CENTRO DE INVESTIGACION Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

UNIDAD ZACATENCO

DEPARTAMENTO DE GENÉTICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

“Transportadores gliales relevantes en la sinapsis glutamatérgica”

TESIS

Que presenta

M. EN C. ORQUIDIA GUADALUPE MÉNDEZ FLORES

Para obtener el grado de

DOCTOR EN CIENCIAS

EN LA ESPECIALIDAD DE

Genética y Biología Molecular

Directores de la Tesis

Dr. Arturo Ortega Soto, Departamento de Toxicología, Cinvestav

Dra. Angelina Rodríguez Torres, Universidad Autónoma de Querétaro

Ciudad de México. Mayo, 2016

II

Agradecimiento a CONACYT:

El presente trabajo se realizó en el Centro de Investigación y de Estudios

Avanzados del Instituto Politécnico Nacional en el Departamento de Genética y

Biología Molecular, con el financiamiento del Consejo Nacional de Ciencia y

Tecnología (CONACYT) a través de la beca de doctorado No. 290749.  

III

Agradezco a: El Dr. Arturo Ortega por ser mi mentor y por compartir sin reservas su gran experiencia. A mi Comité de evaluación por incentivarme a esforzarme constantemente. Agradezco la asesoría técnica de la M. en C. Luisa Clara Regina Hernández Kelly, de la Técnico en Investigación Blanca Rocío Ibarra López y del IBQ Luis Ángel Cid Cid. A todos mis compañeros de laboratorio, que han sido muchos, a lo largo de estos años, por tan grata compañía. A esta gran institución: Cinvestav, forjadora de mentes inquietas. Gracias Gabriel López, por ser quien incondicionalmente está a mi lado.

Dedico este trabajo a mis Queridos Padres y Hermanos.

IV

Contenido

I. Agradecimientos p. 2, 3 II. Resumen p.5 III. Abstract p.6 IV. Acople de la captura de glutamato y de la captura de glucosa en las células

gliales de Bergmann p.7 a. Introducción p.8 b. El Glutamato p.8 c. Acople metabólico glía-neurona: El ciclo glutamato/ glutamina y la

lanzadera de lactato p.10 d. Receptores Glutamatérgicos p.13 e. Transportadores de Glutamato p.15 f. Células Gliales de Bergman p.18 g. Transportadores de glucosa p.19 h. Transportador de glucosa GLUT1 p.20 i. Planteamiento del problema p.22 j. Resultados y discusión p.23 k. Conclusión p.33

V. El Glutamato Regula la plasticidad funcional del transportador de GABA GAT-3 en células gliales de Müller p.35

a. Introducción p.35 b. El GABA p.35 c. Acople metabólico glía-neurona: El ciclo glutamato-GABA/ glutamina

p.36 d. Transportadores de GABA p.36 e. Células gliales de Müller p.37 f. Planteamiento del problema p.38 g. Resultados y discusión p.39 h. Conclusión p.49

VI. El Glutamato regula su propia captura a través de receptores ionotrópicos en la línea celular humana MIO-M1 p.50

a. Introducción p.51 b. Línea celular humana MIO-M1 p.52 c. Planteamiento del problema p.53 d. Resultados y discusión p.54 e. Conclusión p.62

VII. Metodología general p.63 VIII. Referencias p.72 IX. Anexos p.80

5

Resumen El Glutamato (Glu) y el GABA son los principales neurotransmisores excitador e inhibidor en

el sistema nervioso central (SNC), funcionan a través de la activación de sus receptores y

transportadores específicos presentes tanto en poblaciones neuronales como gliales. Las

células gliales son el tipo celular más abundante en el SNC y son elementos importantes

que están en constante comunicación entre ellos y con las neuronas.

Los sistemas glutamatérgicos y GABAérgicos tienen como punto de convergencia las

interacciones metabólicas descritas por el ciclo Glu/GABA/Gln, el cual supone que los tres

aminoácidos comparten la misma fuente de esqueletos de carbono y que solo actividades

enzimáticas y de transporte en diferentes compartimentos celulares permiten la inter-

conversión entre ellos y tránsito entre las neuronas y las glias.

La células de Bergmann (CGB) y las de Müller (CGM) son glias radiales presentes en los

organismos adultos, que no tienen características finales de astrocitos, sino más bien se

asemejan a progenitores del SNC. Estos dos tipos celulares están estrechamente

relacionados a sinapsis glutamatérgicas in situ, por lo tanto es de particular importancia

describir las diversas señalizaciones que el Glu produce en sus sistemas de transporte

relacionados. Mediante diversos ensayos de proteína y de transporte de sustrato

encontramos que el Glu regula a la alza la expresión y funcionamiento de los

transportadores de glucosa (GLUTs) y su interacción con EAAT1/GLAST (Glu/D-Asp

transporter) en las CGB de pollo, mientras que disminuye la expresión membranal y

funcionamiento del transportador de GABA 3 (GAT3) de manera dependiente de receptores

tipo AMPA en las CGM de pollo, finalmente, el Glu aumenta el sistema de transporte de D-

Asp y la asociación relevantemente funcional de EAAT1 con Ezrina y GFAP en las células

MIO-M1 (CGM de origen humano).

Los resultados aquí descritos describen mecanismos moleculares atribuibles en

condiciones basales y que bajo condiciones patológicas se asume se ven alterados.

Palabras clave: MIO-M1, Bergmann glía, Müller glía, GLUT1, GLAST, GAT3, AMPA

receptor.

6

Abstract Glutamate (Glu) and GABA are the major excitatory and inhibitor neurotransmitter in

the central nervous system (CNS), they function through activation of its specific

receptors and transporters which are present both in neuronal and glial populations.

Glial cells are the most abundant cell type in the CNS and are important elements

that are constantly communicating with each other and with neurons.

Glutamatergic and GABAergic systems have the convergent point in metabolic

interactions described as the Glu / GABA / Gln cycle, which assumes that the three

amino acids share the same source of carbon skeletons cycle and only enzymatic

and transport activities in different cellular compartments allow them inter-convert

between the different substrates and transit between neurons and glia.

The Bergmann (CGB) and Müller (CGM) cells are radial glia present in adult

organisms, which have no final characteristics of astrocytes but resemble CNS

progenitors. These two cell types are closely related to glutamatergic synapses in

situ, therefore is particularly relevant to describe the diverse signaling pathways that

are related to Glu transportation systems. Protein and substrate transport assays

indicated that Glu regulates upward expression and functioning of glucose

transporters (GLUTs) and its interaction with EAAT1 / GLAST (Glu / D-Asp

transporter) in the CGB chicken, while decreasing cell membrane expression and

functioning of GABA transporter 3 (GAT3) depends on AMPA receptor activation in

CGM chicken; finally the Glu increases the transport system D-Asp and functional

association of EAAT1 with Ezrin and GFAP in the MIO-M1 (CGM of human origin)

cells.

The results described here entail molecular mechanisms under basal conditions; the

same that under pathological conditions are assumed to be disturb.

7

Acople de la captura de glutamato y de la captura de

glucosa en las células gliales de Bergmann

8

Introducción El cerebro y la médula espinal integran el sistema nervioso central (SNC), éste se

conforma principalmente por dos tipos celulares: las neuronas y las células gliales.

Éstas últimas representan la mayor parte de la población celular en el cerebro de los

mamíferos, dependiendo de la región o el tejido al que se refiera, pero en general se

ha estimado una proporción de 1.3 a 1.5 de glía/neurona (Pelvig et al., 2008; Mota

and Herculano-Houzel, 2014).

La células gliales realizan muchas funciones a lo largo del desarrollo, durante el

funcionamiento normal y en condiciones patológicas del sistema nervioso; algunas

de ellas son: el soporte físico para la migración neuronal, puente metabólico para el

abasto energético, control de la entrada y salida de sustancias desde el torrente

sanguíneo hacia el cerebro, señalización neurotrófica, modulación de la plasticidad

sináptica y transmisión controlada de información a través del sincitio glial por

regiones funcionales (Elsayed and Magistretti, 2015).

El Glutamato El aminoácido Glutamato (Glu) ha sido reconocido por largo tiempo como el principal

neurotransmisor del SNC en vertebrados (Fonnum, 1984), ya que el cerebro humano

tiene aproximadamente 10 x 1013 contactos sinápticos, de los cuales más del 90%

también son glutamatérgicos. Por su parte el ácido gamma-aminobutírico y la glicina

son los principales neurotransmisores inhibidores del SNC (Nicholls, 1993).

El ácido glutámico es transformado en GABA a través de la enzima glutamato

descarboxilasa (Kandel et al., 2000). Es un componente esencial del metabolismo

intermediario, es un bloque estructural en la formación de proteínas y de ácidos

nucleicos, es una potente neurotoxina y sirve como fuente energética (Bak et al.,

2006). Cuando el Glu ingresa en los astrocitos éste puede ser aminado por la enzima

glutamina sintetaza (GS) ó desaminado por las enzimas Glu-decarcarboxilasa o

transaminasas para convertirse en α-cetoglutarato, entonces oxidarse a succinato,

fumarato y malato, para ser procesado en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA,

9

pos sus siglas en inglés), o descarboxilarse para formar piruvato y reducirse a lactato

(Danbolt, 2001).

Las concentraciones de Glu en el plasma sanguíneo son de 50 a 100 µM (Stegink et

al., 1982), 10 µM a 30 µM en el líquido cerebro-espinal, mientras que en el cerebro

oscilan entre 5 y 15 mM por kilogramo de peso húmedo (Danbolt, 2001). En el

espacio extra-celular se encuentra de 3 a 4 µM en condiciones basales, sin embargo

durante la neurotransmisión es al menos de 1 mM (Clements et al., 1992), aunque la

mayoría está almacenado intracelularmente (1-10 mM), ya que las vesículas

presinápticas de las neuronas contienen alrededor de 150 mM, contrariamente, en el

citoplasma de las poblaciones gliales se estima alrededor 0.6 µM dado que es

rápidamente incorporado a alguna de las vías antes mencionadas (Danbolt, 2001;

Lanz et al., 2014)

Cuando el Glu almacenado en vesículas presinápticas es liberado por exocitosis

dependiente de Ca2+ al espacio sináptico, activa a sus receptores ionotrópicos

(iGluR, que forman canales iónicos) y metabotrópicos (mGluR, que actúan a través

de segundos mensajeros), pero la es rápidamente removido a través de la captura a

través de los transportadores de aminoácidos excitadores específicos dependientes

de Na+, los EAATs (Excitatory Amino Acid Transporters) que se encuentran tanto en

la terminal pre-sináptica como en las células gliales que rodean los contactos

sinápticos (Danbolt, 2001).

El Glu es producido mediante la ruta general de síntesis de aminoácidos o por la

transaminación del α-cetoglutarato. Dado que se considera que las neuronas son

deficientes en la enzima piruvato carboxilasa (requerida para formar intermediarios

del TCA), se supone que no son capaces, en su mayoría, de sintetizar el Glu de novo

para sus neurotransmisiones y por lo tanto dependen del ciclo Glu/Gln y de sus

respectivos almacenes neuronales y astrocíticos (Broer and Brookes, 2001)

10

Acople metabólico glía-neurona: El ciclo glutamato/ glutamina y la lanzadera de lactato

Por largo tiempo se ha propuesto que la transmisión glutamatérgica depende de un

acoplamiento metabólico y energético entre las neuronas y las células gliales (van

den Berg and Garfinkel, 1971; Volk et al., 2015). La disponibilidad del Glu para ser

liberado por la neuronas involucra el funcionamiento adecuado de proteínas gliales,

como son los transportadores de Glu, la enzima GS y los SNATs. Un modelo bien

aceptado de este acople es el “el ciclo Glu/Gln” (Waagepetersen et al., 2007). La

propuesta es que el Glu liberado desde la pre-sinapsis activa a sus receptores post-

sinápticos y difunde a las glias cirundantes donde es capturado mediante los

transportadores gliales GLAST (EAAT1) y GLT1 (EAAT2) para posteriormente

convertirse a Gln por la enzima glutamina sintetasa (GS, expresada en astrocitos), la

Gln es expulsada al espacio extracelular por el simporte de un ion Na+ y el antiporte

de un H+, a través del sistema N (SNAT, Sodium-coupled Neutral Amino acid

Transporters, 3 y 5), entonces es capturado por las neuronas mediante el sistema A

(SNAT 1 y 2) de transporte de glutamina y es reconvertido a Glu gracias a la

glutaminasa dependiente de fosfato (PAG) (Broer and Brookes, 2001).

Un hito relevante de este acople es la comprobación de proximidad física y el

consecuente funcionamiento articulado de los diversos elementos moleculares que

intervienen en una vía metabólica. En este sentido, se ha encontrado que la ATPasa

Na+/K+, que es requerida para expulsar el exceso de iones sodio que ingresan a las

células gliales cuando el Glu es capturado mediante los EAATs, algunas enzimas

glucolíticas y la mitocondria, forman complejos funcionales con los transportadores

específicos de Glu (Rose et al., 2009; Genda et al., 2011; Bauer et al., 2012).

Adicionalmente se ha encontrado que la captura de Glu está relacionada a la

liberación de Gln, de tal modo que existe una interacción física y funcional entre

EAAT1 y SNAT3 en las células de glía de Bergmann (CGB) (Martinez-Lozada et al.,

2013).

Existe un cierto consenso respecto a algunas partes de este modelo, por ejemplo la

actividad de la enzima PAG para convertir Gln a Glu es específica de las neuronas

11

(Kvamme et al., 2001), la anaplerosis del Glu tiene que ubicarse en los astrocitos, ya

que ellos son los que principalmente expresan la enzima piruvato carboxilasa (PC)

(Shank et al., 1985), mientras que la Gln tiene que proceder de los astrocitos, ya que

expresan casi de manera exclusiva la GS en el SNC (Norenberg and Martinez-

Hernandez, 1979). Sin embargo, no toda la Gln es generada a partir del Glu

capturado en los astrocitos, ya que éste último puede tomar otros caminos y entrar al

TCA y ser oxidado para producir alrededor de 20 moléculas de ATP (McKenna,

2007), por tal motivo existen argumentos en contra de que la captura de Glu no

conlleve la activación de la captura de glucosa y que en vez de un ciclo Glu/Gln

existe una lanzadera de Gln, ya que esta misma puede provenir de intermediarios del

TCA (Verkhratsky and Butt, 2007) o trans-aminaciones de otros aminoácidos

(McKenna, 2013).

EL ciclo glutamato-glutamina. El Glu liberado en la sinapsis ejerce su función mediante la activación

de sus receptores en la post-sinapsis y la transmisión es terminada mediante la remoción por EAATs.

Dentro de los astrocitos el Glu puede seguir tres caminos: ser convertido a Gln mediante la GS, ser

substrato de la enzima Glutamato descarboxilasa (GDH) para producir alfa-cetoglutarato (α-KG) o ser

desaminado mediante enzimas aminotransferasas como la amino transferasa de Asp (AAT) o la

12

aminotransferasa de amino ácidos ramificados (BCAT), siendo así substrato que será oxidado en el

TCA (Stobart and Anderson, 2013)

Hace más de un siglo, Charles Sherrington sugirió que la actividad neuronal y el

metabolismo están estrechamente acoplados (Nicholls, 1993). En efecto, existe

evidencia respecto a que algunas áreas discretamente activadas aumentan el

consumo local de glucosa, alrededor de un 20% (Raichle, 2003); ésta es uno de los

fundamentos para el modelo energético de que el cerebro de mamíferos es

abastecido por la oxidación de glucosa (Verkhratsky and Butt, 2007)

La hipótesis de la lanzadera de lactato Astrocito-Nuerona (ANLSH, por sus siglas en

inglés) supone el uso de sustratos energéticos alternativos a la glucosa, que son de

uso común para el abastecimiento en la transmisión sináptica glutamatérgica, como

el lactato (Verkhratsky and Butt, 2007). De este modo, un sistema eficiente de

captura de Glu aumenta la concentración de sodio e induce el trabajo de la ATPasa

NA+/K+, además de que la GS también consume ATP al producir Gln,

consecuentemente la captura de glucosa aumenta, tanto para generar lactato (que

puede ser capturado y oxidado en las neuronas) que liberan extracelularmente los

astrocitos, como para abastecer sus propias demandas energéticas y anabólicas

(Bittar et al., 1996).

13

Hipótesis de la lanzadera de lactato astrocito-neurona. El Glu liberado en la sinapsis es capturado

por los astrocitos a través de los EAATs (GLT1 y GLAST), los cuales co-transportan tres iones sodio

por cada Glu, por lo tanto el desbalance iónico es compensado por el funcionamiento de la ATPasa

Na+/K+ y la Gln formada por la GS a partir del Glu. Ambos procesos consumen ATP, en consecuencia

la tasa de captura de Glucosa incrementa y el metabolismo no oxidativo de la misma también, lo cual

se deriva de la isoforma LDH5 (lactato-deshidrogenasa 5) de alta afinidad a piruvato que está

presente en astrocitos, favoreciendo así la conversión a lactato. El transportador 4 de

monocarboxilatos (MCT4) expulsa el lactato hacia el espacio extracelular, de donde es capturado por

las neuronas mediante el (MCT2). Aunque en condiciones basales la neuronas pueden capturar

eficientemente la glucosa, durante la transmisión sináptica se ha reconocido que más fácilmente

pueden oxidar un sustrato como el lactato (Magistretti and Allaman, 2015).

Receptores glutamatérgicos

En los mamíferos se han identificado 22 subtipos de receptores glutamatérgicos, que

han sido categorizados en dos principales clases: los ionotrópicos (iGluR) y los

metabotrópicos (mGluR). Los primeros son canales iónicos abiertos por ligando de

acción rápida; mientras que los segundos son receptores de siete segmentos

transmembranales acoplados a proteínas G (Gasic and Hollmann, 1992).

14

Los iGluR son subdivididos de acuerdo a sus propiedades farmacológicas, se

reconocen los de tipo NMDA (N-metil-D-Aspartato), los receptores tipo AMPA (ácido

α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol propiónico) y los receptores de ácido kaínico

(KA). Por su parte los mGluR integran tres grupos (I-III) y están catalogados

conforme a sus similitudes en la estructura primaria y rutas de segundos mensajeros

involucrados en sus mecanismos de señalización (Gasic and Hollmann, 1992).

Diversos sistemas de nomenclatura han identificado a los receptores ionotrópicos de

Glu, sin embargo el creciente descubrimiento de unidades heteroméricas ha

incentivado el desarrollo de nomenclaturas sistemáticas que faciliten la identificación

de las mismas, por ejemplo la nomenclatura de la Unión Internacional de

Farmacología (IUPHAR, por sus siglas en inglés) descrita en la tabla a continuación

(Collingridge et al., 2009).

Fuente: http://www.guidetopharmacology.org/LGICNomenclature.jsp

Los receptores ionotrópicos de glutamato son canales abiertos por ligando de

respuesta rápida (< 1 s) que forman estructuras transmembranales de 4 a 5

subunidades arregladas radialmente en torno al poro central que es permeable a

cationes, cada subunidad consta de un extremo amino-terminal extenso (S1) que

interactúa un asa extracelular (S1) para formar el sitio de unión para el agonista,

existen tres fragmentos transmembranales (TM1, TM3 y TM4) con un solo segmento

re-entrante (MD2) que se inserta desde la cara citoplasmática (entre TM1 y TM3) y el

extremo carboxilo terminal de ubicación citoplasmática que funciona como sitio de

15

interacción con proteínas de de la densidad post- sináptica de dominios PDZ

(Madden, 2002).

Los receptores metabotrópicos son polipéptidos extensos (~1000 aa) con un extremo

amino-terminal largo (~600 aa) que aloja el sitio de unión para el agonista y un

dominio rico en cisteínas, cuya función es estabilizar la estructura tri-dimensional, a

continuación se reconocen los siete segmentos transmembranales y un extremo

carboxilo terminal citoplasmático, igualmente funcional para la interacción con otras

proteínas; constan de una sola unidad funcional, aunque se ha descrito la formación

de dímeros que se encuentran acoplados a las proteínas G trimétricos (Collingridge

et al., 2009).

Los receptores ionotrópicos glutamatérgicos abiertos por ligando forman estructuras tetraméricas

(Collingridge et al., 2009).

Transportadores de glutamato

En general los transportadores neuronales de Glu capturan alrededor del 20%,

mientras que los gliales el 80% restante (Kirischuk et al., 2007).

16

Los Transportadores de Amino Ácidos Excitadores” (EAAT) pertenecen a la familia

de acarreadores de solutos SLC1. Las funciones de estas proteínas transportadoras

son: participar en el mecanismo de reciclamiento que permite el re- abastecimiento

de las pozas intracelulares del transmisor, delimitar temporal y espacialmente la

actividad, definir que receptores van a ser activados y contribuir a mantener los

niveles basales extracelulares del neurotransmisor(Otis and Dodson, 2009). La

captura de Glu ha sido descrita significativamente mayor en los co-cultivos de células

gliales y neuronales del cerebelo que en los monocultivos neuronales, lo cual sugiere

que las células astrogliales son el principal componente de la captura. La

concentración de los aminoácidos excitadores en las vesículas sinápticas

intracelulares se logra mediante los transportadores vesiculares, proteínas

pertenecientes a la familia SLC17 (Bak et al., 2006).

Los EAATs son acarreadores de solutos con estructuras homo ó

heteropentaméricas, donde cada subunidad consta de dominios carboxilo y amino-

terminal ubicados en el citoplasma, 8 pasos transmembranales y al menos un asa re-

entrante. Otro modelo sugiere la formación de homotrímeros en forma de tazón

donde cada subunidad se inserta como cuña, ya que las regiones de 2 asas

reentrantes se unen en la parte más interna de la membrana, esta región se

considera el sitio de unión y transporte individual para una molécula de Glu por cada

subunidad, de modo que cada subunidad puede transportar Glu independientemente

La estequiometria de un ciclo completo de transporte de Glu incluye el co-transporte

de tres iones sodio, un protón y el anti porte de un ión potasio (Kavanaugh, 2004;

Otis and Dodson, 2009).

Se han descrito cinco subtipos de EAATs, cuyos patrones de distribución y

propiedades cinéticas son diferentes en el cerebro. Entre sus características

compartidas se describe que poseen un peso molecular oscilante entre 65 y 77 kDa,

debido al grado de glucosilación que presenten, además de que poseen una

homología estructural del 50 % (Danbolt, 2001).

EAAT-1 y EAAT-2 (GLAST y GLT-1, respectivamente en humanos y ratas) se

expresan casi de forma exclusiva en las células gliales. El primero de ellos abunda

17

en el cerebelo, mientras que GLT-1 está presente posiblemente en el cerebro

anterior.

EAAT-3 y EAAT-4 son expresados por neuronas, el primero prevalece en neuronas

de Purkinje del cerebelo y el segundo en neuronas corticales.

EAAT5 es casi exclusivo de neuronas de la retina.

El transportador EAAT1 (Excitatory Amino Acid Transporter 1), ó GLAST, es

marcadamente expresado en la capa molecular de la corteza cerebelar, por lo tanto

es la molécula responsable de la captura de glutamato de alta afinidad acoplada a

Na+, en esta región es donde extienden sus procesos las CGB (Zhou and Danbolt,

2013).

Localización y estructura de los transportadores de Glu y GABA en el cerebellum. Esquema de

la localización de los EAATs en una hendidura sináptica glutamatérgica, específicamente de contactos

FP-CP (Fibra Paralela-Célula de Purkine) en la capa molecular del cerebelo; los cuales están

rodeadas por membranas astrogliales que contienen densidades promedio de 4700 y 740 moléculas

de GLAST y GLT1, respectivamente, por micrómetro cuadrado de membrana. EAAT4 es abundante

en las zonas de la membranas de CP cubiertas por procesos astrogliales y en menor proporción en la

densidad post-sináptica, la densidad promedio es de 1800 moléculas por micrómetro cuadrado de

18

membrana. EAAT3 se distribuye en las membranas y en el citoplasma de las PC (Zhou and Danbolt,

2013).

Células gliales de Bergmann

Las células gliales de Bergmann son astrocitos radiales especializados y el tipo glial

más abundante en la corteza cerebelar, sus somas están ubicados en la capa de

Purkinje y extienden sus procesos a través de la capa molecular (3-6 ramificaciones

principales) hasta contactar la superficie pial. Estos procesos contienen muchas

mitocondrias e infinidad de filamentos intermedios, constituidos por vimentina y

proteína acídica fibrilar glial (GFAP) (Verkhratsky and Reichenbach, 2009).

Cada CGB tiene un volumen aproximado de 3600 µm3, lo cual en conjunto ocupa del

15 al 18% del volumen de la capa molecular en roedores. En relación a las

interacciones neurona-glia se ha descrito que existen 8 CGB por cada CP (en ratón),

por lo que las primeras cubren alrededor de 6000 contactos sinápticos de la segunda

(Verkhratsky and Reichenbach, 2009).

Durante la morfogénesis los procesos radiales de las CGB sirven como guía para la

migración de las neuronas granulares, sus pies terminales se arreglan de modo que

conforman una barrera glial y tras concluir la etapa de desarrollo envuelven las

sinapsis formadas por las células de Purkinje, donde asisten en la neurotransmisión

(Koirala and Corfas, 2010).

Algunas características moleculares identificadas en las CGB son moléculas quimio

atractivas o quimio-repulsivas (como la semaforina 4B) útiles para la migración

neuronal crecimiento dendrítico y formación de contactos sinápticos; receptores y

transportadores de glutamato (GLAST), Proteínas Transmembranales Reguladoras

de AMPA (TRAPs); enzimas como la Glutamina sintetiza, Piruvato carboxilasa,

Lactato deshidrogenasa (LDH) y transportadores de monocarboxilatos como MCT1 y

MCT4 (Koirala and Corfas, 2010).

Entre los receptores glutamatérgicos inotrópicos expresados por las células gliales

de Bergman se encuentra el AMPA (subunidades GluR 1, 3, 4), que no cuenta con

19

subunidades GluR2, por lo tanto permean Ca2+; esta entrada iónica selectiva se ha

visto relacionada con la permanencia de los procesos gliales en los contactos

sinápticos de las CP (Verkhratsky and Reichenbach, 2009). Existen reportes de que

en rata se transcribe el RNA mensajero de la subunidad NR2B; mientras que en pollo

se ha corroborado la existencia funcional de estos receptores (Lopez et al., 1994).

De los receptores metabotrópicos se ha reportado a la subunidad mGluR5 (Grupo I,

relacionado a la activación de la PLC, potenciación a largo plazo), que tras su

activación se produce una liberación de Ca2+ intracelular (del Retículo endoplásmico)

dependiente del metabolismo de fosfoinosítidos (1,4,5-trifosfoinositol = IP3), evento al

que ha sido mayormente adjudicado el incremento en la concentración de Ca2+ tras

los estímulos con glutamato, ya que los receptores tipo AMPA se desensibilizan

rápidamente (Verkhratsky and Reichenbach, 2009). Aunque existen reportes previos

de la presencia de los tres grupos de receptores metabotrópicos (Lopez-Juarez,

2008).

El cerebelo tiene una estructura altamente organizada, en la cual la posición y las

proporciones de los tipos celulares son fijos y bien establecidos. Los tres tipos de glía

que en él se encuentran están distribuidos de la siguiente forma: los oligodendrocitos

en la materia blanca, los atrocitos en la capa granular y las células de glía de

Bergmann en la capa molecular. Estas células son el tipo glial predominante en el

cerebelo y envuelven las sinapsis establecidas por las células de Purkinje. Tomando

de partida que todos los contactos de las espinas dendríticas de las CP con las FP

están en estrecha relación anatómica con los procesos de las CGB y son

glutamatérgicos (Teichberg, 1991), se pueden relacionar los eventos

desencadenados por el glutamato en estas ultimas células a los contactos sinápticos

PF-PC.

Transportadores de glucosa

La glucosa es la fuente principal de energía metabólica y es el esqueleto de carbón

para la síntesis de proteínas, de lípidos y ácidos nucleicos en las células de

mamíferos. Proporciona energía en forma de ATP a través de la glucolisis, del TCA

y el poder reductor en forma de NADPH. También se utiliza en la síntesis de glicerol

20

para la producción de triglicéridos y proporciona productos intermedios para la

síntesis de aminoácidos no esenciales (Zhao and Keating, 2007).

Los transportadores de glucosa son proteínas integrales de membrana que permiten

el transporte de glucosa y sustancias estructuralmente relacionadas a través de las

membranas celulares. Se han identificado dos familias de transportadores de

glucosa: a) la familia de transportadores de glucosa de difusión facilitada (símbolo del

gen Slc2a, símbolo de la proteína GLUT, de “Glucose Transporter”), la cual se

constituye por trece miembros (GLUT 1-12, HMIT y 4 pseudogenes); b) la familia de

transportadores dependientes de Na+ (símbolo del gen SLC5A, símbolo de la

proteína SGLT), de la que se han reportado seis miembros, pero solo SGLT1 y

SGLT2 han sido bien caracterizados (Zhao and Keating, 2007; Wilson-O'Brien et al.,

2010).

Transportador de glucosa GLUT1

La isoforma GLUT1 también es conocida como el transportador de glucosa del

eritrocito, cerebro o de la línea celular Hep-G2 y comprende del 3 al 5% de la

proteína total de la membrana del eritrocito. En particular, es expresada en altos

niveles en las barreras endotelial y epitelial del cerebro, ojos, nervios periféricos,

placenta y glándulas mamarias lactantes (Wilson-O'Brien et al., 2010)

La actividad del transporte de glucosa de GLUT1 se ha evaluado en los ovocitos de

Xenopus, GLUT1 transporta la glucosa con una KM de 20 a 21 mM para el 3-O-

metilglucosa bajo condiciones de equilibrio de intercambio de flujo, de 5 mM para el

2-desoxi-D-glucosa y de ~3 mM para la glucosa (Keller et al., 1989).

El modelo conformacional de GLUT1 asume la existencia de 12 segmentos

transmembranales α hélices, un amino y carboxilo terminal intracelular, una gran asa

intracelular y un N-glicosilado en la primer asa extracelular (Carruthers et al., 2009).

En el cerebro, el GLUT1 ha sido detectado en dos distintas isoformas codificadas por

el mismo gen y difieren únicamente en su extensión de glucosilación: la isoforma de

55 kDa se encuentra localizada en la membrana luminal y abluminal de las células

21

endoteliales de los capilares del cerebro presentes en la BHE, mientras el GLUT1 de

45 kDa se expresan en toda las células neuronales (Vannucci et al., 1997).

GLUT1 está conformado por 488 aminoácidos en el pez, 490 en el pollo y 492 en

humano, bovino, rata y ratón con un peso molecular de aproximadamente 54 kDa, es

la isoforma más conservada y presenta aproximadamente de 74 a 98% de identidad

de secuencia entre estas especies (Zhao and Keating, 2007).

22

Planteamiento del problema:

Las CGB están en contacto estrecho con la sinapsis glutamatérgica de la Fibra

paralela con la célula de Purkinje, expresan receptores y transportadores específicos

para el Glu.

Dado que el Glu genera un acople energético entre las neuronas y células gliales en

diversos modelos:

¿La exposición a Glu induce un aumento en la captura de un análogo de la glucosa

en las CGB?

¿Existe una interacción física entre el principal transportador de glucosa astrocítico

GLUT1 y el EAAT1?

23

Resultados y discusión

La posibilidad de que la neurotransmisión glutamatérgica se asocie al metabolismo

glial fue sugerido mucho tiempo atrás (Pellerin et al., 1998), sin embargo se

desconocen los eventos moleculares involucrados en esta “sinapsis tripartita”. Entre

los modelos propuestos para intentar explicar este acople se encuentran el ciclo

Glu/Gln y la lanzadera de lactato astrocito-neurona (Pellerin et al., 1998;

Waagepetersen et al., 2007).

La fig. 1 muestra por inmunodetección en fase sólida (a), inmunofluorescencia (b) e

inmunohistoquímica con diaminobenzidina (c). La presencia de GLUT1 y GLUT3 en

los cultivos primarios de CGB (a,b) y en rebanadas de cerebelo de embrión de pollo

de 18 días (c). De igual manera que con otras glías, los cultivos primarios de CGB de

cerebelo de pollo presentan típicamente el transportador de alta afinidad y amplia

distribución GLUT1. Sin embargo también encontramos evidencia de la expresión de

GLUT3, el cual es una isoforma mayormente reportada en estirpes neuronales, pero

al ser las CGB gliales radiales, no es raro hallar una amplia e incluyente expresión de

proteínas típicas de progenitores neuronales (Patten et al., 2006). Adicionalmente ya

hay reportes de que este transportador GLUT3 ya ha sido encontrado basalmente en

cultivos de astrocitos (Maher et al., 1991), además de que puede ser inducido por

óxido nítrico (Cidad et al., 2001).

Adicionalmente también puede apreciarse la presencia de KBP (Kainate Binding

Protein), proteína que funciona como marcador molecular para este tipo celular

(Somogyi et al., 1990).

El panel C de la Figura 1 muestra la detección de patrones de marcaje típicos de

calbindina, para identificar la capa de Purkinje, mientras que KBP y GLAST marcan

la región abarcada por las CGB, en la corteza de las rebanadas de cerebelo de

embriones de pollo de 18 días. La inmunodeteccción de GLUT1 y GLUT3

corresponden mayormente con el patrón marcado por GLAST y KBP, indicando su

presencia en las CGB.

24

Fig 1. Expresión de transportadores de glucosa (GLUTs) en CBG y en el cerebelo de embriones de

pollo.

El transporte del análogo de glucosa [H3]2DOG en las CGB es saturable con el

tiempo y alcanza un equilibrio próximo a los 30 min (fig. 2 a), por lo cual es

dependiente de proteínas transportadoras específicas. Pese a que es preferible una

captura en la fase lineal de la curva, optamos por medir el influjo de [H3]2DOG a los

30 minutos para tener una señal de mayor intensidad. Un análisis cinético de la

captura de [H3]2DOG en las CGB (fig. 2b) muestra que es saturable con

concentraciones crecientes del sustrato, con una capacidad máxima de transporte

aproximada de 3112 pmol/mg prot./min y una KM de 1.3 mM. Estos valores

concuerdan con lo reportado para GLUT1 y GLUT3, ya que son los dos GLUTs de

mayor afinidad (Vannucci et al., 1997; Carruthers et al., 2009). Se ha documentado

una KM de1.3 mM para GLUT1 expresado en ovocitos de Xenopus (Colville et al.,

1993) y de 1.6 mM en astrocitos de rata (Carruthers, 1990).

25

Fig 2. El transporte de [H3]2DOG en las CGB es saturable a tiempos y concentraciones crecientes.

Considerando que el L-Glu es el principal neurotransmisor excitador del SNC en

todos los vertebrados y que se ha observado inducir el transporte de glucosa en

modelos semejantes (Loaiza et al., 2003), decidimos evaluar si la exposición a L-Glu

en CGB es capaz de alterar la captura de 2DOG marcado. La figura 3 panel a

muestra que tanto Glu como D-As son capaces de inducir un aumento en el

transporte de la glucosa. El hecho de que D-Asp, el análogo no transportable del Glu

mimetice su efecto sugiere fuertemente que el evento está relacionado con la captura

del neurotransmisor Glu. Una parte fundamental en la regulación de la

neurotransmisión es el sistema de captura y alrededor del 80% de la misma es

realizada por los EAATs gliales (Kirischuk et al., 2007).

Los paneles b y c de la figura 3 muestran una relación dosis-efecto de estimulación

en la captura de [H3]2DOG en CGB con valores de EC50 de 11.7 y 9 µM para D-Asp y

L-Glu. Estos datos están próximos a la afinidad aparente previamente reportada para

el transporte de D-Asp en el mismo sistema, con una KM de 26.4 µM (Ruiz and

Ortega, 1995), por lo tanto refuerza la idea de que este incremento en la captura del

análogo de glucosa en las CGB es mediado en gran medida por el transporte de Glu.

26

Fig 3. EL transporte de Glu aumenta la captura de [H3]2DOG.

La actividad de captura de proteínas transportadoras puede ser regulada mediante

un cambio en la afinidad hacia su sustrato (KM) o mediante el cambio en la capacidad

de máxima de captura (Vmax).

Con miras a dilucidar cuál de las dos anteriores posibilidades era la responsable del

efecto de L-Glu sobre la captura de 2DOG, por lo que medimos los valores cinéticos

en condiciones no estimuladas (NS) y con 1 mM de L-Glu por 30 min en las CGB.

La figura 4 A es el conjunto de tres experimentos independientes que sugieren un

aumento significativo en la Vmax pero no así en la KM. Las curvas son

significativamente distintas.

La rápida inserción de GLUTs en la membrana citoplasmática es una respuesta bien

documentada (Ismail-Beigi, 1993), por lo tanto ese aumento en la capacidad máxima

de captura de [H3]2DOG puede reflejar un aumento en la cantidad de GLUTs

27

funcionales en la membrana plasmática. Una forma de corroborar esto fue marcando

con biotina las proteínas de la membrana plasmática y detectar por western-blot.

Como resultado la figura 4 b muestra que la inmunodetección de GLUT1 es mayor en

las CGB se exponen a Glu o D-Asp. Como controles de las facciones el panel c de la

figura 4 muestra la inmunodetección de las proteínas GLAST y α-actina para las

fracciones membranales y citoplasmáticas, respectivamente. EL aumento rápido en

la expresión membranal de GLUT1 se ha documentado con anterioridad en

fibroblastos (Loaiza et al., 2003) y mastocitos (Gunnink et al., 2014).

Fig 4. Incremento en la velocidad máxima de transporte y en la expresión de GLUT1 en la superficie

membranal en CGB tratatadas.

Con miras a indagar el mecanismo por el cual se produce el aumento en la captura

de [H3]2DOG. El transporte de Glu por GLAST/EAAT1 es dependiente del co-

transporte de iones Na+, por lo tanto evaluamos si en medio sin sodio (con Tris-HCl)

28

se producía o no el evento. La figura 5 a muestra que el efecto del Glu y D-Asp no se

presenta en ausencia de sodio. Considerando que el tráfico de receptores y

transportadores puede involucrar arreglos del citoesqueleto y éste último se organiza

de manera dependiente de calcio (Sullivan et al., 2007; Fehon et al., 2010; He et al.,

2014), decidimos evaluar si la ausencia de Ca2+ afectaba en la inducción del

aumento de la captura del análogo de glucosa. En efecto, la respuesta a Glu y a D-

Asp depende de la presencia de este ion también (Fig 5 b).

La señalización por PKA y PKC ha sido relacionada con la regulación de GLUT1,

adicionalmente en las CGB de cerebelo de pollo expresan el transportador

sodio/calcio (NCX), mismo que trabaja en conjunto con la activación de GLAST

(Martinez-Lozada et al., 2011). Por lo tanto evaluamos si la inhibición de PKA (por

H9), de PKC (por BisI) y del NCX (por KBR7943) afectaba en la respuesta de la

captura de [H3]2DOG a la exposición de D-Asp. En efecto la figura 5 c muestra que

tanto PKC como el NCX participan en la señalización. Recientemente se encontró

que el transportador GLUT1 puede insertarse en la membrana plasmática gracias a

una fosforilación directa por PKC en S226 (Lee et al., 2015).

En tanto que se ha propuesto que la activación de PKA puede modular la expresión y

el funcionamiento de GLUT1 a periodos largos de horas y a tiempos cortos, donde

adicionalmente se ha mostrado la gran relevancia del calcio intracelular, en un

modelo murino de la barrera hemato-encefálica en que también se expresa GLUT3

(Kim et al., 2012; Meireles et al., 2013). En el presente trabajo no encontramos

participación de la cinasa PKA pero si encontramos un efecto importante de la

presencia de calcio extracelular para la producción del efecto del transporte de GLU

en el transporte del análogo de la glucosa (Fig. 4 b, 5 c).

Adicionalmente comprobamos que el efecto de L-Glu, mimetizado por D-Asp es

dependiente del funcionamiento de los transportadores de Glu expresados en las

CGB, por lo que la figura 5 d muestra que los bloqueadores generales de los EAATs,

THA (transportable) y TBOA (no transportable) abaten el efecto en la captura del

análogo de glucosa. La regulación de GLUT1 por corrientes de sodio y calcio

29

dependientes del funcionamiento de EAATs fue demostrado con anterioridad en

astrocitos de cerebro rata (Porras et al., 2008).

Fig 5. El efecto de Glu en la captura de [H3]2DOG es dependiente de sodio, calcio y es mediado por

los EAATs.

Los dominios funcionales en las membranas celulares facilitan el desenvolvimiento

de funciones metabólicas de manera más eficiente, dada la proximidad física de las

proteínas involucradas en una ruta específica. Por tal motivo exploramos la

posibilidad de que los transportadores GLAST y GLUT1 establezcan una relación

30

más estrecha cada que el neurotransmisor Glu o su análogo D-Asp estén en el

medio extracelular.

La figuras 6 A y B confirman que dichos transportadores co-inmunoprecipitan cuando

las CGB son expuestas con L-Glu o D-Asp, aunque esta posible interacción parece

ser más rápida ya que se evaluó a los 15 min. Este resultado encaja en la dinámica

funcional que ha sido descrita para múltiples proteínas gliales relacionadas al acople

glía-neurona. Por ejemplo los EAAT1 y EAAT2 con subunidades de la ATPasa

Na+/K+, con diversas enzimas glucolíticas y con la mitocondria (Rose et al., 2009;

Genda et al., 2011; Bauer et al., 2012; Whitelaw and Robinson, 2013).

La figura 6 paneles C y D muestras que la regulación de los transportadores de

glucosa puede ser desde un nivel traduccional, ya que las cantidades totales de las

proteínas GLUT1 y GLUT3 aumentan rápidamente en los extractos totales de

proteínas de CGB tratadas por 30 min con Glu y D-Asp. Esto apunta a que una

probable regulación traduccional diferencial exista, ya que se ha demostrado que un

efecto de Glu por 30 min en las CGB es disminuir la tasa global de traducción y

concomitantemente favorece la traducción de proteínas en el rango de peso

molecular de 40 a 60 kDa (Barrera et al., 2008; Flores-Mendez et al., 2013).

31

Fig 6. Asociación bioquímica entre los transportadores de glucosa y de Glu.

32

Fig 7. El transporte de Glu incrementa la expresión membranal de los GLUTs y la función de los

mismos en las membranas plasmáticas de la CGB. En el panel de la izquierda: el Glu en el espacio

extracelular entra a las células gliales junto con tres iones Na+ a través de los EAATs (GLAST), el Glu

sirve de substrato para que la GS forme Gln, mientras que el desbalance electroquímico es

compensado por el trabajo de la ATPasa NA+/K+. Ambos procesos consumenATP, por lo que una

demanda de energía propicia un incremento en la captura de glucosa. En el panel derecho: las

acumulaciones locales de calcio podrian activar a la cinasa PKC, la cual podria tener como blanco

directo alal GLUT1, entonces las reservas intracelulares de GLUTs pueden ser transferidas a la

membrana plasmática, donde pueden trabajar como unidades independientes o diméricas y el

transportador de Glu GLAST/EAAT1 puede estar en e mimo dominio citoplasmático.

33

Conclusión

La captura de glucosa es incrementada por la captura de Glu en la células gliales de

Bergmann, dicho evento está relacionado con el funcionamiento de la cinasa PKC,

con un aumento en la capacidad máxima de captura y con una mayor presencia del

transportador GLUT1 en la membrana plasmática. Adicionalmente se demostró que

existe una aproximación física entre los transportadores GLAST/EAAT1 y GLUT1, la

cual es potenciada por la presencia del neurotransmisor Glu.

34

El Glutamato Regula la plasticidad funcional del transportador de GABA GAT-3 en células gliales de

Müller

35

Introducción

Las células astrogliales se encuentran en contacto estrecho con las neuronas y es

bien aceptado que existe una comunicación bidireccional mediada por diversos

mensajeros químicos liberados en todo el SNC (de Melo Reis et al., 2008). Los

gliotransmisores son moléculas activas liberadas por poblaciones gliales que

modulan varias funciones neuronales, tales como la supervivencia, la diferenciación y

protección neuronal. En este sentido las sinapsis GABAérgicas en el SNC son

conformadas por una estructura tripartita que incluye los elementos neuronales pre-

sinápticos (con vesículas llenas del neurotransmisor), postsinápticos (con los

receptores ionotrópicos GABAA y GABAC y metabotrópicos GABAB) y lo elemento

gliales. La terminación de la transmisión glutamatérgica depende de su captura en la

presinapsis, en la células gliales, en las células ependimarias y en la aracnoides

(Kanner, 2006; Eulenburg and Gomeza, 2010).

El GABA El ácido gamma-aminobutírico o GABA es el principal neurotransmisor inhibidor en el

SNC. La principal fuente de este transmisor en el cerebro es la descarboxilación de

Glu por la enzima Glutamato-descarboxilasa (GAD). Alrededor del 60 del GABA

sintetizado procede de esta ruta, donde puede haber un paso por el ciclo TCA (Leke

et al., 2008).

La enzima GAD se expresa exclusivamente en poblaciones neuronales pero

raramente en glía, lo cual hizo suponerse que ésta últimas no sintetizan GABA,

aunque recientes estudios han reportado concentraciones altas de GABA en

astrocitos del hipocampo (5-10 mM), en astrocitos laminares y en las células de

Bergmann (Lee et al., 2010; Le Meur et al., 2012; Yoon et al., 2014), por lo cual se

intuye la relevancia del elemento glial, además de que existe una intercomunicación

GABAérgica glía-neurona.

36

El GABA Ejerce sus funciones mediante la activación de receptores en la terminales

pre y post-sinánticas, con el objetivo de reducir la liberación de neurotransmisores

excitadores como el Glu y producir las corrientes post-sináptica inhibidoras (IPSCs

por su denominación en inglés) o hiper-polarizar a las neuronas (Liang et al., 2006)

Acople metabólico glía-neurona: El ciclo Glu / GABA/ Gln EL mecanismo mediante los cuales los astrocitos pueden regular la transmisión

GABAérgica es mediante los transportadores y las enzimas. De tal modo que la Gln

liberada por los astrocitos (SNATs, sistema N) es capturada por las neuronas

(SNATs, sistema A), convertida a Glu (GAP, glutaminasa activada por fosfato) y

luego descarboxilada a GABA (GAD), para finalmente ser empacado en vesículas

sinápticas gracias al funcionamiento de otro transportadores, los vGAT.

Adicionalmente, para completar el ciclo hay que considerar que el Glu liberado por

las neuronas y que es capturado en células gliales (EAATs) es convertido a Gln, por

la GS (Bak et al., 2006).

Transportadores de GABA

Se conocen cuatro isoformas de los transportadores de GABA y que pertenecen a la

familia Slc6a: GAT1 (slc6a1), GAT2 (slc6a13), GAT3 (slc6a11) y BGT1 (slc6a12),

mismas que se encuentran todas expresada en las poblaciones gliales, pero el GAT3

es el predominante. Funcionan de manera dependiente de sodio / cloro y de forma

similar que los EAATs, se ha reportado transporte no acoplado, la estequiometría del

transporte de los GAT 1-3 es 2Na+:1Cl-:1GABA, mientras que para BGT1 3Na+:2Cl-

:1GABA (Nelson and Lill, 1994; Zhou and Danbolt, 2013).

La afinidad aparente oscila con valores de KM de 0.8, 8, 18 y 80 µM para el

transporte de GABA en GAT3, GAT1, GAT2 y BGT1, respectivamente. La

identificación de funciones independientes es abordada farmacológicamente, de

modo que el ácido nipecótico y el beta-guanidinopropionato inhiben a los

transportadores GAT1-3, GAT1 y GAT2 tienen una menor IC50 para isoserina, Beta-

37

alanina e hipotaurina, mientras que tiagabina es altamente selectivo para GAT1

(Zhou and Danbolt, 2013).

En cultivos primarios de células de Glía de Müller de pollo se he determinado que el

transportador GAT3 es la principal ruta de captura de GABA, así mismo es sensible a

β-alanine y Zn2+, pero no a NNC-711 (De Sampaio Schitine et al., 2007).

Células gliales de Müller Las células de Müller (CGM) son el principal componente glial de la retina de los

vertebrados, atraviesan todas las capas de la retina: desde la superficie del humor

vítreo hasta el fondo sub-retiniano. Dan soporte al metabolismo y funcionamiento de

todas las neuronas, son elementos activos en el sistema de la visión; además

contactan los vasos sanguíneos y sirven de conducto para productos de desechos,

iones, agua y otras moléculas (Reichenbach and Bringmann, 2013).

La células de Müller (M) se expanden a lo largo de toda la retina y están organizado en un patrón regular. Esquema de la retina humana. El pericarion de las células de Müller se ubica en la capa nuclear interna (INL). Los pies terminales de la M y lo astrocitos (AG) dan forma a la capa interna de la retina y contactan con los vasos sanguíneos. Los procesos basales de las M (ONL) capa nuclear externa envuelven el pericarion de los fotoreceptores (PRS). Las células microgliales (MG) se localizan en la capa plexiforme y en la capa ganglionae (GCL). (A) células amacrinas, (B) células bipolares, (G) células ganglionares, (H) células horizontales, (P) pericitos y (RPE) Epitelio pigmentoso de la retina (Reichenbach and Bringmann, 2013).

38

Planteamiento del problema El transporte de GABA en los cultivos primarios de CGM es atribuible a GAT3 y

disminuye alrededor del 60 % cuando el cultivo es expuesto a medio condicionado

(MC) de cultivos neuronales de retina. Considerando que el MC es filtrado, es

probable que un neurotransmisor, quizá el excitador mas abundante, el Glu, sea el

causante de este efecto.

39

Resultados y discusión Anteriormente se ha demostrado que el cultivo purificado de CGM obtenido a partir

de retinas de embriones pollo expresa los transportadores GAT1 y GAT3, captura

[3H]GABA de manera dependiente del tiempo, de la concentración de sustrato,

necesita de sodio y cloro, además de que se inhibe con bajas temperaturas y

farmacológicamente se identificó una preponderancia en el funcionamiento de GAT3,

de alrededor del 80% de la captura de [3H]GABA. Dichos cultivos fueron expuestos a

medio condicionado de cultivo de neuronas (MC) durante 24 h, lo cual produjo un

decremento en la actividad de captura de [3H]GABA de aproximadamente 60% (De

Sampaio Schitine et al., 2007). Dado que ese medio enriquecido no contenía células

ni proteínas y que el Glu es el principal neurotransmisor del SNC, decidimos indagar

si era el Glu, el agente causante de tal decremento en el sistema de captura de

[3H]GABA en el cultivo primario de CGM.

A como se observa en la Fig 1a, la exposición a 2 mM de Glu produjo un 50 % de

decremento en la captura de [3H]GABA con una magnitud semejante a la inducida

por el MC, mismo que desapareció al pre-exponer el cultivo a dos inhibidores de

receptores ionotrópicos glutamatérgicos, MK-801 (antagonista no competitivo de

receptores tipo NMDA) y DNQX (inhibidor competitivo de receptores tipo AMPA).

Consecuentemente era necesario indagar si solo la despolarización de la membrana

con 80 mM de KCl era capaz de disminuir la captura de [3H]GABA, en efecto se

redujo la captura de [3H]GABA en proporciones semejantes a las producidas por Glu,

no así en presencia de MK-801 y DNQX (Fig 1b). Por lo tanto puede suponerse que

Glu u otro mensajero químico liberado por las mismas CGM sea el agente causal, ya

que también se ha mostrado que el KCl produce la liberación de Glu y ATP de CGM

de aves (Loiola and Ventura, 2011). Entonces decidimos medir por HPLC la cantidad

de Glu contenida tanto en el CM como en el medio DMEM-F12 fresco, sin embargo

no se encontró diferencia significativa (Fig 1c); lo cual sugiere que algún elemento

adicional puede producir la liberación de Glu del mismo CGM cultivo; uno de estos

elementos puede ser la D-Serina, ya que se ha mostrado ser liberada en la retina de

40

vertebrados y que puede activar al receptor glutamatérgico tipo NMDA (Gustafson et

al., 2015).

Si un neurotransmisor como el Glu produce los cambios en el sistema de captura de

GABA, es necesario conocer si existen corrientes entrantes de calcio en las CGM.

Para este efecto se recurrió a la técnica de Imagen de calcio de una sola célula

(SCCI, por su nombre en inglés) usando la sonda fluorescente Fura2-AM. El panel e

de la fig. 1 muestra la imagen de un experimento, analizando la respuesta a 2 mM de

Glu (flecha en el gráfico, panel d) en 30 ROIs (Regiones de Interés) que representan

30 células de Müller. El incremento de dos veces la proporción de emisión de

fluorescencia entre las longitudes de onda (F340/380) indica incremento en iguales

magnitudes del contenido de calcio intracelular (panel d).

Fig 1. El Glu y el medio condicionado por neuronas de retina de pollo disminuyen la captura de

[3H]GABA en la CGM. (A) el Glu (2 mM) o MC (1:1 v/v con medio del cultivo de CGM) obtenido de

cultivos de neuronas de la retina de pollo inducen una diminución de alrededor de 50% en la captura

de [3H]GABA hasta por 2 h, lo cual es prevenido por la pre-incubación de 10 uM MK-801 y 70 uM

DNQX. (B) EL efecto es mimetizado por 80 mM de KCl y también inhibido por la presencia de los

D) E)

41

agonistas MK-801 y DNQX. (C) Contenido de Glu en el MC y medio nuevo (DMEM-F12), determinado

a través de HPLC-ED. (D) Detección de los niveles de calcio intracelular a través de la sonda

fluorescente Fura-2 AM, el estímulo de 2 mM Glu es indicado por la flecha en la gráfica. (E) Imagen

representativa del análisis de imagen de calcio de una sola células, se muestran 30 campos de interés

indicados por los círculos sobre las células seleccionadas en la imagen.

El efecto de Glu sólo es observable a concentraciones elevadas, como 1 y 2 mM

(Fig. 2 a), lo cual podría justificarse por la alta densidad de transportadores de Glu

que en las células gliales existe (Gadea et al., 2004). Este efecto se presenta desde

los 10 min hasta las 48 h en que fue evaluado (Fig. 2 b). Sin embargo una relación

dosis-respuesta robusta, próxima a los 30 uM fue encontrada en concentraciones

crecientes de los agonistas glutamatérgicos kainato (Fig. 2 c) y NMDA (Fig. 2 d).

Dicho efecto del agonista NMDA depende de la ausencia de Mg2+ y es bloqueado por

el antagonista MK-801 (Fig. 2 e). Debido a que la activación de los receptores

metabotrópicos glutamatérgicos del grupo I activa a la Fosfolipasa C (PLC) y

desencadena la liberación de calcio desde los almacenes intracelulares y a que ha

sido mostrada como regulador de GAT1 (Beckman et al., 1999), evaluamos si la

activación por DHPG emulaba el efecto de Glu, sin embargo esta ruta parece no

participar en el efecto inducido por Glu (Fig. 2 c).

42

Fig 2. Los receptores glutamatérgicos aumentan la captura de [3H] GABA en CGM. El efecto de Glu

sobre la captura de GABA se presenta a altas concentraciones de 1 y 2 mM (A) y desde los 10 min

hasta las 48 h (B). Curvas de dosis-respuesta de Kainato (C) y NMDA (D) en solución sin Mg2+ para la

disminución de la captura de [3H]-GABA. (E) El efecto NMDA en la captura de GABA es bloqueado por

la presencia de iones de Mg2+ y del antagonista específico para receptores tipo NMDA, MK801.

Diferentes concentraciones del agonista de la familia I de receptores metabotrópicos, DHPG, no tienen

efecto sobre la captura de [3H]GABA en CGM. *p < 0.05.

Considerando que se ha reportado que PKC fosforila a GAT1 y promueve su

distribución sub-celular en neuronas del hipocampo (Beckman et al., 1999),

decidimos evaluar la activación de PKC mediante concentraciones crecientes de su

activador específico PMA. El panel b de la figura 3 muestra una relación dependiente

de dosis con una IC50 de 300 nM; sin embargo el efecto de Glu no depende de esta

cinasa, ya que la pre-incubación de varios inhibidores de PKC como: estaurosporina,

43

calfostina C, Ro 320432 y Bis I (no mostrado), no revertieron la disminución en la

captura de [3H]GABA (Fig. 3 b).

La proteína cinasa A (PKA) ha sido descrita como moduladora del funcionamiento de

GAT1 en la retina de aves (Ferreira et al., 2014), donde la activación de dicha cinasa

puede ser mediada por receptores D1A, D1B para dopamina y por receptores a

PACAP, como ha sido específicamente mostrado para el cultivo purificado de CGM

(Kubrusly et al., 2005). Por tales motivos evaluamos diversas señales que

desencadenan la activación de PKA; tales como Forskolina, el agonista sintético de

D1 (SCH23390) o PACAP, pero ningua de ellas tuvo efecto en la disminución de la

captura de [3H]GABA aun en la presencia de 2 mM de Gu (Fig. 3 c). Considerando

que existe una interacción entre la señalización glutamatérgica (receptores tipo

NMDA y AMPA) y del ATP (a través de su receptor P2X7) produciendo muerte

neuronal en cultivos mixtos glía de Müller-neuronas de retina de pollo (Anccasi et al.,

2013), evaluamos si la entrada de calcio mediada por ATP y por su receptor

purinérgico P2X7 mediaban la señalización de Glu, sin embargo no se observó

efecto en la activación o bloqueo de tal receptor mediada por Azul brillante G (BBG)

(Fig. 3 d).

44

Fig 3. El efecto de Glu sobre la actividad de GAT3 no depende de la activación de PKC. (A) La captura

de [3H]GABA en las CGM es dependiente de la actividad de PKC, una curva dosis-respuesta con

concentraciones crecientes de su activador PMA aproxima una IC50 de 300 nM. (B) La pre-incubación

de diversos inhibidores de PKC (100–500 nM estaurosporina, 100 nM Calfostina C o 1 µM Ro 32–

0432) no previene el efecto de Glu sobre la captura de [3H]GABA. (C) Efecto de la activación de PKA.

La aplicación aislada de PACAP38 (Polipéptido de la pituitaria activador de la enzima adenilato

ciclasa)o concomitante de: forskolina (FK, activador de la enzima adenilato ciclasa), SCH23390

(antagonista del receptor metabotrópico D1), H89 (inhibidor de PKA) o PACAP6-38 (antagonista del

receptor para PACAP38) con 2 mM de Glu no intervino en la disminución de la captura de [3H]GABA.

(D) La adición de 0.01 a 1 mM de ATP o de 100 nM del colorante Azul brillante G (BBG, inhibidor de

P2X7) no tuvo efecto en la acción inhibitoria de Glu sobre captura de [3H]GABA. *p < 0.05.

Retomando que la señalización vía PKC, PKA o diversas moléculas señalizadoras no

se relacionan con la disminución en la captura de [3H]GABA generada por Glu,

decidimos describir el efecto sobre los transportadores. De este modo evaluamos por

inmunodetección en fase sólida la cantidad de GAT3 que se encuentra en la

membrana citoplasmática, a través del marcaje con biotina de las proteínas de la

superficie celular y su separación por acople a avidina del extracto total de proteínas.

En la figura 4 a observamos un experimento representativo y en el panel b se

resumen tres experimentos independientes, mostrando que 1 y 2 mM de Glu

producen un desplazamiento de GAT3 hacia la fracción citoplasmática. De igual

forma encontramos que el Glu induce la disminución en la cantidad de RNA

mensajero de GAT1 y GAT3 tras 2h de estímulo (no mostrado).

45

Fig 4. Los niveles de expresión de GAT3 en la membrana celular son modulados por Glu. El

tratamiento por treinta minutos con cantidades crecientes de Glu (1 y 2 mM) aumentan la cantidad de

GAT3 en la fracción biotinilada (membrana citoplasmática) y la disminuye en el sobrenadante

(citoplasma). La menor inmunodetección de alfa-actina en la fracción biotinilada y mayor en la

citoplasmática son mostradas como controles. (B) Se grafican los valores promedio de tres

experimentos independientes +/- SEM, . *P < 0.05, **P < 0.01 (NS vs. Glu, fracción biotinilada), +P <

0.05 (NS vs. Glu, fracción citoplasmática). Se evaluó la presencia del transportador GAT3 desde la etapa embrionaria hasta la

posnatal fue evaluada a través de extractos proteicos totales de la retina de pollo. La

figura 5 muestra una presencia constante, aunque una mayor abundancia a partir del

día embrionario 16 y principalmente en la etapa post-natal.

46

Fig 5. Ontogénesis en la retina de pollo del transportador GAT3. Inmunodetección en fase sólida de

GAT3 y ERK total durante el desarrollo de la retina de pollo.

Finalmente decidimos evaluar la presencia de GAT3 en la retina de pollos. De este

modo se encontró que en condición control (solo inyección de PBS) el GAT3 se ubica

mayormente en las capas plexiforme interna (IPL) y en la nuclear interna (INL),

donde se encuentran la mayor cantidad de las células amacrinas. Por su parte las

CGM, marcadas por su antígeno específico 2M6 (Schlosshauer et al., 1991) no

presentan co-localización con GAT3 (Fig. 6 a). Un protocolo bien conocido de neuro-

degeneración de la retina tras 15 días de la aplicación in situ de 2 µmol de NMDA

(Fischer and Reh, 2001) fue efectuado en el ojo derecho de pollos de 10 días,

mientras que en el ojo control (izquierdo) solo se inyectó el mismo volumen de PBS.

Esta lesión fue corroborada mediante el disminución del grosor de las capas de la

retina, visible con el marcaje de los núcleos (Fig. 6 b), con la disminución en la

detección de Brn3a (marcador específico de las células ganglionares) de los paneles

c al d en la fig. 6 y el aumento de la proteína GFAP (proteína acídica fibrilar glial)

como indicador de astrogliosis característica de una lesión (Fig. 6 e vs. f). El patrón

de marcaje para GAT3 se modificó tras la lesión, de modo que esta condición

patológica favorece la colocación con 2M6 (recuadro de la Fig. 6 b), de modo que las

fibras radiales de CGM ahora más visibles muestran la presencia de GAT3. Estos

resultados sugieren una regulación positiva en la expresión de GAT3 en las CGM,

probablemente a causa de la gliosis reactiva producto de la lesión en la retina. De

47

manera interesante, también el cultivo primario de las CGM presentan el

transportador de GAT3 en la membrana celular dos semanas después de la siembra

(Fig. 6 g).

Fig 6. Inmunodeteción de GAT3 en la retina de pollo adulto y en el cultivo purificado de CGM. (A) En la

condición control (ojo izquierdo, inyectado con PBS) el marcaje de GAT3 (rojo) es visible en la capa

Plexiforme interna (IPL) y en algunos somas en la capa nuclear interna (INL). Las CGM son visibles a

través de su antígeno específico: 2M6 (verde), sin co-localización con GAT3. (B) La lesión

neurodegenerativa inducida por la inyección de NMDA (ojo derecho) induce la expresión de GAT3

48

(rojo) en porciones mas internas de la retina, mostrando co-localización con el marcaje de 2M6 (verde)

característico de CGM, probablemente en los pies terminales de las CGM (amarillo, indicado por las

flechas). El recuadro es un acercamiento del área indicada en B, la cual muestra la co-localización de

los marcajes verde y rojo (2M6 y GAT3). (C) Abundante expresión del marcador específico de células

ganglionares de la retina, Brn3a, (RGC, en verde) en la condición control con PBS, (D) mientras que

en la lesión con NMDA se observa un marcado decremento en a inmuodetección de Brn3a. La

Proteína Acídica Fibrilar Glial (GFAP, rojo) muestra niveles bajos en la condición normal (E), mientras

que en la lesión con NMDA se incrementa, un signo de astrogliosis (F). El cultivo purificado de CGM

muestran al marcador prototípico 2M6 (verde) y expresan al transportador GAT3 (puntos amarillos y

naranja). Las capas de la retina son identificadas convencionalmente con sus siglas en inglés: ONL,

capa nuclear externa; OPL, capa plexiforme externa; INL, capa nuclear interna; IPL, capa plexiforme

interna; GCL, capa de células ganglionares. N = 4. La escala de las barras en los paneles es: 50 µm

en B, 10 µm en D, 50 µm en F y 10 µm en G. Considerando que la expresión de GAT3 es evidente en las CGM después de la

neurodegeneración en el presente estudio, podemos inferir que en el caso de

cualquier lesión in vivo de la retina, isquemia por ejemplo, ésta puede ser potenciada

debido a la disminución en el tono inhibitorio causado por un aumento en el

transportador de GABA en las CGM. Sería interesante considerar las herramientas

farmacológias que podrían reducir la captura de GABA y aumentar el tono inhibitorio

en las lesiones con el objetivo de disminuir la excitotoxicidad. El cultivo primario de

las CGM y la retina de aves parecen un modelo de estudio adecuado para evaluar

procesos moleculares relacionados con la neurodegeneración de la retina.

Las CGM son unidades neuroquímicamente plásticas porque contactan una amplia

diversidad de ambientes a lo largo de la retina (GABA, Gly, Glu, dopamina y

acetilcolina). De este modo se ha reportado que presentan receptores y

tansportadores Glutamatérgicos, GABAérgicos, receptores y enzimas del sistema

dopaminérgico; además de que se ha visto que pueden suplir un funcionamiento

dopaminérgico y han sido usadas en terapia celular de reemplazo de fotoreceptores

(Kubrusly et al., 2005; Kubrusly et al., 2008; Stutz et al., 2014). En este sentido el

presente trabajo aporta conocimiento referente a la plasticidad en el sistema

GABAérgico en condiciones semejantes a procesos patológicos.

49

Conclusión

En este trabajo demostramos que el Glu, actuando a través de sus receptores

ionotrópicos, señaliza para reducir la función del sistema de transporte de GABA. Se

observó un marcado decremento en la captura de [3H]GABA en los cultivos de CGM

expuestos a Glu.

50

El Glutamato regula su propia captura a través de receptores ionotrópicos en la línea celular humana

MIO-M1

51

Introducción El Glu es el principal neurotransmisor excitador en el cerebro y en la retina, ejerce

sus acciones a través de la activación de receptores ionotrópicos y metabotrópicos

específicos (Coutinho and Knopfel, 2002; Rojas and Dingledine, 2013). La sinapsis

glutamatérgica es terminada mediante la remoción del Glu mediante transportadores

dependientes de sodio de alta afinidad. Actualmente se han identificado 5 variantes:

del EAAT1 al 5; de las que se reconoce a EAAT1 y EAAT2 (conocido como GLAST,

homólogos no humanos) como las principales isoformas de células gliales, mientras

que EAAT3, 4 y 5 se localizan predominantemente en células de Purkinje y en

neuronas de la retina (Rothstein et al., 1996; Arriza et al., 1997; Gadea and Lopez-

Colome, 2001)

Entre estos transportadores, EAAT1 se expresa a través del SNC durante el

desarrollo temprano, mientras que su expresión disminuye y se restringe a

poblaciones de glías radiales en tejidos ya diferenciados, como en el cerebelo, la

retina y el bulbo olfatorio, donde EAAT1 es responsable de alrededor del 90% de la

captura de Glu (Danbolt, 2001) y por lo tanto son elementos necesarios en el ciclo de

Glu entre glía y neurona.

En el ciclo de la visión, el Glu es el principal transmisor excitador, sigue una ruta

vertical que va desde los fotoreceptores hasta las células ganglionares. La liberación

continua de Glu desde los fotoreceptores se mantiene durante la oscuridad, es

modulada por la luz. En la capa plexiforme externa (IPL), las células bipolares-ON

liberan Glu durante la exposición a la luz, mientras que las células bipolares-OFF

liberan el mismo neurotransmisor en la oscuridad. Los fotoreceptores y las células

bipolares no generan potenciales de acción, sino que responden con potenciales

graduales que a su vez modulan la liberación tónica de Glu. En tal sistema es

evidente la necesidad de un control estrecho en las cantidades de Glu en la

hendidura sináptica, para lo cual es remarcable la participación de las células gliales

de Müller, mismas que adicionalmente participan en la modulación de la transmisión

excitadora, debido a su proximidad y contacto con la neuronas a lo ancho de las

52

capas de la retina. EAAT1 es el principal transportador en las células de Müller, se

localiza en los procesos que ramifican extensivamente dentro de las capas

plexiformes externas e internas, envolviendo los contactos sinápticos (Copenhagen

and Jahr, 1989; Juusola et al., 1996; Newman and Reichenbach, 1996; Rauen et al.,

1998).

En nuestro grupo de trabajo previamente caracterizado los receptores a Glu en las

células de Müller, acoplados a la cascada de fosfoinosítidos, a la entrada de calcio y

la activación de PKC y de las proteínas cinasas activadas por mitógeno (MAPK)

(Lopez-Colome et al., 1993; Lopez-Colome and Ortega, 1997; Lopez-Colome et al.,

1997; Lopez et al., 1998). Igual se ha encontrado un incremento en la unión del factor

de transcripción AP-1 a DNA mediada por receptores de Glu (Lopez-Colome et al.,

1995). También se ha demostrado que el transporte de Glu dependiente de sodio es

regulado por la activación de la cinasa PKC (Gonzalez et al., 1999). Pese a que las

descripciones de modelos de células Gliales de Müller son abundantes, el

conocimiento en tanto a estirpes humanas es escaso.

Línea celular humana MIO-M1 Las células gliales de Müller son poblaciones de glía radial que sobreviven hasta la

etapa adulta, atraviesan verticalmente todas las capas d la retina y sus somas se

encuentran en la capa plexiforme interna (IPL), donde se ubican la mayoría de los

tipos de células amacrinas, muestran una bipolaridad ya que se distingue claramente

una región distal donde establecen contactos con los fotoreceptores y otra proximal

donde junto con la membrana basal constituyen la membrana limitante interna,

próxima a la capa de las células granulares (Limb et al., 2002).

Las células gliales de Müller presentan una plasticidad neuroquímica que representa

la diversidad de ambientes que contacta a lo largo de la retina. De este modo se ha

reportado que presentan receptores y transportadores Glutamatérgicos,

GABAérgicos (tipo B), receptores dopaminérgicos como D1A y D1B, las enzimas

tirosina hidorxilasa y L-dopa descarboxilasa, además de que se ha visto que pueden

53

suplir un funcionamiento dopaminérgico y han sido usadas en terapia celular de

reemplazo de fotoreceptores (Kubrusly et al., 2005; Kubrusly et al., 2008; Stutz et al.,

2014). Estas células son igualmente importantes en procesos patológicos, en la

recuperación de lesiones, en la re-vascularización y participa en desórdenes de

proliferación en la retina(Limb et al., 2002).

Las células MIO-M1 recibieron su nombre del lugar de obtención de la muestra

(Moorfields/Institute of Ophthalmology-Müller 1), en Londres, Reino Unido y del

número de la clona. La cual fue obtenida por inmortalización espontánea a partir de

tejidos retinianos procedentes de donación post-mortem (36 h posterior a la muerte)

de una mujer de 68 años. La expresión de marcadores moleculares como el factor de

crecimiento epidermal (EGF), la vimentina, la proteína celular de unión a

retinaldehído (CRALBP, no expresada por astrocitos) y la enzima glutamina sintetasa

(GS) fue corroborada hasta el pase 45. Sin embargo se observaron aneuploidías

cromosómicas a partir del pase 43. La morfología, textura de la membrana,

bipolaridad de las células, conexiones inetercelulares y características subcelulares

de las células MIO-M1 corresponden bien con las observadas en cultivos primarios

de células gliales de Müller (Limb et al., 2002).

Planteamiento del problema El transporte de Glu es auto-regulado en algunos sistemas, por tal motivo exploramos la participación de los receptores de Glu en la regulación de EAAT1 en la

línea celular human MIO-M1.

54

Resultados y discusión Entre las múltiples funciones descritas para las células de Müller se encuentra la

terminación de la neurotransmisión glutamatérgica, mediante la captura de alta

afinidad de este neurotransmisor. La células MIO-M1 expresan el transportador

EAAT1, a como se observa en el panel a de la fig. 1, donde se muestran como

controles los extractos totales de células de Bergmann de cerebelo de pollo y de

cerebro de rata, la inmunodetección próxima al marcador de peso molecular de 66

kDa corresponde al peso estimado de 60 kDa en humanos. El patrón de bandeo

amplio que se observa en la imagen puede corresponder a diferentes perfiles de

glicolisación que han sido observados en tejidos humanos versus de rata (Bauer et

al., 2010), además de que la estructura de los transportadores de Glu presenta una

extensa asa extracelular glicosilada, entre las porciones trans-membranales TM3 y

TM4 (Kanai et al., 2013).

La captura de [3H]DAsp es saturable a tiempo y dosis creciente del sustrato, a como

puede observarse en los paneles b y c de la fig.1. La concentración de la molécula

radiomarcada corresponde a 31 nM en todos los experimentos. Se observa un

equilibrio de transporte próximo a los 30 min, por lo cual los ensayos subsecuentes

evaluaron la captura al mismo tiempo. El análisis de la curva de saturación de

transporte (Fig. 1 c) mostró una KM con valor de 18 µM y una Vmax de 75

pmol/min/mg de prot. Estos valores corresponden bien con los reportados en otras

preparaciones (Danbolt, 2001).

55

Fig. 1 Expresión de EAAT1 en las células Mio-M1. (a) Una cantidad igual de extractos de proteína (50

µg) de cerebelo de rata, células Mio-M1 y células gliales de Bergmann fueron cargadas en cada carril.

Se aprecia la banda de 60 kDa en todas las muestras. Una imagen representativa de tres

experimentos similares. (b) Captura basal de [3H]D-Asp a 0, 5, 10, 20, 30 y 60 min. (c) Curva de

saturación de influjo de [3H]D-Asp en células Mio-M1 a treinta minutos en presencia de

concentraciones crecientes de D-Asp no marcado (0, 10, 25, 50, 100 y 200 µM). El análisis cinético

identificó una Vmax de 75 pmol/min/mg Prot. y una KM de 18 µM. Los valores graficados representan el

valor promedio ± SEM de tres experimentos independientes realizados por cuadruplicados.

En otros modelos de células gliales de Müller ha sido evidente que la exposición a

Glu regula la actividad de captura del mismo neurotransmisor (Gadea et al., 2004).

Por tal motivo indagamos si la exposición la exposición a Glu, a sus agonistas o

antagonistas produce algún cambio en la actividad de captura de [3H]D-Asp. Asi

observamos que AMPA y NMDA+L-Gly inducen un incremento alrededor de 50% en

la actividad de captura, en caso contrario el D-Asp y L-Glu inducen un decremento

significativo, el cual es mimetizado en menor medida por el agonista transportable

THA; por tal motivo la pre-incubación del antagonista de receptores tipo NMDA, MK-

801, evitó el aumento significativo en la captura de [3H]D-Asp (Fig. 2 a).

56

De forma semejante a lo encontrado en células gliales de Müller de pollo (Gadea et

al., 2004), el transporte de Glu o de su análogo transportable, el D-Asp, es

disminuido mediante su propia captura (Fig. 2 a y b), ya que la reducción en dicha

actividad no es revertida mediante la incubación de antagonistas ionotrópicos

(DNQX) y metabólicos (L-AP4). De manera importante se resalta que la activación de

receptores ionotrópicos, mayormente del tipo NMDA, aumenta la captura de [3H]D-

Asp, lo cual es segregado del efecto global de solo exponer a L-Glu los cultivos,

donde parece prevalecer el efecto mediado por el abundante sistema de transporte.

Fig. 2 La activación de receptores ionotrópicos tipo AMPA y NMDA incrementan la captura de [3H]D-

Asp en las células Mio-M1. (a) Los cultivos confluentes fueron pre-expuestos treinta minutos al

antagonista glutamatérgico MK-801 (10 µM) y al bloqueador transportable THA (0.1 mM). Los

estímulos de treinta minutos fueron aplicados AMPA (1 mM), NMDA+L-Gly (0.5 y 0.01 mM,

respectivamente), D-Asp (1 mM) y L-Gu (1 mM), posteriormente se midió la actividad de captura de

[3H]D-Asp por 30 min adicionales. (b) El efecto de diferentes antagonistas glutamatérgicos fue

analizado mediante la pre-incubación por 30 min de DNQX (50 µM) y L-AP4 (10 µM), posteriormente

se estimuló con L-Glu (1 mM) y se procedió a medir la actividad de captura. Los valores representan el

valor promedioa ± SEM de tres experimentos independientes, las diferencias entre la condición no

estimulada (NS) y las condiciones experimentales fueron analizadas mediante análisis de variancia de

una sola vía y prueba de comparación múltiple de Dunnett (***p < 0.001; **p < 0.01; *p < 0.05).

Las respuestas rápidas en los transportadores mayormente corresponden a trafico

entre el compartimiento sub-celular y la membrana plasmática, por lo tanto es preciso

saber si la reducción en el influjo de [3H]D-Asp corresponde a un cambio en la

afinidad del transporte o en la capacidad máxima del transporte. Para tal efecto

57

evaluamos la actividad de captura a diferentes concentraciones del sustrato

transportable D-Asp (Fig. 3 a). De este modo encontramos semejanza entre las

curvas de la condición control (NS), del antagonista sólo (MK-801) y del antagonista

más el estímulo (MK-801 + NMDA+L-Gly), en caso contrario, la sola activación de los

receptores de NMDA produjo un aumento significativo en la velocidad máxima y no

así en la afinidad aparente (KM). Esto parece indicativo de que una mayor inserción

de transportadores en la membrana plasmática es inducida por efecto de los

receptores tipo NMDA. Adicionalmente una biotinilación e inmunodetección en fase

sólida corroboró este supuesto, ya que la fracción de la membrana plasmática

presenta mayor inmunodetección de EAAT1, no así en la fracción citoplasmática

donde no se aprecian cambios significativos y solo una tendencia a disminuir la señal

de EAAT1 (Fig. 3 b).

La incubación de concentraciones saturantes de 1 mM de L-Glu seguramente

permiten el trabajo y señalización eficiente tanto de receptores como de

transportadores, por lo tanto, existe la posibilidad de que no todos los

transportadores EAAT1 aumentados por el estímulo de L-Glu (Fig. 3 b) estén

efectivamente funcionando en la membrana (Fig. 2 a, b), a como puede ser sugerido

por la dependencia de EAAT1/GLAST a asociaciones con proteínas de andamiaje o

asociadas al citoesqueleto (Fig. 4) (Lopez-Colome et al., 2012).

58

Fig. 3 La activación del receptor tipo NMDA promueve el aumento de EAAT1 en la membrana

citoplasmática. (a) Las monocapas de células Mio-M1 fueron mantenidas en la solución de ensayo sin

tratamiento (NS), con NMDA-Gly (0.5 y 0.01 mM, respectivamente), pre-expuestas al antagonista MK-

801 (50 µM) y Mk-801 + NMDA+L-Gly durante 30 min, posteriormente se midió la actividad de captura

de [3H]D-Asp en concentraciones saturantes de D-Asp no marcado (0, 25, 50, 100 y 200 µM). Los

datos graficados son el valor promedio ± SEM de un experimento representativo de tres

independientes con tendencia semejante. (b) Los cultivos fueron expuestos durante 30 min a 1 mM de

L-Glu y a NMDA+L-Gly, posteriormente se marcaron las proteínas de la superficie celular con biotina.

Los extractos proteicos fueron separados por acople con avidina para obtener la fracción biotinilada

(proteínas de la membrana celular) y el sobrenadante (proteínas intracelulares). Se muestra la

inmunodetección en fase sólida de EAAT1 y se grafican el valor promedio de 5 experimentos

independientes ± SEM. Los análisis estadísticos fueron una ANOVA de una via más una prueba

múltiple de Dunnett para identificar las diferencias significativas respecto al control (***p < 0.001; **p <

0.01).

Con la intención de describir los mecanismos moleculares que puedan explicar el

incremento en los niveles de EAAT1 en la membrana plasmática, exploramos su

posibilidad de asociación proteína-proteína con Ezrina y GFAP, elementos

importantes en complejos proteicos de andamiaje (Nijboer et al., 2013). La figura 4

59

muestra que la asociación más fuerte de EAAT1 con proteínas asociadas al

citoesqueleto y de andamiaje aumenta con la presencia de los estímulos. Una mayor

inmunodetrección de Ezrina y p-Ezrina (Tyr354) fue encontrada cuando las células

fueron expuestas a NMDA+L-Gly (Fig. 4 a, b), mientras que la interacción con GFAP

fue mayor tanto con L-Glu como con NMDA+L-Gly (FIg. 4 c). Estas asociaciones

fueron corroboradas con el proceso inverso, inmunoprecipitando con GFAP, ezrina

total, p-Ezrina e inmunodetecctando a EAAT1 (Fig. 4 d).

La proteína GFAP es un miembro poco estudiado del citoesqueleto, pese a que en la

descripción inicial de las células MIO-M1, la detección baja de esta proteína y en

pocas células es considerado como un punto a favor ya que convencionalmente se le

relaciona a procesos de astrogliosis y lesiones del sistema nervioso (Limb et al.,

2002), en los últimos años se ha encontrado que GFAP se asocia a proteínas ERM

(“actin associated ezrin, radixin an moesin proteins”), partiendo desde el

citoesqueleto hasta fuera de la membrana celular (Derouiche and Frotscher, 2001).

Por lo tanto una relevancia en el anclaje de proteínas en la membrana fue inferida.

Posteriormente se describió la importancia funcional de la interacción de GLAST con

NHERF1, Ezrina y GFAP; pese a que no se considera que halla una asociación

directa GLAST-GFAP, el formar parte del mismo complejo aumenta la posibilidad de

que GLAST se encuentre en la membrana citoplasmática, además de que GFAP

parece contribuir a la estabilidad de los procesos astrocíticos (Derouiche and

Frotscher, 2001). Por lo tanto, el hecho de que tanto L-Glu como NMDA+L-Gly

aumenten la interacción de EAAT1 con GFAP (Fig. 4 C) concuerda con que

encontremos una mayor inserción de dicho transportador en la membrana celular

(Fig. 3 b), pero el hecho de que el transporte de [3H]D-Asp disminuya con L-Glu

puede explicarse también por la falta de proteínas importantes en el complejo

funcional de EAAT1/GLAST, como la ezrina (Fig. 4 a, b) (Sullivan et al., 2007; Nijboer

et al., 2013).

60

Fig. 4 Interacción de EAAT1 con proteínas asociadas al citoesqueleto. Las células Mio-M1 fueron

tratadas durante 30 min con 1 mM de L-Glu o NMDA+L-Gly (0.5 mM. 0.01 mM, respectivamente),

entonces los extractos proteicos pre-absorbidos de de IgG fueron incubados con anticuerpos anti-

EAAT1 acoplados a Proteína A-agarosa. Se muestra la imagen representativa de uno de tres

experimentos independientes para la inmunodetección en fase sólida (WB) de p-Ezrina en Tyr354 (a),

Ezrina total (b) y GFAP (c). (d) Después del mismo tratamiento previamente descrito, los extractos

fueron inmunoprecipitados con GFAp, Ezrina, y p-Ezrina y se inmuno-detectó a EAAT1. Las gráficas

representan el valor promedio ± SEM. Los análisis de ANOVA de una vía más una prueba de

comparación multiple de Dunnett identificó diferencia significativa respecto del control (***p < 0.001;

**p < 0.01).

61

El presente trabajo también sugiera un papel funcional para el complejo EAAT1-

GFAP en condiciones basales, sin embargo se sugiere que en condiciones

patológicos, como hipoxia, estas relaciones porteína-proteína se modifiquen de modo

que los transportadores de L-Glu se han observado des-localizados y las

proyecciones astrocíticas retraídas, explicando así parte de la excitotoxicidad

comúnmente observada (Nijboer et al., 2013).

Una caracterización detallada del efecto de Glu a través de activar a sus receptores o

de sus transportadores, está comenzando a estudiarse (Fig. 5).

Fig. 5 El Ca2+ extracelular y la activación PKC están involucrados en el aumento en el aumento de la

captura de [3H]D-Asp en las células Mio-M1. La células fueron pre-incubadas por 20 min en las

siguientes condiciones: medio libre de calcio (wo/Ca2+), el inhibidor de PKC Bisindolylmaleimide (BisI,

1 µM), el antagonista de calmodulina N-(6-aminohexyl)-5-chloro-1- naphthalenesulfonamide

hydrochloride (W-7, 25 µM), el bloqueador no transportable de los EAATs (TBOA, 100 µM) o con el

inhibidor de la síntesis de proteínas cicloheximida (Chx, 10 µg /ml). Posteriormente las células fueron

estimuladas con NMDA+L-Gly (0.5 mM y 0.01 mM, respectivamente) durante 30 min y se procedió a

medir la actividad de captura de [3H]D-Asp. Los valores representan el valor promedio ± SEM de tres

experimentos independientes, evaluados mediante una ANOVA de una solo vía y una comparación

múltiple de Bonferroni para todos los pares de columnas, Control vs. su respetivo tratamiento,

identificado con el mismo patrón (***p < 0.001; **p < 0.01; *p < 0.05).

62

Conclusión Describimos la participación de los receptores ionotrópicos glutamatérgicos en la

regulación de EAAT1 en la línea celular humana MIO-M1. La activación de los

receptores tipo AMPA y NMDA conducen a un aumento en la captura de [3H]D-Asp,

pero concentraciones elevadas de L-Glu promueven un decremento en la actividad

de captura. La activación de los receptores tipo NMDA inducen una mayor presencia

de trnasportadores EAAT1 en la membrana plasmática, lo cual se corresponde con

una mayor asociación de EAAT1 con GFAP y Ezrina, sin embargo L-Glu no incluye a

la proteína Ezrina en tal asociación.

63

Métodoogía general Materiales:

Los reactivos de cultivo fueron obtenidos de GE Healthcare (Carlsbad, CA, USA). La

Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] (Actividad específica 20 Ci/mmol) y el [3H]D-Asp de

Perkin Elmer (Boston, MA, USA). [3H]GABA (Amersham Pharmacia Biotech,

Piscataway, NJ, USA).

L-Gln, D-Asp, L-Glu y 2-Deoxy-D-glucose (2DOG) no marcada fueron obtenidos de

Sigma-Aldrich, Mexico. El Bisindolylmaleimide I (Bis I) de Calbiochem, (EMD

Millipore, Darmstadt, Germany), el H-9 dihydrochloride, KB-R7943 mesylate, DL-

threo-b-Benzyloxyaspartic acid (TBOA), threo-b-hydroxyaspartate (THA), MK801

(Cat. No.0924), CNQX (Cat. No. 1045) y DNQX son de Tocris-Cookson (St. Louis,

MO, USA).

Anticuerpos: policlonal conejo anti Ezrina (sc-20773), conejo anti p-Ezrina, Tyr354

(sc-101678), policlonal cabra anti GFAP (sc-6170), policlonal IgG de cabra anti-

GLUT1 (sc-1605) y anti-GLUT3 (sc-7581) son de Santa Cruz Biotechnology, Dallas,

TX USA. El anticuerpo monoclonal anti-calbindina D (C-8666) fue de Sigma-Aldrich,

St. Louis, MO, USA), GAT-3 (AB1574) de Millipore, el IgG de conejo anti-la proteína

de unión a cainato (KBP) y el suero de conejo anti-GLAST fue producido y

caracterizado en nuestro laboratorio (Martinez-Lozada et al.). El anticuerpo

monoclonal anti-alfa-actina fue donado pro el Prof. Manuel Hernández (Cinvestav-

IPN).

Las partículas de agarosa acopladas a la proteína A y G, los anticuerpos secundarios

anti IgG de ratón, cabra y conejo acoplados a la peroxidasa de rábano, el sustrato

para quimioluminiscencia ECL (de “Enhanced Chemilumiscence”), GABA, PMA,

metosulfonato Ro 31-8220, calphostin C, estaurosporina y forskolina fueron

obtenidos de GE Healthcare Life Sciences (Mexico DF). La biotina EZ-Link Sulfo-

NHS-LC-Biotin, No-WeighTM Format (Cat. 21335, from Thermo Scientific), la

suspensión de perlas CaptAvidin agarosa sedimentada (Cat. 21386) y el Fura-2 AM

fueron de Molecular Probes. Los reactivos restantes fueron obtenidos de Sigma (St.

Louis, MO, USA).

Cultivo celular y protocolo de estimulación:

64

Los cultivos primarios de las CGB fueron preparado a partir de cerebelos de

embriones de pollo de 14 días, a como previamente fue establecido (Ortega et al.,

1991). Las células fueron sembradas en cajas de cultivo de 24 y 6 pozos, para

ensayos de radiactividad y de proteínas, respectivamente. Las células disgregadas

fueron re-suspendidas en el medio de cultivo OPTIMEM con 4% de suero fetal

bovino, gentamicina (50µg/ml), crecidas en mezcla gaseosa con 5% de CO2 durante

3 o 4 días antes de ser usadas para experimentación.

Los cultivos de glía de Müller se obtuvieron a partir de retinas de embriones de 9 días

(E9), a como se ha descrito anteriormente (Reis et al., 2002). Se considera ¼ parte

de una retina por cada pozo de 35 mm de una placa de 6 pozos. El tejido es

disociado con tripsina y sembrado en medio DMEM con 10% FBS (suero fetal

bovino). A los 10 días de incubación, si es necesario, se adiciona 4 mM de ácido

ascórbico y se deja actuar durante 90 min aproximadamente para eliminar la mayor

parte de neuronas. Se realiza un lavado con DMEM y el cultivo se incuba durante

unos 5 días más, para ser usado alrededor de los 15 días in vitro.

Línea celular MIO-M1 y subcultivo:

Las células MIO-M1 fueron cultivadas en DMEM con alta glucosa, Glutamax I—

[Gibco BRL, Cat. 31966-047], 10 % FBS, penicilina y estreptomicina. Los pases

fueron realizados una vez por semana, sembrando aproximadamente ½ millón de

células en un frasco de 25 cm2 y el medio de cultivo es reemplazado cada 3-4 días.

Se usa una solución de Tripsina-EDTA (5.0 g/L trypsin, 2.0 g/L EDTA and 8.5 g/L

NaCl, 10X de Gibco BRL, Cat. 354000-027) durante 2-3 min a 37 ºC para despegar

la monocapa, la reacción es detenida con medio DMEM 10% FBS. Las células son

separadas mediante una centrifugación a baja velocidad y el paquete celular es

suspendido de nuevo en DMEM con suero al 10%, la siembra se realiza a una

densidad de 19 105 células por pozo (35 mm) y se incuba a 37ºC hasta alcanzar

confluencia. Los pases usados fueron hasta máximo 40.

Previo a cualquier tratamiento el medio de cultivo fue reemplazado por la solución de

ensayo (25 mM HEPES-Tris, 130 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0.8 mM

65

MgCl2, 5 mM glucosa y 1 mM NaH2PO4, pH 7.4). Los experimentos que incluyen

diferentes condiciones iónicas en la solución de ensayo: el Tris-HCl reemplaza

equimolarmente al NaCl, cuando es en ausencia de calcio se acrecentaron 0.1 mM

EDTA. Los inhibidores y bloqueadores de algún sistema fueron pre-expuestos 20

minutos antes del tratamiento.

Captura de [3H]-2-D-deoxyglucosa ([3H]2DOG):

Las monocapas confluentes de CGB sembradas en placas de 24 pozos fueron

estimuladas por 30 o 15 minutes en la solución de ensayo. A continuación se

realizaron 30 minutos de captura en la misma solución de ensayo solo que sin

glucosa, en su lugar se adiciona 1-5 mM de 2DOG no marcada más 0.4 µCi/ml de

[3H]2DOG (20 nM). Donde se indica el NaCl fue reemplazado por Tris-HCl y el calcio

sustraído de la solución más EDTA. El influjo de [3H]2DOG fue iniciado mediante la

adición de la solución de captura a cada unidad experimental (0.25 ml). Los valores

cinéticos fueron estimados mediante los ensayos de captura con concentraciones

crecientes de 2DOG no marcada (0, 0.1, 0.5, 1, 2 ) mas la cantidad antes indicada de

[3H]2DOG. El tiempo de captura fue d 30 min. La reacción fue detenida mediante

lavados extensos con la solución de ensayo fría sin glucosa ni análogo de la mismas.

La monocapa de CGB fue lisada en solución 0.1 M de NaOH en agitación, a

temperatura ambiente por 2h, una alícuota fue tomada para el cálculo de la

concentración de proteínas con el ensayo de Bradford, lo restante de la lisis celular

fue mezclado con líquido de centelleo y las muestras analizadas en un contador de

centelleos de Perkin Elmer. Cada experimento se evaluó por lo en tres ocasiones

independientes, con cuadruplicados cada condición experimental.

Captura de GABA en células de glía de Müller (CGM)

Los cultivos fueron estimulados, y subsecuentemente incubados en la solución de

captura con [3H]GABA (0.4 µCi/ml) y 100 µM de GABA en solución de captura. Los

antagonistas fueron incubados 15 min antes del tratamiento: PMA (0.1–2 µM), DHPG

(10, 50 and 100 µM), MK801 (10 µM), DNQX (70 µM).

Captura de [3H]D-Asp

66

Las monocapas confluentes de células MIO-M1 sembradas en placas de 24 pozos

fueron cambiadas a solución de ensayo que contiene 0.4 µCi/ml de [3H]-D-Asp, la

reacción es detenida mediante lavados en solución fría. Las células fueron lisadas

con 0.1 M de NaOH durante 2 h a temperatura ambiente, la concentración de

proteínas determinada mediante el ensayo de Bradford y la radiactividad en las

muestras fue estimada por un contador de centelleos. Todos los experimentos

incluyeron cuadruplicados.

Cuantificación de L-Glu por HPLC-ED

Los niveles de L-Glu en las células y en el medio fueron medidos a través de

cromatografía líquida de alta resolución acoplada a detección electro-química

(HPLC–ED; Shimadzu, Japan). El protocolo usado corresponde a la adaptación de

uno anteriormente usado (Monge-Acuna and Fornaguera-Trias, 2009). Las muestras

desproteinizadas con ácido tri-cloroacético (TCA; 10%) fueron congeladas a -70ºC,

hasta su uso posterior. Una vez descongeladas se mezclaron con una solución

derivadora de sulfito de o-Ftalaldehído (Rowley et al., 1995) y corridas a través de

una columna de fase reversa de C-18 (Sigma-Aldrich, USA) antes de ser detectadas.

SDS-PAGE e inmuno-detección en fase sólida

Los cultivos sembrados en placas de seis posos fueron tratadas en la solución de

ensayo, la reacción fue detenida por lavado en PBS frío. La cosecha fue realiza en

PBS (10 mM K2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.4) con inhibidores de proteasas (1 mM

phenylmethylsufonyl fluoride –PMSF-) y fosfatasas (10 mM NaF, 1mM Na2MoO4). La

pastilla de células fue obtenida por centrifugación en frío (16 000 x g, 5 min), las

células fueron lisadas y solubilizadas en el tampón de 50 mM Tris-acetato, pH 7, 5

mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM Na3VO4, 1 µg/ml aprotinin 1 µg/ml leupeptin y 0.2%

SDS (Sodium Dodecyl Sulphate). Los restos celulares fueron descartados mediante

centrifugación en frío (16000 x g, 5 min) y se estimó la concentración de proteínas

por el ensayo de Bradford en micro-placa usando una mezcla de gamma-globulinas

bovinas para la curva estándar. La cantidad necesaria de muestra (alrededor de 50

µg) fue desnaturalizada hirviendo por 5 min en el tampón azul de muestra (Laemmli’s

buffer), posteriormente analizada mediante electroforesis desnaturalizante en poli-

67

acrilamida 8-10% (SDS-PAGE), elctro-transferidos a membranas de nitrocelulosa y la

tinción de Ponceau fue documentada y usada como control de carga. Las

inespecificidades fueron bloqueadas con solución al 5% de leche descremada de

vaca o de soya por 30 a 60 min. Los anticuerpos primarios se incubaron en solución

de TBS-0.1% Tween, 0.25% BSA, en frío por 12 h aproximadamente, en las

siguientes concentraciones: cabra anti-GLUT1 (1:500), cabra anti-GLUT3 (1:500),

conejo anti-GLAST (1:2000) y conejo anti-GAT3. Los anticuerpos secundarios

acoplados a la peroxidasa fueron incubados dos horas a temperatura ambiente,

1:4000. La quimioluminiscencia de la inmuno-reactividad fue detectada mediante el

foto-documentador MicroChemi (DNR Bio-Imaging System) con cámara CCD

(charge-coupled device). Los análisis densito-métricos fueron realizados con el

programa Image J64 (Schneider et al., 2012) y los datas graficados y analizado

mediante el programa Prism 5, GraphPad (San Diego, CA, USA).

Biotinilación de proteínas de la membrana plasmática

Dos pozos por cada placa de cultivo de 6 fueron usados para cada condición

experimental. Posterior al tratamiento las monocapas de células fueron lavadas con

PBS/Ca2+/M2+ (1 mM Ca2+, 0.5 mM Mg2+), incubadas en frío por 30 min con una

solución de EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (0.14 mg/ ml or 0.25mM) en PBS/Ca2+/M2+.

La biotina no ligada fue retirada mediante tres lavados con PBS/Ca2+/M2+/L-Gly (1

mM Ca2+, 0.5 mM Mg2+, 0.1 M L-Glicina) en frío y agitación lenta (3 min c/u). Las

células fueron cosechadas, centrifugadas, lisadas y la concentración de proteínas

cuantificada, a como se indica en la sección de SDS-PAGE. Por lo menos 300 µg, de

cada condición experimental, fueron acoplados con 30 ml de streptavidina acoplada

a partículas de agarosa (SA) en volumen de 400 µl de PBS, en agitación lenta, en

frío, durante 12 h. Las muestras fueron centrifugadas (16000 x g, 10 min, 4º C), el

primer sobrenadante guardado como la fracción citoplasmática, los precipitados de

SA fueron lavados tres veces con PBS 0.1% tritón en frio, centrifugando cada vez. Al

final la pastilla, los sobrenadantes y los “inputs” (proteína sin interactuar con SA)

fueron desnaturalizados por ebullición 5 min con el tampón azul de muestra

(Laemmli’s buffer), a continuación de procedió al procedimiento de inmunodetección

en fase sólida.

68

Inmunoprecipitacion de proteínas

Posterior a los tratamientos las células fueron cosechadas, centrifugadas, lisadas, los

extractos clarificados y cuantificados por el método de Bradford a como se indica en

la sección “SDS-PAGE e inmuno-detección en fase sólida”. Los extractos fueron

limpiados de IgGs mediante la incubación (agitación lenta y en frío) de los mismos

por 30 min con 3 µl de las partículas de agarosa acoplada a la proteína G (para

anticuerpos cuyo hospedero es la cabra) o A (para anticuerpos cuyo hospedero es el

conejo) para cada condición experimental. Los anticuerpos para inmunoprecipitar

fueron acoplados con las proteínas G o A, por interacción en PBS frío, agitación

lenta, durante 4 h. Posteriormente, por lo menos 200 µg de proteínas de los extractos

pre-aclarados se mezclaron con los complejos “Prot. G/A + anticuerpo”, se dejaron

interactuar en agitación lenta, en frío, 12 h. Los primeros sobrenadantes fueron

guardados para cargarlos en los geles. Las patillas de las inmunoprecipitaciones

fueron lavadas tres veces con PBS (400 µl) y centrifugadas cada vez. Los “inputs”

(proteína que no interactuó con Prot. G/A ni anticuerpo), los sobrenadantes y los

inmunoprecipitados fueron desnaturalizados por 5 min de ebullición en el tampón

azul de muestra y procesados para inmunodetección en fase sólida.

Inmunofluorescencia e inmunohistoquímica

Los cultivos fueron sembrados en cubre-objetos de 21 mm de diámetro, estimulados,

lavados con PBS en frío y fijados por 4 % PFA (paraformaldehído) durante 10 min en

temperatura ambiente. Los aldehídos residuales fueron inactivados por una lavado

con solución de cloruro de amonio (0.05 M NH4Cl, 5 min) La membranas celulares

fueron permeabilizadas por 15 min con solución de PBS 0.2% de Tween 20, las

inespecificidades fueron bloqueadas durante 30 (PBS-0.1 % Tween 20 con 1% BSA

y 0.3 M L-Gly). Los anticuerpos primarios fueron incubados por 12 h en frío: anti-

GLUT1 (1:250), anti-GLUT3 (1:250), anti-KBP (1:500), IgG de ratón anti–2M6

(específico para glía de Müller) 1:500, conejo anti GAT-3 (Millipore) 1:200, conejo anti

GFAP (Spring, M3782) 1:100 y anticuerpo monoclonal anti Brn3a en solución de

69

anticuerpos (PBS con 0.1 % BSA). Los cubreobjetos fueron lavados tres veces y el

anticuerpo secundario incubado 2 horas a temperatura ambiente: Alexa Fluor 488

burro anti-goat IgG 1:1000 (A11055), TRITC goat anti-conejo IgG 1:200 (81-6114),

goat anti- ratón Alexa 488 y cabra anti-mouse Alexa 555 (Invitrogen). Los cubre-

objetos fueron lavados tres veces con PBS, enjuagados en agua milliQ, secados por

inmersión en etanol completo y montados sobre porta-objetos con el medio de

montaje Fluoroshield con DAPI (F6057, Sigma-Aldrich), los bordes fueron sellados

con barniz de uñas sin color. Las preparaciones fueron analizadas en una plataforma

confocal Leica TCS SP8.

La inmunohistoquímica fue realizada en secciones de 50 µm de espesor (crio-

preservadas) de cerebelos de embriones de pollo de 18 días. Los cerebelos fueron

lavados exhaustivamente por inmersión en PBS frío antes de fijar durante 1 h con

una solución de 4% PFA in PBS (pH 7.4). El fijador fue cambiado una vez y dejado a

4°C por 48 h. El cerebelo fue criopreservado por inmersión sucesiva en soluciones

de sacarosa en PBS (10 – 20 – 30%). Los cortes fueron realizados sagitalmente en

un criostato (Microm International GmbH, Walldorf, Germany). Los tejidos fueron

lavados exhaustivamente en PBS para remover los excesos de aldehídos y entonces

incubados por 10 min en solución de peróxido de hidrógeno (1.8%) para inactivar la

peroxidasa endógena. La inespecificidad de los anticuerpos fue bloqueada por

incubación en solución de bloqueo por 1 h a temperatura ambiente (PBS-0.3% tritón

con 3% de suero de cabra). Las secciones fueron incubadas a 4°C durante 48 h con

los anticuerpos primarios en la solución de bloqueo: ratón anti-calbindina (1:5000),

anti-KBP (1:2500), anti-GLUT1 and anti-GLUT3 (1:500). El anticuerpo primario fue

lavado tres veces en PB (tampón de fosfatos) y se colocaron los anticuerpos

secundarios biotinilados durante 3 h (1:1000; Vector Laboratories, Inc., Burlingame,

CA, USA), anti-conejo para KBP, anti-cabra para GLUT1 y GLUT3. El complejo de

avidina-biotina-peroxidasa fue incubado durante 1 h (1:250; Vector Labs). Los

complejos de anricuerpo-peroxidasa fueron revelados con una solución 0.05% de

diaminobenzidina, sulfato de níquel (10 mg/mL; Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA),

cloruro de cobalto (10 mg/mL; Fisher Scientific) y 0.01% de peróxido de hidrógeno, lo

cual produjo un precipitado color negro-púrpura. Las secciones de tejido fueron

70

montadas sobre cubre-objetos gelatinizados, deshidratados, aclarado con Hemo-De

(Fisher Scientific) y montados con el medio de montaje Permount. Los cortes fueron

analizados en un microscopio Olympus BX41.

Obtención de la retina de pollo (P10):

Los ojos son enucleados, cortados perpendicularmente para obtener dos secciones

iguales, las cuales fueron fijadas por inmersión en paraformaldehído al 4% en PB

(tampón de fosfatos 0.16 M, pH 7.2) durante 2 h. Posteriormente se lavaron en PB y

se crioprotegieron con sacarosa (15 y 30%) por 24 h. Las secciones de ojo fueron

montadas con el medio OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA), congeladas, cortadas

en rebanadas de 12 a 16 micrómetros y fijadas sobre cubre-objetos tratados con poli-

L-Lisina (Sigma Aldrich).

Imagen de calcio de una sola célula (Single Cell Calcium Imaging, SCCI)

El protocolo usado para evaluar los niveles en calcio intracelular ([Ca2+]) es una

adaptación del reportado anteriormente (De Melo Reis et al., 2011). Las células

fueron cargadas con 5 µM de Fura-2/AM diluido en una solución de Krebs (132 mM

NaCl, 4 mM KCl, 1.4 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2, 6 mM glucose, 10 mM HEPES, pH

7.4) que contiene 0.1 % BSA y 0.02% de ácido plurónico F-127, durante 40 min, en

una incubadora (5% CO2, 95% mezcla atmosférica). La lisis completa de la sonda fue

asegurada con un reposo a temperatura ambiente por 10 min en solución Krebs. Los

cubre-objetos con las mono-capas de células fueron montados en una cámara RC-

20, sobre una plataforma P-5 (Warner Intruments, Hamden, CT) sobre la platina de

un microscopio de epi-fluorescencia invertido (Eclipse Ti-U; Nikon). Una perfusión

continua por gravedad mantiene un baño de Krebs y del estímulo de 2 mM de Glu en

la cámara RC-20. El sistema Lambda DG4 illumination sysmtem (Sutter Instrument,

Novato, CA) permite excitar al indicador de calcio a dos los longitudes de onda (340

y 380), mide la fluorescencia emitida a 510 nm. Las imágenes son obtenidas por una

cámara EMCCD enfriada de 16-bit (Photometrics, Tuscon, AZ), cuando las

fluorescencia es captada por un objetivo de 40x y un filtro de paso de 510 nm

(Semrock, Rochester, NY). Los datos generado son procesados por el programa

71

Meta Fluor (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Los valores de la proporción de la

fluorescencia de Fura-2 del tratamientos son analizados respecto a un nivel de

incremento igual o mayor al 20% respecto la condición control.

Neurodegeneracíón de retina

Este ensayo fue efectuado en pollos de diez días (P10). Se injectaron 5 μl de una

solución 50 mM de NMDA en el ojo derecho, en el ojo izquierdo se injectó la misma

cantidad de PBS estéril. Después de inducir la lesión los pollos fueron mantenidos 15

días en ciclo luz/oscuridad normal, posteriormente sacrificados para la obtención de

las retinas.

Análisis estadístico

Los datos del trabajo con las CGB fueron expresados con un valor promedio ± el

error estándar de la media (SEM). Un análisis de variancia de una sola vía (ANOVA)

permitió ver la diferencia entre grupos y la significancia (con un nivel = ó > 0.05) de

las condiciones experimentales vs. el control fue determinada por pruebas pos-hoc

como la comparación múltiple de Dunnett, usando el programa Prism 5, GraphPad

Software (San Diego, CA, USA).

Los datos del trabajo con las CGM fueron analizados a través del programa Prism 6,

usando la prueba t de Student o ANOVA de una sola vía, seguidas por las pruebas

para comparación múltiple de Tukey o de Dunnett; salvo que se indique de otro

modo, se presentan valores promedio +/- SEM de al menos 3 experimentos con

triplicados.

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References Anccasi, R.M., Ornelas, I.M., Cossenza, M., Persechini, P.M., Ventura, A.L., 2013. ATP induces the death of developing avian retinal neurons in culture via activation of P2X7 and glutamate receptors. Purinergic Signal 9, 15-29. doi: 10.1007/s11302-012-9324-5. Arriza, J.L., Eliasof, S., Kavanaugh, M.P., Amara, S.G., 1997. Excitatory amino acid transporter 5, a retinal glutamate transporter coupled to a chloride conductance. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 4155-4160. Bak, L.K., Schousboe, A., Waagepetersen, H.S., 2006. The glutamate/GABA-glutamine cycle: aspects of transport, neurotransmitter homeostasis and ammonia transfer. J Neurochem 98, 641-653. doi: 10.1111/j.1471-4159.2006.03913.x. Barrera, I., Hernandez-Kelly, L.C., Castelan, F., Ortega, A., 2008. Glutamate-dependent elongation factor-2 phosphorylation in Bergmann glial cells. Neurochem Int 52, 1167-1175. doi: 10.1016/j.neuint.2007.12.006. Bauer, D., Haroutunian, V., Meador-Woodruff, J.H., McCullumsmith, R.E., 2010. Abnormal glycosylation of EAAT1 and EAAT2 in prefrontal cortex of elderly patients with schizophrenia. Schizophr Res 117, 92-98. doi: 10.1016/j.schres.2009.07.025. Bauer, D.E., Jackson, J.G., Genda, E.N., Montoya, M.M., Yudkoff, M., Robinson, M.B., 2012. The glutamate transporter, GLAST, participates in a macromolecular complex that supports glutamate metabolism. Neurochem Int 61, 566-574. doi: 10.1016/j.neuint.2012.01.013. Beckman, M.L., Bernstein, E.M., Quick, M.W., 1999. Multiple G protein-coupled receptors initiate protein kinase C redistribution of GABA transporters in hippocampal neurons. J Neurosci 19, RC9. Bittar, P.G., Charnay, Y., Pellerin, L., Bouras, C., Magistretti, P.J., 1996. Selective distribution of lactate dehydrogenase isoenzymes in neurons and astrocytes of human brain. J Cereb Blood Flow Metab 16, 1079-1089. doi: 10.1097/00004647-199611000-00001. Broer, S., Brookes, N., 2001. Transfer of glutamine between astrocytes and neurons. J Neurochem 77, 705-719. Carruthers, A., DeZutter, J., Ganguly, A., Devaskar, S.U., 2009. Will the original glucose transporter isoform please stand up! Am J Physiol Endocrinol Metab 297, E836-848. doi: 10.1152/ajpendo.00496.2009. Cidad, P., Garcia-Nogales, P., Almeida, A., Bolanos, J.P., 2001. Expression of glucose transporter GLUT3 by endotoxin in cultured rat astrocytes: the role of nitric oxide. J Neurochem 79, 17-24. Clements, J.D., Lester, R.A., Tong, G., Jahr, C.E., Westbrook, G.L., 1992. The time course of glutamate in the synaptic cleft. Science 258, 1498-1501. Collingridge, G.L., Olsen, R.W., Peters, J., Spedding, M., 2009. A nomenclature for ligand-gated ion channels. Neuropharmacology 56, 2-5. doi: 10.1016/j.neuropharm.2008.06.063. Copenhagen, D.R., Jahr, C.E., 1989. Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors. Nature 341, 536-539. doi: 10.1038/341536a0. Coutinho, V., Knopfel, T., 2002. Metabotropic glutamate receptors: electrical and chemical signaling properties. Neuroscientist 8, 551-561. Danbolt, N.C., 2001. Glutamate uptake. Prog Neurobiol 65, 1-105. De Melo Reis, R.A., Schitine, C.S., Kofalvi, A., Grade, S., Cortes, L., Gardino, P.F., Malva, J.O., de Mello, F.G., 2011. Functional identification of cell phenotypes differentiating from mice retinal neurospheres using single cell calcium imaging. Cell Mol Neurobiol 31, 835-846. doi: 10.1007/s10571-011-9673-6.

73

de Melo Reis, R.A., Ventura, A.L., Schitine, C.S., de Mello, M.C., de Mello, F.G., 2008. Müller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors. Neurochem. Res. 33, 1466-1474. De Sampaio Schitine, C., Kubrusly, R.C., De Melo Reis, R.A., Yamasaki, E.N., De Mello, M.C., De Mello, F.G., 2007. GABA uptake by purified avian Muller glia cells in culture. Neurotox Res 12, 145-153. Derouiche, A., Frotscher, M., 2001. Peripheral astrocyte processes: monitoring by selective immunostaining for the actin-binding ERM proteins. Glia 36, 330-341. Elsayed, M., Magistretti, P.J., 2015. A New Outlook on Mental Illnesses: Glial Involvement Beyond the Glue. Front Cell Neurosci 9, 468. doi: 10.3389/fncel.2015.00468. Eulenburg, V., Gomeza, J., 2010. Neurotransmitter transporters expressed in glial cells as regulators of synapse function. Brain Res Rev 63, 103-112. doi: 10.1016/j.brainresrev.2010.01.003. Fehon, R.G., McClatchey, A.I., Bretscher, A., 2010. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat Rev Mol Cell Biol 11, 276-287. doi: 10.1038/nrm2866. Ferreira, D.D., Stutz, B., de Mello, F.G., Reis, R.A., Kubrusly, R.C., 2014. Caffeine potentiates the release of GABA mediated by NMDA receptor activation: Involvement of A adenosine receptors. Neuroscience 281C, 208-215. doi: 10.1016/j.neuroscience.2014.09.060. Fischer, A.J., Reh, T.A., 2001. Muller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina. Nat Neurosci 4, 247-252. doi: 10.1038/85090. Flores-Mendez, M.A., Martinez-Lozada, Z., Monroy, H.C., Hernandez-Kelly, L.C., Barrera, I., Ortega, A., 2013. Glutamate-dependent translational control in cultured Bergmann glia cells: eIF2alpha phosphorylation. Neurochem Res 38, 1324-1332. doi: 10.1007/s11064-013-1024-1. Fonnum, F., 1984. Glutamate: a neurotransmitter in mammalian brain. J Neurochem 42, 1-11. Gadea, A., Lopez, E., Lopez-Colome, A.M., 2004. Glutamate-induced inhibition of D-aspartate uptake in Muller glia from the retina. Neurochem Res 29, 295-304. Gadea, A., Lopez-Colome, A.M., 2001. Glial transporters for glutamate, glycine and GABA I. Glutamate transporters. J Neurosci Res 63, 453-460. Gasic, G.P., Hollmann, M., 1992. Molecular neurobiology of glutamate receptors. Annu Rev Physiol 54, 507-536. doi: 10.1146/annurev.ph.54.030192.002451. Genda, E.N., Jackson, J.G., Sheldon, A.L., Locke, S.F., Greco, T.M., O'Donnell, J.C., Spruce, L.A., Xiao, R., Guo, W., Putt, M., Seeholzer, S., Ischiropoulos, H., Robinson, M.B., 2011. Co-compartmentalization of the astroglial glutamate transporter, GLT-1, with glycolytic enzymes and mitochondria. J Neurosci 31, 18275-18288. doi: 10.1523/JNEUROSCI.3305-11.2011. Gonzalez, M.I., Lopez-Colom, A.M., Ortega, A., 1999. Sodium-dependent glutamate transport in Muller glial cells: regulation by phorbol esters. Brain Res 831, 140-145. Gunnink, S.M., Kerk, S.A., Kuiper, B.D., Alabi, O.D., Kuipers, D.P., Praamsma, R.C., Wrobel, K.E., Louters, L.L., 2014. Alkaline pH activates the transport activity of GLUT1 in L929 fibroblast cells. Biochimie 99, 189-194. doi: 10.1016/j.biochi.2013.12.003. Gustafson, E.G., Stevens, E.S., Miller, R.F., 2015. Dynamic regulation of D-serine release in the vertebrate retina. J Physiol 593, 843-856. doi: 10.1113/jphysiol.2014.283432. He, C., Chen, F., Li, B., Hu, Z., 2014. Neurophysiology of HCN channels: from cellular functions to multiple regulations. Prog Neurobiol 112, 1-23. doi: 10.1016/j.pneurobio.2013.10.001. Ismail-Beigi, F., 1993. Metabolic regulation of glucose transport. J Membr Biol 135, 1-10.

74

Juusola, M., French, A.S., Uusitalo, R.O., Weckstrom, M., 1996. Information processing by graded-potential transmission through tonically active synapses. Trends Neurosci 19, 292-297. doi: 10.1016/S0166-2236(96)10028-X. Kanai, Y., Clemencon, B., Simonin, A., Leuenberger, M., Lochner, M., Weisstanner, M., Hediger, M.A., 2013. The SLC1 high-affinity glutamate and neutral amino acid transporter family. Mol Aspects Med 34, 108-120. doi: 10.1016/j.mam.2013.01.001. Kandel, E., Schwartz, J.H., Jessel, T.M., 2000. Principles of Neuronal Science, 4th ed. McGraw-Hill Companies. Kanner, B.I., 2006. Structure and function of sodium-coupled GABA and glutamate transporters. J Membr Biol 213, 89-100. doi: 10.1007/s00232-006-0877-5. Kavanaugh, M.P., 2004. Accessing a transporter structure. Nature 431, 752-753. doi: 10.1038/431752a. Keller, K., Strube, M., Mueckler, M., 1989. Functional expression of the human HepG2 and rat adipocyte glucose transporters in Xenopus oocytes. Comparison of kinetic parameters. J Biol Chem 264, 18884-18889. Kim, M.O., Lee, Y.J., Park, J.H., Ryu, J.M., Yun, S.P., Han, H.J., 2012. PKA and cAMP stimulate proliferation of mouse embryonic stem cells by elevating GLUT1 expression mediated by the NF-kappaB and CREB/CBP signaling pathways. Biochim Biophys Acta 1820, 1636-1646. doi: 10.1016/j.bbagen.2012.05.008. Kirischuk, S., Kettenmann, H., Verkhratsky, A., 2007. Membrane currents and cytoplasmic sodium transients generated by glutamate transport in Bergmann glial cells. Pflugers Arch 454, 245-252. doi: 10.1007/s00424-007-0207-5. Koirala, S., Corfas, G., 2010. Identification of novel glial genes by single-cell transcriptional profiling of Bergmann glial cells from mouse cerebellum. PLoS One 5, e9198. doi: 10.1371/journal.pone.0009198. Kubrusly, R.C., da Cunha, M.C., Reis, R.A., Soares, H., Ventura, A.L., Kurtenbach, E., de Mello, M.C., de Mello, F.G., 2005. Expression of functional receptors and transmitter enzymes in cultured Muller cells. Brain Res 1038, 141-149. doi: 10.1016/j.brainres.2005.01.031. Kubrusly, R.C., Panizzutti, R., Gardino, P.F., Stutz, B., Reis, R.A., Ventura, A.L., de Mello, M.C., de Mello, F.G., 2008. Expression of functional dopaminergic phenotype in purified cultured Muller cells from vertebrate retina. Neurochem Int 53, 63-70. doi: 10.1016/j.neuint.2008.05.002. Kvamme, E., Torgner, I.A., Roberg, B., 2001. Kinetics and localization of brain phosphate activated glutaminase. J Neurosci Res 66, 951-958. Lanz, B., Xin, L., Millet, P., Gruetter, R., 2014. In vivo quantification of neuro-glial metabolism and glial glutamate concentration using 1H-[13C] MRS at 14.1T. J Neurochem 128, 125-139. doi: 10.1111/jnc.12479. Le Meur, K., Mendizabal-Zubiaga, J., Grandes, P., Audinat, E., 2012. GABA release by hippocampal astrocytes. Front Comput Neurosci 6, 59. doi: 10.3389/fncom.2012.00059. Lee, E.E., Ma, J., Sacharidou, A., Mi, W., Salato, V.K., Nguyen, N., Jiang, Y., Pascual, J.M., North, P.E., Shaul, P.W., Mettlen, M., Wang, R.C., 2015. A Protein Kinase C Phosphorylation Motif in GLUT1 Affects Glucose Transport and is Mutated in GLUT1 Deficiency Syndrome. Mol Cell 58, 845-853. doi: 10.1016/j.molcel.2015.04.015. Lee, S., Yoon, B.E., Berglund, K., Oh, S.J., Park, H., Shin, H.S., Augustine, G.J., Lee, C.J., 2010. Channel-mediated tonic GABA release from glia. Science 330, 790-796. doi: 10.1126/science.1184334.

75

Leke, R., Bak, L.K., Schousboe, A., Waagepetersen, H.S., 2008. Demonstration of neuron-glia transfer of precursors for GABA biosynthesis in a co-culture system of dissociated mouse cerebral cortex. Neurochem Res 33, 2629-2635. doi: 10.1007/s11064-008-9814-6. Liang, S.L., Carlson, G.C., Coulter, D.A., 2006. Dynamic regulation of synaptic GABA release by the glutamate-glutamine cycle in hippocampal area CA1. J Neurosci 26, 8537-8548. doi: 10.1523/JNEUROSCI.0329-06.2006. Limb, G.A., Salt, T.E., Munro, P.M., Moss, S.E., Khaw, P.T., 2002. In vitro characterization of a spontaneously immortalized human Muller cell line (MIO-M1). Invest Ophthalmol Vis Sci 43, 864-869. Loaiza, A., Porras, O.H., Barros, L.F., 2003. Glutamate triggers rapid glucose transport stimulation in astrocytes as evidenced by real-time confocal microscopy. J Neurosci 23, 7337-7342. Loiola, E.C., Ventura, A.L., 2011. Release of ATP from avian Muller glia cells in culture. Neurochem Int 58, 414-422. doi: 10.1016/j.neuint.2010.12.019. Lopez, T., Lopez-Colome, A.M., Ortega, A., 1994. AMPA/KA receptor expression in radial glia. Neuroreport 5, 504-506. Lopez, T., Lopez-Colome, A.M., Ortega, A., 1998. Changes in GluR4 expression induced by metabotropic receptor activation in radial glia cultures. Brain Res Mol Brain Res 58, 40-46. Lopez-Colome, A.M., Martinez-Lozada, Z., Guillem, A.M., Lopez, E., Ortega, A., 2012. Glutamate transporter-dependent mTOR phosphorylation in Muller glia cells. ASN Neuro 4. doi: 10.1042/AN20120022. Lopez-Colome, A.M., Murbartian, J., Ortega, A., 1995. Excitatory amino acid-induced AP-1 DNA binding activity in Muller glia. J Neurosci Res 41, 179-184. doi: 10.1002/jnr.490410205. Lopez-Colome, A.M., Ortega, A., 1997. Activation of p42 mitogen-activated protein kinase by glutamate in cultured radial glia. Neurochem Res 22, 679-685. Lopez-Colome, A.M., Ortega, A., Fragoso, G., Trueba, E., 1997. Excitatory amino acid receptors coupled to the phosphoinositide pathway in Bergmann glia. Neurochem Res 22, 305-312. Lopez-Colome, A.M., Ortega, A., Romo-de-Vivar, M., 1993. Excitatory amino acid-induced phosphoinositide hydrolysis in Muller glia. Glia 9, 127-135. doi: 10.1002/glia.440090206. Lopez-Juarez, A., 2008. [Bergmann glia receptors and transporters: possible roles in cerebellum physiology]. Rev Neurol 47, 527-535. Madden, D.R., 2002. The structure and function of glutamate receptor ion channels. Nat Rev Neurosci 3, 91-101. doi: 10.1038/nrn725. Magistretti, P.J., Allaman, I., 2015. A cellular perspective on brain energy metabolism and functional imaging. Neuron 86, 883-901. doi: 10.1016/j.neuron.2015.03.035. Maher, F., Davies-Hill, T.M., Lysko, P.G., Henneberry, R.C., Simpson, I.A., 1991. Expression of two glucose transporters, GLUT1 and GLUT3, in cultured cerebellar neurons: Evidence for neuron-specific expression of GLUT3. Mol Cell Neurosci 2, 351-360. Martinez-Lozada, Z., Guillem, A.M., Flores-Mendez, M., Hernandez-Kelly, L.C., Vela, C., Meza, E., Zepeda, R.C., Caba, M., Rodriguez, A., Ortega, A., 2013. GLAST/EAAT1-induced glutamine release via SNAT3 in Bergmann glial cells: evidence of a functional and physical coupling. J Neurochem 125, 545-554. doi: 10.1111/jnc.12211. Martinez-Lozada, Z., Hernandez-Kelly, L.C., Aguilera, J., Lopez-Bayghen, E., Ortega, A., 2011. Signaling through EAAT-1/GLAST in cultured Bergmann glia cells. Neurochem Int 59, 871-879. doi: 10.1016/j.neuint.2011.07.015. McKenna, M.C., 2007. The glutamate-glutamine cycle is not stoichiometric: fates of glutamate in brain. J Neurosci Res 85, 3347-3358. doi: 10.1002/jnr.21444.

76

McKenna, M.C., 2013. Glutamate pays its own way in astrocytes. Front Endocrinol (Lausanne) 4, 191. doi: 10.3389/fendo.2013.00191. Meireles, M., Martel, F., Araujo, J., Santos-Buelga, C., Gonzalez-Manzano, S., Duenas, M., de Freitas, V., Mateus, N., Calhau, C., Faria, A., 2013. Characterization and modulation of glucose uptake in a human blood-brain barrier model. J Membr Biol 246, 669-677. doi: 10.1007/s00232-013-9583-2. Monge-Acuna, A.A., Fornaguera-Trias, J., 2009. A high performance liquid chromatography method with electrochemical detection of gamma-aminobutyric acid, glutamate and glutamine in rat brain homogenates. J Neurosci Methods 183, 176-181. doi: 10.1016/j.jneumeth.2009.06.042. Mota, B., Herculano-Houzel, S., 2014. All brains are made of this: a fundamental building block of brain matter with matching neuronal and glial masses. Front Neuroanat 8, 127. doi: 10.3389/fnana.2014.00127. Nelson, N., Lill, H., 1994. Porters and neurotransmitter transporters. J Exp Biol 196, 213-228. Newman, E., Reichenbach, A., 1996. The Muller cell: a functional element of the retina. Trends Neurosci 19, 307-312. Nicholls, D.G., 1993. The glutamatergic nerve terminal. Eur J Biochem 212, 613-631. Nijboer, C.H., Heijnen, C.J., Degos, V., Willemen, H.L., Gressens, P., Kavelaars, A., 2013. Astrocyte GRK2 as a novel regulator of glutamate transport and brain damage. Neurobiol Dis 54, 206-215. doi: 10.1016/j.nbd.2012.12.013. Norenberg, M.D., Martinez-Hernandez, A., 1979. Fine structural localization of glutamine synthetase in astrocytes of rat brain. Brain Res 161, 303-310. Ortega, A., Eshhar, N., Teichberg, V.I., 1991. Properties of kainate receptor/channels on cultured Bergmann glia. Neuroscience 41, 335-349. Otis, T.S., Dodson, P.D., 2009. Transporter proteins in Neurons and Glia, In: Squire, L.R. (Ed.), Ecyclopedia of Neuroscience,Academic Press, pp. 1159-1166. Patten, B.A., Sardi, S.P., Koirala, S., Nakafuku, M., Corfas, G., 2006. Notch1 signaling regulates radial glia differentiation through multiple transcriptional mechanisms. J Neurosci 26, 3102-3108. doi: 10.1523/JNEUROSCI.4829-05.2006. Pellerin, L., Pellegri, G., Bittar, P.G., Charnay, Y., Bouras, C., Martin, J.L., Stella, N., Magistretti, P.J., 1998. Evidence supporting the existence of an activity-dependent astrocyte-neuron lactate shuttle. Dev Neurosci 20, 291-299. Pelvig, D.P., Pakkenberg, H., Stark, A.K., Pakkenberg, B., 2008. Neocortical glial cell numbers in human brains. Neurobiol Aging 29, 1754-1762. doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2007.04.013. Porras, O.H., Ruminot, I., Loaiza, A., Barros, L.F., 2008. Na(+)-Ca(2+) cosignaling in the stimulation of the glucose transporter GLUT1 in cultured astrocytes. Glia 56, 59-68. doi: 10.1002/glia.20589. Raichle, M.E., 2003. Functional brain imaging and human brain function. J Neurosci 23, 3959-3962. Rauen, T., Taylor, W.R., Kuhlbrodt, K., Wiessner, M., 1998. High-affinity glutamate transporters in the rat retina: a major role of the glial glutamate transporter GLAST-1 in transmitter clearance. Cell Tissue Res 291, 19-31. Reichenbach, A., Bringmann, A., 2013. New functions of Muller cells. Glia 61, 651-678. doi: 10.1002/glia.22477. Reis, R.A., Cabral da Silva, M.C., Loureiro dos Santos, N.E., Bampton, E., Taylor, J.S., de Mello, F.G., Linden, R., 2002. Sympathetic neuronal survival induced by retinal trophic factors. J Neurobiol 50, 13-23.

77

Rojas, A., Dingledine, R., 2013. Ionotropic glutamate receptors: regulation by G-protein-coupled receptors. Mol Pharmacol 83, 746-752. doi: 10.1124/mol.112.083352. Rose, E.M., Koo, J.C., Antflick, J.E., Ahmed, S.M., Angers, S., Hampson, D.R., 2009. Glutamate transporter coupling to Na,K-ATPase. J Neurosci 29, 8143-8155. doi: 10.1523/JNEUROSCI.1081-09.2009. Rothstein, J.D., Dykes-Hoberg, M., Pardo, C.A., Bristol, L.A., Jin, L., Kuncl, R.W., Kanai, Y., Hediger, M.A., Wang, Y., Schielke, J.P., Welty, D.F., 1996. Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate. Neuron 16, 675-686. Rowley, H.L., Martin, K.F., Marsden, C.A., 1995. Determination of in vivo amino acid neurotransmitters by high-performance liquid chromatography with o-phthalaldehyde-sulphite derivatisation. J Neurosci Methods 57, 93-99. Ruiz, M., Ortega, A., 1995. Characterization of an Na(+)-dependent glutamate/aspartate transporter from cultured Bergmann glia. Neuroreport 6, 2041-2044. Schlosshauer, B., Grauer, D., Dutting, D., Vanselow, J., 1991. Expression of a novel Muller glia specific antigen during development and after optic nerve lesion. Development 111, 789-799. Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W., 2012. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods 9, 671-675. Shank, R.P., Bennett, G.S., Freytag, S.O., Campbell, G.L., 1985. Pyruvate carboxylase: an astrocyte-specific enzyme implicated in the replenishment of amino acid neurotransmitter pools. Brain Res 329, 364-367. Somogyi, P., Eshhar, N., Teichberg, V.I., Roberts, J.D., 1990. Subcellular localization of a putative kainate receptor in Bergmann glial cells using a monoclonal antibody in the chick and fish cerebellar cortex. Neuroscience 35, 9-30. Stegink, L.D., Filer, L.J., Jr., Baker, G.L., 1982. Plasma and erythrocyte amino acid levels in normal adult subjects fed a high protein meal with and without added monosodium glutamate. J Nutr 112, 1953-1960. Stobart, J.L., Anderson, C.M., 2013. Multifunctional role of astrocytes as gatekeepers of neuronal energy supply. Front Cell Neurosci 7, 38. doi: 10.3389/fncel.2013.00038. Stutz, B., da Conceicao, F.S., Santos, L.E., Cadilhe, D.V., Fleming, R.L., Acquarone, M., Gardino, P.F., de Melo Reis, R.A., Dickson, P.W., Dunkley, P.R., Rehen, S., Houzel, J.C., de Mello, F.G., 2014. Murine dopaminergic Muller cells restore motor function in a model of Parkinson's disease. J Neurochem 128, 829-840. doi: 10.1111/jnc.12475. Sullivan, S.M., Lee, A., Bjorkman, S.T., Miller, S.M., Sullivan, R.K., Poronnik, P., Colditz, P.B., Pow, D.V., 2007. Cytoskeletal anchoring of GLAST determines susceptibility to brain damage: an identified role for GFAP. J Biol Chem 282, 29414-29423. doi: 10.1074/jbc.M704152200. Teichberg, V.I., 1991. Glial glutamate receptors: likely actors in brain signaling. FASEB J 5, 3086-3091. van den Berg, C.J., Garfinkel, D., 1971. A stimulation study of brain compartments. Metabolism of glutamate and related substances in mouse brain. Biochem J 123, 211-218. Vannucci, S.J., Maher, F., Simpson, I.A., 1997. Glucose transporter proteins in brain: delivery of glucose to neurons and glia. Glia 21, 2-21. Verkhratsky, A., Butt, A., 2007. Glial Neurobiology: A Textbook. John Wiley & Sons, Ltd. Verkhratsky, A., Reichenbach, A., 2009. Bergmann Glial Cells, In: Squire, L.R. (Ed.), Encyclopedia of Neuroscience,Academic Press, pp. 161-171.

78

Volk, L., Chiu, S.L., Sharma, K., Huganir, R.L., 2015. Glutamate synapses in human cognitive disorders. Annu Rev Neurosci 38, 127-149. doi: 10.1146/annurev-neuro-071714-033821. Waagepetersen, H.S., Sonnewald, U., Schousboe, A., 2007. Glutamine, Glutamate, and GABA: Metabolic Aspects, In: Lajtha, A., Oja, S.S., Schousboe, A., Saransaari, P. (Eds.), Handbook of neurochemistry and molecular neurobiology, aminoacids and peptides in the nervous system, 3rd edn ed,Springer, Berlin / Heidelberg, pp. 1-21. Whitelaw, B.S., Robinson, M.B., 2013. Inhibitors of glutamate dehydrogenase block sodium-dependent glutamate uptake in rat brain membranes. Front Endocrinol (Lausanne) 4, 123. doi: 10.3389/fendo.2013.00123. Wilson-O'Brien, A.L., Patron, N., Rogers, S., 2010. Evolutionary ancestry and novel functions of the mammalian glucose transporter (GLUT) family. BMC Evol Biol 10, 152. doi: 10.1186/1471-2148-10-152. Yoon, B.E., Woo, J., Chun, Y.E., Chun, H., Jo, S., Bae, J.Y., An, H., Min, J.O., Oh, S.J., Han, K.S., Kim, H.Y., Kim, T., Kim, Y.S., Bae, Y.C., Lee, C.J., 2014. Glial GABA, synthesized by monoamine oxidase B, mediates tonic inhibition. J Physiol 592, 4951-4968. doi: 10.1113/jphysiol.2014.278754. Zhao, F.Q., Keating, A.F., 2007. Functional properties and genomics of glucose transporters. Curr Genomics 8, 113-128. Zhou, Y., Danbolt, N.C., 2013. GABA and Glutamate Transporters in Brain. Front Endocrinol (Lausanne) 4, 165. doi: 10.3389/fendo.2013.00165.

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Anexos

Anexos

1.- Envío del trabajo: “Coupling of glutamate and glucose uptake in cultured Bergmann glial cells”

2.-Artículo: “Functional plasticity of GAT-3 in avian

Müller cells is regulated by neurons via a glutamatergic input”

3.- Artículo: “Glutamate Receptor stimulation up-regulates Glutamate uptake in human Müller glía

cells”

4.- Revisión: “Glia plasma membrane transporters: Key players in glutamatergic neurotransmission”

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ANEXO 1

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ANEXO 2

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ANEXO 3

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ANEXO 4