Larutan buffer adalah larutan yang terdiri dari garam dengan asam lemahnya atau

garam dengan basa lemahnya. Komposisi ini menyebabkan larutan memiliki kemampuan

untuk mempertahankan pH jika kedalam larutan ditambahkan sedikit asam atau basa. Hal ini

disebabkan larutan penyangga memiliki pasangan asam basa konyugasi. (Zulfikar, 2010)

Komponen-komponen ini bereaksi dengan ion hidrogen atau hidroksida apa saja yang

memasuki larutan, sehingga larutan yang berpenyangga dapat menahan perubahan PH ketika

ion hidroksida ditambahkan (Underwood, 2001).

Keefektifan suatu penyangga dalam menahan perubahan pH persatuan asam atau basa

kuat yang ditambahkan, mencapai nilai maksimumnya ketika rasio asam penyangga terhadap

garam adalah satu. Dalam titrasi asam lemah, titik maksimum keefektifan ini dicapai bila

asam tersebut ternetralkan separuh (underwood, 2001).

Protein (asal kata protos dari bahasa Yunani yang berarti "yang paling utama") adalah

senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-

monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida

(Wirahadikusumah, 1989).

Protein berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel makhluk hidup dan

virus. Protein terlibat dalam sistem kekebalan (imun) sebagai antibodi, sistem kendali dalam

bentuk hormon, sebagai komponen penyimpanan (dalam biji) dan juga dalam transportasi

hara (Soendoro, 1985).

Menurut struktur tiga dimensi protein dibagi menjadi tiga tingkatan organisasi

struktur protei, yaitu : Struktur primer, struktur sekunder, struktur tersier dan struktur

kuartener. Faktor-faktor yang mempengaruhi struktur protein adalah :

a. Suhu. Pada protein suhu sangatlah dijaga, hal ini di kerenakan kenaikan suhu

menyebabkan terjadinya proses denaturasi. Denaturasi adalah rusaknya struktur

protein dikarenakan yang menyebabkan protein kehilangan satu hingga sebagian

fungsi biologiknya.

b. pH. Pada umumnya struktur ion protein tergantung pada pH lingkungannya.

Struktur protein terdiri dari beberapa asam amino, dimana asam amino ini dapat

bertindak sebagai ion positif, ion negatif atau berdwikutub (zwitterion).

c. Radiasi. Radiasi merupakan faktor lainnya yang dapat mempengaruhi struktur

dari suatu protein.

d. Pelarut Organik Protein terdiri atas asam amino yang memiliki struktur yang

berbeda. Jadi pelarut organik sangatlah berpengaruh terhadap striktur protein.

Selain itu karena ikatan-ikatan yang terbentuk pada protein inilah yang

mempengaruhi perubahan struktur protein bila dilarutkan dalam pelarut organik

(Poedjiadi, 1994).

Kromatografi filtrasi gel merupakan metode pemisahan yang tergantung pada pertukaran

molekul terlarut di antara pelarut fase gerak dalam pori-pori bahan pengisi kolom yang

menentukan rentang ukuran molekul pada pemisahan yang terjadi. Pada kromatografi jenis

ini fasa diam berupa gel yang terbuat dari dekstran, suatu bahan hasil ikatan silang molekul-

molekul polisakarida. Bahan ini bila dimasukkan dalam air akan menggembung dengan

membentuk saringan berpori dengan ukuran poripori tertentu. Pori-pori akan menehan

molekul komponen-komponen berdasarkan ukurannya (berat molekul). Molekul dengan berat

molekul dari 100 sampai berapa juta dapat dipisahkan dengan teknik ini (Panil, 2008).

Pengecualian untuk kromatografi filtrasi gel ialah memisahkan protein yang lebih besar

dari yang kecil, karena molekul yang lebih besar perjalanan lebih cepat melalui polimer

cross-linked dalam kolom kromatografi. Protein besar tidak masuk ke pori-pori polimer

sedangkan protein yang lebih kecil, dan lebih lama untuk melakukan perjalanan melalui

kolom kromatografi, melalui rute kurang langsung. Eluat dikumpulkan dalam serangkaian

tabung memisahkan protein berdasarkan waktu elusi. Filtrasi gel adalah alat yang berguna

untuk berkonsentrasi sampel protein, karena protein target adalah mengumpulkan dalam

volume elusi lebih kecil dari pada awalnya ditambahkan ke kolom. Teknik filtrasi yang sama

dapat digunakan selama protein skala produksi besar karena efektivitas biaya (Panil, 2008).

Fraksinasi merupakan cara pemisahan bagian-bagian sel dengan menggunakan

sentrifus, setiap bagian atau organel sel dapat mengendap secara bertahap berdasarkan

beratnya. Unsur radioaktif dapat digunakan sebagai penanda pada berbagai kegiatan molekul

yang akan diteliti dalam sel. Dengan mempelajari sel, kita dapat memahami struktur dan

fungsi bagian-bagian sel sebagai unit terkecil dari makhluk hidup (Kimball, 1989).

Fraksinasi merupakan proses pemisahan suatu larutan menjadi fraksi atau bagian-

bagian tertentu. Pembagian atau pemisahan ini didasarkan pada bobot, massa jenis dari tiap

fraksi, fraksi yang lebih berat akan berada paling dasar biasa disebut Pelet sedangkan fraksi

yang lebih ringan akan berada dibagian diatas yang biasa disebut Supernatan. Salah satu

contoh fraksinasi ialah fraksinasi subseluler. Fraksinasi subseluler ialah pemecahan sel

melalui homogenasi dan pemisahan organel-organel dari yang satu degan lainnya

menggunakan alat setrifs. Fraksinasi biasanya dilakukan pada suhu rendah, biasanya 4°C

untuk meminimalisasi degradasi enzim-enzim yang ada terhadap komponen sel serta

mempertahankan struktur dan fungsi dari organel (Girsang, et al., 2003).

Terdapat dua macam prinsip sentrifugasi yang didasarkan atas: massa, ukuran atau

panjang partikel dan densitas partikel. Sentrifugasi zona merupakan contoh sentrifugasi

didasarkan atas massa dan ukuran partikel. Dalam sentrifugasi ini, partikel berbeda ukuran

akan terpisah pada lapisan-lapisan (zona) yang berbeda. Jenis kedua adalah sentrifugasi

berdasarkan pada keadaan yang setimbang, sentrifugasi keseimbangan gradien-densitas.

Sentrifugasi jenis ini bekerja berdasarkan prinsip partikel dan cairan yang berada pada level

keseimbangan densitas (disebut keadaan isopiknik). Teknik sentrifugasi keseimbangan

gradien-densitas dapat memisahkan molekul-molekul dengan perbedaan densitas sampai 0,02

g/ml. Misal : DNA dan RNA yang perbedaan densitasnya dalam larutan cesium klorida

(CsCl) berturut-turut adalah 1,3; 1,6-1,7 dan 1,75-1,8 gr/ml. Proses ini bertujuan memecah sel

tanpa merusak organelnya, dengan langkah awal merusak membran plasma dan dinding sel

jika sel tersebut memilikinya (Artika dan Safithri, 2010).

Pemurnian dan pemisahan merupakan proses pemisahan dua zat atau lebih yang

saling bercampur serta untuk mendapatkan zat murni dari suatu campuran. Campuran

merupakan contoh materi yang tidak murni, yaitu bukan sebuah unsure atau sebuah senyawa.

Susunan suatu campuran tidak sama dengan sebuah zat, dapat bervariasi dapat berupa

homogeny dan heterogen (Petrucci, 1996).

Criteria pemurnian suatu zat ditentukan oleh beberapa sifat fisiknya antara lain yaitu

titik didih, tekanan uap, kerapatan dan sebagainya. Sifat fisik adalah karakteristik zat yang

diamati dan di ukur tanpa mengubah komposisi kimianya. Di laboratorium kimia, sifat fisik

sangat penting karena dapat digunakan sebagai criteria kemurnian suatu zat. Proses

pemisahan suatu zat dari campuran adalah pemisahan berdasarkan sifat fisik dari zat-zat

tersebut. Jadi sangat tergantung dari macam-macam zat tercampur. Keragaman serta

kompleksnya suatu campuran dapat terjadi dari berbagai jumlah komponen dalam campuran

dengan perbandingan massa yang berbeda. Prinsip yang membedakan antara satu campuran

dengan campuran lainnya adalah pada ukuran partikelnya. Campuran dibagi menjadi tiga

bentuk yaitu suspense, koloid dan larutan (Underwood, 1988).

Pada dasarnya tahap pemurnian atau purifikasi protein terdiri dari dua tahap yaitu

tahap pertama yang bertujuan untuk mendapatkan larutan protein dan tahap kedua yang

bertujuan untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran molekul protein. Prosedur

pemurnian protein dapat dilakukan karena adanya variasi: kelarutan, ukuran, muatan, binding

specificity (affinity), sifat hidrofobik/hidrofilik (Levine, 1990).

Pemurnian Enzim, tujuan utama pemurnian enzim adalah mengisolasi enzim dengan

kemurnian

maksimal pada tingkat rendemen yang maksimal dengan biaya yang efektif. Secara umum

pemurnian enzim dapat dibagi menjadi ekstraksi, pemekatan dan fraksinasi. Tahap akhir dari

pemurnian enzim adalah teknik fraksinasi, yang dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan

protein enzim dari protein non enzim lainnya. Enzim protease yang akan dimurnikan dari

cacing tanah terdapat bersama-sama dengan berbagai macam protein lainnya sehingga untuk

menentukan teknik pemurnian yang sesuai perlu dilakukan karakterisasi enzim kasar terlebih

dahulu. Informasi awal tentang karakteristik enzim seperti perkiraan berat molekul, pH dan

suhu optimum enzim, inhibitor spesifik untuk menentukan golongan enzim, pengaruh kation,

deterjen dan senyawa denaturan, akan sangat menentukan dalam penentuan metode

pemurnian yang tepat sehingga kondisi yang dilakukan dapat memurnikan enzim sasaran

yang diinginkan. Protein enzim yang diinginkan dari suatu organisme terdapat dalam bentuk

campuran dengan berbagai senyawa lain seperti lipida, protein/peptida maupun debris sel

sehingga perlu dilakukan tahap pemurnian. Tahapan pemurnian enzim yang umum dilakukan

meliputi pembuatan ekstrak, pengendapan baik dengan garam ataupun pelarut organik,

dialisis dan kromatografi (Yanti, 2003).

Daftar Pustaka

Day, R.A. dan A.L. Underwood. 2001. Analisis Kimia Kuantitatif edisi keenam. Jakarta :

Penerbit Erlangga

Zulfikar. 2010. Larutan Penyangga atau Buffer. Tersedia di

http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/kimia-kesehatan/larutan/larutan-penyangga-

atau-buffer/

Wirahadikusumah, M. 1989. Biokimia (Protein, Enzim, Asam Nukleat). ITB. Bandung.

Soendoro, R. 1985. Prinsip-prinsip Biokimia. Buku terjemahan David S. Page. Jakarta:

Erlangga.

Poedjiadi, Anna. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press.

Panil, Zurbadar. 2008. Memahami Teori dan Praktik Biokimia Dasar Medis. Jakarta: EGC.

Daftar pustaka

Artika, I.M. dan M. Safithri. 2010. Diktat Kuliah Struktur dan Fungsi Subseluler. Bogor:

Departemen Biokimia.

Girsang, M., et al. 2003. Teknik Sentrifugasi untuk Meningkatkan Penemuan Bakteri Tahan

Asam (BTA) dari Sputum Penderita TBC Melalui Metode Zielh-Neelsen. Tersedia di:

http://www.litbang.depkes.go.id/media/index [di akses pada tanggal 9 april 2013].

Kimball John W, 1989. Biologi. Edisi ke-5. Jakarta : Erlangga.

Levine, N.D. 1990. Textbook of Veterinary Parasitology. Terjemahan Buku Pelajaran

Parasitologi Veteriner, oleh Gatut Ashadi. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.

Petrucci. 1996. Kimia Dasar Jilid 1. Jakarta: Erlangga.

Underwood. 1988. Analisa Kimia Kuantitatif. Jakarta: Erlangga.

Yanti. 2003. Pemurnian dan Karakterisasi Protease Cacing Tanah Lumbricus rubellus yang

Bersifat Fibrinolitik. Bogor: Ilmu Pangan Program Pascasarjana IPB.