Analisi MLPA & Troubleshooting › images › media › resnews › Presentazione... ·...

Analisi MLPA & Troubleshooting

- Fondata nel 1985 - Focalizzata in precedenza sulla produzione di

endonucleasi e marker molecolari - Dal 2002 tecnica MLPA: - ~400 probemix - Usate in tutto il mondo per le analisi di copy number e metilazione. - Certificazione ISO 13485:2003 - Obiettivo futuro: marchio CE

Analisi dei “raw data” e troubleshooting

Tecnica relativa

Le intensità assolute dei segnali non sono usate per l’interpretazione!

Ma…

Le probe ratio sono calcolate in base a:

• Sonde di riferimento che sono incluse nella maggior parte delle probemix;

• Campioni di riferimento che sono necessari per il confronto.

Confronto degli elettroferogrammi

Campione di

riferimento

DMD normale

Campione di un

paziente

DMD Gain Ex 3-44

Campione Reference: DMD

normale

Paziente: DMD Gain Ex 3-44

Confronto elettroferogrammi - sovrapposizione -

La variazione sperimentale può essere introdotta in ogni step

1. Set-up dell’Esperimento

1.1 Trattamento dei campioni

Il DNA di tutti i campioni deve essere trattato allo stesso modo per tutta la durata dell’esperimento:

• Usare lo stesso metodo di estrazione per tutti i campioni e I reference.

• Usare DNA estratto dallo stesso tipo di tessuto.

• Usare concentrazioni simili per tutti i campioni.

I risultati MLPA dipendono dalla qualità dei campioni:

• I contaminanti possono causare una denaturazione incompleta:

- Sali e altri ioni

• I contaminanti possono causare sloping/PCR incompleta:

- Ferro, etanolo, fenolo, Trizol, EDTA

• Uno stoccaggio per lunghi periodi e cicli ripetuti di congelamento e scongelamento potrebbero influenzare la qualità dei campioni.

1.2 Qualità dei campioni

1.3 Set-up dell’Esperimento MLPA

Uso di controlli e campioni di riferimento:

• Il controllo no DNA per controllare per contaminazioni di DNA genomico o prodotti MLPA.

• Campioni di riferimento per un’analisi accurata.

• Controlli positivi possono aiutare nell’interpretazione dei dati

• Aggiungere controlli in ogni nuovo esperimento MLPA!

• Con alcune probemix MLPA (ad es. P095) è altamente consigliato confrontare solamente i campioni dello stesso sesso.

• È raccomandato usare un numero di campioni di riferimento 1:7, con un minimo di 3 campioni di riferimento.

• Una distribuzione casuale dei campioni di riferimento permette una normalizzazione dei dati ottimale.

1.3 Set-up dell’Esperimento MLPA

2. Esecuzione dell’Esperimento

2.1 Raccomandazioni generali sul protocollo MLPA

• Seguire attentamente il protocollo, non usare volumi minori di probemix e di reagenti.

• Fare delle mastermix die reagenti (volumi grandi).

• Mescolare bene tutti i reagenti, ma non vortexare troppo a lungo.

- Non vortexare mai gli enzimi!

• Gli enzimi sono viscosi, è quindi necessario pipettare lentamente oppure riscaldare (10 sec. tra le mani).

2.2 Reazione MLPA: Denaturazione ed ibridazione

• Non aspettare troppo a lungo dopo la denaturazione per continuare con l‘esperimento MLPA.

• Usare un termociclatore con un coperchio riscaldato per prevenire l‘evaporazione.

• Lo step di ibridazione dura 16 ore fino ad un massimo di 20 ore.

• Il buffer A di ligasi diventa meno stabile dopo ripetuti cicli di congelamento/scongelamento.

• Mescolare con attenzione.

• Assircurarsi che non ci siano bolle dopo l‘aggiunta della mix della ligasi ai campioni.

• Dopo il completamento i prodotti di ligazione possono essere conservati a 4⁰C.

3. Reazione MLPA

“Raw Data”

• Sono i dati che non sono manipolati (ad es. Size calling, correzione della baseline) dai software di analisi.

• Contengono la maggior parte delle informazioni che forniscono il metodo migliore per la valutazione dei picchi ed il troubleshooting.

• Possono essere accessibili attraverso i software di analisi di frammenti come Peakscanner, GeneMarker, Coffalyser.

Peak scanner

3. Problemi causati da errori durante la reazione di MLPA

• 3.1 Q-fragments alti

• 3.2 Denaturazione incompleta

• 3.3 Sloping del segnale

• 3.4 Alto picco dei primer

3.1 Q-fragments Alti

• Ogni probemix MLPA contiene 4 Q-fragments di 64-70-76-82 nt.

• L’ amplificazione dei Q-fragments è indipendente dal DNA e dalla ligazione.

• I Q-fragments non dovrebbero essere alti più di 1/3 del D-fragment da 92 nt.

• Quando i Q-fragments sono alti: non è stato usato abbastanza DNA o la ligazione non è avvenuta con successo.


Situazione normale con DNA sufficiente


Non è stato usato sufficiente DNA o la ligazione non è avvenuta


0

1 0 0 0 0

2 0 0 0 0

3 0 0 0 0

4 0 0 0 0

5 0 0 0 0

6 0 0 0 0

7 0 0 0 0

8 0 0 0 0

9 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0

1 1 0 0 0 0

1 2 0 0 0 0

5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 6 0 0 6 5 0 7 0 0

P 2 0 2 - 0 6 1 1 - Q T D - n o D N A - R B O . C 0 5 _ 1 1 0 9 1 6 1 8 B N

S i z e ( n t )

Dy

e S

ign

al

61.12

67.22

73.42

79.73

Controllo No DNA


La quantità di DNA ottimale per l’MLPA è di 50-100ng. La reazione di ligazione può non avvenire quando i campioni

non sono depurinati nel sito di legame delle sonde MLPA.

• Almeno 5mM (preferibilmente 10mM) di Tris HCl con un pH tra 8.0 e 9.0 dovrebbe essere presente in 5µl DNA del campione prima di portarlo a 98°C per la denaturazione del DNA.

• Campioni di DNA eluiti in acqua sono vulnerabili.

• Se non siete certi del fatto che il campione di DNA sia in acqua o TE, è consigliato aggiungere 5 o 10 mM di Tris-HCl con un pH tra 8.0 e 9.0.

Per esempio, per un campione di DNA 4µl aggiungere 1µl di 50mM Tris HCl pH 8.5.

3.2 Denaturazione incompleta

La denaturazione è richiesta per il legame delle sonde MLPA


• Sequenze ricche in CG hanno una Tm molto alta e sono difficili da denaturare.

• Sequenze particolari localizzate vicino a isole CpG sono soggette a denaturazione incompleta.

• Isole CpG sono spesso localizzate vicino (<5kb) al sito di inizio della trascrizione dei geni → le sonde per l’esone 1 sono le più coinvolte.

• La denaturazione incompleta può interferire con il legame delle sonde e potrebbe risultare in una falsa delezione.

I contaminanti influenzano la denaturazione:

• Sali, ad es. NaCl, KCl

– concentrazioni > 60mM creano problemi di denaturazione.

• Altri ioni, ad es. Fe, Mg

– A concentrazioni molto basse (1mM) questi ioni possono causare problemi di denaturazione.


• Ogni kit MLPA contiene D-fragments a 88, 92nt e 96nt.

• I D-fragments a 88 e 96nt sono localizzati nelle isole CpG, che sono difficili da denaturare.

• Nel caso in cui il picco a 88 nt o a 96 nt fosse più basso (<40 %) del picco a D-fragment a 92 nt e della altre sonde, la denaturazione del campione è incompleta.


0

1 0 0 0 0

2 0 0 0 0

3 0 0 0 0

4 0 0 0 0

5 0 0 0 0

6 0 0 0 0

7 0 0 0 0

8 0 0 0 0

5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0

P 2 8 9 Q T C -1 .5 u l .C 0 6 _ 0 8 0 9 1 7 1 6 P F

S ize (nt)

Dye S

ignal

86.01

91.44

96.69

100.89

105.70

163.99

170.80

176.71

183.43

188.87

194.61

201.67

208.32

213.92

237.46

246.98

256.02

263.59

271.71

88nt 96nt

3.2 Denaturazione incompleta Campione con una corretta denaturazione

0

1 0 0 0 0

2 0 0 0 0

3 0 0 0 0

4 0 0 0 0

5 0 0 0 0

6 0 0 0 0

7 0 0 0 0

8 0 0 0 0

9 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0

1 1 0 0 0 0

1 2 0 0 0 0

1 3 0 0 0 0

5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0

P 2 8 9 -Q T C -8 0 m M s a l t .C 0 5 _ 0 8 0 9 1 7 1 6 P 8

S ize (nt)

Dye S

ignal

85.92

91.40

100.87

105.69

164.05

170.89

176.80

183.49

188.91

194.64

201.59

208.31

213.95

237.43

246.94

255.98

263.62

271.63

88nt 96nt

Denaturazione incompleta: riduzione dei segnali delle sonde



Soluzioni:

• Usare una quantità minore di DNA: questo riduce la presenza di contaminanti che causano problemi di denaturazione.

• Procedere con uno step supplementare di purifica (come una semplice precipitazione con etanolo).

• Includere glicerolo (5% v/v concentrazione finale) in 5µl del campione di DNA

3.3 Sloping del Segnale • Le intensità dei segnali dei frammenti MLPA più lunghi sono di 3

volte più basse di quelle dei frammenti più corti.

Si possono identificare due tipi di sloping:

1) Sloping SOLO nei picchi MLPA e NON nel size standard: → Causato durante la reazione di MLPA 2) Sloping SIA nei picchi MLPA SIA nel size standard: → Causato durante la separazione dei frammenti (elettroforesi)

3.3 Sloping del Segnale

Sloping solo nei picchi MLPA


Segnali troppo bassi

Sloping solo nei picchi MLPA


Come risultato dello sloping, non è più possibile fare il size calling

3.3 Sloping del Segnale Sloping solo nei picchi MLPA

Campione di riferimento

Campione Test

La differenza di sloping tra i campioni di riferimento ed i campioni da testare può portare a conclusioni false

1) Contaminanti nel campione di DNA che inibiscono la polimerasi: • Ad es. impurità ioniche come ferro (derivato da cellule del

sangue o da biglie magnetiche) • Etanolo, fenol o Trizol • EDTA

Soluzione: 1) Ridurre l’influenza dei contaminanti usando una quantità

minore di DNA (quantità ottimale: 50-100ng). 2) Effettuare uno step extra di purifica, come una semplice

precipitazione con l’etanolo.

3.3 Sloping del Segnale Sloping solo nei picchi MLPA – Cause:

2) Eccessiva evaporazione durante la reazione MLPA:

• Soprattutto durante l’ibridazione o quando si pipetta la reazione di ligazione;

• I tubi non chiusi perfettamente (ibridazione); • Se si stanno manipolando grandi quantità di campioni (quando si

pipetta la reazione di ligazione).


Soluzione: • Controllare sempre che i tubi siano chiusi;

• Controllare se si sia verificata un’evaporazione durante l’ibridazione overnight aggiungendo un tubo con 8 μl di acqua. Il mattino seguente, dovrebbero rimanere almeno 5 μl di acqua sulla base del tubo.

• Evitare l’evaporazione durante il pipettamento. Assicurarsi che i tubi non siano aperti per lungo tempo quando sono nel termociclatore a 54°C durante la preparazione della reazione di ligazione. Usare ad esempio pipette multicanale.


Picco dei primer

Segnali ridotti dei picchi

3.4 Alto picco di primer

3.4 Alto picco di primer

• Un alto picco di primer è indicativo di un fallimento della PCR.

• Un alto picco di primer spesso risulta in una riduzione dell’altezza dei picchi.

• Non è più possibile calcolare la probe.

Cause: • Probemix non aggiunta; • PCR fallita (ad. es. Polimerasi non attiva).

4)Separazione dei frammenti

4. Problemi causati durante la separazione dei frammenti

4.1 Sloping nei picchi MLPA e nel size standard

4.2 Intensità dei segnali MLPA non ottimale

4.3 Baseline Alta

4.4 Fluorescenza alta tra le sonde MLPA

4.5 I picchi del size standard non sono di altezze uguali

Possono essere identificati due tipi di sloping:

1) Sloping SOLO nei picchi MLPA e NON nel size standard: → Causato durante la reazione MLPA

2) Sloping in ENTRAMBI I picchi MLPA e nel size standard: → Causato durante la separazione di frammenti



Il GS500 size standard è progettato in modo tale che lo sloping possa essere facilmente identificato


Cause: • Polimero o capillari vecchi • Injection voltage troppo alto • Formammide di bassa qualità

4.2 Intensità del segnale dei picchi MLPA non ottimale

Quando l’intensità del segnale dei picchi MLPA va oltre il limite di rilevamento del sequenziatore, i picchi diventano troncati e non possono essere quantificati.i

I seguenti fattori influenzano l’intensità del segnale:

• Concentrazione dei prodotti MLPA nell’injection mixture • Injection Voltage • Injection Time

4.2 Intensità del segnale dei picchi MLPA non ottimale

4.3 Baseline Alta

Baseline: • Intensità minima del segnale per dye • Nessun campione passa il detector • I Segnali dovrebbero essere 3 volte

superiori alla baseline

Cause: • Finestra di detection non pulita

perfettamente • Matrice di calibrazione non ottimale

• Il punto più basso tra 2 sonde MLPA dovrebbe essere inferiore a 250 unità.

• Usare meno prodotto PCR: - Diluire i prodotti PCR - Cambiare le impostazioni di injection

4.4 Fluorescenza alta tra sonde MLPA


Una quantità eccessiva di prodotto PCR nell’injection mixture può risultare in una concentrazione alta di sali: Re-annealing dei prodotti PCR → segnali diversi o perdita di segnali inattesi.

Normale

Re-annealing

Suggerimenti:

Non correre i prodotti PCR in acqua, ma in formammide HiDi

• Non usare il prodotto PCR a più di 1/10 del volume finale dell’injection mixture. Molti problemi sono spesso risolti diluendo i prodotti PCR.

• Controllare il sistema di elettroforesi capillare (ad. es. polimero, scarti, tubi, vassoio ed il laser, la temperatura), sostituire il buffer e l’acqua e far ripartire le run fallite .


Per ulteriori informazioni tecniche e commerciali potete contattare:

Tel.: (+39) 06 93955058 Fax: (+39) 06 93955059

E-mail: [email protected]

Per invio ordini: [email protected] PEC-mail: [email protected]

Sito Web: www.resnovaweb.com

Servizio Clienti

S.r.l.

mailto:[email protected]






Analisi MLPA & Troubleshooting › images › media › resnews › Presentazione... ·...

Documents

Transcript of Analisi MLPA & Troubleshooting › images › media › resnews › Presentazione... ·...