Trasporti.ppt
description
Transcript of Trasporti.ppt
Trasporti attraverso la membranaProteine di trasporto
Una membrana costituita da un puro bilayer fosfolipidico è impermeabile alle proteine e alla
maggior parte delle piccole molecole
Gas
EtanoloPiccole molecole polari non cariche
AcquaUrea
Grosse molecole polari non cariche
Glucosio
Ioni
Molecole polari cariche
AminoacidiATPGlc-6-P
Proteine di trasporto
2 principali classi di proteine di trasporto:
Proteine Carrier Proteine Canale
bilayer
lipidico
soluto
sito di legame del soluto
ione
poro acquoso
Diffusione Facilitata
Caratteristiche dei trasporti mediati
• I carriers sono dotati di specificità
• Sono soggetti a saturazione
• Possono essere bloccati dagli inibitori competitivi
• Hanno un’elevata dipendenza termica e dal pH
I trasportatori hanno le caratteristiche di enzimi
• I carriers agiscono cataliticamente come gli enzimi
• Legano selettivamente il loro substrato, cioè la molecola che deve essere trasportata
• Cambiano di conformazione per rilasciare il substrato dall’altro lato
• Ritornano alla conformazione originale per legare un’altra molecola di substrato
• Seguono una cinetica del tipo Michaelis-Menten
0 50 100 150 2000
5
10
15
20
Flu
sso
netto
[mol
i/(cm
2 s]
C (mM)
104
Ck
FF
a
1
max
Fmax
0 10 20 300
100
200
300
F
C
F=kdC
Analisi cinetica del transporto di una molecola tramite proteina carrier: saturazione
In base alla Ia legge di Fick il flusso di particelle che diffondono liberamente aumenta linearmente all’aumentare della concentrazione
Ma la Ia legge di Fick non viene più rispettata se si tratta di un flusso di particelle attraverso la membrana mediato da carriers
I flussi mediati da carriers -a differenza della diffusione libera - sono saturanti
Ciò accade per due motivi:1. Sulla membrana è presente un numero finito di carriers;2. Ciascun carrier opera ad una velocità finita
0 800 1000
0
10
20
30
40
50
Flu
sso
(Par
ticel
le/C
arrie
r/s)
N. particelle
N. partic. Flusso1 110 1050 50
100 501000 50
Rappresentazione del concetto di saturazione con un esempio numerico
Velocità del carrier: 50 p/s
Per semplicità consideriamo una membrana con un solo carrier
Quesito su cui meditare
Distruggendo la metà dei carriers sulla membrana, Fmax rimarrebbe inalterata, aumenterebbe o diminuirebbe?
?
C1
1. Si introduce nella provetta substrato S radioattivo ad una concentrazione C1
2. A tempi successivi (t0, t1, t2, t3, …) si preleva un campione dalla provetta e si misura la concentrazione di S radioattivo all’interno delle cellule del campione
0 10 20 30 40 500
1
2
3
4
5
[S] in
Tempo
1][
vt
S in
pendenza
della retta
3. Normalizzando la velocità v1 rispetto all’area della membrana si ottiene il primo valore del flusso F1 riferito alla concentrazione C1
Flu
sso
netto
[mol
i/(cm
2 s]
C (mM)0 20 40 60 80 100
0
5
10
15
20
C1
F1
Cellule in sospensione
Come è stato ottenuto il grafico che illustra come varia il flusso al variare della concentrazione?
C2 C3 C4
Successivamente si introduce in ciascuna provetta substrato S radioattivo alle altre concentrazioni C2, C3, C4 …. crescenti e si ripete la stessa procedura descritta precedentemente
Flu
sso
netto
[mol
i/(cm
2 s]
C (mM)0 20 40 60 80 100
0
5
10
15
20
C1
F1
0 10 20 30 40 50
0
10
20
30
40
[S] in
Tempo
C2
F2
C3
F3
V4F4
V3F3
V2F2
C4
F4
0 50 100 150 2000
5
10
15
20
Flu
sso
netto
[mol
i/(cm
2 s]
C (mM)
104
Fmax
+Ic
+Ic
I carriers, come gli enzimi, possono essere soggetti ad inibizione competitiva
Quindi, in presenza di inibitore competitivo il valore di Fmax non cambia.
0 50 100 150 2000
5
10
15
20
Flu
sso
netto
[mol
i/(cm
2 s]
C (mM)
0 10 20 300
5
10
15
20
Flu
sso
netto
[mol
i/(cm
2 s]
C (mM)
maxF
2
maxF
ka1 ka2
ka3
In presenza di Ic varia ka
Calcolo della costante di affinità ka
ka è quel valore di concentrazione del substrato al quale il flusso è la metà di quello massimo
ka è inversamente proporzionale all’affinità del carrier per il substrato
.00110.01
Prob[Ic][S]
.01010.1
.091101
.51010
.90910100
.990101000
.9991010000
Come funziona un inibitore competitivo?
0 2000 4000 6000 8000 10000
0
5
10
15
20
Flu
sso
[S]
S S+Ic
0.01 0.1 1 10 100 1000 10000
0
5
10
15
20
Flu
sso
[S]
S S+Ic
substratoInibitore comp.
solo S S << Ic S >> Ic
Se si vuole costruire un grafico che rappresenti un range di
concentrazioni molto ampio (alcuni ordini di grandezza)
conviene usare una scala logaritmica
Un ricercatore trova che la velocità con cui una sostanza è trasportata all’interno di certe cellule varia al variare della sua concentrazione come illustrato in tabella.
1. Trovare i corrispondenti valori di flusso sapendo che l’area di membrana su cui sono state fatte le misure è 3·10-2 cm2;
2. Rappresentare graficamente i valori del flusso al variare della concentrazione di substrato in due grafici distinti ove le concentrazioni sono rappresentate rispettivamente in forma lineare e logaritmica;
3. Ricavare dal grafico i valori di Fmax e ka.
Quesito del giorno
Conc. mM v (mmol/s)
1 10.05 16.7
10 18.220 19.030 19.450 19.6
100 19.8200 19.9
0.1 3.0
Risposta al quesito
0 50 100 150 2000
100
200
300
400
500
600
700
mm
oli/s
/cm
2
Concentr.
0.01 0.1 1 10 1000
100
200
300
400
500
600
700
mm
oli/s
/cm
2
Concentr.
Esempio di Diffusione facilitataIl Trasportatore del Glucosio
Glucosio Permeasi
extracell.
intracell.
poro: formato da 5 a-eliche transmembrana anfipatiche
Diffusione Facilitatasoluto
statoA
statoB
esterno
interno
sito di legamedel soluto
proteinacarrier
gradiente diconcentrazione
bilayerlipidico
es. Trasportatore del glucosio negli epatociti
La driving force per il tranporto in qualsivoglia direzione è determinata dal gradiente di concentrazione attraverso la membrana
Attivita' di RicercaResponsabili Prof. M. Toselli e Dr. Gerardo Biella
Il LABORATORIO DI FISIOLOGIA E BIOFISICA DEI CANALI IONICI del Dipartimento di Fisiologia e Farmacologia Cellulari e Molecolari dell'Universita' di Pavia, diretto dal Prof. Mauro Toselli svolge attivita’ di ricerca sui seguenti argomenti: Canali ionici voltaggio-dipendenti: proprieta' biofisiche e loro correlazione ad aspetti funzionali dell'eccitabilita' elettrica nei neuroni durante lo sviluppo. Modulazione dei canali del calcio e Regolazione del traffico intracellulare: meccanismi molecolari e biofisici dei processi di regolazione dell'attivita' dei canali del calcio voltaggio-dipendenti da parte di protein chinasi e proteine G, e conseguenze nel controllo della trasmissione, ricezione e immagazinaggio dell'informazione nei neuroni. Neurofisiologia cellulare: Identificazione e caratterizzazione funzionale dei circuiti sinaptici delle cortecce paraippocampali. In particolare: ruolo che l'attività ritmica sincronizzata dei neuroni del sistema limbico esercita sui processi di apprendimento e memorizzazione. Cellule staminali neuronali: caratterizzazione elettrofisiologica di cellule staminali neuronali in coltura. Le tecniche correntemente impiegate comprendono misurazioni elettrofisiologiche di patch-clamp sui seguenti preparati: a) linee cellulari stabili di origine neuronale, wild-type o opportunamente ingenierizzate per l'espressione di specifiche proteine ricombinanti normali o mutagenizzate; b) colture primarie di neuroni; c) sezioni sottili di tessuto; d) cellule staminali in coltura.
Numero di posti disponibili: tre posti disponibili dall’inizio del secondo semestre a dicembre 2005; Requisiti per l'accettazione: verra’ data la priorita’ agli studenti che abbiano superato gli esami di Fisica e Chimica Generale.
Alcune considerazioni di bioenergetica
L’energia è la capacità di compiere un lavoro
Un sistema all’equilibrio non può compiere un lavoro. Esso è al minimo della collina energetica
En
erg
ia d
el S
iste
ma
Equilibrio
La parte di Energia che il sistema può utilizzare per compiere un lavoro è definita energia libera del sistema
Una reazione può essere forzata a procedere in senso non spontaneo.
In questo caso la reazione assorbe energia: cioè occorre compiere un lavoro sul sistema
Una reazione di questo tipo è detta endoergonica
Le reazioni non all’equilibrio spontaneamente procederanno nella direzione che porta all’equilibrio
Tali reazioni sono dette esoergoniche
Le reazioni chimiche accoppiate
Un processo endoergonico può avvenire se esso viene opportunamente accoppiato ad un processo esoergonico
Consideriamo la seguente reazione endoergonica:
A + B A-B G>0Affinchè essa possa avvenire deve attingere energia da una reazione esoergonica:
X-P X + P + Energia G<0
La sequenza di reazioni accoppiate sarà la seguente:
A + X-P A-P + X A-P + B A-B + P
I contenitori di energia nelle cellule
Legami ad alta energia: ATP
GTP
Gradienti transmembranari:Gradienti ionici a cavallo del plasmalemma
Contenitori intracellulari di Ca2+
bilayerlipidico
diffusionesemplice
mediatada canale
mediata da carrier
trasportopassivo
trasportoattivo
proteinacarrier
gradiente diconcentraz.
molecola trasportata
Trasporti passivi e attivi a confronto
Trasporti passivi e attivi a confronto• Il gradiente di concentrazione attraverso la
membrana determina la direzione e la velocità della diffusione passiva.
• Nella diffusione passiva le molecole si muovono dalla zona ad alta concentrazione a quella a bassa concentrazione (trasporto “in discesa”)
• Diffusione semplice: le molecole diffondono attraverso il bilayer lipidico
• Diffusione facilitata: diffusione attraverso la membrana mediata da proteine di trasporto (non è richiesta energia)
• Muovere un soluto “in salita” (contro il gradiente di concentrazione) richiede un ingresso di energia - Trasporto Attivo
Trasporti AttiviIl trasporto di un soluto contro un gradiente elettrochimico richiede l’utilizzo di energia
Due strategie sono adottate dalle cellule animali:
Pompe ATP-dipendenti Trasporti accoppiati
Trasporto in salita di una molecola accoppiato al trasporto in discesa di un’altra
Trasporto in salita accoppiato direttamente all’idrolisi dell’ATP
Gradiente elettrochimico
Na+/K+ ATPasi
Na+/K+ ATPasi
gradiente di Na+
gradiente di K+
cytosol
sito di legame del Na+
sito di legame per K+ e ouabaina
Na+/K+ ATPasi
• La pompa idrolizza l’ATP ad ADP per trasportare simultaneamente 3 Na+ dalla cellula e 2 K+ dentro la cellula ad ogni ciclo della pompa
• La Na+-K+ ATPasi è responsabile di >30% del consumo totale di ATP
• Mantiene un gradiente del Na+ (ext>int) e del K+ (int>ext)
• Contribuisce a creare un potenziale di membrana negativo all’interno
• È bloccata dalla ouabaina
Ione Intracellulare Extracellulare
Na+ 5-15 mM 145 mMK+ 140 mM 5 mM
Ciclo della pompa Na+/K+ ATPasi
ext
intil Na si legaal sito citosolico
fosforilazioneATP-dipendente
la proteina subisce un cambiamento conformazionale, il Na è rilasciato all’esterno
il K si legaal sito extracellulare
defosforilazione
la proteina ritorna alla conformazione originale,il K è rilasciato all’interno
1 ciclo 10 millisecondi
Alcune importanti caratteristiche della pompa
Stechiometria - 3 Na+ fuori, 2 K+ dentro, 1 ATP usato
Velocità di attività dipendente dalla concentrazione intracellulare di Na+
Bloccata dal glicoside cardiaco ouabaina e bassa [ATP]i
Elettrogenica, può generare direttamente da -2 a -20 mV
Tiene la pressione osmotica sotto controllo, prevenendo il rigonfiamento cellulare
Gradiente elettrochimico • A cavallo della membrana della maggior parte delle
cellule c’è una differenza di potenziale elettrico – il potenziale di membrana
• Il potenziale di membrana influenza il movimento transmembrana di tutte le molecole cariche (ioni)
• Il lato citoplasmatico della membrana plasmatica di solito ha un potenziale più negativo rispetto all’esterno
• La forza elettrostatica spinge i cationi nella cellula e guida gli anioni fuori
• Quindi, quando consideriamo la diffusione passiva di soluti carichi attraverso una membrana, due forze devono essere considerate:
• (a) il gradiente di concentrazione transmembrana
• (b) la differenza di potenziale transmembrana
• La driving force netta = Gradiente Elettrochimico
Gradiente Elettrochimico
potenziale dimembrana=0
fuori
dentro
potenziale di membrananegativo dentro
trasporto dei cationi aumentato
potenziale di membranapositivo dentro
trasporto dei cationiridotto
In base a quanto detto a lezione, stabilire se la pompa Na+/K+, che è elettrogenica dal momento che trasporta un numero netto di cariche elettriche, aumenterà o diminuirà la sua velocità d’azione qualora la membrana venga depolarizzata.
Ricordarsi che una depolarizzazione comporta un aumento delle cariche positive all’interno della cellula rispetto alla situazione di riposo (potenziale di riposo).
Quesito del giorno
molecola trasportata ione co-transportato
ione contro-transportato
Uniporto Simporto AntiportoTrasporti accoppiati
Alcune definizioni
Altri esempi di trasporti attivi primari
Trasporti accoppiati
Il gradiente di un soluto (es. gradiente del Na+) viene usato per guidare in salita il trasporto di una seconda molecola - trasporto attivo secondario
Gradiente elettrochimico
Trasporto in salita di una molecola accoppiato al trasporto in discesa di un’altra
Trasporti accoppiati al gradiente di NaNelle cellule animali molti processi di trasporto di membrana sono accoppiati al gradiente del Na.
Es. Trasporto del glucosio in cellule dell’epitelio intestinale
Na+ glucosiostato
Astato
B
gradientedi Na
gradiente di glucosio
int
ext
carrier
Stechiometria: 2 Na+ 1 GlcBloccante: florizina
Altri esempi di trasporti attivi secondari
Trasporto del glucosio dal lume intestinale al sangue
SangueCellule dell’epitelio intestinale
Glucosio nel sangue
Glucosio assunto
Lume intest.
GLU permeasi
Co-trasportatore Na/GLUCanale del K+
Una cellula si trova immersa in una soluzione extracellulare contenente glucosio 10 mM. Trascorso un certo tempo la concentrazione di glucosio nel citoplasma sale a 50 mM.
Secondo voi, perche’ cio’ prova che la membrana plasmatica di quella cellula dispone di un trasportatore attivo del glucosio?
Come fareste a dimostrare sperimentalmente che tale trasportatore e’ Na+-dipendente (trasporto attivo secondario)?
Quesito del giorno
Mantenimento dei livelli di Ca2+ intracellulare
• Il Ca2+ è coinvolto in molti processi cellulari
• Il mantenimento di bassi livelli di Ca2+ intracellulare è critico for il normale funczionamento cellulare
• La [Ca2+] extracellulare >>>> della [Ca2+] intracellulare
• Le pompe del Ca2+ ATP-dipendenti della membrana plasmatica e del reticolo endoplasmatico pompano attivamente Ca2+ fuori dal citoplasma
• Esiste anche uno scambiatore Na/Ca (T.A.II) che pompa attivamente Ca2+ fuori dalla cellula
Quali meccanismi mantengono l’ampio gradiente di calcio?
ESTERNO
INTERNO
ADP
Ca++
ATP
Pompa del Calcio
Ca++
3Na+
Scambiatore Sodio:Calcio
Ca2+
Ca2++
Ca2+
I gradienti di calcio esistono sia all’interno della cellula che a cavallo della membrana plasmatica
Contrazione
Secrezione
Esocitosi
Espressionedi geni
Secondomessaggero
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Na+
Concentrazioni ioniche intracellulari ed extracellulari
Ione Intracellulare Extracellulare
Na+ 5-15 mM 145 mMK+ 140 mM 5 mMMg2+ 0.5 mM 1-2 mMCa2+ 10-7 mM 1-2 mMH+ 10-7.2 M (pH 7.2) 10-7.4 M (pH 7.4)
Cl- 5-15 mM 110 mMAnioni fissi high 0 mM
La [intracellulare] è molto diversa dalla [extracellulare]I cationi sono bilanciati dagli anioni
C:\Documents and Settings\Administrator\Documenti\Didattica\Univ British Columbia Biology 350
Bioenergetics.doc