสทธและ crude extract 66 3.11 ผลการแสดงออกของยน และความสามารถในการละลายของรคอมบแนนทโปรตน

hFADDHisSTR 68 3.12 HishTRIM21Δ1(275-475) ไมสามารถเกดปฏสมพนธกบ hFADDHisSTR(wt) จากการทดสอบดวย Strep-Tactin pull down assay จากโปรตนทผานการท าบรสทธ 70 3.13 co-expression โปรตน hFADDSTR(wt) และ HishTRIM21Δ1(275-475) จากเซลลเจาบานเดยวกนไมสามารถเกดปฏสมพนธระหวางกนได 72 3.14 ผลการแสดงออกของยน และความสามารถในการละลายของรคอมบแนนทโปรตน

HishTRIM21 73 3.15 hFADDHisSTR(wt) ไมสามารถสรางปฏสมพนธกบ HishTRIM21(wt) จากการ แสดงผลการท า pull down assay ดวย Strep-Tactin resin 74 3.16 ภาพแสดงผลการสงเคราะหโปรตน hFADD และ hTRIM21 ในเซลลเรมตนขนาด 500,000 และ 900,000 เซลล 75 3.17 GSThTRIM21 ไมสามารถเกดปฏสมพนธกบ hFADDHisFlag ได โดยแสดงผล การท า pull down assay ดวย GST pull down assay 76 3.18 ทง GSThTRIM21 และ hTRIM21ไมสามารถเกดปฏสมพนธกบ hFADDSTR ได ใน Strep-tactin pull down assay 77

รายการภาพประกอบ (ตอ)

ภาพประกอบ หนา 3.19 hFADDHisflag สามารถเกดปฏสมพนธกบ HAhTRIM21 และ HAhTRIM21Δ3(131-475) ได ดวยการท า co-immunoprecipitation 79 4.1 ภาพแสดงโครงสรางทตยภมของ CC domain 84 4.2 ภาพแสดงโครงสรางของ B30.2 domain จาก GUSTAVAS ซงมล าดบโปรตนบางสวน เหมอนกบ B30.2 domain 85 4.3 ภาพแสดงโครงสรางการเรยงตวของ rhTRIM5α ระหวางการเกดปฏสมพนธ กบ HIV capsid 86

1

บทท 1

บทน ำ

1.1 ควำมส ำคญและทมำของงำนวจย

สงมชวตชนสงมความซบซอนของการท าหนาทและการควบคมไมวาจะเปนการควบคมในระดบยน อารเอนเอ การสรางโปรตน หรอแมระทงการควบคมในระดบทเหนอขนไป อนเกดจากการสงตอปฏสมพนธระหวางกนของโปรตนหรอโมเลกลตาง ๆ ภายในรางกาย ทอาจสงผลใหการแสดงออกของโปรตนหรอโมเลกลในรางกายท างานแตกตางกนไปตามชวงเวลาของชวต เชน Fas-asociated death domain (FADD) ซงเปนโปรตนทรจกกนดวาท างานในระบบการตายของเซลลแบบ apoptosis โดยเปนโปรตนในไซโตซอลทสามารถจบกบ Fas ซงเปนตวรบสญญาณบนผวเซลล จากนน FADD จะสงตอสญญาณนเพอใหเซลลเปลยนแปลงสภาวะทเขาสการตายตอไป แตการคนพบครงตอๆ มา นกวทยาศาสตรพบวา FADD เปนโมเลกลทสามารถท าหนาทไดซบซอนกวานนขนอยกบต าแหนงของโปรตนหรอกระบวนการเกด phosphorylation ดงนนตว FADD เองกอใหเกดหนาทๆ หลากหลาย เชน apoptosis, cell cycle หรอการเกด proliferation เปนตน ซงจะไดมการกลาวถงรายละเอยดตาง ๆ ตอไป

ดงนนเพอท าความเขาใจวา FADD ท าหนาทดงกลาวอยางไรในหลายระบบทงการควบคมการเพมจ านวน หรอการตายของเซลล จงมความพยายามในการหาวาโปรตนใดบางทสามารถมปฏสมพนธกบ FADD ได การทดลองกอนหนานพบวา Tripatite motif-containing 21 (TRIM21) เปนหนงในหลายชนดของโปรตนทเกดปฏสมพนธกบ FADD ซงการท างานรวมกนของโปรตนทงสองในระบบภมคมกนโดยก าเนด (innate immunity) ชกน าใหเกดการยบยงการผลต interferon α (IFN-α) สงผลใหอตราการตดเชอกลม RNA virus นอยลง และจากการศกษาเพมเตมพบวา TRIM21 ทขาด B30.2 domain ไมสามารถเกดปฏสมพนธกบ FADD ได จงเปนทมาของการศกษาในครงน ซงมวตถประสงคเพอยนยนวา B30.2 domain มความจ าเปนและเพยงพอตอการเกดปฏสมพนธระหวางโปรตน TRIM21 กบ FADD รวมถงโดเมนอนใดอกหรอไมทเกยวของ ทงนเพอท าใหเขาใจความสมพนธในเชงหนาทและกลไกการเกดปฏสมพนธ ระหวางโปรตนทงสองนนดขนตอไป

2

1.2 ทบทวนวรรณกรรม

1.2.1 Fas-associated death domain (FADD) 1) ยน, กำรแสดงออกและโครงสรำง Fas-associated death domain (FADD) หรอ mediator of receptor-induced

toxicity (MORT1) (Boldin et al., 1995) เปน adaptor protein ทเกยวของกบกระบวนการตายของเซลลแบบ apoptosis (Berghe et al., 2004; Chinnaiyan et al., 1996; Siegmund et al., 2001; Zhang et al., 1998b; Zhang et al., 2001), การเพมจ านวนเซลล (cell proliferation) (Alappat et al., 2003; Hua et al., 2003; Osborn et al., 2010; Osborn et al., 2007), การอยรอดของเซลล (cell survival), การแบงตวของเซลล (cell cycle progression), ระบบภมคมกนโดยก าเนด (innate immunity) (Balachandran et al., 2004; Balachandran et al., 2007), embryonic development FADD เปนโปรตนทพบในสงมชวตประเภทยคารโอตหลายชนดตงแตไพรเมต สตวครงบกครงน า ปลากระดกแขง พชสเขยว และรา เปนตน มการแสดงออกของโปรตนชนดนในทกเนอเยอทงในระยะโตเตมวยและระยะตวออนของมนษย หน และยง (Chinnaiyan et al., 1995; Kabra et al, 2001; Cooper et al., 2009) โดยยนทควบคมการแสดงออกของ FADD ในมนษยอยในโครโมโซมคท 11 ต าแหนง q13.3 (11q13.3) มขนาด 4,240 เบส สวน mRNA มขนาด 627 เบส เมอแปลรหสโปรตนแลวประกอบดวยกรดอะมโน 208 amino acids น าหนกโมเลกล 23,279 ดาลตน (Kim et al., 1996) การเปรยบเทยบกบสงมชวตหลาย ๆ ชนด พบวามความคลาย (similarity) คอนขางสง เนองจากมลกษณะการเรยงตวของโปรตนเปนโดเมนอนรกษ คอ death-effector domain (DED) และ death domain (DD) ดงแสดงในรปท 1.1 โดยสงมชวตทมความคลายกนมากทสด คอ หน (Mus musculus) ซงม 205 amino acids และจากการวเคราะหล าดบกรดอะมโนพบวาระหวาง FADD ของมนษยกบหนมความเหมอน (identity) อยท 68% สวนความคลาย (similarity) อยท 80% (Zhang & Winoto, 1996; Zhang et al., 2004) ซงโครงสรางทตยภมหลกของ FADD ทมลกษณะรวมกบโปรตนอน ๆ ในกลมเดยวกน ประกอบดวย α-helix 12 อน ทเรยงตอกนเปนสองกลม หรอ สองโดเมนทมรปแบบการเรยงตวเปน orthogonal tail-to-tail คอ death effector domain (DED) ทางปลายหมอะมโน (N-terminus) และ death domain (DD) ทางปลายคารบอกซลก (C-terminus) ดงแสดงในรปท 1.2

3

รปท 1.1 แสดงการเปรยบเทยบโดเมนอนรกษและต าแหนงทเกดการเตมหม

ฟอสเฟตของ FADD ระหวางสงมชวตทง 7 สปชส โดยแสดงขอบเขตของ DED, DD domain และต าแหนงของ nuclear export signals (NES) และ nuclear localization signals (NLS) โดย * แทนต าแหนงทมการเตมหมฟอสเฟต (Zhang et al., 2004)

รปท 1.2 ภาพแสดงโครงสรางของ FADD ในมนษย โดยแสดงลกษณะ DED

และ DD domain ทางปลาย N และ C ตามล าดบ (Carrington et al., 2006)

4

DED หรอ Death-effector domain ครอบคลมตงแตกรดอะมโนท 2-83 (ตาม crystal structure) ซงจะพบ DED domain ในกลมของ caspase recruitment domain (CARD) ประกอบขนจาก α-helices 6 อน ทถกเชอมดวย loop และเรยงตอกน สวนโครงสรางของ FADD DED ทต าแหนงเชอมระหวาง α-helix ท 4 และ 5 ม β turn แทรกอย ซงถอวาเปนลกษณะเฉพาะของโปรตนชนดน โครงสรางรอบนอกของ DED domain มบรเวณทไมมขว (Hydrophobic) 2 ต าแหนง คอ Phenylalanine 25 (F25) บน α 2 และเปนต าแหนงส าคญทใชในการเกดปฏสมพนธกบโปรตนอนๆ หรอการเกด self-dimer ของ FADD เอง โดย F25 เปนต าแหนงทมผลตอการเกด hydrophobic interaction เนองจากมการทดลองพบวาหากเปลยนกรดอะมโนฟนลอะลานนซงจดอยในกลมของกรดอะมโนไมมขวเปนไทโรซน (F25Y) ทมโครงสรางแบบมขวเพยงต าแหนงเดยวพบวาไมมการเกดปฏสมพนธระหวางโปรตน และอกจดคอ L26, L28 บน α2 และ L66, L70 บน α5 นอกจากน ใน DED สวนใหญพบลกษณะของ electrostatic surface โดยรอบ RXDL motif ใน helix 6 ดงรปท 1.3 ซงพบใน c-FLIP (Cellular FLICE-inhibitory protein) และ MC159 เชนกน ในโมเลกลของ FADD DED ท าหนาทในการควบคม apoptosis ซงโดเมนนจ าเปนตอการเกด self-association และตอการมปฏสมพนธกบ procaspase-8 ในการสงเสรมใหเกด apoptosis ผานทาง Fas signaling หรอสามารถเกดปฏสมพนธกบโปรตนอนๆ ผาน DED domain เชน c-FLIP เปนตน (Carrington et al., 2006; Eberstadt et al., 1998; Muppidi et al., 2006; Sandu et al., 2006; Siegel et al., 1998)

รปท 1.3 แสดงโครงสรางของ DED domain (Muppidi et al., 2006)

นอกจากน ในระหวางสายเปปไทดของ DED domain พบวาม leucine-rich motif LTELKFLCL ทล าดบเบส 20 - 28 และ KRK sequence ซงมล าดบเบสอยท 33-35 บน α3 ซง motif ทงสอง คอ ต าแหนงของ NES (nuclear export signal) และ NLS (nuclear localization

5

signal) ตามล าดบ มความเปนลกษณะอนรกษสงมาก เชอวามสวนในการก าหนดต าแหนงทอยของ FADD และการท างานบางอยางในเซลล เนองจากพบการแสดงออกของ FADD ไดทงในนวเคลยสและไซโตพลาส เชน NES จ าเปนตอการสงออกนอกนวเคลยสของ FADD หรอ NLS เกยวของกบการเคลอนทเขาสนวเคลยสของ FADD (nuclear localization) ซงการม compartmentalization นอาจเปนหนงในกระบวนการควบคมการท างานของ FADD ในเซลล โดย FADD ทอยในไซโทพลาสเกยวของกบกระบวนการเกด apoptosis สวน FADD ในนวเคลยสอาจกระตนเกยวกบการอยรอดของเซลลและลดความสามารถของ FADD ในการกระตนการเกด apoptosisใน T-cell ได นอกจากน มการคนพบวา FADD ถกสงออกนอกเซลลผานทาง adenosine receptor ซงจะไดกลาวถงความสมพนธระหวางต าแหนงของ FADD และหนาทอยางละเอยดตอไป

Death Domain (DD) ของ FADD มล าดบกรดอะมโนตงแต 93–192ประกอบดวย 6 α helix ทมการพบมวนแบบ Greek Key topology (Steward et al., 2009) จากการทดลองของ Berglund และคณะในป 2000 พบวา โครงสรางของโดเมนนประกอบดวย α1 (D96-N107),α2 (k112-k120), α3 (D123-Y133), α4 (T138-T151), α5 (V158-C168), α6 (N171-Q182) ทจบกลมขนานกนในทางตรงกนขาม โดย α1, α5, α6 วางตวอยเหนอ α2, α3, และ α4 ซงการพบมวนคลายกบ DD อน ๆ แตเมอเปรยบเทยบแลวมความใกลเคยงกบ DD ของ Fas ทสด นอกจากนพบวา บรเวณผวโดยรอบของโครงสรางตตยภมของ FADD DD เปนแบบ electrostatic potential ซงมการกระจายของประจและความเปนขวทเปนกลม โดยกลมแรกประกอบดวย K110, R113, R114, R117 และ R140 แสดงความเปนประจบวกบน α2 สวนกลมทสองประกอบดวย D123, D127, E130 และ D131 ท าใหเกดแนวเสนของ negative electrostatic potential ขนานไปกบกรดอะมโน S122, T124 และ S128 ทไมแสดงประจแตมลกษณะความมขว กลมนอยบน α3 ซงการทดลองโดยการท า mutagenesis พบวาม electrostatic potential ซงนาจะมบทบาทส าคญตอการเกดปฏสมพนธระหวาง DD domain ทงของ FADD และ Fas receptor ทฝงอยภายในเซลลเมมเบรน หรอโปรตนบางตวในกลมของ tumor necrosis factor (TNF) superfamily เชน DR4, DR5, TNFR1 เปนตน (Berglund et al., 2000) รวมทงการทดลองของ Jeong ในป 1999 กสนบสนนวาปฏสมพนธเกดท α2-α3 helix loop motif ดงรปท 1.4 (Carrington et al., 2006; Jeong et al., 1999; Zhang & Winoto, 1996)

6

รปท 1.4 แสดงโครงสรางของ DD domain (Berglund et al., 2000) นอกจากโดเมนทงสองแลว พบวามสวนของโปรตนทอยนอกเหนอโดเมนไปทาง

ปลายคารบอกซลกซงมต าแหนงของกรดอะมโนซรนทต าแหนง 194 ท าใหเกดการเตมหมฟอสเฟตและสงผลตอการเจรญแบงตวของ T-cell ซงจะไดกลาวในล าดบตอไป นอกจากซรนทต าแหนง 194 แลวยงพบท 187 และ 202 ดวย แตไมมการเกดฟอสโฟรเลชน และจากการทดลองทเปลยนกรดอะมโนเปนแอสปาตกเพอดการเปลยนแปลงกไมพบการเปลยนแปลงใด ซงการเตมหรอไมเตมหมฟอสเฟตทต าแหนงซรน 194 นไมมผลตอกระบวนการเกดปฏสมพนธกบ Fas หรอการเกด apoptosis

การท างานของ FADD เกดจากการ translocation, protein phosphorylation, หรอการเกดปฏสมพนธกบโปรตนอน ๆ กอใหเกดการท าหนาททหลากหลายได จงอาจเปนเหตผลส าคญทท าให FADD ถกจดเปน adaptor protein เมอมการจบกนมกจะอยในลกษณะท FADD เปนนวเคลยส และถงแมวา DED จะเปนสวนทใชในการจบกนโดยตรงเพอใหเกดปฏสมพนธทน าไปส apoptosis แตจ าเปนตองม DD domain เพอจบกบ Fas จงจะท าใหเกดการ apoptosis ได เชนเดยวกนหากมเพยง DD domain อยางเดยวสามารถจบกบ Fas ได แตไมสามารถสงตอใหเกด apoptosis ไดในทสด เนองจากขาด DED domain (Spencer et al., 1996; Tourneur & Chiocchia, 2010; Young et al., 2011)

2) FADD กบหนำทใน apoptosis ดงทกลาวมาแลวในขนตนวา FADD ถกคนพบครงแรกผานระบบการตายของ

เซลล ซงกนบไดวาเปนหนาทหรอบทบาทหลกได เนองจาก FADD ท าหนาทเปนเหมอนตวดงหรอเชอมระบบการรบรวาเซลลถงเวลาเขาสกระบวนการตาย จงเรยกไดวา FADD เปน adaptor protein ในกระบวนการเกด apoptosis ทมสาเหตจากภายนอกเซลล (extrinsic pathway) โดย

7

เซลลรบสญญาณการกระตนจากภายนอกผานการจบระหวาง ligand กบ Fas receptor บนผวเซลลจากนนจะเกดปฏสมพนธกนระหวาง Fas กบ FADD โดยสวน DD domain ของทงสองโมเลกลแบบ trimer แลวสงสญญาณใหเกดปฏสมพนธกบโปรแคสเปส 8 (Procaspase-8) ผานทาง DED domain ดวยอตราสวนการจบเปน 3:3:3 ซงเรยกโครงสรางเชงซอนนวา death-inducing signaling complex (DISC) จากนนสญญาณจาก DISC จะถกสงตอไปโดยการท procaspase 8 ซงมคณสมบตเปน protease และสามารถเกด self cleavage ได ถกกระตนให active เปน caspase 8 และไปกระตน procaspase อนๆ เชน procaspase 3, 7 และ 10 ให active และขยายสญญาณออกไปจนเกด apoptosis ในทสด (Carrington et al., 2006) ดงแสดงในรปท 1.5 และมการทดลองอกมากทยนยนวาการท างานของ FADD เพอ recruit โปรตนตาง ๆ จะจบเปนรปแบบเชนน

รปท 1.5 แสดงภาพประกอบปฏสมพนธของ death-inducing signaling

complex (DISC) ระหวาง Fas, FADD และ Procaspase 8 และกระบวนการตอเนองสการเกด apoptosis

แตในขณะเดยวกนถา TNFR1 (TNF-receptor 1) ถกกระตนจะท าใหเกดการรวมกนของ complex ในไซโตซอลเปน FADD-TRADD-caspase 8 หรอ RIP1-FADD-caspase 8 น าไปสการตายแบบ apoptosis ได (Wilson, et al., 2009) ดงนนการท าหนาทอยางถกตอง

8

สมบรณของ FADD จงเปนการรกษาสภาวะสมดลของระบบภมกนไดอกทางหนง อนง FADD เปน main adaptor ในหลาย death receptor (DR) ทงทางตรง ( Fas, TRAIL) และออม (TNFR1 ผาน TRADD) แตปกตแลวรางกายตองรกษาสมดลของปรมาณเซลลไว นอกจากนพบการเกดปฏสมพนธระหวาง FADD, caspase 8 และ มวเทชนโปรตน Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) ซงเปนหนงในสาเหตของการเกด Parkinson Disease (PD) ทเกยวเนองกบความผดปกตทางพนธกรรม ซงพบวา mutant form ของ LRRK2 ท าใหเกดเปนสายยาวทสามารถเกดปฏสมพนธกบ FADD และ TRADD ได จงเปนการสงสญญาณใหเกดการตายของเซลลประสาท เกดการท าลายเซลลประสาท (neurodegeneration) นอกจากนการทดลองของ Hartmann และคณะในป 2002 พบการสะสมของ FADD ในนวรอนทมรอยโรค ซงนาจะมการชกน าใหเกดการตายของเซลลผานการกระตนของ caspase 8 ซงอาจเปนปจจยรวมใหเกดการตายของนวรอนเซลลในผ ปวยพารกนสนตอไป (Hartmann et al., 2002)

3) FADD กบหนำทตอกำรแบงตวของ T-cell ในทางกลบกนท FADD ถกจดวาเปนสวนส าคญของกระบวนการการตายใน

ระดบเซลล แตการทดลองของ Zhang และคณะในป 1998 โดยท าการทดลองในหนท Knockout FADD พบวามอายของการเปนเอมบรโอประมาณ 10 วน จากนนจะตายตงแตในทอง โดยเกดจากการมสวนรวมในการยบยงการเกด proliferation ของ T cell (Zhang et al., 1998) นอกจากน FADD ยงเปนโปรตนอกหนงชนดทสามารถเกด phosphorylation ของกรดอะมโนซรนทางปลายหมคารบอกซลกทต าแหนง S194 ในขณะท FADD ของหนเกดไดทงททรโอนนและซรนแตเกดท ซรนมากกวา และหนงในต าแหนงนนคอ S191 ทเทยบเทากบ hFADD S194 (Zhang & Winoto, 1996) ซงต าแหนงนอยนอกโดเมน DED และ DD ของ FADD แตพบวามสวนส าคญในการคมการเจรญและแบงตวของเซลล ซงซรนทางปลาย C พบไดในสตวเลยงลกดวยนมหลายชนด แตไมพบในปลาหางนกยง แมลงวน และยง หรอสตวทววฒนาการต าลงมา จงเปนไปไดวาล าดบกรด อะมโนนอก DD โดเมนเปนสวนทเพมขนมาในระหวางววฒนาการของสตวเลยงลกดวยนม (Zhang et al., 2004) ซงเปนทชดเจนแลววาการเกด phosphorylation-dephosphorylation ทกรดอะมโนซรนบนปลาย C เพยงต าแหนงเดยว เปนสวนส าคญในการควบคมการแบงเซลล โดย FADD จ าเปนตอการแบงตวของ T-cell ซงการขาดหายไปของ FADD หรอการท าใหขาดคณสมบตตางๆ เชน การท าใหเกด point mutation จากซรนเปนแอสปาตกแอซดท 194 (S194D) กอใหเกดคณลกษณะเปนการเลยนแบบ phosphorylation ของ FADD ปองกนไมใหเกดการ

9

dephosphorylation มผลท าให T-cells ไมผานวฏจกรเซลลจากระยะ G1 เขาสระยะ S ซงเปนชวงทมการจ าลองดเอนเอเพอใหมการแบงเซลลตอไป (Alappat et al., 2005; Hua et al., 2003; Osborn et al., 2007) การขาด FADD ยบยงการกระตนการเจรญแบงตวของ B-cell ผานทาง TLR3/4 (Beisner et al., 2005; Imtiyaz et al., 2006) สวนการทดลองในเซลลไฟโบรบลาสทของหนและมนษย FADD เกยวของกบ IFN pathway ทตอบสนองตอการตดเชอไวรส จากผลทไดจงเชอวาหนาทหลกของ FADD ตอระบบภมคมกนนาจะอยทชวงทายของ IFN pathway และลดการถอดรหสของ IRF7 เมอไดรบ sendai หรอ VSV virus (Balachandran et al., 2007) แตยงไมมความชดเจนวา FADD ควบคมการถอดรหสของ IRF7 และการตอบสนองตอ IFN อยางไร

นอกเหนอจากทไดกลาวมาแลววา FADD มสวนในการเจรญพฒนา และการแบงตวของ T-cell ยงมการทดลองทระบวา FADD มความเกยวของกบการเจรญของเซลลอน ๆ ดวย จงมความสนใจในความเกยวของระหวาง FADD กบการกอเกดหรอการสลายไปของเซลลมะเรง มการทดลองวา การเกดฟอสโฟรเลชนทกรดอะมโนซรน 194 มผลใหการตอบสนองตอยาตานมะเรงเพมขน รวมทงมผลตอการเคลอนทของ FADD ภายในเซลลอกดวย จากการทดลองของ Alappat และคณะในป 2005 พบวา casein kinase Iα (CKIα) ท าหนาทในการเตมหมฟอสเฟตใหกบ FADD ทต าแหนง S194 ทงใน in vitro และ in vivo และการถกเตมฟอสเฟตทต าแหนงนถอวาเปนกญแจส าคญของการควบคมการท างานของ FADD ในบทบาทหนาททไมเกยวของกบการเกด apoptosis (Alappat et al., 2005) ในสวนของการควบคมวฏจกรเซลล พบวาม FADD ทไดรบการเตมหมฟอสเฟตอยในชวง G2/M มากกวา G1/S (Alappat et al., 2005) ปรมาณของ FADD ทปรากฏอาจเปนหนงใน check point เพอใหเซลลพรอมเขาสการแบงตวตอไป มการทดลองใน tumor cell ซงพบวาหากขาด FADD จะตานทานตอการเกด apoptosis ได มผลตอการเจรญของเซลลมะเรง (Tourneur et al., 2005; Tourneur et al., 2003) มการพบแลววาเอมบรโอหนนนตายเกดจากการขาด FADD ไมใชการบกพรองของกระบวนการ apoptosis แตอาจเกยวกบระบบเมทาบอลสม เนองจากการความรทางดานชวสารสนเทศ (bioinformatic) การทดลองนท าโดยการ predict จากโปรแกรม พบวามโปรตนถง 45 ตวทเปลยนแปลงเนองจากขาด FADD อกทงเมทาบอลสมของลปด กรดไขมน glycolysis tricaboxylic acid (TCA) oxidative phosphorylation มแนวโนมเพมขนดวย นอกจากนพบการเพมขนของโปรตนทเกยวของกบ ubiquitin–proteasome (UP) pathway และ c-Myc นาจะเปนศนยกลางการควบคมนการเชอมกนระหวาง FADD กบระบบ metabolism นาจะเปนอกแขนงทนาสนใจของการศกษาหนาท FADD (Zhuang et al., 2013)

10

4) FADD กบกำรม compartmentalization จากทกลาวไวขางตน วา FADD มสญญาณของ NLS ท าใหมการสะสมของ

FADD ไดในนวเคลยสและเกยวของกบการการลดความสามารถของ FADD ในการกระตนการเกดapoptosis ใน T-cell อาจเนองจากวาเฉพาะ FADD ในไซโทพลาสเทานนทเกยวของกบกระบวนการตายของเซลล ในขณะทโปรตนในนวเคลยสเกยวกบการอยรอดของเซลล มรายงานวา exportin 5 nucleocytoplasmic transport protein เปนตวกลางระหวาง FADD และ MBD4 ถา mutate S194A จะยบยงการ export ของ FADD เพราะ S194A และ ∆1-80 ไมเกดปฏสมพนธกบ exportin 5 ซงการเกดปฏสมพนธกบ exportin 5 ควบคมดวย phosphorylation MBD4 จงมสวนในการควบคม apoptosis ผานการจบกบ FADD โดยตรง ท าให FADD ถกกกในนวเคลยสยบยงการแสดงออกและไมเกด apoptosis โดยไมจ าเปน นอกจากนการ mutate ทต าแหนงของ NES มผลตอการกระจายตวของ FADD ดวย (Screaton et al., 2003) โดย Fas recruit FADD ไปยง endosome และเมอกระตน Fas จะมการ relocalize กลบไปยงไซโทพลาสอกครง (Föger et al., 2009)

FADD เปน tumor suppressor gene ดวย เนองจากไมพบการแสดงออกของโปรตน FADD ทงทตรวจพบ FADD mRNA ใน thyroid adenoma/adnocarcinoma และ acute myeloid leukemia (AML) จากการทดลองของ Tourneur และคณะในป 2008 (Tourneur et al., 2008) ซงตรวจหา FADD ในตอมไทรอยด พบวามการปลดปลอย FADD ออกจากเซลลแตไมเกดจากการขาดหรอรวของ plasma membrane เนองจากไมพบ LDH ทจะพบไดใน supernatant หากมการแตกของเซลล นอกจากนในการทดลองดงกลาวพบวา FADD ไมถกท าลายดวยทรปซน แสดงวา FADD ทถกปลอยนอยในรปแคปซลจากการ encapsulation และปลอยในรป vesicle ทม phosphotidylserine (PS) เปนสวนประกอบของเมมเบรน ซงเปนไปในทางเดยวกบ MacKenZie และคณะทตงสมมตฐานวาการปลอยโปรตนดวย microvesicle เปนวธการขนสงโปรตนทไมม secretary signal sequence ออกนอกเซลล (MacKenzie et al., 2001) ซงนอกจากไทรอยดแลว ยงพบการปลอยโปรตน FADD จากเซลลตบ ตอมไทมส ผวหนง กลามเนอ และไตดวย การปลดปลอยนตองมแคลเซยมอยในสารละลายนอกเซลลดวย และนาจะเปนตวชวยในขนตนของการขนสงออกนอกเซลล ซงการทดลองของนกวทยาศาสตรกลมนพบวาการปลอย FADD อยภายใตการท างานของตวรบจ าเพาะทใช adenosine เปนซบสเตรท เนองจากพบวาปรมาณการเพมขนนนสอดคลองกบการเพมของ ATP ในสารละลายนอกเซลล เชน p2x receptor เปน ion channel gate ทตองอาศย ATP โดย microvesicle น เปนวถการปลอย IL-1β อยาง

11

รวดเรวจากโมโนไซตทถกกระตน (MacKenzie et al., 2001) ซงการปลอย FADD จาก thyroid lobe อาศยการท างานของ A3AR receptor (adenosine receptor) ทเกดเมอมพยาธสภาพขนกบเซลลหรออวยวะนน นอกจากนพบการปลอย FADD ผานทาง vesicle ทเกยวกบ adenosine receptor เนองจากพบ adenosine ซงถกรายงานวาเปน regulator of inflammation ในผ ปวยรมาตอยด ดงนนการทดลองนแสดงวาการปลอย FADD ใน in vivo เกดในสภาวะทมพยาธสภาพเชนกน และเนองจาก adenosine จะถกขบออกอยางรวดเรวในสภาวะทเซลลเกดความเครยดหรอไดรบความเสยหาย การตดชนสวนในการทดลองนอาจน าไปสการปลอย FADD อยางรวดเรวเพอหลกเลยงการเกด apoptosis เนองจากสภาวะเครยดน นอกจากนมการพบ FADD ในซรมจากหนทเปน nonpathological gsp แตไมพบในหนปกตทเปน non transgenic ทางผทดลองตงขอสงเกตวา การปลดปลอย FADD อาจเปนหนงในสญญาณการพฒนาของ tumor ไดเชนกน โดยพบการสญเสย FADD ในเซลล carcinoma และ พบ FADD ใน serum ทใชเลยง tumor cell (Tourneur et al., 2008) 5) FADD กบกำรท ำหนำทและควำมเกยวของกบโปรตนอนๆ

จากการศกษาพบวา FADD มความส าคญในการตานแบคทเรยแกรมลบในกลมของแมลง เชน แมลงหว ยง ผานทาง immunodeficiency pathway pathway (IMD) ทใชตอตานแบคทเรยแกรมลบ IMD น เทยบไดกบ RIP1 ในสตวเลยงลกดวยนม ซงจบกบ FADD และ caspase 8 เพอกระตน NF-kB pathway ใหสราง drosomysin ซงเปน anti bacterial peptide (Cooper et al., 2009; Naitza et al., 2002) การเกดปฏสมพนธระหวาง FADD กบ death receptor เปนขนตอนทส าคญของการตอบสนองทางระบบภมคมกน (Newton et al., 2001) และ NF-kB เปนอกสวนส าคญในกระบวนการ apoptosis โดยเปน nuclear transcription factor ทควบคมการแสดงออกของยนหลาย ๆ ตวทเกยวของกบ apoptosis การเพมจ านวนไวรส การเกด tumor การอกเสบ และโรคเกยวกบการแพภมตวเอง

นอกจากนพบความสามารถในการเกดปฏสมพนธกบโปรตน Calmodulin ในการควบคมวฏจกรเซลล (Ho et al., 2009; Papoff et al., 2010; Tourneur et al., 2008) ซง Calmodulin (CaM) เปนโปรตนทมขนาด 17 KDa อยในไซโตพลาส มลกษณะเหมอนดมเบลโดยจบกบกบ Ca2+ ผานทาง EF-hand ทอยสวนปลายโปรตนกอนกลม ซงท าใหเกดเปน hydrophobic ทต าแหนงระหวางโปรตนกอนกลมทงสองซงจะไปจบกบโปรตนอนเพอใหเกดผลตางๆ ตอไป ทง FADD, CaM และ casein kinase I α (CKIα) เคลอนทไปดวยกนสต าแหนง mitotic spindle ใน

12

HeLa cells พบวาเมอท าใหเกดการมวเทชนทต าแหนงจบจ าเพาะของ CaM สามารถยบยงการเขาสกระบวนการพกของเซลลท G2/M cell cycle จากการกระตนดวย Taxol และการเกดปฏสมพนธระหวาง FADD กบ CaM ไมตองการการกระตนจาก Fas ถงแมวาทง Fas และ CaM จะเปน ซบสเตรตแขงขนในการเกดปฏสมพนธกบ FADD ซงต าแหนงทใชในการจบ CaM อยบน S194 ทเปนต าแหนงเดยวกบทใชในการเกดฟอสโฟรเลชน เนองจาก CKIα สามารถจบและเตมหมฟอสเฟตใหกบ FADD และ CaM ได

การท างานของ FADD ตอกระบวนการแบงเซลลในระหวางอนเทอรเฟส ซง FADD ไมไดเกาะโครงสรางใดหรอสะสมทใดเปนส าคญภายในเซลล แตในระหวางเมทาเฟสจะพบความเขมขนของ FADD ทบรเวณขวของ spindle พรอมทง CaM และ CKIα ซง Papoff และคณะกลาววา CaM จบกบ DD ของ FADD โดยม Ca2+ รวมดวย นอกจากนพบวา โปรตนทอยในกลม DD domain สามารถจบกบ CaM ได เชน Fas หรอ FLIP อกทงไมพบการเกดปฏสมพนธระหวาง การจบกนระหวาง FADD และ CaM ไมตองการการเตมหมฟอสเฟตของ FADD แตอยางใด (Papoff et al., 2010) โดย c-FLIP (Cellular FLICE-inhibitory protein) เปน antiapoptotic protein ทชวยยบยงกระบวนการการตายของเซลลไดเชนเดยวกบ caspase 8 แตไมม cystein ในโครงสราง แตมหลายรายงานการวจยทไมพบการเกดปฏสมพนธระหวาง CaM กบ FADD เปนทนาสนใจวาการจบกนของ CaM-Fas, CaM-FLIP ท าใหเกดกระบวนการทตรงขามกบ Fas-FADD-Caspase8 ของ DISC ทสงตอสญญาณของ apoptosis

13

1.2.2 TRIM21 Tripatite motif-containing 21 หรอ TRIM21 1) แหลงผลตและโครงสรำง Tripatite motif-containing 21 (TRIM21) หรอ Ro52/SSA (Chan et al., 1991;

Itoh et al., 1991) จดเปนโปรตนในกลมของ TRIM Superfamily (tripartite motif) (Nisole et al., 2005) ซงเปนโปรตนกลมใหญทพบยนนในมนษยมากกวา 75 ยน นอกจากนยงพบการแสดงออกของยนทคลายกนนในสงมชวตหลายชนดทงไพรเมต ปลา หรอในกลมของหนอนตวกลม โปรตนเหลานถกคนพบวามสวนเกยวของกบการเจรญพฒนา การควบคมวฏจกรเซลล ภมคมกนโดยก าเนด และการตอบสนองตอไวรส TRIM family protein ถกเรยกอกชอหนงวา RBCC protein เนองจากมโครงสรางเปน 4 โดเมนอนรกษ คอ RING, B-box, และ coiled-coil (RBCC) (Reymond et al., 2001) ส าหรบในมนษยนน พบการแสดงออกของ TRIM21 ทระดบต า ๆ ในเกอบทกเซลลและถกกระตนดวยการควบคมของอนเทอรเฟอรอน (interferon-IFN) โดยถกสรางและท างานในไซโตพลาสแตสามารถเขาออกนวเคลยสได (shuttle) โดยเปนยนทอยบนโครโมโซมคท 11 ทต าแหนง p15.5 (11p15.5) มขนาด 8,800 เบส ทแบงเปน 6 axon เมอแปลรหสเปนโปรตนจะมขนาด 475 อะมโนแอซด น าหนกประมาณ 54 KDa ส าหรบโครงสรางของ TRIM21 Protein ประกอบดวย 4 โดเมนทเรยงจากปลายอะมโนดงน คอ Ring, B-box, coiled-coil และ B30.2/PRY-SPY domain ดงรปท 1.6

รปท 1.6 แสดงโครงสรางของ TRIM21 พรอมขอบเขตของแตละโดเมน RING โดเมนมลกษณะของ Zinc finger ทสามารถจบ Zinc 2 โมเลกลและม

กจกรรมของ E3 Ubiquitin ligase ซงท าหนาทในการเชอมตอโมเลกล Ubiquitin ทถกกระตนแลวกบซบสเตรทซงมไดหลายชนด เชน p27 cell cycle inhibitor, IRF3, IRF7, IRF8 รวมทงโมเลกล TRIM21 เองดวย ซงกอใหเกดการปองกนการบกรกของไวรส (Higgs et al., 2008) B-box โดเมนยงไมทราบหนาทแนชด สวน coiled-coil โดเมนจ าเปนตอการเกดปฏสมพนธกบโมเลกลของ TRIM เอง (self aggregation) เนองจากโดเมนนสามารถพบในโปรตนหลายชนดโดยสามารถสงเสรมใหเกด dimer หรอ trimer ได และมต าแหนงของ leucine zipper แทรกอยชวง 211-232 ซงเปนต าแหนงจดจ าของ autoantibody ในผ ปวย Sjogren’s Syndrome และ CC domain นาจะมสวนส าคญในการทท าให TRIM21 อยในไซโตพลาส (Rhodes et al., 2002) ส าหรบ B30.2

14

domain ท าหนาทในการเกดปฏสมพนธกบโปรตนอนและมสวนเกยวของกบระบบภมคมกน(Ottosson et al., 2006) ซง CC และ B30.2 domain มสวนเกยวของกบการเขาสนวเคลยส เนองจากมการทดลองพบวา TRIM21 ทขาด leuzine zipper ใน CC domain จะเขาไปสะสมในนวเคลยส ตอเมอตดสวนของ B30.2 domain ดวย โปรตนนจะไมเขาสนวเคลยส แต TRIM21 ไมม NES sequence ทใชในการเหนยวน าเขานวเคลยส จงเปนไปไดการเขาสนวเคลยสเกดจาก B30.2 หรอ PRY-SPY domain ซงเปนโดเมนทางปลายคารบอกซลก อาจตองอาศยการเกด post-translational modification บางอยาง หรอดวยกระบวนการ “piggy-back mechanism” ซงเปนกระบวนการน าสงโปรตนเขาสนวเคลยสโดยทางออมผานการเกดปฏสมพนธกบโปรตนขนสง (shutting protein) ทมสญญาณ NLS ภายในโครงสราง จงตองมการศกษาเพอเพมความชดเจนของกระบวนการขนสง TRIM21 เขาสนวเคลยสตอไป ตวอยางของกระบวนการ “piggy-back mechanism” เชน โปรตน 46-kDa subunit ของ DNA primase ในหนซงไมมสญญาณ NLS แตเขาสนวเคลยสระหวางการเกดปฏสมพนธกบ 46-kDa subunit ทมสญญาณ NLS (Chan et al., 1995; Espinosa et al., 2008; Mizuno et al., 1996; Oke & Wahren-Herlenius, 2012)

2) TRIM21 กบกำรท ำหนำทในระบบภมคมกน จากทกลาวมาแลววา TRIM21 (Ro52) หรอ Tripatite motif containing-21 เปน

หนงในกลมของ TRIM protein ทมการแสดงออกในทกเซลล และถกกระตนดวยการควบคมของ อนเทอรเฟอรอน (interferon-IFN) TRIM หลาย ๆ ตวมความเกยวของกบการตอตานไวรส เชน การเหนยวน า RIG-1 (Retinoic acid-inducible gene I) ตองการการแสดงออกของ TRIM25 และ TRIM5 เปน factor จ าเพาะตอ HIV (Adachi et al., 1995; Gack et al., 2007; McNab et al, 2011; Stremlau et al., 2004) การศกษาในหนทขาด TRIM21 พบวา TRIM21 จะท าหนาทในการควบคมยอนกลบแบบลบ (negative feedback) ของการสรางไซโตไคน โดยเซลล splenocyte ทขาด TRIM21 จะสราง inflammatory cytokines เพมขน รวมทง type I interferon เมอไดรบ CpG DNA (Espinosa et al., 2009; Yoshimi et al., 2009) นอกจากน TRIM21 ยงเกยวกบการสราง inflammatory cytokines ผานทาง NF-kB ดวยการควบคมยอนกลบแบบลบตอ NF-kB พบวา TRIM21 จบกบ fragment crystallizable region (Fc region) ของ immunoglobulin แบบม สมพรรคภาพสง (high affinity binding) ซงจะจบกบไวรสทเขาสเซลลไปท าลายยง proteasome ผานทาง ubiquitin ligase activity ทจะเกดขนอยางรวดเรวกอนทไวรสจะสามารถแปลรหสโปรตนของตวเองได

15

จากการทดลองของ Manocha และคณะในป 2014 พบวาการไดรบ Japanese encephalitis virus (JEV) กระตนใหเกดการตอบสนองทางภมคมกน ท าใหเกดการสราง type I interferon และการสรางนถกควบคมดวยหลายโมเลกล ซง JEV จะเพม TRIM21 และการท างานของภมคมกนโดยก าเนด (innate immunity) โดยการเพม IFN-β ผาน interferon regulatory factor 3 activation และการเตมหมฟอสเฟตของ TRIM21 (p-TRIM21) ทมากขนจะกด p-IRF และ IFN-β ในขณะทการลด TRIM21 จะเพมการสราง p-IRF3 และ IFN-β ในเซลลทตดเชอ JEV ขนตอนทส าคญในการกระตน innate immunity เพอตอตานการตดเชอไวรส รวมทง JEV คอการสราง type I interferon การปรากฏของไวรสจะถกจบโดย pattern recognition receptors (PRRs) เชน retinoic acid-inducible gene 1 (RIG-I) และToll-like receptors (TLRs) ซงเปนการท างานรวมกน การทดลองเพมการแสดงออกของ TRIM21 กอนการรบเชอ JEV ท าใหลดระดบของ p-IRF3 เมอเทยบกบเซลลทไมไดรบการเพม TRIM21 ซง Manocha และคณะเชอวา TRIM21 สามารถชะลอการท างานของ JEV ตอ IRF3 ได เมอไดรบเชอ JEV การท างานของ TLRs และ RIG-I ท าใหเกดการเตมหมฟอสเฟตให IRF3 จากนนเขาสนวเคลยสน าไปสการสราง IFN-β ออกไป เมอมปรมาณมากพอจะกระตน TRIM21 ใหยบยงการเตมฟอสเฟตให IRF3 ท าใหลดการสราง IFN-β ลง ซงการ up regulate ของ TRIM21 แบบควบคมยอนกลบ (feedback mechanism) ตอการตอบสนองตอระบบภมคมกน (immune response) นอกจากน RING และ PRY-SPRY domain จ าเปนตอการควบคมการแสดงออกของ IRF3 โดยการเกดปฏสมพนธและท าลายดวย proteasome ซง TRIM21เปนโปรตนททราบอยแลววาท าหนาทในการปองกนไวรสดวย activity จ าเพาะตอแตละชนดของไวรส เชน TRIM79 มความจ าเพาะตอการเพมจ านวน ดเอนเอ (replication) ของ TBEV (Manocha et al., 2014) นอกจากนความผดปกตของการแสดงออกของ TRIM21 มความเกยวของตอการเกดโรคในกลมของภมค มกน คอกลมอาการของโรคภมค มกนตอตานตนเอง (autoimmune disease) Sjögren syndrome (Chan et al., 1991; Itoh et al., 1991) เปนตน ซง Sjogren’s Syndrome หรอโรคปากแหงตาแหงจดเปน non-organ specific autoimmune disease ทม พยาธสภาพเกดขนไดในหลายอวยวะ เชนเดยวกบโรค systemic lupus erythematus (SLE) และ rheumatoid arthritis เปนตน เปนกลมอาการทจะมความบกพรองอยางรนแรงในการท างานของตอมตางๆ ซงท าหนาทสรางน าหลอเลยงใหเกดความชมชนแกรางกาย ผลคอท าใหอวยวะบางแหงของรางกายเกดอาการไมสบายตางๆ จากการขาดน าหลอเลยงน เชน การขาดน าลายท าใหปากแหง ขาดน าตาท าใหตาแหงและไมสบายตา เปนตน TRIM21 ถกระบวามสวนเกยวของกบการเกด

16

โรค Sjogren’s Syndrome และ SLE เนองจาก anti-TRIM21 ในผ ปวยกลมน และระดบของโปรตน TRIM21 เพมขนในเซลลระบบภมคมกนชนดนวเคลยสเดยว (Peripheral Blood Mononuclear Cell -PBMC ) ของผ ปวย (Adachi et al., 1995; Espinosa et al., 2006; Rhodes et al., 2002)

1.2.3 กำรเกดปฏสมพนธระหวำง FADD & TRIM21 กบผลตอระบบภมคมกนโดยก ำเนด (innate immunity)

จากทกลาวมาแลววาการสรางไซโตไคน เชน type I IFN จ าเปนตอ innate immunity ดงนนการม cytokine ไมเพยงพอท าใหเจาบานตดเชอไดงายขน แตถามปรมาณมากเกนไปจะท าใหเกดการอกเสบขนได จงตองมการควบคมอยางรดกม จากการศกษาทผานมาพบวา Tripatite motif-containing 21 (TRIM21) มผลตอความเสถยรภาพของ interferon regulatory factor 7 (IRF7) การ overexpression ของ FADD สงผลให ubiquitination activity ของ TRIM21 เพมขน ท าให IRF7 ซงเปนซบสเตรทตวหนงของ TRIM21 ถกเตมหม ubiquitin น าไปสการท าลาย IRF7 ผานทาง proteasome complexes ซง IRF7 เปน transcription factor ทจ าเปนตอการแสดงออกของ IFN-α gene เมอปรมาณของ IFN-α ลดลง ท าใหประสทธภาพของการก าจดและปองกนไวรสทบกรกเซลลตกต าลง (Young et al., 2011)

ในการทดลองของ Young และคณะในป 2011 พบวามการเกดปฏสมพนธระหวาง FADD และ TRIM21 ทงใน in vitro และ in vivo โดย TRIM21 และ FADD ท างานรวมกนในระบบภมคมกนโดยก าเนด (Innate immunity) และยงไมทราบวาแนชดวาโปรตนทงสองจบกนไดอยางไร โดย FADD ใชกรดอะมโนล าดบท 74 ชวยในการสรางปฏสมพนธกบ TRIM21 การ mutate D74A ใน DED ของ FADD ท าใหระดบการเกดปฏสมพนธต า เปนไปไดวาปฏสมพนธน ตองการตวแปรอนดวย และในการทดลองพบวา TRIM21 ทขาด B30.2 domain ไมสามารถเกดปฏสมพนธกบ FADD ได ทางผวจยสรปวา FADD และ TRIM21 ท างานรวมกนในการควบคมในทาง negative regulation ใสวนทายของ IFN-α pathway ในการตอบสนองตอการตดเชอไวรส(Young et al., 2011; Yu et al , 2005) ดงนน B30.2 จ าเปนแตไมทราบวาเพยงพอหรอไมในการเกดปฏสมพนธกบ FADD และการใชเพยง DED ของ FADD สามารถเกดปฏสมพนธนไดหรอไม

ซง FADD เกดปฏสมพนธกบ TRIM21 เพอ down regulate การสรางไซโตไคน ในขณะท TRIM21 นนม negative feedback loop เพอควบคมปรมาณ inflammatory cytokines การลด TRIM21 ท าใหปรมาณของ pro-inflammatory cytokines มากขนและเพมการตอบสนองตอการแสดงออกของ IFN-α นอกจากนพบวา TRIM21 เกยวกบการ proteolysis ของแอนตบอด

17

การควบคม TRIM21, FADD และ TRAF6 ทเปนจดเรมตนของ inflammatory cytokines สงผลตอ IFN ดวย

จากการทบทวนวรรณกรรมทผานมาจะเหนไดวา ทง FADD และ TRIM21 ตางกเปนโปรตนทมความส าคญ และมหนาททนาสนใจ ไมวาจะเปนหนาทตอกระบวนการ apoptosis การเจรญแบงตวของเซลลของ FADD หรอหนาทในการปองกนการตดเชอไวรสของ TRIM21เมอการเกดปฏสมพนธของโปรตนทงสองกอใหเกดหนาทและความสามารถทมากขนจากการทดลองของ Young และคณะ ในป 2011 ทพบวา DED domain ของ FADD สามารถเกดปฏสมพนธกบ TRIM21 ทมสวนของ CC และ B30.2 domain ได และ หากขาด B30.2 domain ปฏสมพนธนจะเกดขนไมได (Young, et al., 2011) ดงนนผวจยจงมความสนใจทจะศกษาต าแหนงโดเมนของการเกดปฏสมพนธใหมากขนวา B30.2 domain มจ าเปนและเพยงพอตอการเกดปฏสมพนธนหรอไม เปาหมายในระยะยาวของงานวจยนคอการทสามารถเขาใจความความสมพนธและหนาทของโปรตนทงสองเนองจากหนาทอนหลากหลาย อนจะเปนความรพนฐานในการปองกนและรกษาการตดเชออารเอนเอไวรส เพอสขภาวะทดของมนษยตอไป

18

วตถประสงคของกำรวจย 1. เพอวเคราะหปฏสมพนธระหวางโปรตน TRIM21 และ FADD

2. เพอศกษาความจ าเปนและเพยงพอของ B30.2 domain จากโปรตน TRIM21

ในการเกดปฏสมพนธกบโปรตน FADD

19

บทท 2

2.1 วสดอปกรณและวธกำรทดลอง

สารเคม

Absolute ethanol Labscan, ไทย

Ammonium persulfate MERCK, ไทย

Ampicillin รพ.สงขลานครนทร, ไทย

Arabinose Biobasic, ไทย

Benzamdine Across organics, ไทย

Betaine Biobasic, ไทย

Bovine serum albumin NEB, ไทย

Butanol Labscan, ไทย

Chloramphenicol รพ.สงขลานครนทร, ไทย

Carboxy methyl cellulose SIGMA, ไทย

Cobalt chloride hexahydrate acs MP Biomedical, ไทย

Complete Protease Inhibitor Roche, ไทย

Coomassie brilliant blue R-250 SIGMA, สงคโปร

Dextrose Fluka, ไทย

Deoxynucleotide-5’-triphosphate AMRESCO, ไทย

d-Desthiobiotin SIGMA, ไทย

Diatomaceous earth non-washed, Sio4 appear 90% SIGMA, ไทย

DNA Ladder 100 bp plus NEB, RBC, ไทย

Dithiothreitol (DTT) Promega, ไทย

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco, ไทย

Tween 20 Labscan, ไทย

Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) MERCK, ไทย

สำรเคม บรษทผผลต, ประเทศ

20

ECL Anti-Mouse IgG Horseradish Peroxidase-Linked GE Healthcare, ไทย

ECL Anti-Rabbit IgG GE Healthcare, ไทย

Enhance Chemiluminescent (ECL) Thermo Scientific, ไทย

Ethylene diamine dihydrochloride Biobasic, ไทย

Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) MERCK, ไทย

Fetal bovine serum Gibco, ไทย

Glutathione Sepharosetm 4B GE Healthcare, ไทย

Guanidine hydrochloride SIGMA, สงคโปร

Human embryonic kidney cell HEK293T cell ATCC# CRL-11268, USA

2-(4-hydroxyphenylazo) benzoic acid Acros organics, ไทย

Imidazole Fisher Scientific, ไทย

Isopropanol Labscan, สงคโปร

Isopropylthio-β-galactosidase (IPTG) Biobasic, ไทย

LipofectamineTM 2000 Invitrogen, ไทย

β-mercaptoethanol BDH biochemical, ไทย

ANTI-FLAG® M2 Monoclonal antibody SIGMA, สงคโปร

N,N’-methylene-bis-acrylamide SIGMA, สงคโปร

N,N,N’.N’-tetramethyl-1,2-diaminoethane (TEMED) Fluka, ไทย

Non-fat milk SIGMA, สงคโปร

Octyl phenoxypolyethoxylethanol-40 (Nonidet P-40) Biobasic, ไทย

Peptone HIMEDIA, ไทย

Phenol reagent AMRESCO, ไทย

Ponceau S sodium salt SIGMA, สงคโปร

Prestained molecular weight marker NEB, BioRAD, ไทย

Protein A bead Thermo Scientific, ไทย

Protein molecular weight marker GE Healthcare, ไทย

21

Rabbit polyclonal to HA tag – ChIP Grade Abcam, ไทย

Rabbit polyclonal to 6xHis tag – ChIP Grade Abcam, ไทย

Sodium azide Labscan, ไทย

Sodium fluoride MERCK, ไทย

Sodium orthovanadate Biobasic, ไทย

Sorbitol Biobasic, ไทย

Sterp-tactin Sepharose IBA, สหรฐอเมรกา

Supersignal west Pico chemiluminescent substrate Thermo Scientific, ไทย

TALON® Metal Affinity resin Clontech, ไทย

Triton X-100 SIGMA, ไทย

TransIT®-LT1 Transfection Reagent Mirus, สหรฐอเมรกา

TE (Tris-EDTA) AMRESCO, ไทย

Tryptone HIMEDIA, ไทย

Trysin/EDTA invitrogen, ไทย

Yeast extract Labscan, ไทย

22

Restriction enzymes NEB, สหรฐอเมรกา

Ribonuclease A, Bovine Pancreas (RNase A) USBiological, สหรฐอเมรกา

Polynuceotide kinase NEB, สหรฐอเมรกา

Pƒu DNA polymerase จาก ดร.เดชา เสรมวทยวงศ

T4 DNA ligase NEB, สหรฐอเมรกา และจาก ดร.เดชา

เสรมวทยวงศ

Enzyme and restriction enzyme

23

หมอนงฆาเชอดวยความดนไอน า ES315 TOMY

เครองชง 4 ต าแหนง AB204-S METTLER TOLEDO

เครองชง 2 ต าแหนง PG5002-S METTLER TOLEDO

เครองแยกดเอนเอดวยกระแสไฟฟา

(agarose gel electrophoresis system) Mupid

ไมโครออโตปเปตพรอมทป ขนาด 0.2-10, 2-20, 10-100, 100-1000 µl

เครองหมนเหวยงความเรวสง AvantiTM J-30 Beckman

ตปลอดเชอ Class 2 Type A2 ESCO

เครองผสมสาร Vortex-mixer GENESYS

อางน าปรบอณหภม EcoTempTW20 JUlabo

เครองแกวพนฐาน (โกรงบด กระบอกตวง ขวดรปชมพ บกเกอร หลอดทดลอง เปนตน)

จานอาหารเลยงเชอ (petri dish) ขนาดเสนผาศนยกลาง 9 เซนตเมตร

อปกรณพลาสตกส าหรบ cell culture

ชอนโลหะและชอนพลาสตกส าหรบตกสาร

CO2 water Jacketed incubator IR AUTOFLOW NUAIRE

Gel Document BioDoc-ItTM system UVP

Microcentrifuge Mikro 200R Hettich zentrifugen

Orbital shaking incubator Thermo electron corporation

pH meter 713pH Metrohm

Polyacrylamide gel electrophoresis ATTO

Semi-dry blotting transfer ATTO

Spectrophotometer 8453 HEWLETT PACKARD

Spectrophotometer Genesys 20Thermo Scientific

Sonicator VCX130 vibra cellTM (tip รน 130-0438)

Thermal cycler Mycycler BIORAD

อปกรณกำรทดลอง รน บรษทผผลต

24

2.2 กำรโคลนยน hFADD และ hTRIM21

2.2.1 กำรเตรยม Bacterial competent cells เรมจากการน าเซลลมาสตรค (streak) ลงบนอาหารแขง TYE (1% Bacto-

tryptone, 0.5% yeast extract, 0.8% NaCl, 1.5% agar) และผสมยาปฏชวนะตามความจ าเปน บมท 37๐C 12-16 ชวโมง เขยเชอ 1 โคโลนลงเลยงในอาหารเหลว 2xTY (1.6% Bacto-tryptone, 1% yeast extract, 0.5% NaCl) 50 ml เขยาทอณหภม 28๐C 220 รอบตอนาท ประมาณ 3-4 ชวโมง ตดตามความขนของเซลลทความยาวคลน 600 nm ใหไดประมาณ 0.4 ดดอาหารเหลวใสในอาหารเหลวขวดใหม 50 ml ทเตม competent cell salt solution (0.44 M MgCl2, 0.44 M MgSO4, 0.11 M KCL) 1.1 ml ใหมความเขมขนเซลลสดทายมคา OD600 เทากบ 0.04 เพอใชเปนตวตงตนเลยงท 18๐C 220 รอบตอนาท ประมาณ 20 ชวโมง ตดตามการเจรญเตบโตของเซลลจากความขนทความยาวคลน 600 nm จนกระทง OD600 เทากบ 0.4 น าภาชนะเลยงเซลลแชในทน าแขงหรอ 4๐C 10 นาท เกบเซลลดวยการหมนเหวยงดวยเครองหมนเหวยงความเรวสงท 2000 รอบตอนาท 10 นาท เทอาหารเลยงทง ละลายตะกอนเซลลดวย transformation buffer (FB) (10 mM PIPES, 250 mM KCl, 15 mM CaCl2 pH 6.7 ) ซงผานการท าใหเยนแลว 30 ml ทงไวบนน าแขง 10 นาท ปนเกบเซลลอกครงทความเรวและเวลาเดม แลวจงละลายตะกอนดวย FB 8 ml จากนนคอยๆ หยด 100% DMSO 0.6 ml ในสารละลายเซลลใน FB พรอม ๆ กบการหมนหลอดเซลลเพอปองกนไมใหความเขมขนตอพนทของ DMSO มากเกนไป เนองจากความเปนพษอาจสงผลตอคณภาพของคอมพเทนทเซลลได แบงบรรจลงในหลอดทดลองขนาด 1.5 ml หลอดละ 100 และ 200 µl ท าใหเยนลงอยางรวดเรวดวยไนโตรเจนเหลว แลวเกบไวท –80๐C จนกวาจะท าการทดลองตอไป สวน JM109/Chap ทใชเปนเซลลเจาบาน เกดจากการทยาย chaperone plasmid pG-KJE8 (TaKaRa) เขาสเซลล E.coli JM109 กอนแลวจงน าเซลลทมพลาสมดนมาเตรยมเปนเซลลเจาบานตอไป

2.2.2 กำรเตรยม vector/insert การวจยในครงนท าทงใน in vitro และ ex-vivo จงตองใช expression vector

ตางชนดกน โดยในแบคทเรยใชพลาสมด pST50Trc1 ส าหรบยน hFADD, pST50Trc2 ส าหรบ hTRIM21 และ pST44 ซงเปน co-expression vector ส าหรบแบคทเรย พลาสมดเหลานไดรบความอนเคราะหจาก Prof. Dr. Song Tan แหง The Pennsylvania State University สวนการทดลองใน Ex-vivo ซงเปนการทดลองในระบบ tissue culture ใชพลาสมด pCI และ pcDNA3

25

โดยไดรบการอนเคราะหพลาสมด pCI vector, pCI-hFADDHisFlag และ pCDNA3-HAhTRIM21 จาก Prof. Dr. Astar Winoto แหง University of California at Berkley

ท าการยอยเวกเตอรดเอนเอใหเปนสายเดยวเสนตรงดวย restriction enzyme ทเหมาะสมกบ insert ดเอนเอทตองการ ซงในปฏกรยาประกอบดวย พลาสมด 3 µg, 1x NEBuffer, 3 µg BSA, 0.1 mM DTT, 15 U restriction enzyme ในปรมาตรทงหมด 30 µl บมท 37 ๐C เปนเวลา 3 ชวโมง สวนกรณทมการใช restriction enzyme สองชนด หรอ double digestion นนท าไดพรอมกนโดยเลอกชนดบฟเฟอรทเหมาะสมตามการแนะน าของบรษทผ ผลต ยกเวนในกรณทเลอกใช BamHI - NgoMIV, BamHI - BsrGI หรอ XbaI - BglII จะตองยอยทละชนด (sequencial digestion) ตามตารางตอไปน

ตำรำงท 2.1 แสดงกำรท ำ double digestion Enzyme to use Digest 1 Digest 2 BamHI & NgoMiV

digest with NgoMIV in NEBuffer 4 for 90 min

Add 150 mM NaCl and BamHI for 90 min

BamHI & BsrGI digest with BsrGI in NEBuffer 2 for 90 min

Add 100 mM NaCl and BamHI for 90 min

XbaI & BglII digest with XbaI in NEBuffer 2 for 90 min

Add 50 mM NaCl and BglII for 90 min

จากนนตดแยกสวนของ vector ทตองการดวยการท า agarose gel electrophoresis ตามขอ 2.2.3 และ gel purification ขอ 2.2.4

2.2.3 กำรท ำ agarose gel electrophoresis การท า agarose gel electrophoresis เปนวธมาตรฐานทใชในการทดลองทาง

อณชววทยาเพอการทดสอบความเหมอน การแยก หรอการท าบรสทธดเอนเอ โดยการเตรยม agarose 1.5 % ใน TAE buffer (40 mM Tris-HCl, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA) ดวยขวดรปชมพใหความรอนจนละลายไดทวกนทงใหเยนตวเลกนอยกอนเทลงในถาดเจล เมอเจลแขงพรอมใชงาน น าตวอยางทตองการมาผสมกบ 6x gel loading buffer (60% Glycerol, 10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 60 mM EDTA, 0.03% Bromophenol Blue, 0.03% Xylene Cyanol) หยอดตวอยางลงในเจลและแยกขนาดดเอนเอภายใตสนามไฟฟาใน TAE buffer ก าหนดความตางศกยคงท 100 โวลต เสรจแลวน ามาแชในสารละลาย Ethidium bromide ความเขมขน 10 µg/ml 3

26

นาท ลางในน ากลน 25 นาท จงน าไปสองภายใตแสง UV ดวยเครอง Gel Document (BioDoc-ItTM system) หรอ UV box เพอตรวจสอบความถกตองหรอตดแยกดเอนเอเพอท าบรสทธตอไป โดยเทยบกบ ดเอนเอมาตรฐาน 100 bp DNA ladder หรอ 2 log DNA marker

2.2.4 กำรท ำ gel purification หลงผานการท า agarose gel electrophoresis ตดแยกสวนของ vector ภายใต

แสงยวใสในสปนคอลมน (spun column) ทถกเจาะรและม glass wool เตรยมไวปนทความเรว 7,000 รอบตอนาท เปนเวลา 5 นาท เจลจะถกดงผาน glass wool ลงมาและไดผลตภณฑเปนสารละลายใสพรอมใชส าหรบการทดลองตอไป ดงรปท 2.1

รปท 2.1 ภาพแสดงสปนคอลมนทเตรยมขนจากหลอดทดลองขนาด 0.5 และ 1.5 ml โดยแสดงภาพกอนและหลงการปนตกทชน agarose gel ถกดงผาน glass wool ไดเปนสารละลายทกนหลอดทดลอง

2.2.5 กำรเตรยมชนดเอนเอยนส ำหรบ hFADD และ hTRIM21 การทดลองครงนไดออกแบบ primer เพอการท า PCR หรอเพอเปน tag ซงจะ

ชวยในกระบวนการท าบรสทธโปรตน ตารางตอไปนแสดง primer ทใชในการทดลอง

ตำรำงท 2.2 แสดง primer พรอมต ำแหนงทใชในกำรทดลอง Primer name Sequence Description DS001-HisSTR

CCGGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCTGGTCTCATCCGCAGTTTGAAAAATAAT

top strand primer to create C-terminal HisSTR tags between NgoMIV and BsrGI sites in pST50Trc1 vector

DS002-HisSTR

GTACATTATTTTTCAAACTGCGGATGAGACCAGCTGCTGTGATGATGATGATGATGG

bottom strand primer to create C-terminal HisSTR tags between NgoMIV and BsrGI sites

27

Primer name Sequence Description DS003-HAHis TATGTACCCGTATGACGTCCCG

GATTACGCACATCATCATCATCATCACG

top strand primer to create N-terminal HA-His tandem tags between NdeI and BamHI sites in pST50Trc2 vector

DS004-HAHis GATCCGTGATGATGATGATGATGTGCGTAATCCGGGACGTCATACGGGTACA

bottom strand primer to create N-terminal HA-His tandem tags between NdeI and BamHI sites in pST50Trc2 vector

DS007-hFADD

GGCCAATTCATATGGACCCGTTCCTGGTGCT

forward primer to PCR amplify hFADD to create pST50Trc1-hFADDHisSTR and attach 5' NdeI restriction site

DS008-hFADD

CAGCCGGCAGACGCTTCGGAGGTAGAGACGCTTCGGAGGTAGATGCG

reverse primer to PCR amplify hFADD to create pST50Trc1-hFADDHisSTR and attach 3' NgoMIV restriction site

DS009-hTRIM21

CCTAGATCTGCTTCAGCAGCACGCTTGAGCTAGTGGATCCTTGTGATCC

Forward primer to PCR amplify hTRIM21 to create pST50Trc2-HAhTRIM21 and pST50Trc2-HAHishTRIM21 vector and attach 5' BglII restriction site

DS010-hTRIM21

CGCTGTACATCAATAGTCAGTGGATCCTTGTGATCC

Reverse primer to PCR amplify hTRIM21 to create pST50Trc2-HAhTRIM21 and pST50Trc2-HAHishTRIM21 vector and attach 3' BsrGI restriction site

DS018-hTRIM21

CCGAGATCTGGGCTGAAGAAGATGCTGAG

Forward primer to PCR amplify hTRIM21(276-475) and attach 5' BglII restriction site

DS019-hTRIM21

AGCAGGAGTTGGCTGAGAAG Forward sequencing primer for hTRIM21 at 465 bp

DS020-hFADD

CAGCCGGCTTCTTCCCCAGCGCGGCCC

Reverse primer to PCR amplify hFADD1(2-95) to create pST50Trc1-hFADDHisSTRΔ1 and attach 3' NgoMIV restriction site

DS021-HA TATGTACCCGTATGACGTCCCGGATTACGCAG

top strand primer to create N-terminal HA tags between NdeI and BamHI sites in pST50Trc2 vector

28

Primer name Sequence Description DS022-HA GATCCTGCGTAATCCGGGACGT

CATACGGGTACA bottom strand primer to create N-terminal HA tags between NdeI and BamHI sites in pST50Trc2 vector

DS025-T7 GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACT

Forward sequencing primer for T7 promoter

DS026-T7 TATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTG

reverse sequencing primer for T7 promoter

DS028-hFADD

GCATTTAACGTCATTTGTGATAATGTGGG

forward SDM primer to mutate an internal NdeI site in hFADD

DS029-hFADD

CCCACATTATCACAAATGACGTTAAATGC

reverse SDM primer to mutate an internal NdeI site in hFADD

DS032-pCIrev CACTGCATTCTAGTTGTGG reverse sequencing primer for pCI vector DS037-hTRIM21

CCTAGATCTGTCCACATCACTCTGGATCC

Forward primer to PCR amplify hTRIM21 (287-465) and attach 5' BglII restriction site

DS038-hTRIM21

CGCTGTACATTACAGTGGACAGAGGGTTAGAG

Reverse primer to PCR amplify hTRIM21(287-465) and attach 3' BsrGI restriction site

DS039-hFADD

CGAGTCCAAGTACCTATGCCTCG

Forward SDM primer to mutate F25 to Y25 in FADD

DS040-hFADD

CGAGGCATAGGTACTTGAGCTCG

reverse SDM primer to mutate F25 to Y25 in FADD

DS043-STR CCGGCTGGTCTCATCCGCAGTTTGAAAATAAT

top strand primer to create a C-terminal STR tags construct between NgoMIV and BsrGI sites

DS044-STR GTACATTATTTTTCAAACTGCGGATGAGACCAG

bottom strand primer to create a C-terminal STR tags construct between NgoMIV and BsrGI sites

DS053-GST GCGCTAGCGCCACCATGTCCCCTATACTAGGTTATTG

Forward primer to PCR amplify GST tag, KOZAK seq and attach 5' NheI restriction site

DS054-GST GCGAATTCACGACCTTCGATCAGATC

reverse primer to PCR amplify GST tag and attach 3' EcoRI restriction site

29

Primer name Sequence Description DS055-hTRIM21

GCGAATTCGCTTCAGCAGCACGC

forward primer to PCR amplify hTRIM21 and attach 5' EcoRI restriction site to create pCI-GSThTRIM21

DS057-hTRIM21

GCGAATTCGCTGCACAGGAGTACC

forward primer to PCR amplify hTRIM21 (131-475) and attach 5' EcoRI restriction site to create pCI-GSThTRIM21D3

DS058-hTRIM21

GCGAATTCGGGCTGAAGAAGATGCTGA

forward primer to PCR amplify hTRIM21 (276-475) and attach 5' EcoRI restriction site to create pCI-GSThTRIM21Δ1

DS056-hTRIM21

CCGGTACCTCAATAGTCAGTGGATCCTTG

reverse primer to PCR amplify hTRIM21 and attach 3' KpnI restriction site

DS059-pCI CTCTTTGCGTTTCTGATAGG Forward sequencing primer for pCI vector (108 bp upstream of NheI )

DS060-pCI TGCAGCTTATAATGGTTACAAAT reverse sequencing primer for pCI vector (108 bp downstream of KpnI )

DS068-HAtagN

CTAGCGCCACCATGTACCCATATGACGTCCCAGATTACGCAG

Top strand primer to create an N-terminal HA tag (NheI Kozak sequence, start codon, HA tag and EcoRI site)

DS069-HAtagN

AATTCTGCGTAATCTGGGACGTCATATGGGTACATGGTGGCG

Bottom strand primer to create an N-terminal HA tag (NheI, Kozak sequence, start codon, HA tag and EcoRI site)

DS088-hTRIM21

GCGGTACCTTATGGCACATGGCACACA

Reverse primer to PCR amplify hTRIM21Δ4(131-275) and attach 3' KpnI restriction site to create pCI-HAhTRIM21Δ4

DS089-hTRIM21

GCGAATTCGTGCAGCAAAAAAACTTCCTG

Forward primer to PCR amplify hTRIM21Δ5(183-475) and attach 5' EcoRI restriction site to create pCI-HAhTRIM21Δ5

DS091-yGcn4 CGGAATTCAGAATGAAACAACTTGAAGACAAGG

Forward primer to PCR amplify the CC domain of yGcn4 and attach 5' EcoRI restriction site

30

Primer name Sequence Description DS092-yGcn4 CCGGTACCGCGTTCGCCAACT

AATTTCT Reverse primer to PCR amplify the CC domain of yGcn4 and attach 3' KpnI restriction site

DS093-yGcn4 GCGCTAGCTCCGAATATCAGCCAAGTTTA

Forward primer to PCR amplify yGcn4 and attach 5' NheI restriction site

DS094-hTRIM21

GCGGTACCGGGCTGAAGAAGATGCTGA

Forward primer to PCR amplify hTRIM21 and attach 5' KpnI restriction site to create pCI-HAyCChTRIM21Δ1

DS095-hTRIM21

CCTCTAGATTAATAGTCAGTGGATCCTTGTG

Reverse primer to PCR amplify hTRIM21 and attach 3' XbaI restriction site to create pCI-HAyCChTRIM21Δ1

2.2.6 กำรเตรยม insert ดเอนเอดวยกำรท ำ polymerase chain reaction

(PCR) เนองจากการทดลองนมการศกษาคณสมบตของโปรตน hFADD และ hTRIM21

ทโดเมนตางๆ เชน pST50Trc2-HishTRIM21Δ1(276-475) และ pST50Trc2-HishTRIM21Δ2 (287-475) จงใชปฏกรยาลกโซพอลเมอเรส หรอ Polymerase Chain Reaction (PCR) โดยเตรยม mastermix ในอตราสวนตอไปน 1. ส าหรบ 1 ปฏกรยา= 100 µl ประกอบดวย 1x Pfu buffer, 0.25 mM dNTP, 0.5 µM forward และ reverse primer, 10 ng ของดเอนเอตงตน, Pfu polymerase 2 µl 2. ผสมใหเขากนน าเขาเครอง Thermo Cycler โดยก าหนด condition ดงน

ก. Initial denaturation 95๐C 2 นาท 1 รอบ ข. Denatured temperature 95๐C 30 วนาท 5 รอบ Annealing temperature Tm-5๐C 30 วนาท Extension temperature 75๐C 1 นาท/Kb

ค. Denatured temperature 95๐C 30 วนาท 20 รอบ Annealing temperature 58๐C 30 วนาท Extension temperature 75๐C 1 นาท ง. Extension temperature 75๐C 3 นาท 1 รอบ

จากนนเครองจะลดอณหภมลงท 10๐C

31

ในการสรางดเอนเอแตละครงอาจใช annealing temperature (Ta) ไมเทากนขนอยกบ คา melting temperature (Tm) ของ primer คนน ๆ

3. ตรวจสอบ PCR product ทไดดวย agarose gel electrophoresis 1.5% (w/v) และยอมดเอนเอดวย ethidium bromide เปรยบเทยบขนาดของดเอนเอทไดดวย 100 bp DNA ladder (NEB) และอานผลดวย Gel Document

2.2.7 กำรเตมหมฟอสเฟตให oligo DNA เปนการเตมหมฟอสเฟตใหกบปลาย 5’-OH ของ oligo DNA ทงสายบนและลาง

ใชหลอดขนาด 1.5 ml 2 หลอด โดยแตละหลอดมสวนประกอบดงน 1x T4 DNA ligase buffers (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 10 mM DTT) 1 µM oligo 1 หรอ oligo 2 และ 5 unit T4 PNK ในปรมาตรทงหมด 20 µl บมท 37 ๐C 15 นาท น าสารละลายทงสองหลอดมารวมกนเพม 10x TM buffer (100 mM Tris-Cl pH 8.0, 100 mM MgCl2) 10 µl เพมน า MilliQ 50 µl ใหความรอนเปนเวลา 2 นาท ในน ารอนทอณหภม 90๐C ในบกเกอร จากนนปดบกเกอรและทงขามคนเพอใหอณหภมเยนลงชา ๆ วนถดไปท าการสกดดวย phenol chloroform ตามขอ 2.2.8 ซงขนตอนสดทายของการท าบรสทธ annealed oligos ตองท าการผานคอลมน Sephadex G-25 (Amersham Pharmacia Biotech) ทเตรยมจาก micropipette tip ขนาด 1 และ 5 ml ในหลอดทดลองขนาด 15 ml (ยหอ Corning เทานนเพอปองกน 5 ml tip ตดคางในหลอดทดลอง) ดงรปท 2.2

รปท 2.2 ภาพแสดงคอลมน Sephadex G-25 จาก micropipette tip ขนาด 1

และ 5 ml ในหลอดทดลองขนาด 15 ml

32

2.2.8 กำรท ำบรสทธผลตภณฑดเอนเอดวย phenol chloroform เตรยมสารละลาย Phenol ทอมตวดวย TE จากนนผสมกบ CIA (chloroform-

isoamyl alcohol โดยท chloroform:Isoamyl alcohol=24:1) ในอตราสวน 1:1 ใหเปน PCIA ผสมใหเขากนดวยเครองผสมสารละลาย Vortex Mixer 30 วนาท จากนนหมนเหวยงทความเรว 13,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท ผสมกบสารละลายดเอนเอในปรมาตรเทากน เขยาดวยเครอง vortex-mixer 30 วนาท แลวหมนเหวยงเพอแยกชนสารละลายทความเรวและเวลาเดม แยกสารละลายใสสวนบนใสหลอดใหมโดยระวงไมใหปนเปอนตะกอนขาวของโปรตนหรอเศษเซลล น าสารละลายใสผสมกบสารละลาย PCIA ในปรมาตรเทากนอกครง จากนนเขยาใหสารแตกตวและกระจายแลวหมนเหวยงทความเรวและเวลาเดม เกบสวนใสดานบน ท าซ าอกครงดวย CIA เกบสารละลายสวนบนซงมผลตภณฑดเอนเอทบรสทธพรอมส าหรบการทดลองตอไปหรอน าไปตกตะกอนดวยเอทานอลเพอใหไดความเขมขนทสงขน

2.2.9 กำรตกตะกอนดเอนเอดวยเอทำนอล น าสารละลายดเอนเอทตองการตกตะกอนใส 3M sodium acetate, pH 5.2 ใน

ปรมาตร 0.1 เทาของสารละลาย จากนนเตม 100% เอทานอล 2.5 เทาของปรมาตรเดม ผสมใหเขากนโดยการ vortex 10 วนาท จากนนน าไปหมนเหวยงเพอตกตะกอนดเอนเอทความเรว 13,000 รอบตอนาท ดดสารละลายใสทงใหหมด ปลอยใหตะกอนดเอนเอแหงทอณหภมหองประมาณ 10 นาท จงละลายดวยน า MilliQ หรอ TE buffer (10mM Tris, 0.1mM EDTA) ประมาณ 300 µl.

2.2.10 กำรเพมชน insert ดวย oligo nucleotide การวจยนจ าเปนตองมการสราง insert ดเอนเอของโปรตน FADD และ TRIM21

ตามขนาดและต าแหนงทตองการ รวมทงการเตมโอลโกนวคลโอไทดเพอท าหนาทเปน tag เพอชวยในการท าบรสทธหรอการตรวจสอบโปรตนดวย Western blot (ขอ2.5.8) ซงชน insert ทสรางขนจะสามารถเชอมตอกบเวกเตอรทมอยใน FADD ไดมการเตม tag ทางปลาย C เชน STR tag โดยการสราง oligonucleotides สายสน ๆ (DS043-STR, DS044-STR) ดงตารางท 2.2 และท าการเชอม double stranded oligos ทงสองเขาระหวาง NgoMIV- BsrGI restriction sites สวน TRIM21 จะเตมทางปลาย N โดย การใช DS021-HA, DS022-HA เพอสราง hemeagglutinine (HA) tag เพอน าไปเชอมตอกบชนยน TRIM21 และพลาสมดเวกเตอรทเตรยมไดจากขอ 2.2.2 นอกจากนยงมการสราง vector ทม HisSTR tag (6xHis tag เชอมกบ Strep-tag II (STR) tag) ซง

33

6xHis tag หรอ Strep-tag II (NH2-WSHPQFEK-COOH) เปนสายเปปไทดทมขนาดเลกไมขดขวางการพบมวนของโปรตน โดยการเชอม double stranded oligos DS001-HisSTR, DS002-HisSTR ระหวางต าแหนง NgoMIV และ BsrGI ซงจะได pST50Trc1-HisSTR plasmid บนปลาย C

2.2.11 กำรสรำงชน insert จำกพลำสมด การทดลองนใช vector pST50Trc1 และ c2 ซงมต าแหนงทสามารถเตม tag ได

ทางปลายดาน C เนองจากมล าดบเบสของ His tag อยแลวใน pST50Tr ในการสราง รคอมบแนนทยนทม His tag ทางปลาย N ท าไดโดยโคลนยนทสนใจเขาระหวาง 5’-BamHI และ 3’-NgoMIV BamHI/HindIII site ของ pST50Tr vector หากยนทสนใจมต าแหนงตดจ าเพาะของ restriction enzyme ทใชสามารถแกปญหาโดยการท า site-directed mutagenesis (SDM) เพอเปลยนล าดบเบสโดยทไมเปลยนล าดบของกรดอะมโน การทดลองนสราง pST50Trc2-HishTRIM21, pST50Trc2-HishTRIM21Δ1(276-475) และ pST50Trc2-HishTRIM21Δ2(287-475) และจากพลาสมด pST50Trc1-HisDHFR plasmid สามารถโคลนยนทตองการเขาระหวาง 5’NdeI หรอ BamHI และ 3’NgoMIV เพอใหไดสวน construct ทม FADD (ปกต NdeI จะไมใชเพอ sub cloning ยกเวนในกรณท gene ม BamHI internal sites) อาท เชน pST50Trc1-hFADDHisSTRx1 (x1 แสดงถง mutate NdeI restriction site ใน hFADD) pST50Trc1-hFADDΔ1HisSTRx1 และ pST50Trc1-hFADDΔ1HisSTRx2 (x2 แสดงถง F25Y mutation ใน DED ของ FADD) ดงทแสดงในรปท 2.3 และตารางท 2.3

34

รปท 2.3 แสดงโครงสรางของ (A) insert รวมทง (B) expression และ co-

expression plasmid ทใชในการทดลองในแบคทเรย (Waji, et al., 2011) สวนใน tissue culture ทใช HEK293T cells ซงเปน mammalian cell lines ตอง

ใชพลาสมดทตางไป คอ pCI vector โดยใส GST tag ลงไปในระหวาง 5’NheI และ 3’EcoRI ของ pCI vector เพอสราง pCI-GST construct และการโคลน hTRIM21 สามารถท าได โดยการตด pCI-GST ดวย 5’ EcoRI และ 3’ KpnI และเชอมตอ (ligate) กบชน PCR amplified hTRIM21 ทมความยาวตางๆ ซงได pCI-GSThTRIM21 รวมทง pCI-GSThTRIM21Δ3(131-475) และ pCI-GSThTRIM21Δ1(276-475) อกทงสรางพลาสมด pCI-HAhTRIM21Δ1(276-475), pCI-HAhTRIM21Δ3(131-475), pCI-HAhTRIM21Δ4(131-275), pCI-HAhTRIM21Δ5(183-475) และ pCI-HAyCChTRIM21Δ1 ดงแสดงในรปท 2.4 และตารางท 2.3 เพอใชในการหาต าแหนงทจ าเปนของการเกดปฏสมพนธระหวางโปรตนทงสอง

รปท 2.4 แสดงตวอยางโครงสรางของ insert และ plasmid ทใชส าหรบการทดลองใน tissue culture

35

ตำรำงท 2.3 แสดงรายการพลาสมดทสรางขนเพอใชในการวจยครงน รำยกำรพลำสมดทสรำงขน

ในงำนวจยครงน คณสมบต

pST50Trc1-hFADDHisSTRx1 x1 แสดงถงการเอา NdeI ออกจาก hFADD เสนเตม มการเตม 6x-Histidine (His) กบ Streptavidine (STR) tag ท ปลาย C

pST50Trc1-hFADDΔ1HisSTR x2 x2 แสดงถง F25Y ใน DED domain ของ hFADD (Δ1) และมการเตม 6x-Histidine (His) กบ Streptavidine (STR) tag ท ปลาย C

pST50Trc2-HishTRIM21 hTRIM21 เสนเตม และ 6x-Histidine (His) tag ท ปลาย N

pST50Trc2-HishTRIM21Δ1(276-475) B30.2 domain และสวนสายเปปไทดขนาด 10 aa กอน B30.2 domain ของ hTRIM21 และ 6x-Histidine (His) tag ท ปลาย N

pST50Trc2-HishTRIM21Δ2(287-475) B30.2 domain ของ hTRIM21 และ 6x-Histidine (His) tag ท ปลาย N

pCI-GSThTRIM21 hTRIM21 เสนเตม และ glutatione S-transferase (GST) tag ท ปลาย N เชอมเขาใน pCI vector เพอใชในงาน tissue culture

pCI-GSThTRIM21Δ1 (276-475) B30.2 domain และสวนสายเปปไทดขนาด 10 aa กอน B30.2 domain ของ hTRIM21 และ GST tag

pCI-GSThTRIM21Δ3 (131-475) hTRIM21 ตงแต coiled-coil domain ถง B30.2 domain และ GST tag

pCI-HAhTRIM21Δ1 (276-475), B30.2 domain และสวนสายเปปไทดขนาด 10 aa กอน B30.2 domain ของ hTRIM21 และ Hemagglutinine (HA) tag

pCI-HAhTRIM21∆3 (131-475), hTRIM21 ตงแต coiled-coil domain ถง B30.2 domain และ Hemagglutinine (HA) tag

pCI-HAhTRIM21∆4 (131-275), Coiled-coil domain ของ hTRIM21 และ Hemagglutinine (HA) tag

36

รำยกำรพลำสมดทสรำงขน ในงำนวจยครงน

คณสมบต

pCI-HAhTRIM21Δ5 (183-475) hTRIM21 ตงแตสวนท 2 ของ coiled-coil domain ถง B30.2 domain และ Hemagglutinine (HA) tag

pCI-HAyCChTRIM21Δ1 Sequence เพอสราง chimeric protein ของ TRIM21 โดยใช coiled-coil domain จากยสต Saccharomyces cerevisiae และ B30.2 domain จากมนษย

2.2.12 กำรท ำ ligation เมอไดชนสวนของทงยนทตองการและvectorทเหมาะสมตอการใชแลว จงท าการ

เชอมตอสายดเอนเอทงสองใหเขากน โดยการใช T4 DNA ligase โดยมหลอดทดลองสองหลอดส าหรบ vector กบ insert ทสนใจ และ vector อยางเดยวเพอตรวจสอบประสทธภาพของดเอนเอแตละสวนทผานการยอยดวยเอนไซมตดจ าเพาะ โดยอตราสวนระหวาง vector กบ insert เปน 2:1.5 ในปรมาตรทงหมด 5 µl ซงมสวนประกอบดงน 1x T4 DNA ligase buffer, 0.1 mM DTT, vector 2 µl, insert DNA 1.5 µl, T4 DNA ligase 0.5 µl ผสมทงไว 1 ชวโมง บมทอณหภมหอง ligated DNA ทไดสามารถน าไปใชในการ transform bacterial cells ไดทนท

2.2.13 กำรท ำ site-directed Mutagenesis

เพอสราง F25Y ของ hFADDΔ1 และ เสนเตม วธการท าเหมอนกบการท า PCR ทวไปหากแตใชไพรเมอรทไดออกแบบใหมการเปลยนเบสบางตว และใชเอนไซม Pfu turbo DNA polymerase (Invitrogen) ส าหรบ 1 ปฏกรยา= 25 µl)

1x Pfu buffer, 0.25mM dNTP, 2.8 µM forward primer และ reverse primer 10 ng ของดเอนเอตงตน, เอนไซม Pfu Turbo polymerase (Invitrogen) 0.4 µl

ก. Initial denaturation 95๐C 2 นาท 1 รอบ ข. Denatured temperature 95๐C 30 วนาท 18 รอบ Annealing temperature 55๐C 1 นาท Extension temperature 68๐C 1 นาท/Kb DNA

จากนนเครองจะลดอณหภมลงท 10๐C

37

สงทตองค านงมากเปนพเศษคอการก าหนดอณหภมและเวลาของ Extention เพอปองกนการ overlap และ duplicate จากนนเกบผลตภณฑทได 2 µl เปน –DpnI แลวน าสวนทเหลอมาบมดวยเอนไซม DpnI 1 µl ท 37๐C 1 ชวโมง เปน + DpnI เพอตดสายดเอนเอตงตน (Parent plasmid) เนองจาก DpnI มคณสมบตในการตดจ าเพาะสายนวคลโอไทดทมการเตมหมเมททล (methylated DNA) ซงการเตมนเกดไดเฉพาะในสงมชวตเทานน เนองจากแบคทเรยทใชเลยงเปน Dam methylase positive strain ท าใหในสารละลายเหลอเพยงพลาสมดดเอนเอทเปนผลตภณฑจากการท า PCR จากนนแบงสารละลายดเอนเอทงสองชด (+DpnI และ –DpnI) ทผานการยอยมา 2 µl เพอท าการยายพลาสมดดเอนเอเขาสเซลลเจาบานดวยวธ heat shock transformation ตามขอ 2.2.14 แลวมากระจาย (spread) ลงบนอาหารแขง TYE ทมแอมพซลน 100 µg/ml บมท 37๐C 16-18 ชวโมง เลอกโคโลนทมพลาสมดบน TYE plate ดวยการท า PCR screen ตามขอ 2.2.15 แลวจงเลยงในอาหารเหลว 2xTY ทมแอมพซลน 100 µg/ml เพอสกด พลาสมดและสงตรวจสอบล าดบนวคลโอไทดตอไป

2.2.14 Bacterial transformation วางหลอดทม competent cells จาก –80๐C freezer บนน าแขงเพอใหเซลล

ละลายชาๆ เปนเวลาประมาณ 10 – 15 นาท จากนนใสสารละลายดเอนเอทผานการเชอมตอดวยเอนไซม T4 DNA ligase แลว หรอใชพลาสมดดเอนเอทผานการท า site-directed Mutagenesis (SDM) จากขอ 2.2.13 ในหลอดทมเซลลอยแลว 50 µl (อตราสวน 1:25) ผสมใหเขากน บมตอในน าแขง 15 นาท จงน าเซลลไป heat shock ท 42๐C 30 วนาท ใหเกดการเสอมสภาพการซมผานชวคราวของผนงเซลลเพอน าพลาสมดเขา จากนนน าลงน าแขงทนทอยางนอย 10 วนาท ใสอาหาร 2xTY ปรมาตร 250 µl บมเซลลท 37๐C 30 นาท จงน าเซลลทงหมดไปกระจายลงอาหารเลยงเชอแบบแขง TYE ทมแอมพซลน 100 µg/ml บมท37๐C เปนเวลา 12-16 ชวโมง จงเกบเซลลเพอสกด พลาสมดตอไป

2.2.15 กำรท ำ PCR Screen หลงจากการน าพลาสมดเขาสเซลลเจาบานและเลยงบนอาหารแขงทมยา

ปฏชวนะแลว จะตองทดสอบวาโคโลนทรอดชวตหรอขนบนอาหารเหลานนโคโลนใดทมชนสวนของพลาสมดทมยนทตองการอยางถกตองทงขนาดและต าแหนงยนโดยการท า PCR screen ดวยไพรเมอรทเหมาะสมและให PCR product ประมาณ 300 – 700 bp โดยมขนตอนตอไปน เลอก 8 โคโลนตอหนง ligation มากระจายในน า MilliQ 100 µl ทเตรยมไวในแตละหลอด 1.5 ml เขยา

38

ใหเซลลกระจายจากนนเตรยมสารละลายเพอการ PCR screen ซงใน master mixture ประกอบดวย 1x Pfu buffer, 0.25 mM dNTP, 0.5 µM forward และ reverse primer และเอนไซม Pfu polymerase น า reaction mixtures 19 µl ผสมใหเขากนกบสารละลายเซลลทเตรยมไว 1 µl ในหลอด PCR น าเขาเครอง Thermo Cycler และใหเครองท าปฏกรยา ดงน

ก. Initial denaturation 95๐C 2 นาท 1 รอบ ข. Denatured temperature 95๐C 30 วนาท 25 รอบ Annealing temperature Tm-5๐C 30 วนาท Extension temperature 75๐C 1 นาท/Kb DNA ค. Extension temperature 75๐C 3 นาท 1 รอบ

จากนนเครองจะลดอณหภมลงท 10๐C น าผลตภณฑทไดไปตรวจสอบดวย agarose gel electrophoresis โดยเลอก 2

โคโลนทมพลาสมดทถกตองเพอน าไป restreak บน TYE + Amp plate แลวคอยเลอกหนงโคโลนเดยวมาเลยงในอาหาร เพอท าการสกด plasmid ตอไป

2.2.16 กำรสกดพลำสมดดวย Merlin method

เลอกโคโลนเดยวน าไปเลยงในอาหารเหลว 2xTY 50 ml เขยาท 37๐C 220 รอบตอนาท เปนเวลา 16 ชวโมง หมนเหวยงเพอเกบเซลลท 5000 รอบตอนาท 5 นาท ละลายตะกอนดวย Merlin I buffer (50 mM glucose, 25 mM Tris-Cl pH 8.0, 10 mM EDTA, 40 µg/ml RNase A) 5 ml จากนนเตม Merlin II (0.2 M NaOH, 1% SDS) 10 ml Invert เบา ๆ 2-3 ครง ตงไวทอณหภมหอง 5 นาท เมอครบก าหนดเตม Merlin III (1.25 M KAc, 1.25 M HAc) 5 ml บมในน าแขง 30 นาท พรอมทง invert และเขยา 2-3 ครง เพอใหตะกอนเลกลงท าใหล าดบตอไปของการกรองดวยกรวยพลาสตกและกระดาษกรองขนาด 11 cm เรวขน หลงจากขนตอนนจะไดสาร ละลายประมาณ 16 ml เตม Isopropanol ปรมาตร 0.6 เทาของสารละลาย หรอ 9.6 ml Invert เบา ๆ 2-3 ครง ปนตกตะกอนพลาสมดดเอนเอทความเรว 10,000 รอบตอนาท 10 นาท ทอณหภม 4๐C ดดสารละลายสวนใส (supernatant) ออกเบาๆ ตงท งไวทอณหภมหองเพอระเหย Isopropanol จากนนละลายตะกอนดวยน า MilliQ 500 µl เตม MerlinMax binding buffer (0.07 mM GuHCl, 1.25 M KAc, 1.25 M HAc) และ MerlinMax Resin Slurry (15 g celite powder of diatomaceous earth/100 ml MerlinMax binding buffer) อยางละ 5 ml ผสมสารละลายใหเขากน น าไปวางบนเครองเขยา Rocker (LabNet) เพอใหดเอนเอจบกบเรซนประมาณ 1 ชวโมง น า

39

สวนผสมทงหมดแบงใสใน spun column (เตรยมจากหลอดทดลอง 15 ml pipette tip ขนาด 5 ml และอดส าลเพอใชกรองเรซนใหอยในคอลมน) คอลมนละ 2.5 ml ปนเพอเกบเรซน ดวยเครองหมนเหวยงแบบแขนหมนรน IEC HN-S II ทความเรว ¾ เทา 5 นาท เกบสารละลาย (flows trough) ทไดไว จากนนปนลางเรซนดวย Merlin V (20 mM Tris-Cl pH 7.5, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50% Ethanol) 2.5 ml 2 ครง จากนนหมนเหวยงใหเรซนแหงอกครง 10 นาท เปลยนหลอดใหมเพอชะดเอนเอดวยน า MilliQ อณหภม 72๐C 250 ml โดยการหมนเหวยงทความเรวเดม 5 นาท ท าซ าอกครง เกบพลาสมดทไดใน 20๐C เพอการทดลองตอไป

2.2.17 กำรท ำแผนทดเอนเอบนพลำสมด (DNA mapping) การท าแผนทดเอนเอเพอตรวจสอบวาเวกเตอรลกผสมทไดนนมขนาดและการ

จดเรยงตวของชนดเอนเอถกตองหรอไม โดยใชหลกการความจ าเพาะของรสตรคชนเอนไซมในการยอยพลาสมดซงในแตละปฏกรยาจะประกอบดวย 1xNEBuffer ทเหมาะสมกบเอนไซม 1 µg BSA, 0.1 mM DTT, 0.2 µg พลาสมด และรสตรคชนเอนไซม 0.5 U บมทอณหภม 37๐C 1 ชวโมง ท าเจลอเลกโตรโฟเรซสตามขอ 2.2.3 และตรวจสอบผลตภณฑทได เปรยบเทยบความถกตองของขนาดดเอนเอกบการค านวณโดยโปรแกรมคอมพวเตอร เชน NEB cutter2.0 (NEB)

2.2.18 กำรสกดดเอนเอจำกยสต Saccharomyces cerevisiae

เขยเชอยสต Saccharomyces cerevisiae จาก LB Broth เลยงในอาหารเหลว YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose) 5 ml ประมาณ 20 ชวโมง จากนนเกบตะกอนเซลลดวยการหมนเหวยงท 10,000 รอบตอนาท ดดอาหารเลยงทง ละลายตะกอนดวย lysis buffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) บดเซลลดวยโกรงบดโดยการเตมไนโตรเจนเหลวลงในโกรงแลวคอยๆหยดสารละลายเซลลลงไป เพอใหเปนผลกน าแขงบดใหละเอยดและท าซ าอก 2 ครง แลวน าสารละลายทไดไปตมในน าอณหภม 95๐C 2 นาท หลงจากนนน ากลบมาแชในไนโตรเจนเหลว 2 นาท และน าอณหภม 95๐C อก 2 นาท เขยาใหสารละลายแตกตวดวยเครอง vortex-mixer 2 นาท แลวเตมคลอโรฟอรม 300 ml และ vortex อกครงเปนเวลา 2 นาท ตกตะกอนเศษเซลลดวยเครองหมนเหวยงทความเรว 13,000 รอบตอนาท 5 นาท จงยายสารละลายใสสวนบนไปใสหลอดใหม เตม 100% เอทานอลเยนปรมาตร 2 เทาของสารละลายทปนเกบได เขยาใหผสมกนเบาๆ บมทอณหภม หอง 5 นาท จากนนน าไปแชใน –20๐C 5 นาท เพอเพมอตราการตกตะกอนดเอนเอ จากนนตกตะกอนดเอนเอดวยเครองหมนเหวยง 5 นาท ทความเรว 13,500 รอบตอนาท ดดสารละลายใสสวนบนออก ลาง

40

ตะกอนดวย 70% เอทานอล และปนตกทสภาวะเดมอกครงดดสวนใสทง ปลอยใหตะกอนแหงทอณหภมหอง 10 นาท ล าดบสดทายจงละลายตะกอนดวย 100 ml 2 µg/ml RNase A in TE ตรวจสอบประสทธภาพของการสกดดวย agarose gel electrophoresis ตามขอ 2.2.3 ตอไป 2.3 กำรทดสอบกำรแสดงออกของยนทตองกำรในแบคทเรย

2.3.1 กำรแสดงออกของยนในแบคทเรย E.coli สำยพนธBL21(DE3)pLysSทอณหภม 37๐C

การทดสอบการแสดงออกของแบคท เ ร ย ส วน ใหญกระท า ใน เซล ล BL21(DE3)pLysS การทดสอบการแสดงออกและการละลายของโปรตนท าตามวธการของ Selleck and Tan (Selleck and Tan, 2008) โดยมการดดแปลงเลกนอย กลาวโดยสรป คอ transform พลาสมดทตองการในเซลลและท าการเลอกโคโลนทตองการบนอาหารแขง TYE ทม ampicillin 100 µg/ml และ chloramphenicol 25 µg/ml เปนเวลา 12-16 ชวโมง เลอก 5-6 โคโลนเพอน าไปเลยงตอในอาหารเหลว 2xTY ทอณหภม 37๐C บนเครองเขยา 220 รอบตอนาทใหเซลลโต จนวดคาการดดกลนแสงท 600 nm ไดเปน 0.5-0.6 กระตนดวย Isopropylthio-β-D-galactosidase (IPTG) ใหมความเขมขนสดทายเปน 0.2 mM โดยกอนใส IPTG ตองเกบเซลลปรมาตร 500 µl หมนเหวยงเพอตกตะกอนเซลลท 13,000 รอบตอนาท แลวละลายตะกอนดวย 2xPGLB 100 µl (2x protein gel loading buffer - 1.25 M Bis-Tris pH 6.8, 20% glycerol, 4% SDS, 2.16 M β-mercaptoethanol, and 0.4 mg/ml bromophenol blue) เมอเตม IPTG ลงในตวอยาง แลว เกบเซลล 250 µl ทเวลา 1, 2, 3 และ 4 ชวโมง หลงการให IPTG หมนเหวยง และละลายตะกอนเซลลดวย 2xPGLB ท าการแยกโปรตนแบบเสยสภาพ (denaturing polyacrylamide gel electrophoresis หรอ SDS-PAGE) ตามขอ 2.3.5 เพอเปรยบเทยบ การสรางโปรตนเปาหมายในแบคทเรย ระหวางกลมทไมไดรบและไดรบ IPTG เปนเวลา 1, 2, 3 และ 4 ชวโมง ตามล าดบ นอกจากนในชวโมงท 3 หลงการกระตนดวย IPTG ท าการเกบตวอยาง 40 ml 2 หลอด หมนเหวยงเพอตกตะกอนเซลล เทสารละลายทงแลวจงละลายตะกอนเซลลดวย P150-EDTA 10 ml (50 mM sodium phosphate buffer pH 7.0, 150 mM NaCl, 1 mM benzamidine และ 5 mM β-mercaptoethanol) เกบเซลลท -20๐C จนกวาจะท าการทดลอง ตอไป (Selleck and Tan, 2008)

41

2.3.2 กำรแสดงออกของยนในแบคทเรย E.coli สำยพนธBL21(DE3)pLysS

ทอณหภม 28 และ 18๐C นอกจากศกษาการแสดงออกของโปรตนท 37๐C มการลดอณหภมลงท 28 ๐C

และ 18๐C เพอตรวจสอบความสามารถในการผลตโปรตนวามความสามารถในการละลายน าไดมากขนหรอไม ทงนตองท าการยายเซลลไปยงอณหภมทตองการในขณะทคาการดดกลนแสงท 600 nm เปน 0.1-0.2 จากนนใหเซลลโตตอไป เมอเซลลมคา OD600 = 0.6 กระตนดวย IPTG ใหมความเขมขนสดทายเปน 0.02 หรอ 0.2 mM ตามความเหมาะสม และเนองจากอตราการเพมจ านวนของเซลลทเลยงใน 18 ๐C ชามาก เมอกระตนดวย IPTG แลวเลยงเซลลตอไปอก 14-16 ชวโมง จงเกบเซลลตามเวลาทก าหนด ซงขนตอนการเกบเซลลท าเชนเดยวกบเซลลทเจรญท 37๐C ตามขอ 2.3.1 และท าการเกบตวอยางทเหลอ 40 ml ทเวลา 3 ชวโมงหลงการกระตนดวย IPTG หรอ 14-16 ชวโมง ท 18๐C เพอตรวจสอบการละลายท าใหบรสทธดวยเรซนทเหมาะสมและท าการทดลองตอไป

2.3.3 กำรทดสอบกำรแสดงออกของ FADD และ TRIM21 รวมกบโปรตนพเลยง (Chaperone protein)

การทดสอบนใชเซลลเจาบาน JM109 ทมการใสพลาสมดทชวยสงเคราะหโปรตนในกลมของโปรตนพเลยง (Chaperone protein) ซงตองใช L-arabinose 1 mg/ml และ tetracyclin 10 ng/ml เพอกระตนการแสดงออกของยนบน chaperone plasmid pG-KJE8 บมเพอใหเซลลเจรญเตบโตทอณหภม 37๐C บนเครองเขยา 220 รอบตอนาท ตดตามการเตบโตจน OD600 ได 0.6 จงกระตนดวย IPTG ท 0.2 M และเกบเซลลในชวโมงท 3 เพอทดสอบการละลายและท าบรสทธตามวธการใน 2.3.1 หากเปนการทดลองทอณหภม ต ากวา 37๐C จะยายขวดรปชมพทใชเลยงเซลลไปยงอณหภมทตองการดงขอ 2.3.2 และกระตนดวย IPTG เมอ OD600 เทากบ 0.6 จากนนเกบเซลลทชวโมงท 16 เพอตรวจสอบการแสดงออก การท าบรสทธ หรอการทดลองอนๆ ตามวธการในขอ 2.3.7 เกบเซลลท -20๐C จนกวาจะท าการทดลองขนตอไป

2.3.4 กำรทดสอบกำรแสดงออกของโปรตนดวยระบบ SPM (Soluble protein media)

เนองจากโปรตนทใชในการศกษาครงนละลายน าไดนอยประมาณ 10% จงไดมความพยายามในการหาวธทชวยในการสงเคราะหโปรตนทสามารถละลายน าไดมากขน ไมวาจะเปนการลดอณหภม ความเขมขนของ IPTG การใชโปรตนพเลยง (chaperone protein) กไม

42

สามารถเพมการสราง soluble protein ได จงมความสนใจทจะวธการเพมสารเคมบางตวลงไป คอ sorbitol และ betaine ซงวธการเลยงเซลลและเตมสารเคมในกลมนเปนกระบวนการเลยงทพฒนาขนโดยการลอกเลยนแบบธรรมชาต เนองจากในสภาวะทการเจรญของสงมชวตชนต าในสภาพแวดลอมทผดปกตไป จะมการสรางสารบางอยางเพอรกษาคณภาพของโปรตนภายในเซลล เรยกสารเหลานวา osmolyst ซงแบงไดเปน 3 กลม คอ polyols/sugar, amino acid, และ polyions (Kai, et al., 2013) เชน สงมชวตทอาศยในททอณหภมสงและตอบสนองตอความเครยดจากอณหภมสงจะมการสะสมสาร betaine, ectaine ในปรมาณมาก ซงมการอธบายถงหนาทอาจเปนไปไดของสารเหลาน เชน การลดอตราเรวในการปลอยสายเปปไทดจากไรโบโซมเพอเพมเวลาของการพบมวนโปรตน หรอการทเพม osmolarity จะเปนการกระตนใหเซลลสราง Hsp protein เพอชวยในการพบมวนอกทางหนง เชนการทดลองของ Ackerley และคณะ ในป 2003 พบวา การเลยงเซลลท 18°C ทม betaine และ sorbitol รวมดวยสามารถเพมปรมาณของ soluble His-PvdD ไดอยางมนยส าคญ (Ackerley et al., 2003)

ซงขนตอนการเลยงมดงน ลงเชอ 1-2 โคโลนในอาหารเหลว SPM (soluble protein media) (1.6% bacto tryptone, 1% yeast extract, 0.5% NaCl, 1 M Sorbitol, 2.5 mM betaine) 100 ml ทมแอมพซลน 100 µg/ ml และคลอแรมฟนคอล 25 µg/ ml บมเซลลทอณหภม 37๐C บนเครองเขยาท 220 รอบตอนาท เมอ OD600 อยทประมาณ 1.2 แตไมเกน 1.5 (หาก OD สงเกนไปไมเหมาะสมแกการน าไปเลยงตอ) น าสารละลายเซลลนนปรมาตร 1 ml มาเปนตวตงตนในอาหารเหลวใหม เลยงเซลลในสภาวะเดม คอ 37๐C บนเครองเขยาท 220 รอบตอนาท ตอไปจน OD600 เปน 0.6 เตม IPTG 0.2 M เกบเซลลในชวโมงท 0, 1, 2, 3 และ 4 เพอดการแสดงออกโดยท า denaturing polyacrylamide gel electrophoresis และชวโมงท 3 เกบเซลลเพอทดสอบการละลายและท าทดลองตอไป 2.3.5 กำรท ำ denaturing polyacrylamide gel electrophoresis

การท า denaturing polyacrylamide gel electrophoresis เปนอกหนงวธการทนยมใชในการตรวจสอบความบรสทธ ปรมาณ หรอน าหนกของโปรตน ในงานวจยนจะใชความเขมขนของ acrylamide gel ท 12% ยกเวนกลาวเปนอยางอน โดยชนลางเปน seperating gel (10% of 30%/0.5% acrylamide/bis-acrylamide, 1.5 M Tris-HCl pH 8.8, 0.1% SDS, 0.1% ammonium persulphate, 0.1% TEMED) เทใน slab gel apparatus ใหมความสงอยใตปลายหวประมาณ 0.5 cm เตมพนทเหนอเจลดวย H2O saturated butanol เพอปองกนหนาเจลแหง

43

เมอเจลใหแขงตวดแลวท าการลาง butanol ออกดวย 70% เอทานอลหลายครง ตามดวยน า จากนนใส stacking gel (3% of 30%/0.5% acrylamide/bis-acrylamide, 0.5 M Tris-HCl pH 6.8, 0.1% SDS, 0.1% ammonium persulphate, 0.1% TEMED ) ใสหว เมอเจลแขงตวดแลว จงแกะซหวและท าความสะอาดหลม load gel และน าไปประกอบเขากบ chamber หลงจากนนจง load ตวอยางจากแตละ fraction ทผานการผสมกบ 2x PGLB แลว หลมละเทา ๆ กน รวมทงโปรตนมาตรฐานเพอใหเปนตวเปรยบเทยบ เมอตอระบบเรยบรอยปลอยกระแสไฟฟาใหวงภายใตความตางศกยคงท 167 โวลต ใน gel running buffer (10 mM Tris, 0.076 M glycine, 0.01% SDS) หลงจากการท าพอลอะครลาไมดเจลอเลกโตรโฟเรซสแลวจงตรงโปรตนบนเจลไวดวยการแชใน FIX solution (45% Ethanol, 10% glacial acetic acid) 10 นาท ยอมดวย staining solution ( 0.5% Coomassie brillian blue R 250 ใน FIX) 10 นาท จากนนลางสสวนเกนออกดวย destaining solution 1 (20% glacial acetic acid, 20% methanol) ทอณหภม 60๐C 4 ครง ๆ ละ 10 นาทหรอจนกวาสพนหลงของเจลจางลงแลวลางตอดวย destaining solution 2 (5% glacial acetic acid, 5% methanol) จนพนหลงเจลใส

2.3.6 กำรทดสอบควำมสำมำรถในกำรละลำย ในการทดสอบการละลายจะตองท าการยอยผนงเซลลโดยการ ละลายเซลล

ตวอยางจาก -20๐C และเตมไลโซไซมใหมความเขมขนสดทายเปน 1 mg/ml เพอชวยในการยอยผนงเซลล บมในน าแขง 30 นาท พรอมเขยาเบาๆ เปนระยะเพอใหไลโลไซมทวถง จากนนท าใหเซลลแตกโดยใชคลนเสยงความถสง (sonication) จากเครอง sonicator ยหอ vibra cell รน VCX130 โดยใช tip รน 130-0438 ดวยก าลง amplitude 50% ครงละ 10 วนาท 3 ครง โดยพยายามใหอณหภมของสารละลายเยนหรอแชในน าแขง และพกระหวางครงดวยการแชในน าแขงเพอปองกนการเสอมสภาพของโปรตนจากความรอนเมอเซลลแตกแลว เกบสารสกดเซลลหยาบ 50 µl เพอท า SDS-PAGE ของ whole fraction ซงการทดสอบการละลายอาศยหลกในการเปรยบเทยบปรมาณโปรตนทสนใจในแตละ fraction คอ สวนของ pellet และ supernatant ทมการปรบปรมาตรใหเทากบปรมาตรเรมตน โดยเกบ 500 µl ใสหลอดทดลองขนาด 1.5 ml ปนตกตะกอนเศษเซลลท 13,000 รอบตอนาท ท 4๐C แยกสวนของสารละลายใสใสหลอดใหม เปน supernatant และละลายตะกอนดวยบฟเฟอร P150-EDTA เทากบปรมาตรเรมตน คอ 500 µl จากนนน าตวอยางจาก pellet และ supernatant 50 µl ผสมกบ 2x PGLB แลวจงน าแตละสวนจาก whole, supernatant และ pellet ในปรมาณทเทากนมาท าการวเคราะห หาปรมาณการละลายของโปรตนทสนใจดวย SDS-PAGE ตามขอ 2.3.5 โดยเปรยบเทยบการละลายจากขนาด

44

และปรมาณความเขมของแถบโปรตนจากแตละสวน โดย supernatant และ pellet แทนโปรตนสวนทละลายและไมละลายน า ตามล าดบ และทงสองสวนรวมกนจะเปนผลรวมของการแสดงออกของโปรตนทสนใจทงหมดในเซลล คอ Whole

2.3.7 กำรท ำบรสทธโปรตนดวย TALON® Metal Affinity resin ท าการแยกรคอมบแนนทโปรตนทม polyhistidine-tagged (เชน HishTRIM21,

hFADDΔ1HisSTRx1, hFADDΔ1HisSTRx2) ใหบรสทธดวย TALON metal affinity (Clontech) โดยท าใหเซลลแตกดวยคลนเสยงความถสงตามขอ 2.3.6 จากนนน าไปปนแยก เอาสวนสารละลายใสสวนบนประมาณ 10 ml ใสในหลอดขนาด 15 ml ทมทาลอนเรซนทอมตวดวยบฟเฟอร (talon resin 50% slurry in 20% ethanol ลางดวยน า 10 ml 1 รอบ และ P150-EDTA buffer 2 รอบ ซง P150-EDTA buffer ประกอบดวย 50 mM sodium phosphate pH 7. 0, 150 mM NaCl, 1 mM benzamidine, 5 mM β-mercaptoethanol ) บมท 4๐C บนเครองเขยาเพอผสมสารเปนเวลา 20 นาท ปนตกตะกอนเรซน 2 นาท ทความเรว 2,000 รอบตอนาท เกบสวนของ extract ทไมเกาะกบเรซน (flow through-FT) จากนนลางเรซนดวยบฟเฟอร P150-EDTA 2 ครง ๆ ละ 10 ml แลวยายเรซนไปยงคอลมนพลาสตกดวยบฟเฟอร P150-EDTA 1 ml ดดใสในคอลมนโดยตรง และท าการชะโปรตนทตดอยกบเรซนดวยบฟเฟอร P150-EDTA + 100 mM imidazole 4 ครงๆ ละ 0.5 ml เกบ eluate ทไดในหลอดขนาด 1.5 ml (E1, E2, E3 และ E4) จากนนน าตวอยางจาก fraction ตาง ๆ มาท า SDS-PAGE เพอตรวจสอบความบรสทธ ตามขอ 2.3.5 และเกบไวเพอการทดลองตอไปโดยน าผลตภณฑทไดมาเตมกลเซอรอลใหไดความเขมขนสดทายเปน 20% เพอปองกนการท าลายโครงสรางตามธรรมชาตของโปรตน เกบท –80๐C จนกวาจะใชทดลองตอไป สวนเรซนทผานการใชสามารถน ากลบมาใชซ าไดโดยตองท าการลาง imidazole ออกดวยขนตอนตอไปน ลางคอลมนดวยน า MilliQ 2-3 เทาของปรมาตรเรซน 0.1 M EDTA 2 เทา น า MilliQ 2-3 เทา 6 M Guanidine HCl เทากบปรมาตรเรซน น า MillQ 2-3 เทา 20% Ethanol 1 เทา ตามล าดบ จากนนเกบใน 20% Ethanol 4๐C

2.3.8 กำรท ำบรสทธโปรตน hFADD ดวย Strep-tactin resin การท าบรสทธ FADD ดวย Strep-tactin resin มขนตอนทเหมอนกบการใช talon

resin ตางกนในสวนของบฟเฟอรทใชบฟเฟอร P150-EDTA หรอ T150 (50 mM Tris-Cl pH 7.5,

150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% NP-40, 1 mM benzamidine และ 10% glycerol) และการชะโปรตนทใช 2.5 mM d-Desthiobiotin ในบฟเฟอร 4 ครงๆ ละ 500 µl เกบสวนใสทชะได คอ

45

E1, E2, E3 และ E4 น าตวอยาง 30 µl ผสม 2xPGLB เพอท าพอลอครลาไมดเจลอเลกโตรโฟเรซสแบบเสอมสภาพ และเกบทเหลอไวใชในการทดลองโดยเตมกลเซอรอลใหความเขมขนสดทายเปน 20% เกบใน -80๐C สวนเรซนทผานการใชแลวน ามาชะ d-Desthiobiotin ไดดวย 1 mM HABA (2-[4'-hydroxy-benzeneazo]benzoic acid) ใน T150 buffer (ใช T150 เทานนมเชนนน HABA จะไมละลาย) 8 ml ลางเรซนอกครงดวยT150 buffer อยางนอย 8 ml สของเรซนจะกลบเปนสขาวพรอมใหงาน หรอหากตองการเกบตองลางดวยน า MilliQ และเกบใน 20% เอทานอล ท 4๐C ตอไป

2.4 กำรตรวจสอบปฏสมพนธของ hFADD และ hTRIM21 จำกแบคทเรย

2.4.1 Strep-tactin pull down น าสารละลายในสวนทมโปรตนมากพอ (E2) ไปท าการทดลองหาความสามารถ

ในการเกดปฏสมพนธกนระหวางโปรตนทงสอง โดยน ารคอมบแนนทโปรตนทม Strep-tag II (STR) เชน hFADDHisSTR บมดวย strep-tactin resin 25 µl ท 4๐C เปนเวลา 1 ชวโมง ลางโปรตนสวนเกนออกดวย P150-EDTA 3 ครงๆ ละ 500 µl จากนนน าสารละลายโปรตนทตองการทดสอบปฏสมพนธซงไมม Strep-tag II เชน HishTRIM21 ใสในหลอดทม hFADDHisSTR -Strep-tactin resin บมตอท 4๐C เปนเวลา 1 ชวโมง ลางสวนเกนออกดวย P150-EDTA 3 ครง ๆ ละ 500 µl ตรวจสอบการเกดปฏสมพนธของโปรตนดวย SDS-PAGE ตามขอ 2.3.5 โดยสงเกตวาโปรตนทตองการทดสอบปฏสมพนธปรากฏอยใน bead fraction พรอมกบ STR-tagged โปรตนหรอไม 2.5 กำรทดสอบกำรแสดงออกของโปรตนทตองกำรในระบบ Ex-vivo

2.5.1 Tissue culture การทดลองนใช HEK293T cell (ATCC# CRL-11268) เรมการทดลองโดยเตรยม

DMEM-F ซงประกอบดวย DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) ทม10% FBS (fetal bovine serum), D-Glucose 4.5 g/l, Sodium Pyruvate 1.1 g/l, Sodium Bicarbonate 3.7 g/l, L-Glutamine 0.584 g/l, penicillin 100 U/ml และ streptomycin 100 µg/ml ในหลอดฝาเกลยวขนาด 15 ml ปรมาตร 9 ml น าเซลลทเกบในถงเกบไนโตรเจนเหลว (liq.N2) ละลายผลกน าแขงในอางน าทปรบอณหภม 37๐C จนเหลอผลกเลกเทานน (ไมควรรอใหน าแขงละลายจน

46

หมด), จงท าใหสารละลายเซลลเปนเนอเดยวกนดวยการดดปลอยเบา ๆ ดวย autopipette 1 รอบ แลวถายโอนไปยง cDMEM 9 ml ในหลอดทเตรยมไว จากนนน าไปตกตะกอนเซลลเพอลาง DMSO ออก ดวยการปนเหวยงดวยเครองหมนเหวยงทความเรว 2000 รอบตอนาท เปนเวลา 2 นาท ดดสารละลายทง จากนนกระจายเซลลเบา ๆ ดวย DMEM-F 1 ml น าทงหมดไปเลยงตอในจานเลยงเซลลขนาดเสนผานศนยกลาง 10 cm ในอาหารทงหมด 10 ml โดยในขนตอนการเพลตเซลลตองเขยาจานเลยงเพอใหเซลลกระจายตวอยางสม าเสมอแลวน าไปเลยงตอในตบมเซลล 37๐

C ในบรรยากาศทม CO2 5% ตดตามการเจรญเตบโตทกวน ถาหากเซลลตายใหลาง plate ดวย PBS (8% NaCl, 0.2% KCl, 1.15% Na5HPO4, 0.2% KH2PO4) แลวเปลยนอาหารเมอเซลลเจรญเตบโตดและเกอบแนนเตม plate แลวใหแยกเซลลดวยทรปซนตอไป

2.5.2 กำรแยกเซลลดวยทรปซน เนองจาก HEK293T cell ทเลยงเปนชนด immortal cell line จงมความสามารถ

ในการแบงตวไดเรอย ๆ ตามพนทผวภาชนะเลยงเซลล แตเมอเตมพนทแลวจะมการแบงตวซอนทบเหนอชนเซลลเดม ซงมผลใหเซลลทอยชนลางขาดอาหารหลอเลยงและมสภาวะไมเหมาะสมตอการเจรญเตบโตจงตองมการแยกเซลลออกเปนเซลลเดยวแลวเพลตเซลลใหมเพอใหมการเจรญและแบงตวตอไป โดยเรมจากการดดเอาอาหารเลยงเกาออกจากภาชนะเลยงเซลล ลางดวย Phosphate Buffer Saline (1xPBS - 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.15% Na5HPO4, 0.2% KH2PO4) 10 ml แลวดดออก เตม 0.025% trysin/0.02% EDTA 2 ml น าเขาตบม 37๐C ทความเขมขนของ CO2 5% 5 นาท เตมอาหารเลยง 8 ml เพอหยดการท างานของทรปซน หลงจากนน gently resuspend ใหเยอเซลลหลดออกจากกน แลวน าสารละลายเซลลทงหมดใสในหลอดฝาเกลยว 15 ml ตกตะกอนเซลลดวยการหมนเหวยงดวยเครองหมนเหวยงทความเรว 2000 รอบตอนาท เปนเวลา 2 นาท ดดสารละลายทง ละลายตะกอนเซลลดวย DMEM-F 1 ml ดดมา 50 µl หาความหนาแนนของเซลล โดยนบบน hemacytometer น าเซลลไปเลยงในจานเลยงเซลลใหมดวยเซลลปรมาณ 1.8 ลานเซลลใน plate ขนาด 10-cm และปรมาตรอาหารเลยง 10 ml ตามการเจรญเตบโตใหเตมจานเลยง ซงปกตจะท าการแยกเซลลทก ๆ 2 วน

2.5.3 Cell transfection เพอท าการทดสอบผลของโปรตนจงใชวธการน าเขาดเอนเอพลาสมดทมยนของ

โปรตนดวยสารน าสงซงการทดลองนใชจากสองบรษท คอ Lipofectamine TM 2000 (invitrogen) และ TransIT®-LT1 Transfection Reagent (Mirus) ซงทงสองชนดมรายละเอยดการท าทตางกน

47

รวมถงความหนาแนนของเซลลดงนนจงตองทดสอบหาปรมาณเซลลเรมตนของการเพลตเพอใหไดความหนาแนนในปรมาณทเหมาะสมส าหรบการ transfection ดวยสารน าสงจากแตละบรษทผผลต

1) LipofectamineTM2000 การใช lipofectamineTM2000 ซงวธนตองใชเซลลทความหนาแนน 90-95% จง

จะท าใหการสงพลาสมดมประสทธภาพสงสด โดยตองท าการแยกเซลลดวยทรปซนและนบจ านวนเซลลแลวจงเพลตทปรมาณ 800,000 เซลล ส าหรบเพลต 6 เซนตเมตร จะไดเซลลทความหนาแนน 90-95% ในวนท 2 กอนการ transfection 4 ชวโมง เปลยนอาหารเลยงเปน DMEM-F ทไมมยาปฏชวนะ ขนตอนการ transfection เรมดวยการเตรยมหลอดทดลองขนาด 1.5 ml 2 หลอด หลอดแรกผสมพลาสมด 8 g กบ Opti-MEM หรอ DMEM ทไมมทงซรมและยาปฏชวนะ 500 µl สวนอกหนงหลอด LipofectamineTM2000 20 µl ผสมกบ DMEM 500 µl บมทอณหภมหอง 5 นาท จากนนผสมทงสองหลอดเขาดวยกนบมตออก 20 นาท กอนน าไปใสในจานเลยงเซลลใหทว เลยงเซลลตอทอณหภม 37๐C ในบรรยากาศทม CO2 5% เปนเวลา 36-40 ชวโมง จงท าการเกบเซลล เพอใชในการทดลองตอไป ซงปรมาณการใชเซลล พลาสมด หรอ LipofectamineTM2000 จะขนอยกบขนาดภาชนะเลยงทใชดงตารางตอไปน

ตำรำงท 2.4 ตารางเปรยบเทยบความเหมาะสมของแตละปจจยในการใช LipofectamineTM2000

2) TransIT®-LT1 Transfection Reagent ลกษณะการเลยงโดยทวไปเหมอนกบการใช LipofectamineTM2000 แตกตาง

เพยงเลกนอย คอ สามารถใชอาหารเลยงปกตไดโดยไมมผลตอการ transfection และปรมาณเซลลทเหมาะสมจะใชทความหนาแนน 50-60% จงเรมตนเพลตเซลลทปรมาณ 400,000 เซลล บนเพลตขนาด 6 cm เลยงตอ 48 ชวโมง จะไดเซลลทความหนาแนน 50-60% ขนตอนการใส

48

ดเอนเอดงน เตรยมหลอดทดลองขนาด 1.5 ml 2 หลอดตอหนงเพลต หลอดแรกใสพลาสมด 5 µg หลอดทสองประกอบดวย Opti-MEM หรอ DMEM ทไมมทงซรมและยาปฏชวนะ 242.5 µl และ LT1 7.5 µl ผสมใหเขากน บมทอณหภมหอง 5 นาท น าสารละลายในหลอดทบมแลวใสในหลอดแรกผสมใหเขากนบมตอ 20 นาท แลวจงน าไปหยดลงจานเลยงเซลลทมความหนาแนนเซลลเหมาะสม ใหกระจายทวทงจานเลยงน าเซลลไปเลยงตอในตบมตอเปนเวลา 24-48 ชวโมง เกบเซลลเพอท าการทดลองตอไป ซงปรมาณการใชเซลล พลาสมด หรอ TransIT®-LT1 Transfection Reagent ทใชจะขนอยกบขนาดภาชนะเลยงทใชดงตารางการเทยบตอไปน

ตำรำงท 2.5 ตารางเปรยบเทยบความเหมาะสมของแตละปจจยในการใช TransIT®-LT1 Transfection

2.5.4 กำรเกบเซลล ดดอาหารเลยงออกและท าตามวธแยกเซลลดวยทรปซนตามวธการขอ 2.5.2 ดวย

ปรมาณทผผลตแนะน า เมอเซลลแยกแลวดดเปาและปนเกบเซลลทความเรว 3000 รอบตอนาท 1 นาท ลางเซลลดวย 1xPBS 2 ครง เกบตะกอนเซลลทไดใน -80๐C

2.5.5 GST pulldown

ท าใหเซลลแตกดวย lysis buffer 500 µl โดย resuspend ดวย 150 µl กอน เมอเซลลกระจายดแลวเพมบฟเฟอรอก 350 µl (50 mM Tris-Cl pH 7.5, 150 mM NaCl,1 mM EDTA, 0.5% NP-40, 10 mM PMSF, 1 mM benzamidine และ 10% glycerol) ทงไวบนน าแขง 20 นาท เขยา 2-3 ครง จากนนน า Glutathione SepharoseTM4B (GE healthcare) ทอมตวดวยบฟเฟอร T150 (50 mM Tris-Cl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% NP-40 และ 10% glycerol) บมในสารละลายเซลลทไดเปนเวลา 1 ชวโมง ปนเกบตะกอนเรซนและชะโปรตนสวนเกนออกดวยบฟเฟอร 3 ครง ตรวจสอบการเกดปฏสมพนธ ระหวางโปรตนทงสองโดยการท า SDS-

49

PAGE ขยายสญญาณ และยนยนผลดวย Western blot ตามขอ 2.5.9 เพอทดสอบวา FADD ปรากฏอยในชดการทดลองทม TRIM21 หรอไม

2.5.6 Coimmunoprecipitation การทดลองนท าตามวธการของ Young และคณะ (Young et al., 2011) โดยม

การดดแปลงเลกนอย กลาวโดยสรป คอ น า HEK293T cells ทผานการเลยงเพอใหมการแสดงออกของโปรตน FADD และ TRIM21 จากการทดลองทเกบใน –80๐C ท าใหละลายบนน าแขงซงการทดลองในขนตอๆ ไปจะตองรกษาอณหภมไวท 4 ๐C เพอรกษาคณสมบตเดมของเซลลไว ท าใหเซลลแตกดวย lysis buffer 500 µl (โดย resuspend ดวย150 µl กอน เมอเซลลกระจายดแลวเพมบฟเฟอรอก 350 µl) (50 mM Tris-Cl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% NP-40, 0.1 mM EDTA, 10 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM sodium orthovanadate, 1 mM sodium fluoride, and 1x complete protease inhibitor from Roche) เปนเวลา 30 นาทโดยระหวางนนเขยา 2-3 ครง จากนนน าไปแยกสวนของตะกอนเซลลและสารละลายภายในเซลลทความเรว 13,200 รอบตอนาท เปนเวลา 30 นาท แยกสวนใสออกใสในหลอดใหม แลวแบง 25 µl ในแตละตวอยาง ส าหรบการวเคราะหโดย SDS-PAGE จากนนเตมแอนตบอด anti-Flag tag M2 monoclonal antibody (Sigma) 10 µg ใน extract ทเหลอน าไปบมท 4๐C เปนเวลา 2 ชวโมง เพอใหแอนตบอดเกาะกบ Flag tag บน FADD จากนนน าตวอยางไปปนตกท 3,000 รอบตอนาทเพอใหไดสารทงหมดแลวถายโอนใสในหลอดทม Protein A beads (Thermo Scientific) ทผานการท าใหอมตวดวย wash buffer (50 mM Tris-Cl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% NP40, 0.1 mM EDTA) น าไป rotate ตอท 4๐C เพอให anti-Flag antibody เกาะกบ Protein A บนผว เรซนเปนเวลา 1 ชวโมง จากนนหมนเหวยงทความเรว 3000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท เพอแยกเรซนออกจากสวนใส ท าการเกบสวนใสในหลอด 1.5 ml และท าการลางเรซน 4 ครง ดวย wash buffer ครงละ 1 ml ชา ๆ resuspend เรซนดวย 2xPGLB 30 µl ท าการวเคราะห fraction ทได เชน lysates และ beads โดย SDS-PAGE ตามขอ 2.3.5 และ Western blot ขอ 2.5.9 ตามล าดบ

2.5.7 Western blot ท าเจลอเลกโตรโฟเรซสแบบเสยสภาพเพอแยกโปรตนตามขนาด ยายแถบโปรตน

ไปไวบนแผนไนโตรเซลลโลส เมมเบรน (nitrocellulose membrane) ดวยวธ semi-dry transfer ดวยเครอง semi-dry bloting transfer (ATTO) โดยใช blotting paper ทชมดวย Towbin

50

Transfer Buffer/0.1%SDS (25 mM Tris,192 mM glycine, 20% methanol, 0.1% SDS) ประกบเจลและแผนเมมเบรนเปนลกษณะของแซนวช ซงขนตอนการประกบเจลตองระวงไมใหเกดฟองอากาศ เนองจากจะขดขวางการวงของกระแสไฟท าใหโปรตนไมถกเคลอนยายสแผนเมมเบรน โดยใหแผนเมมเบรนอยระหวางเจลและขวบวก ใหกระแสไฟฟาทก าลงไฟคงท 1 mA/cm2 เปนเวลา 3 ชวโมง จากนนน าเมมเบรนทผานการยายแถบโปรตนมาตรวจสอบประสทธภาพของการยายโปรตนดวย Ponceau S solution (0.2% Ponceau S sodium salt, 10% acetic acid) 5 นาท ลางสสวนเกนออกดวยน า บลอกโปรตนสวนเกนบนเมมเบรนดวย 5% non-fat milk in 1xTTBS (25 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 8.0) 1 ชวโมง ลางดวย 1xTTBS 3 ครงๆ ละ 5 นาท จากนนบมดวย 1๐แอนตบอด เชน 1:2000 rabbit anti-hTRIM21 antibody, 1: 500 rabbit anti-hFADD antibody, 1:1000 mouse anti-Flag antibody, 1:4000 rabbit anti-HA antibody, mouse 1:500 anti-His antibody ตามอตราสวนทเหมาะสม เปนเวลา 2 ชวโมง ลางแอนตบอดสวนเกนออกดวย 1xTTBS 3 ครง ๆ ละ 5 นาท บมตอดวย 2๐แอนตบอด คอ 1:10,000 anti-mouse antibody หรอ 1:10,000 anti-rabbit antibody เปนเวลา 2 ชวโมง ลางแอนตบอดสวนเกนออกดวย 1xTTBS น าแผนเมมเบรนมาใส enhance chemiluminescent (ECL) กอนประกบฟลมเอกซเรยในหองมด วเคราะหแถบสญญาณโปรตนทไดโดยเทยบกบ purified protein และโปรตนมาตรฐาน ซงแผนเมมเบรนทผานการใชแลวสามารถน ากลบมาใชใหมไดโดยการท าใหแอนตบอดทเกาะอยบนผวเมมเบรนหลดออกดวยการท า membrane strip ตามขนตอน 2.5.10 ซงเมมเบรนทผานการ strip antibody แลวไมเหมาะแกการน าไปใชเพอวเคราะหปรมาณเนองจากความไมคงทของโปรตนทเหลอหลงผานการ strip

2.5.8 กำรก ำจดแอนตบอดบนไนโตรเซลลโลส เมมเบรน (stripping) แชแผนไนโตรเซลลโลสเมมเบรนใน stripping buffer ทเตรยมเมอตองการใช

(100 mM β-mercaptoethanol, 2% (w/v) sodium dodecyl sulphate, 62.5 mM Tris-HCl pH

6.8) ทอณหภม 50๐C เปนเวลา 30 นาท พรอมเขยา 3 ครง จากนนลางแผนเมมเบรนดวยน า

สะอาดจนปราศจากกลนของ β-mercaptoethanol จะไดแผนเมมเบรนทพรอมใชงาน ลางและแช

แผนเมมเบรนใน 1x TTBS หรอน าไปบมดวย 1๐ แอนตบอดตอไป

51

บทท 3 ผลกำรทดลอง

3.1 กำรทดสอบกำรแสดงออกของยนทตองกำรในแบคทเรย

เนองจากการทดลองนเปนการทดลองทท าตอเนองจากงานวจยของ Young และคณะในป 2011(Young et al., 2011) ซงเปนการทดลองทท าขนใน HEK293T cells โดยมจดประสงคเพอทดสอบวาโปรตนใดบางทสามารถเกดปฏสมพนธกบ FADD หนงในนนคอ TRIM21 และท าการศกษาผลทเกยวเนองกนในระบบภมคมกนโดยก าเนด สวนการทดลองทจะท าตอไปเพอหาต าแหนงทจ าเปนและมผลตอปฏสมพนธระหวางโปรตนทงสอง โดยงานวจยในครงน เลอกทจะสงเคราะหรคอมบแนนทโปรตนในแบคทเรย

3.1.1 กำรสงเครำะห กำรทดสอบควำมสำมำรถในกำรละลำย และกำรท ำ

บรสทธรคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21Δ2(287-475) ทผลตในแบคทเรย E.coli สำยพนธ BL21(DE3)pLysS

การทดลองในครงนผ วจยมความสนใจตอการเกดปฏสมพนธระหวาง B30.2 domain ของ TRIM21 และ DED domain ของ FADD ซงมการรายงานผลถงกระบวนการสงเคราะหรคอมบแนนทโปรตนจากทงสองสวน ซงสวนของ B30.2 domain หรอ PRY-SPY domain ไดมการรายงานวามคณสมบตทสามารถสรางปฏสมพนธกบโปรตนอน ๆ ได (Rhodes & Trowsdale, 2007; Yang et al., 2009) ดงนนผวจยจงท าการสรางพลาสมด pST50Trc2-HishTRIM21Δ2(287-475) ซงจากการทดลองแสดงใหเหนวาแบคทเรย E.coli BL21(DE3)pLysS ทใชในการทดลองสามารถสงเคราะหรคอมบแนนทโปรตนนได หลงจากการวเคราะหโปรตนดวยโพลอะครลาไมดเจลอเลกโตรโฟเรซส (polyacrylamide gel electrophoresis) แบบเสอมสภาพ พบวารคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21Δ2(287-475) มขนาดประมาณ 23 KDa (รปท 3.1 A และ C) ซง HishTRIM21Δ2(287-475) ถกเหนยวน าทอณหภม 37๐C มการแสดงออกของโปรตนมากกวา 28๐C เกอบสองเทา (เปรยบเทยบรปท 3.1 A แถวท 8-11 และ 3-6) โดยพบการแสดงออกเพยงเลกนอยกอนการชกน า (pre induction) ดวย IPTG (รปท 3.1 A แถวท 2 และ 7) และเพมปรมาณของการสงเคราะหรคอมบแนนทโปรตนขนตามเวลาและอณหภม (รปท 3.1 A แถวท 3-6 และ 8-11) ซงอตราการแสดงออกของโปรตนทไดคอนขางสง แตโปรตนทผลตไดไมละลายน าหรอละลายน าไดนอยมาก และไมสามารถน าไปใชในการทดลองได (รปท 3.1 B)

52

อยางไรกตามมงานวจยหลายชนทแสดงวาการลดอณหภมมผลตอการสรางโปรตน เชน งานวจยของ Mujacic และคณะในป 1999 พบในการทดลองนนมการสรางโปรตนทเปนพษและไมเสถยร นกวจยจงปรบปรงโดยการเลยงแบคทเรยทอณหภมต าท 15 และ 23๐C ซงสามารถลดการเกดพษได แตปองกนการสลายไดนอยลง การเปลยนโปรโมเตอรเปน cold-shock สามารถลดปญหาการถกท าลายดงกลาวได (Mujacic et al., 1999) สวน Shein และ noteborn กลาววาการลดอณหภมลงสามารถเพมการละลายของโปรตนได (Schein & Noteborn, 1988) ดงนนผวจยจงไดเลอกสภาวะใหมโดยการเลยงท 20๐C เขยาท 220 รอบตอนาท และชกน าดวย IPTG ทความเขมขน 0.02 mM และเลยงตอไปเปนเวลา 14 ชวโมง เพอเพมสภาวะเครยดของเซลลอนจะมผลใหการสรางโปรตนทอณหภมต านจะชาลงเปนการยดเวลาใหเซลลปรบรปรางโปรตนใหถกตองยงขน พบวาอตราการแสดงออกของรคอมบแนนทโปรตนนอยลง แตมอตราการละลายน าเพมขนประมาณ 20-40% (รปท 3.1 C และ D) เนองจากโปรตนทเซลลเจาบานผลตไดนนอยในรปทละลายน าและมคณสมบตทจะน าไปท าการทดลองตอไดมปรมาณนอยไมสามารถน าสวนใสของเซลลทผานการปนเหวยงมาใชท าการทดลองได จงตองมการเพมความเขมขนของโปรตนทตองการดวยการท าบรสทธดวย TALON® Metal Affinity column ซงใชหลกการการจบอยางจ าเพาะระหวาง Histidine tag บนโปรตนกบโคบอลททถกตรงไวกบ bead ท าใหโปรตนไมถกชะออกไปพรอมสวนทไมตองการ นอกจากนมรายงานวา การใช tag กชวยในการละลายของโปรตนรวมทงการท าบรสทธโปรตนได (Pryor & Leiting, 1997; Sorensen & Mortensen, 2005) แตในการทดลองพบการละลายต ามากสอดคลองกบผลการค านวณความสามารถในการ ละลายของโปรตน TRIM21 ทไดท าการสงเคราะหครงนดวย Wilkinson-Harrison model จาก www.biotech.ou.edu พบวาเปนกลมทไมสามารถละลายน าไดเมอท าการสงเคราะหในแบคทเรย E. coli การค านวณ pI และน าหนกโมเลกลจาก expasy พบวา TRIM21 คา pI อยท 5.98 และน าหนกโมเลกลเปน 54169.73 สวน hTRIM21Δ1 ม pI เทากบ 6.43 และน าหนกโมเลกลเปน 23641.75 โดยเมอน าโปรตนทงสองไปค านวณคาการละลายน าจาก www.biotech.ou.ed พบวาใหคาการละลายเปน 0.0% หรอไมสามารถละลายน าได (Diaz et al., 2010) เมอน าไปท าบรสทธโปรตนเพอใชในการทดลองล าดบถดไป ผลจากเจลอเลกโทรโฟเรซสแสดงใหเหนวาสามารถท าบรสทธโปรตนไดจ านวนหนง โดยพบโปรตนดงกลาวใน eluted fraction บนเจลอเลกโตรโฟเรซส (รปท 3.1 E)

53

รปท 3.1 ผลการแสดงออกของยน ความสามารถในการละลาย และการท า

บรสทธของรคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21Δ2(287-475) ทอณหภมตางๆ กน (A) ผลการแสดงออกของยนในการสงเคราะหรคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21Δ2(287-475) ทอณหภม 37, 28๐C ทเวลา 0 ถง 4 ชวโมง และกระตนดวย 0.2 mM IPTG พบวาปรมาณการแสดงออกไมตางกน และ (B) ผลการทดสอบการละลายท 37 และ 28๐C พบวาอตราการละลายต ามากถงไมละลาย (S fraction แถว 3 และ 6) (C) ผลการแสดงออกของยนทอณหภม 20๐C ทเวลา 14 ชวโมง ดวย 0.02 mM IPTG โดย (D) พบการละลายเพยงเลกนอยใน S fraction (แถวท 3) (E) ผลการท าบรสทธของรคอมบแนนทโปรตนท 20๐C พบโปรตนเปาหมายใน E2 fraction แสดงวา Talon resin มความสามารถในการดดซบ HishTRIM21Δ2(287-475) ได และมการลดลงเมอเปรยบเทยบกบ

B

C D

D

E

A

54

flow through (FT) fraction (Un=uninduced, W=whole, P=pellet, S=supernatant, FT=flow through และ E=eluted fraction)

อนง ในการทดสอบการละลายของโปรตนใชโซเดยมฟอสเฟตบฟเฟอร (50 mM sodium phosphate buffer pH 7.0, 1 mM benzamidine และ 5 mM β-mercaptoethanol) ทประกอบดวยเกลอ และเพอเปนการขจดผลกระทบจากการรบกวนการละลายของเกลอ จงท าการทดสอบความสามารถในการละลายของ recombinant HishTRIM21Δ2 (287-475) protein จากการสงเคราะหทอณหภม 20๐C ทเวลา 14 ชวโมง และกระตนดวย 0.2 mM IPTG ทความเขมขนเกลอตาง ๆ กน ตามวธการทดสอบดงขอท 2.3.6 โดยเลอกความเขมขนเกลอท 150, 300, 500 mM ตามล าดบ ซงพบวาความแตกตางของความเขมขนเกลอไมมผลในการเพมหรอลดความสามารถในการละลายของโปรตนชนดน ดงรปท 3.2 อาจเนองจากความไมละลายทเกดขนไมไดเกดจากคณสมบตความเปนประจ ดงนน จงเลอกความเขมขนเกลอท 150 mM (P150-EDTA) เพอท าการทดสอบคณสมบตการละลายและการท าบรสทธของโปรตนตอไป

รปท 3.2 ความเขมขนของเกลอในบฟเฟอรไมมผลตอการละลายของ

HishTRIM21Δ2(287-475) ดงภาพทแสดงการตรวจสอบการละลายของรคอมบแนนทโปรตน โดยเปรยบเทยบผลของความเขมขนของเกลอในบฟเฟอรทใชท าละลายโปรตนพบวาทงสามความเขมขน คอ 100, 300 และ 500 mM ใหผลการละลายไมตางกน (W, P และ S แสดงถง whole, pellet และ supernatant fraction ตามล าดบ)

นอกจากนไดเปรยบเทยบผลของ IPTG ทมตอการการแสดงออกของยน ดวยการเปรยบเทยบผลสงเคราะหรคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21Δ2(287-475) ทอณหภม 20๐C ทเวลา 14 ชวโมง ดวย 0.02 กบ 0.2 mM IPTG พบวาทความเขมขน 0.02 mM IPTG เซลลเจรญไดดกวาการเลยงท 0.2 mM IPTG (รปท 3.3 A) และเมอเปรยบเทยบอตราการละลายน าของโปรตน

55

พบวาทความเขมขน IPTG ต า (0.02) สามารถสงเคราะหโปรตนทอยในรปทละลายน าไดสงกวาการเลยงทความเขมขน IPTG สง (0.2) ดงผลการทดลองในรปท 3.3 B และ C

รปท 3.3 การกระตนเซลลดวย IPTG ทความเขมขน 0.02 mM สรางรคอม-บแนนทโปรตน HishTRIM21Δ2(287-475) ทมคณสมบตของการละลายมากกวาการกระตนดวย IPTG 0.2 mm (A) ผลการสงเคราะหรคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21Δ2(287-475) ทอณหภม 20๐C ทเวลา 14 ชวโมง ดวย 0.02 กบ 0.2 mM IPTG ตามล าดบ พบวาเซลลทเลยงดวย 0.02 mM IPTG (แถวท 2) มปรมาณเซลลหนาแนนกวาเซลลทเลยงดวย 0.2 mM IPTG (B) ผลการท าบรสทธของรคอมบแนนทโปรตน ท 20๐C จาก (A) เพอเปรยบเทยบผล IPTG ตอการละลายของโปรตน พบวาการลด IPTG ท าใหโปรตนอยในรปทละลายมากขน (Un=uninduced, W=whole, P=pellet, S=supernatant, FT=flow through และ E=eluted fraction โดยท E1-E4 แสดงโปรตนทผานการชะดวย imidazole ครงท 1 ถง 4)

B C

A

56

3.1.2 กำรทดสอบกำรแสดงออกของยน ควำมสำมำรถในกำรละลำยและกำรท ำบรสทธรคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21Δ2(287-475) รวมกบโปรตนพ เลยง (Chaperone protein)

เนองจากผลการทดสอบการละลายน าตามขอ 3.1.1 รปท 3.1 ซงรคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21Δ2(287-475) ทไดต ามาก ผ วจยจงไดท าการทดลองสรางโปรตนในกลมโปรตนพเลยง (Chaperon protein) เนองจาก Swazts กลาววา การสะสมของโปรตนใน ไซโทพลาสมากเปนสาเหตหนงของการเกด inclusion bodies เนองจากมโปรตนพเลยงหรอกระบวนการปองกนการตกตะกอนไมเพยงพอ (Swartz, 2001) ถงแมวาการทดลองนไมเกด inclusion bodies แตการทโปรตนในการทดลองครงนถกสงเคราะหไดยากใน E.coli (ผลการค านวณจาก www.biotech.ou.edu) หากมการเพมขนของโปรตนพเลยงนาจะมสวนเพมความสามารถในการละลายของโปรตนเหลานได ซงในการทดลองนใช Chaperone set ของ TaKaRa ทตองเพม tetracycline และ L-arabinose เพอกระตนใหพลาสมดสราง Chaperone protein ขนกอนการกระตนการสรางโปรตนทสนใจเมอ OD600 = 0.6 โดยในชดนประกอบ DnaK หรอทถกเรยกโดยทวไปวา hsp70, GroEL, Tf (trigger factor), DnaJ, GrpE และ GroES ซงมขนาด 70, 60, 56, 40, 22 และ 10 KDa ตามล าดบ

โดยพลาสมด pST50Trc2-HishTRIM21Δ2(287-475) ถกน าเขาสเซลล E.coli สายพนธ JM109 ทม pG-KJE8 plasmid ส าหรบ chaperone protein และท าการเลยงเซลลท 37, 28๐C 0.2 mM IPTG 4 ชวโมง และ 18๐C 220 รอบตอนาท เปนเวลา 14 ชวโมง 0.02 mM IPTG และเตม 1 mg/ml L-arabinose, 10 ng/ml tetracycline เพอกระตนการแสดงออกของ pG-KJE8 plasmid ซงชวยสงเคราะหโปรตนพเลยง ผลการสงเคราะหโปรตนทแตละอณหภมมปรมาณนอยกวาหรอใกลเคยงกบการสงเคราะหใน BL21(DE3)pLysS ดงรปท 3.4 A รวมทงปรมาณของโปรตนทผานการท าบรสทธ แตจะมโปรตนอนปนเปอนมากกวา (รปท 3.4 B-D) จากผลการทดลองทไดไมพบความแตกตางของปรมาณการผลตโปรตน โดยพบการแสดงออกของโปรตนทต าแหนงเดยวกบโปรตนทสนใจตงแตเวลาท 0 ชวโมง ซงเปนต าแหนงโปรตนทมขนาดเทากบ GrpE protein ทมขนาด 22 KDa เชนกน อาจเปนไปไดวาการเพมความเครยดดวยวธการนสงผลใหการเจรญของเซลลต ากวาเดมมาก เพอรกษาพลงงานในการสรางความเสถยรใหเซลล เนองจากมการแสดงออกเพมขนเลกนอยของโปรตนใน 2 ต าแหนงทใกลเคยงการกบการแสดงออกในเซลลทมการเพม chaperone plasmid โดยพบวามการเพมของความเขมแถบโปรตนทประมาณ 70 และ 56 KDa ซงเปนต าแหนงของ DnaK และ Tf protein ทเปนโปรตนพเลยงพนฐานทพบการแสดงออกไดบอยและท าหนาทในการรกษาและเพมความสามารถในการทนตอ

57

ความเครยดของเซลล ดงการทดลองของ Sandee และคณะรวมทง Kohiyama ทพบการเพมขนของ DnaK chaperone protein เมอมการเพมขนของ osmolarity ภายในเซลล (meury et al., 1991; Meury et al., 1993; Sandee et al., 2002)

รปท 3.4 ผลการแสดงออกของยน HishTRIM21Δ2(287-475) และการท า

บรสทธรคอมบแนนทโปรตนรวมกบโปรตนพเลยง (Chaperone protein) ท 37, 28 และ 20๐C (A) ผลการปรบปรงการแสดงออกของยนในการสงเคราะหบแนนทโปรตน HishTRIM21Δ2(287-475) รวมกบโปรตนพเลยง (Chaperone protein) ท 37 และ 28๐C พบวาอตราการเจรญของเซลลและการผลตโปรตนเปาหมายต า โดยท (B และ C) แสดงผลการท าบรสทธรคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21Δ2(287-475) ดวย Talon affinity resin ทอณหภม 37 และ 28๐C ตามล าดบ พบวาอยในรปทละลายน าไดเลกนอยท าใหปรมาณโปรตนทไดจากกระบวนการท าบรสทธต ามาก และ

A

B C

D

58

(D) แสดงผลการท าบรสทธของโปรตนจากการเลยงทอณหภม 20๐C เปนเวลา 14 ชวโมง ดวย 0.02 mM IPTG พบวาทอณหภมต าลงการละลายดขนเลกนอย และสามารถท าบรสทธไดดขน เนองจากพบแถบโปรตนเปาหมายทผานการท าบรสทธไดอยางชดเจน (แถวท 7 และ 8) (Un=uninduced, W=whole, P=pellet, S=supernatant, FT=flow through และ E=eluted fraction โดยท E1-E4 แสดงโปรตนทผานการชะดวย imidazole ครงท 1 ถง 4)

3.1.3 กำรทดสอบกำรแสดงออกของยนและควำมสำมำรถในกำรละลำย

ของรคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21Δ2(287-475) ทผลตในแบคทเรย E.coli สำยพนธ BL21(DE3)pLysS ใน SPM (soluble protein media)

นอกจากการใชวธการเพม chaperone protein แลว มความสนใจทจะเลยนแบบความเครยดทเกดขนอกอยางตามธรรมชาต ดวยการเพมสารเคมบางตวลงไป คอ sorbitol และ betaine ซงวธการเลยงเซลลและเตมสารเคมในกลมนเปนกระบวนการเลยงทพฒนาขนเพอเพม osmotic pressure ใหกบเซลล มการสรางสารบางอยางเพอรกษาคณภาพของโปรตนภายในเซลล เชน heat shock protein (Hsp) ดงทไดอธบายไวในขอ 2.3.4 จากการทดลองเลยงท 37๐C พบวาอตราการเจรญเตบโตของเซลลต าและเมอกระตนดวย IPTG แลวไมพบวาความขนของอาหารเลยงเซลลตางจากเดมเมอเทยบดวยการเลยงดวยอาหารเลยงปกต (ไมแสดงภาพ) อยางไรกตามการเกบตวอยางท 0 ชวโมงจะเปนการเกบครงละ 500 µl สวนเวลาอนๆ เกบท 250 µl จงเปนเหตผลทท าให crude extract ท 0 ชวโมงมความเขมมากกวาท 2.5 ชวโมง เนองความเขมขนเซลลมากกวาจากใชปรมาตรทเทากน และการแสดงออกของยนนนเกด autoinduction (รปท 3.5 A แถวท1 และ 3) หรออาจเปน GrpE protein ซงมขนาดประมาณ 22 KDa เนองจากรปแบบการแสดงผลของเจลอเลกโตรโฟเรซสคลายกบรปแบบเจลของการผลตโปรตนรวมกบโปรตนพเลยง ทมการเพมความเขมขนเลกนอยของแถบโปรตนทประมาณ 70 และ 56 KDa ซงเปนต าแหนงของ DnaK และ Tf protein (รปท 3.5 A) เมอน ามาท าบรสทธโปรตน ผลของเจลอเลกโตรโฟเรซสไมพบแถบโปรตนเปาหมายใน Supernatant และ Flow Through fractions หากแตพบแถบโปรตนทสนใจในสวนของ eluted (E) fraction ดงแสดงในรปท 3.5 B อยางไรกตาม การทดลองเลยงเซลลดวย SPM media ไมประสบความส าเรจ ใหปรมาณโปรตนในรปทละลายน าไมเพยงพอตอการวจย จงไมเลอกวธการนในการเลยงเซลลเพอการวจยตอ

59

รปท 3.5 แสดงผลการสงเคราะหรคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21Δ2(287-

475) ภายใตระบบ SPM ท 37๐C (A) ภาพแสดงผลการสงเคราะหรคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21Δ2(287-475) ในระบบ SPM ทอณหภม 37๐C ทเวลา 0 ถง 2.5 ชวโมง โดยการกระตนดวย 0.2 และ 0.1 mM IPTG ตามล าดบ พบวาปรมาณการแสดงออกไมตางกน (B) ผลการท าบรสทธของ recombinant protein อยในรป insoluble form ไมพบแถบโปรตนใน S และ FT การท าบรสทธใหโปรตนนอยมากไมเพยงพอตอการวจยในครงน (W=whole, P=pellet, S=supernatant, FT=flow through และ E=eluted fraction โดยท E1-E4 แสดงโปรตนทผานการชะดวย imidazole ครงท 1 ถง 4)

3.1.4 กำรทดสอบกำรแสดงออกของยนและควำมสำมำรถในกำรละลำยของรคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21Δ1(275-475) ทผลตในแบคทเรย E.coli สำยพนธ BL21(DE3)pLysS

ทางผ วจยไดสรางพลาสมด pST50Trc2-HishTRIM21Δ1(275-475) ซงมสวนของกรดอะมโนบนต าแหนง N-terminus เพมเตมมาจาก TRIM21Δ2(287-475) และอาจเปนผลใหกระบวนการพบมวนของโปรตนสมบรณถกตองมากขน จงสงเคราะหโปรตนขนดวยการใชแบคทเรย E.coli สายพนธ BL21(DE3)pLysS เปนเซลลเจาบานในการสงเคราะหโดยท าการเลยงเซลลท 37๐C ชกน าดวย 0.2 mM IPTG เปนเวลา 4 ชวโมง และทอณหภม 20๐C ชกน าดวย 0.02 mM IPTG เปนเวลา 14 ชวโมง เพอตรวจสอบการแสดงออกของยน จากผลของเจลอเลกโทรโฟเรซสพบวารคอม-บแนนทโปรตน HishTRIM21Δ1(275-475) มขนาดประมาณ 25 KDa ดงรปท 3.6 A และ B พบวาทงสองอณหภมใหปรมาณโปรตนไมตางกน จงท าการทดสอบการละลายและท าบรสทธโปรตน ผลการทดลองพบวาโปรตนจากการผลตทอณหภม 37๐C ไมละลายน าและท า

A B

60

บรสทธไดนอยมากไมสามารถใชในการทดลองตอไปได (รปท 3.6 C) ตางจากรคอมบแนนทโปรตนทสงเคราะหจากอณหภมทต ากวา คอ 20๐C พบวามการละลายน าทดกวาและสามารถท าบรสทธไดมากและสามารถน าไปใชในการทดลองได (รปท 3.6 D)

รปท 3.6 ผลการแสดงออกของยน และความสามารถในการละลายของรคอม-

บแนนทโปรตน HishTRIM21Δ1(275-475) ทอณหภม 37 และ 28๐C (A) ผลการแสดงออกของยนในการสงเคราะหรคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21Δ1(275-475) ทอณหภม 37๐C ทเวลา 0 ถง 4 ชวโมง และกระตนดวย 0.2 mM IPTG และ (B) อณหภม 20๐C ทเวลา 14 ชวโมง ดวย 0.02 mM IPTG (C) ผลการท าบรสทธของรคอมบแนนทโปรตน ท 37๐C ไมพบการละลายน าของโปรตนเปาหมาย และสามารถท าบรสทธโปรตนไดเลกนอยไมเพยงพอตอการน ามาใชทดสอบตอได ในขณะท (D) พบวารคอมบแนนทโปรตนมความสามารถในการละลายน าไดประมาณ 20-40% (S fraction แถวท 4) และสามารถน ามาท าบรสทธโปรตนเพอการวจยในล าดบตอไปได (W, P, S และ FT แสดงถง whole, pellet, supernatant, และ flow through fraction ตามล าดบ และ E คอ eluted fraction โดยท E1-E4 แสดงโปรตนทผานการชะดวย imidazole ครงท 1 ถง 4

A B

C D

61

3.1.5 กำรทดสอบกำรแสดงออกของยนและควำมสำมำรถในกำรละลำยของรคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21Δ1(275-475) รวมกบโปรตนพเลยง (Chaperone protein)

ท าการตรวจสอบการแสดงออกของยน HishTRIM21Δ1(275-475) รวมกบโปรตนพเลยงโดยท าการทดลองเชนเดยวกบรคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21Δ2(287-475) ตามขอท 3.1.2 ซงผลการสงเคราะหโปรตนทไดมความใกลเคยงหรอมากกวาเลกนอยกบการสงเคราะหใน BL21(DE3)pLysS (รปท 3.7 A) โดยมอตราการละลายน าประมาณ 50% ซงมากกวาอตราการละลายของ HishTRIM21Δ2 เมอมการละลายเพมขนท าใหปรมาณโปรตนทผานการท าบรสทธมความเขมขเนและมากขน ดงรปท 3.7 B (แถวท 7 และ 8)

รปท 3.7 รคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21Δ1(275-475) มการแสดงออกของ

ยน ความสามารถในการละลาย และการท าบรสทธโปรตนไดมากขนดวยการเลยงท 18๐C (A) ผลการแสดงออกของยนในการสงเคราะหรคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21Δ1(275-475) ทอณหภม 18๐C ทเวลา 14 ชวโมง และกระตนดวย 0.02 mM IPTG และ (B) ผลการท าบรสทธของ รคอมบแนนทโปรตนจากอณหภม 18๐C พบวาอยในรปทละลายน าไดบางสวน เมอผานการตรงผาน Talon affinity column ถกดดซบไดสงเนองจากพบการลดลงอยางมากของแถบโปรตนเปาหมายใน Flow through fraction ซงเปนบฟเฟอรทใชในการลาง unbound protein หรอ โปรตนทไมสามรถยดเกาะเรซนได (Un=uninduced, W=whole, P=pellet, S=supernatant, FT=flow through และ E=eluted fraction โดยท E1-E4 แสดงแถบโปรตนทผานการชะดวย imidazole ครงท 1 ถง 4)

จากการพยายามเพอปรบปรงการแสดงออกของรคอมบแนนทโปรตน hTRIM21 พบวาวธทดและสะดวกทชวยเพมอตราการละลายน าของโปรตนไดมากขน คอ การลดอณหภมของการเลยงลงใหอยระหวาง 18 ถง 20๐C สวนวธการอนๆ เชน การเพมการแสดงออกของโปรตน

A B

62

พเลยง (chaperone protein) รวมกบการสงเคราะหโปรตนเปาหมาย ไมเพมความสามารถในการสงเคราะหหรอการละลายของโปรตนมากขนจากการสงเคราะหโปรตนเปาหมายเพยงอยางเดยว และการละลายของโปรตนทสงเคราะหรวมกบโปรตนพเลยงจะเพมขนเมอมการลดอณหภมการเลยงลงเชนกน สวนการใช SPM นนไมเหมาะสมตอการทดลองน เนองจากไมสามารถเพมการสรางโปรตนทตองการได และคาใชจายในการเลยงสงขนดวย จากการทดลองทงหมดไมพบความแตกตางอยางสนเชงของปรมาณการแสดงออกของโปรตนและความสามารถในการละลาย รวมถงความสามารถในการท าบรสทธระหวางโปรตนทงสองขนาด โดยท HishTRIM21Δ1(275-475) อาจใหปรมาณโปรตนสงกวา HishTRIM21Δ2(287-475) เลกนอยเทานน ดงนนจงเลอกใชการลดอณหภมเปนปจจยหลกในการสงเคราะหโปรตนเพอการวจยตอไป

3.1.6 กำรสงเครำะห กำรทดสอบควำมสำมำรถในกำรละลำย และกำรท ำ

บรสทธรคอมบแนนทโปรตน hFADDΔ1HisSTRx2(F25Y) ทผลตในแบคทเรย E.coli สำยพนธ BL21(DE3)pLysS

จากการทดลองของ Young และคณะในป 2011 พบวา FADD DED สามารถเกดปฏสมพนธกบ TRIM21 ได (Young et al., 2011) ผวจยจงมความสนใจในการศกษาปฏสมพนธน จากระบบของแบคทเรย ซงมรายงานกอนหนานวา FADD DED ทผานการสงเคราะหจากแบคทเรยขาดคณสมบตของการละลายน าซงไมสามารถท าการวจยตอได จงตองท าการปรบปรงการสงเคราะห FADD DED ตามรายงานการทดลองของ Eberstadt และคณะในป 1998 ทแสดงวาการเปลยนแปลงกรดอะมโนเปน F25Y FADD DED สามารถปองกนการเกด self-aggregation โดยไมกอใหเกดการเปลยนแปลงของขนาดเซลล กระบวนการตายของเซลล (apoptosis) และยงคงรกษาคณสมบตในการเกดปฏสมพนธกบ caspase 8 (Eberstadt et al., 1998) ดงนนเปนไปไดวาการเปลยนแปลงนจะไมขดขวางตอการเกดปฏสมพนธกบ TRIM21 เชนเดยวกน โดยผวจยท าการสรางรคอมบแนนทโปรตน hFADD∆1HisSTRx2(2-90) ซงเปน DED domain ของ FADD และผานการเปลยนกรดอะมโนฟนลอะลานนทต าแหนง 25 เปนไทโรซน (F25Y) ดวยการท า quick change site-directed mutagenesis (SDM) และตดตามการแสดงออกทเวลา 0, 1, 2, 3 และ 4 ชวโมง พบวารคอมบแนนทโปรตน hFADDΔ1HisSTRx2 มขนาดประมาณ 15 KDa และจากตวอยางท 0 ชวโมง มแถบโปรตนในต าแหนงทสนใจและมปรมาณเพมขนตามเวลาของการเกบโดยตวอยางท 4 ชวโมงมการแสดงออกของโปรตนมากกวาชวโมงท 0 ประมาณ 2 หรอ 3 เทา (รปท 3.8 A) ซงการท า SDM นใหผลสอดคลองกบ Eberstadt และคณะ ดงผลการทดลองในรปท 3.8 B ทพบแถบโปรตน hFADDΔ1HisSTRx2(2-90) (F25Y FADD DED) ในสวนของ

63

supernatant (S(F25Y)) (แถวท 6) แสดงถงความสามารถในการละลายน าไดเมอเปรยบเทยบกบ wt FADD DED ทไมพบแถบโปรตนใน supernatant (S(wt)) แตอยในสวนของ pellet (P(wt)) และ (แถวท 5 และ 3 ตามล าดบ) และ (C) แสดงผลการท าบรสทธโปรตน ซงในการท าบรสทธนนใชสารละลายโปรตนในสวนของ supernatant ผานคอลมน Strep-Tactin affinity resin โดย hFADDΔ1HisSTRx2 จะถกตรงไวกบเรซนผาน STR tag ไดดและเปนจ านวนมาก ท าใหรคอม-บแนนทโปรตน hFADDΔ1HisSTRx2 คงเหลอในบฟเฟอรทผานการลาง non-specific binding protein หรอ flow through (FT) ลดลงเปนอยางมาก เมอเทยบกบปรมาณโปรตนตงตนกอนการผานคอลมน หรอ supernatant (S) fraction (แถวท 5 และ 4 ตามล าดบ) ท าใหมโปรตนทผานการท าบรสทธและพรอมตอการท าวจยเปนจ านวนมาก

รปท 3.8 ผลการสงเคราะห hFADDΔ1HisSTRx2(F25Y) และความสามารถใน

การละลายทมากขนเมอเปรยบเทยบกบ hFADDΔ1HisSTRx1(wt) ท าใหสามารถท าบรสทธโปรตนไดมาก (A) ผลการแสดงออกของยนในการสงเคราะหรคอมบแนนท hFADDΔ1HisSTRx2 ทอณหภม 37 และ 28๐C ตามล าดบ ซงใหโปรตนทมขนาดประมาณ 15 KDa พบวาทอณหภม 28๐C มอตราการสงเคราะหโปรตน hFADDΔ1HIsSTRx2 มากกวาทอณหภม 37๐C (B) การเปรยบเทยบผลการละลายหลงการท า SDM ท าใหรคอมบแนนทโปรตนสามารถละลายน าได และ (C) ผลการท าบรสทธของรคอมบแนนทโปรตน ท 37๐C พบวาอยในรปทละลายน าไดสง และ เรซนสามารถตรงโปรตนไ ดมาก ท าใ หพบแถบโปรตนเปาหมายไดตงแต E2-E4

A

B C

64

(Un=uninduced, W=whole, P=pellet, S=supernatant, FT=flow through และ E=eluted fraction โดยท E1-E4 แสดงโปรตนทผานการชะดวย imidazole ครงท 1 ถง 4)

3.2 กำรตรวจสอบปฏสมพนธของ FADD และ TRIM21 จำกแบคทเรยดวย pull down assay จากการรายงานของ Young และคณะทพบวาโปรตน hFADD และ hTRIM21 สามารถเกดปฏสมพนธตอกนและสงเสรมการท างานของระบบภมคมกนตนเอง (Young et al., 2011) เพอตองการทราบต าแหนงบนโปรตนทใชในการเกดปฏสมพนธ ผ วจยจง ตรวจสอบปฏสมพนธระหวางโปรตนทงสองตามวธการทจะกลาวในล าดบถดไป

3.2.1 กำรตรวจสอบปฏสมพนธระหวำงรคอมบแนนทโปรตน hFADDΔ1HIsSTRx2(F25Y) และ HishTRIM21Δ2(287-475) ทผลตในแบคทเรย การทดสอบปฏสมพนธนใชวธการ pull down assay เรมตนจากการน ารคอม-บแนนทโปรตน hFADDΔ1HisSTRx2(F25Y) มาท าการตรงกบ Strep-tactin resin จากนนน า HishTRIM21Δ2(287-475) มาบมในสารละลาย beads[hFADDΔ1HisSTRx2(F25Y)] ท 4๐C ตามขอ 2.4.1 และตรวจสอบดวย SDS-PAGE พบวา HishTRIM21Δ2(287-475) ไมเกดปฏสมพนธโดยตรงกบ beads (แถวท 4 และ 5) และ HishTRIM21Δ2(287-475) ไมสามารถ เกดปฏสมพนธรวมกบ hFADDΔ1HisSTRx2(F25Y) ได เนองจากไมพบแถบโปรตนของ HishTRIM21Δ2 ใน beads (hFADDΔ1HisSTRx2(F25Y)+HishTRIM21Δ2) (รปท 3.9 แถว 7)

รปท 3.9 hFADDΔ1HisSTRx2(F25Y) ไมสามารถเกดปฏสมพนธกบ HishTRIM21Δ2(287-475) ได โดยแสดงผลการท า pull down assay ดวย Strep-Tactin resin ระหวาง hFADD1HisSTRx2(F25Y) และ HishTRIM212 protein จากผลการทดลองแสดงใหเหนวา เฉพาะ B30.2 domain ของ hTRIM21 ไมสามารถเกดปฏสมพนธกบ F25Y ของ DED

65

domain จาก hFADD ได โดย Inp, S และ B แสดงถง input, supernatant และ beads fraction ตามล าดบ

3.2.2 กำรตรวจสอบปฏสมพนธระหวำงรคอมบแนนท โปรตน hFADDΔ1HIsSTRx2(F25Y) และ HishTRIM21Δ1(275-475) ทผลตในแบคทเรย

เนองจากการทดลองตรวจสอบปฏสมพนธ hFADDΔ1HisSTRx2(F25Y) และ HishTRIM21Δ2(287-475) กอนหนาไมพบการเกดปฏสมพนธระหวางโปรตนทงสอง ผวจยจงไดท าการทดสอบผลระหวาง hFADDΔ1HisSTRx2(F25Y) และ HishTRIM21Δ1(275-475) ผลการทดลองทไดยงไมปรากฏปฏสมพนธระหวางโปรตนทงสองเชนเดม (รปท 3.10 A) นอกจากนผวจยใช crude extract (whole cell extract) เพอหลกเลยงผลกระทบทอาจเกดขนกบโปรตนทตองการในระหวางการเกบรกษาและการท าบรสทธ เพอใหไดโปรตนทอยในรปทใกลเคยงกบสภาวะตามธรรมชาต ซ ง ไมพบการเกดปฏสมพนธระหวางโปรตนทงสองเชนกน ผลทไ ดจาก gel electrophoresis (รปท 3.10 B) พบวา JM109 cell extract จะม non specific binding มากกวา BL21(DE3)pLysS cell extract และปรมาณของ soluble HishTRIM21Δ1(275-475) จากทงสองเซลลเทาหรอใกลเคยงกน และในแถว 11 (รปท 3.10 B) ซง เปน Beads[(hFADDΔ1HisSTRx2(F25Y)+HishTRIM21Δ1(275-475)] พบแถบโปรตนบางๆ ของ HishTRIM21Δ1 ทไมพบในแถว 9 ทเปน beads[(blank+HishTRIM21Δ1(275-475)] อาจเกดปฏสมพนธตอกนในระดบต า ซงทดสอบความถกตองตอไปดวย Western blot analysis (รปท 3.10 C) โดยการน าตวอยางจาก pull down assay ใน beads fraction ท 2, 4, 6, 7, 9, และ 11 ของรปท 3.10 B มาใชในการทดสอบ จากผลของ Western blot พบวา แถวท 2 และ 5 ซงเปนตวอยางจาก beads(HishTRIM21Δ1(275-475) # 4 และ 9 ไมพบการแสดงออกโปรตนทงสองชนด เนองจากไมมรคอมบแนนทโปรตน hFADDΔ1HisSTRx2(F25Y) ทเปนตวกลางในการตรงกบเรซน ในขณะทแถวท 3 และ 6 เปนตวอยางจาก beads[hFADDΔ1HisSTRx2(F25Y)+ HishTRIM21Δ1(275-475)] # 6 และ 11 พบการแสดงออก hFADDΔ1HisSTRx2(F25Y) เทานน แสดงวารคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21Δ1(275-475) ไมสามารถเกดปฏสมพนธกบ รคอมบแนนทโปรตน hFADDΔ1HisSTRx2(F25Y) ได

66

รปท 3.10 hFADD1HisSTRx2(F25Y) ไมสามารถสรางปฏสมพนธกบ

HishTRIM211 ได (A) แสดงผลการท า pull down assay ดวย Strep-Tactin resin ของ รคอมบแนนทโปตนทผานการท าบรสท ธ ระหวาง hFadd1HisSTRx2(F25Y) และ HishTRIM211(275-475) ไมสามารถเกดปฏสมพนธตอกน นอกจากน (B) ในการทดลองทท ากบ crude extract ในคอลมนของ beads พบแถบโปรตนเปาหมายทต าแหนงของ HishTRIM211 protein จงไดทดสอบเพอยนยนผลโปรตนดวย Western blot analysis (C) พบวาโปรตนดงกลาวไมใช HishTRIM211 เนองจากไมพบรคอมบแนนท HishTRIM21Δ1(275-

475) ใน beads[hFADDΔ1HisSTRx2(F25Y)+HishTRIM21Δ1(275-475)] # 6 และ 11 ดงนน การเพมสวนของ linker ทมล าดบเบสกอน B30.2 domain ของ hTRIM21 ไมอาจเพม

B

A

C

67

ความสามารถในการกอใหเกดปฏสมพนธกบ F25Y ของ DED domain จาก hFADD ได โดย Inp, S และ B แสดงถง input, supernatant และ beads fraction ตามล าดบ

3.2.3 กำรสงเครำะห กำรทดสอบควำมสำมำรถในกำรละลำย และกำรท ำ

บรสทธรคอมบแนนทโปรตน hFADDHisSTR จำกแบคทเรย E.coli สำยพนธ BL21(DE3)pLysS

จากการไมพบปฏสมพนธระหวาง DED domain ของ hFADD และB30.2 domain ของ hTRIM21 ผวจยจงสงเคราะห hFADD และ hTRIM21 เสนเตม ในการสงเคาะห hFADD(wt) ท าโดยการสรางพลาสมด hFADDHisSTR(wt) ท าการเลยงท 37, 28๐C 220 รอบตอนาท เปนเวลา 4 ชวโมง และกระตนดวย IPTG ทความเขมขน 0.2 mM และการเลยงทอณหภม 18๐C 220 รอบตอนาท เปนเวลา 14 ชวโมง ดงแสดงในรปท 3.11 A และ B ตามล าดบ ซงใหขนาดของโปรตนบนแผนเจลทผานการท าเจลอเลกโตรโฟเรซสไดขนาด 30 KDa ขนาดทไดนไมตรงตามขนาดของ hFADD ทไดจากทฤษฎทควรไดประมาณ 25 KDa ซงนาจะเกดจากผลรวมของ tag protein และความคลาดเคลอนของระบบถงแมวาทง 6xHistidineg และ Strep-Tactin tag จะถกยอมรบวามขนาดเลกไมมผลกอใหเกดการเปลยนแปลงน าหนกโมเลกลของโปรตนแตอยางใด ถงอยางไรกตามการเพมขนเลกนอยนไมนาสงผลตอผลการทดลองเชนกน แตเมอน าโปรตนไปทดสอบการละลายและท าบรสทธพบวา wt FADD มแถบโปรตนใน W และ P fraction แสดงวาโปรตนละลายน าไดนอย ซงการท าบรสทธผาน Strep-tactin resin สามารถดดซบโปรตนไดสงมาก (รปท 3.11 C-E)

68

รปท 3.11 ผลการแสดงออกของยน ความสามารถในการละลาย และการท า

บรสทธของรคอมบแนนทโปรตน hFADDHisSTR ทอณหภม 37, 28 และ 18๐C (A) ผลการแสดงออกของยนในการสงเคราะหรคอมบแนนทโปรตน hFADDHisSTR ทอณหภม 37 และ 28 ๐C ทเวลา 0 ถง 3 ชวโมง และกระตนดวย 0.2 mM IPTG และ (B) การเลยงเซลลทอณหภม 18๐C ทเวลา 14 ชวโมง ดวย 0.02 mM IPTG พบวาปรมาณการแสดงออกของยนท 37๐C เปน 4 เทาการเลยงเซลลท 28๐C สวนการแสดงออกของยนท 18๐C ใกลเคยงกบการแสดงออกท 28๐C (C และ D) ผลการท าบรสทธของ recombinant protein ดวย Talon resin ท 37 และ 28๐C พบวาอยในรปทละลายน าและท าบรสทธไดบางสวน โดยพบแถบโปรตนเปาหมายใน E2 และ E3 fraction และ (E) เปนการท าบรสทธของ recombinant protein ท 18๐C จากนนท า pull down assay ทนท ในภาพนตองการแสดงถงความสามารถในการละลายและการท าบรสทธ ซงไมพบ

A B

C D

E

69

โปรตนเปาหมายใน Supernatant และ Flow through เมอผานการตรงดวยเรซนพบโปรตนเปาหมายใน beads fraction เลกนอย โดย inp, S และ B แสดงถง input, supernatant และ beads fraction ตามล าดบ

3.2.4 กำรตรวจสอบปฏสมพนธระหวำง รคอมบแนนทโปรตน

hFADDHisSTR(wt) และ HishTRIM21Δ1(275-475) ทผลตในแบคทเรย เนองจากการทดลองนตองการทราบต าแหนงของการเกดปฏสมพนธบนโปรตน

hTRIM21 เมอไมพบปฏสมพนธระหวาง hFADDΔ1HisSTRx2(F25Y) และ HishTRIM21Δ1 ดงนน hFADDHisSTR(wt) ซงเปนรคอมบแนนทโปรตนเสนเตมจากเซลลทผานการเลยงทอณหภม 28๐C 4 ชวโมง และกระตนดวย 0.2 mM IPTG และ 18๐C เปนเวลา 14 ชวโมง และกระตนดวย 0.02 mM IPTG (ซงอยในรป crude extract เพอลดผลกระทบจากกระบวนการท าบรสทธ) จงถกน ามาใชแทน hFADDΔ1HisSTRx2 (F25Y) โดยการยดกบ Strep-tactin resin เพอเปรยบเทยบและท าการทดสอบการเกดปฏสมพนธกบโปรตน HishTRIM21Δ1 จากผลการทดลองพบวาhFADDHisSTR(wt) จากทงสองอณหภมไมสามารถเกดปฏสมพนธกบ HishTRIM21Δ1ได ในขณะท (B) แสดงผลการทดสอบปฏสมพนธ ระหวาง hFADDHisSTR(wt) และHishTRIM21Δ1 ทอยในรปทผานการท าบรสทธทงคซงใหผลเชนเดม คอ ไมเกดปฏสมพนธระหวางโปรตนทงสองชนด นอกจากนผวจยไดท า Western blot analysis เพอขยายสญญาณโปรตนทอาจมการเกดปฏสมพนธระหวางโปรตนทงสองในระดบต ามากๆจนไมสามารถตรวจพบดวย gel electrophoresis ซงผลของ Western blot ไมพบการเกดปฏสมพนธระหวางโปรตนทงสอง ดงรปท 3.12 B

70

รปท 3.12 HishTRIM21Δ1(275-475) ไมสามารถเกดปฏสมพนธกบ

hFADDHisSTR(wt) (A) แสดงผลการท า pull down assay ดวย Strep-Tactin resin ระหวาง hFADDHisSTR(wt) โดยใช crude extract สวนผลจากการท า pull down assay พบวา การ hFADD protein เสนเตมและอยในรป wt ไมสามารถเกดปฏสมพนธกบ HishTRIM211 ได รวมทง (B) การท า pull down assay ดวยโปรตนทผานการท าบรสทธซงใหผลเชนเดยวกบการทดลองใน crude extract ยนยนผลดวยการท า Western blot analysis อกครง ซงไมพบ

HishTRIM21Δ1(275-475) ใน beads fraction โดย lnp, S และ B แสดงถง input, supernatant และ beads fraction ตามล าดบ

A

B

71

3.2.5 กำรตรวจสอบปฏสมพนธระหวำง รคอมบแนนท โปรตน hFADDSTR(wt) และ HishTRIM21Δ1(275-475) จำก co-expression plasmid ทผลตภำยในเซลเจำบำนเดยวกน

เนองดวยการสงเคราะหโปรตนดวยเซลลเจาบานเปนชนดเดยว คอ หนงโปรตนตอหนงเซลล ใหผลการทดลองทไมมปฏสมพนธตอกนระหวางโปรตนทงสอง จงไดท าการทดลองตอดวยการสงเคราะหโปรตนทงสองในเซลลเจาบานเดยวกน ผานการสรางพลาสมดทเรยกวา multi site co-expression vector โดยมจดประสงคเพอลดปจจยเสยงจากภายนอกเซลลทอาจขดขวางการเกดปฏสมพนธ เชน สภาวะแวดลอมนอกเซลลทแตกตางไป กระบวนการท าบรสทธอาจมผลตอโครงสรางของโปรตนตวใดตวหนง จงตองพยายามใหโปรตนอยใน native form มากทสด เชน การทดลองของ Dzivenu และคณะในป 2004 พบวาการสงเคราะห nuclease DFF40 เดยวๆไดโปรตนทพบมวนผดรปไป แตเมอสรางรวมกบ DFF45 ในเซลลเดยวกนพบวาโปรตนทงสองเกดปฏสมพนธเปน complex แบบ heterodimer (Dzivenu et al., 2004) ในการท า co-expression อาจใชหนงพลาสมดทมหลาย open reading frame (ORF) หรอ transform หลาย พลาสมดเขาสเซลลเดยวกน แตอยางไรกตามการทดลองนเลอกใชหนงพลาสมด คอ pST44 ในการ transform เขาสเซลล E.coli BL21(DE3)pLysS ซงเปนเซลลเจาบานทไดรบการยอมรบและใชกนทวไปและม T7 promotor ทถอวามประสทธภาพสงในการเกาะของโพลเมอรเรส เพอตรวจสอบการเกดปฏสมพนธระหวางโปรตนทงสอง (Khow & Suntrarachun, 2012; Selleck & Tan, 2001) โดยการใชหลกการวา หากโปรตนทงสองถกสรางขนภายในเซลลเจาบานเดยวกนและสามารถเกดปฏสมพนธระหวางกนได โปรตนทงสองจะอยในรปทเปน complex เมอท าใหเซลลแตก complex ของโปรตนทงสองจะยงคงสภาพการมปฏสมพนธระหวางกนไวได หากโปรตนหนงในสองตวนถกตรงไวกบ beads จะพบโปรตนอกตวรวมอยใน complex นดวย ซงการทดลองนท าขนระหวาง hFADDSTR(wt) และ HishTRIM21Δ1(275-475) จากผลการทดลองพบวา hFADDSTR(wt) มการแสดงออกสงกวา HishTRIM21Δ1(275-475) แตอยในรปทไมละลายน า ในขณะท HishTRIM21Δ1(275-475) อยในรปทละลายน ามากกวา (เปรยบเทยบระหวาง W, P และ S แถวท 2, 3 และ 4) เมอน า crude extract มาท าการบมรวมกบ Talon affinity resin ซงมโคบอลทตรงบนพนผวเรซน และสามารถเกดปฏสมพนธกบ His tag บนรคอมบแนนท โปรตน HishTRIM21Δ1(275-475) ไดด เมอท าการชะโปรตนดวย imidazole พบเพยง HishTRIM21Δ1(275-475) ทยงเกาะกบ beads และไมพบ hFADDSTR(wt) ในสารละลาย eluted fraction แสดงวา hFADDSTR(wt) ไมสามารถเกดปฏสมพนธกบ HishTRIM21Δ(275-475) ได ดงรปท 3.13

72

รปท 3.13 hFADDSTR(wt) ไมเกดปฏสมพนธกบ HishTRIM21Δ1(275-475)

แมวาโปรตนทงสองจะถกผลตภายในเซลลเจาบาน โดยใชวธเดยวกบการท าบรสทธโปรตนเนองจากโปรตนเปาหมายเกดจาก co-expression plasmid ภายในเซลลเจาบาน แบคทเรย E.coli สายพนธ BL21(DE3)pLysS ทเลยงในสภาวะ 18๐C และกระตนดวย 0.02 mM IPTG จากรปเจลพบวาโปรตน hFADDSTR(wt) มความสามารถในการแสดงออกมากกวา HishTRIM21Δ1 ทพบใน W fraction นอยมาก แตสามารถจบกน Talon resin ไดด จากผลการทดลองไมพบโปรตน hFADDSTR(wt) ใน bead fraction (Un=uninduced, W=whole, P=pellet, S=supernatant, FT=flow through และ E=eluted fraction โดยท E1-E4 แสดงโปรตนทผานการชะดวย imidazole ครงท 1 ถง 4)

3.2.6 กำรทดสอบกำรแสดงออกของยนควำมสำมำรถในกำรละลำย และกำรท ำบรสทธรคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21 ทผลตในแบคทเรย E.coli สำยพนธ BL21(DE3)pLysS ในการสรางและทดสอบรคอมบแนนทโปรตน hTRIM21 ทงสองขนาดเพอตรวจสอบวา B30.2 domain จ าเปนและเพยงพอหรอไมในการเกดปฏสมพนธ ซงผลการทดลองไมพบการเกดปฏสมพนธดงกลาว ทางผวจยจงสรางพลาสมด HishTRIM21(wt) ซงเปนโปรตนเสนเตมของ hTRIM21 protein โดยการเลยงเซลลท 18๐C ชกน าดวย 0.02 mM IPTG เปนเวลา 14 ชวโมง พบวาโปรตนทไดมขนาด 54 kDa มความสามารถในการละลายต า แตยงสามารถพบโปรตนเปาหมายไดใน E2 fraction เพยงเลกนอย

73

รปท 3.14 ผลการแสดงออกของยน และการท าบรสทธดวย Talon resin ของร

คอมบแนนท HishTRIM21(FL) (A) ผลการแสดงออกของยนในการสงเคราะหรคอมบแนนทโปรตน HishTRIM21 ทอณหภม 18๐C ทเวลา 14 ชวโมง และกระตนดวย 0.02 mM IPTG (B) ผลการท าบรสทธของรคอมบแนนทโปรตน ท 18๐C พบวาอยในรปทละลายน าไดนอย เนองจากพบโปรตนเปาหมายใน E2 และ E3 เพยงเลกนอย (Un=uninduced, W=whole, P=pellet, S=supernatant, FT=flow through และ E=eluted fraction โดยท E1-E4 แสดงโปรตนทผานการชะดวย imidazole ครงท 1 ถง 4)

3.2.7 กำรตรวจสอบปฏสมพนธระหวำง รคอมบแนนทโปรตน hFADDHisSTR(wt) และ HishTRIM21(wt) ทผลตในแบคทเรย

เนองจากการทดสอบปฏสมพนธระหวางรคอมบแนนทโปรตน hFADD และ HishTRIM21 ขนาดตางๆ แตไมเกดปฏสมพนธ ดงนน ผวจยจงไดลองทดสอบปฏสมพนธระหวางรคอมบแนนท FADD และ TRIM21 เสนเตมทผลตในแบคทเรย การทดลองนใ ช hFADDHisSTR(wt) ทยดกบ Strep-Tactin beads เพอบมกบ Talon purified HishTRIM21 จากการทดสอบพบวา hFADDHisSTR เสนเตม ไมสามารถสรางปฏสมพนธกบ HishTRIM21 เสนเตมได (รปท 3.15) ดงนนผวจยจงสรปวา โปรตนทงสองทผลตในแบคทเรยไมสามารถสรางปฏสมพนธกนได ซงระบบของแบคทเรยไมสามารถพบมวนโปรตนทงสองไดอยางถกตอง และขาด post-translational modification

A B

74

รปท 3.15 hFADDHisSTR(wt) ไมสามารถสรางปฏสมพนธกบ

HishTRIM21(wt) ได แสดงผลการท า pull down assay ดวย Strep-Tactin resin ระหวาง hFADDHisSTR(wt) และ HishTRIM21(wt) protein ทเลยงในสภาวะ 18๐C และกระตนดวย 0.02 mM IPTG จากผลการทดลองแสดงใหเหนวา ไมพบ TRIM21 ใน bead fraction โดย lnp, S และ B แสดงถง input, supernatant และ beads fraction ตามล าดบ

ระบบของแบคทเรยจงไมเหมาะสมตอการศกษาปฏสมพนธของโปรตนทงสองผ วจยจงเปลยนมาใช tissue culture แทน และการทดลองนเปนการทดลองทท าตอเนองจากงานวจยของ Young และคณะในป 2011 (Young et al., 2011) พบวามการเกดปฏสมพนธระหวางโปรตนทงสอง 3.3 กำรทดสอบกำรแสดงออกของโปรตนทตองกำรในระบบ Ex-vivo

3.3.1 Cell transfection เ นองจากการทดลองในแบคทเรยไมสามารถจะใหโครงสรางโปรตนหรอ

สภาพแวดลอมทเหมาะสมตอการเกดปฏสมพนธของโปรตนทงสอง จงท าการทดลองตอใน cell line เพอประสทธภาพของการน าสงพลาสมดเขาสเซลล จ าเปนตองหาปรมาณเซลลทเหมาะสมตอการใช ซงจากการทดลองเพอหาปรมาณเซลลทใชส าหรบสารน าสง LipofectamineTM2000 พบวาการเรมตนดวย 800,000 เซลลตอเพลตใหผลความหนาแนนเซลลท 90% confluent สวนปรมาณเซลลส าหรบการทดลองการใช LT1 ตองการความหนาแนนท 50-60% จงเรมตนเพลตเซลลทปรมาณ 400,000 เซลล บนเพลตขนาด 6 cm

75

3.3.2 กำรแสดงออกของ FADD และ TRIM21 ใน HEK293Tcells เนองจาการทดลองนสงเคราะหโปรตนจาก human cell line ทมเพยงเยอหมเซลล

เทานนจงตองใชความระมดระวงในการท าใหเซลลแตกเพอใหไดโปรตนทมคณภาพจากไซโตซอล โดยพบวาการใช NaF รวมกบ Na3VO4 ซงท าหนาทรกษาสภาพโปรตนทถกฟอสโฟรเลชน และ cell lysate ใน lysis buffer มผลใหการแสดงผลของโปรตนใน cell lysate ดขน (รปท 3.16 แถวท 7-12) เมอเทยบกบชดการทดลองทไมมการเตมสารทงสองชนด (รปท 3.16 แถวท 1-6) ซงผลการแสดงออกของโปรตนทงสองเมอน ามาทดสอบคณสมบตการละลายหรอต าแหนงของโปรตนภายในเซลล (localization) พบวา TRIM21 สวนใหญอยใน fraction ของ supernatant หรออยในรปทละลายน าได สวน FADD สวนใหญอยใน pellet หรออยในรปทไมละลายน า

รปท 3.16 ภาพแสดงผลการสงเคราะหโปรตน FADD และ TRIM21 ในเซลล

เรมตนขนาด 500,000 และ 900,000 เซลล ซงหากในบฟเฟอรม NaF+ Na3VO4 (แถวท 7-12) สจะเขมกวาโดยเฉพาะทเพมการแสดงออกได 3.4 กำรตรวจสอบปฏสมพนธของ FADD และ TRIM21 จำก HEK293Tcells

3.4.1 GST pull down assay ท าการเลยงเซลล HEK293T cell เพอการศกษาการเกดปฏสมพนธระหวาง

โปรตน FADD และ TRIM21 โดยการท า transfection เพอสรางรคอมบแนนทโปรตน hFADDHisFlag, GSThTRIM21, GSThTRIM21Δ1(275-475), GSThTRIM21Δ2(287-475), GSThTRIM21Δ3(131-475) เนองจาก GST protein tag มขนาด 25 KDa ท าใหฟวชนโปรตนทสงเคราะหไดมขนาดโมเลกลเพมขนโดยประมาณเปน 75, 46 และ 50 KDa ตามล าดบ จากนนท าใหเซลลแตกและน าสวนของสารละลายเซลลมาบมดวย Glutathione Sepharosetm 4B (GE healthcare) วยบฟเฟอร เพอท า glutathione S-transferase (GST) pull down assay ตามวธการทดลองท 2.5.7 และตรวจสอบผลดวย Western blot (รปท 3.17) จากการทดลอง

76

พบวาการใชรคอมบแนนทโปรตนทผลตไดจาก HEK293T cells ซงเปนแหลงของโปรตนทใชในการทดลองของ Young และคณะ (Young et al., 2011) กยงคงไมพบการเกดปฏสมพนธ เนองจากไมพบแถบโปรตนของ hFADDHisFlag รป 3.17 แถวท 13, 14 และ 15 ตามล าดบ ซงยงไมทราบสาเหตทแนชด แตอาจเปนเพราะขนาดของ tag ทใหญ ซงอาจมผลตอการสรางปฏสมพนธระหวางโปรตน ดงนนผวจยจงเปลยน GST tag เปน Strep-Tactin tag และท า pull down assay

รปท 3.17 GSThTRIM21 ไมสามารถเกดปฏสมพนธกบ hFADDHisFlag ผลการท า glutathione S-transferase (GST) pull down assay ระหวาง hFADDHisFlag และ GSThTRIM21 ทขนาดตางๆ กน จากผลการทดลองแสดงใหเหนวาแมจะเปนการใชโปรตนทไดจาก human cell line กไมสามารถสงเสรมใหเกดปฏสมพนธไดโดยท 1-6 แสดงชดการทดลองของ lysates สวนแถวท 10-15 เปน lysate ทผานการท า pull down assay

3.4.2 Strep-tactin pull down assay เนองจากผลการทดลองดวยการใช GST pull down ไมประสบผลส าเรจจงท าการ

ทดลองขนตอไปดวยการสรางรคอมบแนนทโปรตนโดยการใช Strep tag protein (WSHPQFEK) แทนเนองจาก Strep-Tag II มขนาดเลกไมมผลตอการพบมวนของโปรตนตามธรรมชาต โดยการสรางรคอมบแนนทโปรตน hFADDSTR เพอทดสอบปฏสมพนธตอ GSThTRIM21 นอกจากนยงสรางรคอมบแนนท untagged hTRIM21 เพอทดสอบปฏสมพนธกบ hFADDSTR เพอเปรยบเทยบผลของการมหรอไมม GST tag ซงกระบวนการทดลองไดบมชดทดลอง STR beads[hFADDSTR+GSThTRIM21] และ STR beads[hFADDSTR+GSThTRIM21] ผลจาก Western blot หลงจากผานการ pull down ดงรปท 3.18 พบวาในคอลมนของ STR beads พบ

77

เพยงรคอมบแนนทโปรตน hFADDSTR เทานน แสดงถงการท hFADDSTRไมสามารถเกดปฏสมพนธไดทง GSThTRIM21 และ hTRIM21TRIM21

รปท 3.18 ทง GSThTRIM21 และ hTRIM21 ไมสามารถเกดปฏสมพนธกบ

hFADDSTR ได ภาพ Western blot แสดงผลการท า Strep-Tactin pull down assay ระหวาง hFADDSTR(wt) และ GSThTRIM21/hTRIM21(wt) จาก HEK293T cell พบวา hFADD protein เสนเตมและอยในรป wt ไมสามารถเกดปฏสมพนธกบทง GSThTRM21และ hTRIM21 ได เนองจากพบเพยง hFADD(wt) protein ใน beads fraction เทานน (แถวท 10-12) โดยท 1-6 แสดงชดการทดลองของ lysates สวนแถวท 7-12 เปน lysate ทผานการท า pull down assay

3.4.3 Coimmunoprecipitation จากการทดลองเพอศกษาการเกดปฏสมพนธระหวางโปรตน FADD และ TRIM21

ดวยการท า pull down assay ของโปรตนทผลตทงในแบคทเรยและ mammalian cell line ไมพบปฏสมพนธระหวางโปรตนทงสอง FADD และ TRIM21 ผวจยจงท าการศกษาปฏสมพนธดวยการท า Co-immunoprecipitaion ดวยการสรางพลาสมดเพอการผลตรคอมบแนนทโปรตน hFADDHisSTR และ HAhTRIM21 ขนาดตางๆ และน าเขาส HEK293T cell จากนนน าสารละลายเซลลมาบมรวมกบ anti-Flag tag M2 antibody เพอใชในการจบกบ hFADD protein ซงจะเปน bait แทนการท าบรสทธโปรตนแตละตวแยกกน จากผลการทดลองของ Young และคณะในป 2010 พบวา HA-tag จะจบกบ hFADDHisFlag ซง CoIP ครงนใช และเพอทดสอบวา HAhTRIM21Δ1(275-475) (B30.2 domain) ของ TRIM21 เพยงพอตอการเกดปฏสมพนธกบ

78

FADD หรอจ าเปนตองมสวนอนดวย พลาสมดจงถกสรางเพมอก คอ HAhTRIM21Δ3(131-475) ซงมสวนของ CC กบ B30.2 domain, HAhTRIM21Δ4(131-275) เปนสวนของ CC domain เทานน และ HAhTRIM21Δ5(183-475) เปนสวนทสองของ CC domain กบ B30.2 domain ดงแสดงในรปท 3.19 B ซงจากผลการทดลองพบวา ปฏสมพนธระหวางโปรตนทงสองเกดไดในสองชดการทดลอง คอ HAhTRIM21 และ HAhTRIM21Δ3 (รปท 3.19 แถวท 11 และ 13 ) ซงสงททงสองมเหมอนกนคอ CC และ B30.2 โดเมน สวนการทดลองทเหลอ ไมพบการเกดปฏสมพนธ เนองจากไมพบแถบโปรตนใน beads fraction (รปท 3.19 แถวท 13, 15 และ 16) ซงสอดคลองกบงานวจยกอนหนานของ Young และคณะ ซงผลการทดลองดงกลาว แสดงใหเหนวา B30.2 หรอ CC domain เพยงอยางเดยวนนมความจ าเปนตอการเกดปฏสมพนธแตไมเพยงพอ (แถวท 12 และ 14) ตองมควบคกนเปนสวนหนงของรคอมบแนนทโปรตนดวยจงสามารถเกดปฏสมพนธได (แถวท 13) และจ าเปนตองใช CC domain ทงโดเมน หากเปนเพยงครงโดเมน ไมเพยงพอตอการเกดปฏสมพนธได (แถวท 15)

จากรายงานการวจยกอนหนาน ไดมการศกษาถงหนาทของ CC domain ซง CC domain เกยวของกบการเกด dimerization ในโปรตนหลายๆ ตว รวมทงโปรตนในกลม TRIM family และหนงใน CC domain ทมการศกษากนมาก คอ CC domain จากโปรตน GCN4 ในยสต Saccharomyces cerevisiae เพอการศกษาหนาทของ CC ใหมากขน ผวจยไดท าการทดลองตอโดยการสราง HAyCChTRIM21Δ1 ทเกดจากการน าล าดบนวคลโอไทด Gcn4 ของยสต เขาเชอมตอกบ hTRIM21Δ1(275-475) เพอแทนท CC domain ของ TRIM21 ดวย GCN4 protein เนองจากมสมมตฐานวาการท างานของ CC นน เปน universal protein หรอไม ผลการทดลองพบวาในชดการทดลองทผาน CoIP ของ beads[HAyCChTRIM21Δ1(yCC+h275-475) ทต าแหนงโปรตนเปาหมายนนไมพบแถบโปรตนทสนใจปรากฏอย (แถวท 16) แสดงวา hFADDHisFlag ไมสามารถเกดปฏสมพนธกบ HAyCChTRIM21Δ1(yCC+h275-475) ได โดยสรปแลวระบบการทดลองใน mammalian cell เหมาะสมกบการใชศกษาปฏสมพนธระหวางโปรตนทงสอง อาจเ นองจากมโปรตนตวหนงหรอทงสองตวตองการ post-translational modification ในการท าใหปฏสมพนธนเกดได ซงจากการทดลองพบวาแค B30.2 อยางเดยวไมเพยงพอ แตตองการ coiled-coil domain ดวยเพอให B30.2 เกด dimerization ได อนจะน าไปสการสรางคอมเพลกกบ FADD

79

รปท 3.19 hFADDHisflag สามารถเกดปฏสมพนธกบ HAhTRIM21 และ

HAhTRIM21Δ3(131-475) ได ดวยการท า co-immunoprecipitation พรอมทงแสดงต าแหนงของโดเมนตาง ๆ บนโปรตนแตละเสน โดยภาพ (A) แสดงผลการแสดงออกของรคอมบแนนทโปรตนของ hTRIM21 ทขนาดตางๆ กนรวมทงไคเมอรกโปรตน HAyCChTRIM21Δ1(yCC+h275-475) และ (B) แสดงผลการท า CoIP ของ hTRIM21 จาก (A) จากผลของ Western blot พบวากบ HAhTRIM21 และ HAhTRIM21Δ3(131-475) เทานน ทสามารถเกดปฏสมพนธกบ hFADDHisFlag ได (แถวท 11 และ 13) ขณะทรคอมบแนนทโปรตนอนไมพบการเกดปฏสมพนธตอกน รวมทง HAyCChTRIM21Δ1(yCC+h275-475) ซงเปนไคเมอรกโปรตนทไดจากGCN4 ของยสต สวน (C) และ (D) แสดงผลของการแสดงออกของ hFADDHisFlag และผลทไดหลงการท า CoIP ของการท า ระหวาง FADD และ TRIM21 ทขนาดตางๆ กน โดยทแผนภม (E) แสดงขนาดของ hTRIM21 protein ทใชในการทดลองในครงนทงหมด แตผลการทดลองระหวาง HAyCChTRIM21Δ1 (yCC+h275-475) ซงเปน chimeric protein ทม CC domain จากยสต ไม

A B

C D

E

80

สามารถเกดปฏสมพนธกบ recombinant hFADDHisFlag protein เชนกน โดยท 1-8 แสดงชดการทดลองของ lysates สวนแถวท 9-16 เปน lysate ทผานการท า pull down assay

81

บทท 4 วเครำะหผลกำรทดลอง

4.1 กำรตรวจสอบปฏสมพนธของรคอมบแนนทโปรตน hFADD และ

hTRIM21 ทผลตในแบคทเรย เ นองจากการเตรยมโปรตนจากแหลงธรรมชาตบางชนดนนท าไ ดยาก

กระบวนการสรางรคอมบแนนทโปรตนจงถกน ามาใชในการแกปญหาน การใช E.coli ซงม พลาสมดทใชดวยกนไดมาก แตกยงมโปรตนบางอยางทไมสามารถผลตไดหรอนอยมาก จงจ าเปนตองมการปรบปรงอกหลายอยางเพอประสทธภาพของการผลต ไมวาจะเปนการเลอกสายพนธทเหมาะสม ความเสถยรของ mRNA codon bias การเกดและปองกน inclusion body การยอยสลาย การตด หรอการผลตรวมกน ส าหรบการทดลองผวจยไดปรบปรงการสรางรคอมบแนนทโปรตนหลายวธ เชน การลดอณหภมการเลยงเซลลแบคทเรยลงมาท 20๐C การใช tag ซงชวยในการละลายของโปรตนได และท าใหการท าบรสทธของโปรตนดขนดวยการใช affinity column กระบวนการเพมความเครยดตอเซลลเปนอกหนงวธการทนยมใชในการปรบปรงการสงเคราะหโปรตน ในการทดลองนผ วจยไดใชการเลยงใน soluble protein media (SPM) ทมการเตม sorbitol และ betaine การสรางสภาวะเครยดนจงสอดคลองกบการทดลองทท าการสงเคราะหโปรตนรวมกบโปรตนพเลยง chaperone โดยระบบนถกสรางขนเพอเลยนแบบกระบวนการในธรรมชาตเมอตองมการสรางโปรตนในภาวะวกฤตตาง ๆ เชน ความรอน ความเยน ความเปนกรด-ดาง เกลอ โดยสรปแลวหนาทของโปรตนพเลยงคอการปองกนการเกาะกลมของโปรตน และมบางชนดทมหนาทเฉพาะเพอชวยคลายโปรตนจากการเกาะกลมและชวยในการมวนพบโปรตนคนกลบ เชน GroES และ GroEL สวน tag protein ไมนาจะมสวนเกยวของกบการเกดหรอไมเกดปฏสมพนธเนองจากมขนาดเลกมากน าหนกโมเลกลนอย

จากทกลาวมาแลวขางตนวาการทดลองนท าขนเนองจากความสนใจในการเกดปฏสมพนธระหวางรคอมบแนนทโปรตน hFADD และ hTRIM21 ทผลตขนในแบคทเรย โดยเรมตน

ดวยการศกษาปฏสมพนธระหวาง hFADD1HisSTRx2(F25Y) ซงเปน DED domain กบ

HishTRIM212(287-475) ทเปนสวนของ B30.2 domain และปฏสมพนธระหวาง

hFADD1HisSTRx2(F25Y) กบ HishTRIM211(275-475) ทงสองการทดลองไมพบการเกดปฏสมพนธระหวางชนสวนของโปรตนทงสอง ดงนนผวจยจงเลอกใชรคอมบแนนทโปรตนเสนเตม

hFADDHisSTR เพอทดสอบปฏสมพนธทมตอ HishTRIM211(275-475) ทผลตทงระบบทม

82

และไมมโปรตนพเลยง (chaperone protein) รวมทงท าการทดสอบจากรคอมบแนนทโปรตนทผานการท าบรสทธและ cell supernatant อกทงยงไดท าการตรวจสอบความถกตองเพอตรวจหาสญญาณทอาจมอยเพยงเลกนอยดวย Western blot analysis แตไมพบการเกดปฏสมพนธเชนเดยวกน ผ วจยจงทดสอบตอดวยการใช co-expression transformation เพอท าใหรคอมบแนนทโปรตนทงสองถกผลตขนภายในเซลลเจาบานเดยวกน ผลการทดลองทไดนน ไมพบการเกดปฏสมพนธระหวางโปรตนทงสอง ในล าดบสดทายของการทดลองดวยแบคทเรยผ วจยไดทดสอบการเกดปฏสมพนธดวยรคอมบแนนทโปรตน hFADDHisSTR และ HishTRIM21 ผลการทดลองพบวารคอมบแนนทโปรตนทงสองไมสามารถเกดปฏสมพนธระหวางกนได ซงจากผลการทดลองทงหมดจะเหนไดวาการสงเคราะหรคอมบแนนทโปรตนทงสองในแบคทเรยไมสามารถกอใหเกดปฏสมพนธตอกนได ถงแมผวจยจะท าการปรบปรงการแสดงออกดวยวธการตางๆ แลวกตาม จากการทดลองทผานมาแลวอาจกลาวไดวา bacterial system ไมสามารถผลต hFADD และ hTRIM21 ทม activity เหมาะสมตอการเกดปฏสมพนธของโปรตนทงสองได การเกดปฏสมพนธอาจตองม post-translational modification เนองจากการทดลองใน tissue culture พบวา โปรตนทงสองเกดปฏสมพนธกนได (Young et al., 2011) แตในแบคทเรยเซลลไมมกระบวนการน 4.2 กำรตรวจสอบปฏสมพนธของ FADD และ TRIM21 ทผลตใน HEK293Tcells

จากผลการทดลองตามขอ 3.4.1 และ 3.4.2 ซงเปนการท า GST และ Strep-tactin pull down assay ซงทงสองการทดลองไมพบการเกดปฏสมพนธระหวางโปรตนทงสองชนด อาจเนองเพราะ GST tag protein มขนาดใหญถง 25 KDa ท าใหรคอมบแนนทโปรตน GSThTRIM21 มขนาดประมาณ 75 KDa นน ขนาดใหญทเกนไปจนอาจไปมผลกระทบตอการพบมวนของโปรตน hTRIM21 ตามธรรมชาต ท าใหเกดการเปลยน conformation ทอาจบดบง binding site หรอท าให binding site ทงสองไมสามารถสมผสกนได ในขณะทมการทดลองของ Yang และคณะ 2009 พบวา TRIM211 สามารถจบกบ IRF3 (IFN regulatory factor 3) ผานการท า GST pull down assay (Yang et al., 2009) แตอยางไรกตามผวจย ไมสามารถท าการทดลองเพอยนยนผลดงกลาวได และสาเหตกไมเปนทแนชด ในขณะท Strep-Tactin pull down กไมสามารถแสดงปฏสมพนธระหวาง FADD และ TRIM21 ได ดงนนผวจยจงสรปวาไมสามารถท า pull down assay ได ถงแมอาจมการเกดปฏสมพนธภายในเซลล (Young et al., 2011) อาจเปนผลจากสภาวะภายนอกทเปลยนไปมผลตอปฏสมพนธทเกดขนแลวภายในเซลล หรออาจมเหตผลอนใดทอาจตองตรวจสอบ และเพอยนยนระบบการทดลองจงท า Co-immunoprecipitation ซงดวยวธการน มการยนยนผลการเกดปฏสมพนธระหวางโปรตนทงสองไวแลว (Young et al.,

83

2011) ซงในเบองตนผวจยสามารถใชเทคนค co-immunoprecipitation ในการแสดงปฏสมพนธระหวาง FADD และ TRIM21 ได (ไมแสดงผล)

FADD อาศย Death-effector domain ในการสรางปฏสมพนธกบ TRIM21 (Young et al., 2011) และโดเมนดงกลาวของ FADD จ าเปนและเพยงพอตอปฏสมพนธน แตรายงานของ Young และคณะ ยงไมชดเจนวา DED ของ FADD สรางปฏสมพนธอยางไรกบ TRIM21 ถงแม D74A FADD สามารถมผลตอ TRIM21 self ubiquitination แต D74A FADD ยงมปฏสมพนธตอ TRIM21 ทดอยกวา wild type FADD (Young et al., 2011) ดงนนการคนหาต าแหนงบน DED ของ FADD ทจ าเปนตอการเกดปฏสมพนธกบ TRIM21 จงเปนงานในอนาคตทนาศกษาตอไป

ในสวนของ TRIM21 เปนททราบกนดวาสวนของ B30.2 domain เปนสวนทจ าเปนตอการเกดปฏสมพนธกบ FADD แตยงไมเปนทแนชดวา โดเมนดงกลาวเพยงพอตอการเกดปฏสมพนธกบ FADD หรอไม ซงในการศกษาน เปนครงแรกทแสดงใหเหนวา B30.2 domain อยางเดยวไมเพยงพอตอการสรางปฏสมพนธดงกลาว ดงรปท 3.19 แถวท 12 (Waji et al., 2012) การท TRIM21 จะเกดปฏสมพนธกบ FADD ไดนนตองอาศย coiled-coil domain (รปท 3.19 แถวท 13)

จากผลการทดลองในรปท 3.19 แถวท 16 ซงผ วจยไดท าการสงเคราะหรคอมบแนนทโปรตน HAyCChTRIM21Δ1(yCC+h275-475) ซงไมพบการเกดปฏสมพนธของโปรตนน ทมตอ hFADDHisFlag ขอมลทไดจากผลการทดลองนยงไมสามารถตอบขอสงสยทวา โปร ตนม conformation ทถก ตองห รอไม การทดลองน จ งควร มการทดสอบว า HAyCChTRIM21Δ1(yCC+h275-475) สามารถสราง dimer กบ TRIM21 CC domain สงเสรมใหเกด dimer ใน TRIM21 และอาจจะไมเกยวของกบการเกดปฏสมพนธโดยตรง(Yang et al., 2009) แตอาจมสวนในการคงรปโครงสรางของโปรตน สงเสรมใหเกดการรวมตวเปนโมเลกลทใหญขน เชน การสะสมในไซโตพลาสเปน cytoplasmic body การสราง homodimer (Javanbakht et al., 2006) แตถาตด CC domain ออกจะไมม self-association เพราะพบ monomer ใน gel filtration การตดโดเมนอนท าใหปฏสมพนธทเกดจะลดลงบาง การเกดปฏสมพนธระหวางโปรตนอาจเปนหนาทของ B30.2 domain มการตงสมมตฐานวา CC จ าเปนตอการเกดปฏสมพนธในการ recruit โปรตนอนมาจบกบ B30.2 domain (Li et al., 1994; Reymond et al., 2001.)

จากการทดลองของ Rhodes และคณะในป 2002 พบวา รปราง CC ทไดเปน short rod-like structures วางตวอยใตพลาสมาเมมเบรน สวน B-box นาจะชวยในการคงความ

84

เสถยร (Rhodes & Trowsdale, 2007) CC domain มโครงสรางทตยภมแบบ left hand helix โดยม Leucine zipper ทต าแหนง 211-232 มกรดอะมโนลซน 4 ตว มความเปน Hydrophobic ทท าให helix คงรปได ขางในเกลยวเปน hydrophobic ทมรอบนอกเปน polar ทสมผสกบสงแวดลอมหรอน าดวย electrostatic interaction โครงสราง CC เปนไปตามรปขางลางน มความเปนไปไดวาอาจมการขดพบ (รปท 4.1)

รปท 4.1 ภาพแสดงโครงสรางทตยภมของ CC domain ทมลกษณะความเปน α-helix 2 ชวงทคนดวยต าแหนง167-180 ทมคณสมบตความเปนเกลยวนอย (Ottosson et al., 2006)

จากผลการทดลอง แสดงใหเหนวาปฏสมพนธนจ าเปนตองม B30.2 ซง B30.2 หรอ PRY-SPY domain เปนโดเมนทางปลายคารบอกซลกทมอยครงหนงในกลมของ TRIM family protein ซงท าหนาทในการเกดปฏสมพนธ และไมเกยวของกบการเกด dimer แต B30.2 นาจะเปนสวนส าคญทใชในการสรางปฏสมพนธกบโปรตนอน เชน ในการจบ IgG เชน B30.2 ของ FMF/TRIM20 จบกบ caspase 1 เพอควบคมการสราง IL-B1, (Chae et al., 2006) B30.2 ของ TRIM25 จบ RIG1 (Gack et al., 2007) และ B30.2 ของ TRIM21 จ าเปนและเพยงพอตอการจบกบ IRF3 และ hIgG (Keeble et al., 2008; Rhodes &Trowsdale, 2007) TRIM5 B30.2 จบ HIV capsid สดทาย PRY-SPY หรอ B20.2 จบโดยตรงกบแคปซดของเรโทรไวรส นอกจากนการทดลองของ Ottosson (Ottosson et al., 2006) กลาววา ต าแหนงของ B30.2 เพยงอยางเดยวนนสลายไดโดยงายทงในระหวางการสงเคราะหโปรตนในเซลลเจาบานหรอการคนกลบการพบมวน มรายงานการวจยหลายชนทแสดงวา การเกดปฏสมพนธนนตองอาศย B30.2 domain ตามสมมตฐานหลายขอ เชน มการศกษาวาใน TRIM21 นนถาตดตวใดตวหนงใน RBCC ออก แตม B30.2 domain จะยงคงรกษาความสามารถในการเตมฟอสเฟต ซงนาจะเปนสาเหตใหการเกดปฏสมพนธคงอย แตหากตด B30.2 domain ไมพบการเกดปฏสมพนธ เนองจากไมมการเตมฟอสเฟต ซงมกรดอะมโนไทโรซน 3 ต าแหนงทส าคญ โดย Y393 เมอเปลยนกรดอะมโนท าใหไมสามารถเกดการเตมฟอสเฟต สงผลใหไมมปฏสมพนธกบ IRF3 หากเปลยนทต าแหนง 343,388 ยงคงรกษาคณสมบตการเกดปฏสมพนธได (Stacey et al., 2012) สวน Yang และคณะกลาววาสวนของกรดอะมโน 250-380 ซงต าแหนงเหลานครอบคลมอยภายใต hTRIM21Δ3(131-475)

85

และ hTRIM21Δ1 นาจะเปนจดทใชในการเกดปฏสมพนธ มรายงานวาโครงสรางของ B30.2 เปน β-sandwich ทเกดจาก β-sheet ทวางตวในลกษณะตรงขามกน (anti-parallel) และมกรดอะมโนตางๆ กนซงนาจะเปนต าแหนงทใชในการจบกนอยางจ าเพาะกบโปรตนหนงๆ ความสมพนธระหวาง A กบ B นน เกดจาก interaction แบบ Hydrophobic โดย helix ท าหนาทเปนโครงสรางเพอสรางความเสถยรของรปรางมมโคงของ β-sandwich โดย helix α2 interact กบสวนปลายของ β-sandwich ชวงระหวาง 2 β-sheet จะเปน consensus sequence ของ hydrophobic of GUSTAVAS ซงคลายกบ tertiary structure ของ B30.2 ซง GUSTAVAS (CG2944-PF) เปนหนงในกลมของโปรตน ทพบใน Drosophila melanogaster ทม B30.2 domain เปนสวนประกอบ โดยม B30.2 domain อยตรงกลางทมปลาย N เปนกรดอะมโนประมาณ 40 residue และปลาย C เปน SOCS box ทเปนกรดอะมโนประมาณ 50 residue (Stacey et al., 2012; Woo et al., 2006)

รปท 4.2 ภาพแสดงโครงสรางของ B30.2 จาก GUSTAVAS ซงมล าดบโปรตนบางสวนทเหมอนกบ B30.2 รวมกบ SOCS box ทางปลายคารบอกซลก (Park et al., 2010; Woo et al., 2006)

ในการทดลองของ Javanbakht และคณะ พบวา CC domain จาก TRIM5α อยางเดยวไมเกดการสรางเปน oligomer เหมอน TRIM อนๆ และพบวาตวเชอมระหวาง CC กบ B30.2 มความจ าเปนส าหรบ trimer ใน TRIM5α ซงโครงสรางของ CC เหมอนกนหมด โดยมการเรยงตวแบบ abcdefg ทต าแหนง a และ d เปลยนแลวมผลท าใหการเกด trimer ลดลง ม 3 จด คอกรด อะมโนต าแหนงท 137, 202, และ 223 พบวาเมอเปลยน 202 มผลกระทบตอปฏสมพนธอยางมาก (Javanbakht et al., 2006) ทง hTRIM21 และ hTRIM5α นาจะใกลชดกนมาก เพราะการแทนทระหวางกนกใหผลการเกดปฏสมพนธสง (Li et al., 2006) และยนอยบนโครโมโซมคท 11 ทงค มตงสมมตฐานถงลกษณะการเกด conformation ของ rHTRIM5α ในการเกดปฏสมพนธกบ HIV capsid โดยการเกาะเกยวกนเปนรางแห ซงการเรยงตวนแบบน อาจเปนเหตผลทตองม CC domain ในโมเลกลโปรตนเพอใหการพบมวนของโปรตนถกตอง คอ CC เปน helix backbone

86

เพอให B30.2 อยในต าแหนงทจบกบซบสเตรทได รปท 4.3 (Biris et al., 2012) และอาจใชเปนเหตผลของความจ าเปนในการมของ CC domain ตอการเกดปฏสมพนธของ hTRIM21 ไดเชนกน

รปท 4.3 ภาพแสดงโครงสรางการเรยงตวของ rhTRIM5α ระหวางการเกดปฏสมพนธกบ HIV capsid (Biris et al., 2012)

ดงนนผลงานวจยชนนเปนการศกษา และหาต าแหนงของการเกดปฏสมพนธระหวาง hFADDHisFlag และ HishTRIM21 โดยสรปแลวระบบการทดลองใน mammalian cell เหมาะสมกบการใชศกษาปฏสมพนธระหวางโปรตนทงสอง อาจเนองจากมโปรตนตวหนงหรอทงสองตวตองการ post-translation modification ในการท าใหปฏสมพนธนเกดได ซงจากการทดลองพบวาแค B30.2 อยางเดยวไมเพยงพอ แตตองการ coiled-coil domain ดวยเพอให B30.2 เกด dimerization ได อนจะน าไปสการสรางคอมเพลกเพอใหกระบวนการเกดปฏสมพนธน สมบรณ

87

บทท 5

สรปผลกำรทดลอง

จากการทดลองสรปไดวา 1. ในการวเคราะหปฏสมพนธระหวางโปรตนทงสอง พบวา การทดสอบใน

เซลลแบคทเรยไมสามารถแสดงการเกดปฏสมพนธของรคอมบแนนทโปรตน FADD และ TRIM21 ได ในขณะทการทดสอบปฏสมพนธโดยใช tissue culture system ดวยเทคนค co-immunoprecipitation สามารถแสดงการเกดปฏสมพนธระหวางรคอมบแนนทโปรตน FADD และ TRIM21 ได

2. พบปฏสมพนธระหวาง FADD กบ full length TRIM21 และ FADD กบ TRIM21∆3 (275-475) ในขณะท hTRIM21∆1 ไมสามารถสรางปฏสมพนธกบ hFADD ไดดงนน B30.2 domain จ าเปนแตไมเพยงพอตอการเกดปฏสมพนธกบโปรตน hFADD

รายการเอกสารอางอง

Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., & Lamont, I. L. 2003. Substrate Specificity of the Nonribosomal Peptide Synthetase PvdD from Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology, 185(9): 2848-2855.

Adachi, M., Suematsu, S., Kondo, T., Ogasawara, J., Tanaka, T., Yoshida, N., & Nagata, S. 1995. Targeted mutation in the Fas gene causes hyperplasia in peripheral lymphoid organs and liver. Nat Genet, 11: 294 - 300.

Alappat, E. C., Feig, C., Boyerinas, B., Volkland, J., Samuels, M., Murmann, A. E., Thorburn, A., Kidd, V. J., Slaughter, C. A., Osborn, S. L., Winoto, A., Tang, W.-J., & Peter, M. E. 2005. Phosphorylation of FADD at Serine 194 by CKIα Regulates Its Nonapoptotic Activities. Molecular Cell, 19(3): 321-332.

Alappat, E. C., Volkland, J., & Peter, M. E. 2003. Cell Cycle Effects by C-FADD Depend on Its C-terminal Phosphorylation Site. Journal of Biological Chemistry, 278(43): 41585-41588.

Balachandran, S., Thomas, E., & Barber, G. N. 2004. A FADD-dependent innate immune mechanism in mammalian cells. Nature, 432(7015): 401-405.

Balachandran, S., Venkataraman, T., Fisher, P. B., & Barber, G. N. 2007. Fas-Associated Death Domain-Containing Protein-Mediated Antiviral Innate Immune Signaling Involves the Regulation of Irf7. The Journal of Immunology, 178(4): 2429-2439.

Beisner, D. R., Ch’en, I. L., Kolla, R. V., Hoffmann, A., & Hedrick, S. M. 2005. Cutting Edge: Innate Immunity Conferred by B Cells Is Regulated by Caspase-8. The Journal of Immunology, 175(6): 3469-3473.

Berghe, T. V., van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., Brouckaert, G., Kalai, M., Declercq, W., & Vandenabeele, P. 2004. Differential Signaling to Apoptotic and Necrotic Cell Death by Fas-associated Death Domain Protein FADD. Journal of Biological Chemistry, 279(9): 7925-7933.

Berglund, H., Olerenshaw, D., Sankar, A., Federwisch, M., McDonald, N. Q., & Driscoll, P. C. 2000. The three-dimensional solution structure and dynamic properties of the human FADD death domain. Journal of Molecular Biology, 302(1): 171-188.

Biris, N., Yang, Y., Taylor, A. B., Tomashevski, A., Guo, M., Hart, P. J., Diaz-Griffero, F., & Ivanov, D. N. 2012. Structure of the rhesus monkey TRIM5α PRYSPRY domain, the HIV capsid recognition module. Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(33): 13278-13283.

Boldin, M. P., Varfolomeev, E. E., Pancer, Z., Mett, I. L., Camonis, J. H., & Wallach, D. 1995. A Novel Protein That Interacts with the Death Domain of Fas/APO1 Contains a Sequence Motif Related to the Death Domain. Journal of Biological Chemistry, 270(14): 7795-7798.

Carrington, P. E., Sandu, C., Wei, Y., Hill, J. M., Morisawa, G., Huang, T., Gavathiotis, E., Wei, Y., & Werner, M. H. 2006. The Structure of FADD and Its Mode of Interaction with Procaspase-8. Molecular Cell, 22(5): 599-610.

Chae, J. J., Wood, G., Masters, S. L., Richard, K., Park, G., Smith, B. J., & Kastner, D. L. 2006. The B30.2 domain of pyrin, the familial Mediterranean fever protein, interacts directly with caspase-1 to modulate IL-1β production. Proceedings of the National Academy of Sciences, 103(26): 9982-9987.

Chan, E. K., Di Donato, F., Hamel, J. C., Tseng, C. E., & Buyon, J. P. 1995. 52-kD SS-A/Ro: genomic structure and identification of an alternatively spliced transcript encoding a novel leucine zipper-minus autoantigen expressed in fetal and adult heart. The Journal of Experimental Medicine, 182(4): 983-992.

Chan, E. K., Hamel, J. C., Buyon, J. P., & Tan, E. M. 1991. Molecular definition and sequence motifs of the 52-kD component of human SS-A/Ro autoantigen. The Journal of Clinical Investigation, 87(1): 68-76.

Chinnaiyan, A. M., O'Rourke, K., Tewari, M., & Dixit, V. M. 1995. FADD, a novel death domain-containing protein, interacts with the death domain of fas and initiates apoptosis. Cell, 81(4): 505-512.

Chinnaiyan, A. M., Tepper, C. G., Seldin, M. F., O'Rourke, K., Kischkel, F. C., Hellbardt, S., Krammer, P. H., Peter, M. E., & Dixit, V. M. 1996. FADD/MORT1 Is a Common Mediator of CD95 (Fas/APO-1) and Tumor Necrosis Factor Receptor-induced Apoptosis. Journal of Biological Chemistry, 271(9): 4961-4965.

Cooper, D. M., Chamberlain, C. M., & Lowenberger, C. 2009. Aedes FADD: A novel death domain-containing protein required for antibacterial immunity in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 39(1): 47-54.

Diaz, A. A., Tomba, E., Lennarson, R., Richard, R., Bagajewicz, M. J., & Harrison, R. G. 2010. Prediction of protein solubility in Escherichia coli using logistic regression. Biotechnology and Bioengineering, 105(2): 374-383.

Dzivenu, O. K., Park, H. H., & Wu, H. 2004. General co-expression vectors for the overexpression of heterodimeric protein complexes in Escherichia coli. Protein Expression and Purification, 38(1): 1-8.

Eberstadt, M., Huang, B., Chen, Z., Meadows, R. P., Ng, S.-C., Zheng, L., Lenardo, M. J., & Fesik, S. W. 1998. NMR structure and mutagenesis of the FADD (Mort1) death-effector domain. Nature, 392(6679): 941-945.

Espinosa, A., Dardalhon, V., Brauner, S., Ambrosi, A., Higgs, R., Quintana, F. J., Sjöstrand, M., Eloranta, M.-L., Ní Gabhann, J., Winqvist, O., Sundelin, B., Jefferies, C. A., Rozell, B., Kuchroo, V. K., & Wahren-Herlenius, M. 2009. Loss of the lupus autoantigen Ro52/TRIM21 induces tissue inflammation and systemic autoimmunity by disregulating the IL-23–Th17 pathway. The Journal of Experimental Medicine, 206(8): 1661-1671.

Espinosa, A., Oke, V., Elfving, Å., Nyberg, F., Covacu, R., & Wahren-Herlenius, M. 2008. The autoantigen Ro52 is an E3 ligase resident in the cytoplasm but enters the nucleus upon cellular exposure to nitric oxide. Experimental Cell Research, 314(20): 3605-3613.

Espinosa, A., Zhou, W., Ek, M., Hedlund, M., Brauner, S., Popovic, K., Horvath, L., Wallerskog, T., Oukka, M., Nyberg, F., Kuchroo, V. K., & Wahren-Herlenius, M. 2006. The Sjögren’s Syndrome-Associated Autoantigen Ro52 Is an E3 Ligase That Regulates Proliferation and Cell Death. The Journal of Immunology, 176(10): 6277-6285.

Gack, M. U., Shin, Y. C., Joo, C.-H., Urano, T., Liang, C., Sun, L., Takeuchi, O., Akira, S., Chen, Z., Inoue, S., & Jung, J. U. 2007. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature, 446(7138): 916-920.

Hartmann, A., Mouatt–Prigent, A., Faucheux, B. A., Agid, Y., & Hirsch, E. C. 2002. FADD: A link between TNF family receptors and caspases in Parkinson’s disease. Neurology, 58(2): 308-310.

Higgs, R., Gabhann, J. N., Larbi, N. B., Breen, E. P., Fitzgerald, K. A., & Jefferies, C. A. 2008. The E3 Ubiquitin Ligase Ro52 Negatively Regulates IFN-β Production Post-Pathogen Recognition by Polyubiquitin-Mediated Degradation of IRF3. The Journal of Immunology, 181(3): 1780-1786.

Ho, C. C.-Y., Rideout, H. J., Ribe, E., Troy, C. M., & Dauer, W. T. 2009. The Parkinson Disease Protein Leucine-Rich Repeat Kinase 2 Transduces Death Signals via Fas-Associated Protein with Death Domain and Caspase-8 in a Cellular Model of Neurodegeneration. The Journal of Neuroscience, 29(4): 1011-1016.

Hope, I. A., & Struhl, K. 1985. GCN4 protein, synthesize in vitro, binds HIS3 regulatory sequences: Implications for general control of amino acid biosynthetic genes in yeast. Cell, 43(1): 177-188.

Hua, Z. C., Sohn, S. J., Kang, C., Cado, D., & Winoto, A. 2003. A Function of Fas-Associated Death Domain Protein in Cell Cycle Progression Localized to a Single Amino Acid at Its C-Terminal Region. Immunity, 18(4): 513-521.

Imtiyaz, H. Z., Rosenberg, S., Zhang, Y., Rahman, Z. S. M., Hou, Y.-J., Manser, T., & Zhang, J. 2006. The Fas-Associated Death Domain Protein Is Required in Apoptosis and TLR-Induced Proliferative Responses in B Cells. The Journal of Immunology, 176(11): 6852-6861.

Itoh, K., Itoh, Y., & Frank, M. B. 1991. Protein heterogeneity in the human Ro/SSA ribonucleoproteins. The 52- and 60-kD Ro/SSA autoantigens are encoded by separate genes. The Journal of Clinical Investigation, 87(1): 177-186.

Javanbakht, H., Yuan, W., Yeung, D. F., Song, B., Diaz-Griffero, F., Li, Y., Li, X., Stremlau, M., & Sodroski, J. 2006. Characterization of TRIM5α trimerization and

its contribution to human immunodeficiency virus capsid binding. Virology, 353(1): 234-246.

Jeong, E.-J., Bang, S., Lee, T. H., Park, Y. I., Sim, W.-S., & Kim, K.-S. 1999. The Solution Structure of FADD Death Domain: STRUCTURAL BASIS OF DEATH DOMAIN INTERACTIONS OF Fas AND FADD. Journal of Biological Chemistry, 274(23): 16337-16342.

Kabra, N. H., Kang, C., Hsing, L. C., Zhang, J., & Winoto, A. 2001. T cell-specific FADD-deficient mice: FADD is required for early T cell development. Proceedings of the National Academy of Sciences, 98(11): 6307-6312.

Kai, L., Dötsch, V., Kaldenhoff, R., & Bernhard, F. 2013. Artificial Environments for the Co-Translational Stabilization of Cell-Free Expressed Proteins. PLoS One, 8(2): e56637.

Keeble, A. H., Khan, Z., Forster, A., & James, L. C. 2008. TRIM21 is an IgG receptor that is structurally, thermodynamically, and kinetically conserved. Proceedings of the National Academy of Sciences, 105(16): 6045-6050.

Kim, P. K., Dutra, A. S., Chandrasekharappa, S. C., & Puck, J. M. 1996. Genomic structure and mapping of human FADD, an intracellular mediator of lymphocyte apoptosis. The Journal of Immunology, 157(12): 5461-5466.

Khow, O., & Suntrarachun, S. 2012. Strategies for production of active eukaryotic proteins in bacterial expression system. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 2(2): 159-162.

Li, X., Li, Y., Stremlau, M., Yuan, W., Song, B., Perron, M., & Sodroski, J. 2006. Functional Replacement of the RING, B-Box 2, and Coiled-Coil Domains of Tripartite Motif 5α (TRIM5α) by Heterologous TRIM Domains. Journal of Virology, 80(13): 6198-6206.

Li, X., Shou, W., Kloc, M., Reddy, B. A., & Etkin, L. D. 1994. The Association of Xenopus Nuclear Factor 7 with Subcellular Structures Is Dependent upon Phosphorylation and Specific Domains. Experimental Cell Research, 213(2): 473-481.

MacKenzie A., Wilson, H. L., Kiss-Toth, E., Dower, S. K., North, R.A., Surprenant, A. 2001. Rapid Secretion of Interleukin-1by Microvesicle Shedding. Immunity,8: 825–835.

McNab, F. W., Rajsbaum, R., Stoye, J. P., & O’Garra, A. 2011. Tripartite-motif proteins and innate immune regulation. Current Opinion in Immunology, 23(1): 46-56.

Meury, J., Bahloul, A., & Kohiyama, M. 1993. Impairment of nucleoid segregation and cell division at high osmolarity in a strain of Escherichia coli overproducing the chaperone DnaK. FEMS Microbiology Letters, 113(1): 93-99.

Meury, J., & Kohiyama, M. 1991. Role of heat shock protein DnaK in osmotic adaptation of Escherichia coli. Journal of Bacteriology, 173(14): 4404-4410.

Mizuno, T., Okamoto, T., Yokoi, M., Izumi, M., Kobayashi, A., Hachiya, T., Tamai, K., Inoue, T., & Hanaoka, F. 1996. Identification of the nuclear localization signal of mouse DNA primase: nuclear transport of p46 subunit is facilitated by interaction with p54 subunit. Journal of Cell Science, 109(11): 2627-2636.

Mujacic, M., Cooper, K., & Baneyx, F. 1999. Cold-inducible cloning vectors for low-temperature protein expression in Escherichia coli: application to the production of a toxic and proteolytically sensitive fusion protein. Gene, 238: 325 - 332.

Muppidi, J. R., Lobito, A. A., Ramaswamy, M., Yang, J. K., Wang, L., Wu, H., & Siegel, R. M. 2006. Homotypic FADD interactions through a conserved RXDLL motif are required for death receptor-induced apoptosis. Cell Death Differ, 13(10): 1641-1650.

Naitza, S., Rossé, C., Kappler, C., Georgel, P., Belvin, M., Gubb, D., Camonis, J., Hoffmann, J. A., & Reichhart, J.-M. 2002. The Drosophila Immune Defense against Gram-Negative Infection Requires the Death Protein dFADD. Immunity, 17(5): 575-581.

Nisole, S., Stoye, J. P., & Saib, A. 2005. TRIM family proteins: retroviral restriction and antiviral defence. Nat Rev Micro, 3(10): 799-808.

Oke, V., & Wahren-Herlenius, M. 2012. The immunobiology of Ro52 (TRIM21) in autoimmunity: A critical review. Journal of Autoimmunity, 39(1–2): 77-82.

Osborn, S. L., Diehl, G., Han, S.-J., Xue, L., Kurd, N., Hsieh, K., Cado, D., Robey, E. A., & Winoto, A. 2010. Fas-associated death domain (FADD) is a negative regulator of T-cell receptor–mediated necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 107(29): 13034-13039.

Osborn, S. L., Sohn, S. J., & Winoto, A. 2007. Constitutive Phosphorylation Mutation in Fas-associated Death Domain (FADD) Results in Early Cell Cycle Defects. Journal of Biological Chemistry, 282(31): 22786-22792.

Ottosson, L., Hennig, J., Espinosa, A., Brauner, S., Wahren-Herlenius, M., & Sunnerhagen, M. 2006. Structural, functional and immunologic characterization of folded subdomains in the Ro52 protein targeted in Sjögren's syndrome. Molecular Immunology, 43(6): 588-598.

Papoff, G., Trivieri, N., Crielesi, R., Ruberti, F., Marsilio, S., & Ruberti, G. 2010. FADD-calmodulin interaction: A novel player in cell cycle regulation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research, 1803(8): 898-911.

Park, E. Y., Kwon, O.-B., Jeong, B.-C., Yi, J.-S., Lee, C. S., Ko, Y.-G., & Song, H. K. 2010. Crystal structure of PRY-SPRY domain of human TRIM72. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 78(3): 790-795.

Pryor, K. D., & Leiting, B. 1997. High-Level Expression of Soluble Protein inEscherichia coliUsing a His6-Tag and Maltose-Binding-Protein Double-Affinity Fusion System. Protein Expression and Purification, 10(3): 309-319.

Reymond, A., Meroni, G., Fantozzi, A., Merla, G., Cairo, S., Luzi, L., Riganelli, D., Zanaria, E., Messali, S., Cainarca, S., Guffanti, A., Minucci, S., Pelicci, P. G., & Ballabio, A. 2001. The tripartite motif family identifies cell compartments. EMBO J, 20(9): 2140-2151.

Rhodes, D. A., Ihrke, G., Reinicke, A. T., Malcherek, G., Towey, M., Isenberg, D. A., & Trowsdale, J. 2002. The 52 000 MW Ro/SS-A autoantigen in Sjögren's syndrome/systemic lupus erythematosus (Ro52) is an interferon-γ inducible tripartite motif protein associated with membrane proximal structures. Immunology, 106(2): 246-256.

Rhodes, D. A., & Trowsdale, J. 2007. TRIM21 is a trimeric protein that binds IgG Fc via the B30.2 domain. Molecular Immunology, 44(9): 2406-2414.

Sandee, D., Tungpradabkul, S., Tsukio, M., Imanaka, T., & Takagi, M. 2002. Construction and high cytoplasmic expression of a tumoricidal single-chain antibody against hepatocellular carcinoma. BMC biotechnology, 2: 16.

Sandu, C., Morisawa, G., Wegorzewska, I., Huang, T., Arechiga, A. F., Hill, J. M., Kim, T., Walsh, C. M., & Werner, M. H. 2006. FADD self-association is required for stable interaction with an activated death receptor. Cell Death Differ, 13(12): 2052-2061.

Schein, C. H., & Noteborn, M. H. M. 1988. Formation of Soluble Recombinant Proteins in Escherichia Coli is Favored by Lower Growth Temperature. Nat Biotech, 6(3): 291-294.

Selleck, W. and Tan, S. Recombinant protein complex expression in E. coli. 2008. Curr Protoc Protein Sci. CHAPTER: Unit–5.21

Siegel, R. M., Martin, D. A., Zheng, L., Ng, S. Y., Bertin, J., Cohen, J., & Lenardo, M. J. 1998. Death-effector Filaments: Novel Cytoplasmic Structures that Recruit Caspases and Trigger Apoptosis. The Journal of Cell Biology, 141(5): 1243-1253.

Siegmund, D., Mauri, D., Peters, N., Juo, P., Thome, M., Reichwein, M., Blenis, J., Scheurich, P., Tschopp, J., & Wajant, H. 2001. Fas-associated Death Domain Protein (FADD) and Caspase-8 Mediate Up-regulation of c-Fos by Fas Ligand and Tumor Necrosis Factor-related Apoptosis-inducing Ligand (TRAIL) via a FLICE Inhibitory Protein (FLIP)-regulated Pathway. Journal of Biological Chemistry, 276(35): 32585-32590.

Sorensen, H., & Mortensen, K. 2005. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microbial Cell Factories, 4(1): 1.

Spencer, D. M., Belshaw, P. J., Chen, L., Ho, S. N., Randazzo, F., Crabtree, G. R., & Schreiber, S. L. 1996. Functional analysis of Fas signaling in vivo using synthetic inducers of dimerization. Current Biology, 6(7): 839-847.

Stacey, K. B., Breen, E., & Jefferies, C. A. 2012. Tyrosine Phosphorylation of the E3 Ubiquitin Ligase TRIM21 Positively Regulates Interaction with IRF3 and Hence TRIM21 Activity. PLoS ONE, 7(3): e34041.

Steward, A., McDowell, G. S., & Clarke, J. 2009. Topology is the Principal Determinant in the Folding of a Complex All-alpha Greek Key Death Domain from Human FADD. Journal of Molecular Biology, 389(2): 425-437.

Stremlau, M., Owens, C. M., Perron, M. J., Kiessling, M., Autissier, P., & Sodroski, J. 2004. The cytoplasmic body component TRIM5[alpha] restricts HIV-1 infection in Old World monkeys. Nature, 427(6977): 848-853.

Swartz, J. R. 2001. Advances in Escherichia coli production of therapeutic proteins. Current Opinion in Biotechnology, 12(2): 195-201.

Tourneur, L., Buzyn, A., & Chiocchia, G. 2005. FADD adaptor in cancer. Medical Immunology, 4(1): 1.

Tourneur, L., & Chiocchia, G. 2010. FADD: a regulator of life and death. Trends in Immunology, 31(7): 260-269.

Tourneur, L., Mistou, S., Michiels, F., Devauchelle, V., Renia, L., Feunteun, J., & Chiocchia, G. 2003. Loss of FADD protein expression results in a biased Fas-signaling pathway and correlates with the development of tumoral status in thyroid follicular cells. Oncogene, 22: 2795 - 2804.

Tourneur, L., Mistou, S., Schmitt, A., & Chiocchia, G. 2008. Adenosine Receptors Control a New Pathway of Fas-associated Death Domain Protein Expression Regulation by Secretion. Journal of Biological Chemistry, 283(26): 17929-17938.

Waji, N., Sermwittayawong, D., Hutadilok-Towatana, N. 2011. For the 3rd BMB International Conference: From Basic to Translational Research For a Better Life. April 6-8 2011 at The Empress Convention Center, Chiang Mai, Thailand.

Waji, N., Sermwittayawong, D., Hutadilok-Towatana, N. 2012. Characterization of the Interaction between Fas-Associate Death Domain (FADD) and Tripatite Motif-Containing 21 (TRIM21) Proteins. October 17-19 2012 at The Empress Convention Center, Chiang Mai, Thailand.

Wilson, N. S., Dixit, V., & Ashkenazi, A. 2009. Death receptor signal transducers: nodes of coordination in immune signaling networks. Nat Immunol, 10(4): 348-355.

Woo, J.-S., Imm, J.-H., Min, C.-K., Kim, K.-J., Cha, S.-S., & Oh, B.-H. 2006. Structural and functional insights into the B30.2/SPRY domain. EMBO J, 25(6): 1353-1363.

Yoshimi, R., Chang, T.-H., Wang, H., Atsumi, T., Morse, H. C., & Ozato, K. 2009. Gene Disruption Study Reveals a Nonredundant Role for TRIM21/Ro52 in NF-κB-Dependent Cytokine Expression in Fibroblasts. The Journal of Immunology, 182(12): 7527-7538.

Yang, K., Shi, H.-X., Liu, X.-Y., Shan, Y.-F., Wei, B., Chen, S., & Wang, C. 2009. TRIM21 Is Essential to Sustain IFN Regulatory Factor 3 Activation during Antiviral Response. The Journal of Immunology, 182(6): 3782-3792.

Young, J. A., Sermwittayawong, D., Kim, H. J., Nandu, S., An, N., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Coscoy, L., & Winoto, A. 2011. Fas-associated death domain (FADD) and the E3 ubiquitin-protein ligase TRIM21 interact to negatively regulate virus-induced interferon production. J Biol Chem, 286(8): 6521-6531.

Yu, Y., Wang, S. E., & Hayward, G. S. 2005. The KSHV Immediate-Early Transcription Factor RTA Encodes Ubiquitin E3 Ligase Activity that Targets IRF7 for Proteosome-Mediated Degradation. Immunity, 22(1): 59-70.

Zhuang, H., Gan, Z., Jiang, W., Zhang, X., & Hua, Z.-C. 2013. Functional specific roles of FADD: comparative proteomic analyses from knockout cell lines. Molecular BioSystems, 9(8): 2063-2078.

Zhang, J., Cado, D., Chen, A., Kabra, N. H., & Winoto, A. 1998b. Fas-mediated apoptosis and activation-induced T-cell proliferation are defective in mice lacking FADD/Mort1. Nature, 392(6673): 296-300.

Zhang, J., Kabra, N. H., Cado, D., Kang, C., & Winoto, A. 2001. FADD-deficient T Cells Exhibit a Disaccord in Regulation of the Cell Cycle Machinery. Journal of Biological Chemistry, 276(32): 29815-29818.

Zhang, J., & Winoto, A. 1996. A mouse Fas-associated protein with homology to the human Mort1/FADD protein is essential for Fas-induced apoptosis. Molecular and Cellular Biology, 16(6): 2756-2763.

Zhang, J., Zhang, D., & Hua, Z. 2004. FADD and its Phosphorylation. IUBMB Life, 56(7): 395-401.

ภาคผนวก

1. การสรางแอนตบอด

สรางแอนตบอด 2 ชนด คอ anti-DED ของ hFADD และ anti-hTRIM21 โดยใชกระตายสองตวอาย 2-3 เดอน น าหนกประมาณ 2-3 kg กอนท าการฉดประมาณ 3 วนเกบเลอด pre-immune เพอเปนขอมลอางอง โดยเกบเลอดจากเสนเลอดด าบรเวณกลางใบหกระตายปรมาตร 5 ml ดวยเขมขนาด 21 จากนนปลอยใหเลอดแขงตวท 4๐C เปนเวลา 14-16 ชวโมง ใชพาสเจอรปเปตเขยเลอดทแขงตว ขางหลอดออกแลวปนทความเรว 2500 รอบตอนาท 15 นาท เพอเกบซรมซงเปนสวนใสดานบนไวในหลอดใหมท -20๐C เพอการทดลองครงตอไป ท าบรสทธโปรตน hFADDt1HisSTRx2 (1-95 มมวเตชนท F25Y) ดวย Talon metal affinity (clontech) และ Strep-Tactin Sepharose (IBA) เกบในบฟเฟอร TG150 (20mM Tris-Cl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1mM benzamidine และ 10 % glycerol) น าสารละลายโปรตน 500 µl ทมโปรตนประมาณ 180 µg ผสมกบ complete Freund’s adjuvant ฉดเขาใตผวหนง (subcutaneous) เปนสองจดทบรเวณหวไหล หลงจากนน 21 วนท าการฉดกระตนครงท 1 ดวยโปรตนปรมาณ 50-100 µg ทผสมกบ incomplete Freund adjuvant ในอตรา 1:1 จากนนอก 21 วนจงฉดกระตนภมคมกนซ าเปนครงท 2 ดวยสารละลายเหมอนการกระตนซ าครงแรก หลงการกระตนซ าครงท 2 อก 14 วน ดดเกบเลอดจากเสนเลอดด าบรเวณกลางใบหกระตายประมาณ 20-30 ml ท าการทดสอบวาในซรมม anti–FADD หรอไม หากมแอนตบอดทตองการ จงเกบเลอดเพมอก 30-40 ml

ส าหรบการสราง anti-HishTRIM21 ใชกระตายอกหนงตว ท าเชนเดยวกนตางทขนการเตรยมโปรตนเนองจากโปรตนเสนเตมของ HishTRIM21 อยในรปทไมละลาย จงท าใหบรสทธบางสวนดวย Talon metal affinity ตามขอ 2.3.5 ใหได eluate ปรมาตร 1 ml มาท า SDS-PAGE ดวย 8 หรอ 10% acrylamide โดยให stacking gel มความสง 0.5 cm และไมใสหว น าสารละลายโปรตนทผานการท าบรสทธแลวผสมกบ 2xPGLB โดยหยอดโปรตนใหเทากนทวทงแผนครงละ 200 µl เหนอ stacking gel จากนนท า gel electrophoresis ภายใตความตางศกย 180 โวลต ตอ 2 เจล ประมาณ 1 ชวโมง ตดสวนหนงจากขางเจลไปยอมสเพอหาต าแหนงของโปรตน HishTRIM21 ระหวางการยอมเกบเจลอกสวนไวในน ากลน เมอเหนแถบโปรตนในเจลทผานการยอมจงน ามาเทยบกบคเจลทเกบไวแลวใชมดตดแถบเจลโปรตนตามแนวแถบทผานการยอม น า strip ทได เกบสะสมไวใน running buffer เมอท าครบทงแปดเจลน า strip ทไดมาท า electroelution ตามภาคผนวก 2. แลวผสม complete Freund adjuvant ในอตรา 1:1 ฉดเขาชน

ใตผวหนงของกระตาย จากนนจงฉดกระตนครงท 1 และ 2 และเกบเลอดตวอยางเชนเดยวกบอกการทดลองหนง

2. การท า electroelution น า strip ทงแปดใสใน dialysis tube ทม running buffer จากนนท า horizontal

gel electrophoresis ใน protein running buffer ดวยเครอง DNA gel electrophoresis apparatus ท 4๐C หรอ cold room เพอกนโปรตนเสอมสภาพหรอถกท าลาย โดยวาง strip ใหอยทางขวบวกเพอทโปรตนจะถก elude ไปทางขวลบและอยใน running buffer ภายในถง น าหลอดทดลองขนาด 15 ml ทมน าวางทบไวเพอปองกน dialysis เคลอนท ปลอยใหกระแสวงท 25 mA 18 ชวโมง เมอครบก าหนดน า running buffer ในถงออกมาเพอท าใหโปรตนทไดเขมขนขนดวย CM cellulose (AquaSorb) ใหไดปรมาตรเหลอประมาณ 1.2 ml จาก 10.5 ml น าโปรตนทผานการท าใหเขมขนไปท า SDS-PAGE เพอตรวจสอบและวดปรมาณทได เกบโปรตนทไดท-20๐C เพอใชในการกระตนการสรางแอนตบอดตามภาคผนวก 1. ตอไป

3. การสกด polyclonal antibody

เจาะเลอดจากใบหกระตายครงละประมาณ 30 ml แบงใสหลอดทดลองพลาสตกขนาด 15 ml สองหลอด เกบท 4๐C ประมาณ 4-15 ชวโมง เลอดจะแขงตวและหดตวเปนกอนทรงกระเปาะ ใชหลอดหยดปลายแหลมแยกสวนของเลอดทแขงตวออกจากขอบหลอดทดลอง เพอปลอยซรมไดมากขนปนท 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 5 นาท จากนนดดซรมแยกออกมาใสหลอดทดลองใหม เกบท 4 หรอ –20๐C

ในการสกดอมมโนโกลบลนหรอสวนของ IgG ใส 1 M Tris-Cl pH 8.0 ปรมาตร 1 ในสวน10 ของซรมทไดเพอรกษาระดบ pH ของซรม คอยๆ เตมสารละลายแอมโมเนยมซลเฟตอมตวตามภาคผนวก 4. ชาๆ ตามปรมาตรทผานการค านวณเพอใหความอมตวของโปรตนอยท 45% (v/v) พรอมกบคนสารละลายในภาชนะตลอดเวลาเพอปองกนการเกดความเขมขนเปนบางจด ใชเวลาประมาณ 1 ชวโมง ตกตะกอนโปรตนดวยการหมนเหวยงท 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 20 นาท ทอณหภม 4๐C ดดสารละลายสวนใสออก ลางตะกอนดวย Solution A (45% saturated ammonium sulfate in MilliQ H2O) ดวยวธการละลายและหมนเหวยงเพอตกตะกอน 2 ครง จากนนละลายตะกอนดวย Tris buffer (20 mM Tris-Cl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.01 M EDTA) จากนนน าไป dialysis ใน Tris buffer อยางนอย 4 ครง เพอเอาเกลอออกจากสารละลาย ปรมาตรของสารจะเพมเปนเทาตวหลงการ dialysis ท าใหปรมาณของอมมโนโกลบลนทไดเขมขนขนดวย

การใชสาร CM cellulose ดงน าจากสารละลายในถงไดอะไลซส เกบสารละลาย IgG หรอแอนตบอดทไดท 4๐C หรอ –20๐C ซงสามารถตรวจสอบความบรสทธของอมมโนโกลบลนทไดดวยการท า SDS-PAGE และตรวจสอบประสทธภาพดวย Western blot ตามขอ 2.5.8 ตอไป

4. การตกตะกอนโปรตนดวยสารละลายแอมโมเนยมซลเฟตอมตว กอนการตกตะกอนหนงวนตองท าการเตรยมสารละลายแอมโมเนยมซลเฟตอม

ตว โดยการละลายแอมโมเนยมซลเฟต 100 กรมตอน า MilliQ 100 มลลลตร ซงตองใชความรอนในการชวยใหละลาย กรองแลวทงใหสารละลายเยนตวลงชาๆทอณหภมหองขามคน