INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATA SECCIN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIN PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BIOMEDICINA MOLECULAR

Caracterizacin molecular de la poli (A) polimerasa (EhPAP) en

Entamoeba histolytica

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:

MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR

P R E S E N T A

JESSICA MARIA GARCIA VIVAS

MXICO, D.F., FEBRERO DEL 2006.

2

3

4

NDICE

LISTA DE ABREVIATURAS i

LISTA DE FIGURAS iv

LISTA DE TABLAS vi

RESUMEN vii

ABSTRACT viii

1. INTRODUCCIN 1

1.1 Antecedentes histricos de la amibiasis 1

1.2 Taxonoma de E. histolytica 3

1.3 Ciclo de vida de E. histolytica 5

1.4 Epidemiologa de la amibiasis 7

2. ANTECEDENTES 9

2.1 Generalidades sobre la regulacin de la expresin gnica en

eucariontes 9

2.2 Procesamiento del pre-RNAm en eucariontes 10

2.2.1 Capping del pre-RNAm 11

2.2.2 Splicing del pre-RNAm 12

2.2.3 Corte y poliadenilacin del pre-RNAm 14

2.3 Secuencias cis-reguladoras que participan en el corte y

poliadenilacin 16

2.4 Maquinaria de corte y poliadenilacin 20

2.4.1 Factor de especificidad del corte poliadenilacin (CPSF) 20

5

2.4.2 Factor de estimulacin de corte (CstF) 21

2.4.3 Factores de Corte (CFlm y CFllm) 21

2.4.4 oli (A) polimerasa (PAP) 22

2.4.5 rotena de unin al tracto de poli (A) II (PABP II) 22

2.4.6 Protenas adicionales 22

2.5 Mecanismo de corte y poliadenilacin 23

2.5.1 Corte del pre-RNAm 24

2.5.2 Poliadenilacin 26

2.6 Readenilacin citoplsmica 28

2.7 Importancia de la cola de poli (A) del RNAm 30

2.8 Poli(A) polimerasa en eucariontes 31

2.8.1 Generalidades 31

2.8.2 Participacin de la PAP en el splicing del RNAm 35

2.9 Poli (A) polimerasa en el ciclo celular 36

2.9.1 Generalidades del ciclo celular 36

2.9.2 Mecanismos de regulacin del ciclo celular 38

2.9.3 Papel de la PAP en el ciclo celular 39

2.10 Identificacin de las posibles secuencias en cis y

el procesamiento del pre-RNAm en E. histolytica 41

2.10.1 Identificacin de protenas involucradas en el

procesamiento del pre-RNAm en E. histolytica 44

2.10.2 Papel de la poliadenilacin en el fenotipo de

resistencia a mltiples frmacos 46

3 JUSTIFICACION 48

6

4 OBJETIVOS 49

4.1 Objetivo general 49

4.2 Objetivos especficos 49

5 MATERIALES Y METODOS 50

5.1 Estrategia Experimental 50

5.2 Anlisis in silico de la secuencia del gen EhPap 50

5.3 Subclonacin del gen EhPap en el vector pRSET-A 52

5.3.1 Restriccin enzimtica 53

5.3.2 Ligacin 56

5.3.3 Preparacin de bacterias competentes 56

5.3.4 Transformacin de bacterias por choque trmico 57

5.3.5 Mini-preparacin de DNA plasmdico 58

5.4 Expresin de la protena EhPAP recombinante 59

5.5 Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) 61

5.6 Purificacin de la protena EhPAP recombinante 62

5.7 Electroelucin de la protena EhPAP recombinante 63

5.8 Inmunizacin de ratones para obtener anticuerpos 64

5.9 Cultivo de trofozotos 66

5.10 Obtencin de extractos nucleares y citoplsmicos de la clona A 66

5.11 Ensayos de Western blot 67

5.12 Sicronizacin de trofozoitos de la clona L-6 69

5.13 Obtencin del RNA total de los trofozoitos sincronizados 69

5.14 Ensayo de RT-PCR semi-cuantitativa 70

6 RESULTADOS 73

7

6.1 Anlisis in silico: La EhPAP es una protena evolutivamente

conservada 73

6.2 Subclonacin del gen EhPap en el vector pRSET-A 81

6.2.1 Restriccin enzimtica 81

6.2.2 Ligacin 84

6.2.3 Anlisis de clonas y mini-preparaciones de DNA 87

6.3 Expresin de la protena EhPAP recombinante 90

6.4 Purificacin de la protena EhPAP recombinante 92

6.5 Electroelucin de la protena EhPAP recombinante 95

6.6 Inmunizacin de ratones para la obtencin de anticuerpos 95

6.7 Localizacin subcelular de la EhPAP 96

6.8 La expresin de EhPAP aument en la fase G1 y S

del ciclo celular 97

7 DISCUSION 101

8 CONCLUSIONES 106

9 BIBLIOGRAFIA 108

8

LISTA DE ABREVIATURAS

3 UTR regin 3 no traducida

5 UTR regin 5 no traducida

aa aminocidos

ATP trifosfato de adenosina

cdk cinasa dependiente de ciclina

cDNA cido desoxirribonucleico complementario

CTD Dominio carboxi terminal de la RNA polimerasa II

CF I m Factor de corte I de mamfero

CF II m Factor de corte II de mamfero

CPSF Factor de especificidad de corte y poliadenilacin

CstF Factor estimulante del corte

DEPC dietilpirocarbonato

DNA cido desoxirribonucleico

DSE Elemento o secuencia ro abajo

DTT ditiotreitol

dNTPs didesoxinucletidos trifosfatados

dT didesoxitimidina

EhPap gen codificante de la protena EhPAP

EhPgp5 gen codificante de la protena EhPGP5

EDTA cido etilen diamino tetra-actico

EC extractos citoplsmicos

EN extractos nucleares

9

FIP 1 factor de interaccin con la protena PAP

G1 fase de la mitosis, intervalo 1

G2 fase de la mitosis, intervalo 2

GT enzima guanililtransferasa

kb kilobases

kDa kiloDaltones

LB medio de cultivo para bacterias Luria-Bertani

M fase de la mitosis, mitosis

MDR resistencia a mltiples drogas

g microgramos

l microlitros

M micromolar

ml mililitros

mM milimolar

MT enzima metiltransferasa

nt nucletidos

OMS Organizacin Mundial de la Salud

PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida

PAP poli (A) polimerasa

PAPB protena de unin al tracto de poli (A)

pb pares de bases

PBS solucin salina amortiguadora de fosfatos (NaCl, KCl, Na2PO4,

KH2PO4)

PCR reaccin en cadena de la polimerasa

10

pre-RNAm cido ribonucleico mensajero precursor

rpm revoluciones por minuto

RNA cido ribonucleico

RNAm cido ribonucleico mensajero

RNA poli (A+) cido ribonucleico mensajero poliadenilado

RNA poli (A-) cido ribonucleico mensajero no poliadenilado

RNApol II RNA polimerasa II

RNPsn ribonucleoprotena nuclear pequea

RT transcripcin reversa

RTP enzima RNA 5 trifosfatasa

S fase de la mitosis, sntesis

TAE solucin amortiguadora (Tris, cido actico glacial y EDTA)

TBE solucin amortiguadora (Tris, cido brico y EDTA)

U1 RNPsn ribonucleoprotena nuclear pequea rica en uridina 1

U2 RNPsn ribonucleoprotena nuclear pequea rica en uridina 2

U2AF factor auxiliar de U2 RNPsn

USE secuencia localizada ro arriba

xg gravedades

11

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Ciclo de vida de E. histolytica 8

Figura 2. Diagrama esquemtico que muestra las secuencias

conservadas en los intrones 13

Figura 3. Proceso de eliminacin de intrones o splicing 15

Figura 4. Comparacin de las secuencias cis-reguladoras que

participan en el corte y poliadenilacin del pre-RNAm de mamferos

y levaduras 19

Figura 5. Esquema del reclutamiento de los factores

involucrados en la reaccin de corte del pre-RNAm en mamferos 25

Figura 6. Diagrama esquemtico que muestra las protenas

que participan en la reaccin de poliadenilacin 27

Figura 7. Estructura molecular de la poli (A) polimerasa II de

humano (PAP II) 32

Figura 8. Diagrama tridimensional de la estructura cristalina

de la poli(A) polimerasa de bovino 33

Figura 9. Etapas del ciclo celular en eucariontes y su regulacin 40

Figura 10. Representacin del alineamiento mltiple de 8

secuencias genmicas (gDNA) y de cDNA de diferentes genes

de E. histolytica 42

Figura 11. Esquema de las secuencias cis-reguladoras del

procesamiento del pre-RNAm en E. histolytica 43

Figura 12. Modelo de la maquinaria del procesamiento del

12

extremo 3 del pre-RNAm en E. histolytica 47

Figura 13. Estrategia experimental 51

Figura 14. Esquema del vector pRSET 54

Figura 15. Secuencia de la EhPAP obtenida del banco de datos 74

Figura 16. Blast realizado tomando como referencia la

secuencia de EhPAP 76

Figura 17. Alineamiento mltiple de EhPAP con PAP de H. sapiens y PAP1 de S. cerevisiae 79

Figura 18. Representacin esquemtica de la estructura molecular

de PAPs de diferentes organismos incluyendo la EhPAP de

E. histolytica 80

Figura 19. rbol filogentico sin raz de las PAPs de diferentes

organismos 82

Figura 20. Comparacin de la estructura tridimensional de la

EhPAP y la PAP de bovino 83

Figura 21. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los

productos de la restriccin enzimtica del vector pRSET-A y

TA-EhPap 85

Figura 22. Purificacin del vector pRSET y el gen EhPap 86

Figura 23. Restriccin enzimtica de minipreps de 9 clonas

correspondientes a la ligacin de pRSET-EhPap 88

Figura 24. Electroferograma de la secuencia del gen

EhPap clonado en el vector pRSET 89

13

Figura 25. Expresin de la protena recombinante EhPAP 91

Figura 26. Purificacin de la protena recombinante EhPAP 93

Figura 27. Inmunodeteccin de la protena recombinante

EhPAPr purificada 94

Figura 28. Ensayo de Western blot con el anticuerpo especfico

anti-EhPAP 98

Figura 29. Anlisis de la expresin del RNAm del gen EhPap en

trofozotos de la clona L6 sincronizados en el ciclo celular 100

14

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Clasificacin taxonmica de E. histolytica 4

Tabla 2. Tabla comparativa de los factores que participan en

el procesamiento del extremo 3 de E. histolytica, H. sapiens

y S. cerevisiae 45

Tabla 3. Comparacin de EhPAP con otras PAPs de eucariontes 77

15

RESUMEN

En eucariontes, la poliadenilacin del extremo terminal 3 del pre-RNAm es esencial

para el transporte, estabilidad y traduccin del RNAm. Se identific y se clon el gen

que codifica para la protena poli(A) polimerasa nuclear (EhPAP) en Entamoeba

histolytica. Mediante un alineamiento de secuencias de distintas PAPs de otros

eucariontes se demostr que EhPAP contiene una regin de unin al RNA y un dominio

cataltico central descritos en otras PAPs nucleares pertenecientes a la familia de las

nucleotidil transferasas. La EhPAP recombinante expresada en bacterias se us para

generar anticuerpos especficos, los cuales reconocieron dos isoformas de la EhPAP de

60 y 63 kDa en extractos nucleares y citoplsmicos en ensayos de Western blot. Por

ensayos de RT-PCR de la expresin el RNAm gen EhPap en las fases del ciclo celular

se observ un incremento en las fases G1 y S.

16

ABSTRACT

In eukaryotes, polyadenylation of pre-mRNA 3 end is essential for mRNA export,

stability and translation. Here we identified and cloned a gene codifying for putative

nuclear poly(A) polymerase (EhPAP) in Entamoeba histolytica. Protein sequence

alignments with eukaryotic PAPs showed that EhPAP has the RNA-binding region and

the PAP central domain with the catalytic nucleotidyl transferase domain described for

the other nuclear PAPs. Recombinant EhPAP expressed in bacteria was used to

generate specific antibodies, which recognized two EhPAP isoforms of 60 and 63 kDa in

nuclear and cytoplasmic extracts by Western blot assay. RT-PCR assay showed that

EhPap mRNA expression is about 10- and 7-fold increased in G1 and S phase,

respectively, through cell cycle progression.

17

1. INTRODUCCIN

1.1 Antecedentes histricos de la amibiasis

El trmino amiba proviene del griego amoibe que significa cambio (morfologa y

gran movilidad), de ah el nombre de la enfermedad conocida como amibiasis. La

amibiasis humana es una infeccin del tracto gastrointestinal producida por el parsito

protozoario Entamoeba histolytica al ser ingerido en agua o alimentos contaminados por

heces fecales (Schaudinn, 1903). Desde el siglo XVIII se consider una enfermedad

tropical, sin embargo, actualmente se sabe que es una enfermedad distribuida

mundialmente con predominio en las ciudades con grandes concentraciones humanas y

que ataca fundamentalmente a grupos con desnutricin y deficientes prcticas de

higiene.

El descubrimiento y la descripcin inicial de la amibiasis la dio el mdico ruso

Fedor Lsch en 1873 (Kean, 1978), quien sugiri que exista una relacin entre la

presencia de E. histolytica y la amibiasis al tratar a un paciente en San Petersburgo. Sin

embargo, al infectar a un perro con el parsito obtenido del paciente, no logr

reproducir la enfermedad en el animal y no pudo demostrar la relacin entre el parsito

y la patologa. No es hasta 1891, cuando Councilman y La Fleur, describieron la

evidencia clnica y patolgica de la asociacin de E. histolytica con la disentera y el

absceso heptico en humanos (Councilman, 1891). En 1893, Quincke y Roos

describieron al parsito en su forma de quiste (Kean, 1978). Posteriormente Walter y

Sellards (1913) determinaron que: 1) la transmisin de la enfermedad se da por los

quistes no por los trofozotos, 2) los portadores asintomticos son los reservorios y

18

probablemente los responsables de la transmisin, 3) existe un grupo de individuos de

riesgo, y 4) existen diferencias de virulencia en los parsitos.

En Mxico, existen registros de la enfermedad desde 1611 cuando fue relatada

por Fernndez del Castillo al efectuar la autopsia de Fray Garca Guerra, arzobispo y

virrey, quien falleci a dos aos de su llegada a la Nueva Espaa de una enfermedad

descrita como flaqueza de nimo, congoja y calores y en la cual, se encontr un

absceso heptico (Fournier, 1956).

En 1925 Emile Brumpt sugiri que haba dos especies: una capaz de causar

enfermedad invasora, E. histolytica, y otra que nunca causa enfermedad, a la que l

llam Entamoeba dispar. La hiptesis de Brumpt no fue reconocida por otros

investigadores en su momento. En la dcada de los 70s se empezaron a acumular

observaciones que apoyaban a la hiptesis de Brumpt de la existencia de dos

organismos distintos en lo que se conoca como E. histolytica. Se continuaron

acumulando datos bioqumicos, inmunolgicos y genticos y en 1993 se public una

redescripcin formal de E. histolytica, separndola de E. dispar (Diamond-Clark, 1993).

Adems, con base a la informacin gentica obtenida de los bancos de datos, se ha

confirmado que son especies diferentes (Britten y col., 1997; Nunez y col., 2001;

Blessmann y col., 2001).

19

1.2 Taxonoma de E. histolytica

E. histolytica es un parsito protozoario, el cual pertenece a los Rhizopodos que

son organismos que tienen como caracterstica formar pseudpodos en alguna etapa

de su vida y a los Entamoebidae, cuyos miembros son parsitos (Tabla 1). Es una de

las seis diferentes especies de Entamoeba conocidas que infectan al hombre las cuales

son: E. coli, E. gingivalis, E moshkovskii, E. hartmanni, E. polecki y E. histolytica

(Bruckner, 1992).

E. histolytica es un parsito protista del intestino humano, caracterizado por su

estructura celular simple y metabolismo primitivo. Estudios basados en la estructura, el

metabolismo, la organizacin del DNA y RNA, as como la carencia de mitocondria,

aparato de Golgi, retculo endoplsmico rugoso y citoesqueleto microtubular (Martnez-

Palomo, 1986), sugieren que es uno de los eucariontes ms primitivos, o

protoeucariontes (Bakker-Grunwald y Wostman, 1993). Presenta cromosomas que no

estn condensados, con variaciones en tamaos que dificultan el poder determinar el

nmero exacto de stos (Loftus 2005). Es considerada como una reliquia viviente de la

fase temprana de la evolucin de los eucariontes, la cual ocurri antes de que la

simbiosis promitocondrial surgiera, aunque la existencia o ausencia de mitocondrias en

E. histolytica sigue siendo un tema de debate, ya que no contiene una mitocondria con

estructura y forma caracterstica o enzimas tpicas del metabolismo energtico.

20

Reino:

Subreino:

Phylum:

Superclase:

Clase:

Subclase:

Orden:

Suborden:

Familia:

Gnero:

Especie:

Protista

Protozoo

Sarcomastigophora

Rhizopoda

Lobosea

Gymnamoebida

Amoebida

Tubulina

Entamoebidae

Entamoeba

histolytica

Tabla 1. Clasificacin taxonmica de E. histolytica

Fuente: Levine et al., 1980

21

Se han descrito tres genes en el genoma nuclear de E. histolytica que codifican

para tres protenas asociadas tpicamente a la mitocondria en otros eucariontes,

aunque estructuralmente parece carecer de ella. La chaperonina 60 (cpn 60 Hsp 60),

es exclusiva de mitocondria, hidrogenosomas y cloroplastos (Clark y Rogers, 1995); la

nucletido piridina (NAD/NADP) transhidrogenasa (PNT: pyridine nucleotde

transhydrogenase, por sus siglas en ingls), que es una protena de tipo mitocondrial,

junto con la enzima metablica, piruvato: ferrodoxin-oxidoreuctasa (POR) (Huber y

col.,,1988); y la alcohol dehidrogenasas ADH1, ADHE, ADH3 (Yang, 1994). Adems,

diferentes grupos de investigacin, han identificado una serie de pequeos organelos a

los cuales han llamado mitosoma, crypton (Tovar y col., 1999, Mai y col., 1999, Ghosh y

col., 2000) o Ehko (Orozco y col., 1997, Marchat y col., 2002), los cuales contienen DNA

y/o protenas especficas que comparten con algunas caractersticas biolgicas de la

mitocondria. La razn por la que se considera a este organelo una mitocondria

remanente, se ha predicho por la deteccin de los genes de las protenas

mencionadas que tienen como blanco la mitocondria en otros eucariontes (Ghosh y col.,

2000).

1.3 Ciclo de vida de la amiba

E. histolytica presenta diferentes fases o estados en su ciclo de vida: trofozoto,

prequiste, quiste, metaquiste y trofozoto metaqustico (Dobell, 1928), entre los cuales

los ms importantes en la transmisin de la infeccin son el quiste y el trofozoto. La

infeccin se adquiere por la ingestin de comida o agua contaminada con quistes de E.

histolytica provenientes de las heces fecales de humano y por contacto directo oral-

22

fecal. La transmisin de E. histolytica u otros parsitos por agua contaminada es muy

comn en pases de tercer mundo, donde la mayor parte del agua potable no es

tratada. El uso de heces fecales como abono o fertilizantes tambin es una fuente

importante de infeccin (Markell, 1986).

El quiste maduro tiene cuatro ncleos (tetranucleado) (Gathiram, 1990), es

inmvil, esfrico (8.5-19 m de dimetro) y resistente a cambios ambientales y a los jugos gstricos, puede permanecer viable durante tres meses en el agua o alimentos.

Sin embargo, puede ser eliminado por hipercloracin o iodinacin (Kahn, 1975). Al

entrar en el tracto digestivo, se desenquista en el intestino delgado transformndose en

metaquiste, el cual duplica sus ncleos (ocho ncleos) formando as los trofozotos

metaqusticos que miden 8 m de dimetro (Martnez-Palomo, 1982). Estos se alimentan y crecen hasta transformarse en trofozotos maduros (12-60 m) que se establecen en el colon, donde se adhieren a la mucosa intestinal y se alimentan de

bacterias y restos celulares (Walsh, 1986). Los trofozotos presentan gran motilidad, son

hialinos, forman pseudpodos y son muy sensibles a cambios ambientales.

Los trofozotos, una vez en el intestino delgado, pueden tener diferentes destinos

los cuales podran estar relacionados por malos hbitos alimenticios, el alcoholismo, el

uso de esteroides y problemas del sistema inmune. Por lo tanto: 1) pueden habitar el

intestino grueso como comensal, dividirse y alimentarse de desechos orgnicos,

azcares y bacterias; 2) pueden invadir la mucosa intestinal produciendo disentera

amibiana aguda (con una duracin de 14 das) o crnica (ms de 15 das); 3) tambin

23

pueden causar colitis amibiana fulminante o amibiasis extraintestinal caracterizada por

la invasin del hgado y la formacin de abscesos hepticos principalmente, o bien la

invasin de otros rganos como son: piel, pulmn y el corazn; 4) o bien, los trofozotos

pueden enquistarse, en un proceso aparente estimulado por condiciones luminales no

ideales para los trofozotos, aqu el trofozoto reduce su tamao y compacta su DNA en

un solo ncleo (uninuclear) formando al prequiste, el cual realiza una divisin nuclear

hasta formar nuevamente los cuatro ncleos del quiste que ser eliminado con las

heces. La infeccin de un nuevo individuo puede producirse con tan slo un quiste en

el agua o alimentos contaminados (Fig. 1). Con inculos ms grandes el periodo de

incubacin puede acortarse en unos pocos das en vez de 1-2 semanas. Los trofozotos

que son excretados durante los perodos de colitis aguda no transmiten la infeccin, ya

que se desintegran rpidamente en el medio ambiente (Dobell, 1928; Lushbaugh y

Millar, 1988).

1.4 Epidemiologa de la amibiasis

Segn la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), la amibiasis es la 4 causa de

muerte a nivel mundial producida por un parsito, despus de la malaria, la enfermedad

de Chagas y la leishmaniasis; y es la 3 causa de morbilidad por un parsito despus

de la malaria y tricomoniasis (Espinosa-Cantellano y col., 2000)

La amibiasis es considerada un problema de salud pblica ya que entre el 10-12

% de la poblacin mundial (500 millones) es portadora de trofozotos de E. histolytica y

24

Figura 1. Ciclo de vida de E. histolytica. El proceso inicia cuando E. histolytica es

eliminada en forma de quistes en las heces fecales (1), que contaminan agua o

alimentos y son ingeridos por va oral por otro husped (2). Se desenquistan en el

intestino delgado (3) formando los trofozotos, que migran al intestino grueso (4), los

cuales se alojan en ste. (A) El individuo puede permanecer asintomtico, y se pueden

producir desde sntomas leves hasta disentera grave, o invadir otros rganos, tales

como el hgado, pulmn o cerebro (C).

25

Etapa infectiva

Etapa diagnstica

Ingesta de quistes maduros

Excrecin en heces fecales

Colonizacin no invasiva

Enfermedad intestinal

Enfermedad extraintestinal

Multiplicacin

Trofozotos

TrofozotosDesenquistamiento

Quiste

Salida del husped

26

el 10% de sta (50 millones) sufre la enfermedad, la letalidad por complicaciones se

estima entre el 0.1 y 0.25% (70-100,000 muertes) al ao (OMS, 1998). En Mxico, el

8.4% de la poblacin es seropositivo para la deteccin de antgenos de E. histolytica y

un 1.1 % de stos present abscesos hepticos entre 1999-2000

(http://www.ssa.gob.mx).

2. ANTECEDENTES

2.1 Generalidades sobre la regulacin de la expresin gnica en eucariontes

En todos los seres vivos, la regulacin de la expresin gnica es de gran

importancia ya que de esta depende el buen funcionamiento del organismo. Con los

recientes anlisis de genomas de diferentes organismos, principalmente en eucariontes,

se ha observado que slo una pequea fraccin del material gentico,

aproximadamente el 1.5%, codifica para protenas, mientras que la mayor parte del

DNA genmico participa en la regulacin de la expresin gentica (Mignone, 2002). La

informacin gentica se encuentra contenida en el DNA nuclear y mitocondrial, la cual

se traduce a protenas por medio del RNAm, que es el encargado de llevar la

informacin contenida en el DNA, hacia afuera del ncleo. Es en este proceso en donde

se encuentran diversos niveles o puntos de control que regulan la expresin gentica.

En eucariontes, los principales puntos de control se dan a nivel de: i) la transcripcin,

que permite la sntesis del pre-RNAm (transcrito primario) a partir del DNA por medio de

la RNA polimerasa II (RNA pol II) y otros factores de transcripcin; ii) el procesamiento

del pre-RNAm, por medio del cual se genera un RNAm maduro funcional que pueda ser

traducido a protena; en este procesamiento se incluye principalmente el capping, el

27

splicing y la reaccin de corte/poliadenilacin del extremo 3; y iii) la traduccin, que

consiste en la sntesis de una protena funcional a partir del RNAm, incluyendo posibles

modificaciones post-traduccionales (Day y Tuite, 1998). En este trabajo nos

enfocaremos en los mecanismos moleculares del procesamiento del pre-RNAm.

2.2 Procesamiento del pre-RNAm en eucariontes

En eucariontes, el hecho de obtener una copia de la informacin gentica del

DNA para generar un transcrito no significa que se ha completado la sntesis del RNA

mensajero maduro, sino que se obtiene un pre-RNAm el cual requiere de un

procesamiento nuclear para poder ser funcional.

El pre-RNAm, presenta una estructura tripartita que consiste en una regin 5 no

traducida (5 untranslated region: 5UTR por sus siglas en ingls) la cual tiene un rango

de longitud de 100 a 200 nucletidos (nt) y es rica en G y U; una regin codificante que

est constituida por exones que codifican para aminocidos e intrones no codificantes

que son eliminados en el proceso de splicing; y una regin 3 no traducida (3UTR),

cuya longitud es muy variable ya que puede ser de 200 nt en plantas y hongos, a 800 nt

en humanos y otros vertebrados (Mignone, 2002). El procesamiento del pre-RNAm se

lleva a cabo en el ncleo (Dreyfus, 2002) y requiere de varios eventos moleculares, los

cuales estn ligados entre s y pueden influenciarse uno a otro en especificidad y

eficiencia, adems de estar intimamente ligadas a la transcripcin, es por eso que

actualmente se conoce que la mayora de las reacciones de este procesamiento

ocurren co-transcripcionalmente (Proudfoot 2002).

28

2.2.1 Capping del pre-RNAm

La formacin de un capuchn, o estructura cap (capping en ingls), en el

extremo 5 protege el RNAm de la degradacin exonucletica en direccin 5 3 (Furuichi, 1997) y desempea un papel importante en el inicio de la traduccin (Shatkin,

1976). Este capuchn consiste en una guanosina metilada en la posicin 7 localizada

en el primer ribonucletido de la cadena de RNA en el extremo 5 del RNAm por medio

de una unin 5-5 trifosfato, y se conoce como m7G(5)ppp(5)N (donde N representa el

primer nucletido) o simplemente m7G (Day y Tuiter, 1998). La reaccin se lleva a cabo

por la enzima formadora del capuchn o guanililtransferasa (GT) asociada al dominio

carboxi-terminal (CTD) fosforilado de la RNA pol II. Este proceso se inicia en el extremo

5 del pre-RNAm el cual posee un trifosfato derivado del primer trifosfato del nucleido

incorporado en el sitio de inicio de la sntesis del transcrito. La enzima RNA 5

trifosfatasa (RTP: RNA 5 triphosphatase por su siglas en ingls) elimina el ltimo

fosfato (fosfato ), dejando un difosfato en el extremo 5, mientras que la GT transfiere un GMP del GTP al difosfato, dejando el extremo 5 de la guanosina frente al extremo 5

de la cadena de RNA, formando as el puente 5-5 trifosfato de guanosina. El extremo

terminal de la guanosina se metila en la posicin 7 de la guanina por medio de la

enzima metiltransferasa (MT), mientras que el segundo nucletido del lado interno del

puente de trifosfato se metila en la posicin 2 de la ribosa (Cho y col., 1988; Proudfoot

2002). La estructura cap inicial es reconocida por el complejo de unin al cap o CBC

(cap binding complex, por sus siglas en ingls), el cual est formado por las protenas:

CBP20 y CBP80, que estimulan el paso del RNAm a travs del poro nuclear para ser

exportado al citoplasma. Ya en el citosol, CBP20 y CBP80 son remplazadas por el

29

factor citoplsmico de inicio de la traduccin eIF-4E (Shatkin y Manley, 2000). La

estructura cap es importante en la regulacin de la expresin gnica, debido a que los

RNAm sin esta estructura presentan una traduccin deficiente adems de que el RNA

es menos estable (Horikami y col., 1984).

2.2.2 Splicing del pre RNAm

El splicing es el proceso mediante el cual los intrones son removidos del pre-

RNAm para dejar slo la regin codificante (exones). En eucariontes, este proceso se

inicia con el reconocimiento de tres secuencias en el intrn, las cuales son altamente

conservadas en los pre-RNAm de los eucariontes: el dinucletido GU en el extremo 5;

el dinucletido AG en el extremo 3 del intrn y el sitio de ramificacin interno cercano al

extermo 3, el cual est prximo a un sitio rico en pirimidinas (Fig. 2). La protena U1

RNPsn (ribonucleoprotena pequea nuclear, rica en Uridina) se une a la secuencia GU

en el 5 del intrn, mientras que la protena U2 RNPsn, reconoce el sitio de ramificacin

que se encuentra previo a una secuencia rica en pirimidinas, ro arriba de la secuencia

AG del extremo 3 del intrn, a la cual se une dejando una adenina invariable libre que

posteriormente participa en el proceso de eliminacin del intrn. Se reclutan otras tres

protenas RNPsn: U4, U6 y U5, que interactan con U1 y U2. U6 es una ribozima y es la

encargada de realizar el corte en el extremo 5 del intrn, el cual al ser liberado, se une

a la adenina que qued libre en el sitio de ramificacin, formando una estructura en

forma de lazo del intrn. U5 acerca los extremos de los dos exones para unirlos,

mientras que U6 corta el extremo 3 del intrn el cual es liberado junto con los dems

componentes. U4 no interacciona directamente con el pre-RNAm pero su funcin

30

Figura 2. Diagrama esquemtico que muestra las secuencias conservadas de los

intrones. Se observan los dinucletidos conservados en los extremos 5 y 3 del intrn,

GU y AG respectivamente, adems del sitio de ramificacin, as como la frecuencia de

cada nucletido en una posicin especfica y la distancia aproximada entre los sitios de

ramificacin y de splicing 3.

31

pre-RNAm

Frecuencia (%)

Sitio de ramificacinSitio de splicing 5 Sitio de splicing 3

Regin rica en Py(~15b)

32

principal es reclutar a U5 y U6 para llevarlos al sitio de accin. En eucariontes

superiores, se identific tambin la protena U2AF (U2 snRNP auxiliary factor por sus

siglas en ingls) que reconoce a una secuencia rica en pirimidinas en el intrn y se une

a esta, facilitando la unin de U2 al pre-RNAm (Fig. 3). En conjunto las snRNPs y otras

protenas accesorias forman el spliceosoma que constituye la maquinaria de splicing

nuclear.

En el splicing, se ha demostrado que no slo participan las protenas RNPsn,

sino tambin otras protenas como RNA helicasas y protenas involucradas en el

procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm como veremos ms adelante (Li, 2001;

Vagner, 2000; Evans, 2001, Garca- Blanco, 2003)

2.2.3 Corte y poliadenilacin del pre-RNAm

El procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm incluye el corte y la adicin de un

tracto de 100-250 residuos de adeninas (tracto o cola de poli (A)), en el lugar donde se

realiz el corte endonucleoltico del transcrito primario. Una vez que el RNAm est

poliadenilado, es maduro o funcional y est listo para ser transportado al citoplasma

para ser traducido por los ribosomas, los cuales son los encargados de sintetizar la

protena codificada por el RNAm (Wahle, 1995; Colgan, 1997; Mignone, 2002)

Las UTRs tienen un papel muy importante en la regulacin post-transcripcional

de la expresin gentica. Ambas (5 y 3 UTR) tienen funciones importantes ya que

participan en el transporte del RNAm maduro del ncleo al citoplasma, La 5 UTR

33

Figura 3. Proceso de eliminacin de intrnes o splicing. Las ribonucleoprotenas U1 y

U2 reconocen al dinucletido GU y a la adenina presente en el sitio de ramificacin,

respectivamente. Posteriormente se reclutan U4, U5 y U6. U6 realiza el corte del

extremo 5 del intrn y se forma un lazo. Esta misma ribonucleoprotena corta el

extremo 3 del intrn mientras que U5 que funciona como ligasa uniendo los dos

exones.

34

Producto ligado RNAm

35

participa en el inicio de la traduccin, mientras que la 3 UTR participa el control de la

localizacin subcelular, en la estabilidad, as como en la eficiencia de la traduccin del

RNAm (Mignone, 2002). Esto se debe a la interaccin de la 3 UTR con protenas

especficas de unin al RNA, tanto en ncleo como en citoplasma (Kataoka y col.,

2000). A continuacin se describen las secuencias, factores y eventos moleculares del

procesamiento de la 3 UTR en eucariontes.

2.3 Secuencias cis-reguladoras que participan en el corte y poliadenilacin

del pre-RNAm

El procesamiento de la 3UTR del pre-RNAm, requiere de secuencias cis-

reguladoras, las cuales se han estudiado ampliamente en eucariontes superiores (Zhao,

1999; Colgan, 1997; Wahle, 1995; Wahle 1999) y estas incluyen:

1. La seal de poliadenilacin, formada por el hexanucletido AAUAAA, la cual se

localiza de 10-30 nt ro arriba al sitio de corte/poliadenilacin. Es una secuencia

consenso y uno de los elementos ms conservados en mamferos, la cual se

encontr en un 90% de todos los pre-RNAm. En el 10% restante, cambia esta

secuencia en una sola base A U, dando la variante ms comn: AUUAAA, la

cual tambin acta como seal de poliadenilacin. Estudios realizados con

mutaciones en esta seal y sus variantes, concluyen que esta secuencia es

esencial tanto para el proceso de corte como para la adicin de la cola de poli

(A), ya que al mutarla se inhibe el proceso de poliadenilacin (Zhao, 1999).

36

2. El sitio de poliadenilacin o de corte que se encuentra de 10 a 30 nt ro abajo de

la seal de poliadenilacin. La secuencia que rodea al sitio de corte no es

conservada aunque en un 70% de los mRNA de vertebrados, se encuentra una

adenosina al extremo final del sitio de corte nucleoltico. El penltimo nucletido

ms frecuente antes del corte es normalmente una C, por lo que el dinucletido

CA define el sitio de poliadenilacin en la mayora de los genes (Zhao y col.,

1999).

3. El elemento ro abajo (DSE: down stream element por sus siglas en ingls), rico

en GU/U, est localizado de 20-40 nt ro abajo del sitio de corte. Esta secuencia

slo est presente en un 70% de los pre-RNAm de mamferos. Este elemento no

es tan conservado y puede ser de dos tipos: un elemento rico en U y un

elemento rico en GU. El elemento rico en U es una cadena corta de residuos de

U, mientras que el elemento rico en GU tiene el consenso YGUGUUYY (Y =

pirimidina). Esta secuencia DSE puede tener slo uno de estos elementos, o

ambos, que en este caso trabajan juntos sinrgicamente. Sin embargo, algunos

elementos ro abajo no contienen ninguno de estos dos motivos. Mutaciones

puntuales en cualquiera de estos elementos no alteran su funcin, sin embargo,

si se pierden grandes fragmentos de esta secuencia, se puede inhibir su funcin

al no ser identificada por los factores de procesamiento del 3 terminal. La

proximidad de estas secuencias ro abajo del sitio de poliadenilacin pueden

afectar la posicin del sitio de corte y la eficiencia del mismo.

37

4. El elemento ro arriba (USE: upstream element, por sus siglas en ingls) de la

seal de poliadenilacin es una secuencia rica en U que participa en el corte del

extremo 3 del pre-RNAm en el ncleo, y tambin puede ser identificada como

CPE (cytoplasmic polyadenylation element), la cual participa en la readenilacin

citoplsmica del RNAm como veremos ms adelante (Fig. 4A).

En levadura se han descrito secuencias homlogas a las secuencias

identificadas en eucariontes superiores, con algunas diferencias que radican tanto en la

organizacin molecular como en la secuencia propiamente dicha. Las secuencias cis-

reguladoras de los pre-RNAm de levaduras son menos conservadas que en eucariontes

superiores (Fig. 4B). Al menos tres seales son necesarias para realizar el

procesamiento en el extremo 3 en S. cerevisiae (Zhao y col., 1999):

1. Un elemento posicionador (PE: Position element, por sus siglas en ingls) rico

en A que funciona como la seal de poliadenilacin representada por la

secuencia AAUAAA, la cual puede ser no conservada y presentar una

variante que es AAAAAA y se localiza de 10 a 30 nt ro arriba del sitio de

corte. Slo un 50% de todos los RNAm la presentan (Wahle y Seller, 1992)

2. El sitio de corte o poliadenilacin, que generalmente corresponde al

dinucletido AA.

3. El elemento de eficiencia (EE) el cual se encuentra ro arriba del elemento

posicionador, es rico en UA y su funcin es activar al elemento posicionador.

4. No se ha identificado el dominio DSE rico en GU.

38

Figura 4. Comparacin de las secuencias cis-reguladoras que participan en el corte y

poliadenilacin del pre-RNAm de mamferos y levaduras. USE: Elemento ro arriba por

sus siglas en ingles: Upstream element; SP: Seal de poliadenilacin, DSE: Elemento

ro abajo, por sus siglas en ingls: Downstream element. EE: Elemento eficiente, PE:

Elemento Posicionador.

39

S. cerevisiae

Mamferos

USE SP Sitio Poli(A) DSE

U-rica AAUAAA CA U/GU-rica

30 nt10-30 nt

STOP

Sitio Poli(A)PEEE

UAUAUA AAUAAA Py(A)n

AAAAAA

10-30 nt

STOP

3 UTR

3 UTR

40

2.4 Maquinaria de corte y poliadenilacin

El procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm se puede dividir en dos eventos

principales que son el corte y la poliadenilacin, en donde participan diversas protenas

las cuales pueden intervenir simultneamente en uno o ambos eventos. El corte y la

poliadenilacin son dos procesos que se llevan a cabo con espacios de separacin de

tiempo muy cortos in vivo, pero pueden dividirse ampliamente para su estudio in vitro. A

continuacin, se describen las protenas involucradas en este procesamiento en

eucariontes superiores.

2.4.1 Factor de especificidad del cortepoliadenilacin (CPSF)

El complejo CPSF, (Cleavage/polyadenylation specificity factor CPSF, por sus

siglas en ingls), pesa 360 kDa y est constituido por cuatro subunidades de 30, 73,

100 y 160 kDa. Participa tanto en el corte como en la poliadenilacin, reconoce la seal

de poliadenilacin en el RNA y se une a sta por la subunidad de 160 kDa (Jenny y col.,

1994; Colgan y col., 1997; Wahle y col., 1999; Zhao y col., 1999; Li y col., 2001; Ryan y

col., 2004). Se ha reportado que la protena Fip1 de humano (o factor interacting with

PAP, en ingls), es otra subunidad del complejo CPSF. Se une al elemento USE rico en

U (que se encuentra ro arriba de la seal de poliadenilacin) y acta junto con el

CPSF-160, en reconocer la seal de poliadenilacin y reclutar a la poli (A) polimerasa

(Poly (A) polymerase o PAP por sus siglas en ingls) hacia el sustrato de RNA

(Kaufman y col., 2004)

41

2.4.2 Factor de estimulacin de corte (CstF)

El complejo CstF (Cleavage stimulation factor CstF por sus siglas en ingls), es

una protena heterotrimrica formada por tres subunidades de 77, 64 y 50 kDa. La

subunidad de 64 kDa reconoce e interacta con la secuencia DSE rica en GU/U que se

encuentra ro abajo del sitio de corte y la subunidad 77 kDa interacta con el complejo

CPSF estabilizando el complejo ternario CPSF-CstF-RNA (Colgan y col., 1997; Wahle y

col., 1999; Zhao y col., 1999; Li y col., 2001; Ryan y col., 2004). Existen reportes que

demuestran que CstF-64 tambin participa en el proceso de splicing en Caenorhabditis

elegans (Evans y col., 2001)

2.4.3 Factores de Corte (CFIm y CFIIm)

Existen dos complejos de corte (Cleavage Factor o CF, por sus siglas en ingls),

los cuales son los principales responsables de la reaccin de corte. El CFIm est

formado por cuatro subunidades de 25, 59, 68 y 72 kDa, de las cuales se sabe que los

polipptidos 25 kDa y 68 kDa participan en la reaccin de corte. La subunidad de 25

kDa se une al RNA cerca del sitio de corte e interacta con la subunidad CFIm-68, PAP

y la protena de unin a la Poli (A) (PABP II: poly(A) binding protein II, por sus siglas en

ingls) (Dettwiler 2004). La funcin exacta del CFIIm no se reconoce, pero se sabe que

est formado por dos protenas denominadas CIP 1 y Pcf II, que se reclutan y participan

en el corte del extremo 3 (Wahle y col., 1999). CIP 1 interacta con CFIm-25 y CPSF-

100 (Vries y col., 2000). Los factores CFIm y CFIIm tienen una actividad de

endonucleasa, al igual que el factor CPSF-73 (Ryan y col., 2004)

42

2.4.4 Poli (A) polimerasa (PAP)

La Poli (A) polimerasa es la enzima que sintetiza del tracto de poli (A), pero

tambin participa en la reaccin de corte mediante su interaccin con el complejo

CPSF. Es probablemente la protena mejor estudiada y conocida de la maquinaria del

procesamiento del extremo 3. Es un polipptido monomrico que presenta diferentes

isoformas debido a un splicing diferencial. La forma activa en mamferos tiene un peso

molecular alrededor de 80 kDa (Wahle y col., 1999). De las isoformas enzimticamente

activas se encuentran la PAP I, PAP II y PAP IV (Zhao y Manley, 1996), de las cuales la

ms predominante es la PAP II. Sobre esta protena se hablar ampliamente ms

adelante.

2.4.5 Protena de unin al tracto de poli (A) II (PABP II)

La PABP II es monomrica con un peso molecular de 33 kDa (Wahle, 1995) y

presenta una alta afinidad por el tracto de poli (A). Cuando el tracto de poli (A)

comienza a ser sintetizado, la PABP II se une a l formando un multicomplejo con

CPSF y PAP, estabilizando as a la PAP en extremo 3 del RNA, lo que facilita la

agregacin de adeninas permitiendo que el proceso sea ms rpido (Bienroth y col.,

1993). La PABP II tambin participa estimulando la traduccin de los RNAm, mediante

la interaccin con algunos factores de la traduccin tales como el eIF4.

2.4.6 Protenas adicionales

Recientemente se han identificado otras protenas que tambin participan en

este procesamiento las cuales incluyen la Symplekina, Rrbp6, PNAS-120 y PC4, de las

43

cuales se sabe que tambin participan como coactivadores del la RNA polimerasa II en

humano.

En S. cerevisiae, se han identificado protenas homlogas a estos factores. El

complejo CPSF (160, 100, 73 y 30kDa) de mamferos, se encuentra representado en

levadura por las protenas Cft1p/Yhh1p, Cft2p/Ydh1p, Brr5/Ysh1p y Yth1p,

respectivamente (Zhao y col., 1999). Existe un homlogo de PAP y FIP 1 denominados

pap1 y fip 1 respectivamente, adems de otra protena identificada como Ptalp que en

humano se le conoce como Symplekina, las cuales no se han caracterizado en la

levadura. En levadura slo se identifican dos protenas homlogas al complejo CstF 77

y 64 de humano, conocidos como RNA14 y RNA15; mientras que la subunidad 50 kDa

del CstF de mamfero no tiene una protena homloga en S. cerevisiae. No se han

encontrado protenas homlogas al complejo CF Im (25, 59, 68 y 72 kDa) pero s al CF

IIm, las cuales son Clp1 y Pcf II, adems de otras protenas adicionales como son Hrp

1, Mpe I, Ssu 72 y Sub1, de las cuales no se sabe exactamente su funcin en la

reaccin de corte y poliadenilacin. Las protenas Mpe I, Ssu 72 y Sub1 son homlogas

a las protenas de mamfero Rrb6, PNAS-120 y PC4 respectivamente.

2. 5 Mecanismo de corte y poliadenilacin

La poliadenilacin es una reaccin en la que participan mltiples secuencias en

cis y protenas, las cuales son requeridas para la reaccin de corte de pre-RNAm y la

adicin de adeninas en eucariontes. A continuacin se descibe el mecanismo de corte y

poliadenilacin del pre-RNAm.

44

2.5.1 Corte del pre-RNAm

La subunidad de 160 kDa del CPSF se une a la seal de poliadenilacin

AAUAAA del 3 UTR del pre-RNAm. Por otro lado el factor CstF-64 identifica la

secuencia DSE rica en GU, que se encuentra ro abajo de la seal de poliadenilacin.

El CstF interacta con el CPSF-160 por medio de la subunidad de 77 kDa del CstF,

provocando un cambio conformacional del extremo 3 del pre-RNAm, formndose un

complejo ternario estable (CPSF-CstF-RNA), al cual se une la PAP, interactuando con

el CPSF y FIP 1. PAP interacta tambin con el CFIm-25 que se une al sitio de

poliadenilacin. El factor CF I m recluta al CF II m en donde CIP 1 interacta con CFIm-

25 y CPSF-100. CPSF interacta con el CTD (dominio carboxi- terminal carboxy

terminal domain, por sus siglas en ingls) de la RNA pol II estableciendo una relacin

funcional entre el procesamiento del 3 y la terminacin de la transcripcin (Steinmetz,

1997). Una vez reclutada toda la maquinaria, se realiza el corte del RNAm. El CstF y los

factores de corte CF I m y CF II m, junto con el fragmento de RNA donde se encuentra

la secuencia rica en GU se liberan, dejando una molcula de RNA con un extremo 3

OH libre en donde se inicia la sntesis de la cola de poli (A) (Fig. 5). El fragmento de

RNA liberado es degradado con rapidez.

El procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm est estrechamente relacionado

al inicio y terminacin de la transcripcin. Se ha demostrado que el complejo CPSF-160

es reclutado por el factor de transcripcin TFIID formando un complejo estable con ste

al inicio de la transcripcin. Posteriormente, durante la elongacin se transfiere al CTD

de la RNA po II, que se encuentra hiperfosforilado, y permanece unido a ste durante la

transcripcin (Dantonel y col., 1997). Existen reportes de que CstF tambin se asocia al

45

Figura 5. Esquema del reclutamiento de los factores involucrados en la reaccin de

corte del pre-RNAm en mamferos. CPSF reconoce a la seal de poliadenilacin por la

subunidad de 160 kDa, CstF reconoce la regin rica en G y U ro abajo del sitio de corte

por su subunidad de 64 kDa, e interactan ambas por la subunidad de 77 kDa del CstF,

reclutando a los factores de corte I y II (CFI y CFII), a PAP, a FIP entre otras.

46

CTD

RNA

Pol I

I

5

3

STOP

100 K

73K

CPSF

160

30 K AAUAAA

CstF

77K

50 K

64 K

rica G/U72

59

68

25

CF I

CIP1

FIP1Sitio decorte

PcfII

CF II

CA

PAP

47

CTD (McCracken y col., 1997). Cuando la RNA pol II identifica la seal poliadenilacin

AAUAAA en el pre-RNAm que se est sintetizando, existen dos posibles mecanismos

de cmo participa este factor en el procesamiento del extremo 3 (Li y col., 2001):

1) CPSF y CstF se disocian del CTD y se unen a las secuencias AAUAA y DSE

rica en GU del RNAm, respectivamente, para iniciar el corte del extremo 3

(Dantonel y col., 1997; McCracken y col., 1997) bien

2) CPSF y CstF permanecen asociados con el CTD, ya que ste tambin

participa en el corte del extremo 3 (Hirose y Manley, 1998)

2.5.2 Poliadenilacin

Inmediatamente despus del corte se inicia la poliadenilacin, donde la protena

PAP que contina unida al CPSF, comienza a agregar adeninas en el extremo 3. La

adicin de los primeros 10 residuos de adeninas se lleva a cabo con lentitud, a partir de

la cual le sigue una polimerizacin rpida de hasta 250 residuos de adenosina extras.

(Zhao y col., 1999). Tambin es necesaria la PABP II que se une a la cola de adeninas,

formando un complejo cuaternario junto con las protenas CPSF, PAP y el sustrato de

RNA. Esta protena estabiliza la unin de PAP al RNA en el extremo 3 y da soporte a

la sntesis de la cola de poli(A), al unirse a 10 adeninas del tracto recin sintetizado.

Adems de que facilita la agregacin de adeninas, permitiendo que sea ms rpida

(Bienroth y col., 1993) (Fig. 6). El RNAm maduro sale del ncleo ayudado por las

protenas que interactan con el cap del extremo 5 y la cola de poli (A) que son las

48

Figura 6. Diagrama esquemtico que muestra las protenas que participan en la

reaccin de poliadenilacin. La PAP sintetiza el tracto de poli (A) y su actividad es

estimulada por interacciones con las protenas CSPF, CFIIm25 y PABP II. La protena

PAPB II forma un complejo cuaternario con CPSF, PAP y el RNA para estabilizar a la

PAP, adems de que protege el tracto de poli (A) recin sintetizado.

49

STOP

73K

CPSF

16030 K

100 K

AAUAAAPcf

II

CIP1

CF II

PAPPAB II AAAAAAAAAAAAA

AAAA

AAAA

AAAA

A

AAAAAAAA

AAAAA

AAAAAAAAAAAAA

160

PAPPAB II

50

encargadas del transporte del RNAm y guiarlo hacia el citoplasma para ser identificado

por los ribosomas y ser traducido a protenas. Una vez que el RNAm se encuentra en

citoplasma y es traducido, comienza a ser degradado progresivamente por medio de

ribonucleasas especficas. Este proceso lo podemos dividir en tres fases principales:

1) El tracto de poli(A) se corta progresivamente por deadenilasas especficas como

Caf 1, POP2 y PAN, las cuales van eliminando las adeninas del tracto hasta

dejarlo aproximadamente en 10 adeninas, que es el mnimo necesario para que

se una la molcula de PABP II.

2) El decapping del extremo 5, que es un proceso en donde es removida la

estructura cap (m7GpppG) del extremo 5 por medio de la hidrlisis de la unin

del trifosfato mediante la enzima , y

3) Finalmente el RNAm es degradado por actividades de exonucleasa en direccin

53 y 35.

2.6 Readenilacin citoplsmica

La regulacin de la estabilidad, traduccin y localizacin del RNAm es esencial

en el desarrollo, crecimiento celular, homeostasis y plasticidad neuronal. La cola de

poli(A) en el extremo 3 del RNAm es clave para el control de la estabilidad y traduccin

del RNAm. Cuando la cola de poli(A) se acorta en el citoplasma, la traduccin se

detiene y el RNAm se degrada, con lo que se puede afirmar que la estabilidad del

RNAm y la activacin de la traduccin dependen de la longitud del tracto de poli(A)

(Kwan 2004). Todos los RNAm salen del ncleo con un tracto de poli(A) aproximado de

51

150-200 adeninas, el cual se va perdiendo por la accin de ribonucleasas, las cuales

eliminan las adeninas en una direccin 35. Es en este momento, en que algunos RNAm pueden alargar su tracto de poli(A) estando en el citoplasma, proceso conocido

como readenilacin citoplsmica (Dreyfus y Regnier, 2002). Se ha reportado la

existencia de diversas Poli(A) polimerasas citoplsmicas (PAPc) diferentes en

secuencia a la PAP nuclear, que catalizan la readenilacin de los mRNAs para que su

eficiencia de traduccin sea mayor. Las PAPc comparten la misma funcin, aunque

requieren de otras seales en el extremo 3 del RNAm.

Las PAPc son una familia reciente de polimerasas que se descubri

primeramente en Schizosaccharomyces pombe y en Caenorhabditis elegans. Difieren

de las PAPs principalmente en su secuencia y en su estructura, sin embargo tienen la

misma funcin. Fueron identificadas y llamadas GLD-2 ya que estaban involucradas en

el desarrollo y en embriognesis, de ah se deriva el nombre de GLD (Germline

development, por sus siglas en ingls). Se ha reportado que GLD-2 posee una baja

actividad de poli (A) polimerasa, y que necesita de otra protena que es GLD-3, que

pertenece a la familia de protenas de unin a RNA (Wang 2002). Mientras que la PAP

nuclear es monomrica, GLD-2 requiere de una protena de unin a RNA para realizar

su funcin. Recientemente, se han descrito una poli (A) polimerasa citoplsmica

homloga en humano conocida como Hs1 o hGLD-2, que se estudi en ovocitos de X.

laevis la cual no contiene el extremo C-terminal y que funciona como una poli (A)

polimerasa citoplsmica, aunque se cree que tambin participe como un estimulador de

52

la traduccin. Adems se han encontrado transcriptos de esta protena en la mayora de

los tejidos (Kwak y col., 2004).

Se ha demostrado que puede tambin existir readenilacin del RNAm en el

citoplasma en X. laevis y en Drosophila melanogaster (Dickson y col., 2001, Wickens,

1990; Richter, 1999; Juge 2002). Las enzimas involucradas se conocen como GLD-2 y

GLD-3 (Kwak y col., 2004; Keller y Martin, 2002), en donde participa la seal AAUAAA y

una seal cercana a est, rica en U y que se encuentra ro arriba, llamada elemento de

poliadenilacin citoplsmica; CPE (ver pag. 18); adems de los factores CPSF, PAP y

CPEB o protena de unin al CPE (cytoplasmic polyadenylation element binding, por

sus siglas en ingls). Al ser reunidas las secuencias AAUAAA y CPE por CPSF y CPEB

respectivamente, reclutan a la PAPc para iniciar la readenilacin del RNAm.

2.7 Importancia de la cola de poli(A) del RNAm

En las clulas animales, todos los RNA mensajeros excepto los de las histonas

poseen una cola de poli (A) en el extremo 3. Las funciones propuestas de esta cola

incluyen: promover la eficiencia de la transcripcin del RNA, en el transporte del mRNA

del ncleo al citoplasma y conferir estabilidad al mRNA. Los defectos en la formacin de

la cola de poli (A) pueden alterar profundamente la viabilidad, el crecimiento y el

desarrollo de la clula alterada. (Zhao y col., 1999). La vida media del RNAm depende

de su estabilidad, dada por el tracto o cola de poli(A) en el extremo 3 y por la estructura

cap en el extremo 5. La formacin del extremo 3 del RNAm es la clave en la expresin

de muchos genes y en algunos casos, una poliadenilacin aberrante lleva a una

enfermedad.

53

2.8 Poli(A) polimerasa

2.8.1 Generalidades

La PAP es un regulador postranscripcional de la expresin gentica, ya que al

sintetizar el tracto de poli(A) le da estabilidad el RNAm y permite que la traduccin del

RNAm sea ms eficiente. El peso molecular de la PAP en diferentes especies va desde

70 hasta106 kDa. La PAP de humano es un polipptido con una masa molecular de 84

kDa (Raabe y Manely, 1991; Wahle y col., 1991), la cual presenta mltiples sitios de

fosforilacin en su extremo amino (Raabe y Manley, 1994). En eucariontes, 2/3 partes

del extremo amino es altamente conservado y contiene un dominio cataltico homlogo

al de la familia de las nucleotidiltransferasas, el cual se caracteriza por presentar tres

residuos de aspartato (D) conservados en las posiciones 113, 115 y 167 en la PAP de

bovino. Un dominio de unin al RNA, est localizado entre los nucletidos 488 y 508, en

el extremo carboxi-terminal, el cual se traslapa a la seal de localizacin nuclear (NSL1)

que se localiza entre los nucletidos 493 y 538. A 140 nucletidos ro debajo de esta

NLS1, se encuentra la segunda seal NSL2. A partir de la seal NLS1, hasta el extremo

carboxil, es un segmento rico en serina y treonina, los cuales permiten mltiples

fosforilaciones las cuales regulan la actividad de la PAP (Fig. 7 y 8).

La PAP ha sido identificada en diversos eucariontes como levadura, humano,

ratn, bovino, rana y gallina y se han observado mltiples isoformas. Los mecanismos

moleculares que generan estas isoformas an no son completamente entendidos, sin

embargo, se sabe que la fosforilacin y el splicing alternativo contribuyen a que existan

PAPs con diversos pesos moleculares (Kyriakopoulou y col., 2001). La generacin de

diferentes isoformas, se lleva a cabo al menos, por tres mecanismos distintos:

54

Figura 7. Estructura molecular de la poli (A) polimerasa II de humano. PAP II est

formada por 689 aa, con un dominio central cataltico conservado donde se realiza la

transferencia de nucletidos e interaccin con el ATP y un dominio de unin a RNA, que

presenta 2 seales de localizacin nuclear (por sus siglas en ingls NLS). Adems

presenta varios posibles sitios de fosforilacin por las cinasas CK2 y cAMP.

55

HsPAP689 aa

Dominio central cataltico

Dominio de unin al RNA

F/YGS DD D NLS1CK2CK2 cAMP NLS2

56

Figura 8. Diagrama tridimensional de la estructura cristalina de la poli(A) polimerasa de

bovino. En naranja se localiza el dominio cataltico (aa 60-173); en azul el dominio

central y en morado el dominio terminal de unin al RNA. En magenta se seala la

molcula de ATP interactuando con el sitio cataltico.

57

58

duplicacin gnica, procesamiento alternativo de RNA y modificaciones

postranscripcionales. Con esto, podra parecer razonable la hiptesis de que diferentes

PAPs son responsables de diferentes funciones in vivo, ya que la PAP participa en el

corte de pre-RNAm, dependiente o independiente de la seal de poliadenilacin

AAUAAA y en la sntesis de la cola de poli(A). De estas isoformas, la ms abundante en

mamferos es la PAP II o , sin embargo existen otras como la PAP que presenta las mismas caractersticas que la PAP II nuclear de 90 kDa, incluyendo la interaccin que

tiene con la protena U1A (Kyriakopoulou 2001).

Se ha reportado que existe una expresin diferencial de la PAP II durante el

desarrollo y de manera tejido especfica, as como en diferentes lneas celulares, por

ejemplo en extractos nucleares (EN) de clulas HeLa se han encontrado tres isoformas

con aparentes masas moleculares de 90, 100 y 106 kDa (Thuresson y col., 1993;

Kyriakopoulou 2001). Otro ejemplo es una nueva isoforma de la poli (A) polimerasa

conocida como TPAP (Testis-specific poly(A) polymerase, por sus siglas en ingls), la

cual se presenta especficamente en el citoplasma de clulas espermatognicas.

Presenta un peso molecular de 70 kDa y una identidad del 86% con respecto a la PAP

II (Kashiwabara 2000). Adems, se ha identificado otra PAP, la Neo-Poli(A) polimerasa

la cual presenta una masa molecular de 82.8 kDa y 71% de homologa con la PAPII de

humano, y que es sobreexpresada en tumores humanos (la Neo Poli(A) polimerasa). La

Neo PAP es una enzima importante en el procesamiento del RNA, pero que es

regulada de una manera distinta a la utilizada por la PAP (Topalian y col., 2001), lo que

sugiere que algunas isoformas de PAP son restringidas o caractersticas con ciertas

59

etapas de desarrollo o tejidos. Recientemente se identific una PAP mitocondrial, con

un peso de 65-68 kDa y que participa en la sntesis del tracto de poli(A) de los RNAm

mitocondriales, aunque se observ que este tracto no participa en la estabilidad de los

RNAm mitocondriales (Tomecki 2004). En S. cerevisiae tambin se ha identificado una

PAP nuclear (Zhelkovsky 1995; Bard 2000), la cual presenta una masa molecular de

63 kDa (Linger 1991). Al ser comparada con la PAP de mamferos se observ que la

regin carboxi-terminal no es conservada mientras que los primeros 400 aa son

idnticos en un 47%. Se ha demostrado que la Pap1 no es requerida en el proceso del

corte del pre-RNAm, sin embargo es reclutada aparentemente para reconocer el sitio de

poliadenilacin (Zhao 1999)

2.8.2 Participacin de la PAP en el splicing del pre-RNAm

La PAP no slo participa en la poliadenilacin, sino tambin en otros eventos del

procesamiento del pre-RNAm, como lo es el splicing. La maquinaria basal de

poliadenilacin no contiene snRNPs, sin embargo, existen evidencias en las que se

sugiere que el splicing y la poliadenilacin estn ligados, estableciendo un enlace

funcional entre ellos. Por ejemplo, una seal funcional de poliadenilacin, puede facilitar

el splicing del extremo 5 terminal del intrn in vivo. Adems, en estudios recientes se

sugiere que los factores de splicing pueden actuar como auxiliares en la seleccin del

sitio de poli(A) (Colgan, 1997)

El mejor ejemplo estudiado de cmo una protena del spliceosoma influye en la

poliadenilacin es la protena U1 snRNP A (U1A). El pre-RNAm de la protena U1A

contiene una secuencia ro arriba del sitio de poliadenilacin, la cual es un sitio de unin

60

a U1A, de esta forma, el RNAm de U1A es autorregulado negativamente cuando dos

molculas de U1A se unen al pre-RNAm de U1A, dando como resultado una inhibicin

de la poliadenilacin (Boelens 1993). Al examinar esta reaccin por separado, se

determin que la unin de U1A no afecta al proceso de corte, sin embargo la

poliadenilacin se inhibe, sugiriendo que existe una relacin directa entre U1A y PAP,

algo que se haba propuesto anteriormente en un estudio realizado en EN de hepatoma

(Raju y Jacob, 1988). Existen estudios en donde se demostr que el extremo carboxi-

terminal de la PAP, incrementa la eficiencia de la protena U2AF 65, que participa en el

proceso de splicing, estimulando y facilitando su unin al intrn, ya que en el extremo

carboxi-terminal de PAP interacta con los residuos 17-47 de U2AF 65 (Vagner 2000).

Otro estudio reporta que la protena U2AF participa en el control de la longitud del tracto

de poli (A) (Gu y Schoenberg, 2003)

2.9 Poli (A) polimerasa en el ciclo celular

2.9.1 Generalidades del ciclo celular

El concepto de ciclo celular naci con el estudio de cultivos in vitro de clulas que

se dividen a intervalos regulares, en donde una clula madre da origen a dos clulas

hijas, cada clula hija se desarrolla y sufre posteriormente un nuevo proceso de divisin

para originar dos clulas idnticas dando con esto un fenmeno, llamado ciclo celular,

ya que estos procesos se repiten en cada generacin (Murray y col, 1993).

Originalmente se crea que el ciclo celular estaba compuesto por dos fases, las cuales

son la interfase y la divisin celular propiamente dicha o mitosis; sin embargo, se

observ que en algn momento en la interfase se duplicaba el DNA nuclear, para que

se divida en forma equitativa entre las clulas hijas. Actualmente sabemos que la

61

interfase se ha dividido en 3 fases denominadas: G1, S, y G2 (Fig. 9) (Murray y col,

1993; Lodish y col, 2002, Karp, 1996)

G1: (Intervalo 1 o Gap 1 en ingls) es el intervalo que va de la etapa final de la

mitosis hasta el inicio de la fase S. En este periodo, las clulas pueden permanecer

estacionadas, o prepararse para entrar en la fase S para iniciar el proceso de divisin.

S: (Sntesis) es la etapa en donde el DNA se duplica para poder obtener dos

ncleos con la misma informacin gentica que el ncleo de la clula madre.

G2: (Intervalo 2 o Gap 2 en ingls) es el tiempo que transcurre entre el final de la

sntesis del DNA y el inicio de la mitosis. Durante esta etapa la clula contiene el doble

de la cantidad de DNA presente en la clula original. Le provee a la clula un lapso

durante el cual actan mecanismos de seguridad para controlar si las molculas de

DNA se replicaron correctamente. A esta fase, tambin se le conoce como etapa de

crecimiento (Growing) ya que aumenta su tamao para dividirse.

M: (mitosis) es la etapa del ciclo celular donde se realiza la divisin celular y

tanto el citoplasma, como el material gentico se dividen equitativamente. En el

citoplasma, se forma el huso mittico, que est compuesto por microtbulos y es un

sistema generador de fuerzas que controla la posicin de los cromosomas y su

distribucin en las clulas hijas. Los microtbulos se implantan en los centrmeros. La

divisin del citoplasma de manera equitativa se conoce como citocinesis. En esta etapa,

la sntesis de DNA y RNA se interrumpen casi totalmente. Esta fase, a su vez se divide

62

en cuatro fases: profase, metafase, anafase y telofase. La profase es el primer estadio

de la mitosis, en donde la cromatina se condensa, la membrana nuclear se disuelve, los

centrolos (si se encuentran presentes) se dividen y los pares migran a los polos, se

forma el cinetocoro y las fibras de ste, adems se forma el huso mittico. En la

metafase, los cromosomas migran al ecuador de la clula donde las fibras del huso se

"pegan" a las fibras del cinetocoro. En la anafase se inicia la separacin de los

centrmeros y el arrastre de los cromosomas a los polos opuestos y por ltimo, la

telofase en la cual los cromosomas llegan a los polos de sus respectivos husos

mitticos, la membrana nuclear se reconstituye, los cromosomas se desenrollan para

formar la cromatina y el nucleolo, que desapareci en la profase se vuelve a constituir.

Donde antes haba una clula ahora existen dos pequeas con exactamente la misma

informacin gentica. Estas clulas pueden luego diferenciarse durante el desarrollo

(Lodish y col, 2002, Earnsshaw y col, 1994).

2.9.2 Mecanismos de regulacin del ciclo celular

Hay mecanismos especializados para coordinar los procesos de divisin en el

ncleo y en el citoplasma y determinar el inicio y el fin de las fases del ciclo celular. En

esta regulacin participan varias protenas: las ciclinas y las cinasas dependientes de

ciclinas (cdc o cdk por sus siglas en ingls de cyclin dependent of kinases). En

mamferos, la regulacin de este ciclo se inicia con una protena conocida como Rb, la

cual se encuentra unida al factor de transcripcin E2F. Las cdk 4 y 6, se unen a la

ciclina D para activarla. Cuando se activa la ciclina D en la fase G1, fosforila a Rb la

cual libera el factor de transcripcin E2F, que activa la expresin gentica como de los

genes que codifican para la cdk2 y las ciclinas A y E, en la fase G1 del ciclo celular. Al

63

expresarse esta la cdk2, se une a la ciclina E y la activa, y contina fosforilando a Rb,

durante la fase G1 y al inicio de la fase S. En la fase S, la cdk2 se une a la ciclina A,

inactivando a la ciclina E, la cual desfosforila a Rb que se une nuevamente al factor

E2F; la ciclina A/cdk2 se mantiene activa toda la fase de S y parte de la fase G2. Al

finalizar la fase G2, la ciclina A/cdk 2 disminuye mientras que al inicio de la fase M

aumenta la ciclina B/cdk2 y se mantiene activa durante toda la fase (Downes y col,

1994; Morgan, 1997; Lodish, 2002)(Fig. 9).

2.9.3 Papel de la PAP en el ciclo celular

En X. laevis se ha observado que la poli (A) polimerasa se hiperfosforila por la

ciclina B durante la fase M del ciclo celular, lo que causa una inactivacin de la misma

(Colgan et al., 1996). Por otra parte se sabe, que durante la fase M en el ciclo celular, la

sntesis de protenas disminuye y que la longitud de los tractos de poli (A) del RNAm

tambin disminuyen. Por lo anterior, se propone que la poli (A) polimerasa inhibe la

expresin gentica durante la mitosis, es decir cuando la p34cdc2/ciclina B, que es el

regulador de la fase M, hiperfosforila a la poli (A) polimerasa, sta se inactiva en esa

misma fase, lo que va a generar RNAm poli (A-) y esto a su vez lleva a una traduccin

ineficiente y por lo tanto a un silenciamiento en la expresin gentica (Colgan et al.,

1998).

De acuerdo con estos trabajos se puede hacer la interrogante de que en otros

organismos suceda algo similar; al inactivarse la poli (A) polimerasa, se inhibe la

expresin gentica en la fase M y que probablemente cambios en la expresin del

64

Figura 9. Etapas del ciclo celular en eucariontes y su regulacin. La ciclina D/cdk4 o 6,

fosforila a Rb que se encuentra unido al factor de transcripcin E2F y lo libera. La

transcripcin de la ciclina E y de cdk 2, permite que Rb contine fosforilada. En la fase

S, se activa la ciclina A/cdk2 e inactiva a la ciclina E/cdk2, que desfosforila a Rb y se

une nuevamente a E2F. Al entrar en la fase M, se activa la ciclina B/cdk2 y se inactiva

la ciclina A/cdk2.

65

Ciclina D

Cdk 4, 6

Ciclina A

Cdk 2

Ciclina E

Cdk 2

Rb

E2F

Ciclina B

Cdk 2

RbE2F

66

RNAm del gen de la PAP durante la fase M del ciclo celular puedan tambin generar

este fenmeno.

2.10 Identificacin de las posibles secuencias en cis que participan en el

procesamiento del pre-RNAm en E. histolytica

El procesamiento del extremo 3 terminal en E. histolytica, es poco conocido. La

informacin obtenida del proyecto del genoma de E. histolytica (Loftus 2005), ofrece

nuevas aproximaciones experimentales en el estudio de la expresin gentica y facilita

la determinacin completa de los genes involucrados en el metabolismo del RNA. En un

anlisis in silico Lpez-Camarillo y col (2005) alinearon 320 nt (donde 240 nt

corresponden a la 3 UTR) de 50 diferentes secuencias genmicas, y se observ que

las 3UTR estn constituidas por una alta cantidad de los nucletidos AT (80%) y hay

una alta frecuencia de Ts en los primeros 10-50 nt de las 3UTR. Se identific la seal

de poliadenilacin, UA(A/U)UU, en un 65% de los genes y en 8% de ellos, esta

secuencia incluye el codon de paro (Fig. 10). Tambin se identificaron dos regiones

ricas en U, una localizada de 1-30 nt ro abajo del sitio de poliadenilacin y la otra a 3-

30 nt ro arriba de sitio de poliadenilacin; se sugiere que el 35% de los genes del

parsito que no presentan esta secuencia puedan usar otras secuencias regulatorias

diferentes para este procesamiento.

Todo lo anterior demuestra que existen cuatro secuencias cis-reguladoras del

procesamiento del 3UTR del pre-RNAm en E. histolytica (Fig. 11), las cuales son:

67

Figura 10. Representacin del alineamiento mltiple de 8 secuencias genmicas

(gDNA) y de cDNA de genes de E. histolytica. Se muestran las seales de

poliadenilacin (cajas amarillas), asterisco indica los nucleotidos que no coinciden con

la secuencia consenso de poliadenilacin, en negrita se muestran el sitio de corte y

poliadenilacin y subrayadas las regiones ricas en U.

68

Genmico

Genmico

Genmico

Genmico

Genmico

Genmico

Genmico

Genmico

69

Figura 11. Esquema de las secuencias cis-reguladoras del procesamiento del pre-

RNAm en E. histolytica. La seal de poliadenilacin se localiza de 10-30 nt ro arriba del

sitio de corte y poliadenilacin. Se localizan 2 secuencias ricas en U, una est

localizada ro arriba del sitio de corte y la otra se encuentra de 3-30 nt ro abajo del sitio

de corte. El codn de paro (TAA) est remarcado (lnea superior roja)

70

UAAUU UA(A/U)UU N Rica en URica en

Upre-RNAm

Seal de poliadenilacin

Sitio de poliadenilacin

Codnde paro

variable 10-30 nt 3-30 nt

71

1) Una seal del sitio de poliadenilacin (UA(A/U)UU) o con alguna

variante, localizada de 10-30 nt ro arriba del sitio de poliadenilacin

2) Una regin rica en U localizada de 1-30 nt ro arriba del sitio de

poliadenilacin

3) El sitio de poliadenilacin, sin una secuencia consenso conocida

4) Un elemento rico en U localizado 3-30 nt ro abajo al sitio de

poliadenilacin

Estas secuencias difieren de las descritas en mamferos y levaduras, por lo que

podra ser un modelo adecuado de estudio de los cambios evolutivos en las secuencias

de reconocimiento en el procesamiento del 3 UTR del pre-RNAm

2. 10. 1 Identificacin de protenas involucradas en el procesamiento del

extremo 3 del pre-RNAm en E. histolytica

En una bsqueda de la maquinaria que participa en el procesamiento del

extremo 3 del pre-RNAm en diferentes organismos y al compararlas entre ellos, se

observ que en E. histolytica existen protenas homlogas a la mayora de los factores

identificados en humano y en levadura. Se encontraron homlogos al CPSF-160,

CPSF-100, CPSF-73, CPSF-30, PAP, FIP 1, CstF 77, CstF 64, CstF 50, CstF 25, Cip 1,

Pcf II; adems de Rrbp6, PNAS-120 y PC4 que han sido identificadas recientemente

en humano. No se identificaron homlogos a las protenas de humano symplekina,

CFIm 59, CFIm 68 ni CFIm 72; pero se identific la protena Pfs2, homloga a Pfsp de

S. cerevisiae (Tabla 2) (Lpez-Camarillo y col., 2005). Adems, se propone que el

72

Pro

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73

procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm en E. histolytica, sea semejante al de

mamferos, ya que presenta una gran homologa con las protenas requeridas por stos

(Fig.12).

2.10.2 Papel de la poliadenilacin en el fenotipo de resistencia a mltiples

frmacos en E. histolytica

En un estudio a nivel postranscripcional realizado en E. histolytica (Lpez

Camarillo y col., 2003), en los trofozoitos de la clona C2 mutante que presenta el

fenotipo de resistencia a mltiples frmacos (MDR), se observ que la vida media del

RNAm del gen EhPgp5 es mayor en los trofozotos de la clona C2 mutante crecidos en

altas concentraciones de emetina, donde la vida media del RNAm del gen EhPgp5

obtenido de la clona C2 es 2.1 horas, en la clona C2 crecida a una concentracin de 90

M de emetina fue de 3.1 horas, mientras que en la clona C2 crecida a 225 M de

emetina fue de 7.8 horas (Lpez-Camarillo y col., 2003). Tambin se demostr que la

longitud del tracto de poli (A) del RNAm del gen EhPgp5 aument en los trofozotos de

la clona C2 (225), sugiriendo que la actividad de la PAP es la responsable del aumento

de la longitud del tracto de poli (A) y la estabilidad del RNAm del gen EhPgp5. Estos

datos muestran que la PAP es un regulador importante de la estabilidad del los RNAm,

por lo que su estudio ayudara en el entendimiento de los mecanismos moleculares que

regulan la expresin gnica a nivel postranscripcional.

74

Figura 12. Modelo de la maquinaria del procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm E.

histolytica. (A) Reconocimento de la seal de poliadenilacin por medio del CPSF, PAP

y Fip1. (B) EhCstF se une a la secuencia rica en U, localizada ro abajo del sitio de

poliadenilacin y se une a la subunidad 160 del CPSF. Los factores de corte CFIm y

CFIIm reconocen el sitio de poliadenilacin y realizan el corte. (C) Despus del corte,

PAP se une al CPSF para sintetizar la cola de poli (A). Las interacciones entre estas

protenas y el RNA son hipotticas.

75

Seal de poliadenilacin Sitio de poli (A)

Sitio decorte

Degradacin

rica U

rica U

rica U

rica U

rica U rica U

Lpez-Camarillo et al., 2005

76

3 JUSTIFICACION

En eucariontes se sabe que el procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm es un

evento importante dentro de la regulacin de la expresin de diferentes genes,

incluyendo genes involucrados en virulencia y resistencia a drogas de diversos

patgenos, ya que de esto depende la estabilidad del RNAm en el citoplasma y la

eficiencia de la traduccin. La formacin de la cola de poli (A) en el extremo 3 del

RNAm se ha estudiado en diferentes organismos eucariontes y se han identificado las

diferentes protenas que participan en este proceso. Entre ellos se encuentra la poli (A)

polimerasa (PAP) que es directamente responsable de la adicin de adeninas. Sin

embargo, la informacin que se tiene acerca del procesamiento y la estabilidad del

RNAm de los genes de E. histolytica es casi nula y aunque se sabe que se presenta un

control de la longitud del tracto de poli(A) en el extremo 3 del RNAm del gen EhPgp5,

se desconocen los mecanismos que lo regulan. El anlisis funcional y estructural de la

EhPAP nos permitir entender la reaccin de procesamiento y poliadenilacin del

mRNA en este parsito, as como analizar su importancia en el recambio del RNAm y

su papel en la regulacin de la expresin gentica durante el ciclo celular.

77

4 OBJETIVOS

4.1 Objetivo general

Caracterizar estructural y funcionalmente la poli(A) polimerasa EhPAP de

Entamoeba histolytica.

4.2 Objetivos especficos

1. Realizar un anlisis in silico de la secuencia de la EhPAP.

9 Bsqueda de secuencias similares a la EhPAP en las bases de

datos de protenas.

9 Relacin filogentica de la EhPAP con otras PAPs.

9 Determinacin de patrones y motivos conservados.

9 Prediccin de la estructura terciaria de la EhPAP.

2. Determinar el perfil de la expresin del mRNA del gen EhPap durante el

ciclo celular.

3. Subclonar el gen EhPap en un vector de expresin.

4. Expresar y purificar la protena EhPAP recombinante.

5. Generar anticuerpos policlonales especficos contra la EhPAP.

6. Determinar la localizacin subcelular de la EhPAP en trofozotos de E.

histolytica.

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5. MATERIALES Y METODOS

5.1 Estrategia Experimental

Para cumplir con los objetivos de este proyecto, seguimos la estrategia

experimental presentada en la Fig. 13

5.2 Anlisis in silico de la secuencia de aminocidos de la EhPAP

Tomando como referencia primaria la secuencia de la EhPAP (tesis Doctorado

Dr. Lpez-Camarillo), se hizo una bsqueda de secuencias similares en los bancos de

datos de la secuencia de PAPs de diferentes especies por medio del programa BLAST

2.0 (por sus siglas en ingls Basic Local Alignament Search Tool), que se encuentra en

el servidor en lnea de ExPASy Proteomics Server (por sus siglas en ingls Expert

Protein Analysis System) (http://www.expasy.org), el cual se especializa en el anlisis

protemico y que detecta regiones con similitudes presentes en otras protenas

reportadas en la base de datos.

Posteriormente se realiz un alineamiento mltiple de EhPAP con otras PAPs de

diferentes especies que presentaban mayor homologa entre ellas, las cuales fueron

obtenidas del BLAST usando el programa CLUSTALW. Para establecer los dominios

conservados entre las diferentes protenas se usaron los programas Prosite

(http://www.expasy.org) y Pfam (http://www.sanger.ac.uk) con los cuales se predijeron

los dominios funcionales y estructurales. Para realizar el rbol filogentico se us el

programa Molecular Evolutionary Genetics Analysis: MEGA

(http://www.megasoftware.net). Primeramente se realiz un alineamiento mltiple con

las secuencias de las especies ms representativas de cada grupo: Vertebrados: H.

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Figura 13. Estrategia experimental. La cual consiste en el anlisis in slico de la

secuencia obtenida de gen EhPap clonado en el vector TA. Subclonacin del gen

EhPap en un vector de expresin (pRSET-A), con el cual se transformaron bacterias

E.coli BL21 (DE3) pLysS para obtener la protena EhPAPr, que se purific para generar

anticuerpos especficos en ratones. Se obtuvieron extractos nucleares y citoplsmicos

de trofozotos de la clona A, que se analizaron por ensayos de Western blot con el

anticuerpo especfico para determinar su localizacin subcelular. Trofozoitos de la clona

L-6 fueron tratados con colchicina para obtener el RNA de cada fase, con el cual se

realizaron ensayos de RT-PCR para analizar la expresin del gen de EhPap.

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Trofozotos de la clona L6 sincronizados en el

ciclo celular

ExtraccinRNA total

RT-PCR

Secuenciacin de la EhPAP

Purificacin de laEhPAP recombinante

Generacin de anticuerpos en ratones

Westernblot