Tesis Massiel Castro - Dirección de Bibliotecas UC
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PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE FACULTAD DE AGRONOMIA E INGENIERIA FORESTAL DIRECCION DE INVESTIGACION Y POSTGRADO MAGISTER EN FISIOLOGIA Y PRODUCCIÓN VEGETAL INFLUENCIA DE LA POLINIZACIÓN CRUZADA EN LA FORMACIÓN DE SEMILLAS EN MANDARINAS CV. CLEMENULES Y W.MURCOTT Tesis presentada como requisito para optar al grado de Magister en Fisiología y Producción Vegetal por: Massiel Paulina Castro Oyarzún Comité de Tesis Profesor Guía: Johanna Mártiz Profesor Informante: Gloria Montenegro Junio 2018 Santiago-Chile
Transcript of Tesis Massiel Castro - Dirección de Bibliotecas UC
PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE FACULTAD DE AGRONOMIA E INGENIERIA FORESTAL
DIRECCION DE INVESTIGACION Y POSTGRADO MAGISTER EN FISIOLOGIA Y PRODUCCIÓN VEGETAL
INFLUENCIA DE LA POLINIZACIÓN CRUZADA EN LA FORMACIÓN DE SEMILLAS EN MANDARINAS CV. CLEMENULES Y W.MURCOTT
Tesis presentada como requisito para optar al grado de
Magister en Fisiología y Producción Vegetal
por:
Massiel Paulina Castro Oyarzún
Comité de Tesis Profesor Guía: Johanna Mártiz
Profesor Informante: Gloria Montenegro
Junio 2018 Santiago-Chile
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Agradecimientos En primer lugar quisiera agradecer al Comité de Citricos-Asoex por permitirme desarrollar esta
tesis bajo el marco del proyecto “Diseño de una estrategia para reducir la presencia de
semillas en mandarinas de Exportación”
A mi profesora guía, Johanna Mártíz por impulsarme a realizar el magister, por su confianza y
por su constante apoyo en el desarrollo de esta investigación. A mi profesora informante,
Gloria Montenegro por su disposición y contribución a la realización de este estudio.
A mis compañeros y amigos de laboratorio de Cítricos UC, Mati, Maca, Dani y Karen por su
inmenso apoyo y risas constantes. A mis grandes amigas Paola Belen y Nachita Arías, por el
cariño, amistad y terapias espirituales.
A David, por su preocupación, apoyo y paciencia y a mi madre, por su amor incondicional.
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A la vida…
1
Índice de contenidos
1. Introducción ........................................................................................................... 3
2. Materiales y métodos ............................................................................................. 6
2.1 Ensayos de polinizaciones dirigidas .................................................................... 6
2.2 Ensayos de germinación de polen..................................................................... 11
2.3 Evaluación de temperatura ................................................................................ 12
3. Resultados y discusión ........................................................................................ 13
3.1 Ensayos de polinizaciones dirigidas .................................................................. 13
3.2 Porcentaje de germinación de polen in vitro ...................................................... 23
3.3 Evaluación de la influencia de la temperatura en la germinación de polen y
formación de semillas .............................................................................................. 30
4. Conclusiones ....................................................................................................... 33
5. Referencias.......................................................................................................... 35
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Abstract Massiel Paulina Castro Oyarzún. Influencia de la polinización cruzada en la formación de semillas en mandarinas cv. Clemenules y W.Murcott. Tesis,
Magister en Fisiología y Producción Vegetal, Facultad de Agronomía e Ingeniería
Forestal, Pontificia Universidad Católica de Chile. Santiago, Chile. 38 pp.
Clemenules and W. Murcott mandarins are the most produced varieties in Chile, due
to its high organoleptic quality and the ability to produce seedless fruits in isolation,
due to parthenocarpy. However, given the introduction of new citrus crops and the
close proximity of the orchards is that cross-pollination is developing. Due to the
compatibility between different citrus crops with mandarins, seed formation occurs in
the fruits. The aim of this study was to evaluate the seed formation capacity of different
citrus groups, such as tangerines and hybrids (Clemenules, W. Murcott, Fortune, Orri
and Tangelo Minneola); lemon trees (Eureka, Benjamín Andes, Fino 49 and Messina)
and orange Valencia Late. Conducted pollination trials on Clemenules and W. Murcott
in two citrus areas of Chile during two seasons (2016 and 2017) were made. Before to
pollination, in vitro pollen germination tests were carried out. For the evaluation of
environmental conditions on seed formation, meteorology data were collected and
evaluated at the time of flowering and fruit set. Pollen cross-pollination of the
mandarins and hybrid over Clemenules crops were the ones that caused the greatest
number of seeds in both zones and study seasons, being the cultivar most susceptible
to seed development compared to W. Murcott. In addition, a positive relationship is
established between the number of seeds per fruit and the percentage of pollen
germination.
Key words: Mandarins, cross pollination, seeds, pollen germination.
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1. Introducción La capacidad partenocárpica de las variedades de cítricos para producir frutos sin
semillas está relacionada con los diferentes tipos de esterilidad gamética que pueden
producirse (Tadeo et al., 2003). La esterilidad gamética consiste en la incapacidad de
producir óvulos o polen fértil (Agustí et al., 2003).
Los cítricos presentan esterilidad y/o incompatibilidad, lo que evita la formación de
semillas, sin embargo, este fenómeno en la mayoría de los casos se produce de
manera parcial (Montalt, 2009). La partenocarpia obligada se refiere al cuajado de
frutos sin la necesidad del algún estimulo externo, como el polen. Dentro de este
grupo se encuentran las naranjas Washington Navel y la mandarina satsuma (Gravina
et al., 2011).
Las clementinas presentan partenocarpia facultativa, son autoincompatibles y aunque
el polen el capaz de germinar en el estigma, el ovario desarrolla fruta sin semillas sino
se produce polinización cruzada (Mesejo et al., 2013). La mandarina Afourer, también
conocida como W.Murcott, es patentada como autoincompatible, produce frutos de
gran calidad y sin semillas en ausencia de polinización cruzada (Gravina et al., 2016)
La presencia de semillas en los frutos es uno de los factores que más afecta la
calidad de consumo fresco de mandarinas (Pardo et al., 2007), ya que actualmente
unas de las características más requeridas es la ausencia de semillas, causando un
problema económico con graves pérdidas en varios lugares del mundo.
En la década de los 80 se definió como fruta sin semillas a aquellas frutas que
contenían menos de cinco semillas, sin embargo, actualmente se considera fruto sin
semilla si el número de estas es inferior a una de doce frutos (Mautone et al., 2016).
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Dada la cercanía entre plantas de Clementinas y W. Murcott en las principales zonas
citrícolas del país, ha conllevado a que ambos grupos se vean afectados, ya que, al
no existir una barrera física, se produce polinización cruzada y con ello la formación
de semillas en los frutos (Vargas, 2016).
En Chile la normativa de exportación de mandarinas varía dependiendo del destino,
sin embargo, en términos generales la aceptación es que de cada 100 frutos, un
máximo de 10 frutos pueden presentar 1 a 2 semillas, siempre que el 4% no supere
las 2 semillas. Aproximadamente un 35% de la fruta exportada ha sido descartada por
presentar un número superior de semillas al aceptado (Comité de Cítricos, 2017), lo
que en consecuencia ha conducido que en los últimos años, gran parte de las
exportaciones de cítricos chilenos han debido enviar su fruta a Estados Unidos,
principal mercado de destino, bajo la denominación “Almost seedless” (Vargas, 2016).
Las principales variedades plantadas en Chile son las mandarinas clementinas (Citrus
clementina Hort. Ex tanaka) tales como Clemenules, Orogrande y Oronules, las cuales
son cosechadas desde mayo hasta mediados de agosto y la mandarina W. Murcott
(Citrus reticulata Blanco), la cual se cosecha desde agosto hasta mediados de
noviembre (Comité de cítricos, 2018) siendo actualmente una de las variedades más
populares en nuestro país (Polanco, 2017). Ambos tipos de mandarinas tienen muy
buen color de cascara, son fáciles de pelar (“easy peeler”) y no producen semillas
cuando se cultivan de forma aislada. Sin embargo, pueden producir semillas
fácilmente al existir huertos aledaños de otras especies de cítricos con polen
compatible (Chao, 2005; Gravina et al., 2011).
La notable presencia de variedades de cítricos con polen compatible como Fortune,
Nova y otros híbridos de mandarinas, así como la abundancia de colmenas durante el
período de floración, han favorecido que las Clementinas y W. Murcott sean
polinizadas y fecundadas con pólenes foráneos y fértiles, capaces de inducir la
formación de semillas (Pardo et al., 2007).
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La polinización y consiguiente fecundación puede verse afectada por factores
ambientales, hormonales y nutricionales. Dentro de los factores ambientales, la
temperatura y la humedad relativa son los más importante (Fasiolo y Rey, 2013).
Es por esto que se han investigado diferentes alternativas para evitar la presencia de
semillas, como la malla antipolinización que permite reducir la presencia de semillas
en mandarinas de exportación (Mártiz, 2017), al restringir la polinización cruzada entre
los diferentes cultivares de cítricos (Stander y Cronjé, 2016). Además, se han
explorado varias estrategias de mejoramiento como la introducción de la esterilidad
masculina citoplasmática, la manipulación de la ploidía, mutación inducida y
transgénie (Distefano et al., 2012).
Dado que el número de semillas formadas en los frutos de los cultivares de
mandarinas Clemenules y W.Murcott varía según las diferentes especies de cítricos
que las polinizan y que la temperatura es un factor determinante en el porcentaje de
germinación de polen se esperaría obtener frutos con un número de semillas variable,
dependiendo de la zona y temporada en que se cultive.
Para dilucidar la hipótesis se plantea como objetivo evaluar el efecto del polen de
diferentes cultivares de cítricos en la formación de semillas mediante polinización
cruzada en clementinas Clemenules y mandarinas W.Murcott en la zona centro norte
de Chile.
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2. Materiales y métodos 2.1 Ensayos de polinizaciones dirigidas
Se establecieron dos ensayos en dos zonas citrícolas de Chile, en la primavera del
2016. El primero, denominado “Zona Norte” se estableció en Ovalle, Región de
Coquimbo, Chile (30º34’17’’Sur - 71º24’54’’Oeste). Dentro del mismo campo, se
seleccionó un huerto de Clemenules (Citrus clementina hort. ex Tanaka), injertadas
sobre Carrizo, plantados a 5.5 x 3 m, y otro huerto de mandarinas W.Murcott (Citrus
reticulata Blanco), injertadas sobre portainjerto C35 plantadas a 5.3 x 2.4m, ambos
huertos separados por 5 Km aproximadamente y una Viña entre ambos, lo que
evitaría la polinización cruzada.
El segundo ensayo se estableció en Mallarauco “Zona Centro”, Provincia de Melipilla,
Región metropolitana, Chile (33º33’41’’Sur - 70º58’37’’Oeste). En donde se
seleccionaron dos huertos, uno de clementinas Clemenules sobre Carrizo plantadas a
6 x 3 m y otro de mandarinas W. Murcott sobre Rubidoux plantadas a 4,5 x2 m.
La recolección de las flores de los cultivares utilizados como parentales paternos se
realizó entre la última semana de Septiembre (semana 39) y la primera semana de
Octubre (semana 40) del año 2016 , cuando la temperatura ambiente alcanzó entre
los 20-25º C.
Las flores que se recolectaron se encontraban en estadio 59 de la escala BBCH, en
donde la mayoría de las flores tienen sus pétalos cerrados , adquieren la forma de
una bola hueca y alargada (Agustí et al., 1997) y las anteras se encuentran de color
amarillo palido o amarillo, según la especie y variedad. Posteriormente las flores
recolectadas se almacenan en bolsas de papel dentro de un cooler en frío hasta la
extracción de polen.
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En laboratorio se procesaron las flores para la extracción de polen desde las anteras,
se removieron los pétalos con pinzas dejando el disco floral con los filamentos y las
anteras, las que fueron pasadas por harneros de 1mm2, permitiendo el
desprendimiento de las anteras de los filamentos.
Las anteras se recolectaron por separado según la variedad y se depositaron en
placas Petri en una capa simple sin sobreponerse entre ellas, para su posterior
secado. Las placas Petri fueron puestas a 20°C durante 12 horas. Cuando el 70% de
las anteras se encontraban abiertas, se almacenaron en contenedores tipo eppendorf
de 2 ml hasta el 50% de su capacidad. Los tubos eppendorf se almacenaron a -20º C
hasta su utilización en campo.
Para realizar las polinizaciones dirigidas en campo, se seleccionaron 10 árboles del
cultivar Clemenules y 10 árboles de W.Murcott con altura y volumen de copa similar y
se realizaron 150 polinizaciones manuales distribuidas completamente al azar sobre
brotes del tipo solitario, campanero y mixto, con polen de 10 especies de cítricos, tales
como Mandarinas Clemenules, W.Murcott, Fortune, Orri, Tangelo Minneola;
Limoneros Eureka, Fino 49, Messina, Benjamín Andes y Naranja Valencia late
(Cuadro 1). Se seleccionaron flores en estado 59 de la escala BBCH (Agustí et al.,
1997), en el cual el estigma se encuentra receptivo.
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Cuadro 1. Tratamientos de polinizaciones cruzadas entre los cultivares maternos
Clemenules y W.Murcott y los cultivares paternos.
cv. paterno cv. materno
Clemenules W.Murcott
Clemenules Control T1
W.Murcott T1 Control
Fortune T2 T2
Orri T3 T3
Tangelo Minneola T4 T4
Eureka T5 T5
Fino 49 T6 T6
Messina T7 T7
Benjamín Andes T8 T8
Valencia Late T9 T9
Las flores a polinizar fueron enmasculadas y polinizadas de manera manual, mediante
el uso de un pincel nº 4 de pelo sintético marca Artel, previamente desinfectado con
etanol. Posteriormente los brotes polinizados fueron embolsados con mallas hasta la
época de caída fisiológica, para evitar la contaminación con polen proveniente de otra
fuente. En cada malla polinizada se colocó una etiqueta con el cruzamiento (Parental
materno x parental paterno), el número de flores polinizadas y la fecha de polinización
(Figura 1).
Cinco meses después de la polinización (marzo 2017) se cosechó la fruta para
cuantificar la presencia y número de semillas por fruto. Para el conteo de semillas, los
frutos fueron cortados en forma transversal superficialmente, con la precaución de no
cortar las semillas.
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Durante la primavera del 2017 se repitieron las polinizaciones dirigidas en los huertos
de Clemenules y W.Murcott de la Zona Norte para comparar ambas temporadas y
evaluar el efecto de las condiciones ambientales en la formación de semillas.
En la Zona Centro el ensayo se estableció en Puchuncaví, ubicado en la Quinta
Región, 32º42’32’’Sur - 71º14’14’’Oeste. Se seleccionó un huerto de clementinas
Clemenules sobre Carrizo plantados a 5 x 2,5 m y un huerto de mandarinas W.Murcott
plantado sobre portainjerto C35 a 5 x 2 m de distancia.
Transcurridos cinco meses (marzo 2018), se cosechó y analizó la fruta proveniente de
las polinizaciones realizadas en primavera, con el mismo protocolo de las
polinizaciones descritas anteriormente.
El diseño experimental correspondió a un diseño completamente al azar, con 9
tratamientos correspondientes a las diferentes polinizaciones cruzadas (cultivar
materno x cultivar paterno), la unidad experimental fue cada flor polinizada con los
diferentes pólenes con 150 repeticiones.
El análisis de varianza se realizó en el programa estadístico Infostat, utilizando la
prueba de Tukey con un nivel de confianza del 95 % (α= 0,05), en el que se consideró
una muestra de 10 frutos de cada cruzamiento. Los cruzamientos en los que se
obtuvo un número inferior de frutos cuajados no fueron considerados para el análisis
estadístico.
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Figura 1. (A) Estado de botón floral de Naranjo Valencia late. (B). Procesamiento de
flores. (C) Recolección de anteras de Cítricos. (D) Polinización manual de flores. (E)
Embolsado de flores polinizadas. (F) Fruto cuajado.
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2.2 Ensayos de germinación de polen Los pólenes recolectados para realizar las polinizaciones cruzadas, fueron sometidos
a ensayos de germinación previo a ser utilizados. Estos ensayos se realizaron en el
Laboratorio de Frutales de Hoja persistente de la Pontificia Universidad Católica de
Chile.
Para el análisis de germinación de polen se prepararon medios de cultivo en placas
Petri de tamaño 60 x 15 mm. El medio utilizado para la incubación del polen fue
preparado con agar 1%, ácido bórico 0,1%, sacarosa 20% y nitrato de calcio 0,8%
(Ramos et al., 2008). En cada placa se sembraron los granos de polen de manera
uniforme y se incubaron a 25º C durante 24 horas. Cada placa fue evaluada a las 4 y
24 horas transcurridas desde la incubación.
Para determinar el porcentaje de germinación de los pólenes, se seleccionaron y
analizaron 4 cuadrantes de las fotografías tomadas a las placas Petri obtenidas desde
la cámara ProgRes C3 (Jenoptik Germany) que posee el microscopio Olympus CX-31
con aumento de 40 X.
El conteo de granos de polen germinados se midió en 1 mm2 utilizando el software
WCIF Image J v1.37 (Wright Cell Imaging Facility, University Health Network
Research, Canadá). Se consideró como polen germinado aquellos con tubo polínico
con una longitud de al menos el doble de la del grano de polen.
Los datos fueron sometidos a un análisis de varianza (ANOVA de una vía). Luego se
realizó una comparación múltiple de medias utilizando la prueba de diferencia mínima
significativa (LSD Fisher) con un nivel de confianza del 95% (α= 0,05).
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2.3 Evaluación de temperatura
Para la evaluación de la temperatura se analizaron los datos entregados por la
Estación metereológica El Sauce perteneciente a Agrícola Tamaya, Ovalle.
Los parámetros analizados fueron temperatura máxima, mínima y media, y grados
días (base 12,5ºC), desde el mes de octubre a diciembre, es decir, desde floración a
caída fisiológica.
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3. Resultados y discusión
3.1 Ensayos de polinizaciones dirigidas En la figura 2 se observa el número promedio de semillas formadas por fruto en
clementinas Clemenules el año 2016 en la zona Norte. Los diferentes cultivares
parentales de cítricos muestran diferencias significativas entre ellos en la formación de
semillas, destacando los tratamientos con polen de mandarina W.Murcott, Fortune y
Tangelo Minneola, todos con un mayor número de semillas en comparación con los
tratamientos con limoneros Fino 49 y Messina. Estos resultados concuerdan con un
estudio realizado por Bono et al. (2000) en España, en donde bajos condiciones de
polinización cruzada W.Murcott y Fortune producen 27 y 24 semillas en promedio
respectivamente.
Figura 2. Número promedio de semillas por fruto en clementinas Clemenules en zona
norte formadas por polinizaciones dirigidas con diferentes cultivares de cítricos
durante la primavera 2016. Letras distintas indican diferencia significativa entre los
tratamientos (p <0,05).
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En la zona centro la cantidad de semillas que fueron generadas por el grupo de las
mandarinas sobre Clemenules fue significativamente superior al grupo de los
limoneros y al naranjo Valencia (Figura 3), lo que coincide con los resultados
obtenidos de las polinizaciones de la zona Norte. Chao et al., 2005, señala que las
polinizaciones cruzadas sobre Clemenules con polen de W.Murcott formó 25, 4
semillas promedio por fruto en la primera temporada y 32 semillas promedio por fruto
en la segunda temporada de estudio, lo que concuerda con los resultados obtenidos
en este ensayo.
Figura 3. Número promedio de semillas por fruto en clementinas Clemenules en zona
centro formadas por polinizaciones dirigidas con diferentes cultivares de cítricos
durante la primavera 2016. Letras distintas indican diferencia significativa entre los
tratamientos (p <0,05).
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De Azevedo et al., (2013) indica que las polinizaciones dirigidas sobre Clemenules
con polen de las variedades de Naranja Valencia, mandarina W.Murcott y tangelo
Nova provocó la formación de frutos con semillas.
Los tratamientos de polinizaciones cruzadas sobre W. Murcott en la zona norte el año
2016 mostraron diferencias significativas entre el polen de Naranjo Valencia en
comparación con los limoneros Fino 49, Eureka y Messina (Figura 4). Estudios
realizados por Gravina et al., (2011) sobre polinización cruzada en mandarina
W.Murcott indican que el polen de naranja Valencia fue el que produce el mayor
número de semillas por frutos.
Figura 4. Número promedio de semillas por fruto en mandarinas W.Murcott en zona
norte formadas por polinizaciones dirigidas con diferentes cultivares de cítricos
durante la primavera 2016. Letras distintas indican diferencia significativa entre los
tratamientos (p <0,05).
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En la Zona Centro el año 2016, las polinizaciones realizadas sobre W.Murcott
mostraron diferencias significativas entre los tratamientos, destacando la mandarina
Fortune y Tangelo Minneola como las que generaron mayor número de semillas
promedio por fruto. Los tratamientos con polen de limoneros no arrojaron diferencias
significativas con el tratamiento testigo, sin embargo, las polinizaciones con
Clemenules si provocó diferencias significativas con el tratamiento control (Figura 5).
Figura 5. Número promedio de semillas por fruto en mandarinas W.Murcott en zona
centro formadas por polinizaciones dirigidas con diferentes cultivares de cítricos
durante la primavera 2016. Letras distintas indican diferencia significativa entre los
tratamientos (p <0,05).
a a a a a a ab
c c
0
5
10
15
20
25
30
35
Control
Messina
valencia
Fino 49
Eureka
Benjam
ín Orri
Clemenules
Minneola
Fortu
ne
N°S
emill
as p
rom
edio
/fru
to
Variedades de cítricos
17
En el cuadro 2 se observa que en la Zona Norte (Ovalle) y Zona Centro (Mallarauco)
en el 2016, Clemenules presentó un número de semillas promedio significativamente
superior comparado con W.Murcott. Esto podría indicar que Clemenules es una
variedad más susceptible al desarrollo de semillas, al tener mayor compatibilidad de
polen con otros cítricos en comparación con W.Murcott.
Un estudio con muestras de campo de un huerto de Clemenules y W.Murcott, se
encontró un máximo de 36 semillas por fruto en Clemenules y un máximo de 16
semillas por fruta en la mandarina W.Murcott. Por lo tanto, cuando hay fuentes de
polen compatibles, el número máximo de semillas por muestra de campo es similar al
número de semillas obtenidas por polinización manual (Chao, 2005), al encontrarse
mayor número de semillas en Clemenules versus W.Murcott.
Cuadro 2. Comparación del número de semillas promedio por fruto entre W.Murcott y
Clemenules en la Zona Norte (Ovalle) y Zona Centro (Mallarauco) en 2016. Letras
distintas indican diferencia significativa entre los tratamientos (p < 0,05).
Zona Cultivar Materno N° semillas
promedio/fruto Ovalle
W.Murcott 2,6 a
Clemenules 5,7 b
Mallarauco
W. Murcott 4,0 a
Clemenules 11,5 b
18
En el cuadro 3 se observan los resultados de las polinizaciones realizadas sobre
Clemenules durante la primavera del 2017 en la Zona Norte y Centro. En la Zona
Norte, el mayor número de semillas promedio por fruto fue provocado por las
polinizaciones con W.Murcott en comparación con la mandarina Orri y los limoneros
Eureka y Benjamín Andes. En la Zona Centro, hubo un comportamiento similar, en
donde el mayor número promedio de semillas por fruto fueron formadas por
W.Murcott, seguida por Fortune y Orri, que produce 1,1 semillas promedio por fruto.
Cuadro 3. Número promedio de semillas por fruto en Clemenules en Zona Norte
(Ovalle) y Centro (Puchuncaví) formadas por polinizaciones dirigidas con diferentes
cultivares de cítricos durante la primavera 2017. Letras distintas indican diferencia
significativa entre los tratamientos (p <0,05).
Zona Norte (Ovalle)
Cultivar Paterno
N° de semillas promedio/fruto
Clemenules 0 a Eureka 0 a
Benjamín Andes 0,2 a Orri 1,4 a
W.Murcott 25,7 b
Zona Centro (Puchuncaví) Cultivar Paterno
N° de semillas promedio/fruto
Clemenules 0 a
Orri 1,1 a Fortune 8,6 b
W.Murcott 29,6 c
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El número promedio de semillas por fruto formadas por las polinizaciones realizadas
en W.Murcott durante la primavera del 2017 en la Zona Norte y Centro se observan en
el cuadro 4. En ambas zonas, el polen que produjo el mayor número promedio de
semillas por fruto fue Fortune, con un número de semillas significativamente superior a
las formadas por el grupo de los limoneros.
Cuadro 4. Número promedio de semillas por fruto en W.Murcott en Zona Norte
(Ovalle) y Centro (Puchuncaví) formadas por polinizaciones dirigidas con diferentes
cultivares de cítricos durante la primavera 2017. Letras distintas indican diferencia
significativa entre los tratamientos (p <0,05).
Zona Norte (Ovalle) Cultivar Paterno
N° de semillas promedio/fruto
W.Murcott 0 a Messina 0 a
Tangelo Minneola 0 a Orri 0 a
Benjamín Andes 0 a Eureka 0 a Fino 49 0,1 a Valencia 0,2 a Fortune 8,3 b
Zona Centro (Puchuncaví)
Cultivar Paterno
N° de semillas promedio/fruto
W.Murcott 0 a
Orri 0 a Messina 0 a
Benjamín Andes 0 a Fino 49 0 a Eureka 0,1 a
Tangelo Minneola 0,4 a Valencia 7,8 b Fortune 8,4 b
20
En la Zona Norte (Ovalle), los resultados de las polinizaciones realizadas durante
ambas temporadas sobre Clemenules indicaron que el polinizante que produce la
mayor cantidad de semillas promedio por fruto correspondió a W.Murcott, siendo
significativamente superior al número de semillas producidas por el limonero Eureka y
la mandarina Orri. Por otra parte, si bien durante la temporada 2016 el número de
semillas fue superior, no existieron diferencias significativas respecto de las
temporada 2017 (Cuadro 5).
Estudios comparativos de polinizaciones dirigidas con polen de W.Murcott y Tango
(Variedad obtenida mediante irradiación de W.Murcott) indican que W.Murcott es
capaz de generar 18,8 semillas por frutos en comparación con 0,2 semillas por fruto
producidas por Tango. Esto podría relacionarse con el gran poder germinativo del
polen de W.Murcott (Williams, 2011).
Cuadro 5. Comparación del número promedio de semillas por fruto en Clemenules
Zona Norte (Ovalle) durante temporada 2016 y 2017. Letras distintas indican
diferencia significativa entre los tratamientos (p <0,05).
Cultivar paterno N° semillas promedio/fruto
Clemenules 0,0 a
Orri 1,2 a
Eureka 5,4 a
W.Murcott 22,5 b
Temporada N° semillas promedio/fruto 2017 6,8 a
2016 7,8 a
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Las polinizaciones cruzadas sobre W.Murcott en la Zona Norte (Ovalle) indicaron que
el polen del naranjo Valencia Late es el polinizante que produce un mayor número de
semillas en comparación al grupo de los limoneros Messina, Eureka y Fino 49. Al
comparar ambas temporadas se observa que durante la temporada 2016 el número
promedio de semillas fue superior a las formadas en la temporada 2017 (Cuadro 6).
Cuadro 6. Comparación del número promedio de semillas por fruto en W.Murcott en la
Zona Norte (Ovalle) durante temporada 2016 y 2017. Letras distintas indican
diferencia significativa entre los tratamientos (p <0,05).
Cultivar paterno N° semillas promedio/fruto
W.Murcott 0,0 a
Messina 0,2 a
Eureka 0,8 a
Fino 49 1,0 a
Valencia Late 3,5 b
Temporada N° semillas promedio/fruto 2017 0,1 a
2016 2,1 b
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Figura 6. (A) Semillas de W.murcott en Clemenules, (B) Ausencia de semillas de
Eureka en Clemenules, (C) Semillas de Valencia Late en W.Murcott (D) Semillas de
Eureka en W.Murcott.
En la figura 6 se aprecian las semillas formadas por la mandarina W.Murcott y el limón
Eureka en Clemenules (A y B) y las semillas de Naranjo Valencia Late y limonero
Eureka en W.Murcott.(C y D)
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3.2 Porcentaje de germinación de polen in vitro El porcentaje de germinación de polen in vitro es variable y depende de la especie y
variedad de cítricos, de la temperatura de floración (Pardo et al., 2007) y de la
temperatura de incubación del polen (Distefano et al., 2012).
En el cuadro 7, se observan los porcentajes de germinación del polen de los
diferentes cultivares de cítricos utilizados para la polinizaciones cruzadas en este
estudio, señalando que existen diferencias significativas entre los diferentes especies
y cultivares de cítricos.
Cuadro 7. Porcentaje de germinación de polen in vitro de las diferentes variedades de
cítricos. Letras distintas indican diferencia significativa entre los tratamientos (p <0,05)
Variedades de cítricos % Germinación de polen
Valencia Late Benjamín Andes
1,46 a 1.50 a
Eureka 1,67 a Clemenules
Messina 1,85 a
8,67 b Fino 49 8,96 b
Orri 15,80 c W.Murcott 25,91 d Fortune 31,12 d
Minneola 39,24 e El porcentaje de germinación del grano de polen para el naranjo Valencia late fue de
1,46 %. Pardo et al., (2007) indica que en general la germinación de las diferentes
variedades de naranjo Valencia es bajo, sin embargo, el porcentaje de viabilidad de
polen fue de 20,9 % (Domingues, 1999), lo que podría relacionarse con el mayor
número de semillas formadas por fruto cuando se utilizó como polinizante de
W.Murcott (Cuadro 6).
24
Figura 7. (A) Polen de Clemenules,(B) Polen de W.Murcott, (C) Polen de Fortune, (D)
Polen de tangelo Minneola
Clemenules presentó un 1,85 % de germinación de polen (Figura 7), lo que coincide
con otros estudios donde se señala que la germinación de polen in vitro de esta
variedad presentó un bajo porcentaje de germinación con valores inferiores al 8%
(Gravina et al., 2011). Esto indicaría que la capacidad para formar semillas de
Clemenules en otras variedades de cítricos es débil, sin embargo, al utilizar polen de
Clemenules como polinizante de W.Murcott, el número promedio de semillas que
genera es significativamente diferente a que W.Murcott fuera autopolinizada con su
mismo polen (Figura 5).
25
Los resultados de porcentaje de germinación de los limoneros en general en este
estudio resultó ser bajo, obteniendo 1,5 % para Benjamín Andes, 1,67 % para Eureka
y 8,96 % para Fino 49. Sin embargo, estudios realizados con polen de Eureka indican
un 27,4 % de germinación de polen a los 25 °C y 25, 55 % para el limonero Fino 49
(Rabadán, 2016), resultados muy superiores a los obtenidos en este estudio (Cuadro
7). Los resultados obtenidos en Benjamín Andes, son similares a los obtenidos en
Eureka, ya que es una variedad obtenida por mutación espontanea de Eureka
(A.N.A, 2018).
Cuando los limoneros fueron utilizados como polinizantes en Clemenules tanto en la
Zona Norte como en la Zona Centro, el número de semillas promedio formadas por
fruto fue variable, ya que en la Zona Norte el polen de Eureka formó mayor número de
semillas en comparación con el polen de Fino 49 (Figura 2), sin embargo, en la zona
Centro el polen de Fino 49 fue el que desarrolló un número de semillas promedio por
fruto significativamente superior al polen de Eureka (Figura 3).
La mandarina Orri presentó un porcentaje de germinación de 15,8 % en las
condiciones de este estudio. Sin embargo, estudios realizado por Schneider et al.,
(2009) indican que la viabilidad del polen fue de 0% y el número de granos de polen
germinados en su misma flor polinizados manualmente no supero a 10. A pesar que
se obtuvo un porcentaje de germinación mayor al señalado en la literatura, el número
de semillas que generó tanto en Clemenules (Cuadro 3) como en W.Murcott (cuadro
4), fueron significativamente menor que las obtenidas por otros polinizantes.
Se han realizado diversos estudios sobre el porcentaje de germinación de polen de
W.Murcott, los cuales señalan que éste varía según las condiciones de cada estudio.
Fasiolo y Rey (2013) obtuvieron un 39 % de germinación de polen in vitro, mientras
que otros estudios obtuvieron 25 % (Gravina et al., 2011).
26
Bajo las condiciones de este ensayo se obtuvo un 25,9 %, lo cual coincide con los
resultados mencionados (Cuadro 7). El alto porcentaje de germinación de polen
explicaría el número de semillas que es capaz de producir en frutos de Clemenules
(Cuadro 3).
La mandarina Fortune y Tangelo Minneola son los cultivares que presentaron el
mayor porcentaje de germinación de polen, 31,12 % y 39,24 % respectivamente
(Cuadro 7, figura 7), y fueron los que formaron el mayor número promedio de semillas
por fruto, tanto en Clemenules (Figura 2 y 3) como en W.Murcott (Figura 5). Asíns et
al., (2002) señala que el hibrido Fortune, en condiciones de polinización cruzada con
cualquier variedad de clementina, puede producir de 20 a 25 semillas por fruto, datos
que concuerdan con los resultados obtenidos en este estudio (Figura 2 y 3). Estudios
realizados por Barry (1995), indican que el polen de tangelo Minneola tiene un alto
porcentaje de germinación de polen.
Barry (1995) realizó una calificación de distintos pólenes de cítricos según el
contenido de semillas formadas en Clemenules en tres categorías; clasificando como
débil, al limonero Eureka y Valencia Midknight, intermedio a Valencia late y fuerte
cuando se utilizó tangelo Minneola. Según Gravina (2014), en condiciones de campo
o in vivo, en parentales compatibles, porcentajes de germinación en el estigma
superiores al 10% son suficientes para asegurar la fecundación en condiciones de
temperatura ideales.
En la Figura 8 se observa que existe una correlación lineal positiva de un 60% entre el
número de semillas promedio por fruto de mandarinas con el porcentaje de
germinación de polen in vitro, es decir, un bajo número de semillas es indicativo de la
baja viabilidad de los rudimentos seminales presentes en la flor y viceversa, ya que la
polinización forzada conduce a la fecundación de casi todos los óvulos en el ovario
(Bermejo, 2011).
27
Además, se aprecian 2 grupos, el primero (Grupo B) en que las variedades de
cítricos con mayor porcentaje de germinación de polen in vitro fueron las que
desarrollan mayor número semillas en los frutos, los que según los resultados
obtenidos son atribuidos al grupo de las mandarinas e híbridos y el segundo (Grupo
A) en que el porcentaje de germinación de polen es menor y por ende el desarrollo de
semillas en los frutos es menor, los cuales corresponden al grupo de los limoneros y
naranjo Valencia.
Figura 8. Relación entre el número de semillas promedio por fruto y el porcentaje de
germinación de polen in vitro de los diferentes cultivares de cítricos.
% G e rm in a c ió n d e p o le n
Nº
sem
illa
s p
rom
ed
io /
fru
to
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0
0
1 0
2 0
3 0
y = 0 ,5 1 9 1 x + 0 ,6 8 6 1
r2 = 0 ,6 0 9 4p = 0 ,0 0 0 1
A
B
28
En Clemenules se establece una correlación lineal positiva de un 78% entre el número
de semillas promedio por fruto y el porcentaje de germinación de polen in vitro de las
diferentes variedades de cítricos (Figura 9), lo que indica que esta variedad es más
susceptible al desarrollo de semillas en sus frutos en comparación con W.Murcott, en
donde la relación es de 20% (Figura 10), lo que coincide con los resultados del cuadro
2. Por otra parte, en Clemenules se distingue claramente la formación de los grupos
de variedades que poseen el mayor porcentaje de germinación de polen y que a su
vez desarrollan mayor número de semillas por fruto (Grupo B versus Grupo A), sin
embargo, en el caso de W.Murcott estos grupos no se distinguen (Figura 10).
.
Figura 9. Relación entre el número de semillas promedio por fruto en Clemenules y el
porcentaje de germinación de polen in vitro de los diferentes cultivares de cítricos
% G e rm in a c ió n d e p o le n
Nº
sem
illa
s p
rom
ed
io /
fru
to
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0
0
1 0
2 0
3 0
y = 0 ,6 4 2 7 x + 0 ,6 7 0 9
r2 = 0 ,7 8 4 4p < 0 ,0 0 0 1
A
B
29
Figura 10. Relación entre el número de semillas promedio por fruto en W.Murcott y el
porcentaje de germinación de polen in vitro de los diferentes cultivares de cítricos
% G e rm in a c ió n d e p o le n
Nº
sem
illa
s p
rom
ed
io /
fru
to
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0
0
5
1 0
1 5
y = 0 ,1 3 5 2 x + 1 ,1 5 8 5
r2 = 0 ,2 0 9 2p = 0 ,0 8 6 5 n s
30
3.3 Evaluación de la influencia de la temperatura en la germinación de polen y formación de semillas
En el cuadro 8 se observa que la temperatura media diaria del período de floración y
cuaja en el año 2017 fue 1,7 °C inferior a la temperatura media del año 2016, lo cual
pudo haber influenciado en el porcentaje de germinación de polen durante el período
efectivo de polinización. Según Distefano et al., (2012) uno de los factores
ambientales más importantes que podría afectar el rendimiento del polen es el
régimen de temperatura durante el período que comprende desde la floración hasta la
fecundación, ya que se ve afectada la germinación del polen y la cinética del tubo
polínico en el estilo. La temperatura media diaria registrada durante el mes de octubre
durante los años 2016 y 2017 (Cuadro 8), fue menor durante la última temporada, lo
que pudo haber afectado el poder germinativo del polen y por ende la formación de
semillas en los frutos.
Cuadro 8. Temperatura media diaria (°C) y Grados día (T° base 12, 5 °C) durante el
período que comprende desde la floración a cuaja (Octubre a Diciembre) del año
2016 y 2017) en Zona Norte. Estación meteorológica El Sauce.
Temperatura
media diaria (°C) 2016
Temperatura media diaria
(°C) 2017
Grados día 2016
Grados día 2017
Octubre 15,1 11,1 81,4 -43,0
Noviembre 16,8 17,0 127,7 134,0
Diciembre 18,5 17,2 120,8 93,9
Floración - Cuaja 16,8 15,1 329,9 227,9
31
Las bajas temperaturas durante la formación de la flor, reducen la germinación de
polen y el número de semillas, como resultado de la disminución en el contenido de
almidón y concentraciones de azúcar acumuladas en el grano de polen en las últimas
etapas de desarrollo (Shaked et al., 2004).
Lo anterior podría explicar la variación entre la formación de semillas durante ambas
temporadas, en el caso de Clemenules, si bien no existieron diferencias significativas,
en la temporada 2016, el número promedio de semillas por fruto fue superior en
comparación con la temporada 2017 (cuadro 5). En el caso de W.Murcott, la
formación de semillas durante 2016 fue significativamente superior a las formadas
durante el año 2017 (cuadro 6).
Se observa que la acumulación de grados día durante la primera temporada de
estudio fue mayor que la temporada 2017(cuadro 8), lo que podría afectar la duración
e intensidad de la floración.
La viabilidad del polen se relaciona con la temperatura de los estadios 55 y 56 BBCH
(Agustí et al., 1997), es decir, en estado de botón verde y blanco, y no con la
temperatura durante la floración (Gravina, 2014). El número de óvulos que
potencialmente podrían desarrollar semillas también es afectado por las bajas
temperaturas y disminuye cuando las temperaturas son considerablemente bajas
durante floración (Pardo et al., 2007).
En un estudio realizado por Bermejo et al., (2012) se determinó que existe una
correlación entre las temperaturas mínimas durante el período de floración y el
número de semillas formadas, lo que demuestra el efecto negativo de las bajas
temperaturas en la cantidad de semillas formadas.
32
En la mayoría de las especies de cítricos la germinación del polen se incrementa en el
rango de 10° a 30 °C, aunque para una misma temperatura se presentan diferencias
entre especies, resultando en una interacción genotipo temperatura (Gravina, 2014).
Cuando las temperaturas son menores a 20°C se reduce o inhibe totalmente la
germinación del grano de polen, sin embargo, cuando las temperatura son elevadas
entre 25 y 30 °C la germinación del grano de polen y crecimiento del tubo polínico a lo
largo del estigma se ve favorecido (Agustí, 2010).
Esto podría explicar la variabilidad en la formación de semillas entre las diferentes
especies y cultivares de cítricos, ya que algunos casos el poder germinativo del grano
de polen se ve afectado mayormente cuando las temperaturas son bajas. La
capacidad de formar semillas, disminuye cuando las temperaturas son notoriamente
bajas y superan el nivel de sensibilidad de cada variedad (Gravina, 2014).
Los limoneros pueden desarrollar esterilidad inducida por la condiciones ambientales
(Agustí et al., 2003) siendo afectado por las bajas temperaturas. En el caso de limón
Fino, las bajas temperaturas durante el proceso de formación de flores, disminuyen el
poder germinativo del polen (Pardo et al., 2007). Lo anterior, podría explicar que la
formación de semillas generadas por polen de Fino 49 fue inferior a las reportadas
durante la temporada 2017. Lo mismo ocurre en el Limón Eureka, en donde las bajas
temperaturas inducen esterilidad masculina (Yamamoto, 2014), lo cual podría explicar
el mismo comportamiento en el desarrollo de semillas generadas por esta variedad.
33
4. Conclusiones Clemenules es una variedad altamente susceptible a ser polinizada por distintos
cultivares de citricos en comparación con W.Murcott, existiendo una relación positiva
entre el número de semillas promedio por fruto y el porcentaje de germinación de
polen in vitro de cítricos.
El polen del grupo de mandarinas e hibridos es el que produce la mayor cantidad de
semillas en Clemenules y W. Murcott en comparación a pólenes de otros citricos, lo
que se traduce en una información trasendental para la toma de decisiones en la
combinación de especies y variedades de citricos en un mismo huerto y con huertos
vecinos.
Se predice que la temperatura durante el período de floración influye en la
germinación de polen in vivo y por ende en la formación de semillas.
34
Resumen Las mandarinas Clemenules y W.Murcott son las variedades más producidas en Chile,
debido a su gran calidad organoléptica y a la capacidad de producir frutos sin semillas
en condiciones de aislamiento, debido a la partenocarpia. Sin embargo, dada la
introducción de nuevos cultivares de cítricos y la gran cercanía de los huertos es que
se está desarrollando polinización cruzada. Dado que existe compatibilidad entre los
diferentes cultivares de cítricos con las mandarinas se produce la formación de
semillas en los frutos. Con el objetivo de evaluar la capacidad de formación de
semillas de los diferentes grupos de cítricos, tales como mandarinas e híbridos
(Clemenules, W.Murcott. Fortune, Orri y tangelo Minneola); limoneros (Eureka,
Benjamín Andes, Fino 49 y Messina) y naranjo Valencia Late se realizaron ensayos
de polinizaciones dirigidas sobre Clemenules y W.Murcott en dos zonas citrícolas de
Chile durante dos temporadas (2016 y 2017). Previo a las polinizaciones se realizaron
ensayos de germinación de polen in vitro. Para evaluar la influencia de las
condiciones ambientales sobre la formación de semillas, se recolectaron y evaluaron
datos de meteorología en la época de floración y cuaja. Las polinizaciones cruzadas
con polen de los cultivares del grupo de las mandarinas e híbridos sobre Clemenules
fueron las que provocaron el mayor número de semillas en ambas zonas y
temporadas de estudios, comportándose como el cultivar más susceptible al
desarrollo de semillas en comparación con W.Murcott. Además, se establece una
relación positiva entre el número de semillas por fruto y el porcentaje de germinación
de polen.
Palabras clave: Mandarinas, polinización cruzada, semillas, germinación de polen.
35
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