TEMPERATURA PSICROFILI TERMOFILI 40-70 MESOFILI...
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IPERTERMOFILI 65-95 TEMPERATURA PSICROFILI 0-20 MESOFILI 8-46 IPERTERMOFILI ESTREMI 90-115 TERMOFILI 40-70 Dove c’è acqua possono esserci microbi
Transcript of TEMPERATURA PSICROFILI TERMOFILI 40-70 MESOFILI...
IPERTERMOFILI65-95
TEMPERATURA
PSICROFILI0-20
MESOFILI8-46
IPERTERMOFILIESTREMI
90-115
TERMOFILI40-70
Dove c’è acqua possonoesserci microbi
TEMPERATURA
temperatura
Tasso di crescita
Minimo Massimo
Optimum
Vr aumenta
Vr = massima
ALTA NORMALE BASSA
MASSIMA MINIMA
OPTIMUM
Gelificazione della M.I.I trasporti rallentano la crescita si ferma
Denaturazione delle proteineCollasso della M.I.termolisi
Thermus aquaticus comune negli ambienti idrotermali: optimum di temperatura attorno a 70 C
Gli enzimi termoresistenti di Thermus aquaticus sono utilizzati per applicazioni biotecnologiche
30°C70°C
Proteine strutturali termostabili
enzimi attivi a temperatura alta
Lipidi termostabili (archibatteri)
Termofili estremi: topoisomerasi inversaIntroduce giri positivi
Chaperonine particolari e abbondanti
Proteine protettive per il DNA
Magnesio (stabilizza il DNA neutralizzando i fosfati)
Psychromonas ingrahamii (-12 °C)
Il limite minimo è correlato alle modificazioni della capacità di
solvatazione dell’acquaAltera le interazioni
idrofobiche
Le alte temperature uccidono le cellule batteriche
Basse temperature non uccidono
Shock termico può uccidere
PRESSIONE
PRESSIONE
Pressione
1
400
500
Barofili moderati Non barofiliBarofili estremi
Forma baseForma attivata
Gli involucri esterni e la membrana, permeabili all’acqua proteggono i batteri dallo schiacciamento
La pressione agisce impedendo che il volume molecolare aumenti
Inibita dalla pressione
Favorita dalla pressione
I barofili estremi non crescono sopra le 400 atmosfere
hanno una membrana particolarmente ricca di acidi grassi insaturi
più fluida e meno soggetta a variazioni di conformazione sotto pressioni elevate
Saccharomyces non cresce oltre le 8 atmosfere
La quantità di acqua EFFETTIVAMENTE disponibile in un substrato
Viene detta water-activity (Aw)
Ed è definita dal rapportopressione di vapore della sostanza/pressione di vapore dell’acqua pura
Aw = P/P0
Pressione osmotica
I valori di Aw sono compresi tra 0 e 1
La maggior parte dei microrganismiNecessita di Aw≥ 0,98
(valore dell’acqua marina)
Microrganismi alofili estremi riescono a vivere fino a 0,75
ProcariotiALOFILI
Soprattutto archibatteri
FUNGHI
BATTERI
1,0 ACQUA PURA0,99 SANGUE0,90 SCIROPPI
PROSCIUTTO
0,95 PANE0,85 SALAMI0,80 DOLCI DI FRUTTA
MARMELLATE
0,75 PESCE SALATO0,70 GRANDE LAGO SALATO
CEREALIFRUTTA SECCA
I microrganismi che vivono in ambienti con bassa Aw “estraggono” acqua dal mezzo circostante mantenendo inalterata la concentrazione salina interna
L’acqua non può essere trasportata, deve entrare nella
cellula per diffusione
Lo scopo quindi deve essere raggiunto giocando con la concentrazione e il
trasporto di ioni e soluti
I microrganismi alotolleranti sintetizzano o concentrano soluti organici che non danneggino i processi biochimici interni
si tratta in genere di zuccheri (saccarosio, mannitolo, glicerolo) o aminoacidi (prolina) e derivati (betaina) e
vengono definiti “soluti compatibili”
La concentrazione intracellulare dei soluti compatibili richiama acqua all’interno della cellula
Na+
Na+
Na+
Na+Na+
H2O
ACIDOFILI1 - 5,5
NEUTROFILI5,5 - 8
ALCALOFILI8,5 - 11,5
H2SO4
H2O
CaCO3
la maggior parte degli ambienti naturali ha pH compreso tra 5 e 9
I batteri crescono in un intervallo di 2-3 punti di pH in
cui è compreso il valore ottimale per la crescita
Il pH intracellulare deve essere vicino alla neutralità
Limite minimo conosciuto: 4,6(acidofili estremi)
Limite massimo conosciuto: 9,5(basofili estremi)
Acidofili estremi
Acidofili
neutrofili
alcalofili
Alcalofili estremi
acido
basico
Ambienti caratterizzati da pH estremi
Acque acide di miniera
Laghi alcalini
Sorgenti acide
I meccanismi di efflusso ionico sono molto efficienti per mantenere il pH interno
I batteri possono vivere in un intervallo di pH più vasto di quello tollerato dalle loro proteine
7
5,8
3,3
7
5,7 6
8
7,8
E. coli cresce tra pH
Devono pompare via gli ioni idrossile (OH-) che neutralizzerebbero i protoni interni distruggendo il normale metabolismo che dipende dai gradienti protonici
le membrane di questi microrganismi sono modificate, per combattere l’azione degli alcali che saponificano i grassi
OH-OH-OH-
I microrganismi alcalofili sono tutti procarioti(soprattutto archibatteri, ma anche Bacillus e cianobatteri)
LAGHI ALCALINI (soda-lakes)Fortemente basici > pH 9
elevate concentrazioni di bicarbonato e soda caustica
I batteri acidofili si trovano soprattutto nelleACQUE ACIDE DI MINIERA
pH fortemente acido
Quando giacimenti di carbon fossile vengono aperti, la pirite che si trova nel carbone e nelle rocce circostanti
A contatto con l’aria si ossida FeS2 H2SO4
LA CONOSCENZA DELLE ESIGENZE NUTRIZIONALI DEI MICRORGANISMI
E’ indispensabile per la coltivazione in laboratorio
Che fornisce informazioni sulla fisiologia
E permette di ottenere biomassa
La crescita di una coltura è rappresentata dall’aumento del numero delle cellule
Una curva di crescita "standard" (sistema chiuso) prevede diverse fasi,
correlate
al consumo dei nutrienti
all’accumulo dei prodotti di scarto
1
2
3
4
la curva di crescita è riferita alla POPOLAZIONE
e si segue attraverso la variazione del numero di Unità Formanti Colonia (UFC)
A diverse velocità di crescita corrispondono diverse quantità di ribosomi, DNA e proteine
Le cellule che crescono velocemente sono più grandi
1-Fase di latenza (lag)
Corrisponde al tempo necessario alle cellule batteriche per adeguarsi alle condizioni del terreno
La sua durata dipende
dal tipo di inoculo(età, entità)
dalla natura del terreno
latenza
Terreno riccoTerreno povero
La Fase di latenza è un esempio di crescita sbilanciata
alcuni componenti sono sintetizzati e altri no
prima di moltiplicarsi vanno sintetizzati nuovi ribosomi per adeguare il ritmo della sintesi proteica alle nuove disponibilità
Passando a un ambiente PIU’ ricco
Terreno ricco
Passando a un ambiente MENO ricco
le cellule si adeguano al nuovo stato
Terreno povero
non si moltiplicano finchè non siano stati prodotti gli enzimi biosintetici necessari a sopravvivere
Se la coltura è invecchiata
È necessario riparare i danni prima che possa iniziare la moltiplicazione
o danneggiata
2-Fase esponenziale (log)
la crescita raggiunge la massima velocità possibile
la popolazione cellulare è uniforme (adatta per studi biochimici e fisiologici)
logaritmica
la fase esponenziale è un esempio di CRESCITA BILANCIATA in cui tutti i componenti cellulari sono sintetizzati a velocità costanti e coordinate
3-Fase stazionaria
i batteri arrivano a densità di popolazione di circa 109cellule/ml, alghe,
miceti e protozoi a circa 106
una coltura entra in fase stazionaria a causa della deplezione in nutrienti (o in O2)
o dell’accumulo di metaboliti tossici (es ac lattico)
stazionaria
4-Fase di morte accelerata
A volte può esserci una fase di sopravvivenza
se le cellule non lisano questa fase può essere inapparente ( per avere dati precisi si può fare la conta delle UFC)
4
Lo studio della curva di crescita permette di sorvegliare lo stato della coltura
Per motivi pratici, si esegue spesso rilevando l’assorbanza della coltura stessa
Con questa tecnica, la curva assume un aspetto diverso
Una curva particolare è la diauxia
la popolazione batterica esaurisce un primo
nutriente
Entra in una seconda fase lag
Sintetizza gli enzimi necessari a utilizzare un’altra fonte di carbonio (inducibili)
riprende a crescere secondo la normale curva
COLTURE SINCRONE
La sequenza di quel che accade durante la crescita di una popolazione batterica
Si può seguire con precisione in una coltura sincrona
che può essere avviata con mezzi fisici (filtrando per selezionare le cellule più piccole)
O limitando i nutrienti
La sincronia si perde dopo 2-3
generazioni
La velocità di crescita può essere calcolata con l’equazione
n = logN – log N0/0,301 n = numero di generazioni
N = numero di cellule
valore di n in un intervallo di tempo definito
Quanto tempo impiegherà la mia coltura ad arrivare
a una certa densità?
Tempo generazionalelog 2 x intervallo tempo
logOD(2)-logOD(1)
Tgen*logOD(?)-log OD(obs)log(2)
COLTURE CONTINUE
Per studiare la crescita microbica in condizioni di nutrienti basse, simili a quelle naturali
Questo è possibile nel
CHEMOSTATO
È utile ottenere colture che restino in fase esponenziale, crescendo a velocità nota
TURBIDOSTATO
motore
aria
CHEMOSTATO
crescitaTerreno sterile scarto
CHEMOSTATO
il terreno contiene un fattore limitante
il tasso di crescita dipende dalla velocita’ di immissione di terreno
fresco
Il tasso di crescita vienemantenuto costante
TURBIDOSTATO
Non ci sono fattori limitanti nel terreno
la diluizione del terreno varia a seconda della
velocità di crescita della coltura
la torbidità viene mantenuta costante
C
40 min
D
20 min
I
variabile
Nel ciclo cellulare di E. coli si possono distinguere diversi momenti
Fase I (interinizio) la cellula si prepara alla replicazione del DNASi osserva in cellule che si dividono lentamente (T>60’);
Fase C (copia) periodo necessario a replicare il DNA. Il limite è rappresentato dalla velocità di sintesi della DNA polimerasi
Fase D (divisione): tra il completamento della replicazione del cromosoma e la divisione delle cellule figlie
La velocità di divisione può essere inferiore ai 40 minuti necessari per la duplicazione del cromosoma
infatti diverse replicazioni si avviano in sequenza rapida, e il cromosoma che entra in una cellula figlia ha già intrapreso una nuova duplicazione
1L
La divisione di una cellula comporta la formazione di un setto, che avviene quando la distanza tra il centro dei due nucleoidi è pari a una “lunghezza cellulare”
La forma della cellula batterica si mantiene durante la divisione
La cellula si allunga; il cromosoma si duplica, restando attaccato alla membrana
I nucleoidi si separano
la proteina FtsZ forma un anello (Z-ring)nello spazio tra i nucleoidi, e recluta altre
proteine che partecipano alla formazione del setto
FtsZ-GFP
Z-ring
La formazione dello Z-ring è dovuta alla capacità della proteina FtsZ di polimerizzare
La sintesi parte da un “sito del setto a livello della membrana citoplasmatica e prosegue nelle due direzioni, a formare l’anello
L’anello si stringe progressivamente
il setto si completa, si formano due pareti distinte e le cellule figlie si separano
Forzando la membrana citoplasmatica verso l’interno
la divisione avviene sempre e solo dopo la duplicazione del DNA (se la sintesi di DNA si blocca la divisione non ha luogo)
SI NO
nei batteri bastoncellari il setto si localizza esattamente al centro della cellula
Il corretto posizionamento del setto è dovuto a :
SISTEMA MinOCCLUSIONE
DEL NUCLEOIDE
OCCLUSIONE DEL NUCLEOIDE
La presenza del nucleoide in una regione inibisce la formazione del setto
Nella regione mediana la concentrazione del DNA è diminuita per la separazione del nucleoidi: il setto è libero di formarsi
Le estremità della cellula (poli) sono libere dal nucleoide e potenziali siti di formazione del setto
minicellula
Ma la formazione di un setto in corrispondenza di un polo provoca la formazione di “minicellule” (piccole e prive di cromosoma)
SISTEMA Min: impedisce che il setto si formi alle estremità della cellula MinC
MinDMinE
MinC inibisce FtsZ; non è in grado di spostarsi all’interno della cellula
MinD è una ATPasi che si associa a uno dei poli della cellula, lega MinC e la attiva (complesso MinCD)
MinE forma un anello all’estremità della zona occupata da MinD
EEEEEEEEEEE E
EEEEEEEEEEE
Man mano che le unità di MinD si staccano dalla membrana, l’anello di MinE si sposta
verso il polo
EEEEEEEEEE E E
EEEEEEEEEEE
E
E
E
E
L’interazione MinE/MinD provoca il distacco di quest’ultima dalla membrana
Di conseguenza, anche MinC si stacca
EEEEEEEEEE E E
EEEEEEEEEEE
quando l’anello raggiunge il polo, si disgrega
MinD, liberata da un polo, raggiunge l’altro spostandosi a spirale lungo la membrana e si lega, legando e attivando MinC
E EEEEEEEE
EEEEEE
EEEEEEEE
MinE torna a formare l’anello all’estremità della zona di legame di MinD
L’oscillazione si sussegue con un periodo di circa 30”
EE
E
E
E
E
EE
E
EE
EEEEEE
E
E
EE
EE
La presenza di MinCD ai poli impedisce a FtsZ di reclutare le altre proteine per formare il setto
durante un ciclo cellulare, quindi, la presenza di MinC attivata è statisticamente maggiore ai due poli
Questo meccanismo è detto divisione a scatto
In alcuni casi la parete è formata da due strati e solo quello interno partecipa alla formazione del setto
Quando il setto si ispessisce rompe la parte esterna della parete su un
solo lato
le due cellule figlie si allontanano facendo perno sul lato opposto a quello della rottura
DIVISIONE POLARE
A volte la crescita e la divisione della cellule batteriche sono polari
La divisione per gemmazione è uno di questi casi
Nitrobacter: le lamelle di invaginazioni della membrana non sono presenti al polo della cellula
da cui si origina la gemma
LA DIVISIONE INEGUALE PERMETTE L’EVOLUZIONE DI UNA DIVERSA COMPLESSITÀ STRUTTURALE
gemmazione
Gemmazione con ifa
Anche il processo di sporificazione è una divisione ineguale
Come tutti i batteri, gli sporigeni si dividono solitamente per schizogonia
Ma in condizioni di carenza di nutrienti o di altri tipi di stress ambientali
O in colture molto affollate, si innesca il processo di sporulazione
II-Divisione asimmetrica
III- Protoplasto prespora IV- Parete e cortex
V- tuniche
VI- maturazione
VII- rilascio
Ciclo cellulare di Caulobacter crescentus:alternanza delle forme prostecata e flagellata
Il ciclo vitale di Streptomycesuno dei cicli più complessi tra i procarioti
Un micelio vegetativo (Micelio del substrato) formato da ife intrecciate, dà luogo a una colonia
lo sviluppo coordinato multicellulare porta alla produzione di antibiotici e, contemporaneamente, inizia a comparire un micelio aereo specializzato
Le ife si affondano nel terreno, traendone i necessari nutrienti
1) Micelio del substrato
Nel micelio del substrato i filamenti non sono settati e intrecciandosi danno alla colonia una consistenza compatta
Quando le ife aeree sono cresciute, inizia un secondo momento di sviluppo che porta a una nuova e articolata regolazione della crescita, del ciclo cellulare e dei processi di morfogenesi
2) MICELIO AEREO
Quando si formano gli sporofori (e poi le spore)la colonia assume un aspetto polveroso
ANCHE IL CICLO VITALE DEI MYXOBATTERI E’ COMPLESSO
germinazione
Corpo fruttifero
sciame
Inizio del differenziamento
variazioni ambientali
Necessità di modulare le attività cellulari
QUALITATIVAQUANTITATIVA
Scelta del set di enzimi utili a seconda delle situazioni
Modulazione della quantità di enzima
Modulazione dell’attività enzimatica
Il ciclo vitale dipende dalle possibilità che l’ambiente offre
MODULAZIONE DELL’ATTIVITÀ ENZIMATICA
le proteine possono cambiare conformazione
ESSERE ATTIVATE ESSERE INIBITE
ACQUISIRE CAPACITA’ NUOVE (LATENTI)
ATTRAVERSO IL LEGAME CON EFFETTORI
ALLOSTERICI (LIGANDI)
Il sito di legame per l’effettore non coincide con il sito catalitico dell’enzima
Il legame con l’effettore modifica
positivi
negativi
Velocità di reazione (Vmax)
Affinità per il substrato(Km)
Inibizione a FEED BACK
REGOLAZIONE DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA
QUANDO IL PRODOTTO SI ACCUMULA
si lega a uno degli enzimi della catena, causandone l’inattivazione
la reazione enzimatica cessa e non si forma più prodotto
Se il prodotto finale di una biosintesi è in eccesso o se è disponibile nell’ambiente, il
processo non è più conveniente
Non tutti i geni sono espressi nello stesso modo
Enzimi particolariPoco espressi
Proteine house-keeping: molto espresse
